CN109207521B - 人GDNF基因在牛β-casein基因座定位整合的载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了人GDNF基因在牛β‑casein基因座上定位整合的打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体。打靶载体是基于同源重组原理设计的，包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与牛β‑casein基因的5′同源臂和3′同源臂相连，人GDNF cDNA基因位于5′同源臂下游；CRISPR/Cas9表达载体，用于特异性地断裂打靶位点序列，包括引导序列sgRNA、Cas9蛋白序列和CRISPR结构序列。本发明还提供了所述载体用于获得人GDNF cDNA基因在牛β‑casein基因座上定位整合的牛胎儿成纤维细胞的应用。

Description

人GDNF基因在牛β-casein基因座定位整合的载体及其应用
技术领域
本发明涉及动物乳腺生物反应器，具体地说，涉及人GDNF基因在牛β-casein基因座定位整合的打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体及其在制备高效表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。
背景技术
众所周知，帕金森综合症(PD)是一种多巴胺能神经元退行性疾病，在中老年人群中发病率逐年升高，其特点是黑质多巴胺能神经元(DN)的损伤或丧失导致黑质纹状体内多巴胺含量下降，大部分是自发性的，还有些是环境毒性导致的脑损伤。然而，尽管有许多药物能够在一定程度上缓解PD的症状，但是，在帕金森病的治疗上效果仍然不是很明显，不仅不能根治，而且还对患者机体本身具有很大的副作用。最新的治疗PD的研究方案大多是提高多巴胺能神经元的存活率或者修复已损伤的多巴胺能神经元；研究发现，胶质细胞源性神经营养因子(本文简称“GDNF”)是一种强效的，相对特异的DN保护因子，能够很好的促进多巴胺能神经元的生长。
GDNF由Lin等在1993年从大鼠B49胶质瘤细胞中分离、纯化并成功克隆的一种神经营养因子，能特异地维持中脑多巴胺能神经元的存活和分化。GDNF是TGF-β超家族中一员，基因位于人染色体5p12-13.1区域，全长30kb，有三个外显子和两个内含子，表达出的GDNF蛋白是一种由211个氨基酸残基构成的前体合成的、典型的具有生物活性的分泌蛋白。GDNF营养神经作用的分子机理是通过与胶质细胞源性神经营养因子受体alpha(GFRαs)和受体酪氨酸激酶(RET)这两类受体亚基形成复合物后引起下游信号转导来介导的。GDNF蛋白在PD治疗上已进入二期临床研究。2006年，Lang等在利用重组人GDNF蛋白对PD患者进行为期六个月的临床治疗试验，但是，试验结果并不能有效的证明重组人GDNF蛋白对PD患者有效，并且治疗组患者还产生了一些不良反应，如：出现头疼、感觉异常等。同年，Slevin等改善药物输入方式和持续高剂量给药，一期试验中，向10例PD患者单侧壳核注入GDNF并持续6个月，PD患者的运动功能有明显改善，随后进入二期临床试验，在二期临床过程中有1例患者出现感染，7例患者体内产生抗体，随后终止临床试验，但是，GDNF在患者身上仍能表现出一定的疗效。直到2013年Patel等对单个病例进行观察研究，患者接受颅内壳核后背部注射GDNF，双侧壳核每天注射GDNF 14～43mg，持续39个月；在终止GDNF注射后36个月，患者的味觉嗅觉和性功能均有所改善，而且，没有发现副作用，表明GDNF对PD患者治疗安全有效，并有持续作用。在实验室的PD老鼠模型中，将GDNF转运到纹状体或黑质中，来保护多巴胺能神经元免受毒性损伤、修复已经损伤的多巴胺能神经元和促进运动功能的恢复。这种蛋白的研究使用，开辟了治疗PD的新的前景。
但是，GDNF在人和动物体内含量很低，从动物体中提取用于临床研究是不现实的，用转基因细胞生产，效率低，成本高，生产这种具有生物活性的糖基化蛋白不容易。现在合成蛋白质的方法主要有：化学合成法、组织提取法、微生物发酵法、哺乳动物细胞表达法、动物乳腺生物反应器制备等，其中化学合成法不能合成出具有生物活性的蛋白，而且副产物很多，不利于GDNF蛋白的体外合成；组织提取法、微生物发酵法、哺乳动物细胞表达法、不能大批量制备安全的、有生物活性的糖基化的GDNF蛋白；而动物乳腺生物反应器具有很多其他方法所不具备的优点，如：生产成本低、周期短，产品质量高、易纯化，产品活性高、无污染，外源基因在动物体内可稳定遗传、翻译后加工等。故选用动物乳腺生物反应器制备具有生物活性的糖基化GDNF蛋白是一种理想的方法。
动物乳腺生物反应器是乳汁中含有表达产物的转基因哺乳动物的总称；外源基因随机整合到细胞基因组中，并利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达。但是，这种利用转基因动物生产蛋白质，基因表达效率低和表达受位置效应影响等问题一直是制约动物乳腺生物反应器研究与产业化的主要因素。
基因打靶技术是用含已知序列的外源DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或非常相近的基因发生同源重组，定点整合到受体细胞基因组中并使该基因表达缺失或表达一种外源基因。该技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术、同源重组技术和转基因技术基础之上，并随着体外核移植技术的发展而进一步发展。但是，干细胞(ES)的基因打靶得到的动物存在生殖嵌合效应，这就把研究者们的目光转向了体细胞的基因打靶。体细胞基因打靶与核移植技术相结合的转基因方法对常规体外培养的体细胞进行基因打靶，有效解决外源基因表达受位置效应影响这一技术难题。
CN101851639A公开了一种采用同源重组的方法，将目的基因GDNF cDNA定位整合到牛β-casein基因启动子的下游，借助牛β-casein基因天然启动子使得目的基因高效表达，从而获得人GDNF基因在牛β-casein基因座上定位整合的克隆囊胚。该打靶方法较传统方法提高了打靶效率，但仍然偏低，相对打靶效率为0.65％。
体细胞基因打靶虽然能够解决位置效应，但打靶效率极低。研究发现，体细胞基因打靶的效率较干细胞低两个数量级，并且同源重组的效率远低于非同源末端连接的效率，这就使得在对体细胞进行基因打靶异常困难。传统的基因打靶效率低，一般在1×10-6以下，特别是对于没有干细胞建系的大型的哺乳动物效率更低，所以，自然条件下的基因打靶很难成功的实现。直到研究发现，DNA断裂可以提高基因打靶效率；而人工核酸酶能够按照研究者的意愿对DNA进行靶向切割，并在此特异位点产生一个DNA双链切口，而后由细胞固有的DNA修复机制通过同源重组修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)将切口修复，基于人工核酸酶介导的同源重组能够使基因打靶效率提高3～5个数量级，而且具有极高的特异性。目前应用最为广泛的CRISPR/Cas9能够高效的对靶基因进行切割，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，利用这种识别切割靶序列的人工核酸酶来介导基因打靶，就可以解决体细胞基因打靶存在的低效率的问题。为动物乳腺生物反应器制备具有生物活性的糖基化GDNF蛋白奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供人GDNF基因在牛β-casein基因座上定位整合载体，含有打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体。
本发明的另一目的是提供上述载体在制备表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。
为了实现本发明目的，本发明的人GDNF基因在牛β-casein基因座的定位整合的打靶载体是基于同源重组原理设计的，包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与牛β-casein基因的5′同源臂和3′同源臂相连，人GDNF cDNA基因位于5′同源臂下游；CRISPR/Cas9表达载体，用于特异性地断裂打靶位点序列，包括引导序列sgRNA、Cas9蛋白序列和CRISPR结构序列。
前述的打靶载体，其中所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶的基因，即neo基因。
前述的打靶载体，其中所述重组酶识别序列为Cre酶识别序列。
前述的打靶载体，其中扩增所述牛β-casein基因5′同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGGCCCGTGTGTCAAGAGATTGTGATGG-3'，下游引物5'-CATCTCGAGCAAGTCCTGGGAATGGGAAGATG-3'。
前述的打靶载体，其中扩增所述牛β-casein基因3'同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGATCCGGTCCTCATCCTTGCCTGC-3'和下游引物5'-GCTGGATCCGCTCCTCCTCTATGGGATTTTCC-3'。
前述的CRISPR/Cas9表达载体，其中sgRNA的靶基因位点在牛β-casein基因座第二外显子处，其靶位点序列为：CCAGGAATTGAGAGCCATGAAGG。
所述人GDNF基因在牛β-casein基因座上定位整合的打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体在基因打靶中的应用。
所述人GDNF基因在牛β-casein基因座上定位整合的打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体在制备表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(1)本发明采用同源重组的方法，将目的基因GDNF cDNA定位整合到牛β-casein基因启动子的下游，借助牛β-casein基因天然启动子使得目的基因高效表达。
(2)采用本发明方法制备得到的乳腺生物反应器能够在乳腺上皮细胞中高效表达具有生物学活性的、糖基化的人GDNF蛋白因子。
(3)采用CRISPR/Cas9介导的基因打靶方法，较传统的体细胞基因打靶方法，能够显著提高基因打靶效率。
(4)本发明利用家畜动物乳腺生物反应器生产药用蛋白具有以下优点：乳腺可以不断分泌奶汁，长期收集不会对动物造成伤害；对动物的生理活动影响小，药物蛋白限制在乳腺内生产，分泌到乳汁中，不会进入血液，不会对转基因动物的正常生理活动造成影响；生物活性高，家畜乳腺可对表达的蛋白质进行糖基化、酯化、磷酸化和形成多聚体等一系列翻译后加工，产品接近天然提取物，活性高，不易产生抗药性；产量大，易提纯；设备简单，无环境污染；开发周期短；生产成本低。
(5)与传统的基因随机整合方法制备乳腺生物反应器不同，其外源基因的表达调控易受到整合部位邻近的DNA序列影响，表达水平差异大且大多停留在较低水平；本发明采用基因打靶方法制备的转基因动物外源基因定位表达不受位置效应影响，能够显著提高表达水平。
附图说明
图1为为人gdnf在牛β-casein基因座定位整合原理图；
图2为实验流程图；
图3为牛基因电泳图，基中1代表500bp DNA Ladder Marker，2、3.代表牛基因组DNA>21kb；
图4为5’arm和3’arm PCR电泳图，其中，1.表示5’arm，2表示3’arm，3表示D15000bpDNA Ladder Marker；
图5为pJET-5’arm质粒酶切图，其中1表示1kb DNA Ladder Marker，2表示5’armPCR产物对照，3表示pJET-5’arm质粒XhoⅠ单酶切，4表示pJET-5’arm质粒XhoⅠ、ApaI双酶切，5表示pJET-5’arm质粒；
图6为pJET-3’arm质粒酶切图，其中，1表示1kb DNA Ladder Marker，2表示pJET-3’arm质粒，3表示3’arm PCR产物对照，4表示pJET-3’arm质粒BamHⅠ单酶切；
图7为pJET-5’arm-gdnf质粒酶切图，其中，1表示1kb DNA Ladder Marker，表示.pJET-5’arm-gdnf质粒，3表示pJET-5’arm-gdnf质粒反向插入时ApaI和EcoRI双酶切，4表示pJET-5’arm-gdnf质粒正向插入时ApaI和EcoRI双酶切；
图8为pJET-5’arm-gdnf质粒酶切图，其中，1表示pJET-5’arm-gdnf质粒，2表示pJET-5’arm-gdnf质粒ApaI单酶切，3表示pJET-5’arm-gdnf质粒XhoⅠ单酶切，4表示pJET-5’arm-gdnf质粒XhoⅠ、ApaI双酶切；
图9为pP40-3’arm质粒酶切图，其中，1表示1kb DNA Marker，2表示pP40质粒，3表示pP40-3’arm质粒，4表示pP40-3’arm质粒XbaⅠ单酶切，5表示pP40-3’arm质粒BamHⅠ单酶切；
图10为pP40-3’arm质粒酶切图，1表示500bp DNA Marker，2表示pP40-3’arm质粒MunⅠ单酶切；
图11为pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒酶切图，1表示D15000DNA Marker，2表示pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒，3表示pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒XhoⅠ单酶切，4表示pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒BamHⅠ单酶切，5表示pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒XhoⅠ、ApaⅠ双酶切；
图12为pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒图；
图13为CRISPR/Cas9质粒图谱；
图14为牛胎儿成纤维细胞体外培养图，其中：A：组织块培养1d，已有少量成纤维细胞细胞迁出，B：组织块培养2d，组织块周围已有均匀的成纤维细胞生长；CDE：组织块培养3～5d，成纤维细胞生长旺盛，D：组织块培养6d，各组织块周围的成纤维细胞已生长至完全汇合，G：传8代后细胞形态；
图15为牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418的耐受性检测分析图；
图16为CRISPR/Cas9质粒在牛胎儿成纤维细胞的转染图，A:10倍镜下相差显微镜，B:10倍镜下荧光显微镜；
图17为T7核酸内切酶I酶切图，1表示100bp DNA Marker，2表示T7核酸内切酶I酶切产物，3表示PCR产物对照；
图18为打靶细胞克隆的筛选图，A-1为10倍相差显微镜下细胞，A-2为10倍荧光下荧光细胞，B-1为4倍相差显微镜下单克隆细胞，B-2为4倍相差显微镜下单克隆细胞，C为冻存前的24孔板中细胞的形态；
图19为5’arm PCR鉴定图，1表示14EcoRI/HindⅢDNA Marker，2-13表示5’arm PCR产物；
图20为3’arm PCR鉴定图，1和14表示EcoRI/HindⅢDNA Marker，2-13表示3’armPCR产物。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐明和理解本发明的实质，但不以此限制本发明的范围。
实验材料和方法
实验材料
主要实验仪器-80℃超低温冰箱Thermo Scientific 88000CO2细胞培养箱(Thermo Scientific)、超纯水仪(Thermo Scientific)、高速离心机(EppendorfCentrifge)、pH计(Mettler Toledo)、三孔电热恒温水槽(北京百晶生物技术有限公司)、PCR仪器(TECHNE，TC-5000)、压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司)、凝胶成像仪(Tanon-4200)、涡旋仪(北京六一仪器厂)、电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、磁力搅拌器(北京六一仪器厂)、微波炉(美的)、恒流电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-2c)、高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司，TGL-16M)、恒温培养摇床(上海新苗医疗器械制造有限公司，QYC-200)、超净工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司)电子天平(Sartorius CE15)电转仪(Bio-Rad)倒置显微镜(Nikon C-SHG1)细菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
实验试剂：
溴酚蓝(Sigma公司)、甘油(重庆化学试剂厂)、无水氯化钙(天津凯通化学试剂有限公司)、引物(上海生物工程技术有限公司合成)、异丙醇(重庆化学试剂厂)、无水乙醇(重庆化学试剂厂)、EDTA(Sigma公司)十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma公司)、异戊醇(重庆化学试剂厂)、氯仿(重庆化学试剂厂)、Tris饱和酚(Sigma公司)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)、氢氧化钠(西陇化工有限公司)、Tri碱(Sigma公司)、氯化钠(西陇化工有限公司)、琼脂粉(Sigma公司)、酵母提取物(Sigma公司)、盐酸(重庆化学试剂厂)、琼脂糖(Biowest)核酸染色剂(GoldView)、蛋白酶K(天根生化科技有限公司)、核酸酶(Rnase)(ThermoScientific)、限制性内切酶ApaⅠ(Thermo Scientific)、限制性内切酶XhoⅠ(ThermoScientific)、限制性内切酶BamHⅠ(Thermo Scientific)、限制性内切酶EcoRⅠ(ThermoScientific)、限制性内切酶DpnⅠ(Thermo Scientific)、dNTP(天根生化科技有限公司)、T4DNA Ligase(Thermo Scientific)、EcoRⅠ+HindⅢLambda DNA Marker(Fermentas)、D15000DNA Marker(天根生化科技有限公司)、500bp DNA Marker(Thermo Scientific)、100bp DNA Marker(Thermo Scientific)、2×Pfu MasterMix(天根生化科技有限公司)、Fast HiFidelity PCR Kit(天根生化科技有限公司)、DreamTaq DNA Polymerase(Fermentas)GeneJET PCR纯化试剂盒(Thermo Scientific)、血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)、去内毒素质粒大提试剂盒(天根生化科技有限公司)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)、质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)标准胎牛血清(FBS)(天津灝洋生物制品科技有限责任公司)、DMEM/F12(ThermoScientific)、DPBS(Thermo Scientific)。
实验菌株：
胚胎和质粒(来自内蒙古包头市北沙梁屠宰场和呼和浩特市回民区屠宰场)；pJET1.2/blunt Cloning Vector质粒(Thermo Scientific)，pGDNF-EGFP载体质粒(本实验室保存)，pPGK-SV40质粒(本实验室保存)；大肠杆菌(本实验室保存)。
主要溶液的配制：
1)、液体LB培养基酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，NaCl 10g，溶于800mL去离子水中，调pH至7.0，定容1000mL，高压灭菌，4℃保存备用；
2)、固体LB培养基酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂粉15g，溶于800mL去离子水中，调pH至7.0，定容1000mL，高压灭菌，4℃保存备用；
3)、细胞总DNA抽提缓冲液10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，0.1mmol/L EDTA(pH8.0)，20μg/mL胰蛋白酶，0.5％SDS；
4)、1M Tris-HCl(pH8.0)121.1g Tris-base置于1L烧，加入约800mL的去离子水，40mL浓HCl，充分搅拌溶解，定容至1000mL，调节pH到8.0高温高压灭菌后，室温保存；
5)、10×TE缓冲液100mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)；
6)、电泳缓冲液的配制(1)50×TAE盐酸缓冲液的配制Tris-base 242g，冰醋酸57.1mL，EDTA 18.612g，加入800mL去离子水充分搅拌溶解，加入57.1mL醋酸充分混匀，加去离子水定容至1L室温保存(2)1×TAE盐酸缓冲液的配制50×TAE盐酸缓冲液20mL，用菌水无去离子水定容至1000mL，室温保存备；
7)、CaCl2(0.1mol/L)称取无水CaCl2 1.1g溶于90mL去离子水，定容至100mL，高压灭菌后，4℃保存备用；
8)、EDTA(0.5mol/L，pH 8.0)称取186.1g EDTA-Na·2H2O，加入800mL去离子水，用磁力搅拌器搅拌，用NaOH调节pH到8.0，再用去离子水定容至1L，灭菌后室温保存；
9)、10N NaOH(10mol/L)400g NaOH颗粒慢慢加入到800mL水中(边加边搅拌)，溶解后定容至1L，室温保存；
10)、10％SDS 100g SDS溶于900mL水中，加热至68℃，并用磁力搅拌器搅拌溶剂，调节pH至7.2，定容至1L，室温保存；
11)、50％甘油50mL丙三醇，50mL去离子水，混合后，高压灭菌，-20℃保存；
12)、Amp(100mg/mL)在无菌小烧杯中称取2g Ampicillin，在无菌环境中加入20mL无菌去离子水，轻轻摇匀，待彻底溶解后，1m每份分装在1.5mL的EP无菌管中，-20℃保存；
13)、琼脂糖凝胶(1)0.8％琼脂糖凝胶称取0.28g琼脂糖粉末，置于锥形瓶中，加入35mL新配置的1×TAE盐酸缓冲液，煮沸完全溶解后，待胶液约70℃，加入核酸染料3.5μL，混匀，倒入安置好的胶槽中，冷却凝固。(2)2.0％琼脂糖凝胶称取0.7g琼脂糖粉末，置于锥形瓶中，加入35mL新配置的1×TAE盐酸缓冲液，煮沸完全溶解后，待胶液约70℃，加入核酸染料3.5μL，混匀，倒入安置好的胶槽中，冷却凝固。
CaCl2法制备大肠杆：
CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞：(1)在新鲜的LB固体培养基上挑取一个单菌落，接种在含有3mL LB培养基的大试管中，至于恒温摇床中，37℃培养12-16小时。(2)于含有50mL的LB液体培养基的250mL锥形瓶中，加入过夜培养的菌液500μL，于恒温摇床中，37℃培养2小时。(3)取出锥形瓶，置于冰面上10min，再转移至50mL离心管中，4℃，3000g离心10min，弃上清。(4)用少量冰冷的0.1M CaCl2洗去残留上清，再加入20mL的0.1M CaCl2，轻轻吹打，重悬细菌，冰浴30min。(5)4℃，2800g离心10min，小心弃上清。(6)加入1.4mL冰冷的0.1M CaCl2，轻轻吹打悬浮细胞，冰浴5min。(7)向溶液中加入50％的甘油，使得甘油终浓度为10％。混匀后，100μL体系分装在1.5mLEP管中，4℃过夜保存，再置于-80℃保存。
实施例1 CRISPR/Cas9介导的人GDNF基因在牛β-casein基因座上的定位整合(整合原理见图1，实验流程见图2)
1、基因组DNA的提取
在内蒙古包头市当地屠宰场取新鲜黑白花奶牛血于EDTA抗凝剂管中，混匀，带回实验室，用血液基因组DNA提取试剂盒提取牛基因组DNA，步骤如下：
(1)取血液500μL，加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，11500g离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，再加入200μL缓冲液GS，悬浮沉淀，再加入4μL RNase A(100mg/mL)溶液，震荡混匀。
(2)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃水浴10min，期间颠倒混匀，直至溶液变得清亮。
(4)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可出现絮状沉淀。
(5)将步骤(4)中的溶液加入吸附柱CB3中，13400g离心30sec，倒掉废液。
(6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，13400g离心30sec，倒掉废液。
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，13400g离心30sec，倒掉废液。
(8)重复步骤(7)。
(9)13400g离心2min，倒掉废液，将吸附柱至室温干燥2-5min。
(10)将吸附柱转入1.5mL离心管中，向吸附柱中加入50-200μL洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，13400g离心2min，收集离心管中溶液。将提取好的牛基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检查基因组的大小和完整性，-20℃保存。
2、5’arm和3’arm目的基因片段的获取
根据GenBank牛β-casein基因序列，设计出5’arm和3’arm同源臂扩增引物，5’arm同源臂上游引物：
5'-ATTGGGCCCGTGTGTCAAGAGATTGTGATGG-3'，设计了ApaⅠ酶切位点；下游引物：5'-CATCTCGAGCAAGTCCTGGGAATGGGAAGATG-3'，设计了XhoⅠ酶切位点。3’arm同源臂的上游引物为：5'-ATTGGATCCGGTCCTCATCCTTGCCTGC-3'，下游引物为：5'-GCTGGATCCGCTCCTCCTCTATGGGATTTTCC-3'，上下游均设计了BamHⅠ酶切位点。以基因组DNA为模板，用Dream Taq DNA聚合酶扩增5’arm和3’arm同源臂。反应体系如表1所示。
表1 5’arm和3’arm PCR体系
Figure BDA0001819844970000111
加样后混匀，再进行PCR，5’arm同源臂PCR反应条件为：变性95℃30sec，复性64℃30sec，延伸72℃90sec，共35循环。3’arm同源臂PCR反应条件为：变性95℃30sec，复性62℃30sec，延伸72℃90sec，共35循环。分别切胶回收，得到5’arm和3’arm同源臂，再进行测序，-20℃保存。
3基因打靶载体的构建
3.1pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒载体的构建
pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒连接，将纯化后的5’arm和3’arm同源臂分别按如下体系和条件与pJET 1.2/blunt载体质粒相连接：
(1)在冰面上进行以下操作，加入2×buffer 5μL，纯化后的5’arm 0.6μL，无菌去离子水2.9μL，DNA Blunting Enzyme 0.5μL，混匀。
(2)70℃水浴10min，立即冰浴。
(3)在冰面上加入0.5μL pJET 1.2/blunt Cloning Vector和0.5μLT4DNALigase，混匀。
(4)22℃水浴30min。
3’arm操作步骤同5’arm。
pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒转化，将上述好的pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，步骤如下：
(1)取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，在冰面上融化。
(2)加入10μL重组质粒pJET-5’arm和pJET-3’arm，轻轻混匀，冰浴30min。
(3)42℃水浴90sec，立即冰浴3-5min。
(4)加入800μL LB液体培养基，并转移至无菌小试管中，在恒温摇床中，
(5)将步骤(4)中的菌液全部转移在含有终浓度为100μg/mL的Amp的固体LB培养基的平板上，每个平板菌液250μL，用涂布棒涂匀菌液。
(6)将平板正面放置在细菌培养箱中，37℃培养15min左右，待平板中菌液被培养及全部吸收后，倒置平板，37℃培养。
pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒的提取，用接种环挑取转化得到的菌落，于含有终浓度为100μg/mL的Amp的液体LB培养基的试管中，37℃培养过夜，将菌液8000g离心10min离心，收集细菌沉淀，利用试剂盒提取质粒，步骤如下：
(1)将吸附柱放入吸附管中，向吸附柱中加入500μL平衡液BL。13400g离心30sec，倒掉废液。
(2)取过夜培养的菌液1.5mL于1.5mL EP管中，13400g离心2min，尽可能去除上清。
(3)向EP管中加入250μL缓冲液P1(含有RNase A)，悬浮细菌，充分颠倒混匀。
(4)加入250μL缓冲液P2，温和的颠倒混匀，使细菌充分裂解。此时可出现絮状沉淀，13400g离心10min。
(5)向EP管中加入350μL缓冲液P3，温和的颠倒混匀，此时可出现絮状沉淀，13400g离心10min。
(6)取上清液加到吸附柱中，室温静置2min，13400g离心30sec，倒掉废液。
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，13400g离心30sec，倒掉废液。
(8)重复步骤(7)。
(9)13400g离心2min，倒掉废液，将吸附柱至室温干燥2-5min。
(10)将吸附柱转入1.5mL离心管中，向吸附柱中加入50-200μL洗脱缓冲液EP，室温放置2-5min，13400g离心2min，收集离心管中溶液，-20℃保存。
pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒的鉴定，用提取的质粒为模板，按照从基因组中获得5’arm和3’arm的PCR体系和条件，分别进行PCR，0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测产物大小；再将质粒分别进行酶切鉴定，分别用XhoⅠ单酶切，XhoⅠ和ApaⅠ双酶切鉴定质粒pJET-5’arm；BamHⅠ鉴定质粒pJET-3’arm。体系如表2：
表2 pJET-5’armp和JET-3’arm酶切体系
Figure BDA0001819844970000131
混匀后，37℃水浴10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.2 pJET-5’arm-gdnf质粒的构建
将本实验室保存的pGDNF-EGFP载体质粒按照上述方法进行转化，利用试剂盒提取质粒，将所得的质粒进行XhoⅠ酶切，胶回GDNF基因片段；同时将pJET-5’arm质粒利用XhoⅠ酶切，与胶回收后的GDNF基因片段连接，重组质粒经转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，过夜培养，收集细菌，提质粒，再利用质粒酶切鉴定，由于插入的GDNF基因片段两端都为XhoⅠ酶切位点，连接后的质粒可能是正向插入也可能存在反向插入，所以，除了对pJET-5’arm-gdnf质粒进行片段大小的鉴定以外，还进行插入的方向鉴定，用Apa和EcoRⅠ双酶切进行鉴定pJET-5’arm-gdnf质粒。得到阳性pJET-5’arm-gdnf质粒后，再针对5’arm和gdnf两片段之间的XhoⅠ酶切位点做点突变；设计的引物为：5’arm-gdnf-M-F:5'-CCATTCCCAGGAATTGAGAGCCATGAAG TTATGGGATGTCGTGG-3'和5’arm-gdnf-M-R:5'-CCCATAACTTCATGGCTCTCA ATTCCTG GGAATGGGAAGATGAG-3'，按表3体系进行反应：
表3 pJET-5’arm-gdnf突变PCR体系
Figure BDA0001819844970000132
Figure BDA0001819844970000141
变性94℃20sec，退火59℃20sec，延伸72℃90sec，共20个循环。PCR产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，过夜培养，收集细菌，按照前面方法提质粒，经ApaⅠ单酶切鉴定、XhoⅠ单酶切鉴定、XhoⅠ和ApaⅠ双酶切鉴定，得到突变后的载体为pJET-5’arm-gdnf-M，进行酶切和测序。
3.3 pP40-3’arm质粒的构建
pJET-3’arm质粒与pPGK-SV40(参见CN101851639的制备，全文引入参考，用Not I、Ssp I酶切质粒pCMV-Red，回收264bp的SV40polyA转录终止信号序列；用Not I、EcoRV酶切质粒pPGK-neo LoxP，将SV40polyA克隆到pPGK-neo LoxP载体上，得到pPGK-SV40，命名为pP40)质粒分别用BamHⅠ酶切，电泳，切胶回收，分别得到3’arm/BamHⅠ小片段和pPGK-SV40/BamHⅠ大片段，再将两片段用T4DNA连接酶进行连接，得到pgk-sv40-3’arm(简称为pP40-3’arm)重组质粒，经转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，过夜培养，收集细菌，按照前面方法提取质粒，载体质粒分别用XbaⅠ单酶切鉴定和BamHⅠ单酶切进行鉴定。由于同源臂3’arm两端均为BamHⅠ酶切位点，在插入到pPGK-SV40骨架载体上时，存在正向插入，也存在反向的可能性，在分别选取同源臂3’arm上的MunⅠ酶切位点和骨架上的MunⅠ位点做MunⅠ单酶切鉴定，判断出插入的方向。
3.4 pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒的构建
将pJET-5’arm-gdnf-M质粒用XhoⅠ和ApaⅠ内切酶进行双酶切，回收5’arm-gdnf片段，同时对pP40-3’arm质粒也将进行XhoⅠ和ApaⅠ双酶切，并且切胶回收大片段，再将两回收片段用T4DNA连接酶进行连接，重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，过夜培养，收集细菌，按照前面方法提取质粒，再用XhoⅠ单酶切、BamHⅠ单酶切、XhoⅠ和ApaⅠ双酶切进行酶切鉴定。
pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒大提及线性化：接种含有pP40-5’arm-gdnf-3’arm打靶载体质粒大肠杆菌DH5α于200mL LB培养基中，培养后菌液用去内毒素质粒大量提取试剂盒(QIAGEN)提取质粒，步骤如下：
(1)从含有氨苄抗生素的新鲜LB平板上挑取一个单菌落，于5mL含有氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养8小时。
(2)取菌液200μL加到200mL含有氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养培养12-14小时。
(3)4℃、6000g/min离心12min，弃上清，收集菌落，加入10mL缓冲液P1，反复吹打沉淀，重悬细菌沉淀。
(4)加入10mL缓冲液P2，剧烈颠倒混匀，冰浴5min。
(5)加入10mL缓冲液P3，轻轻颠倒4-6次，混匀，冰浴5min。
(6)准备滤筒装置，将步骤(5)中溶液倒入滤筒，室温下静置10min，再将活塞插入滤筒，取下喷嘴，滤下细菌裂解液于50mL干净无菌离心管中。
(7)加入2.5mL缓冲液ER，到滤液中，轻轻颠倒混匀，冰浴30min。
(8)用10mL缓冲液QBT平衡滤筒Tip-500，并保持重力流下，直至排空平衡液。
(9)将步骤⑺中滤液加入到滤筒Tip-500中，使其重力流下。
(10)用30mL洗脱液洗脱，重复一次。
(11)加入15mL缓冲液QN洗脱吸附在滤筒Tip-500上的质粒DNA。
(12)加入10.5mL异丙醇到抽提的DNA中并混合，分装到1.5mL离心管中，15000g离心10min，小心去除上清。
(13)用70％的乙醇1mL洗涤DNA沉淀，15000g离心10min，小心去除上清，重复一次。
(14)室温干燥沉淀，使乙醇挥发，加入适量无内毒素的TE缓冲液。
(15)检测质粒浓度和纯度，0.8％的琼脂糖凝胶检测质粒完整性；-20℃保存备用。
(16)ApaⅠ酶切质粒，氯仿异戊醇抽提、乙醇沉淀、1×TE回溶线性质粒；-20℃保存备用。
4、CRISPR/Cas9表达载体的构建
CRISPR/Cas9表达载体的构建，包括将CRISPR/Cas9的引导序列sgRNA、Cas9蛋白序列和CRISPR结构序列同时构建在同一表达载体上。其中，sgRNA的靶基因位点在牛β-casein基因座第二外显子处，其靶位点序列为：CCAGGAATTGAGAGCCATGA AGG。构建方法为：合成引物序列
Bovine-V-Gui-F：5’-CACCGCCAGGAATTGAGAGCCATGA-3’
Bovine-V-Gui-R：5’-AAACTCATGGCTCTCAATTCCTGGC-3’
载体PX330-GFP使用BbsⅠ酶切电泳回收，与Bovine-V-Gui-F/R退火产物连接转化，涂布于氨苄平板上，37℃培养过夜。次日，挑取单克隆，提取质粒，DNA测序鉴定。
5、牛胎儿成纤维细胞的分离培养
从屠宰场(包头市昆区北沙梁屠宰场和呼和浩特市回民区屠宰场)取牛子宫(含胎儿，约2个月大小)带回实验室，无菌操作挑选出雌性胎儿，用DPBS清洗。按如下方法，分离培养牛胎儿成纤维细胞。
(1)取出子宫，于无菌操作台上小心剪开子宫壁，不得剪破羊膜；
(2)将整个羊膜(含羊水、胎儿)泡在含有75％的酒精的无菌大烧杯中5min，重复2次；
(3)再在无菌操作台中小心将胎儿从羊膜中剥离出，将胎儿置于无菌培养皿中；
(4)用无菌手术剪刀剪下牛胎儿耳部组织，于含有DPBS的小烧杯中，并在小烧杯中尽可能剪碎耳部组织，剪碎至大约为1mm3大小，将组织悬液转移到无菌离心管中，600g/min离心后，用DMEM/F12培养液洗2-3遍；
(5)然后将组织块连同培养液一起转移到25cm2培养瓶中，轻轻摇动使得组织块分布均匀，吸去组织块周围培养液，37℃、5％CO2下培养3小时左右，待组织块贴壁后，缓缓加入10％FBS+90％DMEM/F12的完全培养液(不得冲起组织块)，37℃、5％CO2下继续培养。每天观察并记录细胞的生长情况，待生长的细胞汇合度约80％～90％时，去除组织块，用0.25％的胰蛋白酶消化约2min，转移至75cm2培养瓶中传代扩大培养，待细胞生长汇合度至80％时，消化细胞，加入细胞冻存液(10％DMSO+20％FBS+70％DMEM/F12)按1×106cells/ml的密度冷冻保存(4℃保存15min，-20℃保存30min，-80℃过夜冻存，再转移至液氮中长期保存)
6、牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418的耐受性分析
分别在12孔板中培养牛胎儿成纤维细胞，待细胞汇合度达到80％左右，分别用含有不同浓度的G418的10％FBS+90％DMEM/F12的完全培养液培养，所含G418的终浓度分别为：100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml和600μg/ml，37℃、5％CO2下培养，每天观察细胞生长状况。
7、CRISPR/Cas9的生物学功能检测
7.1CRISPR/Cas9质粒转染牛胎儿成纤维细胞
培养牛胎儿成纤维细胞，待其生长汇合度达80％，用0.25％胰蛋白酶消化，后离心收集细胞，再用适量不含FBS的DMEM/F12重悬细胞，取细胞悬液用细胞计数仪计数，弃上清，再用不含FBS的DMEM/F12重悬细胞，使细胞密度达到1×107cells/mL。取100μL细胞悬液加入2mm电击杯中，加入12μgCRISPR/Cas9质粒，冰浴2min后轻敲杯底混匀细胞悬液后电击，条件为：200V电压、2次脉冲，每次间隔0.1sec，每个脉冲5ms。电击后，电击杯在电击槽中静置2min，再置冰面冰浴2min，然后将细胞按照密度为3×105cells/mL密度接种在100mm细胞培养皿中，加入不含抗生素的10％FBS+90％DMEM/F12的完全培养液15mL，37℃、5％CO2下培养。
7.2基因组提取
裂解液配制培养2天后，待细胞在培养皿中生长汇合度约80％，按照下述方法提取细胞基因组：按照表4列配方配制细胞裂解液：
表4细胞裂解液
Figure BDA0001819844970000171
裂解液中的蛋白酶K在使用之前加入，其他组分可在室温长期保存。
步骤如下：
(1)将待提取基因组的细胞使用DPBS清洗两次。
(2)按照100mm细胞培养皿中2.5mL细胞裂解液，37℃过夜孵育。
(3)将裂解后的细胞转移至15mL离心管中，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混匀后，12000rpm离心5min。
(4)小心将离心后的上层水相转移至新的离心管中，注意不要将水相和有机相搅浑，弃有机相液体。
(5)在水相离心管中再加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分颠倒混匀后，12000rpm离心5min。
(6)将上层水相再转移至新的1.5离心管中，每管约400μL；再在每管加入2.5倍体积的无水乙醇，或等体积的异丙醇，颠倒混匀8-10次。12000rpm离心10min，小心去除上清。
(7)每管加入1mL 70％乙醇，颠倒离心管8-10次，12000rpm离心5min。重复两次。
(8)小心去除乙醇，将沉淀室温晾干。残余的乙醇会抑制后续的PCR、酶切等实验。
(9)使用50-100μL 1×TE缓冲液回溶DNA，37℃水浴1h左右，-20℃保存备用。
7.3用T7核酸内切酶I检测CRISPR/Cas9的生物学功能
利用上述所提取的基因组进行PCR，引物T7E1-F位于5’同源臂上，序列为：5'-ATCTGGATGGCTGGCAGTGAAACA-3'，T7E1-R位于3’同源臂上，序列为5'-GACTCAGACTTGTGGTCCCATAGG-3'；95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环。PCR产物按照T7核酸内切酶I(T7EI)步骤进行处理，方法步骤如下：
(1)在冰面上按照如下体系加样：PCR产物15μL，10×T7EI Buffer 3.3μL，无菌去离子水13.2μL，并在EP管中混匀。
(2)加热变性，退火复性处理，在1L烧杯中加入500mL水，加热使其沸腾后，将步骤⑴中的体系置于浮板上放入沸水中，停止加热，将烧杯置于室温，待其冷却至室温(约24℃)即可。
(3)在变性复性后的体系中加入1μL T7核酸内切酶I，立即37℃水浴20-30min，后立即加入6μL DNA Loading Buffer，混匀后65℃煮10min。
(4)将得到的酶切后产物通过2.0％琼脂糖凝胶电泳检测得到结果。
8单克隆细胞筛选及鉴定
8.1pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒和CRISPR/Cas9质粒共转染
培养牛胎儿成纤维细胞，待其生长汇合度达80％，用胰蛋白酶消化，离心后收集细胞，再用适量体积的不含FBS的DMEM/F12重悬细胞，取细胞悬液用细胞计数仪计数，去除上清，再用不含FBS的DMEM/F12重悬细胞，加入DMEM/F12的量使得细胞密度达到1×107cells/mL。取100μL细胞悬液加入2mm电击杯中，加入1.5μg线性化的pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒和6μgCRISPR/Cas9质粒，冰浴2min，轻敲杯底混匀细胞悬液后电击，条件为：175V电压、2次脉冲，每个脉冲5ms，每次间隔0.1sec。电击后，电击杯在电击槽中静置2min，再冰浴2min，然后将细胞按照密度为3×10 5cells/mL接种在100mm培养皿中，加入不含抗生素10％FBS+90％DMEM/F12的完全培养液15mL，37℃、5％CO2条件下培养。
8.2单克隆细胞筛选
共转染后培养48h的细胞，加入含有终浓度为200μg/mL的G418的10％FBS+90％DMEM/F12的完全培养液15mL，继续培养，每天按时观察死亡细胞数量和活细胞生长状况，视死亡细胞数量换液，用含有G418的完全培养液培养6-7天，显微镜下观察细胞克隆，并用标记笔标记出单克隆细胞的位置。在无菌条件下，用自制的直径8mm的钢圈(克隆杯)沾取少量凡士林油，粘在有细胞克隆的标记处，用DPBS清洗后，加入0.05％的胰蛋白酶50μL，37℃消化2-3min，在倒置显微镜下观察消化情况后，加入10％FBS+90％DMEM/F12的完全培养液150μL终止消化，用移液枪轻轻吹打悬浮细胞再转移至48孔的细胞培养板中，再补加终浓度为100μg/mL的G418的10％FBS+90％DMEM/F12的完全培养液至500μL，于37℃、5％CO2下培养。
每天观察细胞生长状况，待细胞在48孔板中生长汇合度达到80％左右，加0.05％的胰蛋白酶消化细胞，终止消化后，将2/3体积的细胞悬液接种在24孔细胞培养板里，待细胞生长约90％汇合度后，收集细胞，梯度冷冻后置于液氮中冷冻保存。余下的1/3体积的细胞悬液继续在48孔细胞培养板中培养，待细胞基本汇合后，在48孔板中加入100μL细胞裂解液，按照前面的方法提取基因组DNA，-20℃保存备用。
8.3打靶细胞克隆的鉴定
以克隆细胞基因组DNA为模板，PCR鉴定中靶克隆。5’arm同源重组的鉴定：PCR正义引物位于β-casein基因5’arm的上游，序列为5'-GCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGC-3'，反义引物位于gdnf基因上，序列为5'-AATGGGTAGCCTA TCCCTTCTCCTG-3'；PCR条件为95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，共35个循环。3’arm同源重组的鉴定：PCR正义引物位于neo基因上，序列为5'-GCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGC-3'，反义引物位于β-casein基因3’arm的下游，序列为5'-GGACTACACTCATTCTCACTGCCTC-3'；PCR条件为95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min 15sec，共35个循环；由于PCR产物含有杂带，故我们将得到的PCR产物稀释100倍，然后将稀释的PCR产物作为模板，进行嵌套PCR，嵌套PCR正义引物序列为5'-ATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTC-3'，反义引物为：5'-AATGGGTA GCCTATCCCTTCTCCTG-3'，PCR条件为95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 45sec，共35个循环。将5’arm与3’arm同源重组鉴定的PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收目的条带，DNA测序鉴定。
实施例2实验结果与分析
1、PCR扩增获取5’arm和3’arm同源臂，从牛血液中提取基因组DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳(见图3)，完整性以及大小都符合PCR模板要求。以此为模板，通过PCR扩增得到5’arm和3’arm同源臂，PCR产物大小分别为：1050bp和1080bp(见图4)，通过与测序结果比对，均与GenBank牛β-casein基因序列一致，可以作为基因打靶载体的同源臂。
2、基因打靶载体鉴定
2.1pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒载体鉴定，提取pJET-5’arm和pJET-3’arm质粒后，对pJET-5’arm质粒分别做XhoⅠ单酶切和XhoⅠ/ApaⅠ双酶切，单酶切片段大小为4026bp，双酶切两片段大小分别为1040bp和2986bp(见图5)。对pJET-3’arm质粒进行BamHⅠ酶切(见图6)，酶切后两片段大小分别为1068bp和2986bp。表明pJET-5’arm质粒和pJET-3’arm质粒载体均构建正确。
2.2pJET-5’arm-gdnf质粒载体鉴定，人gdnf基因在pJET-5’arm载体中插入，预期将gdnf基因的5’端连接在同源臂5’arm的3’端，属于正向插入，但是，由于插入的gdnf基因两端都为XhoⅠ酶切位点，连接后的质粒可能是正向插入也可能存在反向插入，所以，在对pJET-5’arm-gdnf质粒进行插入的方向鉴定，即进行ApaⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，得到的两片段大小为1280bp和3293bp(见图7泳道4)；如果gdnf基因反向插入，则片段大小为1383bp和3190bp(见图7泳道3)；结果表明，既有正向插入的质粒，也有反向插入的质粒，正向插入的pJET-5’arm-gdnf质粒即为阳性质粒载体。然后对阳性质粒5’arm和gdnf连接处XhoⅠ酶切位点做点突变；如果点突变成功，XhoⅠ单酶切、ApaⅠ单酶切则会到一条4573bp片段，XhoⅠ/ApaⅠ双酶切产物两条片段，大小分别为1608bp和2965bp；反之，ApaⅠ单酶切得到一条4573bp片段，而XhoⅠ单酶切产物则为两条片段，大小分别为564bp和4009bp，XhoⅠ/ApaⅠ双酶切产物也会有564bp、1044bp和2965bp三条DNA片段；将酶切鉴定为阳性突变的质粒(见图8)进行测序，结果表明，成功预期点突变质粒，命名为pJET-5’arm-gdnf-M。
2.3pP40-3’arm质粒载体鉴定，BamHⅠ酶切pJET-3’arm，胶回收小片段，插入到骨架载体pPGK-SV40的BamHⅠ酶切位点，BamHⅠ单酶切鉴定重组质粒(见图9)，酶切产物为1070bp的3’arm片段和5813bp的pPGK-SV40载体骨架片段，与预期片段大小一致。在鉴定同源臂3’arm是否正向插入在pPGK-SV40载体骨架上，用MunⅠ单酶切进行鉴定，如果酶切片段为为2199bp和4685bp，则为正向插入；反向插入，酶切产物大小则为2540bp和4344bp。最终，通过MunⅠ单酶切鉴定，获得正向插入质粒(见图10)，命名为pP40-3’arm。
2.4pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒载体鉴定，XhoⅠ/ApaⅠ双酶切pJET-5’arm-gdnf-M质粒，胶回收5’arm-gdnf片段，插入到pP40-3’arm质粒XhoⅠ/ApaⅠ双酶切位点，得到重组质粒pP40-5’arm-gdnf-3’arm质粒，XhoⅠ单酶切、BamHⅠ单酶切、XhoⅠ/ApaⅠ双酶切鉴定，均得到预期大小片段(见图11)，即成功构建pP40-5’arm-gdnf-3’arm打靶载体(见图12)。
3、CRISPR/Cas9质粒的构建CRISPR/Cas9命名为Bovine beta-casin-1，为真核表达载体，大小为10154bp；质粒具有氨苄抗性，含有EGFP表达序列；在真核细胞中能编码出gRNA和Cas9蛋白。质粒载体中黄色部分是gRNA启动序列，编码序列太小，未能在载体上显示；质粒载体中的蓝色部分表示Cas9蛋白表达序列见图13所示。
4、牛胎儿成纤维细胞的分离培养以及对G418耐受性的检测
4.1利用组织块贴壁法分离培养得到牛胎儿成纤维细胞，将牛胚胎耳部组织块剪碎贴壁培养，1d后，部分组织块边缘开始游离出少许成纤维细胞(见图14-A)此时细胞大多呈梭形，为成纤维细胞，也有少部分细胞呈不规则形状。培养2d后，多数组织块周围已有均匀的成纤维细胞迁出(见图14-B)；培养3-5d，组织块周围的成纤维细胞生长旺盛，数量明显增多，向四周扩散(见图14-C、图14-D、图14-E)，梭形的成纤维细胞越来越多，所占比例也越来越大；培养6d后，组织块周围的细胞已生长至完全汇合(见图14-F)，且基本汇合时，绝大部分细胞都呈纤维状，高度汇合的细胞呈旋涡状生长；说明在细胞生长过程中，成纤维细胞呈优势生长且在细胞群中占主导地位，并且，成纤维细胞生长分裂快速，细胞形态较好，利于后续基因打靶和阳性单克隆的筛选，以及核移植和胚胎的生成。在传代过程中，不规则细胞被胰蛋白酶消化的时间比成纤维细胞消化所需时间长，因而，几次传代后，可获得高纯度的成纤维细胞(图14-G)。
4.2牛胎儿成纤维细胞对不同浓度G418的耐受性检测，利用不同浓度的G418对牛胎儿成纤维细胞进行抗药性检测，结果发现，G418的浓度在100-600μg/mL的范围时，对牛胎儿成纤维细胞有明显的毒害作用，细胞全部被杀死的培养时间随G418浓度的增大而缩短。G418浓度为200μg/mL时，细胞培养7d被全部杀死(见图15)；本实验利用含有浓度为200μg/mL G418的培养基对电转后的细胞进行筛选，不仅能在7d内杀死所有未转染的成纤维细胞，分离出单克隆细胞，而且还能最大限度降低对单克隆细胞的损伤，防止在后续实验中单克隆细胞老化。
5、CRISPR/Cas9表达载体的生物学功能检测
5.1CRISPR/Cas9质粒转染牛胎儿成纤维细胞，将12μg CRISPR/Cas9质粒转染到1×10 6细胞中，转染24h后，在荧光显微镜下观察细胞释放荧光，如图16-B所示，转染效率约为70％。
5.2T7核酸内切酶I检测，CRISPR/Cas9靶向切割效率提取CRISPR/Cas9质粒转染后两天的细胞基因组DNA，PCR扩增得到含有切割位点的558bp DNA片段，将PCR产物变性后复性，然后用T7核酸内切酶I进行酶切，2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物，部分PCR产物酶切形成329bp和229bp条带(见图17)，与预测结果一致。只有CRISPR/Cas9表达质粒在牛胎儿成纤维细胞中完成表达并在β-casein基因座上靶位点进行了有效的切割，引发了基因组DNA的NHEJ修复，导致在靶位点的基因突变，才能被T7核酸酶内切酶Ⅰ进行酶切。该结果表明，本发明设计构建的CRISPR/Cas9表达质粒具有生物学功能，能够有效切割β-casein基因的靶位点。
6、打靶细胞克隆的筛选及鉴定
6.1 CRISPR/Cas9和pP40-5’arm-gdnf-3’arm共转染牛胎儿成纤维细胞，共转染后48h观察到的绿色荧光表达情况(图18A)，200μg/mL浓度的G418筛选7天，观察单克隆细胞在100mm细胞培养皿中的生长状况(图18B)；挑去单克隆细胞后，待48孔板以及12孔板中的细胞汇合度达到80％时，观察细胞生长状况，并冻存生长状况良好的细胞(图18C)，便于后续的体外核移植和胚胎的发育。
6.2打靶细胞克隆的鉴定，提取48孔板中细胞的基因组DNA，PCR鉴定中靶细胞克隆，按照所设计的引物，中靶克隆的5’arm PCR产物和3’arm PCR产物大小分别为1394bp和1573bp。PCR法检测12个G418抗性克隆，其中5个为阳性中靶克隆(见图19和20)。将5个阳性克隆的PCR产物进行DNA测序，测序结果表明，在5’arm和3’arm均发生了同源重组。说明本发明利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，将人gdnf定位整合到了牛胎儿成纤维细胞β-casein基因座，相对打靶效率为41.7％(5/12)，绝对打靶效率为1.67×10-5(5/(3×106))(表5)。
表5牛胎儿成纤维细胞基因打靶效率
Figure BDA0001819844970000231
结论
1、成功构建了打靶载体pP40-5’arm-gdnf-3’arm。
2、设计并构建了适用于牛成纤维细胞β-casein基因座靶向修饰的CRISPR/Cas9表达载体，并且通过T7核酸内切酶Ⅰ该表达载体具有生物学功能。
3、采用组织块贴壁法成功分离出牛胎儿成纤维细胞，具有正常的形态和旺盛的生长分裂速度，为基因打靶提供了供体细胞。
4、成功利用CRISPR/Cas9来介导人gdnf在牛胎儿成纤维细胞β-casein基因座中的定点整合，成功筛选出阳性中靶克隆，而且，中靶克隆的细胞形态较为正常、生长速度较为旺盛，为后续的基因打靶体细胞克隆囊胚的制备提供材料，进而为制备能够产生重组人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器的研究奠定了基础和提供实施路径。
本发明成功构建了牛β-casein基因座的打靶载pP40-5'arm-gdnf-3'arm；并基于打靶位点序列，成功构建了特异性断裂靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体；使用电击转染的方法将CRISPR/Cas9表达载体和打靶载体共转染到牛胎儿成纤维细胞中，通过同源重组获得了人GDNF基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞。
将本发明的人GDNF基因在牛β-casein基因座上定位整合的基因打靶牛胎儿成纤维细胞作为核供体，可以通过体细胞核移植法获得克隆囊胚，移植到受体牛的子宫角，进行妊娠，产生具有高效表达GDNF重组基因的牛的后代，通过后代动物的乳腺生产GDNF蛋白。
以上只是本发明代表性实施例，在不偏离本发明的精神实质的基础上进行简单的变化或替换也属于本发明的范围。

Claims (5)

1.人GDNF基因在牛β-casein基因座上定位整合的载体，包含打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体，其中，所述打靶载体是基于同源重组原理设计的，包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与牛β-casein基因的5′同源臂和3′同源臂相连，人GDNF cDNA基因位于5′同源臂下游，所述CRISPR/Cas9表达载体，用于特异性地断裂打靶位点序列，包括引导序列sgRNA、Cas9蛋白序列和CRISPR结构序列，其中，sgRNA的靶基因位点在牛β-casein基因座第二外显子处，其靶位点序列为：CCAGGAATTGAGAGCCATGAAGG，扩增所述牛β-casein基因5′同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGGCCCGTGTGTCAAGAGATTGTGATGG-3'，下游引物5'-CATCTCGAGCAAGTCCTGGGAATGGGAAGATG-3'。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶的基因，即neo基因。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述重组酶识别序列为Cre酶识别序列。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，扩增所述牛β-casein基因3'同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGATCCGGTCCTCATCCTTGCCTGC-3'和下游引物5'-GCTGGATCCGCTCCTCCTCTATGGGATTTTCC-3'。
5.权利要求1-4任一项所述的载体在制备表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。
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