KR100267749B1

KR100267749B1 - 돼지 아데노바이러스 4형 으로부터 제작한 재조합 발현벡터 및그를 이용하여 유전자 재조합 돼지 아데노바이러스 4형을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR100267749B1
Application number: KR1019980025039A
Authority: KR
Inventors: 박종현; 송재영; 현방훈; 안동준; 차상호; 안수환
Original assignee: .; 대한민국
Priority date: 1998-06-29
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2000-11-01
Also published as: KR20000003767A

Abstract

본 발명은 국내 돼지 사육농가에 심각한 경제적 피해를 야기시키는 돼지의 주요 전염병의 백신제조에 사용될 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용하여 재조합 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 발현벡터는 돼지아데노바이러스 4형의 E3 유전자 부위를 제거하여 E3 프로모터하에 삽입된 외래 유전자가 발현될 수 있도록 제작한 플라스미드이고, 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형은 발현벡터에 외래 유전자를 삽입한 후, 이를 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자와 대장균내에서 동질성 재조합(homologous recombination)하고, 이를 리포펙틴을 사용하여 돼지신장세포(porcine kindey)에 형질도입시켜 바이러스를 선발한 것이다. 한편, 본 발명의 발현벡터에 삽입될 수 있는 외래 유전자는 최대 약 4.0kb의 크기를 갖는 것으로, 예를 들면 돼지 유행성 설사병 바이러스 스파이크(spike) 유전자, 돼지 전염성 위장염 바이러스 스파이크 유전자 등이 있다.

Description

돼지아데노바이러스 4형으로부터 제작한 재조합 발현벡터 및 그를 이용하여 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 제조하는 방법

본 발명은 국내 돼지 사육농가에 심각한 경제적 피해를 야기시키는 돼지의 주요 전염병의 백신제조에 사용될 수 있는 발현 벡터 및 이를 이용하여 재조합 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지아데노바이러스 4형의 E3 유전자 부위를 제거하여 E3 프로모터하에 삽입된 외래 유전자가 발현될 수 있도록 발현벡터를 제작하고, 여기에 외래 유전자를 삽입한 후, 이를 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자와 대장균내에서 동질성 재조합(homologous recombination)하고 리포펙틴을 사용하여 돼지신장세포(porcine kindey)에 형질도입시켜 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 제조하는 방법에 관한 것이다.

유전공학적으로 최근에는 목적하는 항원을 코딩하는 유전자를 아데노바이러스에 삽입하는 DNA 벡터 시스템이 안전하고 효과적인 유전자 요법 치료를 제공할 수 있으므로, 이에 대하여 많은 연구가 진행되고 있는 실정이다. 특히, 사람 아데노바이러스는 다른 바이러스 벡터들보다 작은 게놈 유전자를 가지고 있어 제작이 용이할 뿐만 아니라 외래 유전자를 근육, 상피, 신경 및 임파구 세포에 도입시킬 수 있는 감염력을 가지고 있고, 바이러스 DNA가 세포질에 수개월 동안 존재함으로써 지속적인 면역을 유발할 수 있을 뿐만 아니라 개, 돼지, 소, 마우스, 토끼, 침팬지, 고양이 등 많은 포유동물에서 외래 유전자에 대한 면역반응이 확인된 바 있어 유전자 치료법이나, 백신을 목적으로 외래 유전자를 운반하고 발현하는 훌륭한 수용체로서 알려져 있으므로, 이들에 관한 연구가 많이 진행되고 있으며, 가장 활발히 연구되고 있는 것이 사람 아데노바이러스 5형을 이용한 발현벡터 시스템이다. 특히, 사람 아데노바이러스 5형을 이용한 발현벡터는 수의학 분야에서도 각 동물에 질병을 일으키는 병원체의 항원을 코딩하는 유전자를 삽입하여 생체내에서 발현항체를 유발시키므로서 질병을 예방할 수 있으므로 효과적이다.

그러나, 사람아데노바이러스 5형을 이용한 발현벡터는 돼지 유행성 설사병 바이러스, 돼지 전염성 위장염 바이러스와 같은 돼지의 주요 바이러스성 전염병의 예방을 위하여 적용시 사람에게서 유래된 바이러스이므로 아직 바이러스의 사람 및 동물에 대한 안전성이 확실히 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 발현벡터를 이용하여 돼지의 주요 바이러스성 전염병을 예방하는데 있어서 점막에 감염되는 특징을 지닌 돼지에서 유래된 아데노바이러스에 돼지의 점막에 감염되는 여러 바이러스, 세균 등의 유전자를 삽입하여 감염시킬 경우 돼지에서 주요질병에서 이겨낼 수 있을 것이라는 생각으로부터, 지름이 약 70nm이며, 유전자의 크기가 35kb이고, 상업적으로 구입이 용이하며, 1∼5형까지의 공지된 돼지아데노바이러스들 중 제거될 수 있는 유전자의 크기가 크므로 삽입 가능한 유전자의 크기를 크게 할 수 있는 돼지아데노바이러스 4형을 이용하여 발현벡터를 제조하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지의 주요 바이러스성 질병 등을 예방하기 위해 돼지아데노바이러스 4형을 이용하여 제작한 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터를 이용하여 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 재조합 발현벡터를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 2는 본 발명의 재조합 발현벡터인 pXBK의 상세한 모식도이다.

도 3은 돼지아데노바이러스 4형의 E3(early region 3) 위치에서 5' region 에 해당되는 pVⅢ 유전자의 부분염기서열이다.

도 4는 돼지아데노바이러스 4형의 E3 위치에서 3' region에 해당되는 fiber유전자의 부분염기서열이다.

도 5는 본 발명의 재조합 발현벡터인 pXBK에 모델유전자로서 형광발현단백질(green fluoresent protein; GFP) 유전자를 삽입하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 6은 돼지아데노바이러스 4형의 전체유전자를 클로닝벡터에 클로닝하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 7은 본 발명의 유전자 재조합 돼지 아데노바이러스 4형의 제작과정을 나타내는 모식도이다.

도 8은 돼지아데노바이러스 4형의 전체 유전자를 클로닝벡터에 클로닝하고, GFP의 발현벡터로의 클로닝을 확인한 전기영동 사진이다.

도 9는 재조합된 돼지아데노바이러스 4형 유전자를 함유한 플라스미드 pPAV4-GFP를 돼지 신장세포에 형질도입시켰을 때, 바이러스로 감염되어 세포변성효과가 나타남을 보여주는 사진이다.

A; 플라스미드 pPAV4-GFP를 돼지신장세포에 형질도입한 것

B; 정상 돼지신장세포

도 10은 플라스미드 pPAV4-GFP를 돼지신장세포에 형질도입시켰을 때, GFP가 발현되어 나타난 형광 현미경 사진이다.

A; 플라스미드 pPAV4-GFP를 돼지신장세포에 형질도입시켰을 때 발현된 형광단백질

B; 정상 돼지신장세포

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 발현벡터는 돼지 아데노바이러스 4형의 E3 유전자 위치에서 5'영역에 해당하는 pVⅢ 유전자 부위와, 3' 영역에 해당하는 fiber 유전자 부위를 증폭한 후, 외래 유전자의 삽입 사이트가 BamHⅠ이 되도록 플라스미드에 클로닝하는 것에 의해 제조된다.

또한, 본 발명의 돼지의 주요 전염병의 백신 제조에 사용되는 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형은, 외래 유전자가 E3 프로모터하에 발현될 수 있도록 발현벡터의 BamHⅠ 사이트에 외래 유전자를 삽입한 후, 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자와 함께 대장균에서 동질성 재조합(homologous recombination)하여 클로닝한 후, I-pPolⅠ로 절단하고, 돼지신장세포(porcine kidney cells)에서 형질감염(transfection)시켜 선발한다.

한편, 본 발명의 재조합 유전자 돼지아데노바이러스 4형을 제작하는데 있어서 외래 유전자는, 본 발명의 재조합 발현벡터의 최대 삽입용량이 4.0kb이므로, 돼지의 주요 전염병을 예방하기 위해 이들 전염병에 대한 항체의 발현을 효과적으로 유도할 수 있는 유전자로서 크기가 4.0kb 이내인 것으로, 그 종류는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면, 돼지 유행성 설사병 바이러스 스파이크 유전자, 돼지 전염성 위장염 바이러스 스파이크 유전자가 있다.

이하 각종 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

실시예 1. 돼지아데노바이러스 4형의 게놈 유전자 분리

돼지아데노바이러스 4형(PAV4, Kasza strain, ATCC-VR359)주를 돼지 신장세포(porcine kindey 15; PK15, ATCC-CCL33)에서 다음과 같이 증식하였다. 세포배양액은 α-MEM(Gibco)에 5% 우태아혈청(Gibco), 비필수아미노산(Gibco), 트립토스 인산 브로쓰(tryptose phosphate broth, Gibco) 및 젠타마이신(gentamycin, 50㎍/㎖)을 첨가하여 사용하였다. PAV4의 게놈 유전자는 다음과 같은 방법으로 분리된다. 즉, 돼지 신장세포에 PAV4를 접종한 후, 세포변성효과가 95% 이상 관찰될 때, 배양액 전체를 10,000×g로 20분간 원심분리한 다음, 상층액을 -70℃에서 보관하여 침전물을 생성시켰다. 생성된 침전물을 트리스 완충용액(50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.0)에 부유한 다음, 소듐도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, Sigma)를 1%가 되게 첨가하고 페놀로 2회 추출한 다음, 다시 페놀/클로로포름으로 2회 추출하였다. 추출된 PAV4의 DNA 용액에 DNA 용액 2.5배 부피의 에탄올을 첨가하여 PAV4의 DNA를 침전시킨 후, 형성된 침전물을 멸균목침으로 건져내어 에탄올을 제거한 다음, 멸균된 TE 완충용액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)에 추출된 DNA를 용해시킨 후, 이를 재조합 돼지아데노바이러스 4형의 제조에 이용하였다.

실시예 2. E3 프로모터를 이용한 발현벡터의 제작

돼지아데노바이러스 4형으로부터 발현벡터인 pXBK를 제작하는 과정은 도 1에 도시한 바와 같다. 즉, 돼지아데노바이러스 4형 게놈 DNA의 E3 유전자의 5' 영역에 해당되는 817bp의 pVⅢ유전자를 클로닝하기 위하여 프라이머 P8XF 5'-GCT CTA GAA TGA CCC TGG CGA AAG AG-3'와 프라이머 P8BR 5'-CGG GAT CCT TAT GGC GCG CTG TAG AG-3'를 합성한 후, 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 92℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 30회 증폭하였다. 증폭된 pVⅢ유전자의 염기서열은 도 3과 같다. 증폭된 유전자를 pBluescript SK(+) 플라스미드(Stratagene)의 XbaⅠ과 BamHⅠ위치에 클로닝하여 'pXB'를 작성하였다. 또한, E3 유전자의 3' 영역에 해당되는 979bp의 fiber 유전자를 클로닝하기 위하여 프라이머 FIBBF 5'-CGG GAT CCT GAA TAA AAA CAT ACA CC-3'와 프라이머 FIBKR 5'-GGG GTA CCA AAT GAG GTG GGG GGA GA-3'를 합성한 후, 92℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 30회 증폭하였다. 증폭된 fiber 유전자의 염기서열은 도 4와 같다. 증폭된 fiber 유전자를 상기 pXB 플라스미드의 BamHⅠ과 KpnⅠ 위치에 클로닝하여, 'pXBK'를 작성하였다.

이렇게 작성된 발현벡터 pXBK의 상세한 모식도는 도 2에 나타내었다.

상기 발현벡터 pXBK에서 외래 유전자를 삽입하기 위한 클로닝 사이트는 BamHⅠ사이트이다.

실시예 3. 발현벡터 pXBK에 외래 유전자 삽입

유전자의 발현을 모니터하기 위한 리포터 유전자(reporter gene)로 사용되는 형광발현단백질(Green fluorescent protein; GFP; Clotech사 미국 )유전자를 외래 유전자로 하여, E3 프로모터하에서 발현될 수 있도록 상기 실시예 2에서 작성한 발현벡터 pXBK의 BamHⅠ 사이트에 삽입하였다. 즉, 도 5에 도시되어 있는 바와 같이, 약 750bp의 GFP 유전자를 클로닝하기 위해 프라이머 FPFB 5'- CGG GAT CCG CCA CCA TGG TGA GCA-3'와 프라이머 FPRB 5'-CGG GAT CCT TAC TTG TAC AGC TCG-3'를 합성한 후, 92℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 30회 반복하는 PCR 반응으로 증폭하였다. 증폭된 GFP유전자를 BamHⅠ으로 처리한 다음, 상기 실시예 2에서 제작한 발현벡터 pXBK의 BamHⅠ부위에 삽입하여 'pXBK-GFP'를 작성하였다.

실시예 4. 재조합 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자의 클로닝

재조합 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자를 클로닝하기 위해서, 재조합 돼지아데노바이러스 4형 플라스미드 pPAV4를 대장균에서 동질성 재조합(homologous recombination)하여 제작하였다. 즉, 도 6의 하단에 도시되어 있는 바와 같이, 상기 실시예 1에서 추출된 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자 2㎍과 선형화된 pRLITR 플라스미드 1㎍를 컴피던트 세포(competent cell)인 E. coli BJ5183 recBC sbcBC(Canada, 수위전염병연구소) 100㎕에 형질전환(transformation)시키기 위하여 얼음에서 30분 동안 반응하고, 42℃에서 1분간 처리한 후, 얼음에서 다시 10분간 정치하였고, LB broth 1㎖를 첨가하여 30분간 배양한 후, 엠피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 한천에 도말하였다. 그 다음, 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 세균 콜로니 2㎖를 다시 18시간 후 miniprep을 실시하여 플라스미드를 추출하였다. 다시 전량의 플라스미드를 대장균 DH5α(GibcoBRL)에서 42℃에서 1분간 처리로 형질전환시켜 재조합 돼지아데노바이러스 4형 유전자가 함유된 플라스미드 pPAV4를 제작하였다. 제작된 pPAV4 플라스미드를 I-pPolⅠ으로 절단한 후, 전기영동하여 플라스미드내에 재조합 돼지아데노바이러스 4형 유전자가 클로닝되었음을 확인하였다(도 8).

한편, 상기 동질성 재조합에 사용된 선형화된 pRLITR 플라스미드는 각각 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자의 왼쪽 및 오른쪽 말단을 각각 PCR로 증폭시킨 후, 이 유전자들을 pBluescript SK(+) 플라스미드(Stratagene)에 삽입하여 작성된 것이다. 즉, 도 6에 도시되어 있는 바와 같이, 상기 실시예 1에서 추출된 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자의 왼쪽 말단 ITR 영역(inverted terminal repeat region; 1954bp)을 클로닝하기 위하여 프라이머 ITRKIF 5'-GGG GTA CCC TCT CTT AAG GTA GCC GTT GCT GTC GCA ATC AAA T-3'와 프라이머 E1HR 5'-TCA CAA GCT TGT TGA ACA TGG TCA A-3'을 합성한 후, 92℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 30회 증폭하였고, 증폭된 ITR 유전자를 pBluescript SK(+) 플라스미드(Stratagene)의 XbaⅠ과 HindⅢ 위치에 클로닝하여 pLITR을 작성하였다. 한편, 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자의 오른쪽 말단의 E4 유전자 영역을 클로닝하기 위하여 프라이머 ITRXIF 5'-GCT CTA GAC TCT CTT AAG GTA GCC GTT GCT GCA ATC AAA T-3', 프라미어 E4HF 5'-GCC TAA GCT TTA CCA TGA CCT TAC C-3'를 합성하고, 92℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 30회 증폭한 후, 상기 pLITR의 HindⅢ와 XbaⅠ위치에 클로닝하여 pRLITR을 작성하고, 작성된 pRLITR을 HindⅢ로 절단하여 선형화하였다.

실시예 5. 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형 제작

유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 도 7에 도시된 방법으로 제작하였다. 즉, 상기 실시예 3에서 제작된 pXBK-GFP를 제한효소 KpnⅠ과 XbaⅠ으로 절단하여 pVⅢ 유전자-GFP 유전자-fiber 유전자를 갖는 약 2.6kb의 유전자를 순수분리하고, 실시예 3에서 클로닝한 플라스미드 pPAV4를 SalI으로 절단하여 선형화한 DNA와 실시예 3과 동일한 방법으로 대장균에서 동질성 재조합하여 재조합된 돼지아데노바이러스 4형의 유전자를 함유한 플라스미드 pPAV4-GFP를 제작하였다. 작성된 플라스미드 pPAV4-GFP를 I-pPolⅠ으로 절단한 후, 전기영동하여 재조합 돼지아데노바이러스 4형 유전자의 클로닝을 확인하였다(도 8).

상기한 방법으로 작성된 pPAV4-GFP를 I-pPolⅠ으로 절단한 DNA를 리포펙틴(lipofectin)을 이용하여 PK15세포(ATCC-CC133)에 형질도입시켜 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 선발하였다. 즉, I-pPolⅠ으로 절단된 pPAV4-GFP DNA 2㎍을 희석된 리포펙틴(100㎍/㎖, GibcoBRL) 용액 100㎕와 혼합한 다음 실온에서 20분간 방치하였다. 한편, 직경 30㎜ 배양용기에 60% 정도 단층세포로 형성된 PK15세포를 혈청 및 항생제가 포함되지 않은 MEM배지로 3회 세척한 후, 1㎖의 MEM배지를 첨가하였다. 그 다음, 리포펙틴과 DNA 혼합액을 PK15세포에 점적한 후, 24시간 동안 탄산가스 부란기에서 배양하고, 5% 우태아혈청이 함유된 MEM배지를 첨가한 후 3∼5일간 배양하여 세포변성효과를 나타내는 바이러스를 수확하여 GFP를 발현하는 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 선발하였다(도 9). 발현된 GFP를 확인하기 위하여 암시야 조건하에서 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 도 10과 같다. 이로부터, 본 발명의 발현벡터의 E3 위치에 삽입되는 외래 유전자는 E3 프로모터하에 발현됨을 알 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 발현벡터는 E3 위치에 삽입된 외래 유전자를 E3 프로모터하에 발현시킬 수 있는 것으로서, 돼지 유행성 설사병 및 돼지 전염성 위장염 등의 일정 유전자를 E3 위치에 삽입하여, 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 제작하고, 이를 이용하면 국내 돼지 사육농가에 심각한 경제적 피해를 야기시키는 돼지의 주요 바이러스성 전염병을 예방하는데 효과적이다.

Claims

도 2로 표시되며, 삽입될 외래 유전자를 E3(early region 3) 프로모터하에서 발현시키기 위한 재조합 발현벡터 pXBK에 있어서,

상기 발현벡터는 돼지아데노바이러스 4형 유래의 E3 유전자 위치에서 5'영역에 해당하며, 크기가 817bp인 제한효소 XbaⅠ-BamHⅠ단편의 pVⅢ 유전자와, 돼지 아데노바이러스 4형 유래의 E3 유전자 위치에서 3'영역에 해당하며, 크기가 979bp인 제한 효소 BamHⅠ-KpnⅠ단편의 fiber 유전자를 순서대로 포함함을 특징으로 하는 벡터 pXBK.
제 1항에 있어서, 외래 유전자는 발현벡터 pXBK의 1636bp의 BamHⅠ사이트에 삽입되며, 상기 외래 유전자는 형광발현단백질임(Green Fluorescent protein)임을 특징으로 하는 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 pVⅢ유전자는 프라이머 P8XF 5'-GCT CTA GAA TGA CCC TGG CGA AAG AG-3'와 프라이머 P8BR 5'-CGG GAT CCT TAT GGC GCG CTG TAG AG-3'를 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 증폭시킨 것이며, 도 3의 서열로 표시되는 것임을 특징으로 하는 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 fiber유전자는 프라이머 FIBBF 5'-CGG GAT CCT GAA TAA AAA CAT ACA CC-3'와 프라이머 FIBKR 5'-GGG GTA CCA AAT GAG GTG GGG GGA GA-3'를 사용하여 PCR 반응으로 증폭시킨 것이며, 도 4의 서열로 표시되는 것임을 특징으로 하는 벡터.
(1) 제 2항에 기재된 발현벡터의 pVⅢ 유전자-외래 유전자-fiber 유전자 부위를 KpnⅠ과 XbaⅠ으로 절단하는 단계;

(2) 플라스미드 pRLITR를 HindⅢ로 절단한 것과 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자를 대장균내에서 동질성 재조합(homologous recombination)하여 제작한 pPAV4의 E3 위치를 SalI으로 절단하여 선형화 DNA를 얻는 단계;

(3) 상기 (1)단계의 유전자와 상기 (2) 단계의 선형화 DNA를 대장균내에서 동질성 재조합하여 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 클로닝하는 단계; 및

(4) 클로닝된 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 I-pPolⅠ으로 절단한 후, 이를 돼지신장세포(porcine kidney 15 cells)에 형질도입시켜 재조합 돼지아데노바이러스 4형을 획득하는 단계;

를 포함함을 특징으로 하는 유전자 재조합 돼지아데노바이러스 4형의 제조방법.
제 5항에 있어서, 플라스미드 pRLITR은 돼지아데노바이러스 4형 게놈 유전자의 왼쪽 말단 ITR 영역에 해당하는 1986bp 부위와 오른쪽 말단 E4 영역에 해당하는 3.7Kb 부위를 각각 PCR 반응으로 증폭한 후 플라스미드 pBluescript SK(+)에 삽입한 것임을 특징으로 하는 제조방법.