CN104046644A - 人源化小鼠模型的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人源化小鼠模型的构建方法和应用，具体涉及人源Nbs1c.657del5基因的转基因小鼠模型的构建方法和应用，包括构建人源Nbs1基因中含5bp缺失突变的BAC载体，原核显微注射，筛选获得高表达和低表达人源Nbs1基因的3个稳定转基因系。本发明的转基因小鼠在其中一个系中以一定比例出现了发育延迟、体长均匀缩短、骨发育异常的表型，为奈梅亨破碎综合症疾病建立了新的小鼠模型。同时，由于Nbs1基因功能损伤与癌症密切相关，因此该转基因模型可应用于药物临床前安全性评价中的短期致癌实验，为传统的两年期致癌实验提供了有潜力的替代模型，也为癌症发生机理的研究提供了有效的工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因小鼠模型，具体涉及一种在不同发育阶段和器官中较高水平表达NBS1p70的转基因小鼠模型的构建方法，以及该动物模型以及由其衍生的胚胎、细胞、组织和器官在药物临床前安全性评价、致癌物筛选及治疗NBS（奈梅亨破碎综合症）药物筛选中的用途。
背景技术
DNA修复系统和细胞周期检测点系统与基因组的稳定性直接相关。若细胞无法正常发挥DNA双链断裂修复功能（同源重组修复和非同源末端连接修复），会导致染色体重排和突变积累，进而激活细胞周期检测点，抑制生长。但若作为最后的检测，细胞周期检测点阻止功能也同时受损，才使细胞更容易恶性增殖和组织癌变，如奈梅亨破碎综合症(K.K.Khanna等,2001,Nature,27:247-254；M.O'Driscoll等,2006,Nature Reviews Genetics,7:45-54)。
95%的奈梅亨破碎综合征病人为Nbs1c.657del5突变的纯合子（缺失cDNA657-661位点5nt，属常染色体隐性遗传）。携带Nbs1c.657del5突变的杂合子人群与正常人群相比也表现出癌症发生机率的显著性提高(E.Seemanová等,2007,J Natl Cancer Inst.,99:1875-1880；E.Seemanova等,2006,Cas LekCesk.,145:138-143)，因此研究人员推断：与经典“two-hit”肿瘤发生模型中的肿瘤抑制基因不同，Nbs1属于单倍不足肿瘤抑制基因群，肿瘤的发生仅仅取决于基因剂量的下降程度(M.Santarosa等,2004,Biochim BiophysActa,1654:105-122)。该疾病的主要症状可概括如下：倾向在青年时期患淋巴癌、血液系统或固态恶性肿瘤(C.Cybulski等,2004,Cancer Research,64:1215-1219；J.P.Ehlers等,2005,Clin Cancer Res.,11:1849-1853；B.Gorski等,2003,International Journal of Cancer.,106:379-381；J.Steffen等,2004,Int.J.Cancer.,111:67-71；H.Tauchi等,2002,Oncogene.,21:8967-8980)，成长缓慢，体长均匀缩短，头小畸形，面部特征异常，骨发育异常，染色体不稳定，免疫系统缺陷，易反复感染，脑发育异常，皮肤异常(K.H.Chrzanowska等,2012,Orphanet Journal of Rare Diseases,7:1-19；K.等,2012,Journal ofApplied Genetics,53:189-191)，女性卵巢发育障碍(I.v.d.Burgt等,1996,J MedGenet.,33:153-156；K.H.Chrzanowska等,2010,J Clin EndocrinolMetab.,95:3133-3140)、男性第二性征发育推迟（http://www.emedicine.com/derm/topic725.htm）。奈梅亨破碎综合征病人的细胞具有如下显著特点：intra-S期、G1到S期、G2期到M期的检测功能缺陷，即在离子射线或类辐射药物（如bleomycin）处理后，无法停止DNA的合成和阻止细胞进入S期（或M期）。导致这些病人对直接或间接引起DNA双链断裂的所有致变剂敏感(I.Demuth等,2007,Oncogene,26:7792-7798)。
Nbs1与Mre11、Rad50相互结合形成的MRN复合物是DNA的同源重组修复和非同源末端连接修复系统中双链断裂的识别和启始元件，并参与信号传导和修复(R.S.Williams等,2009,Cell.,139:87-99)。此外，Nbs1在细胞周期检测点和端粒稳定性维持系统中也发挥了重要的功能(S.E.R.P.,2009,GENES&DEVELOPMENT.,23:171-180；Y.L.Erin R.P.Shull,HironobuNakane,2009,Genes Dev,23:171-180；B.J.Lamarche等,2010,FEBSLetters.,584:3682-3695)。
Nbs1蛋白由N-端的FHA结构域及两个相邻的BRCT结构域（BRCT1、BRCT2）(J.Lloyd等,2009,Cell.,139:100-111)，和C-端的Mre11结合结构域及ATM结合结构域组成。FHA-BRCT1-BRCT2协助Mdc1和Ctp1绑定在DSB位置，进行同源重组修复(R.S.Williams等,2009,Cell.,139:87-99)；该结构域还介导与ATR的相互作用，其缺失不仅抑制正常的同源重组修复，也会使S期检测点的功能受损(E.Olson等,2007,Journal of BiologicalChemistry.,282:22939-22952)。T细胞、卵母细胞的发育或其它体内或外界压力造成DNA双链断裂引起的G2/M、S期检测点停滞均依赖于N-端FHA结构域的功能，而非ATM的磷酸化激活和C-端区域的功能(S.Difilippantonio等,2007,Journal of Experimental Medicine.,204:1003-1011)。
Nbs1的c.657del5突变导致表达：N端26KD蛋白片段（包括FHA-BRCT1，不能与其它蛋白相互作用）和翻译起始位点移位的70KD片段（有完整的Mre11、ATM的结合基序）(R.S.Maser等,2001,Nature Genetics.,27:417-421)。这种不连续导致FHA-BRCT1-BRCT2介导的相互作用与Mre11、ATM间的相互作用隔离(R.S.Williams等,2009,Cell.,139:87-99)。而且使蛋白质不稳定和丰度降低，导致NBS病人具有离子射线敏感性和易发癌症(L.Kruger等,2007,Carcinogenesis.,28:107-111；R.S.Maser等,2001,NatureGenetics.,27:417-421)。已有体内数据表明：hNbs1p70可以与mMre11、mRad50（鼠源Mre11和Rad50）形成部分功能损伤的MRN复合物，对ATM及ATM下游信号通路的激活有一定程度的影响(S.Difilippantonio等,2005,Nature CellBiology.,7:675-685)。
已有体内外数据表明：Nbs1过表达或单倍不足均与肿瘤的发生率联系紧密。40-52%的晚期头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、肝癌和食管癌病人被检测出NBS1呈过表达状态。Nbs1杂合子敲除小鼠模型（Nbs1+/-）与野生型小鼠相比，肿瘤的自发率和γ-辐射诱导的肿瘤发生率都显著性提高(V.Dumon-Jones等,2003,Cancer Res,63:7263-7269)。与对照组相比，NBS1过表达细胞系的克隆形成能力、迁移和入侵活性及恶性转化能力都显著性上升(Y.-C.Chen等,2005,Journal of Biological Chemistry,280:32505-32511；C.-Y.Wu等,2011,Journal of Biomedical Science,18:1-6；M.-H.Yang等,2006,ClinicalCancer Research,12:507-515)。
比较已有的NBS疾病模型发现，虽暗示了NBS细胞具有恶性增殖的倾向，但在人源化地模拟因Nbs1的突变（c.657del5），导致肿瘤易发方面还有改进的空间（如模型不育、未用致癌剂诱导等）。
致癌性实验是药物临床前安全性评价中的重要内容，是为评价人体长期用药的致癌风险，以考察药物对动物的潜在致癌作用为主进行的实验研究(宋征等,2010,中国药理学与毒理学杂志.,6:557-561)。1997年，ICH的S1B发布了可采用遗传修饰小鼠模型作为临床前致癌性评价中大鼠长期致癌性实验附加试验的指导原则(Testing for carcinogenicity of pharmaceuticals[S],1997,CurrentStep4verson1-7)。通过将致癌基因或抑癌基因转入（或敲除）而建立的5种遗传修饰小鼠模型（包括CB6F1-Tg RasH2、Tg.AC、C57BL/6(N5)-Trp53+/-、Xpa-/-、Xpa-/-/P53+/-）虽然有实验周期仅需24-26周、假阳性和假阴性的发生率较低等优点，但它们也普遍存在对基因毒性和非基因毒性致癌物的反应不一致、对鼠类致癌剂而非人类致癌剂区分界限不明显等缺陷(E.M.Agency,2004,Evaluationof Medicines for Human Use,CPMP/SWP/2592/02Rev1:1-12；J.MacDonald等,2004,Toxicological Sciences.,77:188-194；J.B.Pritchard等,2003,EnvironmentalHealth Perspectives,111:444-454)。我国在利用遗传修饰动物进行致癌性评价领域，目前仍处于“四无”状态：无商业化动物模型可售，无技术标准可查，无关键技术可用，无背景数据可考(范昌发等,2009,实验动物科学,26:59-61)。
本申请将来源于人的Nbs1c.657del5基因整合到小鼠基因组中，然后通过基因型鉴定、表达分析和回交繁殖建立了3个稳定转基因系。以期通过致癌剂的诱导来筛选出具有理想短期致癌特点的人源化模型。本发明弥补了NBS模型方面的空白，同时具有区分鼠类致癌剂而人类非致癌剂和在各个器官（含内分泌、生殖器官）的致癌敏感性上获得比较一致表型的潜力。有利于最终实现借助药物的化学结构信息、基因毒性实验（如Ames突变实验）、大鼠的2-年致癌性实验等其它体内外实验来充分且真实地预测待上市药物对人体致癌的潜在威胁(J.B.Pritchard等,2003,Environmental Health Perspectives,111:444-454)。
发明内容
本发明的目的是提供基于BAC显微注射技术，产生可稳定表达不同水平NBS1p70的人源化转基因小鼠，弥补现有NBS疾病模型的缺陷，并为药物临床前安全性评价中的短期致癌实验建立替代模型。
本发明的目的部分通过提供一种基因载体而实现。具体而言，本发明的基因载体含有人的Nbs1c.657del5基因，通过显微注射该基因载体、使之整合到小鼠基因组，产生人源Nbs1基因表达特征与内源Nbs1一致的转基因小鼠，进而使部分功能受损的NBS1p70参与到影响染色体的稳定性、细胞周期检测点等相关信号通路中，提高细胞和个体恶性转化和癌变的概率。
本发明借助rpsl-neo反向筛选系统将Nbs1基因的大量上下游调控元件（如c-Myc介导的转录诱导结合位点，该位点位于Nbs1基因的转录起始位点上游493-439bp的启动子区和其第1个内含子中）与Nbs1的c.657del5突变串联起来，从而构建本发明的基因载体。
因此，本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列含有人的Nbs1c.657del5基因。
在一具体实施方式中，所述多核苷酸含有Nbs1基因的上下游调控元件。
在一具体实施方式中，所述多核苷酸含有Nbs1及其上下游至少40kb、至少50kb、或至少60kb的DNA序列。在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列长度在40-60kb的范围内。
在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列还含有人源CALB1和DECR1。
在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列是载体。
在一具体实施方式中，所述载体是BAC载体。
在一具体实施方式中，所述BAC载体是CH17-246C15。
本发明第二方面提供一种构建小鼠模型的方法，所述方法包括：
（1）将本发明的BAC载体显微注射到小鼠受精卵的雄原核内，体外培育该受精卵至2细胞期后，移植入假孕受体输卵管内，获得Nbs1基因5’、3’端调控序列以及突变位点均为阳性的子代小鼠；和
（2）将步骤（1）所得的子代小鼠分别与WT C57BL/6N品系小鼠进行回交，通过基因的自由组合与分离来获得稳定表达的转基因系。
在一具体实施方式中，所述方法还包括：筛选人源Nbs1呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达的、稳定的Nbs1c.657del5转基因系。
本发明还涉及Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代。
在一个实施方式中，Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代采用本发明构建小鼠模型的方法获得。
在一个实施方式中，本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代表现为人源Nbs1呈不同水平转录、BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达、具有稳定的Nbs1c.657del5转基因特征。
在一个实施方式中，本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代中，人源Nbs1可以在胸腺、脾脏、睾丸、脑中较高水平地转录，在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠中也可以被活跃地转录，其转录特征与内源Nbs1一致，可参与到相关功能的信号通路中。
在一个实施方式中，本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代中，NBS1p70在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺组织、脾脏组织和激活的B细胞中表达；其表达水平接近内源NBS1或高于内源NBS1的表达水平。暗示人源Nbs1p70在胎鼠和成年鼠的免疫器官中可代替部分内源的NBS1蛋白，影响DNA DSB引起的同源重组修复、非同源末端连接或细胞周期检测点等功能的正常发挥。
在一个实施方式中，本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代中，人源CALB1和DECR1基本不表达或表达水平非常微弱，基本可忽略。
在一个实施方式中，本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代具有发育迟缓、体长均匀缩短和骨发育异常（如上肢或下肢脚趾弯曲）的表型，与临床上NBS病人的症状类似。
在一个实施方式中，本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代还可在长时间，例如至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间的生长期间内不发生自发肿瘤。
本发明也包括本发明Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物，所述小鼠后代、其细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物的特征是人源Nbs1呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达的、以及具有稳定的Nbs1c.657del5转基因。
本发明还涉及本发明多核苷酸序列，尤其是BAC载体，在构建Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠中的应用，包括用于制备构建Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠用的物质中的应用。
本发明还涉及本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代、Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物作为模型的用途，包括用于检测化合物在如下实验或疾病中的效果或用来研究可诱发下述疾病化合物的敏感性：药物临床前安全性评价；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的广泛性检测；双链断裂修复失常与癌症或其它相关疾病发生的关系研究；免疫毒理学实验；发育障碍如头小畸形、发育迟缓；面部特征异常如前额退化、下颌骨退化、耳大、头发稀疏；骨发育异常如趾畸形、髋骨发育不良、骶骨发育不良；性发育障碍如卵巢早熟性发育不足、雄性不育；易反复感染如窦炎、肺炎；免疫缺陷如体液免疫缺陷、细胞免疫缺陷；脑发育异常如脑积水、大脑额叶发育不良；认知功能变差；皮肤异常如浅褐色斑点、白癜风斑点。
本发明也提供方法，所述方法包括给予本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代、Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物某些物质、化合物、分子，例如化学物质、蛋白质、抗体、核酸分子等等，以检测和/或评价所述物质、化合物、分子等在如下实验或疾病中的效果或用来研究可诱发下述疾病化合物的敏感性：药物临床前安全性评价；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的广泛性检测；双链断裂修复失常与癌症或其它相关疾病发生的关系研究；免疫毒理学实验；发育障碍如头小畸形、发育迟缓；面部特征异常如前额退化、下颌骨退化、耳大、头发稀疏；骨发育异常如趾畸形、髋骨发育不良、骶骨发育不良；性发育障碍如卵巢早熟性发育不足、雄性不育；易反复感染如窦炎、肺炎；免疫缺陷如体液免疫缺陷、细胞免疫缺陷；脑发育异常如脑积水、大脑额叶发育不良；认知功能变差；皮肤异常如浅褐色斑点、白癜风斑点。
特别地，本发明提供一种检测药物致癌性的方法，所述方法包括对本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代、Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物施加所述药物；和检测所述Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代、Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物中与癌症发生、发展相关的因子的水平，从而确定该药物的致癌性。
本发明还包括来自本发明提供的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物；组织或器官型切片培养物；组织外植体或器官外植体或其培养物；组织提取物或细胞提取物作为工具的用途，包括用于评定评定环境致癌因子（如电离辐射、核辐射和紫外辐射等污染物）的强度是否达到了致癌水平、分析人和鼠源Nbs1功能的一致和差异性、确定作用于NBS1p70的化合物的特异性、研究NBS1p70或其他与NBS1p70相关联细胞成分的核内转运和鉴定NBS1p70的未知配体。
本发明还提供评定环境致癌因子（如电离辐射、核辐射和紫外辐射等污染物）的强度是否达到了致癌水平的方法，所述方法包括：对本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、组织提取物或细胞提取物施与所述环境致癌因子；检测所述Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、组织提取物或细胞提取物的与癌发生相关的因子的水平；以及评价所述环境致癌因子（如电离辐射、核辐射和紫外辐射等污染物）的强度是否达到了致癌水平。
本发明构建了人源Nbs1基因中含5bp缺失突变的BAC载体，原核显微注射后，获得了人源Nbs1的表达特征与内源Nbs1一致的人源化转基因小鼠。人源NBS1p70可以在不同转基因系后代的胚胎期，成年期的胸腺、脾脏和激活的B细胞中表达。通过筛选不同的转基因系，获得了高表达和低表达人源Nbs1基因的3个稳定转基因系。在这3个稳定的转基因系中，BAC载体上同时存在的人源CALB1和DECR1基本不转录。经过表型统计发现，上述转基因小鼠在其中一个稳定低表达系中以一定比例出现了发育延迟、体长均匀缩短、骨发育异常的表型。本发明的有益结果在于：建立了一个新的NBS(奈梅亨破碎综合症)疾病小鼠模型。同时，部分功能受损的NBS1p70影响染色体的稳定性、细胞周期检测点等与癌症发生密切相关的信号通路，因此Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠为药物临床前安全性评价中的短期致癌实验提供了有潜力的替代模型，也为癌症发生机理的研究提供了有效的工具。
附图说明
图1为BAC克隆的结构示意图。表示：基因型鉴定的上下游引物所在的位置。
图2为利用rpsl-neo反向筛选系统进行两步同源重组的基本原理示意图。
图3为测序峰值结果（上）和比对结果（下），表明ACAAA5bp的缺失突变成功修饰在BAC载体上的人源Nbs1基因c.657-661位点。
图4为Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠Founder的基因型鉴定图。BAC：作为阳性对照的BAC载体DNA，G：作为阴性对照的WT C57BL/6N小鼠的基因组DNA，hNbs1-5’：引物位于人源Nbs1基因的5’端调控序列，hNbs1-3’：引物位于人源Nbs1基因的3’端调控序列，hNbs1-M：引物位于人源Nbs1基因突变位点的附近，mNbs1：引物位于内源Nbs1编码序列中。
图5为在WT C57BL/6N和Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠中，人源Nbs1及内源Nbs1在10种组织中的转录情况RT-PCR结果图。Li：肝脏，Th：胸腺，Mu：肌肉，He：心脏，Br：大脑，Lu：肺，Co：结肠，Ki：肾脏，Sp：脾脏，Te：睾丸，N：未加cDNA模板的阴性对照，hNbs1m-5：引物位于突变位点的5’端，hNbs1m-3’：引物位于突变位点的3’端，GAPDH：作为内参基因。
图6为在Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠后代的WT和转基因胎鼠中，人源NBS1p70及内源NBS1的表达情况Western blot结果图。27#F0：胎鼠为转基因27#F0与WT C57BL/6N回交第一代的阳性胚胎，10#N1：胎鼠为转基因10#N1与WT C57BL/6N回交第二代的阳性胚胎，WT：胎鼠为基因型鉴定结果为阴性的胚胎，mNbs1：内源Nbs1，hNbs1m：人源NBS1p70。
图7为在成年的WT和Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠中，人源NBS1p70及内源NBS1在胸腺（A）、脾脏（B）和激活的B细胞（C）中的表达情况Westernblot结果图。
图8为在成年WT和1个稳定高表达、2个稳定低表达的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠中，人源Nbs1及内源Nbs1的转录水平Real-time PCR结果图。20#TG：稳定高表达的转基因系，“22#TG”和“94#TG”分别代表2个稳定低表达的转基因系，WT：WT C57BL/6N小鼠作为阴性对照。
图9为在成年WT和1个稳定高表达、2个稳定低表达及1个作为阳性对照的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠中，人源CALB1和DECR1的转录情况Real-time PCR结果图。3#TG：人源CALB1和DECR1转录水平较高的阳性对照转基因系。
图10为同窝4周龄雄性WT C57BL/6N（左）和Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠（右）的发育迟缓表型的代表图。
具体实施方式
本发明的多核苷酸序列含有人的Nbs1c.657del5基因。人Nbs1基因的Genbank登陆号为NG_008860。
本文中，人Nbs1c.657del5基因指缺失cDNA第657-661位点共5个碱基（即ACAAA）的人的Nbs1基因。
本发明的多核苷酸序列为分离的多核苷酸序列。术语“分离的”意味着所指的分子从发现该分子天然存在的整个生物体中分离和分开，或基本不存在其它相同类型的生物大分子。术语“分离”对于多核苷酸序列是指一种核酸分子，它完全或部分缺乏与其天然结合的序列；或一条序列，因为它天然存在，但具有与其结合的异源序列；或从染色体分离的分子。
本发明的多核苷酸序列优选为基因载体，其含有Nbs1基因的上下游调控元件，例如，含有Nbs1及其上下游至少40kb、至少45kb、至少50kb、或至少55kb的DNA序列。通常，所述多核苷酸序列长度可在40-60kb的范围内。
本发明的基因载体可以是例如BAC载体。BAC载体可从市售途径获得，例如购自Children’s Hospital Oakland Research Institute（BACPAC Resource atCHORI）。如本文所述，可借助rpsl-neo反向筛选系统进行两步同源重组，在BAC载体上造成上述5bp的缺失，从而构建得到本发明的载体。
在一具体实施例中，载体构建可如下进行：
1．扩增含有rpsl-neo的同源片段用于反向筛选，合成含点突变的同源序列并退火获得双链；和
2．将可发挥同源重组功能的pSIM18质粒电转入BAC载体的宿主菌，然后采用rpsl-neo反向筛选系统进行两步同源重组，将5bp缺失突变制作在BAC载体的目的位置（见图1）。
此外，还可实施PCR和测序来验证所构建的BAC载体修饰是否正确，以及在已修饰好的BAC载体上随机选择10个500bp左右的片段进行测序验证BAC载体内部未发生大片段同源重组。
获得本发明的BAC载体后，可将过柱纯化。使用时可先稀释。
进行显微注射的BAC载体上除完整的Nbs1的序列外还存在CALB1和DECR1的完整序列。由于转基因在随机插入的过程中会发生断裂和部分片段的丢失，因此可通过Genotyping和Real-time PCR来筛选CALB1和DECR1未插入或基本不表达、但目的基因可表达的转基因系来进行深入研究。
阳性Founder小鼠的筛选和后代的繁殖可如下进行：
1．将本发明的BAC载体显微注射到小鼠受精卵的雄原核内，之后将体外培养到2细胞期的胚胎，移植入假孕受体输卵管内；
2．使用分别对应于位于Nbs1基因-5’、3’端调控序列和突变位点附近的3对特异性引物鉴定基因型，三阳性的小鼠称为Founder；
3．将每只Founder分别与WT C57BL/6N品系小鼠进行回交，通过基因的自由组合与分离来获得稳定表达的转基因系，即本发明的人源Nbs1c.657del5转基因小鼠。
在一具体实施例中，对应于位于Nbs1基因-5’、3’端调控序列和突变位点附近的3对特异性引物选自SEQ ID NO:27-32。
本发明也涉及SEQ ID NO:27-32和/或本文所公开的其它引物中的一条或任意多条的组合在构建、筛选和鉴别本发明的阳性Founder小鼠或在构建、筛选和鉴别本发明Nbs1c.657del5转基因小鼠及其后代中的应用。
进一步地，可采用以下的方法来分析Nbs1c.657del5转基因小鼠中人源Nbs1的转录特征及NBS1p70的表达情况：
1．分别提取WT和不同转基因系鼠中10个组织的RNA，进行RT-PCR，检测人源Nbs1在不同组织中的转录特征。
2．分别提取WT和不同转基因系的后代胎鼠蛋白，进行Western blot，检测NBS1p70在转基因小鼠胚胎期的表达情况。
3．分别提取WT和不同转基因系小鼠的胸腺，脾脏和激活的B细胞中的蛋白，进行Western blot，检测NBS1p70在成年转基因小鼠免疫器官中的表达情况。
最后，筛选人源Nbs1呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达的，稳定的Nbs1c.657del5转基因系，并对相关的表型进行统计，包括：
1．分别提取不同转基因系小鼠的RNA，反转录后进行Real-time PCR，分析并筛选出可稳定转录人源Nbs1的转基因系。
2．通过Real-time PCR检测筛选出的转基因系中，人源CALB1和DECR1的转录情况。
3．统计这几个系中，发育迟缓、体长均匀缩短、骨发育异常等NBS疾病相关症状的表型出现率。
本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠指转化了人Nbs1c.657del5基因且稳定表达人Nbs1c.657del5基因的小鼠。
本发明的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代具有以下一种或多种特征：
（1）人源Nbs1呈不同水平转录；
（2）BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达，或表达水平非常微弱，基本可忽略；
（3）具有稳定的Nbs1c.657del5转基因特征；
（4）人源Nbs1可以在胸腺、脾脏、睾丸、脑中较高水平地转录，在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠中也可以被活跃地转录，其转录特征与内源Nbs1一致，可参与到相关功能的信号通路中；
（5）NBS1p70在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺组织、脾脏组织和激活的B细胞中表达；其表达水平接近内源NBS1或高于内源NBS1的表达水平；
（6）具有发育迟缓、体长均匀缩短和骨发育异常（如上肢或下肢脚趾弯曲）的表型，与临床上NBS病人的症状类似；
（7）在长时间，例如至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间的生长期间内不发生自发肿瘤。
本发明包括本发明Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物，所述小鼠后代、其细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物的特征是人源Nbs1呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达的、以及具有稳定的Nbs1c.657del5转基因。
本发明中，来自所述Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代可以是具有分化功能的干细胞，也可以是体细胞。所述细胞培养物可以是干细胞培养物，也可以是体细胞培养物。所述组织或器官可以是各种组织器官，包括但不限于胚胎、胸腺、脾脏、睾丸、脑、肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠等。
下文将以具体实施例的方式产生本发明。应理解，除非另有说明，否则所采用的方法、条件、试剂等都是本领域常规的技术手段。
实施例
实施例1：人源BAC克隆的查询、订购和PCR鉴定。
通过搜索Ensemble Genome Browser来确定Nbs1及其上下游至少50kb的DNA序列在染色体上的区域，并将其它基因的存在降到最低，从NCBI CloneDB中筛选出编号为CH17-246C15的人源BAC克隆符合条件（见图1）。订购的BAC克隆（CHORI）保存在DH10B的宿主细胞中，以琼脂为载体邮寄过来。将该菌种划线培养，接种后扩增培养。然后使用位于c.657del5突变位点5’、3’的2对特异性引物对购回的BAC菌种进行菌液PCR鉴定，引物序列如下：
hNbs1-657tF：TGTCACCTGCCACCATATTTCTAG（SEQ ID NO：1）
hNbs1-657tR：CCGTAATCACAGCCATGATCACT（SEQ ID NO：2）
PCR扩增条件：94℃5min，35*（94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec），72℃5min，4℃保温（dNTP、Mg2+、Taq酶、10*buffer均购自博彩）。产物片段为494bp，鉴定结果表明BAC克隆正确。
实施例2：基因载体的构建
步骤一、以pRpsl-neo质粒（由南京大学模式动物研究所载体组惠赠）为模板，通过PrimeSTAR高保真性PCR（TaKaRa）获得rpsl-neo片段，其包含：1319bp的rpsl-neo，c.657del5突变位点5’端61bp同源臂（l-hm）和其3’端61bp同源臂（r-hm）。引物序列如下：
hNbs1-657hF：CTCTTGATGAACCATCTATTGGAAGTAAAAATGTTGATCTGTCAGGACGGCAGGAAAGAAAGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG（SEQ ID NO：3）
hNbs1-657hR：TTAGCTTATAACATAATTACCTGTTTGGCATTCAAAAATATAAATGTTTTCCCTTTGAAGATCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG（SEQ ID NO：4）
PCR扩增条件：95℃5min，5*（98℃15sec，55℃15sec，72℃2min），26*（98℃15sec，65℃15sec，72℃2min），72℃5min，4℃保温。产物片段为1441bp，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收（BioFlux）并确定回收产物浓度。
步骤二、人工合成携带突变的序列，其包含引入的c.657del5缺失突变、突变位点5’端51bp同源臂（l-hm）和其3’端51bp同源臂（r-hm）。合成的序列如下：
hNbs1-657mF：ACCATCTATTGGAAGTAAAAATGTTGATCTGTCAGGACGGCAGGAAAGAAATCTTCAAAGGGAAAACATTTATATTTTTGAATGCCAAACAGGTAATTATGT（SEQ ID NO：5）
hNbs1-657mR：ACATAATTACCTGTTTGGCATTCAAAAATATAAATGTTTTCCCTTTGAAGATTTCTTTCCTGCCGTCCTGACAGATCAACATTTTTACTTCCAATAGATGGT（SEQ ID NO：6）
将20ul10uM的上述序列混合，95℃变性10min，室温退火2h，形成双链。
步骤三、制作BAC宿主菌的电转感受态，转入pSIM18质粒（由南京大学模式动物研究所载体组惠赠，也可使用其它已知的用于同源重组的质粒，例如pSC101-BAD-gbaA质粒），用具有Hygromycin B（150ug/ml，溶于MilliQ水，上海生工）、Chloramphenicol（50ug/ml，溶于无水乙醇，上海生工）的LB平板筛选，并用特异性引物psim18-F/psim18-R（由南京大学模式动物研究所载体组惠赠，或可根据所使用的用于同源重组的质粒的序列设计其特异性引物）进行菌落PCR鉴定。PCR扩增条件：94℃5min，28*（94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec），72℃5min，4℃保温。产物片段约为550bp。
制作已含pSIM18质粒的BAC宿主菌电转感受态，转入rpsl-neo片段，用具有Kanamycin（50ug/ml，溶于MilliQ水，上海生工）、C+的LB平板筛选，并用特异性Nbs1-657tF/Nbs1-657tR（序列同“实施例1”）进行菌落PCR鉴定。PCR扩增条件：94℃5min，28*（94℃30sec，55℃30sec，72℃2min），72℃5min，4℃保温。产物片段为1809bp。然后将K+、C+并PCR鉴定正确的菌株在K+、Streptomycin（50ug/ml，溶于MilliQ水，上海生工）LB平板上划线验证菌株对链霉素敏感。
制作已完成第一步同源重组的BAC宿主菌电转感受态，转入携带突变的合成片段，用S+、C+抗性的LB平板筛选，并用Nbs1-657tF/Nbs1-657tR（序列同“实施例1”）进行菌落PCR鉴定。PCR扩增条件：94℃5min，28*（94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec），72℃5min，4℃保温。产物片段为490bp。然后将S+、C+并PCR鉴定正确的菌株在K+C+LB平板上划线验证菌株失去卡那霉素抗性。
将已完成第二步同源重组的菌株，用Nbs1-657tF/Nbs1-657tR（序列同“实施例1”）进行PrimeSTAR高保真性PCR。PCR扩增条件：94℃5min，35*（98℃15sec，55℃15sec，72℃30sec），72℃5min，4℃保温。回收PCR产物、送与上海invitrogen公司测序，验证BAC修饰成功（见图3）。
以上步骤的原理为利用rpsl-neo反向筛选系统进行两步同源重组（见图2）。更详细的实验操作步骤可以参考Counter-Selection BAC Modification Kit（GeneBridges）。
步骤四、将修饰正确的BAC宿主菌于37℃培养，通过菌落或菌液PCR筛选pSIM18质粒完全丢失的菌株（pSIM18质粒在30℃以上复制终止，随着分裂而丢失）。并再次测序证实在37℃培养的过程中目的位置未引入其它突变（Invitrogen，结果与图3相同）。
步骤五、获得修饰正确且完全丢失pSIM18质粒的BAC宿主菌后，随机选择10个500bp左右的片段测序，结果与NCBI的序列信息一致，表明BAC载体正确且内部未发生大片段同源重组。10对引物的序列信息如下：
步骤六、注射前准备BAC DNA。将600ml含终载体的BAC菌液过柱纯化（NucleoBond BAC100），溶解到注射溶液中（1*injection buffer），稀释使其终浓度达到1ng/μl。
PCR产物的回收、DNA片段的回收、质粒DNA的提取、感受态菌株的制备、电转等操作均按《分子克隆》第二版进行。注射溶液的配方可参考《小鼠胚胎操作手册第三版》。
实施例2：阳性Founder小鼠的筛选和稳定转基因系的建立。
步骤一、选择C57BL/6N品系的雌雄小鼠作为供体。原因在于：①能较快获得遗传背景明确的转基因系；②利于同C3H/HeJ品系杂交后获得B6C3F1的转基因系，而该品系的肿瘤发生对照数据库已被NTP（National ToxicologyProgram）建立并储存(J.K.Haseman等,1998,Toxicologic Pathology,26:428-441)。选择B6CBA F1品系的雌雄小鼠来作为受体品系。
共进行了578个受精卵的显微注射，移植了21只B6CBA F1受体雌鼠，获得了75只N0代小鼠。B6CBA F1和C57BL/6N品系的小鼠均由南京大学模式动物研究所提供，该阶段的显微注射工作由南京大学模式动物研究所转基因技术服务组完成。本实验涉及的动物操作程序已经得到南京大学模式动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准。
步骤二、鉴定N0代小鼠的基因型来筛选阳性Founder。
剪取出生后6-7d小鼠的尾尖约0.5cm，分别置于1.5ml离心管中，加入500ul组织裂解液（1%SDS、0.1mol/L NaCl、0.1mol/L EDTA pH8.0、0.05mol/LTris.HCl pH8.0、100ug/ml PK），50℃保温过夜，按《分子克隆》第二版制备基因组DNA，作为PCR模板。
用对应于hNbs1-5’端（hNbs1-G1F/R）、3’端调控序列（hNbs1-G2F/R）和c.657del5突变位点位置（hNbs1-G3F/R）的3对特异性PCR引物鉴定基因型，三阳性鼠称为Founder，并用mNbs1-G1F/R来鉴定基因组DNA的质量。引物序列如下：
hNbs1-G1F：GGTCCACCGAACACATAGACTTACG（SEQ ID NO：27）
hNbs1-G1R：AAGGGAGCCAAAAAGAAAGCAC（SEQ ID NO：28）
hNbs1-G2F：CCCCTTTTTGGTGGTCTTACTGAG（SEQ ID NO：29）
hNbs1-G2R：TGACTGGAACTCCCTTCTTGCTG（SEQ ID NO：30）
hNbs1-G3F：GTGTCACCTGCCACCATATTTCTAG（SEQ ID NO：31）
hNbs1-G3R：CCGTAATCACAGCCATGATCACT（SEQ ID NO：32）
mNbs1-G1F：ACCTGTGTGCATATATATGTGGAGGT（SEQ ID NO：33）
mNbs1-G1R：CCACAAGGTACTGCATATTGGCT（SEQ ID NO：34）
PCR扩增条件：94℃5min，35*（94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec），72℃5min，4℃保温。通过两次重复实验，筛选出9只Founder，编号为18、19、27、37、61、66、68、69、70（PCR结果见图4）。转基因Founder的阳性率为12%。并对所获得的9只Founder进行测序验证（Invitrogen，结果与图3相同）。其中69#Founder和66#Founder分别由于哺乳期营养供给不足导致极度瘦弱和牙长无法进食分别于22天和8个月时死亡。
步骤三、建立稳定的转基因系。
根据染色体的自由组合与分离定律，为建立稳定的转基因系，需将8只Founder分别与WT C57BL/6N回交，来获得具备稳定遗传特点的N1代阳性小鼠，并将N1代阳性小鼠继续与WT C57BL/6N回交，获得可用于保存品系的N2代阳性小鼠。共获得18个可稳定遗传的转基因系（18#4个、19#2个、27#2个、37#2个、61#1个、66#1个、68#3个和70#3个）。
实施例3：分析Nbs1c.657del5转基因小鼠中人源Nbs1的转录特征。
步骤一、不同组织RNA的提取与反转。
处死8周的小鼠，迅速取10种组织（结肠、肝脏、脾脏、心脏、肌肉、肾脏、脑、睾丸、肺脏、胸腺）分别置于500ul RNAiso Plus（TaKaRa）中，用已被0.5M NaOH溶液中处理过的组织匀浆器（PT2100，Kinematica）快速匀浆。匀浆物用1/5体积的氯仿提取，然后加等体积的异丙醇沉淀总RNA，75%的乙醇清洗沉淀后，将其溶解在DEPC-H2O中。随后测定OD值并校正，用RT reagent Kit（TaKaRa）逆转录1ug RNA，得到cDNA。
步骤二、RT-PCR检测人源Nbs1的转录特点。
以cDNA为模板，用分别位于c.657del5突变位点5’端、3’端的2对特异性引物进行PCR反应，并用GAPDH为内参进行校正。引物序列如下：
hNbs1-RT1F：TACTGAATTCCTGAAAGCAGTTGAGTC（SEQ ID NO：35）
hNbs1-RT1R：TGAGGATCACAGTAATTCTTTGTAGTCATG（SEQ IDNO：36）
hNbs1-RT2F：CAATGACAAACTTCAGGATGATAGTGAG（SEQ ID NO：37）
hNbs1-RT2R：GCCATAAAACATTGTAACTTAAATCGC（SEQ ID NO：38）
GAPDH-RTF：AACGGGAAGCCCATCACC（SEQ ID NO：39）
GAPDH-RTR：CAGCCTTGGCAGCACCAG（SEQ ID NO：40）
PCR扩增条件：94℃5min，30*（94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec），72℃5min，4℃保温。结果见图5。通过2次独立的实验表明：人源Nbs1可以在胸腺、脾脏、睾丸、脑中较高水平地转录；此外在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠中也可以被活跃地转录。与已报道的内源性Nbs1的转录特征一致，表明人源Nbs1可以被正常转录，并暗示人源Nbs1可参与到相关功能的信号通路中。
实施例4：分析NBS1p70在胚胎期和成年期阳性转基因鼠中的表达情况。
步骤一、提取来自不同转基因系的胎鼠、胸腺、脾脏蛋白并进行Westernblot。
取来自2个阳性转基因系13.5-15.5的胚胎，去除四肢、尾、内脏和头部，将躯干分别置于1ml裂解缓冲液中（50mM Tris.HCl pH8.0，150mM NaCl，0.1mM EDTA，2mM PMSF，1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠，1%NP-40，1mM DTT，1mM Na3VO4，50mM NaF，100*蛋白酶抑制剂，获自Sigma公司），迅速用匀浆器匀浆，4℃翻转振摇30min，离心取上清，用BCA法测浓度，稀释调整浓度到一致。然后将6*载样缓冲液加到上清中，100℃煮沸5min使蛋白变性。
在8%的聚丙烯酰胺凝胶上分离100-200ug样品。然后将蛋白质转移到PVDF（BioTrace）膜上，5%的脱脂牛奶（BD）中封闭1小时，洗膜后，与一抗在4℃孵育过夜（GAPDH1：3000，Santa Cruz；β-actin1：10000，Sigma；hNbs11:250，Novus；mNbs11:1500，Novus）。充分洗膜，加二抗（anti-MouseIgG1:10000，Pierce；anti-Rabbit IgG1:10000，Bioworld Tec.），室温孵育1小时，再次洗涤后，将膜放入ECL（Sigma）中，随后暴露于x射线胶片（Kodak）。结果见图6。
8周龄1#、24#转基因小鼠及WT C57BL/6N小鼠的胸腺蛋白，11周3#、8#、13#转基因小鼠及WT C57BL/6N小鼠的脾脏蛋白提取方法和Western blot步骤与上述相同。结果见图7A和图7B。
步骤二、收集转基因和WT C57BL/6N小鼠激活的B细胞，并进行Westernblot。
取8周龄转基因小鼠和WT C57BL/6N小鼠的脾脏，使用cell strainer（70um，Fisher）将其分别处理成无红细胞的单细胞悬液后，用已加20ug/ml LPS（Sigma）的RPMI-1640（GIBCO）培养基（10%FBS，Hyclone）激活培养72hr，收集细胞，加200ul裂解缓冲液于冰上裂解15min后，提取蛋白。并进行Western blot（步骤与上述相同）。结果见图7C。
分析结果表明NBS1p70可在不同转基因系的胚胎期，成年期的胸腺组织、脾脏组织和激活的B细胞中表达；其表达水平接近内源NBS1，并甚至在10#（胎鼠）、3#（脾脏）、8#（脾脏）、24#（胸腺）转基因小鼠和激活的转基因B细胞中高于内源NBS1的表达水平。暗示人源NBS1p70在胎鼠和成年鼠的免疫器官中可代替部分内源的NBS1蛋白，影响DNA DSB引起的同源重组修复、非同源重组末端连接或细胞周期检测点等功能的正常发挥。
实施例5：筛选人源Nbs1呈不同水平转录的稳定转基因系。
按照实施例3的步骤一提取20#、22#、94#转基因和阴性对照WT C57BL/6N小鼠的肾脏RNA，逆转录得到cDNA。以cDNA为模板，用分别位于人源Nbs1和内源Nbs1编码序列的2对特异性引物进行实时定量PCR反应（PremixEx TaqTM II，TaKaRa），以36B4为内参进行校正。引物序列如下：
hNbs1-re2F：TGGATATGCTCCAAAGGCAAGGTCT（SEQ ID NO：41）
hNbs1-re2R：TCACTGGGGCGCTTGGCATT（SEQ ID NO：42）
mNbs1-re1F：GTTGTTGGGAGGAAAAACTGTGG（SEQ ID NO：43）
mNbs1-re1R：GTAGGAATTTCATCTGTTTGACTCAAAC（SEQ ID NO：44）
36B4-reFP：AGATTCGGGATATGCTGTTGGC（SEQ ID NO：45）
36B4-reRP：TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC（SEQ ID NO：46）
Real-time PCR扩增条件：95℃30sec，40*（95℃5sec，60℃31sec），95℃15sec，60℃1min，95℃15sec（ABI7300）。2次独立实验的结果见图8。分析结果表明，20#转基因系为稳定高表达系，22#和94#转基因系为稳定低表达系。并且在20#转基因系小鼠中内源Nbs1的表达量与WT相比有一定程度地下降（虽然经统计学分析无显著性差异），说明在稳定高表达系中人源Nbs1的表达影响了部分内源Nbs1的正常表达。
实施例6：检测已筛选出的3个稳定Nbs1c.657del5转基因系中，人源CALB1和DECR1的表达情况。
按照实施例3的步骤一提取3#（人源CALB1和人源DECR1高水平转录的阳性对照）、20#、22#、94#转基因和阴性对照WT C57BL/6N小鼠的肾脏RNA，逆转录得到cDNA。以cDNA为模板，用分别位于人源CALB1和DECR1编码序列的2对特异性引物进行实时定量PCR反应（Premix Ex TaqTMII，TaKaRa），以36B4为内参进行校正（引物序列与“实施例5”相同）。引物序列如下：
hCALB1-re1F：TCCAGGGAATCAAAATGTGTGG（SEQ ID NO：47）
hCALB1-re1R：GCACAGATCCTTCAGTAAAGCA（SEQ ID NO：48）
hDECR1-re1F：TCTTCAAAAAGCGATGCTACCA（SEQ ID NO：49）
hDECR1-re1R：ACATCCATCTTCCGGCTGGCTAT（SEQ ID NO：50）
Real-time PCR扩增条件：95℃30sec，40*（95℃5sec，60℃31sec），95℃15sec，60℃1min，95℃15sec（ABI7300）。2次独立实验的结果见图9。在20#、22#和94#转基因系中，人源CALB1基本不表达；22#转基因系不表达人源DECR1，虽可以检测到20#和94#转基因系有DECR1的表达，但是与其它转基因系相比（如3#）其人源DECR1的表达水平非常微弱，基本可忽略。
实施例7：统计分析与NBS（奈梅亨破碎综合症）疾病的相关表型。
通过统计发现，在94#转基因系的Nbs1c.657del5转基因阳性小鼠中，有27.3%的小鼠出现发育迟缓、体长均匀缩短（见图10）和骨发育异常（如上肢或下肢脚趾弯曲）的表型。与临床上NBS病人的症状类似。说明该Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠可作为一种新的NBS（奈梅亨破碎综合症）疾病模型用于致病机理和药物筛选等方面的研究。通过观察9个月Nbs1c.657del5转基因小鼠的生长状况，未发现自发肿瘤的发生，说明该Nbs1c657del5人源化小鼠模型具有自发肿瘤率低的优点，减少该人源化转基因模型在未来应用于临床前安全性评价中短期致癌实验时假阳性的概率。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列含有人Nbs1及其上下游长40－60kb的序列，其中，所述人Nbs1基因为人Nbs1c.657del5基因。
2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列为BAC载体。
3.权利要求1或2所述的多核苷酸序列在制备构建Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代用的物质中的用途。
4.一种细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、或组织提取物或细胞提取物，其特征在于，
所述细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物来自经权利要求2所述的BAC载体转基因的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代；和
所述细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、和组织提取物或细胞提取物的特征是人源Nbs1呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达的、以及具有稳定的Nbs1c.657del5转基因。
5.如权利要求4所述的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、或组织提取物或细胞提取物，其特征在于，所述Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠或其后代具有以下一种或多种特征：
（1）人源Nbs1呈不同水平转录；
（2）BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达，或表达水平非常微弱，基本可忽略；
（3）具有稳定的Nbs1c.657del5转基因特征；
（4）人源Nbs1在胸腺、脾脏、睾丸、脑中高水平地转录，在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、肺脏和结肠中被活跃地转录，其转录特征与内源Nbs1一致，参与到相关功能的信号通路中；
（5）NBS1p70在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺组织、脾脏组织和激活的B细胞中表达；其表达水平接近内源NBS1或高于内源NBS1的表达水平；
（6）具有发育迟缓、体长均匀缩短和骨发育异常（如上肢或下肢脚趾弯曲）的表型，与临床上NBS病人的症状类似；和
（7）在至少12个月的生长期间内不发生自发肿瘤。
6.权利要求4或5所述的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、或组织提取物或细胞提取物的用途，包括用于检测化合物在如下实验或疾病中的效果或用来研究可诱发下述疾病化合物的敏感性，
其中，所述实验选自：药物临床前安全性评价；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的广泛性检测；双链断裂修复失常与癌症或其它相关疾病发生的关系研究；免疫毒理学实验；
所述疾病选自：发育障碍，如头小畸形、发育迟缓；面部特征异常，如前额退化、下颌骨退化、耳大、头发稀疏；骨发育异常，如趾畸形、髋骨发育不良、骶骨发育不良；性发育障碍，如卵巢早熟性发育不足、雄性不育；易反复感染，如窦炎、肺炎；免疫缺陷，如体液免疫缺陷、细胞免疫缺陷；脑发育异常，如脑积水、大脑额叶发育不良；认知功能变差；皮肤异常，如浅褐色斑点、白癜风斑点。
7.权利要求4或5所述的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官型切片培养物、组织外植体或器官外植体或其培养物、或组织提取物或细胞提取物的用途，包括用于评定环境致癌因子（如电离辐射、核辐射和紫外辐射等污染物）的强度是否达到了致癌水平、分析人和鼠源Nbs1功能的一致和差异性、确定作用于NBS1p70的化合物的特异性、研究NBS1p70或其他与NBS1p70相关联细胞成分的核内转运和鉴定NBS1p70的未知配体。
8.一种构建小鼠模型的方法，所述方法包括：
（1）将权利要求2所述的BAC载体显微注射到小鼠受精卵的雄原核内，体外培育该受精卵至2细胞期后，移植入假孕受体输卵管内，获得Nbs1基因5’、3’端调控序列以及突变位点均为阳性的子代小鼠；和
（2）将步骤（1）所得的子代小鼠分别与WT C57BL/6N品系小鼠进行回交，通过基因的自由组合与分离来获得稳定表达的转基因系。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：筛选人源Nbs1呈不同水平转录的、且BAC载体上同时存在的CALB1和DECR1基本不表达的、稳定的Nbs1c.657del5转基因系。
10.采用权利要求8或9所述的方法构建得到的Nbs1c.657del5人源化转基因小鼠及其后代。
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