CN1384759B - 单链寡聚脱氧核苷酸突变载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到预定的遗传变化在活体细胞的靶基因中的引入，该引入通过引入编码预定遗传变化的寡聚脱氧核苷酸来完成。该寡聚脱氧核苷酸在动物、植物和细菌细胞中有效。对于极大的提高了该寡聚脱氧核苷酸在细菌中的效能的特异的末端修饰进行了描述。令人惊奇的，未经修饰的寡聚脱氧核苷酸在包括肝细胞在内的哺乳类细胞中与经修饰的核苷酸同样有效，并且可能与杂体寡聚核苷酸同样有效或者更为有效，该杂体寡聚核苷酸由脱氧核苷酸和2’-0-甲基核苷酸的混合物组成。
Description
本发明为申报于1999年8月27日的U.S.申请序列号No.09/384,960的后续部分申请，所述的申请之披露在此全部引为参考。
1.发明领域
本发明涉及到单链寡聚脱氧核苷酸、其特定衍生物以及使用它们向活体细胞的靶基因的预定位置引入预定的变化的方法。该细胞可以是人工培养基或者生物体中的哺乳类、昆虫、鱼类、蠕虫类或者鸟类细胞，该细胞还可以是细菌细胞或者植物细胞。该靶基因可以是染色体基因或染色体外基因，即处于细菌人工染色体中的基因。
2.发明背景
在一种细胞的某一靶核酸的预定位置产生预定的变化的技术已经有所描述。这些技术利用了参与DNA修复以及同源重组的细胞酶。在这些技术中合成了一种含一种寡核苷酸或者寡核苷酸类似物，该类似物含有两个区域，这些区域具有靶基因的序列，这些序列侧生于被称为“增变区域(mutator region)”的区域，这些区域不同与靶基因。在本应用中，这样的寡核苷酸和类似物被统称为“突变载体”。这样的突变载体可向靶基因引入预定的遗传变化，该引入所利用的机制据信涉及到同源重组和/或核苷酸切割和修复。
Kmiec的美国专利号No.5,565,350和5,731,181描述了含有互补链的突变载体，其中第一条链含有核苷酸类似物，该类似物同第二条链的脱氧核苷酸形成Watson-Crick碱基对。Kumar和Metz的美国专利号No.6,004,804描述了二体突变载体的改进，该改进包括一种变体，增变区域只在该变体中的两条链的其中之一上存在。Kmiec类型突变载体在哺乳动物系统中的应用在美国专利号No.5,760,012中有所描述，并且同Kren等人的国际专利出版物WO98/49350和相关的美国专利申请序列号No.09/108,006中的大分子载体相关联。Kmiec类型的突变载体的应用的描述可见于Cole-Stauss et al.，1996，Science 273：1386；Kren et al.，1998，Nature Med4：285；Bandyopadhyayet al.，1999，J.Biol.Chem.274：10163。
Kmiec类型突变载体在植物细胞中的应用的描述见Pioneer Hi-Bred International的国际专利出版物WO99/25853，Kimeragen，Inc.的WO99/07865以及Zeneca Ltd.的WO98/54330。描述Kmiec类型载体在植物细胞中的应用的科学出版物包括Beetham et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8774和Zhu et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8768。
双链的Kmiec类型突变载体及其变体的应用的描述见Kumar和Metz的美国专利号No.6,004,804。Kumar和Metz的该出版物中指出Kmiec类型的载体及其变体可被用于细菌细胞。
单链寡核苷酸作为突变载体在啤酒酵母染色体基因中产生变化的应用，在来自耶鲁大学Dr.F.Sherman实验室的报道中有所描述。Moerschell et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：542-528以及Yamamoto et al.，1992，Yeast 8：935-948。在这些研究中所使用的突变载体的最佳长度为50个核苷酸。
使用一条160个核苷酸的单链和双链多聚核苷酸在染色体基因中产生变化的单独报道，可见于Hunger-Bertling et al.，1990，Mol.Cell.Biochem.92：107-116。单链聚核苷酸的结果是不明确的，这是因为仅仅分析了使用双链聚核苷酸的实验的产物。
488个碱基对的单链DNA片段，在囊性纤维化转膜传导调控基因中产生特定遗传变化的应用的报道见goncz et al.，1998，Hum.Mol.Genetics7：1913；以及Kunzelmann et al.，1996，Gene Ther.3：859。
长约40个核苷酸的单链寡聚脱氧核苷酸作为参照，而在哺乳类细胞中用于进行附加体基因的研究，在该研究中该寡聚脱氧核苷酸被共价连接于一种可形成三体的寡核苷酸，并且该寡聚脱氧核苷酸单独可导致附加体基因中每5×104中一次或更低频率的的预定遗传变化。Chanet al.，1999，J.Biol Chem.74：11541。单链寡聚脱氧核苷酸用于在哺乳动物细胞附加体基因中产生预定的变化的更早的报道见于Campbell et al.，1989，The New Biologist1：223。
本发明的一个方面涉及到一些寡聚脱氧核苷酸，这些寡聚脱氧核 苷酸通过一种indocarbocyanine染料的连接而被修饰。indocarbocyanine染料已知为出色的荧光团。适用于固相核苷酸合成的blocked indocarbocyanine β cyanoethy1 N，N-diisopropryphosphoroamididites的合成的描述，见美国专利号No.5,556,959和5,808,044。
本发明的第二个方面涉及到一种组合物，该组合物含有一种单链寡核苷酸，该寡核苷酸编码一种预定的遗传变化，该组合物还含有一种大分子组合物，该组合物含有一种该靶细胞表面受体的配基。在国际专利出版物WO93/04701中描述了一种组合物，该组合物含有多聚L-赖氨酸，它是去唾液酸糖蛋白受体的配基，以及一种21到24个核苷酸的反义寡聚脱氧核苷酸。
本发明的第三个方面涉及到对寡聚脱氧核苷酸的一种修饰，该修饰通过以一种3’-3’连接的核苷酸进行连接而完成。美国专利号No.5,750,669对这样一种修饰的寡聚脱氧核苷酸进行了说明。
在第二部分或者本申请的任何部分中对任何参考文献的引述和确证不应被解释成为承认这些参考为本发明的之前的技术。
3.发明概要
本发明基于出乎意料的发现，即单链寡聚脱氧核苷酸，特别是在经适当的修饰或处于含有适当的大分子载体的组合物中的情况下，该寡聚脱氧核苷酸在对细胞中的靶基因上产生预定的遗传突变中可以同先前工艺一样，即同Kmiec类型突变载体一样有效或者更为有效。适于本发明的应用的单链寡聚脱氧核苷酸在后文中被称为单链寡聚脱氧核苷酸突变载体或者SSOMV。
在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物以用于在诸如哺乳类这样的动物的细胞染色体基因中产生突变，该组合物由编码遗传变化的寡聚脱氧核苷酸和一种大分子载体组成。该载体可以是多阳离子水核脂囊泡或者脂类纳米球。在一个适用于体内应用的进一步的实施方案中，该载体进一步含有一种配基，该配基同被内化的一种细胞表面受体结合，该配基的例子如一种披网格蛋白小窝受体的配基，这样的受体的例子有去唾液酸糖蛋白受体、叶酸受体或者转铁蛋白受体。在一个优选的实施方案中，该单链寡聚脱氧核苷酸通过3’和5’封闭取 代物进行连接而修饰，这样的取代物的例子如3’-3’连接的胞嘧啶核苷酸和5’连接的靛羰花青(indocarbocyanine)染料。在另一个实施方案中，该修饰由以一种不可水解的键最3’和/或最5’的核苷酸间的磷酸二酯连接进行，该不可水解的键的例子如硫代磷酸二酯键或者phosphoramidiate键。
在第二个实施方案中，本发明提供了对编码预定的遗传变化的寡聚脱氧核苷酸的3’和5’末端核苷酸的修饰。本发明进一步基于预期之外的发现，即有些这样的修饰并不阻断该寡聚脱氧核苷酸产生遗传变化的效能。一个这样实施方案为3’-3’连接的胞嘧啶核苷酸和5’连接的靛羰花青染料的组合。经过这样的修饰，这些寡聚脱氧核苷酸在用于产生细菌细胞中的遗传变化时比对应的未修饰寡聚脱氧核苷酸有效50倍。
在第三个实施方案中，本发明提供了一些化合物以及用于向植物细胞中引入预定的遗传变化的方法，该过程通过向植物细胞的细胞核中引入一种编码预定的遗传变化的寡聚脱氧核糖核酸来完成。
在优选的实施方案中，该寡聚脱氧核糖核酸通过3’和5’封闭取代物进行连接而修饰，这样的取代物的例子如3’-3’连接的胞嘧啶核苷酸和5’连接的靛羰花青染料。在一个替代的实施方案中，该修饰由以一种不可水解的键替换最3’和/或最5’的核苷酸间的磷酸二酯连接进行，该不可水解的键的例子如硫代磷酸二酯键或者phosphoramidiate键。在替代的情况下，5’连接的indocarbocyanine染料和最3’核苷酸间的磷酸二酯键，这些不能水解的键，能够用于第三个实施方案。
本发明可通过参考下列具体实施方案的详细描述和阐释性实施例来进行全面的了解。
4.发明详述
SSOMV的序列基于与先前工艺的突变载体相同的原理。SSOMV的序列含有两个与靶序列同源的区域，这两个区域被的含有所需遗传变化的名为“增变区域”的区域所分隔。该增变区域所具有的序列可以同在靶序列上分隔这两个同源序列的序列长度相等，但是具有不同的序列。这样的一种增变区域导致了一个替换。或者，SSOMV中的同源区域可以彼此毗邻。而在靶基因上的具有相同的序列的这两个区域被一 个、两个或者更多个核苷酸分隔。这样的一种SSOMV导致了这些SSOMV中缺乏的核苷酸从靶基因中被缺失。同样，靶基因中与这些同源区域相同的的序列可能在该靶基因上相互毗邻但在SSMOV的序列上被一个或者更多个核苷酸所分隔。这样的一种SSOMV导致了对靶基因序列的插入。
SSOMV的核苷酸为脱氧核苷酸，除3’末端和/或5’末端的核苷酸间的键或者两个3’末端和/或5’末端的核苷酸间的键可以为硫代磷酸酯(phosphorothioate)或者phosphoramidate之外，这些核苷酸通过未修饰的磷酸二酯键连接。本文所用的核苷酸间键为一种SSOMV的核苷酸之间的键，并且该核苷酸间的键不包括3’末端核苷酸或者5’末端核苷酸与封闭替代物之间的的键，见下文。
SSOMV的长度取决于该靶基因所定位的细胞的类型。在靶基因为一种诸如哺乳动物或者鸟类这样的动物细胞的染色体基因的情况下，该SSOMV长度在25到65个核苷酸之间，优选的情况下在31到59个脱氧核苷酸之间，在最优选的情况下在34到48个脱氧核苷酸之间。同源区域的总长度通常比该SSOMV的长度短一个、两个或者三个核苷酸。增变核苷酸可在该SSOMV的多于一个位点引入，这在该SSOMV中产生了多于两个的同源区域。无论同源区域为两个还是多个，这些同源区域中至少两个区域的长度应各自不少于8个脱氧核糖核酸。
对于原核细胞，该SSOMV的长度在15到41个脱氧核苷酸之间。用于原核应用的寡聚脱氧核苷酸的优选长度取决于所使用的3’保护基团。当该3’保护基团为一种3’-3’连接的脱氧胞苷时，该寡聚核苷酸在优选的情况下为21到28个脱氧核苷酸，除此情况之外该最佳长度为25到35个脱氧核苷酸。因此，该同源区域的长度为总长度至少为14个脱氧核苷酸，并且至少两个同源区域应各自具有至少为7个脱氧核苷酸的长度。
对于植物细胞，该SSOMV的长度在21到55个脱氧核苷酸之间，并且由此该同源区域的长度为总长度至少20个脱氧核苷酸，并且至少两个同源区域应各自具有至少为8个脱氧核苷酸的长度。
在这些范围之内，该寡聚脱氧核苷酸的最佳长度根据GC含量而确定，GC含量越高，最佳寡聚脱氧核苷酸越短。但是，高于50％的GC含量是优选的。
SSOMV可被用于任何类型的动物细胞，例如，哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、鱼类细胞或者蠕虫(worm)(线虫)细胞。该SSOMV还可被用于任何类型的植物细胞。另外，该SSOMV还可被用于任何类型的细菌细胞，例如，革兰氏阳性细菌细胞或者革兰氏阴性细菌细胞。这些细菌的示例性类型包括，沙门菌属、大肠杆菌、假单胞菌、Ros tani等等。该细胞是否进行活跃的复制或者该靶基因是否活跃转录并不重要。但是，但该靶基因位于细菌内时，该细菌为RecA+十分重要。因此，常用于重组DNA工作的多数细菌株并不适用于本发明，这是由于为降低其中所克隆的质粒的稳定性这些细菌均为RecA-。进一步，在细菌细胞中该靶基因可定位于一种质粒或者一种细菌人工染色体(BAC)以及该细菌的染色体。
该SSOMV可经设计而互补于该靶基因的编码或者非编码链。当所需的突变为一种单碱基的替换时，在优选的情况下该增变核苷酸为一个嘧啶核苷酸。在一致于获得所需的功能性结果的程度上，增变核苷酸和互补链上靶定核苷酸在优选的情况下均为嘌呤核苷酸。编码颠换突变的SSOMV是特别优选的，即一个C或者T增变核苷酸分别同互补链上的C或者T核苷酸进行错配。
除寡聚脱氧核苷酸外，该SSOMV还可含有5’封闭的替代物，该替代物通过接头连接于5’末端碳原子。该接头除长度之外的化学性质并不重要，该长度在优选的情况下应至少6个原子并且该接头应是柔性的。
用于哺乳动物、鸟类或者植物细胞的5’封闭替代物除分子量之外的的化学性质并不重要，除了其分子量应少于1000道尔顿。多种无毒替代物如生物素、胆固醇或者其它甾类化合物或者一种非嵌加阳离子荧光染料(non-intercalating cationic fluorescent dye)均可被使用。然而，对于细菌系统的应用，该封闭替代物对于SSOMV的效果具有主要的影响，并且在优选的情况下为一种3，3，3’，3’-四甲基N，N’-氧烷基取代的靛羰花青。特别优选的用于制造SSOMV的试剂如Amersham Pharmacia Biotech，Pi scataway，NJ的Cy3TM以及Cy5TM，它们封闭phosphoroamidites，在掺入到寡聚核苷酸时它们分别产生了3，3，3’，3’-四甲基N，N’-异丙基取代的靛羰花青和靛羰花青染料。当靛羰花青为N-氧烷基取代时，它可以同5末端磷酸通过一个磷酸二酯 键方便地连接于该寡聚脱氧核苷酸5’末端。染料和寡聚脱氧核苷酸之间的染料接头的化学性质并不重要，可为合成的方便进行选择。当根据指导而使用商业化的Cy3phosphoroamidites时，所产生的5’修饰由一个封闭替代物和接头共同组成，它们为N-羟丙烷基，N’-磷脂酰基丙烷基3，3，3’，3’-四甲基靛单羰花青(indomonocarbocyanine)。
在另一个实施方案中，该靛羰花青染料，例如Cy3phosphoroamidites，可在该寡聚脱氧核苷酸被合成之后与其进行连接。
在优选的实施方案中，该靛羰花青染料在吲哚环的3位和3’位被四取代。这些取代物在理论上不受限制地防止该染料成为加嵌染料。在这些位置上的取代物的性质并不重要。
该SSOMV还可额外地含有3’封闭取代物。在该靶基因位于除细菌细胞之外的细胞中时，该3’封闭取代物的化学性质也不重要，只要无毒并且分子量低于1000。然而，当该靶基因位于细菌细胞内时，该优选的3’封闭取代物为所谓的反向核苷酸(inverted nucleotide)，即，通过未取代的3’-3’磷酸二酯键进行连接的核苷酸，如美国专利号No.5,750,669所述。在一个更加优选的实施方案中，该反向核苷酸为一个胸苷或者在最优选的情况下为脱氧胞苷。对于细菌细胞中的应用，Cy35’封闭的替代物和反向脱氧胞苷3’封闭替代物的组合特别优选，这是因为这两种修饰对于SSOMV的效能具有协同作用，具有上述修饰的SSMOV可通过传统固相核苷酸合成方法合成。
该SSOMV可通过一些用于向植物或者动物细胞中引入Kmiec类型突变载体的技术，而引入含有该靶基因的细胞。对于细菌细胞，引入该SSMOV的一种优选的方法为电穿孔。
对于以包括哺乳类细胞和鸟类细胞在内的动物细胞进行的应用，向细胞进行递送的优选的方法通过使用保护性的大分子载体而进行。商业化的脂质体转染试剂如LipofectamineTM和SuperfectTM经设计以使待转染核酸通过静电连接于该脂质体的表面。这样的载体的优选程度不如保护性的大分子载体。适当的保护性大分子载体披露于国际专利出版物WO98/49350以及WO99/40789以及Bandyopadhay et al.，1999，J.Biol.Chem.274：10163，这些均在此全部引为参考。
一种特别优选的大分子载体为水核心的脂类囊泡或者脂质体，其 中SSOMV深埋于水核心中。这样的囊泡的制作是通过利用不含溶剂的脂薄膜并向其中加入SSOMV的水溶液，随后进行振荡、挤出或者通过一种微滤膜排出。在一个优选的实施方案中，该脂组分为二油酰基磷脂酰胆碱/二油酰基磷脂酰丝氨酸/半乳糖脑苷脂(galactocerebroside)的1∶1∶0.16的混合物。其它的载体包括多阳离子，例如聚乙醇胺，该多阳离子的分子量在500到1.3Md之间，适当的种类的分子量为25Kd，其它的载体还包括脂类纳米球体，SSOMV在其中以亲脂性盐类的形式提供。
当该SSOMV被用于向哺乳动物或者鸟类细胞中引入遗传变化时，该大分子载体在优选的情况下进一步含有一种内化的细胞表面受体的配基。适当的受体为可经过披网格蛋白小窝途径进行内化的受体，例如脱唾液酸糖蛋白受体、表皮生长因子受体以及转铁蛋白受体。同样适用的还有通过caveolar途径进行内化的受体，例如叶酸受体。半乳糖脑苷脂为脱唾液酸糖蛋白受体的一种配基。本文所使用的可内化的受体为一种可通网格蛋白小窝途径或者通过caveolar途径进行内化的受体。
该SSOMV可被用于任何先前工艺的突变载体所应用的目的。具体的应用包括通过回复导致疾病的遗传损害而进行的遗传疾病的治疗；这样的疾病包括血友病、α1抗胰岛素缺陷和Crigler-Najjar症以及国际专利出版物WO98/49350所指出的的其它疾病。
在替代的情况下，该SSOMV可用于对植物进行修饰，该修饰出于国际专利出版物WO99/07865所描述的目的，该出版物在此全文引为参考。SSOMV在植物中的其它用途为抗除草剂植物的产生，该产生过程通过避免向作物植物中引入外源或者异源基因的手段进行。特别令人感兴趣的是对除草剂草甘磷的抗性。对导致草甘磷抗性的突变的鉴别可见于国际专利出版物WO99/25853以及WO97/04103。
在替代的情况下，该SSOMV可被用于修饰细菌。SSOMV对于细菌的遗传操作在抗生素生产，以及用于疫苗生产的具体减毒菌的构建的领域中特别具有价值。在上述两种应用中，抗生素抗性基因不存留于最终的修饰细菌中是十分重要的。
更进一步，该SSOMV可同一种细菌人工染色体(BAC)联合应用于修饰一种靶基因，该靶基因来自于任何物种，且被克隆入该BAC。比该 靶基因更大的片段可被引入．具有该被克隆的靶基因的BAC可被置入一种细菌宿主中，并且根据本发明而引入了一种预定的遗传变化。可对具有该预定的遗传变化的BAC亚克隆进行鉴定，并且取出该插入片段用于进一步的应用。本发明允许进行预定变化，而不需要进行PCR片段的制备以及将该片段插回源基因的过程中所伴随的时间和花销。
5．实施例1：Gunn大鼠的处理
Gunn大鼠在UDP-葡萄糖醛酰转移酶基因上含有突变，该基因与Crigler-Najjar病中被突变的基因为同一基因。Roy-Chowdhury eta1.，1991，J.Bi01.Chem.266：18294；Iyanangi et a1.，1989，J.Bio1.Chem.264：21302。在Gunn大鼠中核苷酸1206上有一个突变，该突变缺失了一个G。名为CN3-35UP的一个35个核苷酸的SSOMV同该反义链相对应，该SSOMV被构建用于反转该突变并且具有以下的序列：5'-ATCATCGGCAGTCATTT c CAGGACATTCAGGGTCA-3′(SEQ ID NO：1)，。对应于反义链的第二条SSOMV，CN3-35LOW，具有以下的序列：
5'-TGACCCTGAATGTCCTG G AAATGACTGCCGATGAT-3′(SEQ ID NO：2).。黑体字为增变核苷酸。
5，Cy3，3’-3'dC修饰的CN3-35UP(两只动物)以及CN3-35LOW以及未修饰的CN3-35UP在水核心的脂囊泡中被制剂化，该脂囊泡具有的脂类组分为比例为1∶1∶0.16的二油基磷脂酰胆碱/二油基磷脂酰丝氨酸/半乳糖脑苷脂。约2ml的含有500μg该SSMOV的5％的葡萄糖被用于水化2mg的脂，随后排挤出直径为0.5μm的囊泡。包囊化的效率为80％。阳性参照组以等摩尔量的Kmiec型MV(2只动物)在同样的载体中进行处理。以300μg的SSOMV或者载体对重250克的大鼠连续处理5天。mg/d1表示的所产生的血清胆红素如下。
数据显示，经修饰或者未经修饰的SSMOV以及有义和反义序列至 少是等价的，并且在更长的时间点上SSOMV表现出优于Kmiec型突变载体。
6.实施例2：人类UDP-葡萄糖醛酰转移酶基因的修饰
以下的例子显示，在大分子载体中的未修饰的SSOMV可被用于向人工培养基中的哺乳类细胞中引入特定的遗传变化，其比率为Kmiec型DNA/2’OMERNA突变载体中所观察到的比率的三倍之内。数据进一步显示最小如单phosphorothioate键这样的修饰可导致完全可比的比率。
安曼教派(Amish)的一个群体的人患有Crigler-Najjar病，该病由UDP-葡萄糖醛酰转移酶基因上的222位核苷酸上的一个C→A替换所导致。该突变导致TAC(Tyr)变为一个TAA终止密码子。一种SSMOV经设计用于向人类肝细胞瘤细胞系HuH-7中引入该致病突变。名为CNAM3-35UP的一种35个核苷酸的SSOMV对应于反义序列并且具有以下序列：
5′-GGGTACGTCTTCAAGGTT TAAAATGCTCCGTCTCT-3′(SEQ ID NO：3)。增变核苷酸为黑体字。
向106/cm2的HuH-7细胞中加入300μl的根据实施例1的方法制造的载体，这些载体含有CNAM3-35UP，各种修饰的CNAM3-35UP以及等摩尔量的82核苷酸的Kmiec型突变载体。收集细胞并且通过PCR扩增相关基因，克隆并根据上文提及的Bandyopadhyay的方法，通过等位基因特异杂交进行分析。观察到了下列转换比率：
未修饰SSOMV 6％
5’Cy3 SSOMV 15％
3’-3’dC SSOMV 5％
5’Cy3，3’-3’dC SSOMV 15％
5’phos’thioate SSOMV 16％
3’phos’thioate 12％
Kmiec型MV 14％
这些数据显示，在大分子载体存在的情况下，经修饰的SSOMV同Kmiec型突变载体同样有效，并且未经修饰的SSOMV的效率在其三倍之内。
7.实施例3：一个BAC中的卡那霉素抗性的转换
以下的例子显示，修饰的SSOMV在细菌细胞中比KmiecDNA/2’OMeRNA突变载体更为有效。
卡那霉素经一个框架内的ATG终止密码子的插入而失活。卡那霉素抗性通过将第三个核苷酸转换成为C而恢复，即，在第三位核苷酸上进行转换。
对应于用于卡那霉素抗性恢复的有义链的41个nt的SSOMV的序列如下：
5′-GTGGAGAGGCTATTCGGCTA C GACTGGGCACAACAGACAAT-3′(SEQ ID NO：4)。增变核苷酸为黑体字。
为产生pBACKans，向pKans的单一SmaI位点内插入一个BamHI接头，并将所产生的含有该突变卡那霉素基因的1.3kb的BamHI-HindIII片段插入克隆有载体pBeloBAC11的BAC的BamHI/HindIII位点(Genome Systems，Inc.，St.Louis，MO)。以pBACKans转化大肠杆菌菌株MC1061和DH10B，在LB氯霉素平板上进行选择，并且制造电感受态。
以5到10μg的SSOMV对40μl电感受态细胞进行电穿孔，该电穿孔使用以下的条件：25KV/cm，200ohms，25微法。电穿孔后立即向这些细胞中加入1mL的SOC，培养物在37℃下振荡生长1小时。加入4mL的LB+氯霉素(终浓度12.5μg/mL)并且该培养物在37℃下再振荡生长2小时。适当稀释度的培养物被涂布于LB-氯霉素平板上以使其生存，并同样在LB-卡那霉素平板上涂布以进行转换。通过以每毫升的卡那霉素抗性菌落数除以每毫升的氯霉素抗性菌落数来计算转换频率。
使用5’Cy3，3’-3’dC修饰的25个核苷酸的SSOMV的转换率对应于每100个存活细菌一次转换。相对转换率为：
68nt Kmiec MV w/2′OMe RNA接头 0.04
68nt Kmiec MV w/DNA接头0.004
41nt SSOMV w/3′，5′phos′thioate 0.4
35ntSSOMVw/3′，5′phos′thioate 4.0
29nt SSOMV w/3′，5′phos′thioate 0.9
25nt SSOMV w/3′，5′phos′thioate 1.0
41nt SSOMV w/3′-3′dC，5′Cy3 2.0
35nt SSOMV w/3′-3′dC，5′Cy3 2.9
35nt SSOMV w/3′-3′dC， 2.5
35nt SSOMV w/5′Cy3 2.5
29nt SSOMV w/3′-3′dC，5′Cy3 4.2
25nt SSOMV w/3′-3′dC，5′Cy3 42.0
25nt SSOMV w/3′-3′dC 1.3
25nt SSOMV w/5′Cy3 1.8
25nt SSOMV w/3′phos′thioate，5′Cy3 8.4
35nt SSOMV w/3′phos′thioate，5′Cy3 10.2
这些数据显示，最优的SSOMV的转换率比Kmiec型突变载体高出103到104。
8.实施例4：无保护性载体的SSOMV在哺乳动物细胞-潮霉素抗性中的应用
本实施例显示了在不存在保护性大分子载体的情况下，使用经修饰的SSOMV对哺乳类细胞的修饰。经修饰的SSOMV能够在高出Kmiec型突变载体15到30倍的效率下引入遗传修饰。该实施例使用了与实施例3相同的基因；但是该基因在HuH-7细胞系中表达。
HUH7细胞的一个克隆，在含有IRES的载体(pIRESkan-)中含有一个稳定整合的突变体卡那霉素基因的拷贝，该克隆在潮霉素选择下产生。这些细胞在DEME高葡萄糖/10％FBS中培养，该培养基中含有100mg/ml的潮霉素以维持整合结构体的高表达。转染前24小时这些细胞在1.0×106的细胞密度下在100mm培养皿中生长。转染前2小时以10ml的Opti-MEMTM替换该生长培养基。在含有200ml pH8.5的Opti-MEM的隔离试管中稀释40微克寡聚核苷酸以及40ml(80μg)的LipofectamineTM。随后将该Lipofectamine加入寡聚核苷酸，以微量移液器进行混合，并在加入3.6ml pH8.5的Opti-MEM之前在室温下温育30分钟。从细胞中析出该培养基并代之以4ml转染混合物。在以转染混合物替换标准生长培养基之前在37℃下培养这些细胞2小时。转染后2天这些细胞被分入两个100mm的培养皿中，培养皿中有10ml含有450mg/ml G418的培养基。在10天内每天更换含G418的培养基， 随后每更换两次直至在显微镜下可见到细胞菌落(转染后16-18天)。在转染后约21天检选克隆并扩增用于分子分析。
潮霉素抗性基因的发生的背景频率为约每106一次，当使用Kmiec型突变载体时在抗性菌落数量上没有增加。对5个菌落中的一个进行的序列分析表明该菌落已经获得了特异性突变。其它4个菌落的突变不可鉴定。当使用一种41核苷酸的SSOMV w/3’-3’dC，5’Cy3时，潮霉素抗性基因的发生频率增加了15到30倍，即，提高至每105三次。对这些菌落的序列分析表明100％到80％菌落具有正确的遗传变化。使用35nt SSOMV w/3’-3’dC，5’Cys或者w/3’phosphorthioate5’Cy3或者w/在3’和5’末端的2个pho s phor thi oa t e接头而进行的实验所显示的潮霉素抗性基因的发生频率，约为经修饰的41个核苷酸的SSOMV的一半。
9.实施例5：无保护性载体的SSOMV在哺乳动物细胞-酪氨酸酶中的应用
本实施例表明，在哺乳动物细胞中无保护性载体的未经修饰的SSOMV可能优于经5’Cy3/3’-3’dC修饰的SSOMV，并且优于Kmiec型DNA/2’OMe RNA突变载体。
这些实验使用Melan-c，一种小鼠黑色素细胞系，该细胞系在酪氨酸酶基因的82位密码子上具有一个C→G，该突变产生了一个框架内终止。Bennett，et al.，1989，Development105：379。一个35个核苷酸的SSOMV经设计对应于编码序列，并且具有以下的序列：5’-CCCCAAATCCAAACTTACAGTTTCCGCAGTTGAAA-3’(SEQ ID NO：5)。增变序列为黑体字母。
在RPMI培养基中培养Melan-c细胞，该培养基中含有10％的胎牛血清，100nM的(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)以及0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco，Bethesda，MD)。转染前两天，在一个6孔板中以0.5-1.5×105细胞/孔的密度培养细胞并且在转染前24小时换新培养基。在室温下将5-10微克(220-440nM)的寡聚核苷酸同6-9μg的SuperfectinTM在0.1ml的TE(10mM TRISpH7.5，1mM EDTA)中保温30分钟。向含有0.9mlDMEM高葡萄糖培养基的细胞中加入转染混合物，该培养基中含有10％的血清和100nM的PMA。6-18个小时之后， 以磷酸盐缓冲液洗涤细胞并加入2ml的DMEM培养基。通过显微镜检测细胞在染色中的变化。通过在转染后5到8天计算染色细胞或细胞簇的数目来确定转换事件数。
每105个细胞中的白化→野生型(被染色)转换频率如下：
Kmi ec型MV 1
未修饰的SSOMV 5
SSOMV w/3’，5’phos’thioate 6
SSOMV w/3’-3’dC 2
SSOMV w/5’Cy3 3
SSOMV w/3’-3’dC，5’Cy3 1
10.实施例6：经修饰的SSOMV在植物中的应用
本实施例涉及到SSOMV在向arabodopsis thaliana的乙酰羟酸合成酶(亦称为acetolatate合成酶)的653位引入Ser→Asn突变中的应用。该突变需要将一个AGT密码子转换成为AAT密码子，并且该突变引入了对咪唑啉除草剂以及磺酰基脲除草剂的抗性。
一种25个核苷酸的SSOMV和35个核苷酸的SSOMV经合成而具有3’-3’dC以及5’Cy3修饰，并且它们分别具有以下的序列：5’-CGATCCCGAA TGGTGGCACTTT-3’(SEQ ID NO：6)，
5′-CGATCCCGA A TGGTGGCACTTT-3′(SEQ ID NO：6)，5′-GTTGCCGATCCCGA ATGGTGGCACTTTCAACG-3′(SEQ ID NO：7)。增变核苷酸为黑体字母。
制备106每平板的A.thaliana分散细胞群体并且对其进行该SSOMV或者具有相同序列的Kmiec型MV的生物弹射击法引入。使用一种质粒的参照平板测定该生物弹射击法系统效率约为每200个平板细胞一次递送。以10μM ImazaquinTM进行2个月的选择后，各个经生物弹射击法处理的细胞群体表现出对Imazaquin抗性的背景校正率约为每103个成功引入该突变载体的细胞出现一次。
11.实施例7：叶酸盐偶联的PEI的制备
本实施例描述了叶酸盐偶联的PEI的制备，该PEI适于在本发明中被用作为大分子载体。
磷酸钠缓冲液(1.5mL，133mM，pH4.5)中的叶酸(4.4mg，10μmole) 经200μL吡啶和1-(3-)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC，15.5mg，98μmol)处理并且在室温下温育1小时。将该活化的叶酸盐溶液(1.7mL)加入聚乙烯亚胺的水溶液(25kDa，24.55mg/ml；1.02mL)并且在室温下轻微搅拌保温3天。通过以一种12kDa分子量阻留膜对水进行透析而纯化被偶联的聚乙烯亚胺。该产物经水合茚三酮分析为胺阳性，经在最大为259，289和368nm的UV吸收分析为叶酸盐阳性。
偶联结果为每1000胺上1-2个叶酸结构，这相当于每个PEI分子1-2个叶酸。
本发明并非局限于本文所描述的具体实施方案的范围内。实际上，从先前的描述和附图出发，除本文所描述之外的本发明的各种修饰对于本领域的技术人员是很明显的。这些修饰也应处于附上的权利要求的范围之内。
本文引用了多种出版物，这些出版物全部引为参考。
序列表
<110>VALIGEN(美国)公司
<120>单链寡聚脱氧核苷酸突变载体
<130>7991-085-228
<140>PCT/US00/23457
<141>2000-08-25
<150>09/384,960
<151>1999-08-27
<160>7
<170>适用于Windows 3.0版的Fast SEQ
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡聚脱氧核苷酸突变载体
<400>1
atcatcggca gtcatttcca ggacattcag ggtca 35
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡聚脱氧核苷酸突变载体
<400>2
tgaccctgaa tgtcctggaa atgactgccg atgat 35
<210>3
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡聚脱氧核苷酸突变载体
<400>3
gggtacgtct tcaaggttta aaatgctccg tctct 35
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡聚脱氧核苷酸突变载体
<400>4
gtggagaggc tattcggcta cgactgggca caacagacaa t 41
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡聚脱氧核苷酸突变载体
<400>5
ccccaaatcc aaacttacag tttccgcagt tgaaa 35
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡聚脱氧核苷酸突变载体
<400>6
cgatcccgaa tggtggcact tt 22
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡聚脱氧核苷酸突变载体
<400>7
gttgccgatc ccgaatggtg gcactttcaa cg 32
Claims (12)
1.用于获得哺乳动物细胞的方法，该哺乳动物细胞在靶基因上含有预定的遗传变化，该方法包括：
(a)提供培养基中的哺乳动物细胞群体；
(b)将下述的组合物加入培养基；并且
(c)对群体中的具有该预定的遗传变化的细胞进行鉴定，其中，所述哺乳动物细胞不是胚胎干细胞
所述的组合物用于在哺乳类或鸟类细胞的靶基因上产生预定的遗传变化，该组合物含有：
(a)单链寡聚脱氧核苷酸，该寡聚脱氧核苷酸具有3’末端核苷酸，5’末端核苷酸，具有至少31个脱氧核苷酸和不超过59个脱氧核苷酸，并且具有含有至少两个区域的序列，每个区域至少8个脱氧核苷酸，这些区域分别与靶基因上的至少两个区域相同，这些区域总共长至少24个核苷酸，并且这些区域被该靶基因的序列中或者该寡聚脱氧核苷酸的序列中或同时两者的序列中的至少一个核苷酸所分隔，以便该寡聚脱氧核苷酸的序列与靶基因的序列不相同；以及
(b)大分子载体，这些载体选自
(i)水核心的脂类囊泡，其中该水核心含有该单链寡聚脱氧核苷酸，
(ii)脂类纳米球体，该球体含有该单链寡聚脱氧核苷酸的亲脂性盐，以及
(iii)多聚阳离子，其具有500道尔顿至1.3Md的平均分子量，其中该多聚阳离子同该单链寡聚脱氧核苷酸形成盐。
2.权利要求1的方法，该方法进一步包括对被鉴定的细胞进行分离。
3.用于获得哺乳动物细胞的方法，该哺乳动物细胞在靶基因上含有预定的遗传变化，该方法包括：
(a)提供培养基中的哺乳动物细胞群体；
(b)将下述的化合物加入培养基；并且
(c)对群体中的具有该预定的遗传变化的细胞进行鉴定，其中，所述哺乳动物细胞不是胚胎干细胞
所述的化合物用于在哺乳类或鸟类细胞的靶基因上产生预定的遗传变化，该化合物含有单链寡聚脱氧核苷酸，其具有3’末端核苷酸，5’末端核苷酸，具有至少25个脱氧核苷酸和不超过65个脱氧核苷酸，并且具有含有至少两个区域的序列，每个区域至少8个脱氧核苷酸，这些区域分别与靶基因上的至少两个区域相同，这些区域总共长至少24个核苷酸，这些区域被该靶基因的序列中或者该寡聚脱氧核苷酸的序列中或同时两者的序列中的至少一个核苷酸所分隔，以便该寡聚脱氧核苷酸的序列与靶基因的序列不相同。
4.用于获得哺乳动物细胞的方法，该哺乳动物细胞在靶基因上含有预定的遗传变化，该方法包括：
(a)提供培养基中的哺乳动物细胞群体；
(b)将下述的化合物加入培养基；并且
(c)对群体中的具有预定的遗传变化的细胞进行鉴定，其中，所述哺乳动物细胞不是胚胎干细胞
所述的化合物用于在哺乳类或鸟类细胞的靶基因上产生预定的遗传变化，该化合物含有单链寡聚脱氧核苷酸，其具有3’末端核苷酸，5’末端核苷酸，具有至少25个脱氧核苷酸和不超过65个脱氧核苷酸，并且具有含有至少两个区域的序列，每个区域至少8个脱氧核苷酸，这些区域分别与靶基因上的至少两个区域相同，这些区域总共长至少24个核苷酸，这些区域被该靶基因的序列中或者该寡聚脱氧核苷酸的序列中或同时两者的序列中的至少一个核苷酸所分隔，以便该寡聚脱氧核苷酸的序列与靶基因的序列不相同，其中，连接于3’末端核苷酸的核苷酸间的键为硫代磷酸酯键；其中连接于5’末端核苷酸的核苷酸间的键为硫代磷酸酯键。
5.用于获得植物细胞的方法，该植物细胞在靶基因上含有预定的遗传变化，该方法包括：
(a)将下述的化合物引入植物细胞的群体；并且
(b)对群体中的具有该预定的遗传变化的细胞进行鉴定
所述的化合物用于在植物细胞的靶基因上产生预定的遗传变化，该化合物含有单链寡聚脱氧核苷酸，该单链寡聚脱氧核苷酸具有3’末端核苷酸，5’末端核苷酸，具有至少21个脱氧核苷酸和不超过55个脱氧核苷酸，并且具有含有至少两个区域的序列，每个区域至少8个脱氧核苷酸，这些区域分别与靶基因上的至少两个区域相同，这些区域总共至少长20个核苷酸，并且这些区域被该靶基因的序列中或者该单链寡聚脱氧核苷酸的序列中或同时两者的序列中的至少一个核苷酸所分隔，以便该寡聚脱氧核苷酸的序列与靶基因的序列不相同。
6.权利要求5的方法，该方法进一步包括对被鉴定的细胞进行分离。
7.权利要求5的方法，其中5’末端核苷酸的5’羟基被连接于5’封闭取代基。
8.权利要求7的方法，其中3’末端核苷酸的3’羟基被连接于3’封闭取代基。
9.权利要求8的方法，其中
(a)该5’封闭取代基为N’-羟烷基取代3，3，3’，3’-四取代的靛羰花青染料，该染料通过接头连接于5’末端核苷酸的5’羟基；并且
(b)该3’封闭取代基为封闭核苷酸，该核苷酸被3’-3’连接于该3’末端核苷酸的3’羟基。
10.权利要求9的方法，其中该单链寡聚脱氧核苷酸长度至少为25个脱氧核苷酸并且不多于35个脱氧核苷酸。
11.权利要求9的方法，其中该封闭核苷酸为脱氧胞苷或者胸苷。
12.权利要求9的方法，其中该靛羰花青染料同接头一起为N-羟丙基，N’-磷脂酰丙基3，3，3’，3’-四甲基靛单羰花青。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: CIBUS GLOBAL, LTD. Free format text: FORMER OWNER: VALIGENE CORP. Effective date: 20120806 |
|
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| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: British Isles Applicant after: VALIGEN (US), Inc. Address before: British Isles Applicant before: VALIGEN (US), Inc. Address after: British Isles Applicant after: VALIGEN (US), Inc. Address before: California, USA Applicant before: Saibusi Global Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: CIBUS GLOBAL, LTD. TO: CIBUS INTERNATIONAL SA |
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Effective date of registration: 20120806 Address after: California, USA Applicant after: Saibusi Global Ltd. Address before: American Pennsylvania Applicant before: Valigene Corp. |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190927 Address after: Capelle, Netherlands Patentee after: Cybex Europe Address before: British Virgin Islands Patentee before: VALIGEN (US), Inc. |
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| CX01 | Expiry of patent term | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20130522 |