PT2324856E

PT2324856E - Vetores mutacionais oligodesoxinucleotídicos de cadeia simples

Info

Publication number: PT2324856E
Application number: PT101839603T
Authority: PT
Inventors: Bruce L Frank; Richard A Metz; Debra M Walther
Original assignee: Cibus Internat Lp
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2015-09-03
Also published as: ES2544727T3; CA2382120C; ZA200201228B; DK2324856T3; JP2003508451A; NZ517942A; EP2266627B1; JP5813571B2; DK2266627T3; PT1210123E; ATE478687T1; AU7076700A; WO2001015740A1; AU2004205139A1; US20040023392A1; AU773242C; EP1210123A1; ES2542530T3; EP1210123A4; PT2266627E

Description

DESCRIÇÃO "Vetores mutacionais oligodesoxinucleotídicos de cadeia simples"

1. CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a oligodesoxinucleótidos de cadeia simples, seus derivados determinados e a métodos para a sua utilização para introdução de uma alteração predeterminada numa localização predeterminada num gene alvo numa célula viva. A célula pode ser uma célula de mamífero, de inseto, de peixe, de verme ou de ave, quer num meio de cultura artificial quer num organismo, uma célula bacteriana ou uma célula vegetal. 0 gene alvo pode ser um gene cromossómico ou um gene extracromossómico, i.e., num cromossoma bacteriano artificial.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Estão descritas técnicas para efetuar uma alteração predeterminada numa localização predeterminada numa sequência de ácido nucleico alvo de uma célula. Estas técnicas utilizam as enzimas da célula que se referem à reparação do ADN e recombinação homóloga. Nestas técnicas é sintetizado um oligonucleótido ou um análogo oligonucleotídico que contém duas regiões que possuem a sequência do gene alvo que flanqueia uma região, denominada uma "região mutadora", que difere do gene alvo. No presente pedido estes oligonucleótidos e análogos serão genericamente denominados "vetores mutacionais". Estes vetores mutacionais podem introduzir alterações genéticas predeterminadas num gene alvo através de um mecanismo que se crê envolver recombinação homóloga e/ou excisão de nucleótidos e reparação.

As Patentes dos Estados Unidos N.2 5565350 e 5731181 de Kmiec, descrevem vetores mutacionais que contêm cadeias complementares em que uma primeira cadeia compreende análogos ribonucleotídicos que formam pares de bases de Watson-Crick com desoxirribonucleótidos de uma segunda cadeia. A Patente dos Estados Unidos N.2 6004804 de Kumar e Metz descreve certos melhoramentos em vetores mutacionais dúplices, incluindo uma variante em que a região mutadora está presente em apenas uma das duas cadeias. A utilização de vetores mutacionais do tipo Kmiec em sistemas de mamífero está descrita na patente U.S. 5760012 e em conjunto com transportadores macromoleculares na Publicação Internacional de Patente WO 98/49350 de Kren et al., e no pedido de patente dos Estados Unidos relacionado, com o n.2 de série 09/108006. Descrições adicionais da utilização de vetores mutacionais do tipo Kmiec podem ser encontradas em Cole-Strauss et al., 1996, Science 273:1386; Kren et al., 1998, Nature Med. £:285; e Bandyopadhyay et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:10163. A utilização de vetores de mutação do tipo Kmiec em células vegetais está descrita nas Publicações Internacionais de Patente WO 99/25853 de Pioneer Hi-Bred International, WO 99/07865 de Kimeragen, Inc. e WO 98/54330 de Zeneca Ltd. As publicações científicas que descrevem a utilização de vetores do tipo Kmiec em plantas incluem Beetham et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9_6:8774 e Zhu, et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:8768. A utilização de vetores mutacionais do tipo Kmiec e suas variantes, que têm cadeia dupla, está descrita na Patente dos Estados Unidos N.2 6004804 de Kumar e Metz. O pedido de Kumar e Metz ensina, Inter alia, que os vetores do tipo Kmiec e suas variantes podem ser utilizados em células bacterianas. A utilização de oligodesoxinucleótidos de cadeia simples como vetores mutacionais para efetuar alterações num gene cromossómico na levedura S. cerevisiae foi descrita em relatórios do laboratório do Dr. F. Sherman, Yale University. Moerschell et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:524-528 e Yamamoto et al. , 1992, Yeast _8:935-948. O comprimento ótimo dos vetores mutacionais utilizados nestes estudos era de 50 nucleótidos.

Num relatório isolado relativo à utilização de um polinucleótido de 160 nucleótidos de cadeia simples e dupla para tentar fazer alterações num gene cromossómico pode encontrar-se em Hunger-Bertling, 1990, Mol. Cell. Biochem. j/2 :107-116. Os resultados para polinucleót idos de cadeia simples foram ambíguos porque apenas foi analisado o produto das experiências utilizando polinucleótidos de cadeia dupla. A utilização de um fragmento de ADN em cadeia simples de 488 pares de bases para fazer alterações genéticas especificas no gene regulador da condutância transmembranar na fibrose cística foi relatada por Goncz et al., 1998, Hum. Mol. Genetics 7_:1913; e Kunzelmann et al., 1996, Gene Ther. _3:8 5 9.

Utilizaram-se oligodesoxinucleótidos de cadeia simples de cerca de 40 nucleótidos de comprimento em células de mamífero como controlo para estudos de genes epissómicos em que o oligodesoxinucleótido foi ligado covalentemente a um oligonucleótido que forma um tríplice e em que o oligodesoxinucleótido sozinho resultou em taxas de alteração genética predeterminada do gene epissómico de cerca de 1 por 5xl04, ou menos. Chan et al., 1999, J. Biol. Chem. 7 4:11541. Encontra-se um relatório anterior da utilização de oligodesoxinucleótidos de cadeia simples para fazer alterações predeterminadas num gene epissómico numa célula de mamífero em Campbell et al., 1989, The New Biologist _1:223.

Um aspeto da divulgação refere-se a oligodesoxinucleótidos que foram modificados através da ligação de um corante de indocarbocianina. Os corantes de indocarbocianina são conhecidos como excelentes fluoróforos. A síntese de cianoetil-N,N-diisopropilfosforoamiditos de indocarbocianina bloqueados que são adequados para utilização em síntese de nucleótidos em fase sólida está descrita nas Patentes dos Estados Unidos N.2 5556959 e 5808044.

Um segundo aspeto da divulgação refere-se a uma composição compreendendo um oligonucleótido de cadeia simples que codifica uma alteração genética predeterminada e um transportador macromolecular que compreende um ligando para um recetor na superfície da célula alvo. Uma composição compreendendo uma poli-L-lisina, um ligando para o recetor de asialoglicoproteínas e um oligodesoxinucleótido anti-sentido com entre 21 e 24 nucleótidos está descrita na Publicação Internacional de Patente WO 93/04701.

Um terceiro aspeto da divulgação refere-se a uma modificação de um oligodesoxinucleótido através da ligação de um nucleótido ligado em 3'-3'. A Patente dos Estados Unidos N.2 5750669 ensina um tal oligodesoxinucleótido modificado. A citação ou identificação de qualquer referência na Secção 2, ou em qualquer secção no presente pedido não deverá ser entendida como uma admissão de que essa referência está disponível como anterioridade relativamente à presente invenção.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na verificação inesperada de que oligodesoxinucleótidos de cadeia simples, particularmente quando apropriadamente modificados ou colocados numa composição com um transportador macromolecular adequado, podem ser tão ou mais eficazes para efetuar alterações genéticas predeterminadas em genes alvo em células como os vetores da arte anterior, i.e., vetores mutacionais do tipo Kmiec. Um oligodesoxinucleótido de cadeia simples adequado para utilização de acordo com a presente invenção é denominado daqui em diante um vetor mutacional oligodesoxinucleótídico de cadeia simples ou um SSOMV (do inglês, "Single Stranded Oligodeoxynucleotide Mutational Vector".

Numa concretização a divulgação proporciona uma composição para utilização para efetuar alterações dos genes cromossómicos de células de animais, e.g. de mamífero, consistindo no oligodesoxinucleótido que codifica a alteração genética e um transportador macromolecular. O transportador pode ser um policatião, uma vesícula lipídica de núcleo aquoso ou uma nanoesfera lipídica. Numa outra concretização que é adequada para utilização in vivo, o transportador compreende adicionalmente um ligando que se liga a um recetor da superfície celular que é internalizado, tal como um ligando para um recetor do fosso revestido de clatrina, e.g., o recetor de asialoglicoproteínas, o recetor de ácido fólico ou o recetor de transferina. Em concretizações preferidas o oligodesoxinucleótido é modificado pela ligação de substituintes bloqueadores a 3' e 5' tais como um nucleótido de citosina ligado em 3'-3' e um corante de indocarbocianina ligado em 5'. Numa concretização alternativa a modificação pode consistir na substituição da ligação fosfodiéster internucleótidos mais a 3' e/ou mais a 5' por uma ligação não hidrolisável tal como uma ligação fosforotioatodiéster ou uma ligação fosforamidato.

Numa segunda concretização a divulgação proporciona a modificação dos nucleótidos das extremidades 3' e 5' do oligodesoxinucleótido que codifica a alteração genética predeterminada. A invenção baseia-se ainda na verificação inesperada de que determinadas destas modificações não bloqueiam a eficácia do oligodesoxinucleótido produzir alterações genéticas. Uma destas concretizações é a combinação de um nucleótido de citosina ligado em 3'-3' e um corante de indocarbocianina ligado em 5'. Assim modificados, os oligodesoxinucleótidos são mais de 50 vezes mais eficazes do que os oligodesoxinucleótidos não modificados correspondentes quando utilizados para efetuar alterações genéticas em células bacterianas.

Numa terceira concretização a divulgação proporciona compostos e métodos para a introdução de uma alteração genética predeterminada numa célula vegetal através da introdução de um oligodesoxinucleótido que codifica a alteração genética predeterminada no núcleo de uma célula vegetal.

Em concretizações preferidas o oligodesoxinucleótido é modificado pela ligação de substituintes bloqueadores a 3' e 5' tais como um nucleótido de citosina ligado em 3'-3' e um corante de indocarbocianina ligado em 5'. Numa concretização alternativa a modificação pode consistir na substituição da ligação fosfodiéster internucleótidos mais a 3' e mais a 5' por uma ligação não hidrolisável tal como uma ligação fosforotioatodiéster ou uma ligação fosforamidato. Alternativamente, um corante de indocarbocianina ligado a 5' e uma ligação não hidrolisável na ligação fosfodiéster internucleótidos mais a 3' podem ser utilizados ainda numa terceira concretização. A presente invenção pode ser entendida mais inteiramente por referência à descrição detalhada e exemplos ilustrativos de concretizações especificas que se seguem.

4. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A sequência do SSOMV é baseada nos mesmos princípios que os vetores mutacionais da arte anterior. A sequência do SSOMV contém duas regiões que são homólogas da sequência alvo separadas por uma região que contém a alteração genética desejada, denominada a "região mutadora". A região mutadora pode ter uma sequência que tem o mesmo comprimento que a sequência que separa as regiões homólogas na sequência alvo, mas possuindo uma sequência diferente. Essa região mutadora provoca uma substituição. Alternativamente, as regiões homólogas no SSOMV podem ser contíguas uma em relação à outra, embora as regiões no gene alvo que possuem a mesma sequência estejam separadas por um, dois ou mais nucleótidos. Este SSOMV provoca uma deleção no gene alvo dos nucleótidos que estão ausentes no SSOMV. Igualmente, a sequência do gene alvo que é idêntica às regiões homólogas pode estar adjacente no gene alvo mas separada por um, dois ou mais nucleótidos na sequência do SSOMV. Este SSOMV provoca uma inserção na sequência do gene alvo.

Os nucleótidos do SSOMV são desoxirribonucleótidos que estão ligados por ligações fosfodiéster não modificadas exceto a ligação internucleótidos no terminal 3' e/ou no terminal 5' ou alternativamente as duas ligações internucleótidos do terminal 3' e/ou do terminal 5', que podem ser fosforotioato ou fosforamidato. Como aqui se utiliza, uma ligação internucleótidos é a ligação entre nucleótidos do SSOMV e não inclui a ligação entre o nucleótido da extremidade 3' ou o nucleótido da extremidade 5' e um substituinte bloqueante, veja-se adiante. 0 comprimento do SSOMV depende do tipo de célula em que o gene alvo está localizado. Quando o gene alvo é um gene cromossómico de uma célula animal, e.g. , uma célula de mamífero ou de ave, o SSOMV tem entre 25 e 65 nucleótidos, preferivelmente entre 31 e 59 desoxinucleótidos e mais preferivelmente entre 34 e 48 desoxinucleótidos. 0 comprimento total das regiões homólogas é usualmente o comprimento do SSOMV menos um, dois ou três nucleótidos. Um nucleótido mutador pode ser introduzido em mais do que uma posição no SSOMV, o que resulta em mais do que duas regiões homólogas no SSOMV. Quer hajam duas ou mais regiões homólogas, os comprimentos de pelo menos duas das regiões homólogas deverão ser de pelo menos 8 desoxinucleótidos cada um.

Para células procariotas, o comprimento do SSOMV está entre 15 e 41 desoxinucleótidos. 0 comprimento preferido do oligodesoxinucleótido para utilização em procariotas depende do tipo de grupo protetor a 3' que se utiliza. Quando o substituinte protetor a 3' é uma desoxicitidina ligada em 3'-3', o oligonucleótido tem preferivelmente entre cerca de 21 e 28 desoxinucleótidos, sendo de outro modo o comprimento ótimo entre 25 e 35 desoxinucleótidos. Os comprimentos das regiões de homologia são, deste modo, um comprimento total de pelo menos 14 desoxinucleótidos e pelo menos duas regiões de homologia deverão ter comprimentos de pelo menos 7 desoxinucleótidos cada uma.

Para células vegetais, o comprimento do SSOMV está entre 21 e 55 desoxinucleótidos e os comprimentos das regiões de homologia são, deste modo, um comprimento total de pelo menos 20 desoxinucleótidos e pelo menos duas regiões de homologia deverão ter comprimentos de pelo menos 8 desoxinucleótidos cada uma.

Dentro destas gamas o comprimento ótimo do oligodesoxinucleótido é determinado pelo teor de GC, sendo tanto menor o comprimento ótimo do oligodesoxinucleótido quanto maior o teor de GC. Contudo, é preferido um teor de GC superior a 50%. O SSOMV pode ser utilizado com qualquer tipo de célula animal, e.g., uma célula de mamífero, uma célula de ave, uma célula de inseto, uma célula de peixe ou uma célula de verme (nemátodo). O SSOMV pode também ser utilizado em qualquer tipo de célula vegetal. Adicionalmente, o SSOMV pode ser utilizado com qualquer tipo de célula bacteriana, e.g., células bacterianas Gram-positivas ou células bacterianas Gram-negativas. Exemplos de tipos de bactérias incluem, Salmonella, E. coli, Pseudomonas, Rostani, etc. Não é importante se as células estão em replicação ativa ou se o gene alvo está transcricionalmente ativo. Contudo, quando o gene alvo está localizado numa bactéria é importante que a bactéria seja RecA+.

Assim, a maioria das estirpes de bactérias vulgarmente utilizadas em trabalhos de ADN recombinante não são adequadas para utilização na presente invenção porque essas bactérias são RecA~ de modo a reduzir a instabilidade genética dos plasmídeos clonados. Adicionalmente, em células bacterianas o gene alvo pode estar localizado num plasmídeo ou num cromossoma bacteriano artificial (BAC, do inglês "Bacterial Artificial Chromosome"), assim como no cromossoma bacteriano. 0 SSOMV pode ser desenhado para ser complementar a cada uma das cadeias codificante ou não codificante do gene alvo. Quando a mutação desejada é uma substituição de uma única base, prefere-se que o nucleótido mutador seja uma pirimidina. Na medida em que seja consistente com o facto de se conseguir o resultado funcional desejado prefere-se que tanto o nucleótido mutador como o nucleótido alvo na cadeia complementar sejam pirimidinas. São particularmente preferidos os SSOMV que codificam mutações de transversão, i.e., um nucleótido mutador C ou T fica mal emparelhado, respetivamente, com um nucleótido C ou T na cadeia complementar.

Em adição ao oligodesoxinucleótido, o SSOMV pode conter um substituinte bloqueador a 5' que é ligado aos carbonos do terminal 5' através de um ligante. A química do ligante não é crítica para além do seu comprimento, que deverá preferivelmente ser de pelo menos 6 átomos de comprimento e de que o ligante dever ser flexível. A química do substituinte bloqueador a 5' para células de mamífero, de ave ou vegetais não é crítica para além do peso molecular que deverá ser inferior a cerca de 1000 daltons. Podem utilizar-se uma variedade de substituintes não tóxicos, como biotina, colesterol ou outros esteroides ou um corante fluorescente catiónico não intercalante. Para utilização em sistemas bacterianos, contudo, o substituinte bloqueador possui um efeito importante sobre a eficiência do SSOMV e é preferivelmente uma indocarbocianina substituída com 3,3,3',3'-tetrametil-N,N'-oxialquilo. São particularmente preferidos como reagentes para preparar os SSOMV os reagentes comercializados como Cy3™ e Cy5™ pela Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, que são fosforoamiditos bloqueados que após incorporação num oligonucleótido originam cortantes de indomonocarbocianina e indodicarbocianina substituídas com 3,3,3', 3'-tetrametil-N,N'-isopropilo, respetivamente. Quando a indocarbocianina é substituída com N-oxialquilo pode ser convenientemente ligada ao terminal 5' do oligodesoxinucleótido através de um fosfodiéster com um fosfato no terminal 5'. A guímica do ligante corante entre o corante e o oligodesoxinucleótido não é crítica e é escolhida por conveniência da síntese. Quando é utilizado o fosforamidito comercialmente disponível Cy3 como dirigido a modificação resultante a 5' consiste num substituinte bloqueador e num ligante juntos que são uma N-hidroxipropil, N'-fosfatidilpropil-3,3,3',3'-tetrametilindomonocarbocianina.

Numa concretização alternativa, o corante de indocarbocianina, e.g., fosforamidato Cy3, pode ser ligado ao oligodesoxinucleótido após o oligodesoxinucleótido ter sido sintetizado.

Na concretização preferida o corante de indocarbocianina é tetrassubstituído nas posições 3 e 3' dos anéis indole. Sem limitação quanto à teoria, estas substituições impedem o corante de ser um corante intercalante. A identidade dos substituintes nestas posições não é crítica. 0 SSOMV pode, em adição, ter um substituinte bloqueador a 3'. Novamente, a química do substituinte bloqueador a 3' não é crítica, para além da não toxicidade e do peso molecular inferior a cerca de 1000, quando o gene alvo está localizado numa célula não bacteriana. Contudo, quando o gene alvo está localizado numa célula bacteriana o substituinte bloqueador a 3' preferido é um denominado nucleótido invertido, i.e., um nucleótido que está ligado através de um fosfodiéster não substituído em 3'-3', como é ensinado na Patente dos Estados Unidos N.2 5750669. Numa concretização mais preferida o nucleótido invertido é uma timidina ou mais preferivelmente uma desoxicitidina. Para utilização em células bacterianas, a combinação de um substituinte bloqueador a 5' Cy3 e um substituinte bloqueador a 3' de desoxicitidina invertida, é particularmente preferida pois as duas modificações possuem um efeito sinérgico sobre a eficácia do SSOMV. O SSOMV com as modificações acima referidas pode ser sintetizado por síntese convencional de nucleótidos em fase sólida. 0 SSOMV pode ser introduzido na célula contendo o gene alvo pelas mesmas técnicas que são utilizadas para introduzir os vetores mutacionais do tipo Kmiec em células animais e vegetais. Para células bacterianas, um método preferido para a introdução do SSOMV é por eletroporação.

Para utilização com células animais, incluindo células de mamífero e de ave, o método preferido de entrega na célula é utilizando um transportador macromolecular protetor. Os reagentes de transfecção lipossómica comercialmente disponíveis tais como Lipofectamine™ e Superfect™ são desenhados de modo a que o ácido nucleico a transfectar seja electrostaticamente aderente à superfície exposta do lipossoma. Estes transportadores não são tão preferidos como os transportadores macromoleculares protetores. Os transportadores macromoleculares protetores adequados são divulgados nas Publicações Internacionais de Patente WO 98/49350 e WO 99/40789 e em Bandyopadhyay et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:10163.

Um transportador macromolecular particularmente preferido é uma vesícula lipídica de núcleo aquoso ou um lipossoma em que o SSOMV é aprisionado no núcleo aquoso. Estas vesículas são feitas tomando um filme lipídico isento de solventes e adicionando uma solução aquosa do SSOMV, seguindo-se agitação com vórtex, extrusão ou passagem através de uma membrana de microfiltração. Numa concretização preferida os constituintes lipídicos são uma mistura de dioleoílfosfatidilcolina/ dioleoíifosfatidilserina/ galactocerebrósido numa razão de 1:1:0,16. Outros transportadores incluem policatiões, tais como polietilenoimina, possuindo um peso molecular entre 500 daltons e 1,3 Md, senso adequada uma espécie de 25 kd e nanoesferas lipídicas, em que o SSOMV é proporcionado na forma de um sal lipófilo.

Quando os SSOMV são utilizados para introduzir alterações genéticas em células de mamífero e de ave, prefere-se que o transportador macromolecular compreenda ainda um ligando para um recetor da superfície celular que seja internalizado. Os recetores adequados são os recetores que são internalizados pela via do fosso revestido de clatrina, tais como o recetor de asialoglicoproteínas, o recetor do fator de crescimento epidérmico e o recetor de transferina. São também adequados os recetores que são internalizados através da via caveolar tais como o recetor de ácido fólico. 0 galactocerebrósido é um ligando para o recetor de asialoglicoproteinas. Como aqui se utiliza, um recetor internalizável é um recetor que é internalizado pela via do fosso revestido de clatrina ou pela via caveolar. 0 SSOMV pode ser utilizado para qualquer finalidade em que os vetores mutacionais da arte anterior tenham sido empregues. As utilizações especificas incluem a cura de doenças genéticas por inversão da doença que causa uma lesão genética; estas doenças incluem por exemplo hemofilia, deficiência de antitripsina i e doença de Crigler-Najjar e outras doenças ensinadas na Publicação Internacional de Patente WO 98/49350.

Alternativamente, o SSOMV pode ser utilizado para modificar plantas com a finalidade descrita na publicação de patente WO 99/07865.

Uma utilização adicional dos SSOMV em plantas é a geração de plantas resistentes a herbicidas por meios que evitam ter que introduzir um gene estranho ou heterólogo numa planta agrícola. Tem particular interesse a resistência ao herbicida glifosato (ROUNDUP®). A identidade das mutações que conferem resistência ao glifosato pode ser encontrada nas Publicações Internacionais de Patente WO 99/25853 e WO 97/04103.

Alternativamente, o SSOMV pode ser utilizado para modificar bactérias. A utilização de SSOMV para manipulação genética de bactérias é particularmente valiosa nos campos da produção de antibióticos e na construção de bactérias especificamente atenuadas para a produção de vacinas. Em ambas as aplicações anteriores é importante que os genes de resistência aos antibióticos não permaneçam na bactéria final modificada.

Ainda adicionalmente, o SSOMV pode ser utilizado em combinação com um cromossoma bacteriano artificial (BAC) para modificar um gene alvo de qualquer espécie que tenha sido clonado num BAC. Pode ser incorporado um fragmento muito maior do que o gene alvo. O BAC possuindo o gene alvo clonado é colocado num hospedeiro bacteriano e é introduzida uma alteração genética predeterminada de acordo com a invenção. Um subclone do BAC possuindo a alteração genética predeterminada pode ser identificado e a inserção pode ser removida para posterior utilização. A presente invenção permite fazer alterações predeterminadas sem o tempo e despesa inerentes à sua obtenção fazendo fragmentos de PCR e inserindo os fragmentos de novo no gene original.

5. EXEMPLO 1: TRATAMENTO DO RATO GUNN 0 rato Gunn contém uma mutação no gene da UDP-glucuronosiltransferase, que é o mesmo gene que está mutado na Doença de Crigler-Najjar. Roy-Chowdhury et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:18294; Iyanangi et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:21302. No rato Gunn existe uma mutação no nucleótido 1206 que eliminou uma G. Foi construído um SSOMV de 35 nucleótidos, denominado CN3-35UP, correspondente à cadeia anti-sentido, para inverter a mutação, que tem a seguinte sequência: 5'-ATCATCGGCAGTCATTT C CAGGACATTCAGGGTCA-3' (SEQ ID NO:1). O CN3-35LOW, um segundo SSOMV que corresponde à cadeia de sentido direto, tem a seguinte sequência: 5'-TGACCCTGAATGTCCTG G AAATGACTGCCGATGAT-3' (SEQ ID NO:2). O nucleótido mutador está a negrito. O CN3-35UP (2 animais) e o CN3-35LOW modificados com 5'Cy3 e dC em 3'-3' e o CN3-35UP não modificado, foram formulados numa vesícula lipídica de núcleo aquoso possuindo constituintes lipídicos de dioleoílfosfatidilcolina/ dioleoíifosfatidilserina/galactocerebrósido numa razão de 1:1:0,16. Utilizaram-se aproximadamente 2,0 ml de dextrose a 5% contendo 500 pg do SSOMV para hidratar 2 mg de lípido e as vesículas foram depois extrudidas com um diâmetro de 0,5 pm. A eficiência da encapsulação foi de 80%. Um grupo de controlo positivo foi tratado com MV do tipo Kmiec (2 animais) dadas numa quantidade equimolar no mesmo transportador. Os ratos, pesando 250 gramas, foram tratados em cinco dias consecutivos com 300 pg de SSOMV ou com o transportador. Os níveis de bilirrubina sérica resultantes foram os seguintes, em mg/dl. R / dias após R 0 d 14 d 21 d 26 d 39 d

Unmod-UP 6,3 4,6 5,4 4,2 3,2

Mod-UP 7,9,6,5 4,1,3,3 4,9,5,0 4,2,3,8 3,6,3,0

Mod-LOW 6,8 4,3 5,9 4,2 3,5 tipo Kmiec 6,3, 7,1 4, 6,5,7 4,8,4,2 5,5, 5, 1 4,4,4,7

Os dados demonstram que tanto os SSOMV modificados como os não modificados e que tanto as sequências de sentido direto como as anti-sentido, foram pelo menos equivalentes e que nos pontos temporais mais longínquos o SSOMV pareceu superior aos vetores mutacionais do tipo Kmiec.

6. EXEMPLO 2: MODIFICAÇÃO DO GENE DA UDP-GLUCURONOSILTRÃNSFERASE HUMANA O exemplo seguinte mostra que um SSOMV não modificado num transportador macromolecular pode ser utilizado para introduzir uma alteração genética específica numa célula de mamífero num meio artificial com taxas que estão dentro de um fator de 3 do que se observa com vetores mutacionais tipo Kmiec de ADN/2'OMeARN. Os dados mostram adicionalmente que modificações mínimas, como de uma única ligação fosforotioato, podem resultar em taxas inteiramente comparáveis.

Um grupo de pessoas Amish têm Doença de Crigler-Najjar resultante de uma substituição C A no nucleótido 222 do gene da UDP-Glucuronosiltransferase. A mutação resulta na conversão de um codão TAC (Tyr) num codão de paragem (stop) TAA. Foi desenhado um SSOMV para introduzir a mutação que causa a doença numa linha celular de carcinoma hepatocelular humano, HuH-7. Um SSOMV de 35 nucleótidos, designado por CNAM3-35UP, ou corresponde à cadeia anti-sentido e tem a seguinte sequência: 5'-GGGTACGTCTTCAAGGT T TAAAATGCTCCGTCTCT-3' (SEQ ID NO:3). O nucleótido mutador está em negrito.

Deram-se às células HuH-7 a 106/cm2 300 μΐ feitos num transportador de acordo com o método do Exemplo 1 contendo CNAM3-35UP, CNAM3-35UP modificado de várias maneiras ou uma quantidade equimolar de um vetor mutacional do tipo Kmiec de 82 nucleótidos. As células foram colhidas e o fragmento génico relevante foi amplificado por PCR, clonado e analisado por hibridação específica de alelos de acordo com os métodos de Bandyopadhyay, supra. Observaram-se as seguintes taxas de conversão: SSOMV não modificado 6% SSOMV 5'Cy3 15% SSOMV dC 3' -3' 5% SSOMV 5'Cy3, dC 3' -3' 15% SSOMV 5' fos'tioato 16% 3' fos'tioato 12% MV tipo Kmiec 14%

Estes dados demonstram que na presença de um transportador macromolecular, os SSOMV modificados foram tão eficazes como vetores mutacionais do tipo Kmiec, e que os SSOMV não modificados foram eficazes dentro de um fator de 3.

7. EXEMPLO 3: CONVERSÃO DE RESISTÊNCIA A CANAMICINA NUM BAC 0 exemplo que se segue mostra que os SSOMV modificados são mais eficazes do que vetores mutacionais Kmiec de ADN/2'0MeARN em células bacterianas.

Um gene de resistência a canamicina foi inativado pela inserção de um codão de paragem ATG em enquadramento. A resistência à canamicina é recuperada convertendo o terceiro nucleótido numa C, i.e., efetuando uma transversão no terceiro nucleótido.

A sequência de um SSOMV de 41 nt que corresponde à cadeia de sentido direto para a recuperação da resistência a canamicina é como se segue: 5'-GTGGAGAGGCTATTCGGCTA C GACTGGGCACAACAGACAAT-3' (SEQ ID NO: 4). 0 nucleótido mutador está a negrito.

Para gerar pBACKans, inseriu-se um ligante BamHI no local Smal único de pKans, e o fragmento BamHI-HindlII de 1,3-kb resultante, contendo o gene mutante da canamicina foi inserido nos locais BamHI/HindiII do vetor de clonagem de BAC pBeloBACll (Genome Systems, Inc., St. Louis, MO). As estirpes de Escherichia coli MC1061 e DH10B foram transformadas com pBACKans, selecionadas em placas de cloranfenicol LB, e tornadas eletrocompetentes.

Quarenta μΐ de células eletrocompetentes foram eletroporadas com entre 5 e 10 pg de SSOMV utilizando as seguintes condições: 25 kV/cm, 200 ohms, 25 microfarads.

Adicionou-se 1 mL de SOC às células imediatamente após a electroporação e cresceu-se a cultura durante 1 hora enquanto agitando a 372C. Adicionaram-se 4 mL de LB+ cloranfenicol (final de 12,5 pg/mL) e cresceram-se as culturas durante mais 2 horas enquanto agitando a 37 2C. Plaquearam-se diluições apropriadas da cultura em placas de LB-cloranfenicol para avaliar a viabilidade e em placas de LB-canamicina para avaliar a conversão. A frequência da conversão foi calculada dividindo o número de colónias resistentes a canamicina/mL pelo número de colónias resistentes a cloranfenicol/mL. A taxa de conversão observada com o SSOMV de 25 nucleótidos modificado 5'Cy3, dC 3' -3' correspondia a cerca de 1 conversão por 100 bactérias sobreviventes.

As taxas de conversão relativas foram: MV Kmiec de 68 nt w/ ligante de 2'OMeARN 0,04 MV Kmiec de 68 nt w/ligante de ADN 0,004 SSOMV de 41 nt w/3',5' fos'tioato 0,4 SSOMV de 35 nt w/3',5' fos'tioato 4,0 SSOMV de 29 nt w/3',5' fos'tioato 0,9 SSOMV de 25 nt w/3',5' fos'tioato 1,0 SSOMV de 41 nt w/dC 3' -3' ,5'Cy3 2,0 SSOMV de 35 nt w/dC 3' -3' ,5'Cy3 2,9 SSOMV de 35 nt w/dC 3' -3' , 2,5 SSOMV de 35 nt w/5'Cy3 2,5 SSOMV de 29 nt w/dC 3' -3' ,5'Cy3 4,2 SSOMV de 25 nt w/dC 3' -3' ,5'Cy3 42,0 SSOMV de 25 nt w/dC 3' -3' 1,3 SSOMV de 25 nt w/5'Cy3 1,8 SSOMV de 25 nt w/3'fos'tioato,5'Cy3 8,4 SSOMV de 35 nt w/3'fos'tioato,5'Cy3 10,2

Estes dados demonstram que a taxa de conversão do SSOMV ótimo era entre 103 e 104 maior do que a do vetor mutacional do tipo Kmiec.

8. EXEMPLO 4: A UTILIZAÇÃO DE UM SSOMV SEM UM TRANSPORTADOR PROTETOR NUMA CÉLULA DE MAMÍFERO - RESISTÊNCIA A HIGROMICINA

Este exemplo mostra a modificação de uma célula mamífero utilizando SSOMV modificado na ausência de um transportador macromolecular protetor. Os SSOMV modificados foram capazes de introduzir a modificação genética a uma taxa que era entre 15 e 30 vezes maior do que a dos vetores mutacionais do tipo Kmiec. Este exemplo utiliza o mesmo gene que se utilizou no Exemplo 3; contudo, é expresso na linha celular HuH-7.

Um clone de células HuH7 contendo uma cópia integrada de forma estável do gene da canamicina mutante num vetor contendo IRES (pIRESKan-) foi gerado sob seleção por higromicina. As células foram cultivadas em DMEM de levado teor de glucose/ FBS a 10% contendo 100 mg/ml de higromicina para manter uma elevada expressão a partir da construção integrada. Vinte e quatro horas antes da transfecção semearam-se as células a uma densidade de 1,0 xlO6 células numa placa de 100 mm. Duas horas antes da transfecção o meio de crescimento foi substituído por 10 ml de Opti-MEM™. Diluíram-se 40 microgramas de oligonucleótido e 40 ml (80 pg) de Lipofectamine™ em tubos separados contendo 200 ml de Opti-MEM pH 8,5. A Lipofectamine é então adicionada ao oligonucleótido, mistura-se através de uma pipeta e incuba-se à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da adição de 3,6 ml de Opti-MEM pH 8,5. O meio é aspirado das células e substituído pelos 4 ml de mistura de transfecção. As células são incubadas durante 2 horas a 37 °C antes da mistura de transfecção ser substituída por meios de crescimento padrão. Dois dias após a transfecção as células são divididas por 2 placas de 100 mm em 10 ml de meio contendo 450 mg/ml de G418. O meio contendo G418 é substituído diariamente durante 10 dias, depois duas vezes por semana até as colónias serem visíveis macroscopicamente (16-18 dias após transfecção). Os clones são recolhidos aproximadamente 21 dias após a transfecção e expandidos para análise molecular.

As taxas de fundo do desenvolvimento de resistência a higromicina é de cerca de 1 por 106. Quando foram empregues vetores mutacionais do tipo Kmiec não houve aumento no número de colónias resistentes. A análise da sequência de uma de 5 colónias mostrou que tinha obtido a mutação específica. As mutações nas outras 4 colónias não puderam ser identificadas. Quando se utilizou um SSOMV w/dC 3' -3' ,5'Cy3 de 41 nucleótidos, as taxas de desenvolvimento de colónias resistentes a higromicina aumentou entre 15 e 30 vezes, i.e., para cerca de 3 por 105. A análise da sequência destas colónias mostrou que entre 100% e 80% das colónias tinha a alteração genética correta. Experiências com SSOMV w/dC 3' -3' ,5'Cy3 de 35 nt ou w/3'fosfortioato 5'Cy3 ou w/duas ligações fosforotioato em cada uma das extremidades 3', 5', mostraram taxas de desenvolvimento de resistência a higromicina que eram cerca de metade da taxa do SSOMV modificado de 41 nucleótidos.

9. EXEMPLO 5: A UTILIZAÇÃO DE UM SSOMV SEM UM TRANSPORTADOR

PROTETOR NUMA CÉLULA DE MAMÍFERO - TIROSINASE

Este exemplo mostra que numa linha celular de mamífero um SSOMV não modificado sem um transportador protetor pode ser superior tanto ao SSOMV modificado a com 5'Cy3/dC 3' -3' como superior a vetores mutacionais do tipo Kmiec de ADN/2'OMe ARN.

Estas experiências utilizam Melan-c, uma linha celular melanocítica murina possuindo uma mutação C G no codão 82 do gene da tirosinase, que cria uma paragem em enquadramento. Bennett, et al., 1989, Development 105:37 9. Foi desenhado um SSOMV de 35 nucleótidos que corresponde à sequência de codificação e tem a seguinte sequência: 5'-CCCCAAATCCAAACTTA C AGTTTCCGCAGTTGAAA-3' (SEQ ID NO: 5). O nucleótido mutador está em negrito.

As células Melan-c foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino, 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) 100 nM e b-mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco, Bethesda, MD). Dois dias antes da transfecção, as células foram semeadas a uma densidade de 0,5-1,5 xlO5 células/poço numa placa de 6 seis poços e reenchida com meio fresco 24 horas antes da transfecção. Cinco a dez microgramas (220-440 nM) dos oligonucleótidos foram incubados com 6-9 pg de Superfectin™ em 0,1 ml de TE (TRIS 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) durante 30 min à temperatura ambiente. A mistura de transfecção foi adicionada às células contendo 0,9 ml de meio de crescimento DMEM de elevado teor de glucose contendo 10% de soro e PMA 100 nM. Após 6-18 horas, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato e alimentadas com 2 ml do meio DMEM. As células foram monitoradas quanto a uma alteração na pigmentação por microscopia. 0 número de eventos de conversão foi determinado por contagem do número de células pigmentadas ou agrupamentos de células 5 a 8 dias após a transfecção.

As taxas de conversão albino tipo selvagem (pigmentadas) por 105 células foram como se segue: MV tipo Kmiec 1 SSOMV não modificado 5 SSOMV w/3',5' fos'tioato 6 SSOMV w/dC 3' -3' 2 SSOMV w/5' Cy3 3 SSOMV w/dC 3' -3' , 5'Cy3 1

10. EXEMPLO 6: A UTILIZAÇÃO DE UM SSOMV MODIFICADO EM PLANTAS

Este exemplo refere-se à utilização de um SSOMV para introduzir uma mutação Ser Asn na posição 653 da aceto-hidroxiácido-sintase (também conhecida como acetolatato-sintase) de Arabodopsis thaliana. A mutação requer que um codão AGT seja convertido num codão AAT e introduz resistência a herbicidas de imidazolina assim como a herbicidas de sulfonilureia.

Sintetizaram-se um SSOMV de 25 nucleótidos e um SSOMV de 35 nucleótidos possuindo modificações com dC 3' -3' e 5'Cy3 e que tinham as seguintes sequências, respetivamente: 5'-

CGATCCCGA A TGGTGGCACTTT-3' (SEQ ID NO: 6), 5'-GTTGCCGATCCCGA A TGGTGGCACTTTCAACG-3' (SEQ ID NO: 7). 0 nucleótido mutador está em negrito.

Preparou-se uma população celular desagregada de A. thaliana plaqueada a 106 por placa e submeteu-se a introdução biolística do SSOMV ou de um MV do tipo Kmiec possuindo a mesma sequência. Placas de controlo utilizando um plasmídeo determinaram que a eficiência do sistema biolístico é de cerca de uma entrega por 200 de células plaqueadas. Após dois meses de seleção com Imazaquin™ 10 μΜ, cada uma das populações celulares tratadas biolisticamente apresentava uma taxa de fundo corrigida de resistência a Imazaquina de cerca de 1 por 103 células em que os vetores mutacionais foram introduzidos com sucesso.

11. EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO DE PEI CONJUGADO COM FOLATO

Este exemplo descreve a preparação de PEI conjugado com folato que é adequado para utilização como um transportador macromolecular na invenção. Ácido fólico (4,4 mg, 10 pmol) em tampão de fosfato de sódio (1,5 mL, 133 mM, pH 4,5) foi tratado com 200 pL de piridina e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC, 15,5 mg, 98 pmol) e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de folato ativada (1,7 mL) foi adicionada a uma solução aquosa de polietilenoimina (25 kDa, 24,55 mg/mL; 1,02 mL) e incubou-se durante 3 dias à TA com agitação suave. A polietilenoimina conjugada foi purificada por diálise contra água através de uma membrana de limite de exclusão de PM de 12 kDa. O produto foi positivo para aminas no ensaio da ninidrina e para folato por absorvância de UV com máximos a 259, 289 e 368 nm. O acoplamento foi de cerca de 1-2 porções de folato por 1000 aminas, o que é equivalente a 1-2 folatos por molécula de PEI. A presente invenção não se pretende limitada em âmbito pelas concretizações específicas aqui descritas. De facto, várias modificações da invenção em adição às aqui descritas serão evidentes para os peritos na especialidade a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Essas modificações pretendem-se dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Itens numerados adicionais da divulgação. 1. Composição para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene cromossómico alvo de uma célula animal, compreendendo: (a) um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', e possuindo pelo menos 25 desoxinucleótidos e não mais de 65 desoxinucleótidos, e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões de pelo menos 8 desoxinucleótidos que são, cada uma, respetivamente, idênticas a duas regiões do gene cromossómico alvo, regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene cromossómico alvo ou na sequência do oligodesoxinucleótido, ou ambas, e regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 24 nucleótidos de comprimento, e (b) um transportador macromolecular selecionado do grupo que consiste em (i) uma vesícula lipídica de núcleo aquoso, em que o núcleo aquoso contém o oligonucleótido de cadeia simples, (ii) uma nanoesfera lipídica, que compreende um sal lipófilo do oligonucleótido de cadeia simples, e (iii) um policatião possuindo um peso molecular médio de entre 500 daltons e 1,3 Md em que o policatião forma um sal com a oligonucleobase. 2. Composição do item 1 em que o comprimento do oligonucleótido de cadeia simples é de pelo menos 31 desoxinucleótidos e não mais de 59 desoxinucleótidos. 3. Método de obtenção de uma célula animal que contém uma alteração genética predeterminada num gene alvo que compreende: (a) proporcionar uma população de células animais num meio de cultura; (b) adicionar a composição do item 2 ao meio de cultura; e (c) identificar uma célula da população possuindo a alteração genética predeterminada. 4. Método do item 3, que adicionalmente compreende isolar a célula identificada. 5. Composição do item 1, em que o transportador macromolecular compreende adicionalmente um ligando para um recetor internalizável da célula animal que está ligado à superfície do transportador macromolecular. 6. Método para efetuar uma alteração genética predeterminada num tecido de um indivíduo mamífero que compreende: (a) administrar ao indivíduo mamífero a composição do item 5 num transportador farmaceuticamente aceitável; e (b) detetar a presença da alteração genética predeterminada nas células do tecido do indivíduo mamífero. 7. Método do item 6, em que o indivíduo mamífero é um ser humano possuindo uma lesão genética que é invertida pela alteração genética predeterminada, que compreende a administração de uma quantidade da composição que é eficaz para melhorar os efeitos da lesão genética. 8. Método do item 6, em que o tecido é o fígado. 9. Composição do item 5, em que o recetor é selecionado do grupo que consiste no recetor de asialoglicoproteínas, no recetor de transferina e no recetor do fator de crescimento epidérmico. 10. Composição do item 5, em que o recetor é o recetor de ácido fólico. 11. Composição do item 1, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligação fosforotioato. 12. Composição do item 1, em que a ligação internucleót idos ligada ao nucleótido da extremidade 5' é uma ligação fosforotioato. 13. Composição do item 1, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5'. 14. Composição do item 13, em que o substituinte bloqueador a 5' é um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'- tetrassubstituída e substituída com Ν' -hidroxialquilo, que está ligado ao hidroxilo 5' através de um ligante. 15. Composição do item 14, em que o corante de indocarbocianina e o ligante, juntos, são uma N-hidroxipropil, Ν' -fosfatidilpropil-3,3,3',3'-tetrametilindomonocarbocianina. 16. Composição do item 14, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligação fosforotioato. 17. Composição do item 1, em que o hidroxi 3' do nucleótido da extremidade 3' está ligado a um substituinte bloqueador a 3 ' . 18. Composição do item 17, em que o substituinte bloqueador a 3' é um nucleótido bloqueador que está ligado em 3'-3' ao hidroxi 3' do nucleótido da extremidade 3'. 19. Composto para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene cromossómico alvo de uma célula animal, compreendendo um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', e possuindo pelo menos 25 desoxinucleótidos e não mais de 65 desoxinucleótidos e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões de pelo menos 8 desoxinucleótidos que são, cada uma, respetivamente, idênticas a duas regiões do gene cromossómico alvo, regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene cromossómico alvo ou na sequência do oligodesoxinucleótido, ou ambas, e regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 24 nucleótidos de comprimento. 20. Método para obtenção de uma célula animal que contém uma alteração genética predeterminada num gene alvo que compreende: (a) proporcionar uma população de células animais num meio de cultura; (b) adicionar o composto do item 19 ao meio de cultura; e (c) identificar uma célula da população possuindo a alteração genética predeterminada. 21. Composto do item 19, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligação fosforotioato. 22. Composto do item 21, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 5' é uma ligação fosforotioato. 23. Método para obtenção de uma célula animal que contém uma alteração genética predeterminada num gene alvo, que compreende: (a) proporcionar uma população de células animais num meio de cultura; (b) adicionar a composição do item 22 ao meio de cultura; e (c) identificar uma célula da população possuindo a alteração genética predeterminada. 24. Composto do item 21, em que um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetrassubstituída e substituída com Ν' -hidroxialquilo está ligado ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' através de um ligante. 25. Composto do item 19, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 5' é uma ligação fosforotioato. 26. Composto do item 25, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligação fosforotioato ou em que um nucleótido desoxicitidina ou timidina está ligado em 3'-3' ao hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3' ou ambos. 27. Composto para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene alvo numa célula bacteriana compreendendo: (a) um oligonucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', e possuindo pelo menos 15 desoxinucleótidos e não mais de 41 desoxinucleótidos, e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões de pelo menos 7 desoxinucleótidos, que são, cada uma respetivamente, idênticas a duas regiões do gene alvo, regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene alvo ou na sequência do oligonucleótido de cadeia simples, ou ambas, e regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 14 nucleótidos de comprimento; (b) uma modificação a 5' em que a ligação internucleót idos ligada ao nucleótido da extremidade 5' é uma ligação fosforotioato ou em que um corante de indocarbocianina 3, 3,3' , 3'-tetrassubstituida e substituída com N'-hidroxialquilo está ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5'; e (c) uma modificação a 3' em que a ligação internucleót idos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligação fosforotioato ou em que um nucleótido desoxicitidina ou timidina está ligado em 3'-3' ao hidroxi 3' do nucleótido da extremidade 3' ou ambos. 28. Composto do item 27, em que a modificação a 5' compreende uma N-hidroxipropil,N'-fosfatidilpropil-3,3,3',3'-tetrametilindomonocarbocianina. 29. Composto do item 27, em que a modificação a 3' consiste numa desoxicitidina ligada em 3'-3'. 30. Composto do item 27, em que a modificação a 3' consiste numa ligação internucleótidos fosforotioato ligada ao nucleótido da extremidade 3'. 31. Composto para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene alvo numa célula vegetal, compreendendo um oligonucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', e possuindo pelo menos 21 desoxinucleót idos e não mais de 55 desoxinucleótidos e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões de pelo menos 8 nucleótidos que são, cada uma, respetivamente, idênticas a duas regiões do gene alvo, regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene alvo ou na sequência do oligonucleótido de cadeia simples, ou ambas, e regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 20 nucleótidos de comprimento. 32. Método para obtenção de uma célula vegetal que contém uma alteração genética predeterminada num gene alvo que compreende: (a) introduzir o composto do item 31 numa população de células vegetais; e (b) identificar uma célula da população possuindo a alteração genética predeterminada. 33. Método do item 32, que adicionalmente compreende o isolamento da célula identificada. 34. Composto do item 31, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5'. 35. Composto do item 34, em que o hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3' está ligado a um substituinte bloqueador a 3'. 36. Composto do item 35, em que (a) o substituinte bloqueador a 5' é um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetrassubstituída e substituída com Ν' -hidroxialquilo, que está ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5'; e (b) o substituinte bloqueador a 3' é um nucleótido bloqueador que está ligado em 3'-3' ao hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3 ' . 37. Composto do item 36, em que o oligonucleótido de cadeia simples tem pelo menos 25 nucleótidos e não mais de 35 nucleótidos de comprimento. 38. Composto do item 36, em que o nucleótido bloqueador é uma desoxicitidina ou uma timidina. 39. Composto do item 36, em que o corante de indocarbocianina e o ligante, juntos, são uma N-hidroxipropil, Ν' -fosfatidilpropil-3,3,3',3'-tetrametilindomonocarbocianina. 40. Composto do item 31, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligação fosforotioato. 41. Composto do item 31, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 5' é uma ligação fosforotioato. 42. Composto do item 31, em que (a) o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5'; e (b) a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligação fosforotioato. 43. Composto do item 42, em que o substituinte bloqueador a 5' é um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetra-substituida e substituída com Ν' -hidroxialquilo, que está ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5 ' . 44. Composição do item 1 ou 3, em que a célula animal é selecionada do grupo que consiste em uma célula de mamífero, uma célula de ave, uma célula de inseto, uma célula de verme e uma célula de peixe. 45. Composto do item 19, 21 ou 22 em que a célula animal é selecionada do grupo que consiste em uma célula de mamífero, uma célula de ave, uma célula de inseto, uma célula de verme e uma célula de peixe. 46. Método do item 20 ou 23 em que a célula animal é selecionada do grupo que consiste em uma célula de mamífero, uma célula de ave, uma célula de inseto, uma célula de verme e uma célula de peixe. 47. Composto do item 27 em que o gene alvo está num cromossoma artificial bacteriano

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> KIMERAGEN, INC.

<120> VETORES MUTACIONAIS OLIGODESOXINUCLEOTÍDICOS DE CADEIA SIMPLES <130> 7991-085-228 <150> US 09/384,960 <151> 1999-08-27 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Versão 3.0

<210> 1 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 1 atcatcggca gtcatttcca ggacattcag ggtca 35

<210> 2 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 2 tgaccctgaa tgtcctggaa atgactgccg atgat 35

<210> 3 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 3 gggtacgtct tcaaggttta aaatgctccg tctct 35

<210> 4 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 4 gtggagaggc tattcggcta cgactgggca caacagacaa t 41

<210> 5 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 5 ccccaaatcc aaacttacag tttccgcagt tgaaa 35

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 6 cgatcccgaa tggtggcact tt 22

<210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 7 gttgccgatc ccgaatggtg gcactttcaa cg 32

Lisboa, 2015-08-05

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização in vitro de um composto para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene cromossómico alvo de uma célula animal, em que o composto é um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 25 desoxinucleótidos e não mais de 65 desoxinucleótidos, e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões, cada uma com pelo menos 8 desoxinucleótidos, que são idênticas, respetivamente, a pelo menos duas regiões do gene cromossómico alvo, regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 24 nucleótidos de comprimento, e regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene cromossómico alvo ou na sequência do oligodesoxinucleótido, ou ambas, e possuindo uma sequência diferente, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5', sendo o substituinte bloqueador a 5' um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetrassubstituida e substituída com N'-hidroxialquilo ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5'.
2. Utilização de um composto para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene alvo numa célula bacteriana, em que o composto é um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 15 desoxinucleótidos e não mais de 41 desoxinucleótidos, e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões, cada uma com pelo menos 7 desoxinucleótidos, que são idênticas, respetivamente, a pelo menos duas regiões do gene alvo, regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 14 nucleótidos de comprimento, e regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene alvo ou na sequência do oligodesoxinucleótido, ou ambas, e possuindo uma sequência diferente, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5', sendo o substituinte bloqueador a 5' um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetrassubstituida e substituída com N'-hidroxialquilo ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5'.
3. Utilização de um composto para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene alvo numa célula vegetal, em que o composto é um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3' e um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 21 desoxinucleótidos e não mais de 55 desoxinucleótidos; e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões, cada uma com pelo menos 8 desoxinucleótidos, que são idênticas, respetivamente, a pelo menos duas regiões do gene alvo, regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 20 nucleótidos de comprimento, e regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene alvo ou na sequência do oligodesoxinucleótido, ou ambas, e possuindo uma sequência diferente, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5', sendo o substituinte bloqueador a 5' um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetrassubstituida e substituída com N'-hidroxialquilo ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5'.
4. Utilização de qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o corante de indocarbocianina e o ligante ligado ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' , juntos, são uma N-hidoxipropil, Ν' -fosfatidilpropil-3,3,31,31-tetrametilindomonocarbocianina.
5. Utilização de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a ligação internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' e/ou ao nucleótido da extremidade 5' é uma ligação fosforotioato.
6. Utilização de qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o hidroxi 3' do nucleótido da extremidade 3' está ligado a um substituinte bloqueador a 3' .
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6 em que o substituinte bloqueador a 3' é um nucleótido bloqueador que está ligado em 3-3' ao hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3' .
8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o nucleótido bloqueador que está ligado em 3'-3' ao hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3' é desoxicitidina ou timidina.
9. Utilização de qualquer das reivindicações 1 a 8, em que a célula animal é selecionada do grupo que consiste em uma célula de mamífero, uma célula de ave, uma célula de inseto, uma célula de verme e uma célula de peixe.
10. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o gene alvo está num cromossoma artificial bacteriano.
11. Utilização in vitro de uma composição para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene cromossómico alvo de uma célula animal, a referida composição compreendendo: (a) um composto para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene cromossómico alvo de uma célula animal, em que o composto é um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 25 desoxinucleótidos e não mais de 65 desoxinucleótidos, e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões, cada uma com pelo menos 8 desoxinucleót idos, que são idênticas, respetivamente, a pelo menos duas regiões do gene cromossómico alvo, regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 24 nucleótidos de comprimento, e regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene cromossómico alvo ou na sequência do oligodesoxinucleótido, ou ambas, e possuindo uma sequência diferente, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5', sendo o substituinte bloqueador a 5' um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetrassubstituída e substituída com N'-hidroxialquilo ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5', e; (b) um transportador macromolecular selecionado do grupo que consiste em (i) uma vesícula lipídica de núcleo aquoso, em que o núcleo aquoso contém o oligodesoxinucleótido de cadeia simples, (ii) uma nanoesfera lipídica, que compreende um sal lipófilo do oligodesoxinucleótido de cadeia simples, e (iii) um policatião possuindo um peso molecular médio de entre 500 daltons e 1,3 Md em que o policatião forma um sal com o oligodesoxinucleótido de cadeia simples.
12. Utilização da reivindicação 11, em que o comprimento do oligodesoxinucleótido de cadeia simples é de pelo menos 31 desoxinucleótidos e não mais de 59 desoxinucleótidos.
13. Utilização da reivindicação 11, em que o transportador macromolecular compreende adicionalmente um ligando para um recetor internalizável da célula, ligando esse que está ligado à superfície do transportador macromolecular.
14. Utilização da reivindicação 13, em que o recetor é selecionado do grupo que consiste em, o recetor de asialoglicoproteínas, o recetor de transferrina, o recetor de ácido fólico e o recetor do fator de crescimento epidérmico.
15. Composição para utilização num método terapêutico para efetuar uma alteração genética predeterminada num gene cromossómico alvo num tecido, opcionalmente o fígado, de um indivíduo mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição, composição essa que compreende: (a) um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 25 desoxinucleótidos e não mais de 65 desoxinucleótidos, e possuindo uma sequência compreendendo pelo menos duas regiões, cada uma com pelo menos 8 desoxinucleótidos, que são idênticas, respetivamente, a pelo menos duas regiões do gene cromossómico alvo, regiões essas que, em conjunto, têm pelo menos 24 nucleótidos de comprimento, e regiões essas que estão separadas por pelo menos um nucleótido na sequência do gene cromossómico alvo ou na sequência do oligodesoxinucleótido, ou ambas, e possuindo uma sequência diferente, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5', sendo o substituinte bloqueador a 5' um corante de indocarbocianina 3,3,3' , 3'-tetrassubstituída e substituída com N'-hidroxialquilo ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5', e; (b) um transportador macromolecular selecionado do grupo que consiste em (i) uma vesícula lipídica de núcleo aquoso, em que o núcleo aquoso contém o oligodesoxinucleótido de cadeia simples, (ii) uma nanoesfera lipídica, que compreende um sal lipófilo do oligodesoxinucleótido de cadeia simples, e (iii) um policatião possuindo um peso molecular médio de entre 500 daltons e 1,3 Md em que o policatião forma um sal com o oligodesoxinucleótido de cadeia simples. Lisboa, 2015-08-05