JP2003508451A

JP2003508451A - 一本鎖オリゴヌクレオチド変異ベクター

Info

Publication number: JP2003508451A
Application number: JP2001520151A
Authority: JP
Inventors: メッツ，リチャード，エイ．; フランク，ブルース，エル．; ウォルター，デブラ，エム．
Original assignee: バリゲン（ユーエス）インコーポレイテッド
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2003-03-04
Anticipated expiration: 2020-08-25
Also published as: EP2266627B1; ATE478687T1; AU7076700A; EP1210123A1; EP1210123B1; CA2382120A1; AU773242C; DE60044876D1; EP2324856B1; DK2266627T3; CA2382120C; ES2544727T3; US20040023392A1; EP2266627A1; PT2324856E; DK2324856T3; ZA200201228B; EP2324856A1; WO2001015740A1; BR0013590A

Abstract

(57)【要約】本発明は、所定の変化をコードするオリゴデオキシヌクレオチドを導入することにより、生細胞の標的遺伝子の中に所定の遺伝子変化を導入することに関する。このオリゴデオキシヌクレオチドは、動物、植物および細菌の細胞において有効である。細菌においてこのオリゴデオキシヌクレオチドの効率を大いに増大させる特定の末端修飾について記載している。驚いたことに、非修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、in vivoの幹細胞を含む哺乳動物細胞において、修飾ヌクレオチドと同様に効果的であり、デオキシヌクレオチドおよび2'-O-メチルリボヌクレオチドの混合物からなるキメラオリゴヌクレオチドと同等またはそれ以上に効果的であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、1999年8月27日出願の米国出願番号第09/384,960号の一部継続出願
であり、該出願の開示は全て本出願中に参照として組み込むこととする。

【０００２】１．発明の背景本発明は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、その特定の誘導体、および生
細胞内の標的遺伝子中の所定の位置に所定の変化を導入するためのこれらの使用
に関する。細胞は、哺乳動物、昆虫、魚類、蠕形動物もしくは鳥類の細胞でよく
、これらは人工的培養培地中にあるものでも器官内にあるものでもよく、または
細菌細胞もしくは植物細胞であってもよい。標的遺伝子は、染色体内の遺伝子で
もよく、染色体外の遺伝子（つまり、細菌人工染色体上の遺伝子）でもよい。

【０００３】２．発明の背景細胞の標的核酸配列内の所定の位置に所定の変化をもたらす技術は既に記載さ
れている。これらの技術は、DNAの修復および相同組換えに関する細胞の酵素を
利用する。これらの技術では、標的遺伝子とは異なる「変異誘発領域（mutator
region）」と呼ばれる領域に隣接する２つの標的遺伝子配列を有している領域を
含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を合成する。本明細書
中では、このようなオリゴヌクレオチドおよび類似体は概して「変異ベクター（
mutational vector）」と呼ぶ。このような変異ベクターにより、相同組換えな
らびに/または核酸の切除および修復に関与すると考えられる機構により標的遺
伝子内に所定の遺伝子変化を導入することができる。

【０００４】 Kmiecに付与された米国特許第5,565,350号および第5,731,181号には、第１鎖
に第２鎖のデオキシリボヌクレオチドとワトソンクリック型塩基対を形成するリ
ボヌクレオチド類似体を含む相補鎖を含有する変異ベクターが記載されている。
KumarおよびMetzに付与された米国特許第6,004,804号は、その変異誘発領域が二
本鎖の一方の鎖にだけ存在する変異体を含む二重鎖変異ベクターの特定の改良に
ついて記載している。Kmiec型の変異ベクターの哺乳動物系における使用は、米
国特許第5,760,012号に記載されており、ならびにKrenらの国際特許出願公開番
号WO98/49350中に高分子担体と併せて、および関連米国特許出願番号第09/108,0
06号に記載されている。さらに、Kmiec型の変異ベクターの使用についての記載
は、Cole-Straussら、1996,Science 273: 1386; Krenら、1998, Nature Med. 4:
285; およびBandyopadhyayら、1999, J. Biol. Chem. 274: 10163に見られる。
植物細胞におけるKmiec型の変異ベクターの使用は、Pioneera Hi-bred Internat
ionalの国際特許出願公開番号WO99/25853、Kimeragen, Incの国際特許出願公開
番号WO99/07865、Zeneca Ltd.の国際特許出願公開番号WO98/54330中に記載され
ている。植物におけるKmiec型の変異ベクターの使用を記載している科学刊行物
には、Beethamら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8774およびZhuら、1
999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8768がある。

【０００５】二本鎖のKmiec型変異ベクターおよびその変異体の使用は、KumarおよびMetzに
付与された米国特許第6,004,804号に記載されている。、KumarおよびMetzの出願
は、とりわけ、細菌細胞においてKmiec型変異ベクターおよびその変異体を使用
できることを教示している。

【０００６】酵母S. cerevisiaeの染色体内の遺伝子における変化をもたらす変異ベクター
としての一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの使用は、エール大学のＦ.Sherman
博士の研究室から発表された報告に記載された（Moerschellら、1988, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 85: 524-528およびYamamotoら、1992, Yeast 8: 935-948
）。これらの研究に用いる変異ベクターの最適な長さは、50ヌクレオチドであっ
た。

【０００７】染色体内の遺伝子に変化をもたらす試みへの160ヌクレオチドの一本鎖および
二本鎖ポリヌクレオチドの使用についての１つの報告は、Hunger-Bertling, 199
0, Mol. Cell. Biochem. 92: 107-116に見受けられる。二本鎖ポリヌクレオチド
を用いる実験の産物しか解析されていないので、一本鎖ポリヌクレオチドについ
ての結果ははっきりしなかった。

【０００８】嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子遺伝子に特異的な遺伝子変化をもたらす
ための488塩基対からなる一本鎖DNA断片の使用は、Gonczら、1998, Hum. Mol. G
enetics 7: 1913;およびKunzelmannら、1996, Gene Ther. 3:859により報告され
ている。

【０００９】哺乳動物細胞において、長さが約40ヌクレオチドの一本鎖オリゴデオキシヌク
レオチドは、エピソーム遺伝子の研究の対照として用いられ、該オリゴデオキシ
ヌクレオチドは、３重鎖形成オリゴヌクレオチドに共有結合し、該オリゴデオキ
シヌクレオチド単独で約5Ｘ10⁴につき１個またはもっと少ない割合でエピソーム
遺伝子の所定の遺伝子変化をもたらした（Chanら、1999, J. Biol. Chem. 74: 1
1541）。哺乳動物細胞内のエピソーム遺伝子の中に所定の変化をもたらすための
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの使用についてのさらに以前の報告は、Camp
bellら、1989, The New Biologist 1:223に見られる。

【００１０】本発明の第一の態様は、インドカルボシアニン色素を結合させることにより修
飾されたオリゴデオキシヌクレオチドに関する。インドカルボシアニン色素は、
優れた蛍光発光団として知られている。固相ヌクレオチド合成への使用に好適な
ブロック化インドカルボシアニンβシアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホロア
ミダイト合成は、米国特許第5,556,959号および第5,808,044号に記載されている
。

【００１１】本発明の第２の態様は、所定の遺伝子変化をコードする一本鎖オリゴヌクレオ
チド、および標的細胞の表面にある受容体に対するリガンドを含む高分子担体を
含む組成物に関する。ポリ-Ｌ−リジン、アシアロ糖タンパク質受容体に対する
リガンド、および21〜24ヌクレオチドのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ
ドを含む組成物は、国際特許出願公開番号WO93/04701に記載されている。

【００１２】本発明の第３の態様は、3'-3'結合ヌクレオチドの結合によるオリゴデオキシ
ヌクレオチドの修飾に関する。米国特許第5,750,669号は、かかる修飾オリゴデ
オキシヌクレオチドを教示している。

【００１３】本明細書中の第２節またはいずれかの節におけるあらゆる参照の引用または特
定は、かかる参照が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解
釈するべきではない。

【００１４】３．発明の概要本発明は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドが、特に、適切に修飾されてい
るか、または適切な高分子担体と共に組成物中に含まれる場合、細胞内の標的遺
伝子における所定の遺伝子変化を作製するのに先行技術（即ち、Kmiec型変異ベ
クター）と同等またはそれ以上に効果的であり得るという予想外の発見に基づい
ている。本発明に適切な一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、以後、一本鎖オ
リゴデオキシヌクレオチド変異ベクターまたはSSOMVと呼ぶ。

【００１５】 1実施形態では、本発明は動物（例えば、哺乳動物）の細胞の染色体内の遺伝
子に変化をもたらすための、遺伝子変化をコードするオリゴデオキシヌクレオチ
ドおよび高分子担体からなる組成物を提供する。該担体は、ポリカチオン、水溶
性コア脂質小胞または脂質ナノスフェアのいずれかであってよい。in vivoでの
使用に好適なさらなる実施形態では、該担体には、クラスリン被覆小孔受容体（
例えば、アシアロ糖タンパク質受容体、葉酸受容体、またはトランスフェリン受
容体など）に対するリガンドなどの、細胞内に移行する細胞表面受容体に結合す
るリガンドがさらに含まれる。好ましい実施形態では、オリゴデオキシヌクレオ
チドは、3'-3'結合シトシンヌクレオチドおよび5'結合インドカルボシアニン色
素などの3'および5'ブロッキング置換基の結合により修飾される。他の実施形態
では、この修飾は、ほぼ3'および/またはほぼ5'のヌクレオチド間ホスホジエス
テル結合をホスホロチオエートジエステル結合もしくはホスホルアミデート結合
などの非加水分解性結合で置換することにより構成されてもよい。

【００１６】第２の態様では、本発明は所定の遺伝子変化をコードするオリゴデオキシヌク
レオチドの3'末端および5'末端の修飾を提供する。本発明は、かかる修飾は遺伝
子変化をもたらすオリゴデオキシヌクレオチドの効果を阻害しないという予想外
の発見にさらに基づいている。かかる実施形態の一つは、3'-3'結合シトシンヌ
クレオチドと5'結合インドカルボシアニン色素との組合せである。このように修
飾されると、オリゴデオキシヌクレオチドは、細菌細胞内に遺伝子変化をもたら
すための用いる場合、対応する非修飾のオリゴデオキシヌクレオチドに比べて50
倍を上回るほど効果的である。

【００１７】第３の態様では、本発明は、所定の遺伝子変化をコードするオリゴデオキシヌ
クレオチドを植物細胞の核に導入することにより、植物細胞内に所定の遺伝子変
化を導入するための化合物および方法を提供する。

【００１８】好ましい実施形態では、オリゴデオキシヌクレオチドは、3'-3'結合シトシン
ヌクレオチドおよび5'結合インドカルボシアニン色素などの3'および5'ブロッキ
ング置換基を結合させることにより修飾される。他の実施形態では、この修飾は
、ほぼ3'および/またはほぼ5'のヌクレオチド間ホスホジエステル結合をホスホ
ロチオエートジエステル結合もしくはホスホルアミデート結合などの非加水分解
性結合で置換することからなる。あるいはまた、5'結合インドカルボシアニン色
素およびほぼ3’のヌクレオチド間ホスホジエステル結合である非加水分解性結
合を第３の態様にも用いることができる。

【００１９】本発明は、以下の詳細な説明および特定の実施形態の例示的な実施例を参照す
ることによりさらに十分に理解されるであろう。

【００２０】４．発明の詳細な説明 SSOMVの配列は、従来の変異ベクター（mutational vector）と同じ原理に基づ
く。SSOMVの配列は、「変異誘発領域」と呼ばれる所望の遺伝子変化を含む領域
により隔てられた、２つの標的配列に相同な領域を含む。変異誘発領域は、標的
配列中の該相同領域を隔てる配列と同じ長さで且つ異なる配列を有することがで
きる。このような変異誘発領域は、置換を引き起こす。あるいは、SSOMV中の該
相同領域は互いに連続していてもよいが、標的遺伝子中の同じ配列を有する該領
域は、１個、2個またはそれ以上のヌクレオチドにより隔てられていてもよい。
このようなSSOMVは、SSOMVには無いヌクレオチドを標的遺伝子から欠失させる。
また、標的遺伝子中の該相同領域と同じ配列は該標的遺伝子の中で隣接していて
もよいが、SSOMVの配列中では１個、2個またはそれ以上のヌクレオチドにより隔
てられていてもよい。このようなSSOMVは、標的遺伝子の配列において挿入を引
き起こす。

【００２１】 SSOMVのヌクレオチドは、その3'側末端および/または5'末端側のヌクレオチド
間結合あるいはその2つの3'側末端および/または5'側末端のヌクレオチド間結合
はホスホロチオエートまたはホスホロアミダイトであってもよいが、それ以外は
非修飾ホスホジエステル結合によって結合されたデオキシリボヌクレオチドであ
る。本明細書中で用いるヌクレオチド間結合という用語は、SSOMVのヌクレオチ
ド間の結合であって、3'側末端ヌクレオチドまたは5'側末端ヌクレオチドとブロ
ッキング置換基との間の結合を含まない（以下参照）。

【００２２】 SSOMVの長さは、標的遺伝子が位置する細胞の種類に応じて相違する。標的遺
伝子が動物細胞（例えば哺乳動物細胞または鳥類細胞等）の染色体内の遺伝子で
ある場合、SSOMVは25〜65ヌクレオチド、好ましくは31〜59デオキシヌクレオチ
ドおよび最も好ましくは34〜48デオキシヌクレオチドである。相同領域の全長は
通常SSOMVよりも１、２または３ヌクレオチド短い。変異誘発ヌクレオチドは、S
SOMV中の２箇所以上の位置に導入することができ、これにより、SSOMV中に３つ
以上の相同領域ができる。相同領域が２つであれ３つ以上であれ、該相同領域の
少なくとも２つの長さはそれぞれ８デオキシヌクレオチドとする。

【００２３】原核細胞の場合、SSOMVの長さは15〜41デオキシヌクレオチドである。原核生
物に使用するオリゴデオキシヌクレオチドの好適な長さは、使用される3'保護基
のタイプに応じて相違する。3'保護置換基が3'-3'結合デオキシシチジンである
場合、該オリゴヌクレオチドは好ましくは約21〜28デオキシヌクレオチドであり
、それ以外の場合は、最適な長さは25〜35デオキシヌクレオチドである。したが
って、相同領域の長さは全長が少なくとも14デオキシヌクレオチドであり、かつ
少なくとも２つの相同領域はそれぞれ少なくとも７デオキシヌクレオチド長を有
する。

【００２４】植物細胞の場合、SSOMVの長さは21〜55デオキシヌクレオチドであり、したが
って相同領域の長さは全長が少なくとも20デオキシヌクレオチドであり、かつ少
なくとも２つの相同領域はそれぞれ少なくとも８デオキシヌクレオチド長を有す
る。

【００２５】上記の範囲内で、該オリゴデオキシヌクレオチドの最適な長さはGC含量によっ
て決まり、GC含量が高くなれば最適オリゴデオキシヌクレオチドは短くなる。し
かし、50％を超えるGC含量が好ましい。

【００２６】 SSOMVは、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、魚類細胞または蠕形動物（線
虫）細胞等のあらゆる種類の動物細胞と共に用いることができる。またSSOMVは
、任意の種類の植物細胞において用いることもできる。さらにSSOMVは、グラム
陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞等の任意の種類の細菌細胞と共に用いる
ことができる。細菌の種類の例としては、サルモネラ菌、大腸菌、シュードモナ
ス、Rostani等が挙げられる。その細胞が活発に複製するか否か、または標的遺
伝子が転写活性を有するか否かは重要ではない。ただし、標的遺伝子が細菌中に
ある場合、その細菌がRecA⁺であることが重要である。従って、組換えDNA作業に
おいて一般的に使用される細菌株の大部分はRecA^-であるため、一緒にクローニ
ングされるプラスミドの遺伝子の不安定性を低減するためには、これらの細菌は
本発明で使用するのに適していない。さらに、細菌細胞内において、標的遺伝子
はプラスミド上または細菌人工染色体（BAC）上、ならびに細菌染色体上に位置
していよい。

【００２７】 SSOMVは、標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のいずれかに相補的となる
よう設計することができる。所望の突然変異が１塩基の置換である場合、該変異
誘発ヌクレオチドがピリミジンであることが好ましい。所望の機能的な結果を得
るために、相補鎖中の標的とするヌクレオチドおよび変異誘発ヌクレオチドは両
方ともピリミジンであることが好ましい。特に好適なのは、トランスバージョン
変異をコードする（すなわちCまたはTの変異誘発ヌクレオチドがそれぞれ相補鎖
中のCまたはTとミスマッチする）SSOMVである。

【００２８】該オリゴデオキシヌクレオチドに加えて、SSOMVは、リンカーを介して5'末端
炭素に結合された5'ブロッキング置換基を含み得る。このリンカーの化学的性質
は、その長さ（好ましくは少なくとも6原子長である）および該リンカーが柔軟
でなければならないこと以外は重要ではない。

【００２９】哺乳動物、鳥類または植物細胞の5'側ブロッキング置換基の化学的性質は、分
子量以外は重要ではなく、その分子量は、約1000ダルトン未満でなければならな
い。ビオチン、コレステロールもしくは他のステロイド等の種々の非毒性置換基
または非インターカレート陽イオン蛍光色素を使用することができる。しかし、
細菌系で使用する場合は、該ブロッキング置換基は、SSOMVの有効性に大きな影
響を及ぼし、好ましくは、3,3,3',3'-テトラメチルN,N'-オキシアルキル置換イ
ンドカルボシアニンである。SSOMVを作製するための試薬として特に好適なのは
、Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)によりCy3（商品名）およびCy
5（商品名）として販売されている試薬であり、これらはオリゴヌクレオチド中
に組み込まれるとそれぞれ 3,3,3',3'-テトラメチルN,N'-イソプロピル置換イン
ドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン色素を生成するブロッキン
グされたホスホロアミダイトである。インドカルボシアニンは、N-オキシアルキ
ル置換されると、5'末端ホスフェートを有するホスホジエステルによりオリゴデ
オキシヌクレオチドの5'末端に共有結合され得る。色素とオリゴデオキシヌクレ
オチドとの間の色素リンカーの化学的性質は重要ではなく、合成上の便宜によっ
て選択される。市販されているCy3ホスホロアミダイトを指示通りに使用する場
合、得られる5'修飾は、ブロッキング置換基およびリンカーが一緒になって形成
するN-ヒドロキシプロピル, N'-ホスファチジルプロピル3,3,3',3'-テトラメチ
ルインドモノカルボシアニンからなる。

【００３０】他の実施形態において、イオンドカルボシアニン色素（例えばCy3ホスホロア
ミダイト等）は、オリゴデオキシヌクレオチドが合成された後にそのオリゴデオ
キシヌクレオチドに結合することができる。

【００３１】好適な実施形態において、インドカルボシアニン色素は、インドール環の3位
および3'位でテトラ置換される。理論に制限されることなく、これらの置換は、
色素がインターカレート色素となるのを防ぐ。上記の位置にある置換基の正体は
重要ではない。

【００３２】 SSOMVはさらに、3'ブロッキング置換基を有することができる。この3'ブロッ
キング置換基の化学的性質も、標的遺伝子が細菌細胞内以外の場所に存在する場
合、非毒性であること、および分子量が約1000未満であることを除いては重要で
はない。しかし、標的遺伝子が細菌細胞内に存在する場合、好適な3'ブロッキン
グ置換基はいわゆる逆方向ヌクレオチド（inverted nucleotide）、すなわち非
置換3'-3'ホスホジエステルにより結合されたヌクレオチドである（米国特許第5
,750,669号に教示されている）。より好適な実施形態において、該逆方向ヌクレ
オチドはチミジンであるか、または最も好適なのはデオキシシチジンである。細
菌細胞内で使用する場合、Cy3の5'側ブロッキング置換基と逆方向デオキシシチ
ジンの3'ブロッキング置換基との組み合わせは、その２つの修飾がSSOMVの効力
に対して相乗効果を示すため、特に好ましい。上記修飾がなされたSSOMVは、従
来の固相ヌクレオチド合成により合成することができる。

【００３３】 SSOMVは、Kmiec型変異ベクターを動物細胞および植物細胞内に導入するために
用いられるのと同じ技法により、標的遺伝子を含む細胞内に導入することができ
る。細菌細胞の場合、SSOMVの好適な導入方法は、エレクトロポレーションによ
るものである。

【００３４】哺乳動物細胞および鳥類細胞等の動物細胞で使用する場合、細胞内への好適な
送達方法は、保護高分子担体を用いるものである。リポフェクトアミン（Lipofe
ctamine；商品名）やスーパーフェクト（Superfect；商品名）等の市販されてい
るリポソーム性トランスフェクト試薬は、トランスフェクトしようとする核酸が
静電気により該リポソームの露出表面に付着するように設計される。このような
担体は、保護高分子担体ほど好ましいわけではない。好適な保護高分子担体は、
国際特許出願公開番号第98/49350号および第WO99/40789号ならびにBandyopadhya
yら, 1999、J. Biol. Chem. 274:10163に開示されており、これらの文献はそれ
ぞれ本明細書中に参照として全て組み込むこととする。

【００３５】特に好適な高分子担体は、SSOMVを水性コアの中にトラップする、水性コアを
有する脂質小胞またはリポソームである。このような小胞は、溶媒を含まない脂
質膜を取り、SSOMVの水溶液を加えた後、ボルテックス、押し出しまたはミクロ
濾過膜による濾過を行うことにより作製される。１つの好適な実施形態において
、脂質成分は、ジオレオイルホスファチジルコリン/ジオレオイルホスファチジ
ルセリン/ガラクトセレブロシドの混合物（1：1：0.16）である。他の担体とし
ては、そのうち25kdの好適な種および脂質ナノスフェア（nanosphere）を有する
、分子量が500ダルトン〜1.3Mdであるポリエチレンイミン等のポリカチオンが挙
げられ、その中でSSOMVは親油性塩の形態で提供される。

【００３６】 SSOMVを用いて哺乳動物および鳥類の細胞内に遺伝子変化を導入する場合、該
高分子担体は細胞内移行される細胞表面受容体に対するリガンドをさらに含むこ
とが好ましい。好適な受容体としては、クラスリン被覆小孔経路により細胞内移
行される受容体が挙げられ、例えばアシアロ糖タンパク質受容体、上皮増殖因子
およびトランスフェリン受容体等がある。また、カベオラ経路を介して細胞内移
行される受容体（例えば葉酸受容体等）も好適である。ガラクトセレブロシドは
、アシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドである。本明細書中で使用され
る細胞内移行が可能な受容体は、クラスリン被覆小孔経路またはカベオラ経路に
より細胞内移行される受容体である。

【００３７】従来技術の変異ベクターが用いられるあらゆる目的のために、SSOMVを用いる
ことができる。具体的な用途としては、疾患を引き起こす遺伝子障害を復帰させ
ることによる遺伝子疾患の治療が含まれる。このような疾患としては、例えば血
友病、α₁抗-トリプシン欠乏症、およびクリグラー-ナジャー症候群、ならびに
国際特許出願公開番号WO98/49350号により教示される他の疾患が挙げられる。

【００３８】あるいは、SSOMVを用いて、国際特許出願公開番号WO99/07865号（本明細書中
に参考として全て組み込まれる）に記載された目的で植物を改変することができ
る。植物におけるSSOMVの更なる用途は、除草剤耐性植物の作出であり、これに
より、外来もしくは異種遺伝子を作物植物中に導入する必要性が回避される。特
に興味深いのは、除草剤グリホサート（ROUNDUP：登録商標）に対する耐性であ
る。グリホサート耐性を付与する変異の正体は、国際特許出願公開番号WO99/258
53およびWO97/04103に見られる。

【００３９】あるいは、SSOMVを用いて細菌を改変することができる。SSOMVを細菌の遺伝子
操作に用いることは、抗生物質製造の分野およびワクチン製造のための特異的に
弱毒化された細菌の構築において特に貴重である。上記用途の双方において、抗
生物質耐性遺伝子が最終的に改変された細菌の中に残存しないことが重要である
。

【００４０】さらに、SSOMVを細菌人工染色体（BAC）と組合わせて用いて、BAC中にクロー
ニングされた任意の種に由来するターゲッティングされた遺伝子を改変すること
ができる。標的とする遺伝子よりもはるかに大きな断片を組み込むことができる
。クローニングされた標的とする遺伝子を含有するBACを細菌宿主内に入れ、所
定の遺伝子変化を本発明にしたがって導入する。所定の遺伝子変化を有するBAC
サブクローンを同定し、該挿入体を除去して更に使用することができる。本発明
により、PCR断片を作製し該断片を元の遺伝子中にまた挿入し戻す作業に伴う時
間およびコストを省いて、所定の変化を達成することができる。

【００４１】５．実施例１：Gunnラットの治療 Gunnラットは、クリグラー‐ナジャー病において突然変異している遺伝子と同
じ遺伝子である、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子の中に突然変異
を含む（Roy-Chowdhuryら, 1991, J. Biol. Chem. 266: 18294；Iyanangiら, 19
89, J. Biol. Chem. 264: 21302）。Gunnラットにおいて、1206番目のヌクレオ
チドに突然変異があり、これはGの欠失を有する。CN3-35UPと呼ばれる35ヌクレ
オチドのSSOMV（アンチセンス鎖に対応）は、この突然変異を復帰させるために
構築したものであり、以下の配列を有する：5'-ATCATCGGCAGTCATTTCCAGGACATTCA
GGGTCA-3'（配列番号１）。CN3-35LOWと呼ばれる第2のSSOMV（センス鎖に対応）
は、以下の配列を有する：5'-TGACCCTGAATGTCCTGGAAATGACTGCCGATGAT-3'（配列
番号２）。変異誘発ヌクレオチドは下線で示してある。

【００４２】 5'Cy3, 3'-3' dC修飾CN3-35UP（2匹）およびCN3-35LOWならびに非修飾CN3-35U
Pを、ジオレオイルホスファチジルコリン/ジオレオイルホスファチジルセリン/
ガラクトセレブロシド（1：1：0.16）からなる脂質成分を有する水性コアを有す
る脂質小胞中に製剤化した。500μgのSSOMVを含む5％デキストロース（約2.0ml
）を用いて脂質2mgを水和した後、該小胞を押し出しにより直径0.5μmとした。
カプセル化効率は80％であった。陽性対照群を、同じ担体中に入れた等モル量の
Kmiec型MVで処理した（2匹）。ラット（体重250g）を連続５日間300μgのSSOMV
または該担体で処理した。得られた血清ビリルビンレベルは以下の通りであった
（mg/dl）。

【００４３】

【表１】このデータは、修飾SSOMVおよび非修飾SSOMVの両方ならびにセンス配列およびア
ンチセンス配列の両方が、少なくとも同等であり、およびより長期の時点におい
てはSSOMVがKmiec型変異ベクターより優れているようであることを示す。

【００４４】６．実施例２：ヒトUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子の改変以下の実施例は、高分子担体中の非修飾SSOMVを用いて、人工培地中の哺乳動
物細胞内に特異的遺伝子変化を、Kmiec型DNA/2'OMeRNA変異ベクターで観察され
る比率の約３分の１の比率で、導入することができることを示す。これらのデー
タはさらに、ホスホロチオエート結合１つという最小限の修飾で、十分に匹敵す
る比率が得られることを示す。

【００４５】アマン人の群は、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子の222番目ヌ
クレオチドのC→Aの置換により生じたクリグラー‐ナジャー病を有する。この突
然変異は、TAC（チロシン）をTAA停止コドンに変えるものである。ヒト肝細胞癌
細胞株HuH-7にこの疾患を引き起こす突然変異を導入するためにSSOMVを設計した
。CNAM3-35UPと呼ばれる35ヌクレオチドのSSOMVは、該アンチセンス鎖に対応し
、以下の配列を有する：5'-GGGTACGTCTTCAAGGTTTAAAATGCTCCGTCTCT-3'（配列番
号３）。変異ヌクレオチドは下線で示してある。

【００４６】 CNAM3-35UP、様々に修飾されたCNAM3-35UP、または等モル量の82ヌクレオチド
のKmiec型変異ベクターを含む本発明の実施例１の担体（300μl）を、HuH-7細胞
（10⁶/cm²）に与えた。細胞を回収し、関連遺伝子断片をPCRで増幅し、クローニ
ングし、Bandyopadhyay（前掲）の方法に従って対立遺伝子特異的ハイブリダイ
ゼーションにより分析した。以下の転換率（conversion rate）が観察された。

【００４７】非修飾SSOMV 6％ 5'Cy3 SSOMV 15％ 3'-3'dC SSOMV 5％ 5'Cy3, 3'-3' dC SSOMV 15％ 5'ホスホロチオエート SSOMV 16％ 3'ホスホロチオエート 12％ Kmiec型MV 14％これらのデータは、高分子担体の存在下において修飾SSOMVがKmiec型変異ベクタ
ーと同じくらい有効であったこと、および非修飾SSOMVはその約３分の１の効力
しかなかったことを示す。

【００４８】７．実施例３：BACにおけるカナマイシン耐性の転換以下の実施例は、細菌細胞内において、修飾SSOMVがKmiec DNA/2'OMeRNA変異
ベクターよりも効率的であることを示す。

【００４９】インフレームATG停止コドンの挿入によってカナマイシン耐性遺伝子は不活化
された。カナマイシン耐性は、第３のヌクレオチドをCに変える（すなわち第３
のヌクレオチドにトランスバージョンを行う）ことにより回復する。

【００５０】カナマイシン耐性の回復のためのセンス鎖に対応する41 ntのSSOMVの配列は、
以下の通りである：5'-GTGGAGAGGCTATTCGGCTACGACTGGGCACAACAGACAAT-3'（配列
番号４）。変異ヌクレオチドは下線で示してある。

【００５１】 pBACKansを作製するために、BamHIリンカーをpKansの唯一のSmaI部位に挿入し
、得られた1.3kbのBamHI-HindIII断片（突然変異カナマイシン遺伝子を含む）を
、BACクローニングベクターpBeloBAC11（Genome Systems, Inc., St. Louis, MO
）のBamHI/HindIII部位に挿入した。大腸菌株MC1061およびDH10BをpBACKansで形
質転換し、LBクロラムフェニコールプレートで選択し、電気的コンピテント(ele
ctrocompetent)にした。

【００５２】 40μlの電気的コンピテント細胞に5〜10μgのSSOMVをエレクトロポレーション
により導入した。使用した条件は以下の通りである：25kV/cm, 200ohms, 25マイ
クロファラド。エレクトロポレーションの直後に、1mLのSOCを細胞に加え、培養
物を37℃にて振蕩しながら１時間培養した。4mLのLB+クロラムフェニコール（最
終濃度12.5μg/mL）を加え、培養物を更に２時間37℃にて振蕩しながら培養した
。培養物を適度に希釈したものを、生存率の評価のためにL B-クロラムフェニコ
ールプレートにプレーティングし、そして、転換率評価のためにLB-カナマイシ
ンプレートにプレーティングした。転換頻度は、1mLあたりのカナマイシン耐性
コロニーの数を1mLあたりのクロラムフェニコール耐性コロニーの数で割って算
出した。

【００５３】 5'Cy3, 3'-3'dC修飾25ヌクレオチドSSOMVで観察された転換率は、100個の生存
細菌あたり約１個の転換に相当した。

【００５４】相対転換率は以下の通りである： 68 nt Kmiec MV w/2'OMe RNAリンカー 0.04 68 nt Kmiec MV w/DNAリンカー 0.004 41 nt SSOMV w/3',5'ホスホチオエート 0.4 35 nt SSOMV w/3',5'ホスホチオエート 4.0 29 nt SSOMV w/3',5'ホスホチオエート 0.9 25 nt SSOMV w/3',5'ホスホチオエート 1.0 41 nt SSOMV w/3'-3'dC,5'Cy3 2.0 35 nt SSOMV w/3'-3'dC,5'Cy3 2.9 35 nt SSOMV w/3'-3'dC 2.5 35 nt SSOMV w/5'Cy3 2.5 29 nt SSOMV w/3'-3'dC,5'Cy3 4.2 25 nt SSOMV w/3'-3'dC,5'Cy3 42.0 25 nt SSOMV w/3'-3'dC 1.3 25 nt SSOMV w/5'Cy3 1.8 25 nt SSOMV w/3'ホスホチオエート,5'Cy3 8.4 35 nt SSOMV w/3'ホスホチオエート,5'Cy3 10.2 これらのデータは、最適SSOMVの転換率がKmiec型変異ベクターの転換率に比べて
10³〜10⁴倍大きかったことを示す。

【００５５】８．実施例４：哺乳動物細胞-ハイグロマイシン耐性における保護担体を用いな
いSSOMVの使用この実施例は、保護高分子担体の不在下で修飾SSOMVを用いた哺乳動物細胞の
改変を示す。修飾SSOMVは、Kmiec型変異ベクターよりも15〜30倍の高率で遺伝子
改変を導入することができた。この実施例は実施例３と同じ遺伝子を用いている
。ただしこの遺伝子はHuH-7細胞株中で発現させる。

【００５６】 IRES含有ベクター（pIRESKan-）中に安定に組み込まれた突然変異カナマイシ
ン遺伝子のコピーを含むHuH7細胞のクローンを、ハイグロマイシン選択下で作製
した。組み込まれた構築物からの発現率を高レベルに維持するために、100mg/ml
ハイグロマイシンを含むDMEM高グルコース/10% FBS中で細胞を培養した。トラン
スフェクションの24時間前に細胞を100mmディッシュの中に1.0×10⁶個の密度で
接種した。トランスフェクションの２時間前に、増殖培地を10mlのOpti-MEM（商
品名）に取り替えた。40μgのオリゴヌクレオチドおよび40ml（80μg）のリポフ
ェクトアミン（Lipofectamine：商品名）を、200mlのOpti-MEM pH8.5の入った別
々の試験管中で希釈した。次にリポフェクトアミンを該オリゴヌクレオチドに加
え、ピペットで混合し、室温にて30分間インキュベートした後、3.6mlのOpti-ME
M pH8.5を加えた。培地を細胞から吸引除去し、4mlのトランスフェクション混合
物と取り替える。細胞を37℃にて2時間インキュベートした後、トランスフェク
ション混合物を標準増殖培地と取り替える。トランスフェクションの2日後に、4
50mg/ml G418を含む10mlの培地を入れた２つの100mmディッシュに細胞を分注す
る。10日間G418含有培地を毎日取り替えた後、顕微鏡でコロニーが見えるように
なる（トランスフェクションの16〜18日後）までは１週間に2回取り替える。ト
ランスフェクションの約21日後にクローンを回収し、分子的分析のために増殖さ
せる。

【００５７】バックグラウンドのハイグロマイシン耐性の発生率は10⁶個あたり約1個である
。Kmiec型変異ベクターを用いた場合、耐性コロニーの数は増加しなかった。５
つのコロニーのうち１つを配列決定したところ、この特異的突然変異が起こって
いた。他の４つのコロニーにおいて突然変異は特定されなかった。41ヌクレオチ
ドSSOMV w/3'-3' dC, 5'Cy3を用いた場合、ハイグロマイシン耐性コロニーの発
生率は15〜30倍増加した（すなわち10⁵個あたり約３個）。これらのコロニーの
配列決定により、これらのコロニーの100％〜80％が正しい遺伝子変化を有して
いたことが分かった。w/3'-3' dC, 5'Cy3またはw/3'ホスホロチオエート5'Cy3ま
たはw/２つのホスホロチオエート結合（それぞれ3'側および5'側末端）を有する
35nt SSOMVを用いた実験はそれぞれ、修飾41ヌクレオチドSSOMVの約半分のハイ
グロマイシン耐性の発生率を示した。

【００５８】９．実施例５：哺乳動物細胞-チロシナーゼ中における保護担体を用いないSSOMV の使用この実施例は、哺乳動物細胞系において、保護担体を用いない非修飾SSOMVが5
'Cy3/3'-3'dC修飾SSOMVおよびKmiec型DNA/2'OMe RNA変異ベクターの両方よりも
優れていることを示す。

【００５９】これらの実験は、チロシナーゼ遺伝子の82番目のコドンがCからGに突然変異（
この変異はインフレームの停止を作製する）しているネズミメラノサイト細胞株
Melan-cを用いる（Bennettら, 1989, Development 105: 379）。このコード配列
に対応する35ヌクレオチドSSOMVを設計した。このSSOMVは以下の配列を有する：
5'-CCCCAAATCCAAACTTACAGTTTCCGCAGTTGAAA-3'（配列番号５）。変異誘発ヌクレ
オチドは下線で示してある。

【００６０】 10％ウシ胎児血清、100nM ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)お
よび0.1mM β-メルカプトエタノール（Gibco, Bethesda, MD）を含むRPMI培地中
で、Melan-c細胞を培養した。トランスフェクションの２日前に、6枚の6ウェル
プレートに0.5〜1.5×10⁵細胞/ウェルの密度で細胞を接種し、トランスフェクシ
ョンの24時間前に新しい培地を加えた。5〜10μg（220〜440nM）のオリゴヌクレ
オチドを、0.1mlのTE（10mM TRIS pH7.5, 1mM EDTA）中の6〜9μgのスーパーフ
ェクチン（Suprfectin：商品名）中で室温にて30分間インキュベートした。10％
血清および100nM PMAを含むDMEM高グルコース増殖培地（0.9ml）を含む細胞にト
ランスフェクション混合物を加えた。6〜18時間後に、リン酸緩衝食塩水で細胞
を洗浄し、2mlのDMEM培地を加えた。顕微鏡で、細胞の色素沈着の変化について
モニターした。トランスフェクションの5〜8日後に色素沈着した細胞または細胞
クラスタの数を計数することにより、転換発生数を測定した。

【００６１】 10⁵細胞あたりのアルビノから野生型（色素沈着した細胞）への転換率は以下
の通りである。

【００６２】 Kmiec型MV 1 非修飾SSOMV 5 SSOMV w/3',5'ホスホロチオエート 6 SSOMV w/3'-3'dC 2 SSOMV w/5'Cy3 3 SSOMV w/3'-3'dC, 5'Cy3 1１０．実施例６：植物中の修飾SSOMVの使用この実施例は、シロイヌナズナArabodopsis thalianaのアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ（アセトール酸シンターゼ（acetolatate synthase）としても知られて
いる）の653位に変異（Ser→Asn）を導入するためのSSOMVの使用に関する。この
変異は、AGTコドンのAATコドンへの変換を必要とし、イミダゾリン除草剤および
スルホニル尿素除草剤に対する耐性を導入する。

【００６３】 3'-3'dCおよび5'Cy3修飾を有する25ヌクレオチドSSOMVおよび35ヌクレオチドS
SOMVを合成した。これらはそれぞれ以下の配列を有していた：5'-CGATCCCGAATGG
TGGCACTTT-3'（配列番号６）；および5'-GTTGCCGATCCCGAATGGTGGCACTTTCAACG-3'
（配列番号７）。変異誘発ヌクレオチドは下線で示してある。

【００６４】プレートあたり10⁶個のばらばらのA. thaliana細胞集団を調製し、SSOMVまた
は同じ配列を有するKmiec型MVの遺伝子銃による導入に供した。プラスミドを用
いた対照プレートは、遺伝子銃による系の効率が、接種した細胞200個あたり約
１個に送達されたことを示した。２ヶ月後に遺伝子銃により処理した細胞集団の
各々に対し10μM Imazaquin（商品名）を用いて選択を行ったところ、変異ベク
ターが首尾良く導入された細胞10³個あたり約１個のImazaquin耐性のバックグラ
ウンド修正率を示した。

【００６５】１１．実施例７：葉酸コンジュゲートPEIの調製この実施例は、本発明で高分子担体として使用するのに適した葉酸コンジュゲ
ートPEIの調製について記載する。

【００６６】リン酸ナトリウム緩衝液（1.5mL、133mM、pH4.5）中の葉酸（4.4mg、10μモル
）を200μLのピリジンおよび1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボ
ジイミド塩酸（EDC、15.5mg、98μモル）で処理し、室温にて１時間インキュベ
ートした。活性化した葉酸溶液（1.7mL）をポリエチレンイミン（25kDa、24.55m
g/mL；1.02mL）の水溶液に加え、室温にて３日間ゆっくり攪拌しながらインキュ
ベートした。コンジュゲートしたポリエチレンイミンを、12kDa 分子量カットオ
フ膜を用いて水に対して透析して精製した。生成物は、ニンヒドリンアッセイに
よりアミンに対し陽性であり、かつ、紫外線吸光度により葉酸に対して陽性であ
った（259、289および368nmで最大）。

【００６７】結合は1000アミンあたり約１〜２葉酸成分であり、これは、PEI分子１つあた
り1〜２個の葉酸に相当する。

【００６８】本発明の範囲は、本明細書中に記載された特定の実施形態によって限定されな
い。実際に、上記記述および添付した図面から、本明細書中に記載したもの以外
にも、本発明の様々な改良が当業者には自明である。このような改良は特許請求
の範囲内に含まれるものとする。

【００６９】様々な文献が本明細書に引用されており、これらの開示内容は、本明細書中に
参考として全て組み込まれる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウォルター，デブラ，エム．アメリカ合州国 19047 ペンシルバニア州ラングホーン，ティンバーレーン 725 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA08 BA07 BA10 CA02 FA11 HA01 4B063 QA08 QQ08 QQ09 QQ26 QQ38 QQ42 QR06 QR18 QR32 QR77 QR78 QR81 4B065 AA91X AB01 BD27 BD30 BD35 CA24 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物細胞の標的とする染色体内の遺伝子の中に所定の遺伝子
変化をもたらすための組成物であって： (a) 3'末端ヌクレオチドと5'末端ヌクレオチドとを有し、25個以上65個以下
のデオキシヌクレオチドを有する一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであって、
それぞれ少なくとも8個のデオキシヌクレオチドからなる少なくとも２つの領域
を含む配列を有しており、該２つの領域は、それぞれ標的とする染色体内の遺伝
子の2つの領域と同一であり、これら２つの領域は、標的とする染色体内の遺伝
子の配列内もしくはオリゴデオキシヌクレオチドの配列内、またはその両方にお
いて、少なくとも1個のヌクレオチドで隔てられており、該２つの領域を合計す
ると少なくとも24ヌクレオチド長である、上記一本鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ド；ならびに (b) 以下の (i) 水性コア内に上記一本鎖オリゴヌクレオチドを含んでいる水性コアを
有する脂質小胞、 (ii) 一本鎖オリゴヌクレオチドの親油性の塩を含んでいる脂質ナノスフェ
ア、および (iii) オリゴ核酸塩基と塩を形成する、平均分子量が500ダルトン〜1.3Md
であるポリカチオン、からなる群より選択される高分子担体；を含む、上記組成物。
【請求項２】一本鎖オリゴヌクレオチドが31個以上59個以下のデオキシヌ
クレオチドからなる長さを有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】標的とする遺伝子の中に所定の遺伝子変化を含む動物細胞を
取得する方法であって、 (a) 培養培地に入った動物細胞の集団を用意し； (b) 該培養培地に請求項２に記載の組成物を添加し；そして (c) 該集団内の所定の遺伝子変化を有する細胞を特定すること；を含む、上記方法。
【請求項４】同定された細胞を単離することをさらに含む、請求項３記載
の方法。
【請求項５】高分子担体が、その表面に接着した、動物細胞の細胞内移行
可能な受容体に対するリガンドをさらに含んでいる、請求項１記載の組成物。
【請求項６】対象とする哺乳動物の組織内に所定の遺伝子変化をもたらす
方法であって、 (a) 薬学的に許容される担体中の請求項５記載の組成物を対象の哺乳動物に
投与し；そして (b) 対象の哺乳動物の組織の細胞内における所定の遺伝子変化の存在を検出
すること；を含む、上記方法。
【請求項７】対象の哺乳動物が、遺伝子障害を有するヒトであり、該遺伝
子障害は所定の遺伝子変化によって復帰するものであり、該遺伝子障害の影響を
回復させるのに有効な量の上記組成物を投与することを含む、請求項６記載の方
法。
【請求項８】組織が肝臓である、請求項６記載の方法。
【請求項９】受容体が、アシアロ糖タンパク質受容体、トランスフェリン
受容体および上皮増殖因子受容体からなる群より選択されたものである、請求項
５記載の組成物。
【請求項１０】受容体が葉酸受容体である、請求項５記載の組成物。
【請求項１１】 3'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】 5'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】 5'末端ヌクレオチドの5'水酸基が5'ブロッキング置換基に
結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】 5'ブロッキング置換基が、N'-ヒドロキシアルキル置換3,3
,3',3'-テトラ置換インドカルボシアニン色素であり、リンカーを介して5'水酸
基に結合している、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】インドカルボシアニン色素およびリンカーが一緒になって
、N-ヒドロキシプロピル, N'-ホスファチジルプロピル3,3,3',3'-テトラメチル
インドモノカルボシアニンである、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】 3'末端ヌクレオチドに結合しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】 3'末端ヌクレオチドの3'水酸基が3'ブロッキング置換基に
結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】 3'ブロッキング置換基が、3'末端ヌクレオチドの3'水酸基
に3'-3'結合しているブロッキングヌクレオチドである、請求項１７記載の組成
物。
【請求項１９】動物細胞の標的とする染色体内の遺伝子の中に所定の遺伝
子変化をもたらすための化合物であって、3'末端ヌクレオチドと5'末端ヌクレオ
チドとを有し、25個以上65個以下のデオキシヌクレオチドを有する一本鎖オリゴ
デオキシヌクレオチドを含んでおり、該一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、
それぞれ少なくとも8個のデオキシヌクレオチドからなる少なくとも２つの領域
を含む配列を有しており、該２つの領域は、それぞれ標的とする染色体内の遺伝
子の2つの領域と同一であり、これら２つの領域は、標的とする染色体内の遺伝
子の配列内もしくはオリゴデオキシヌクレオチドの配列内、またはその両方にお
いて、少なくとも1個のヌクレオチドで隔てられており、該２つの領域を合計す
ると少なくとも24ヌクレオチド長である、上記化合物。
【請求項２０】標的遺伝子中に所定の遺伝子変化を含む動物細胞を取得す
る方法であって、 (a) 培養培地に入った動物細胞の集団を用意し； (b) 該培養培地に請求項１９記載の化合物を添加し；そして (c) 該集団内の所定の遺伝子変化を有する細胞を特定すること、を含む、上記方法。
【請求項２１】 3'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項１９記載の化合物。
【請求項２２】 5'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】標的とする遺伝子の中に所定の遺伝子変化を含む動物細胞
を取得する方法であって： (a) 培養培地に入った動物細胞の集団を用意し； (b) 該培養培地に請求項２２記載の組成物を添加し；そして (c) 該集団内の所定の遺伝子変化を有する細胞を特定すること、を含む、上記方法。
【請求項２４】 N'-ヒドロキシアルキル置換3,3,3',3'-テトラ置換インド
カルボシアニン色素が、リンカーを介して5'末端ヌクレオチドの5'水酸基に結合
している、請求項２１記載の化合物。
【請求項２５】 5'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項１９記載の化合物。
【請求項２６】 3'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合であるか、デオキシシチジンもしくはチミジンヌクレオ
チドが3'末端ヌクレオチドの3'水酸基に3'-3'結合しているか、またはこの両方
である、請求項２５記載の化合物。
【請求項２７】細菌細胞内の標的とする遺伝子の中に所定の遺伝子変化を
もたらす化合物であって： (a) 3'末端ヌクレオチドと5'末端ヌクレオチドとを有し、15個以上41個以下
のデオキシヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、それぞれ
少なくとも7個のデオキシヌクレオチドからなる少なくとも２つの領域を含む配
列を有しており、該２つの領域は、それぞれ標的とする遺伝子の2つの領域と同
一であり、これら２つの領域は、標的とする遺伝子の配列内もしくは上記一本鎖
オリゴヌクレオチドの配列内、またはその両方において、少なくとも1個のヌク
レオチドで隔てられており、該２つの領域を合計すると少なくとも14ヌクレオチ
ド長である、上記一本鎖オリゴヌクレオチド； (b) 5'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合がホスホルチオ
エート結合であるか、またはN'-ヒドロキシアルキル置換3,3,3',3'-テトラ置換
インドカルボシアニン色素がリンカーを介して5'末端ヌクレオチドの5'水酸基に
結合している5'修飾；および (C) 3'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合がホスホロチオ
エート結合であるか、デオキシシチジンもしくはチミジンヌクレオチドが3'末端
ヌクレオチドの3'水酸基に3'-3'結合しているか、またはこの両方である3'修飾
；を含む、上記化合物。
【請求項２８】 5'修飾がN-ヒドロキシプロピル,N'-ホスファチジルプロピ
ル3,3,3',3'-テトラメチルインドモノカルボシアニンを含むものである、請求項
２７記載の化合物。
【請求項２９】 3'修飾が3'-3'結合デオキシシチジンからなるものである
、請求項２７記載の化合物。
【請求項３０】 3'修飾が3'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド
間ホスホロチオエート結合からなるものである、請求項２７記載の化合物。
【請求項３１】植物細胞内の標的とする遺伝子の中に所定の遺伝子変化を
もたらす化合物であって、3'末端ヌクレオチドと5'末端ヌクレオチドとを有し、
21個以上55個以下のデオキシヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドを
含み、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、それぞれ少なくとも8個のヌクレオチド
からなる少なくとも２つの領域を含む配列を有しており、該２つの領域は、それ
ぞれ標的とする遺伝子の2つの領域と同一であり、これら２つの領域は、標的と
する遺伝子の配列内もしくは一本鎖オリゴヌクレオチドの配列内、またはその両
方において、少なくとも1個のヌクレオチドで隔てられており、該２つの領域を
合計すると少なくとも20ヌクレオチド長である、上記化合物。
【請求項３２】標的とする遺伝子の中に所定の遺伝子変化を含む植物細胞
を取得する方法であって： (a) 植物細胞の集団に請求項３１記載の化合物を導入し；そして (b) 該集団内の所定の遺伝子変化を有する細胞を特定すること、を含む、上記方法。
【請求項３３】特定された細胞を単離することをさらに含む、請求項３２
記載の方法。
【請求項３４】 5'末端ヌクレオチドの5'水酸基が5'ブロッキング置換基に
連結している、請求項３１記載の化合物。
【請求項３５】 3'末端ヌクレオチドの3'水酸基が3'ブロッキング置換基に
連結している、請求項３４記載の化合物。
【請求項３６】請求項３５記載の化合物であって、 (a) 5'ブロッキング置換基が、N'-ヒドロキシアルキル置換3,3,3',3'-テトラ
置換インドカルボシアニン色素であり、リンカーを介して5'末端ヌクレオチドの
5'水酸基に結合しており；そして (b) 3'ブロッキング置換基が3'末端ヌクレオチドの3'水酸基に3'-3'結合して
いるブロッキングヌクレオチドである；上記化合物。
【請求項３７】一本鎖オリゴヌクレオチドが、25ヌクレオチド以上35ヌク
レオチド以下の長さを有する、請求項３６記載の化合物。
【請求項３８】ブロッキングヌクレオチドがデオキシシチジンまたはチミ
ジンである、請求項３６記載の組成物。
【請求項３９】インドカルボシアニン色素およびリンカーが一緒になって
、N-ヒドロキシプロピル,N'-ホスファチジルプロピル3,3,3',3'-テトラメチルイ
ンドモノカルボシアニンである、請求項３６記載の組成物。
【請求項４０】 3'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項３１記載の化合物。
【請求項４１】 5'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項３１記載の化合物。
【請求項４２】請求項３１記載の化合物であって、 (a) 5'末端ヌクレオチドの5'水酸基が、5'ブロッキング置換基に結合してお
り；そして (b) 3'末端ヌクレオチドに連結しているヌクレオチド間結合がホスホロチオ
エート結合である；上記化合物。
【請求項４３】 5'ブロッキング置換基が、N'-ヒドロキシアルキル置換3,3
,3',3'-テトラ置換インドカルボシアニン色素であり、リンカーを介して5'末端
ヌクレオチドの5'水酸基に結合している、請求項４２記載の化合物。
【請求項４４】動物細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、蠕形動
物細胞および魚類細胞からなる群より選択される、請求項１または３記載の化合
物。
【請求項４５】動物細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、蠕形動
物細胞および魚類細胞からなる群より選択される、請求項１または３記載の組成
物。
【請求項４６】動物細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、蠕形動
物細胞および魚類細胞からなる群より選択される、請求項２０または２３記載の
方法。
【請求項４７】標的とする遺伝子が細菌の人工染色体上にある、請求項２
７記載の化合物。