CZ20003441A3 - Vektory pro přenos nukleových kyselin, přípravky, které je obsahují a jejich použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nových vektorů a jejich použití pro přenos nukleových kyselin. Zejména se týká nových vektorů schopných směrovat přenos nukleových kyselin do specifických buněk nebo buněčných kompartmentů.

Description

Oblast techniky ,

Předkládaný vynález se týká nových vektorů a jejich použití k přenosu nukleových kyselin. Konkrétně se vynález týká nových vektorů, které jsou schopné cíleně přenášet nukleovou kyselinu do určitých buněk nebo specifických buněčných kompartmentů.

Dosavadní stav techniky . Přenos nukleových kyselin představuje základ pro všechny biotechnologické aplikace, a tedy zvýšení účinnosti přenosu nukleových kyselin představuje důležitý úkol při rozvoji těchto aplikací. Účinnost přenosu nukleových kyselin závisí na řadě faktorů, např. na. schopnosti nukleových kyselin procházet pTazmatickou membránou a schopnosti transportu uvnitř· buňky až k buněčnému jádru.

Jednou z hlavních překážek účinného přenosu nukleových kyselin je skutečnost, že genetická informace je obvykle Špatně specificky směrována do cílového orgánů, pro který je zamýšlena, a nebo není směrována vůbec. Avšak jakmile se nukleová kyselina dostane do vnitřku buňky, musí , být směrována do. jádra,' aby tam mohla být exprimována. Kromě toho, v případě přenosu nukleových kyselin do diferencované nebo klidové buňky, jádro je ohraničenu jaderným obalem, který představuje další překážku v přenosu nukleových kyselin.

• ·

, Rekombinantní viry užívané jako vektory mají složité •a účinné .mechanismy pro zavedení nuklěové kyseliny do jádra. Avšak virové-'vektory mají také určité nevýhody- vyplývající z jejich' virové- podstaty, které naneštěstí nelze·' snadno eliminovat. ' Jiná strategie spočívá v užívání . v přenosu samotné nahé DNA a nebo v užití nevirových činidel, která jsou. schopna usnadňovat: přenos nukleových kyselin do eukaryotických buněk.’ Avšak tyto nevirové vektory neobsahují žádný, signál- pro . .nasměrování ' nuklěové ' kyseliny do subcelulárního .kompartmerttu -nebo jádra. Tudíž'- přenos nahé DNA, nebo -DNA.v kombinaci S- nevirovým činidlem, z cytoplazmy do.· jádra,, je proces probíhající s velmi malou účinností (Zabr.er et al., 1995).. '

Byly již učiněny mnohé pokusy o připojení nějakého' směrovacího (targeting) signálu. ' Zejména peptidové -fragmenty -prosměrování -byly -kovalentně - navázány.- naoligonukleotidy -při ' směrovací strategii užívající antisense-oiigonucleotidy - [Eritja et al., Synthesis of -defined_speptide-oligonucleptide. hybrids containing a hučlear transport, signál sequence, ' Tetrahedron·, Vol. 47, No. 24, pp / 41.13-4120, 1991]. Takto vytvořené komplexy byly. dobrými kandidáty na- potenciální-. inhibitory exprese endogenních genů.

Transfekční vektory obsahující syntetické polypeptidy navázané elektrostatickými interakcemi ^: na. sekvence. DNA byly popsány v patentové přihlášce '- WG 95/31557, kde'- tyto polypeptidy obsahovaly,. polymerní řetězec' bazických aminokyselin,- polypeptid NLS a kloubovou- oblast, která spojovala 'peptid - -.NLS-.-.—s-polymerním -řetězcem, a umožňovala zabránit nežádoucím sterickým interakcím...- Avšak tento' typ •konstruktu představoval problém z hlediska, stability,, neboť interakce vstupující do hry mezi DNA a směrovacím signálem byly elektrostatické povahy. • · (signální . sekvence· -pro lokalizační -signál)

Avšak, chiméry'obsahující'nukléovou· kyselinu a specifický směrovací- peptid existují -a byly popsány např. v patentové přihlášce WO 95/34664,· kde ' je vazba obou částí chemické povahy. Avšak způsob .přípravy těchto' chimér obsahuje zvláštní enzymatické kroky, které' , se jen obtížně řídí a které neumožňují vytvářet' velká množství takových nukleových kyselin.

A-nakonec bylo ukázáno, že je možné.navázat sekvenci NLS lokalizaci v jádře, ... jaderný k plazmidu ' . prostřednictvím cyklopropapyrroloindolu (viz NatUre Bio-technology, Vol. 16, pp. 80-85, January 1998). Avšak byla '.pozorována úplná inhibice' transkripce- požadovaného genu vzhledem- k náhodnému připojení několika set sekvencí NLŠ '’ k plazmidu-. ' Jedním řešením, které- navrhli sami autoři ' tohoto způsobu, .je navázání . sekvencí. -N-LS do -lineárních fragmentů DNA·- a '-pak' spojení. ' '. těchto .modifikovaných . fragmentů s jinými nemodifikovanými -fragmenty. ’ Avšak 'i tento způsob, stejně jako předchozí 'zmíněný,' má nevýhodu, že obsahuje přinejmenším jeden enzymatický krok. ‘ .

' Takže žádná z - doposud navrhovaných metod -neumožnila vyřešit ' uspokojivě potíže spojené se směrováním dvoj řetězcové DNA.- . ..

Podstata vynálezu-'Předkládaný vynález ..poskytuje výhodné, řešení 'popsaných problémů.

Konkrétně předkládaný vynález uziva oligonukleotidy, které jsou spojené se směrovacími signály a ktere jsou schopné, vytvářet trojitou šroubovici (triple helix, trpjšroubovice) s jednou nebo více specifickými • ·· O · ' · · · · · · ·· · · · · · · *, · · · « « « · · · 9 9 9 9 9 • ··· · ·- · ··· · 9 9 9 9 • · ··· ···· ···-«· '» · ·· · · · · sekvencemi - přítomnými v dvoj řetězcové (double helix) molekule DNA. . ' '

- ' - Takové vektory mají . výhodu, že jsou. schopné směrovat dvoj řetězcovou - DNA' do · buňky nebo specifického buněčného kompartméntu pomocí ' směrovacího, signálu, aniž by byla inhibóvána .exprese -genu. Původce předkládaného vynálezu skutečně ukázal, že vlivem vytvoření stálé místně- specifické ťrojšroubovice je nyní možné -navázat směrovací signál vně expresní kazety pro gen,, který má být’přenesen. Původce také’ ukázal, že genová exprese .v buňce není inhibóvána i přes'to, že dochází k chemické‘modifikaci DNA. Kromě toho- přítomnost trojšroubovice jako' prostředku' pro · navázání směrovacího, signálu- k DNA je -zvláště výhodná, neboť umožňujme zachovat velikost DNA, -která-je vhodná pro transfekci.

Získaný vektor má navíc výhodu, že obsahuje směrovací .signály, které- '.'jsou- velmi- stabilně .spojeny s dvojšroubovicovbu DNA, zejména když oligonuklečtid schopný vytvářet ' ťró'j šrouboví ci je modifikován' -přítomností alkylujícího cindla.

Další výhodou předkládaného vynálezu je to, že dovoluje spojit -DNA, která . má být- přenesena, .se směrovacími signály, jejichž povaha i -počet je řízena. Skutečně' je možné řídit počet ' směrovacích ' signálů dvojšroubovicové molekule DNA specifických sekvencí vhodných k vytvoření trojšroubovicové struktury v dané dvojŠroubovicové molekule DNA. Podobně je možné vnést do téže dvojšroubovicové molekuly DNA několik, oligonukleotidů spojených s /r-ůznými - směrovacími signály (intracelulárními a/nebo éxtracelulárními), a ,v tomto případě je také možné stanovit předem j ej ich. poměr. . Kromě toho .tyto různé směrovací signály mohou být připojeny k dvojšroubovicové molekule DNA. způsobem, který je více či každé počtu navázaných ke vložením vhodného méně' stabilní, a· sice v závislosti na tom, zda je (troj šrouboviče vytvořena. s kovalentními vazbami nebo bez nich (jinými slovy tedy s. použitím alkylujících činidel nebo bez).

A nakonec získaná funkcionalizovaná trojšroúbovice je výsledkem pouze kroků· -chemické 'přeměny,' lze- ji tudíž dosáhnout jednoduchým způsobem, reprodUkovatelně á ve velkém, tj.. průmyslově využitelném'množství .'

První předmět předkládaného vynálezu se proto' týká vektoru vhodného ' k transfekci', který je schopen směrování dospecifické buňky ' a/nebo specifického . buněčného kompartmentu... .Vektor · podle’ předkládaného '/vynálezu obsahuje dvo j šroubovicovou molekulu·. ..DNA , a alespoň jeden cligcnukieotid, který- je spojen se. směrovacím signálem .a.který je . schopen vytvořit trojšroubovicovou strukturu hybridizací se -specifickou sekvencí přítomnou v dané·' dvojšroubovicové molekule.DNA.

V popisu' vynálezu termín, dvoj šroubovicové DNA- zňamenádvojšroubovicovou nebolidvouřetězcovou.

deoxyribonukleotidovou - kyselinu, která pochází z člověka, zvířete, rostliny,, bakterie, viru apod.·. 'Lze ji získat .jakýmkoliv způsobem- ' odborníkovi známým, zejména .screeningem genové knihovny .a' chemickounebo enzymatickou syntézou sekvencí získaných scréeningem. Může být-' chemicky - nebo -enzymaticky modifikována.'. ’.

Tato dvojšroubovicová- DNA je v lineární nebo kruhové formě. Pokud.- je , v 'kruhové formě,_t ' je buďto v tzv. nádšroubovicovém .nebo relaxovaném stavu'; ·‘-Výhodně je molekula DNA v kruhové formě v nadšro.ubovicové konformaci. .

Dvojšroubovicová molekula DNA může · nést'· replikační počátek, který je funkční v cílové buňce,' jeden nebo několik' markerových genů, jednu nebo několik sekvencí, pro regulaci ttt • · transkripce nebo. replikace, terapeuticky významné, geny, antisense sekvence, které mohou, být .modifikovány, úseky pro vazbu k jiným buněčným složkám apod. Výhodně dvojšroubovicová DNA obsahuje expresní kazetu, složenou' z jednoho nebo několika, požadovaných genů, řízených' jedním nebo několika promotory, a terminátoru, .transkripce, které' jsou. aktivní v cílové.buňce.

V popisů vynálezu termín expresní . kazeta .požadovaného genu znamená fragment DNA., který může být. vložen do. vektoru ve specifických .restrikčních místech. Fragment DNA obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující RNA nebo' požadovaný polypeptid, a navíc sekvence potřebné, pro expresi (j,eden nebe několik enhancerů, promotorů, ·polyadenylační,sekvence apod.) požadované sekvence. 'Kazeta a- restrikční 'místa jsou navrženy tak,., aby . zajistily vložení expresní kazety do otevřeného čtecího rámce vhodného pro transkripci','a translaci.

Obecně se jedná o plazmid nebo epizom nesoucí jeden-nebo . I několik terapeuticky významných genů. Jako. příklad lze uvést plazmid .popsaný' v patentových -.přihláškách' WO 96/26270 a WO 97/10343, které' jsou 'formou odkazu, .součástí předkládané přihlášky. . · . .

-Terapeuticky významný gen je v předkládaném popisu zejména.' jakýkoliv gen, který- kóduje proteinový- produkt s terapeutickým uplatněním. Terapeutickýprodukt ,je zejména protein nebo - peptid. Takový proteinový produkt může být' homologní . vzhledem k cílové 'buňce (tj . jde o produkt, který ,je normálně v cílové buňce exprimován, pokud buňka není v patologickém stavu) . . V takovém -, případě -exprese· proteinu umožňuje zmírnit nedostatečnou expresi v buňce nebo expresi proteinu, který je neaktivní nebo slabě aktivní v důsledku modifikace, a nebo nadměrně exprimovat protein. Terapeuticky významný, gen může -kódovat mutantu buněčného ’ proteinu, která « · φ · φ · · » · · ·

- 7. má zvýšenou- Stabilitu, - modifikovanou aktivitu apod. Proteinový .produkt může být., také heterologní vzhledem, k cílové buňce. V-takovém- případě exprimovaný protein např. doplňuje nebo poskytuje., aktivitu, - která je v-'buňce nedostatečná .nebo. -chybí', -což dovoluje bojovat proti nemoci nebo- stimulovat .imunitní) reakci.. K terapeutickým produktům podle předkládaného -vynálezu patří zejména enzymy, krevní deriváty, hormony,, lymfokiny interleukiny, interf e.rony,

TNF, apod'.,

FR 92/03120) , růstové faktory, nervové- přenašeče nebo jejich prekurzory nebo enzymy, jejich -syntézy, trofické faktory (BDNF, CNTF, - NGF,. , IGF, GMF, _aFGF, pFGF, . NT3, ' NT5, HARP/p-leiotrof in . -apod.,· dystrofin nebo minidysťrofnn, viz FR 91/11947-),. geny kódující faktory ' podílející se na

'.koagulaci (faktory Vil, VIII,' IX), geny podílející se na - -opravách - .DNA,-' -vtzv. - .-•-sebevražedné ‘geny (thymidinkináza., cyto.si.ndeamináza) , gény pro hemoglobin nebo jiné proteinové

-přenašeče, ..geny' pro protein zúčastněné' v metabolismu lipidů, apolipoproteinů ze ' Skupiny A-l,· -A-IÍ, .A-IV, B, C-I, C-II,· C-III, D, - E, F, G, H,- J a apo(a), metabolické enzymy jako např. lipoprotienlipáza, jaterní lipáza, lecitin:cholesterol ..acyltransf eráza, - . 7-alfa cholesterolhydroxyláza, kyselá fosfatáza, -proteiny přenosu - lipidů jako např. protein pr-o přenos esterů cholesterolu a fosfolipidů, HDL-vazebný protein nebo recéptor vybraný ze skupiny obsahující . LDL receptory, zbytkové, chilortiikronové receptory, scavenger .receptory apod.

DNA s terapeutickým významem- může být také ' gen.- nebo ' antisense sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožní kontrolovat expresi buněčných genů nebo transkripci buněčných mRNA. Také sekvence jsou v. cílové buňce např.- přepisovány do . RNA, která' je komplementární- k buněčné mRNA, a tím blokují

VIZ napr.

• · • · • · • · transkripci příslušného, -genu do proteinu, jak bylo např. popsáno v EP 140 308. K terapeutickým genů patří také sekvence 'kódujíc ^; ribozymy, které jsou schopné, selektivně ničit- cílovou· RNA. (viz' EP . 321 201), nebo ' sekvence jednořetezcové vnitrobuněčné protilátky’ jako’např.· ScEv-.

- ' ’ Jak bylo již uvedeno výše, deoxyribonukleová kyselina může obsahovat jeden nebo -několik genů kódující antigenní peptid,, který je schopen vyvolat imunitní reakci u člověka nebo zvířete· V takovém specifickém provedení předkládaný vynález umožňuje produkci vakcín nebo provádění imunoterapie u lidí nebo' zvířat,- zejména namířené 'proti mikroorganismům,virům nebo- proti . rakovině. Jde zejména- o antigenní peptidy proti viru Epstein-Barrové, viru HIV, viru hepatitidy B (viz EP 185 573), viru pseudorabies, .viru tvořícího- syncytia, viru chřipky, cytomegaloviru (CMV). a. dalším- -virům, - a' nebo specifický .-proti nádorům (viz-EP 259 212) . .....-. .

.f ... -

Výhodně. deoxyribonukleová ’ kyselina obsahuje také ^sekvence' umožňující expresi terapeutického, genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid, v požadované buňce nebo orgánu. Jsou to sekvence, které jsou přirozeně zodpovědně za expresi uvažovaného genu, pokud, jsou tyto sekvence schopné funkce v infikované cílové ' buňce.' Mohou to být i sekvence pocházející z-rostlin (zodpovědné za expresi jiných proteinů) nebo syntetické sekvence, zejména to mohou být promotorové sekvence' pocházející Z virových nebo eukar.yótických genů. např. promotorové sekvence pocházející . Z -genomu buňky, která má být -infikována. Podobňě to mohou být promotorové sekvence .pocházející z genomu viru. Jako-příklady lze. Zmínit promotory, genů z E1A, MLP, CNV, RSV apod.' kromě -toho'.expresní sekvence mohou být modifikovány přidáním aktivačních nebo regulačních sekvencí apod. Promotor může být navíc indukovatelný nebo reprimóvatelný. ' • tf · ' · • tftf * • tftf · • · · · tftf ··

Trojšroubovice odpovídá navázání oligonukleotidu, který může být modifikován, na dvoj šroubovícovu DNA tzv. Hoogsteen vodíkovvými vazbami . mezi bázemi třetího vlákna a bázemi dvojšroubovice. K tomuto párování dochází.ve velkém zářezu dvojšroubovice a je. specifické pro uvažované sekvence [Frank-Kamenetski,- M.Ď., Triplex DNA Structuřes, Ann. Řev.· Biochem.., 1995, 64, pp 65-95]. Specifické sekvence ve formě dvojšroubovice jsou zejména sekvence homopurin-homopyrimidin. Rozlišují se tři kategorie 'trojšroubovicové struktury' na 'základě povahy, baží třetího vlákna [Sun, J.· and C. Hélěne, Oligonucleoťidé-directed triple-helix ,formation, Curr. Opin.' .Struct.. Biol.., 1993, 3, pp. 345-356]: purinové báze umožňují získat C-G’G a Τ-Α.Ά páry,- pyrimidinové nbaze umožňují získat C-G'G* a T-A’T páry, přičemž symbol* odpovídá 'párováni s třetím řetězcem.

, Takové struktury ‘ byly - cha-rakte-rizovány zfyziklněchemického.'hlediska četnými studiemi /' NMR . (nukleární magnetická rezonance)., hybridi zační.ch teplot a nukl.eázové ochrany, \ které' umožnily definovat. . jejich vlastnosti, a podmínky jejich stability. Ve trojšroubóvici s třetím purinovým řetězcem . je tento' řetězec . antiparalelní,

k.purinovému řetězci DNA. a vytvoření trojšroubovic závisí významně na koncentraci divalentních iontů:· ionty jako Mg²⁺ ^stabilizují strúkturú vytvářenou třetím řetězcem. Ve trojšroubovici třetím homopyrimidinovým řetězcem' je tento paralelní s purinovým řetězcem a -vytváření trojšroubovice je významně, závislé .na.' pH: kyselé pH nižší '.než ' 6 umožňuje protonaci .cytosinů a vytvoření- dodatečných vodíkových vazeb stabilizujících triplet C-G*C⁺. . Také existují smíšené troj šroubovice,. kde třetí .řetězec obsahuje purinové i pyrimidinové baze.. Vtakovém případě pak orientace třetího řetězce závisí na «sekvenci homopurinového.úseku.

• '· 9 9

- 10 Oligonukleotidy použité, v předkládaném vynálezu jsou takové · - oligonukleotidy, které hybřidizují přímo

DNA.

který

Tyto oligonukleotidy obsahují .je. schopen-' vytvářet DNA (Rajagopal triplety et al., s dvojšroubovicovou následující baze:

thymidin (T) , s dublety .A.T dvoj.šroubovicové

Biochem 28 (.1989) 7859)·, ' ader.in (A), který je schopen vytvářet triplety s dublety A.T. dvoj šroubovicové DNA, . _; guánin (G) , který je’ schopen vytvářet triplety s dublety

G.C dvojšroubovicové DNA, protonovaný cytosin (C⁺) ,- který, je schopen vytvářet triplety, s dublety G.C dvojšroubovicové DNA (Rajagopal et,. al., viz výše), ' uráčil- (U) , který je’ schopen vytvářet triplety s dublety

A.U nebo A.T.- ” ; - , - * Aby bylo možné vytvářet troj šroubovicl' hybridizací, je důležité,. aby oligonukleotid a 'specifická 'sekvence- přítomná y DNA byly komplementární.. Aby se získalo co' nej lepší připojení a . nej lepší ' selektivita,-- ve vektoru' podle předkládaného- vynálezu se užívají oligonukleotid a.- specifická sekvence, - které jsou -perfektně komplementární. Může to, být zejména -oligonukleotid poiy-CTT a -specifická sekvence poíy-GAA. Jako- přiklad lze uvést oligonukleotid, ktrerý má sekvenci (sekvence ,id. č. 1) : ,

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’ (GAGG(CTT)-_t kde baze GAGG netvoří trojšroubovicl, ale umožňují separovat oligonukleotid- od, . spojovacího ' ramínka. 'Lze' -také zmínit sekvenci (CTT)₇ (sekvence id. č. 2).. Tyto oligonukleotidy jsou schopny vytvářet trojšroubóvici se specifickou sekvencí, obsahující komplementární jednotky (GAA). Zejména to můhou být úseky Obsahující 7, 14 nebo 17 GAA jednotek. Další

9 9 • 9 9

999 • · ii- zajímavou specifickou sekvencí je. sekvence. .. idi č. 3 :, 5 '-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA^-3 ' . Tato sekvence vytváří trojšrouboviči s oligonukleotidy 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3^r (sekvence id. č. 4) nebo 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (sekvence id. č. 5). ¹

V takovém . případě .se ol.igonuklěotid. váže v orientaci, která je antíparalelní k polypurinovému řetězci. Takové trojšroúboviče. jsou nestálé v přítomnosti: MgCl?·, jak bylo již zmíněno (Vasquez. et ál. ,· Biochemistry, 1995, 34, 7243-7.251;

Beal- a Dervan, Science/ 1991', 2.51, Λ360-1363) .

'Specifickou sekvenci je. sekvence,.- která se přirozeněvyskytuje v dvojšroubovicové -DNA, nebo syntetická sekvence nebo sekvence .přírodního původu do ní uměle vložená. Jezvláště výhodné použít oligonukleotidy 'schopné vytvářet, troj šrouboviči. se sekvencí,' která se .přirozeně vyskytuje v molekule dvoj šrouboví dové DNA, _ Askutečně . '.to ·. umožňuj e . získat vektory, podle .- -předkládaného .vynálezu užitím nemodifikovaných . pl a zmidů, zvláště' komerčně . dostupných např. plažmidů typu pUC, pBR322, pSV apod, K přirozeným' sekvencím homopurin-homppyrimidin vyskytujícím se ' v dvojsroubovicové .DNA patří sekvence obsahující celou nebo část sekvence id. č-. '6: . 5' -CT.TCCCGAAGGGAGAAAGG-3' , přítomné'· v replikačním.

počátku. CplEl z p. coli. V tomto případě oligonukleotid vytvářející, troj šrouboviči. má sekvenci, (sekvence id. č. 7):/ 5’-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' a váže se alternativně k oběma řetězcům dvojšroubovice, jak popsali Beal a Dervan (J. Am. Chem.. Soc. 1992, 114,- 4976-4932) nebo -Jaya-sena' a Johnston • (Nucleic Áčids·, Res. 1992,-....-..2 0, 5279-5288) . Lze také .zmínit sekvenci id.'č. 3: 5 ' -GAÁAAAGGAAGAG-3'' z β-laktamázového genu z. piazmidu pBR3.22 (Duval-Valentin et al., Rroc. Nati. Acad. Sci. USA,. 1922, .- 89, ,504-508). Další sekvencí je sekvence

AÁGAAAAAAAAGAA (sekvence id. , č. ,9) přítomná v replikačním ·· ·· ··

I · · · · ·

I · · · · ♦ ··· · · · · · • 9 · · ·

99 ··

- 12 počátku γ. plazmidů ’ s podmíněným replikačním počátkem jako je pCOR.

I když výhodné, s.ekvence' jsou perfektně komplementární sekvence, je·však'jasné, že.určité neshody mezi sekvencí DNA .a- sekvencí oligonukleotidu .mohou být -tolerovány, pokud nevedou k · nadměrné . ztrátě afinity. Lze zmíni-t - sekvenci id. č. 10: 5' -ÁAAAAAGG'GAÁTAAGGG-3 ^r přítomnou v genu β-laktamázy

£. coli·. V takovém případě přerušení polypurinové sekvence thýminem může, být rozpoznáno guaňinem ve třetím řetězci, 'čímž se-vytvoří triplet AT'G, který je stabilní, pokud je obklopen dvěma triplety TAT (Kiessling et al.,' . Biochemistry, 1992, 31, 2829-2334) .

Použité oligonukleotidy mohou být -přírodní, , složené s přírodních.· baží , které nej sou modifikovány· nebo které jsou modifkovány chemicky. Výhodné jsou · zejména oligonukleotidy

-s -určitými '· -'chemickými '·,modifikacemi, který zvyšuji jejich.

rezistenci k- nukleězám, nebo afinitu vzhledem ke specifické sekvenci nebo které přinášejí další specifické vlastnosti (J.Goodchild, ' Conjugates of Oligonucleotides and .Modified Oligonucieotide.s: A..Review of th.eir Synthesis; and Properties, Bioconjugate Chemistry, Vol.-1 No, 3, 1990, pp. 165-187).

Termín ' oligonukleotidy podle předkládaného . vynálezu označuje ’ -také- 'jakoukoliv sekvenci nukleosidů, ' kde· byla .1 . '' ' ‘ _ modifikována jejich -kostra. K takovým . možným modifikacím p,atří fosforothíoátové oligonukleotidy, které jsou schopné vytvářet troj šroub.ovici' s DNA (Xodo et al., Nucleic A.cids Res., 1994, 22, 3322-3330), oligonukleotidy . mající formacetálovóu nebo metylfosfonátOvou.-.kostru .-(Matteucci et' al., J. Am. _:Chem.. Soc.', 1991, 113, 7766-7768)': Je také možné užít oligonukleotidy syntetizované s _a-anomery nukleotidů, které také vytvářejí trojšroubovici . s DNA (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, -7749-7760.) . Jinou' modifikací • 4 4 4 · · · ·' ♦ · • · *·· • 4 .4 • · 44

99 ► · 4 « >44 <

> 4 4 <

»44 4

4 4 4

- 13 páteře je .fosforamiditová., vazba. Lze třeba zmínit intérnUkleotidovou fosformaidátovou vazbu N3'-P5',. kterou popsali Gryaznov a Chen (J. Ám. Chem. Soc., 1994, 116, 3.1433144),· která, poskytuje oligonukleotidy vytvářející zvláště stabilní 'trojšroubovici š DNA. K.dalším modifikacím páteře, které. lže ’ zmínit, patří. . použití ribonukleotidů,

2'-O-metylribózy, fosfotriesterů apod, (Sun and Hélěne, Curr. Opinion Struct. Biol.,· 116, 3143-31,44) . Kostra obsahující fosfor může být také nahrazena' polyamidovou pateří, jak je tomu u PNA (peptidová nuk-leová kyselina), která také' může wtvářet troj šroubovici (Nielson et al. / Science, 1991, 2.54, ' ! 1497-1500; Kim et al., J. Am Chem. Soc,,. 1993, 115, .64776-481)· nebo. kostru' založenou na .guanidinu, . jak je tomu u DNG (deoxyribunkleotid-guanin, Proč. Nati. 'Acad.. -Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101) , polykationtového. analogu DNA,, -který také vytváří trojšroubcvice. ...

Thymin třetího řetězce může' být ' nahrazen také' 5-bromouracilem, který zvyšuje áfinitu olígonukleotidu k DNA (Póvsic and Dervan, L. Am. Chem. Soc., 1989, lil, 3059-3061). Třetí·, řetězec může také obsahovat baze, které 'se přirozeně' nevyskytují, jako je např. 7-deaza-2'-deox.yxanthosiň (Milligan et al., Nucleic Acidš Res., 1993, 21,- 327-333), 1(2-deoxy-p-D-ribofuranosyl)— 3-methyl-5-amino-Itf-pyrazólo[4,3d]pyrimidin-7-on (Kóh .a Dervan, J. Am. Chem.. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxo.adeniri, 2-aminopurin, ' 2'-Omet.hylpseudoisocytidin, nebo jiné modifikace, které jsou odborníkům .známy .(viz.- přehled “Sun., a Hélěne, Curr. Opinion Struct. Biol. , 1993, _3, 345-356) . .

Cílem dalšch typů modifikací oligonukleotidů je. zejména zlepšit interakci a/nebo afinitu mezi oligonukleotidem a specifickou sekvencí. Zvláště výhodná modifikace spočívá, v navázaní alkylujícího činidla na oligonukleotid. Navázání • · ·· • · · · · • ' ' · · « · • · · · • · · · · · · · • · · · ·· ·· . může ' nastat chemickou- cestou nebo, fotochemickou prostřednictvím .fotoreaktivní' funkční skupiný. Výhodná alkylující činidla jsou zejména fotoaktivovat-eíná alkylující činidla, jako jsou např. psoráleny. Působením světla vytvářejí kovalentní · vazby v DNA' na- úrovni pyrimidinových baží.. Když jsou takové molekuly, vmezeřeny (interkalovány) na úrovni- sekvencí .5’-ApT-3’ nebo 5’-TpA-3' ve fragmentu dvo j šroubovicové. DNA, vytvářejí vazby s oběma řetězci. Tato světlem indukovaná vazebná' reakce se může uskutečnit_ ve.

specifickém místě plazmidu.

Jak bylo - již uvedeno výše, . jednou z .výhod předkládaného'vynálezu je .možnost vytvářet velmi' stabilní a místně . specifické trojšroubovice mezi oligonukleotidem a specifickou sekvencí v molekule dvojšroubovicové DNA , prostřednictvím kovalentních vazeb vytvořených pomocí alkyluj ícího činidla.· ' Délka oligonukleotidu^: použitéhove-vynálezu je alespoň 3 báze, výhodně '5 ^: až 30 bázi. Výhodnější je - užití, oligonukleotidu s délkou 10 až ‘30 baží. Délka může být případ od případu upravena odborníkem v závislosti na požadované selektivitě a stabilitě interakce. '

Oligoňukleotidy; podle - předkládaného : vynálezu lze syntetizovat jakoukoliv odborníkovi’známou technikou. zejména' 'mohou být připraveny-užitím syntětizátorů nukleových- kyselin. Ale zjevně může být užita jakákoliv jiná. odborníkovi známá ' metoda. · ·.;

' Termín směrovací , signál' v popisu předkládaného

Vynálezu znamená směrovací molekuly různé povahy. Ve. většině případů se .jedná o peptidy známé pro směrování.· -Ty se mohou užít pro interakci se složkami, extracelulární matrix, s receptory -plazmatické membrány, . ke směrování do. íntarcelulárního kompartmentu nebo ke zlepšení . toku DNA při .nevirovém přenesu DNA při; genové terapii.

• · 99 . « » · β · · » · β · · » · ··· · 9 • ·· '99

- 15 Κ těmto, '.směrovacím signálům patří ' např.. růstové faktory (EGF, PDGF, TGFp, NGF, IGF, I, FGF), cytokiny (IL-1, ,· IL-2, TNF, Interferon,' CSF),' . hormony . (insulin, růstový hormon, prolaktin., glukagon,'hormony štítné žlázy, steroidní hormony), - cukry ' rozpoznávající lektiny, .imunoglóbuliny, ScFv', transferin, lipoproteiny,; .vitaminy jako' je vitamin 312, peptidové nebo neuropeptidové .' hormony (tachykininy, neuřotensin, VIP, endotelin, CGRP, CCK), nebo jakákoliv jednotka rozpoznávaná integriny, např. peptid RGD, nebo jinými vnitřními proteiny buněčné membrány. v

Je možné také ' užít celé proteiny, nebo peptidové, sekv.ence z těchto. proteinů, · nebo alternativně .peptidy, .které . se -váží na jejich, receptory,- a které' lze získat technikou expozice fagů-nebo kombinační, syntézou. '

Lze- také užít .' intercelulární směrovací . ,'signálý. Bylo ' identifikováno mnoho ·· jadernýeh lokaliz-ačníc-h- .s-ekvencí (NLS) různorodého aminokyselinového složení, což dovoluje pro jaderný transport proteinů nebo nukleových kyselin užít různé proteiny. Patří sem zejména-krátké' sekvence (NLS z T_; .antigenu SV40, sekvence id.-č. 11: PKKKRKV), bipartitní sekvence (NLS . nuk.leopl a zrninu obsahující dvě- esenciální domény pro jaderný transport,, .'sekvence·' id.' č. 12: KRPAATKKAGQAKKKKLDK) nebo sekvence M9- proteinu ' -hnŘNPAl (sekvence' id. č. 13:' NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY).- 'Proteiny' nesoucí tyto specifické sekvence se váží na specifické receptory, jako jsou např. -receptory -rodiny importinu nebo karyoferinu. Úkolem, těchto sekvencí je směrovat DNA dovnitř jádra, kde je

.....pak okamžitě přístupná transkripčnímu apařátu- a může' být.

exprimována. '

Smíšený síměrovaci .signál, tj . - směrovací signál, vhodný jak pro intracelulární tak i extracelulární směrování, je také zahrnut v předkládaném vynálezu. Jako příklad lze uvést • ·

··· · · • · · · cukry,· které' zaměřují lektiny přítomné na buněčné· membráně, ale také v .jaderných pórech. Směrování pomocí takových cukrů se tedy týká' jak- extrcelulárníh.o směrování tak i jaderného importu. , ‘

Další signály se účastní ^; mitochodnriálního směrování (např. N-koncová část ornitintranskarbamylázy (ÓTC) , která dovoluje' /zaměření mitochodrie) - nebo ' směrování do endoplazmatického retikula. A nakonec některé · signály umožňuj.í zadržení, v jádře' nebo na 'úrovni endoplazmatického retikula (jako např. sekvence KDEL·)'.

Výhodně, směrovcí signály podle předkládaného vynálezu umožňují směrovat' dvojšroubovicovou DNA do určitých buněk n.ebo buněčných kompartmentů. Např. směrovací signály podle předkládaného vynálezu zaměřuji receptory nebo ligandy na buněčném povrchu, zejména receptory pro inzulín,·transferrin, -.kyselinu, listovou nebo jakýkoliv* růstový faktor, ·'citokiny,. vitaminyj .nebo zejména polysacharidy-na buněčném povrchu nebo do sousedství extracelulární matrix. 1' ' - .

Syntéza chimér oligonukleotid-směrovací .signál probíhá na pevné fázi nebo v roztoku, a bere' do úvahy velmi odlišné stab.ilitní vlastnosti- oligonukleotidů a směrovacích signálů (Erijita, R. et al.., Synthesis of 'defined 'peptideoligonucleotide hybrids containing á nuclear transport signál sequence', Tetráhedron,. 1991, .47 (24), pp.' 4113-4120].

- V roztoku .může docházet k. navázání v jednom kroku: směrovací signál se např. syntetizuje se skupinou nesoucí disulfidovou, .maleimidovou, aminovou, 'karboxylovou,: esterovou, epoxidovou, kýanbrpmidovou nebo aldehydovou funkční skupinu,- a spojuje se s oligonukleotidem modifikovaným thiolovou, aminovou nebo karboxylovou koncovou skupinou v poloze. 5'nebo 3' . Takovým spojením vznikne,disulfidická, thioéterová,. esterová, amidová nebo ' aminová vazba mezi oligonukleotidem a směrovacím

99

9 ·

9 9

9 9

9 9

99

99

9 9

9

999 9 9 signálem. Jakýkoliv jiný způsob, který je odborníkovi znám, může. být použit, např. bifunkční. konjugační činidla.

Dalši předmět předkládaného vynálezu se týká přípravků, které obsahují vektor 'définovaný výše.

.Výhodně se vektory podle předkládaného vynálezu mohou kombinovat ,s jedním nebo_; více známými činidly pro 'transřekci DNA. Jako příklad lze uvést kationtové lipidy,. které mají výhodné vlastnosti.. Tyto vektory se skládají z kationtové polární části,-' která interaguje' sDNA, a hydrofobní lipidové část.i, která usnadňuje, proniknutí do buňky a. činí iontovou· interakci 's DNA necitlivou k vnějšímu médiu. ..Specifickým příkladem jsou monokationtové - lipidy' (DÓTMA: Lipofectin?), některé kationtové detergenty(DDÁB), lipopolyaminy a zejména dioktadecylamidoglycylspermin ; (DOGS) nebo 5-karboxyspermylamid ' ,palmitoylfosfatidylěthanolaminu (DPPES), jejichž

•.příprava... byl a popsána, např. v .patentové přihlášce .EP., 394 111... Jiná výhodná. · lipopolyaminová .rodina‘ byla popsána -v.patentové přihlášce . WO .97/18185,' která - je formou odkazu součástí předkládané přihlášky. -Byly vyvinuty. , četné další kationtové lipidy a mohou ' se -užít s vektory podle předkládaného vynálezu, .Ze známých -syntetických. transfekčních činidel jsou také výhodné kationtové' polymery polylysinu · a typu D.EAE-dextranu. Je možné použít také polyetyleniminové (.PEI) a. .polypropyleniminové (PPI) polymery, které jsou komerčně dostupné a lze. je připravit způsoby podle'· , vynálezu popsaného v patentové přihlášce WO 96/02655. . ..

Obecně.....lze jakékoliv' syntetické, transfekční činidlo .odborníkovi' známé kombinovat s vektory podle předkládaného vynálezu..

Přípravky podle vynálezu navíc mohou obsahovat adjuvans schopné kombinace - s' komplexem vektoru .podle : vynálezu

ΦΦ ΦΦ φ φ · « φ ΦΦ <

φ φ φ « • φ · I

ΦΦ ΦΦ ΦΦ «· ΦΦ

I · Φ φ » · · · » φ ··· » φ • φ ·φ· ··

- 13 s trans f-ekčním činidlem, které 'ještě zlepšuje jeho -..transfekční účinnost. V jiném . provedení se překládaný vynalez .týká · přípravků'· . obsahujících vektor podle předkládaného' vynálezu, 'jedno nebo více transfekčních činidel 'definovaných výše a j.ednoho nebo několika adjuvans .schopných kombinace s komplexu .vektoru podle vynálezů s jedním nebo několika .transfekčními činidly. Přítomnost' takového adjuvans (např. lipidů, peptidů nebo proteinů) může .výhodně umožnit zvýšení transfekční účinnosti .přípravku.

Přípravky podle · předkládaného vynálezu mohou ' jako adjuvans-. obsahovat jeden' nebo několik neutrálních· lipidů, jejichž použití je zvláště- výhodné. Původce skutečně'ukázal, že- ' . přídavek', neutrálních ' -lipidů zvyšuje - vytváření ríukleolipidových'částic- a zlepšuj e . penetraci částic -do buněk tím,· že destabilizuje' jejich membrány-.

'Výhodněji·', '-neutrální lipidy , použité ’. v .předkládaném -vynálezu jsou lipidy obsahující -2 mastné řetězce. Zvláště výhodné' je užití přírodních nebo 'syntetických lipidů, které mají zwitteriontovou. .povahu nebo za- fyziologických podmínek postrádají iontový náboj . K těmto lipidům-' patří zejména dioléoylfosfatldylethanolamin . (DOPE), , ' oleoylpalmitoyl. fosf atidyl.ethano lamin- (POPE), mirystoylfosfátidy1ethanolaminy, které jsou '1 až 3x N-metylovány, - a, dále' fosfatidylglycerol.y, diacylglyceróly, glykosyldiacylglyceroly,. cerebrosidy' (jako jsou ,zejména galaktocerebrosidy), ' sfingolipidv (jako jsou zejména sfingomyeliny) ' nebo ásialoga-nglipsidy (jako jsou zejména as-ialoGMl a GM2)'.

Tyto různé lipidy, mohou být získány buďto syntézou- nebo izolací z orgánů (např. z mozku) nebo z vajíček, -a sice metodami, 'které' jsou „ odborníkům známy. Konkrétně např. extrakce neutrálních lipidů může být provedena např. pomocí

- di-stearoy.l, -palmitoyl, a- také' jejich deriváty,

organických. rozpouštědel '(viz např.- Lehninger,. Biochemistry).

Původce také ukázal, že bylo zvláště výhodné použít jako adjuvans sloučeniny přímo či nepřímo, se účastnící' kondenzace .DNA . (viz WO 96/25508). Přítomnost. . takových sloučenin v přípravku .podle' předkládaného -vynálezu .umožňuje snížit množství transfekční sloučeniny, což má 'prospěšné důsledky z.toxikologického hlediska, aniž by to mělo jakékoliv nežádoucí účinky z hlediska transfekční účinnosti. Sloučenina účastnící se kondenzace nukieové - kyseliny je taková sloučenina,, která- přímo či. nepřímo DNA kondenzuje, tj'. činí ji kompaktní. Tato 'sloučenina působí buďto .přímo na úrovni /DNA, která -má být transfekována, nebo se podílí na úrovni dalších sloučenin, které se přímo účastní kondenzace nukíeových kysel-in. Výhodně- působí přímo na- úřovni DNA. Toto činidlo, -které se účastní kondenzace DNA, může.být jakýkoliv -pol.ykationt, 'např.- -po-l-y lysin.·. Ve .výhodném provedení vynálezu je tímto činidlem jakákoliv sloučenina, která je odvozena, zcela nebo částečně, z- histonu, nukleolinu,.' protaminu a/nebo jejich derivátů, peptidových jednotek (KŤPKKAKKP) a/nebo' (ATPAKKAA),jejichž počet je 2 až 10. Ve struktuře sloučeniny podle- vynálezů'· se tyto. jednotky mohou opakovat nepřerušené za sebou»-. nebo jinak. Mohou, být odděleny spojkami .'biochemické povahy, např. jednou'' nebo několika ' aminokyselinami, 'nebo chemické povahy.

Předmětem předkládaného.vynálezu je také použití vektorů podle vynálezu pro výrobu léku určeného - k. léčení nemocí tím, že se transfekuje DNA do primárních buněk nebo do trvalých buněčných linií-. tyto buňky jsou.fibroblasty, svalové buňky, nervové, buňky (neurony, astrocyty, gliové buňky), jaterní buňky,. buňky hematopoetické řady - (lymfocytý, CD34, dendritické. buňky apod.),epitelové buňky apod., a sice v diferencované nebo plúripotentní formě '(prekurzory) .

• · • ·

- 20 Vektory podle předkládaného vynálezu se mohou užít pro in vitro, ex vivo nebo in vivo transfekci \ DNA kódující proteiny nebo. , polypeptidy, což je zde uvedeno formou 'ilustrace ' - - .

, . Pro použití in vitrof' 'ať. již pro terapii nebo pro studium regulace genů.nebo vytváření zvířecích modelů nemocí, přípravky podle předkládaného vynálezu jsou formulovány pro. topické, kutánní, perorální, rektální., . vaginální, parenterální, - intranasální, , intravenózní, intramuskulární, .

subkutánní, intráokulární, . ťránsdermální, intratracheální nebo’- intraperitoneální podávání.. Výhodně-· přípravek .podle předkládaného- . vynálezu, obsahuje vehikulum, které ' je farmaceuticky přijatelné pro ihjikovátělně 'přípravky, .zejména . pro přímou injekci do požadovaného, orgánu, nebo pro topické podávání (na kůži a/nebo na sliznici) .· Takovým vehikulem'jsou '-..zejména iš.otonické -.sterilní -ro-z-toký.. -Nebo.se- jedná o suché, zejména lyofilizované přípravky, které . v závislosti na případu buďto vody nebo roztoku.,, umožní .rekonstituovat injikovatelný roztok. Dávky nuklěové kyseliny- použité pro.-injekce stejně, jako' jejich, počet- se upraví v závislosti na různých parametrech, zejména podle způsobu podávání', relevantní nemoci, genu, který se má exprimovat, ' nebo . požadované doby- léčení. Pokud - se týká způsobu podávání, jedná se buďto o přímé injekce do tkání nebo do krevního oběhu, a nebo. se ošetří buňky v buněčně kultuře a- pak se reimplantují in- vivo injekcí ' nebo-transplantací. ... , :

Předkládaný - vynález se .kromě toho týká i způsobu transfekce DNA do buněk, který obsahuje následující kroky: ..

1) syntéza chiméry oligonukleotid-směrovcí signál způsobem

-popsaným výše,. . .

2) přivedení chiméry syntetizované v 1) do kontaktu pq přidání, fyziologického • · • ·

s dvoj šroubovícovou DNA, aby se vytvořila' tro j šroubovice,

3) případě, vytvoření komplexu vektoru získaného v 2) s jedním nebo' . několika, transfekčními činidly a/nebo jedním nebo několika adjuvans, a

	-4) přivedení buněk- do kontaktu s nebo, pokud je to vhodné,· ve 3) .	komplexem vytvořeným	ve	2)
	Buňky se přivedou do kontaktu s komplexem , tak	, že	se
	buňky inkubují s komplexem- (pro	použití in vitro	nebo	ex
	vivo) neboj se- komplex 'injikuje	do - organismu (pro	použití
'	in vi vo) - . ' ' . ,t,
	. Předkládaný vynález tudíž	poskytuje ' zvláště	výhodný

způsob ' pro léčeni nemocí - podáváním vektor . podle vynálezu, který obsahuje- nukleovou kyselinu, která je schopná' léčit

X nemoc. Zvláště- je táto 'metoda vhodná na nemoci, které jsou .'důsledkem nedostatku , proteinové nebo peptidového produktu, přičemž^ podávaná DNA. kóduje - daný -protein -nebo peptid. Předkládaný vynález zahrnuje i ' jakékoliv použití vektoru podle vynálezu při in vivo, ex vivo nebo- in vitro transfekci buněk. '

Předkládaný vynález se týká také rekombinantních buněk obsahující-· vektor ·, popsaný ' výše. ,. Jde výhodně, zejména o- eukaryotické buňky, např. kvasinky, zvířecí buňky' apod·. Tyto buňky se získají' jakýmkoliv odborníkovi známým’ způsobem, který umožňuje vnesení DNA do buněk.

Následůj íčí^J ' příklady ilustrují předkládaný vynález -a umožňují ukázat'další vlastnosti- a výhody vynálezu, aniž by předmět vynálezu'jakkoliv omezovaly. ' ¹ Μ • · · · · · · • · · · · · · • ····· · · · .4» · · · ·

• 4Γ· ··

- .22 Popis obrázků

Obr.. 1. Kondenzace oligonukléotidu (ODN) a peptidu maleimidNLS.

;Obr. 2. Analýza· chimérý oligonukleotid-peptid ( (Pso-GAis-NLS). řiá, 15% polyakrylamidového gelu po proteolytickém působení trypsinu.

, 1. = cligo Pso-GAis-SH . / . , .

. 2’=.chiméra oligonukleotid-peptid Pso-GAí₉-NLS = chiméra'oligonukleotid-peptid ' Pso-GA_i3-NLS po štěpení . .trypsinem '

Obr. 3. Schematické znázornění plazmidu pXL2813

Obr·.· 4. .Schematické Znázornění plazmidu pXL2652

Obr.· 5., Analýza vytváření tro j šroúbovice mezi- plazmidem pXL2813 a chimérou oligonukleotid-peptid Pso-GAi₉-NLS. oligonukleotid pso-GAi₉-ŇLS a plazmid byly smíchány v pufru obsahujícím 100 mM.MgCl₂. Molární nadbytek oligonukléotidu. vzhledem ...k plazmidu byl proměnný od 0,- do 20Q. Směs byla fotoaktivována, ponechána přes noc ve 37 °C, a pak štěpena dvěma restrikčními enzymy, .které,štěpí plazmid obou stranách úseku, kde se vytvoří trojšroúbovice.

= bez oligonukléotidu .

- molární'nadbytekoligonukléotidu.k plazmidu je, 15

3.- molární'nadbytek oligonukléotidu k plazmidu je 50

- molární nadbytek oligonukléotidu k plazmidu je .100 5' = molární nadbytek . oligonukléotidu 'k plazmidu je 200 = samotný fotoaktivovaný oligonukleotid . .

= samotný neaktivovaný oligonukleotid

4» ··· · · · · · · · · ··

- molární nadbytek oligonukleotidu’ k plazmidu je 30, směs nebyla fotoaktivována. '

Obr.. 6./' .Exprese in vitro transgenu ' (β-galaktosidázy) pro testy, prováděné se samotným· plazmidem. pXL2813,, s. vektorem pXL2'813-Pso-GAi₃-NLS á bez plazmidu

Obr. 7. Charakterizace peptidové části chiméry oligonukle.otid-peptid , . Pso-GAíj-NLS ' užitím . interakce s. importinem 60-GST ' (analýza na 1-5% polyakrylamidovém gelu).

= oligo Pso-GA₁₉ (ίμο), · = chiméra, oligonukleotid -peptid Pso-GÁi_S-NLS (Ιμς),

=.supernatant. získaný po inkubaci”glutathionových perliček potažených ‘ importinem ' 60 a oiigonukieotidem Pso-GA₁₉, a separace peletů'perliček (obsahujících složky. interagující s importiny) ze supernatantů,

4’ = pelet 'získaný- po inkubaci glutathionových perliček potažených- importinem. 60 a 'oiigonukieotidem Pso-GA.₁₅, a Separace, peletů- perliček (obsahuj ících. složky interaguj ící s importiny) ze- supernatantů,

5- = ''supernatant získaný po inkubaci glutathionových perliček potažených importinem 60 a' chimérou -oligonukleotid-peptid Pso-GAis-NLS,1a separace peletů perliček (obsahujících- složky reagující s importiny) ze supernatantů, = pelet . získaný po inkubaci- glutathionových perliček potažených importinem 60 .a- chimérou oligonukleotid-peptid Pso-GAig-NLS', a separace peletů perliček (obsahujících složky reagující’ s importiny) · ze'supernatantů.

'Obr. 8. Analýza . chiméry oligonukleotid-peptid (GAig-NLS) na 15% pplyakrylamidového gelu po proteolytickém působení trypsinu. ;

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99999 99

- 24 1 = oligo GA;;-SH (200 ng) , = chiméra oligonukleotid-peptid GAig-NLS (Ιμς) před purifikaci užitím HPLC, = chiméra oligonukleotid-peptid GAig-ŇLS (l^g)-po purifikaci 14 '. = chiméra oligonukleotid-peptid CA^-NLS po štěpení trypsinem (Ιμς) . _Λ< . ' ,· Obr. 9. Grafi.c.ké znázornění kinetiky vytváření troj šroubovice. (% obsazených trojšroubovicových míst v závislosti na čase) mezi’ plazmidem pXL2313a chimérou GAig-NLS.’

Obr.’ ,10] Charakterizace, peptidové části chiméry oligonukleotid-peptid GA.ig-NLS interakcí s importinem 60-GST.

= chiméra oligonukleotid-peptid GAig-NLS,- .·2 = oligo- GAig, ·

3; supernatant- získaný po inkubaci glutathionových perliček potažených importinem: 60 -a. chimérou oligonukleotid-peptid GAig-ŇLS, a separace peletu perliček (obsahujících složky interagující s importiny) -ze· supernatantu, = pelet získaný po inkubaci glutathionových perliček potažených importinem' 60· a chimérou oligonukleotid-peptid GAig-NL.S' a - separace- peíetů perliček- (obsahujících, složky reagující s-importiny) ze supernatantu, = supernatant získaný pp inkubaci' 'glutathionových perliček, potažených'. importinem 60 a oligonukleotidem GA₁₅, a separace peletu perliček ·. (obsahuj ících složky reaguj ící s .importiny) ze.supernatantu,

- pelet získaný pd - inkubaci glutathionových perliček potažených importinem 60 a oligonukleotidem GA₁₉ . a separace peletu perliček (obsahujících složky reagující s importiny) ze supernatantu. ' , ' ·· ·· • · ·' · ··· · • · · ·

Obr. 11. Schematické znázornění plazmidu pXL2997. .

Obr. 12. Grafické znázornění kinetiky vytváření trojšroubovio (% obsazených trojŠroubovicOvých míst v závislosti na čase) mezi-plazmidem'plasmid pXL2.997 ,a chimérou pim-NLS.

Obr... 13. histogram představující aktivitu β-galaktosidázy inyivo plazmidu pXL2813 (označeno B.gal) a pXL2.813-Pso-GA₁₅NLS (označeno NLS-Bgal v lidském plicním nádoru.H1299 v RLU· (relativní světelné jednotky) .na nádor. ··'.

Transfekce . byla, provedena ,' elektropřenosovou technikou popsanou v patentových přihláškách WO 99/01157 a WO 99/01158.

Materiály a metody použité v příkladech

Spojení oligonukleotidů a peptidů . . '

Oligonukleotidy

Byl, použit oligonukleotid' velikosti 19' bp, který · měl sekvenci 5'-ÁAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (sekvence id. č. 4), označený ' GA₁₃, nebo oligonukleotid velikosti 13' bp se sekvencí 5'-GGGGAGGGGGAGG-3' (sekvence id. č. 15).označovaná dále -pim” (jde o sekvenci protóonkogenu piml)

Oligonukleotidy označené GA_1S-SH . nebo. pim-SH mají stejné ' sekvence „'jako - GA19 a pim .a mají fhio.lovou. skupinu na 5'-konci s oddělovačem (spacer) 6 uhlíků .mezi' thiolovou a fosfátovou skupinou na 5'-konci. Oligonukleotidy, označené Pso-GA₁₃-SH mají thiolovou skupinu na 3'-konci (SH) a navíc psoralen (Pso) na 5'-konci s oddělovačem pěti uhlíků mezi psoralenem « ·· ·♦'-·· ·· ·♦ (III· ·' · · · · · ·· · ιι · .· · · · ·. · * · · «, ··· · · · ··· · · · · ·

II · · · · · · · · • II · · · . · · · · · ♦ · ·

- 26,a fosfátovou, skupinou 5'^konce. Oligonukleotidy označené. Pso-GAia neobsahují thiolovou skupinu. .

Použité,názvy jsou shrnuty v následující tabulce I. Tabulka I

označení	modifikace ··.	modifikace
oligonukleotidu	.3' -konce	5' -konce
GAio	žádná	žádná
pim .	žádná	žádná'
GAis-SH	- žádná	thiolová skupina
pim-SH	žádná	thiolová skupina
Psi-GA1S’	žádná;	. psoralen ,
. Pso-GA-l3-SH	thiolová skupina	psoralen

Tyco- lyofilizované oligonukleotidy byly- neředěny.· do 100 mM trimetylamon.iumacetátového pufru, pH- = 7.

Peptidy / . . ' , ' . Peptidy' použité pro konjugaci byly syntetizovány, pomocí automatického- syntetizátoru na pevné fázi. Tyto peptidy obsahují: / buďto jadernou (lokalizační sekvenci T- antigenu SV40 (PKKKRKV, sekvence id. c. 11), nebo.' stejnou sekvenci ale mutovanou (-(PKNKŘKV, ''sekvence id. č. 14)·, . kteráž 'neumožňuje - .ani směrování - ani jadrný transport (právě kvůli mutaci).

Tyto peptidy obsahuji, také. oddělovač (spacer). čtyř aminokyselin na N-konci: KGAG. N-koncový lysin je chemicky modifikován: obsahuje maleimídovou skupinu .na ’ ε-uhlíku • 99 ·· 99 ·· ·· .

9 9 9 ‘ · · 9· 9 · · 9 » · 9 - · *9 9 9 9 9 9 9 « ·99 9 * 9 99999 · 9 9 f 9 9 9 9 9 9 9 9.

99 99 99 99 9 9 99 a ochrannou 9-f luorenylmetýloxykarbon-ylovou skupinu (Fmoc) na aminové skupině' _a-uhlíku. - Tato skupina'· Fmoc absorbuje při 260 nm, což umožňuje monitorovat- peptid užitím vysokoúčinné kapalinové chromatograf ie.' s reverzní fází. G-koncová skupina j e. také ' chráněna ' (GONH, skupina) , přičemž ochranná' skupina se navazuje až na konci syntézy pep.tidu.

Peptidy jSou'uvedeny v	následující tabulce II.
Tabulka II. '
; označení peptidu ,	sekvence u .-modifikace1
maleimid-NLS i	maleimid-KGAGPKKKRKV-CONH2'
	. ,Fmoc ’
'maleimid-mutováný NLS	maleimid-KGAGPKNKRKV-C0NH2' Fmoc

i .. Tyto lyofilizované peptidy byly odebrány do 10,0 -mM -trimetylamoniumacetátového pufru,' pH = 7. Koncentrace- byla

J . . ' ·

0,4 mg/ml

- Konjugace · .

(Použitá strategie konjugace s oligonukleotidy spočívala v reakci thiolóvé ; skupiny .nesené. oligonukleotidem -a maleimidové -skupiny nesené'' peptidem [Eřitja,,. R.> etal.,. Synthesis of . defined ' peptide-oli.gonucíeotide . hybrids contáining a nuclear transport signál sequence, Tetrahedron, 1991, .47(24), pp. 4113-4120] .

' Óligonukleotid se.'přidá k roztoku peptidu.v ekvimolárním « · · * · ·φ φ φ φ · • · · · φ · φ φ φ ·· ♦ • -· · ’ · φ φ φ φ φ φ · • ··· · · φ φφφ φ φ φ φ φ • · φ φ φ φ φ φ φ • ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ί φ φ · ·

-28-, 'množství a reakční směs se ponechá 2 . hodiny při teplotě .místnosti-. Chiméra oligonukleotid-peptid se pak purifikuje užitím vysokotlaké kapalinové- chromatografie s reverzní fází na koloně Vydac Č8 obsahuj ící. sferoidní křemičitanovou zeminu s průměrem' 5 μΐή a pórpvitostí 300 A. Užívá še 0,1-M trietylamoniumacetátový pufr ' '(T-EAA) a gradient ' acetonitrilu od 5 % do 50 %za 35 minut,,Produkty se detekují při,260 nm.

- Analýza chimér' štěpením trypsinem ' '

Konjugáty p.r.o t eo1yt i c kému

1995, 6,. pp. 101-108: peptidu v . 7 μΓ oligonukleotid-peptid byly podrobeny Štěpení' trypsinem, což- dovoluje odhalit péptidovou část chiméry- [Reed,-- M.W. et al.', Synthesis andevaluation '.of ' nuclear , targeting v peptide-anti-sense , oligodeoxynucléotide conjugates, Bioconjugate - Chemistry/ . Roztoky obsahující .,1 μg ol.igonukleotidof - 0,1 M triety.lamoniového (TEAA) ' purif ikačního.. pufru- ,byly smíchány s,' 1 μΐ roztoku 'trypsinu (5 mg/ml) .' Pak se přidal 1 μΐ 100 mM - Tri-s-HCl pufru s pH = 9, ;a l μ1 5-00 mM EDTA. Po- štěpení 1- ho.dinu byly vzorky naneseny do' jamek- na^! 15%' polyakrýlamidovém .gelu se ' 7M močovinou. Elektorforéza probíhala ve 100 mM Tris -pufru- s ·ρΗ 8,3 ' obsahujícím 90-mM kyselinu boritou a 1 mM EDTA. -Nukleové kyseliny byly vizualizovány barvením- stříbrem užitím .soupravy Bior-ad. .

'2. Vytváření trojšroubovic s chimérami Plazmidy - - ' Plazmid použitý přo studium vytváření trojšroubovicové struktury ,s chimérami GAi₉-peptid byl nazván pXL2813 (velikost • Φ φ φ · · · · · • φ · φ φ φ φφ · φ φ φφφ φ φφ ·· ··

- -29 7257 ·' , bp, viz cbr. . 3) . Tento' plazmid exprimuje gen β-galaktosidázy, řízený silným'; promotorem časných - genů cytomegaloviru (CMV) a gen rezistence k ampicilinu.

Proti směru· transkripce. (upštream) od promotoru mezi nukleotidy 7238 - a 7256 byla klonována. sekvence GA;₃ ( 5-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA- 3 ' , sekvence; id. č. _?4) konvenčním způsobem molekulární -biologie.

Byla klonována; do plazmidu pXL2652. (velikosti. 7391 bp, který je znázorněn schematicky na obr-. 4), který exprimuje gen β-galaktosidázy. .řízený' silným promotorem· časných genů cytomegaloviru (CMV)' a' také. .gen' rezistence- k ampicilinu. tento’ promotor pochází z pCDNA3, lacZ a polyA pocházejíz pCHHO. a zbytek byl získán z pGL2. . - Sekvence-byla klonována do místa-proti směru, transkripce '(upštream) od promotoru mezi jedinečná štěpná_: .místa· pro enzymy Munl -a ’XmaI. ’Pro, tento -účel .byly -dva. komplementární oligonukleot.idy určené. ke klonování,, 6 651- (5’-AATTGA.TTCCTCTCCTCCCTCCCTTAC-3 ' ) ' a 6652 - (3 ' -CTAAGGÁGAGGAGGGAGGGAATGGG-5') .byly zahřátý 5 minut na teplotu 95 °C a ponechány hybridizovat během postupného ochlazování. Plazmid pXL2652byl pak -štěpen restrikčními enzymy Munl .a Xmal 2 hodiny při 37 °C a produkty dvojitého štěpení -byly rozděleny e.lektrořorézou na .1% agarózovém gelu a ’pak obarveny etidiumbromidem.

'Požadovaný fragment pro- klonování byl eluován -podle protokolu Jetsorb . (Genomed) a, 200 ng. tohoto fragmentu 'bylo ligováno T4-. ligázcu s 10 ng .'směsi hybridizovaných oligonukléotidů po dobu 16 hodin při 16 °C. .Kompetentní· bakterie kmenu DH5d, .byly transformovány' tímto reakčním- '.produktem užitím- elektrqporace, vysety na Petriho· misky obsahující LB médium' a ampiciliri. Klony rezistentní k ampicilinu byly selektovány a. DNA byla extrahována alkalickou-, lýzí a pak analyzována na 1% ·' ·· ·· «· ·· tf · » · I • · 9 1

9 9 « • 9 9 <

• tf ·· .-. ' .-- .30 -., agarózovém gelu. Klon odpovídající velikostí, požadovanému produktu byi sekvencován. ' '

V případě, kdy oligonukleotid byl .pim.,. plazmid použitý ke studiu vytváření trojšroubovice byl pXL2997 znázorněný na obři 11. tento plazmid exprimuje. gen β-galaktosidázy řízený silným promotorem časných genů cytomegaíoviru (CMV) a také gen rezistence k ampicilinu.

Proti směru transkripce /upstream) od promotoru byla klonována, sekvence pim · (sekvence ' id. č. 15) konvenčním způsobem molekulární'biologie.

Vytváření 'troj šrcubovicových struktur

-1 ' · .Vytvoření trojšroubovice se provádělo tak, že se smíchal plazmid. pXL2813 (3 pmol,' čili 15 μρ) .nebo pXL2997, ,v závislosti , na případu,., a .různé množství.....oligonukleotidu nebo chiméry v pufru 100 mM Třis-HCl,. pH =-7,5, obsahujícím 100 mM MgCio...

Fotoaktivace tro jšr-oubovice- ' ,Po inkubaci pře^s noc byla směs ná ledu ozářená 15 minut monochromatickou lampou s vlnovou délkou '365 nm (Biorad). Produkt fotoaktivace 'byl .naštěpen' restrikčními enzymy -.Mfel a Spěl a analyzován, na 15 % polyakrylamidovém gelu se 7M močovinou užitím migračního pufru. obsahujícího 100cmM Tris, pH = .8,3, , 90. mM. kyselinu boritou a 1 mM EDTA. ' Nukleové kyseliny byly vižualizovány.barvením stříbrem užitím, soupravy firmy Biorad [Mussú, Μ,., J.C. Wang, and M.-W.V. Dyke, ,In vivo persistence . of ' DNA triple helices - containing psoral-enconjugated oligodeoxyribonucleotides, Nucleic Acid Research, 1996, 24(24), pp. 4924-4932].

φφφ φ φ φφ φφ » φ φ *

Φ Φ I

Φφ φφ ’ Metoda studia trojšroubovice

Tato. metoda je . založena na principu vylučovací chromatografie roztoku obsahujícího plazmid a oligonukleotid, které- jsou- schopné vytvořit , trojšroubovici. Použitá • vylučovací kolona (Columns, Linkers 6, Boehringer .Mannheim) , obsahovala sefarózové' perličky a měla. limit- 194 párů baží, .což znamenalo, že, kolona zachytí, oligonukleotidy nenavázané na plazmid. . ..

.. . Nejdříve , byly^; oligonukleotidy '.užitím terminální transferázy radioaktivně’ označeny na svém 3'-konci pomocí Ía-S1 dATP podle' protokolu firmy Amersham: - 10 pmol oligonukleotidů .bylo inkuhováno 2 hodiny ve 37 °C s 50 μθί [_a-³⁵SJ dATP v přítomnosti 10 jednotek terminální .transferázy • v 5-0’ : μ! pufru' obsahujícího' . kakodylát'·· .sodný. .-Procento . označených oligonukleúhidů bylo vyhodnoceno, následujícím' způsobem: 1 μΐ vzorku. roztoku po značení,· naředěný 1/100, byl nanesen na^; filtrační’ papír. Whatmaír ’ DE81 ve dvou

-opakováních.' Jeden' z papírů byl' pak' dvakrát propláchnut. 5 minut .v 2 x, SSC, ' 30 vteřin ve vodě a 2 minuty, v etanolu. Radioaktivita obou papírů pak byla. porovnána. Radioktivita •zachycená na opláchnutém. papíru' _ odpovídala- ' účinně ir.korpcrované ³⁵S . .

Trojšroubovice se. vytvářely v objemu 35 μΐ. Hodnoty koncentrací plazmidu’ (40 nM) a- oligonukleotidů (20 nM) , použitý, pufr . (100 mM Tris-HC.l pH = 7.5, 50 mM . of MgCl₂)

..teplota byly fixní, zatímco inkubhční čas, se měnil od 1' do 24 , ‘ hodin. Sefarózo.vé' kolony . byly ekvilibrovány před použitím, reakčním pufrem a' pak 4 minuty centrifugovány při 2200 rpm, aby se usadily. 25 -μΐ reakčního média bylo naneseno na kolonu a kolona byla Centrifugóvána stejně jako. před tím. Pak φ φφ φφ φφ ·· ·· ·< · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ- φ · · · φ φ φφφφφ φ φφφφφφ» φ φ φ φφ φ φφφφ bylo naneseno' 25 μ! reakčního pufru á kolona se opět stejně centrifugov.ala. Eluát byl odebrán..

.Byla určena radioaktivita v '5 μΐ reakčního média ..označená cpm(deposit) , a v éluátu, označená cpm(eluát), což umožnilo stanovit procento eluovaných oligonukleotidu.:

. % -eluovaných oligonukleotidu = cpm(eluát)/ [5 x cpm(deposit) ] x 100..

Procento plazmidů, které bylo účinně eluováno v. průběhu experimentu- bylo stanoveno .měřením optické denzity eluátu a depozitu při' 260 nm, což' umožnilo vypočítat procento oligon-ukleotidů^; navázaných k plazmidy:

% -navázaných oligonukleotidu = [% eluovaných oligonukleotidů./% eíuovaného plazmidů] -x. 100.,

Tento parametr umožnil vyhodnotit;procento míst, kde se tvoří trojšroubovice (je jedno v plazmidů. pXL2813 nebo pXL'2997) >.-které ^rje- účinně- -obsazeno, když - se .-vezme' -v-úvahu koncentrace plazmidů (označená [plazmid]) a oligonukleotidu (označená [oligo])_: použité v reakci' vytváření trojšroubovice:

-. % obsazěných míst ‘ troj.šroubovice = % navázaných oligonukleotidů-x. '.[oligo] / [plazmid] .

Interakce s importiny /'

Rekombinantní proteiny ' ' Podj e.dnotka importinu 60 použitá ke studiu interakce s konjugáty oligoríukleotid-peptid (NLS -nebo mutovaný ,NLS) je myšího původu a je fúzována s glutathion-S-transferázou (GST). Sekvence importinu 60· byla klonována, dó vektoru pGEX-2T., aby. fúzovala s GST. Rekombinantní protein byl produkován v coli [Imamoto,. N. et al.,. In vivo evidence • ft ·» ·· ·· ·· • · · ·· · · ·'· · ··*··· ♦ · · · ·»· · » ······ · » · • . 9 · · · -9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 .99 , . - 33 for involvement-of a 58kDa component' of nuclearpóre-targeting ' co-mplex in nuclear protein import, The EMBO Journal, 1995,’ 14(15) , pp.'3617-3625] . · ' 'Interakce·..S^! rekómbinantními' proteiny. - . '

Všechny, experimenty s interakcemi byly prováděny ve vazebném' pufru (20 mM HEPES, pH = 6, 8,- 150. mM octan draselný, mM octan 'horečnatý, 2mM_DTT a 100 ^g/ml BSA).

Nejdříve. byly rekombinantní- proteiny -inkubovány v-přítomnosti sefarózových perliček'- potažených glutathionem . (Pharmacia Biptéch), 1 μg rekombinantního proteinu bylo užito na 10 μΐ perliček-. Po inkubaci- -'30 , min,Ut při teplotě 'místnosti - v ' 500 μΐ vazebného . pufru byla směs centrifugována při 2000 g po-. 30 vteřin a. odstraněn supernatant. Perličky byly 5- x- opláchnuty tím, - že byly resuspendovány v 500 _ui vazebného - pufru' a centrifugovány, ' jak bylo. popsáno výše. -Nakonec'byly perličky resuspendovány ve vazebném 'pufru, aby se získala suspenze obsahující 50% perličky potažené rekombinantním proteinem.

Ve - druhém' případě bylo 60 . μ'1 .suspenze- obsahující -50% perličky potažené - rekombinantním proteinem inkubováno s 2 μρ oligonukleotidů- nebo oligonukleotid-peptidu .v 500- , μΐ vazebného.pufru. ' Po- inkubaci 30 minut př.i .teplotě·místnosti byla směs centrifugována 30 vteřin při. 2000 g a supernatant odstraněn. 30 μΐ ’supernatantu bylo odebráno pro analýzu, frakce nenachytané.na perličkyPerličky byly 5 x opláchnuty, tím, , -že- byly- resuspendovány v. 500 μΙ ' vazebného pufru a centrifugovány, jak 'bylo popsáno' výše·. ”. Pak byly perličky resuspendovány.v 15 μΐ nanášecího pufru (0,05% bromofenolová modř,.. 40% sacharóza, 0,1 M EDTA, pH - 8, 0,5% -laurylsulfát

-sodný) a zahřátý 10 - minut na 95 °C. Obsah supernatantu^

99 99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 ,9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99999 9 99999 99 9

9 9 9 9 9999

999 99 99 ·9- 99 99 i peletu- byly analyzovány na 15 % polyakrylamido.vém gelu se 7M . močovinou - užitím migračního pufru obsahujícího 100 mM Tris, pH = 3,3, '90 -mM - kyselinu boritou a 1 mM EDTA'.. Nukleové kyseliny bylý vi zualizován.y barvením stříbrem užitím soupravy, firmy Biorad [Rexach, M. and G. Blobel, Protein import.'into r.uclei: association and. dissociation reactions' involving transport, substráte,' transport, factors,. .and nucleoporins, Cell,, .1995, 83, pp. 683-692].

Transfekce buněk .' ¹ · , .Buněčná kultura

Byly použity buňky NIH 3T3. (ATCC CRL-1658), což jsou myši ..f ibrobLas-ty.......Tyto buňky b.yly'· kultivovány v.modifikovaném

Dulbeccově médiu se 4,5 g/l glukózy' (DMEM — Gibco), 2 mM glutaminem, penicilinem - (100 U/ml) , a streptomycinem (100 μς/ml), a . 10% fetálním. telecím sérem . (Gibco) . Inkubace· probíhala ve. 37 °Q v inkubátoru obsahujícím 5% CO?.- ' .

Transfekce,

Jeden den před transfekci byly . jamky 2.4-jamkové .destičky inokulov-ány 50 000 buněk na jamku.. Vektory byly naředěny -ve 150 mM NaCl a smíchány s kationtovými lipidy (sloučeniny' se ' sumárním vzorcem H₂N (CH?) ₃N.H (CH₂) 4NH (CH₂).₃NHCH₂COGlyN [ (CH₂) I-žCH?] ₂ popsané v patentové přihlášce WO 97/15135 pod bodem (6))' naředěnými. ve' -150. mM NaCl. '.Byla .vytvořena směs obsahující 6 nmol lipidu na. 1 μς piazmidu. Tato směs byla naředěna ,1/10 v kultivačním médiu bez séra a nanesena na buňky. Po inkubaci 2 hodiny, ve 37 °C v inkubátoru obsahujícím 5% CO₂ bylo φφ.

-φφ ·· φ φ ' φ φ ' · φ φ ' φ · φ φ φ φ φφφ φφφφ φ φφ* φ ΦΦΦΦΦ'# · φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ ·». .v# φ ·.··'··· φφφ φφ φφ φφ .φφ φφ

- 35 - .

přidáno 10% telecí fetální sérum.

.Kvantifikace β-galaktosidázy ,

Po inkubaci· 4 8 .hodin’ byly buňky opláchnuty - 2 x v PBS a lyžovány 250. μ! lyzovacího -pufru (Promega) . β-galaktosidáza byla kvantitativně s.tanovéna užitím protokolu Lumigal βGalactosidase génetic, reportér systém. (Clontech) . Aktivita byla .měřena · užitím luminometru ¹ Lumat LB9501 (Berthold).' Množství proteinů se -měřilo pomocí.soupravy'BCA' (Pierce).

Příklady provedení' vynálezu

Příklad.1 . . .Tento. ' .příklad ilustruje možnost . konjugace oligonukleotidu'. 'Pso-GAig-SH s peptidem ‘ - maleimid-NLS. oligonukleotid .Pso-GAig-SH, který má sekvenci ' -AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3 ', s-thiolovou -skupinou na 3 '-konci, byl' 'kondenzován s peptidem NLS, ' který, nese maleimidovou skupinu na. N-konci metodou, která, byla popsán výše v části' Materiály a metody, vazba -oligonukleotidu. s peptidem.

Konjugace .. byla monitorována .vysokoúčinnou kapalinovou. chromatografií . (HPLC) s reverzní fází. Proběhla s ekvimolární stečniometriú: během dvou- hodin byla konjugace ukončena a výsledná chiméra .byla purifikóvána pomocí HPLC.,

Reakční sphémá konjugace je uvedeno na obr. ly

Chiméra oligonukleotid-peptid (Pso-GAig-NLS.) byla .analyzována elektroforéz-ou. na polyakrylamidovém . gelu po proteolytickém ‘ působení trypsinu, což umožnilo odhalit_ φ *4 4« 44 44 44

4«> 1 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ,4 4 4 4 4 4 4 4 .4 4 4

444 44 4 444 44 44 4

4 4 4 4 4 4 4 4 «44 44 44 44 44 44 přítomnost peptidové složky chiméry, po . migraci v denaturújícím polyakrylamidovém gelu a barvení nukleové kyseliny stříbrem, (jak bylo ji uvedeno v části Materiály a metody, analýza chimér štěpením s .trypsinem) .

Chiméra . Pso-GA-_l9-NLS vykazovala '. zpožděnou elektroforetickou migraci ' ve srovnání s’ oligonukleotidem PSoGAig-SH, a produkt p.roteolytického·, štěpení' byl viditelný ve středu mezi' pásy Pso-GA₁₉-NLS -a Psó-GA-₉-SH, jak^řje ukázáno na obr. 2.

Chiméra Pso-GAiý-NLS .tudíž obsahuje peptidovou část, která je přístupná trypsinu. Tyto výsledky jasně'ukázaly, žé konjugace olígonukleotidu a .peptidu proběhla/ a to s vysokým výtěžkem.

Příklad 2 .....,,.;..·....

•Tento pří klad ‘ ilustruje vytváření tiroj šroubovice mezi plazmidem. pXL2813 a chimérou Pso-GAig-NLS,· která je modifikována fotoáktivovatelným alkylujicím činidlem. Tento příklad' -také ukazuje podíl.·· modifikovaného plazmidu v závislosti na molárním nadbytku olígonukleotidu. vzhledem k plazmidu .·,.··.' ·,·.'.. ,

Plazmid pXL281'3, . znázorněný na obr. 3, obsahuje homopurinovou sekvenci komplementární k'GAi₉, která j.e schopná vytvářet troj šroubovici s oligonukleotidem - GAig, Pso-GA-_l9, Pso-GAi₉-SH nebo Pso-GAi₉-NLS . Dvojmocné ' kationty jako např. Mg²* .. stabilizují takové tro j šroubovice. Oligonukleotid Pso-GAi₉-NLS a plazmid se smíchaly v pufru obsahujícím.100.mM MgCl2·· Molární nadbytek olígonukleotidu vzhledem k plazmidu byl proměnný od 0 do 2 00.

Po inkubaci . 12 hodin při 37 °C se směs 15. minut

- 37 fotoaktivovála. . (jak bylo již popsáno v části Materiály a metody, fotoaktivace trojšroubovice) a pak byla štěpena restrikčními enzymy Mfel a .Spěl', které, štěpí'' plazmid 'na - každé straně úseku, kde se vytváří ' - trojšroubovice.

Z nemodifikovného plazmidu pXL2813 se tak vyšt.ěpil fragment, velikosti' 70. bp. Z plazmidu s oligonukleotidem · vytvářej ícím trojšroubovici . kovalentně vázanou 'k plazmidu byl získán fragment obsahující 7,0 párů baží a navíc 19 . párů baží oligonukleotidu.. Tyto .fragmenty různé velikosti je možné separovat migrací . na. polyakrylamidovém gelu:- fragmenty pocházející' z plazmidu. modifikovaného ' troj šroubovíci mají.

kratší . migrační z nemodifikovaného elektroforézou ' .ha.

vzdálenost -než fragmenty pocházející také -m-ožné, a sice polyakrylamidovém gelu, . troj šroubovice vytvořené' nebo 'Pso-GA-ig-NLS. jsou ' po.

plazmidu..- Je . dená-turuj ícím kvantifikovat .podíl- modifikovaných plazmidů v závislosti na molárním nadbytku .oligonukleotidu vzhledem k-plazmidu'

Výsledky ) j sou .uvedeny na' obr. -5-. Pro molární nadbytekoligonukleotidu vzhledem k plazmidu vyšší _:než 50.byly všechny plazmidy modifikovány . a spojily se s Oligonukleotidem Pso-GA-._?-NLS. Bez fotoaktivace se elektroforetické zpoždění fragmentů na denaturujícím gelu-ztratilo.

Je ' tedy .. zjevné, že s oligonukleotidem Pso-GAi_S-SH fotoáktivaci skutečně kovalentně'vázané k dvojšřoubovici.

Kromě ' toho, štěpení zbytku plazmidu a uplatněním -analýzy, jaká byla popsána výše, 'je možné ..ověřit, že fotoaktivace. nevede k-nespecifické -kovalentní -vazbě oligonukleotidu. P.so-GA-_l3-NLS na místa mimo. .úsek. obsahující specifické sekvence, schopné vytvářet, tro j šřoubovici .

Tyto výsledky jasně ukázaly podmínky, které umožňují specificky a kovalentně. . vázat pep.tidovou sekvenci' s plazmidem, - a to na mís,to mimo. promotor regulující expresi _

• ·

- '38 transgenu,. takže exprěse -transgenu tím není ovlivněna.

Příklad 3 ' ' . . Tento', příklad ilustruje . shopnost ' in vitro exprese transgenu, i když plazmid je modifikován.

Byly srovnány exprese β-galaktosidázy v plazmidu pXL2813, který není modifikovaný, s plazmidem^ který je vázán 's oligonukleotidem-Pso-GA₁₉-NLS, po zra.nsfekci buněk NIH3T3.'

Výsledky .uvedené na obr. 6 a získané průměrné .hodnoty (+ směrodatná . .odchylka) jsou- uvedeny ' 'v následující tabulce III: . Tabulka III

plazmid	exprěsetransgenu (RLU/^g proteinu)
pXL2813 '.	253759 + 48545
• pXL2813-Pso-GA19-NLS '	473934+111476
bez plazmidu	' 129 + 85 -

Je vidět,· že' exprese transgenu- vzrostla po modifikaci 'koválentríím navázáním 'trojšroúbovice proti směru transkripce (upstream) od promotoru.

. . Tyto výseldky jasně ukázaly, že vytvoření trojšroúbovice neovlivňuje negativně expresi in vitro·.' Naopak, vlivem jaderné lokalizace plazmidu vzhledem, ke spojení se směrovací sekvencí jNLS, se plazmid do,stal do jádra, což vedlo ke zvýšení transfekční účinnosti.

• · ·

Pří klad 4 , - ; , .

Tento.příklad sloužil' k ověření toho, že exprese invivo není inhibováná’ přítomnosti směrovacího signálu spojeného s plazmidem prostřednictvím trojsroubovice.

'Experiment·, spočíval v tom, že pXL2813 a pXL2813-Pso-GA₁₉NLS byly'-transfekováný do. buněk lidského pli.cního .'nádoru •H1299 užitím techniky elektropřenosu (popsané v patentových přihláškách WO 99/01157. a WO *99/01158).· Experiment byl proveden se·· samicemi nahých myší s hmotností 18 až 20 g.

.Myším- byl' jednostranně implantován štěp 20 mm³- nádoru H1299. Nádor se rozvinul a dosáhl objemu 200 až 300 mm³. Myši byly rozděleny do 'homogenních skupin na základě velikosti nádoru. Pak byly myši anestetizovány užitím komerčně dostupné směsi Ketamin/Xylazin. Roztok plazmidu·.(8 μ^. DNA/40 μ.1 150 'mM NaCl) 'byl' podélně injikován do periferie .nádoru injekční .stříkačkou Hamilton.

. '•Laterální strana ' nádoru byla pokryta .vodivým gelem /a nádor byl umístěn, mezi dvě'ploché elektrody z nerezavějící oceli vzdálené .0,45 až 0,7 cm. Pomocí komerčně dostupného generátoru ' obdélníkových elektrických pulzů - (Electropulsateur PS .15,' Jouan, France) byly- aplikovány elektrické pulzy- 20 až 30‘ vfeřin po injekci. Pomocí osciloskopu - bylo ' možné kontrolovat ' intenzitu ve- voltech,. . trvání v milisekundách a frekvenci v hertzech, neboť pulzy je třeba ' aplikovat -v intenzitě 500 V/cm po 20 ms s frekvencí 1 Hz.

Pro.vyhodnocení ťransfekce nádoru bylo .10 a 7 myší' pro plazmid pXL2S13 a pXL2818-Pso-GA-_l9-NLS, v uvedeném pořadí,

.. šetrně utraceno', 2 . .dny po injekci plazmidu. Nádory byly

Odebrány, zváženy a rozdrceny v .lyzovácím pufru -(Promega) doplněném antiproteázúvým.prostředkem (Complete, Boehringer)·. Získaná suspenze se ., centrifugovala, aby se získal čirý • · ' · • ·

- 40 supernatant.' Po 'inkubaci '10 μΐ tohoto supernatantu s-250 μΐ reakčního pufru '(Člontech) i hodinu ve. tmě, byla měřena ρ-galaktosidáza . pomocí komerčně dostupného' luminome.tru. Výsledky byly vyjádřeny v relativních světelných jednotkách (RLU) na nádor.'

Bylo pozorováno, že hladina exprese transgenu in vivo z plazmidu pXL2813-Pso-GAi=-NLS byla vyšší nebo stejná jako exprese získaná s nemodifikovaným- yplazmidem pXL2'813 (viz obr. 13). '

Příklad 5 '

Tento příklad ilustruje charakterizaci peptidové části konjugátů- Pso-GÁ_iS-NLS,· čili verifikaci směrovacích vlastností peptidu NLS .kombinovaného.. s. konstrukty, podle ' předkládaného vynálezu.'

Použitá peptidová sekvence, NLS signál T- antigenu SV4ů, je rozpoznávána, receptory rodiny ' _a-karyoferinů. Myší ekvivalent', zvaný importin 60, fúzovaný s glutáthion-Stransferázou, ' byl použiť pro charakterizaci. konjugátů oligonukleotid-peptid. Ta byla . provedena . metodou popsanou v.části Materiály a metody, interakce s importiny.

Byla zkoumána interakce mezi glutathionovými perličkami potaženými, imporťinem 60', a .oligonukleotidy GA-_i9-NLS nebo Pso-GAig-NLS, Po inkubaci 30 minut při teplotě místnosti byl· pelet perliček - (obsahující- složky,· ' které interagují. s importiny) byl oddělen od supernatantu. Výsledky této charakterizace jsou- uvedeny na obr., 7. Ukazují, že oligonukleotid Pso-GA₁₅-NLS je navázán na glutathionové perličky, zatímco oligonukleotid Pso-GA₁₉ zůstal v supernatantu.

····· · ··· • · · · • a · · · ' * · . - 4.1 To zcela jasně . ukázalo ^; schopnost interakce oligonukleotidů P.so-GAi₅-NLS s _a-impprtinem.· Peptidová část chimér oligonukleotid-peptid je.‘ tedy ' skutečně .rozpoznávána· příslušným- receptorem, - což znamená/ .že peptid účinně plní funkci směrovacího signálu. '

Příklad 6 má sekvenci

č. 4) , . a má byl kondenzován

- Tento¹. -. příklad , ilustruje ' / možnost konjugace oligonukleotidů' GA19-SH s peptidem maleimid-NLS. Na rozdíl od příkladu.!, chiméra zde není modifikována foto.aktivovaťelným alkyiujícím činidlem., · . ·

-. . Oligonukleotid .'. GA15-SH, který . 5 ’ -AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3 ' ( sekvence id.

thiolovou · skupinu ' na . . svém 5'-konci, s peptidem' maleimid-NLS,. 'který’ nesemaleimidovou skupinu na N-konci stejně jako- to bylo popsáno v příkladu 1 pro oligonukleotid ?so-GA-._;.-SH. ·-'.·

Konjugace byla- monitorována vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC)· s reverzní fází. 'Proběhla s' ekvimo.lární sťechionmetrií': během dvou hodin- byla - konjugace ukončena a výsledná chiméra byla purifikována'pomocí HPLC.

Chiméra ' oligonukleotid-peptid · byla analyzována protečlytickým působením trypsinu, jak .bylo popsáno výše • v části Materiály a' metody·.

Výsledky jsou ..uvedeny 'na. obr. '8. Jsou· · · srovnatelné .· .s·-výsledky získanými pro oligonukleotid Pso-GAi_S-SH. ·,· .

99 99 • '· · 9· · · • 9 9 · · · ····* 9 99 9

9 9 9 • · · ·

9 9 · • · · 9.

9 9 · • · · ·

9 ' ·· . . - 42 - '

Příklad Ί . . ^; '

Tento příklad .ilustruje možnost vytvoření trojšroubovice mezi plazmidem pXL2813 a. chimérou GÁ-ig-ŇLS bez přítomnosti' alkyluj ících. činidel'. ¹

Kinetika vytvářeni. trojšroubovice mezi plazmidem pXK2813 a chimérou GA—ig-NLS, jak byla ' popsána v příkladu .5, byla zkoumána¹ ^způsobem popsaným v části Materiály a metody, vytváření tro j šroubovice s chimérami]-

Obr. 9 představuje kinetiku vytváření trojšroubovice.

Je vidět, že v. podmínkách koncentrace plazmidu .40 nM a koncentrace, oligonukleotidu ' 20 ; nM se vytváří stabilní trojšroubovice. .

'Příklad 8 ' ' . Tento příklad-ilustruje ’ charakterizaci peptidové části Chiméry GA;₃-NLS.

Použitá' peptidové -sekvence, . signál NLS z T antigenu SV4, je rozpoznávána receptory-rodiny ’_a-karyoférinů, jakjiž bylo uvedeno v příkladu 4. myší ekvivalent, zvaný importin .60, fúzovaný - . s glutáthion-S-transferázou, . byl použit k charakterizaci konjugátu oligonukleotid-peptid postupem popsaným v části Materiály a metody, interakce s importiny.

' Byly zkoumány interakce mezi glutáthionovými perličkami potaženými ''importinem 60 a oligonukleotidy GA_1S nebo GA-₁₉NLŠ? .Po '..inkubaci 30 minut - při teplotě mísťno.sti byl pelet, perliček (obsahující složky reagující s importiny) separován od supernatantu.

Výsledky jsou .uvedeny na obr.' 10. Je vidět, . že oligonukleotid , GAisNLS i je -vázán na. glutathionové perličky, _ ·· ·· • 99 ·

9 9 ·

- 4 3zatímco óligonukleotid GAig zůstal v supernatantu.

,1 · ' ' · '

To . jasně' ukázalo schopnost oligonukleotidu GA-_1S-NLS interagovat' s^; ·_a-importiny. Peptidová část chimér

oligohukleotid-peptid příslušným receptorem signálu. ' '	je tedy a· plní 'ták	skutečně . ·. opět roli	rozpoznávána směrovacího
Příklád 9 .	y
.Tento příklad.	ilustruje	možnost	kondenzace
oligonukleotidu prim-SH	s-peptidem maleimid-NLS..
Óligonukleotid pim-	-SH, se sekvencí 5’—GGGGAGGGGGAGG—3'
(sekvence id. č. 15).· a	S-thiolovou	skupinou na	5'-konci byl
konjugován s peptidem- maléimid-NLS	obsahuj ícím	maleimidovou

skupinu -;na ··. N-kohci, a to. za stejných '.podmínek 'jako Óligonukleotid GA-.j-SH v příkladu 5.

• Konjugace 'byla monitorována vysokoúčinnou kapalinovou chromatograf ií (HPLC) s-reverzní fází. Proběhla s ekvimolár-ní stechiometrií: během dvou- hodin byla konjugace ukončena

a. výsledná chiméra byla. purifikována pomocí HPLC. ‘ '

Příklad 10 .

Tento přikladilustruje možnost vytvoření trojšroubovice mezi' ..plazmidem pXL2997a chimérou pim-NLS bez přítomnosti alkylujících činidel..

Kinetika vytváření trojšroubovice mezi plazmidem pXL2997 a Chimérou pim-NLS (vytváření bylo popsáno ' v příkladu 8), byla zkoumána způsobem popsaným v. části:Materiály a metody, vytváření trojšroubovice s chi-mérami.

·· ' ·· • , ♦ · ♦ • · · · • · · · • ♦ · · ·· ·· ··· ·· • · ·· ·,'♦·· · • · · · • · · · · · • · · • · · *

-:4 4 Obř. 12'představuje kinetiku vytváření.trojšroubovice. \

Je vidět,_λ že v podmínkách koncentrace plazmidu 40 nM a koncentrace oligonukleotidů 20 nM se vytváří stabilní troj šroubovice. . ' ' , Z úplného popisu předkládaného vynálezu je odborníkovi (

zřejmé, že je možné provést četné modifikace vynálezu v rámci vynálézecké myšlenky předkládaného vynálezu, jehož předmět je definován připojenými patentovými nároky.

• ··	·♦ ««		• ·
• · ' Φ ·	* · ·	•	♦ ·
• ··· · ·	, · · · · ·	*	• Φ
• · ·	• ·	•	• ·
• · · ·	• » · ·		• ·

- 4.5

SEZNAM SEKVENCÍ

(.2) -INFORMACE PRO SEKVENCI. S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

' ' (i) CHARAKTERISTIKA' SEKVENCE:' '

- . (A): DÉLKA: 25 párů bazí. (B) -TYP; nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché .

, (D) TOPOLOGIE:. lineární (ii) TYP.MOLEKULY: cDNA ' (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE. S ID, Č. 1:

GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25 (2) INFORMACE, PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM, ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) - DÉLKA: 21 párů baží (B) .TYP: nukleová' kyselina· (C) TYP ‘VLÁKNA,: jednoduché (D)'. TOPOLOGIE :. lineární (ii) TYP MOLEKULY: -cDNA - ' (xi), POPIS SEKVENCE:' SEKVENCE S ID. Č. 2: CTTCTTCTTC TTCTTCTTCTT 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI'S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: .21 párů baží (3). TYP: nukleová .kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:' cDNA ^; (xij POPIS SEKVENCE:' SEKVENCE S ID.' O.- 3:

AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19

Φ- φ φ φ φ φ φ φφφ * φ φ · ’φ φ φ φ (2) INFORMACE PRO 'SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE': ' ' ;

(A) DÉLKA: 19 párů baží. ' ' ' (3) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché(D) TOPOLOGIE: lineární(ii) . TYP MOLEKULY: cDNA ' . .

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4: AAGGAGAGGA GGGAGGGAA . 19 . , (2) -INFORMACE. PRO SEKVENCI .S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM- 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:' ·'·. (A) DÉLKA: Ί9 párů baží (3) TYP: nukleová kyselina ·' '',. \C) TYP-VLÁKNA: jednoduché . (D) TOPOLOGIE:- lineární (ii) TYP MOLEKULY':. cDNA.

, (xi)' POPIS. SEKVENCE:- SEKVENCE S ID.G.5:

'TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19 (2) INFORMACE'PRO ‘SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6?

(i) .CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: , (A) DÉLKA: .19. párů baží (B) TYP.: nukleová. kyselina (C) TYP VLÁKNA: j ednoduché-y ’ (D) TOPOLOGIE: - lineární . .. .

·’. (ii) TYP MOLEKULY: cDNA - (xi) POPIS SEKVENCE:' SEKVENCE S ID. Č.6:

CTTCCCGAAG GGAGAAAGG ·· ·· ♦tf ·« • ♦ · tf • · · · • · ··· · • · · • tf ·· tf tftf tf tf tf · tf tf tf · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI. S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

' (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE':

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TY? VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární .(ii) TYP'MOLEKULY: cDNA ' ' ,· ' ^: (xi) POPIS. SEKVENCE: SEKVENCE. S ID. Č.7: .

GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ·.S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: ' (A) DÉLKA: 13 párů'baží.

(B) TYP: nukleová⁴kyselina (C) . TYP VLÁKNA: j ednoduché' (D) . TOPOLOGIE: lineární A (ii) , . TYP MOLEKULY: cDŇA (xi) POPIS SEKVENCE·: SEKVENCE S-ID. Č.8: GAAAAAGGAA GAG -13 (2) INFORMACE PRO~ SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: ' (A) DÉLKA:· 14 párů baží.

, ' . (3) ..TYP: nukleová kyselina . 7

.. (C) . TYP VLÁKNA: jednoduché (D) .-TOPOLOGIE: lineární ' ' ( '(ii)/TYP MOLEKULY: cDNA (xi.) POPIS -SEKVENCE': SEKVENCE S’ ID. Č.9:

AAGAAAAAAA AGAA . .14 • 9 9 ♦ , 9 9 • 9 9 9 »9 9 9 9

999 99 99

9 ' V· 9 • 9 99 « (2)., INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• (A)- DÉLKA: 17 párů baží (3) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché.

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) .TYP MOLEKULY: cDNA .

(xi) POPIS .-SEKVENCE: SEKVENCE S 10. Č.1C:

. ‘ o ’

AAAAAAGGGA ATAÁGGG 17 ,2} INFORMACE PRO'SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM.11 (i) '.CHARAKTERISTIKA-SEKVENCE: ' ; ' (A) DÉLKA:'7 aminokyselin . ' (3) TYP: aminokvseliny (C) TYP VLÁKNA:jednoduché .' (D) TOPOLOGIE: lineární ‘ (.-ii) TYP ..-MOLEKULY:. peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č.ll:

Pro Lys Lys Lys Arg Lys-Val : - ' 5 [2) ' INFORMACE .-PRO SEKVENCI S - IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

- (i)CHARAKTERISTIKA-SEKVENCE: .

(A) DÉLKA: 1.9 aminokyselin .

' · (B) TYP: aminokyseliny (O) . TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP' MOLEKULY: peptid, ‘ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 12: ,

Lys Arg Pro' Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gin Ala Lys Lys 5 , -. 10

Lys Lys Leu Asp Lys ·« ·· > Μ · » · · ·

- 49. ,(2j INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

· ·'·'· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 aminokyselin (3) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA:jednoduché ‘ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:' peptid . (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 13:

Asn 1

Gin

Ser

Ser

Asn 5' '

Phe

Gly

Pro Met

Lys Gly 10

Gly Asn

Phe

Gly

Gly

Arg

Ser

Ser

Gly

Pro

Tyr

Gly

Gly

Gly

Gly Gin

Tyr

15'

20

25

Phe

Ala

Lys

Pro

Arg

Asn

Gin

Gly

Gly

Tyr

'30

35

.(2.) INFORMACE 'PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

. (i) .CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)' DÉLKA: 7 aminokyselin

- (B) TYP.: aminokyseliny (C) TYP, VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ’’(i.i) TYP MOLEKULY: peptid ; ' (xi) POPIS SEKVENCEr SEKVENCE' S ID. Č. 14:

Pro Lys Asn Lys Arg Lys Val ' '5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) . CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 párů baží . (B) TYP: nukleová kyselina (C) T.YP VLÁKNA: j ednoduché _ (D)TOPOLOGIE: lineární .

' (ii) . TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č.15:

GGGGAGGGGG AGG . ‘

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. -Vektor pro. přenos nukleových kyselin, který, obsahuje molekulu .dvojšroubovicové DNA a alespoň jeden oligonukleotid, který je svázán se směrovacím signálem . a který je schopen vytvořit ťrújšroubovici se- specifickou sekvencí přítomnou v molekule dvojšroubovicové DNA.
2. 2. Vektor pro přenos, nukleových kyselin podle nároku 1/ kde .molekula dvojšroubovicové DNA je plazmid nebo :epižom. . 3. Vektor pro přenos nukleových kyselin podíe nároku 2, kde molekula dvoj šroubovicové. DNA je plazmid v. .kruhové formě nebo v -nadšroubovicové formě.

   4/. Vektor pro' přenos ' nukleových kyselin podle nároků 1 až 3,

   - kde molekula'dvojšroubovicové DNA obsahuje expresní kazetu složenou z jednoho nebo několika požadovaných genů pod kontrolou, ' jednoho nebo několika promotorů nebo, , transkripčních terminátorů, .které jsou aktivní v savčích buňkách.· , ‘ ·· ' . 5. Vektor pro přenos nukleových kyselin podle nároku 4, kde' požadovaný ,gen je nukleová kyselina kódující terapeutický produkt.

   6. Vektor pro přenos 'nukleových kyselin podle nároků 1 až 5,. kde ^; specifická sekvence přítomná v molekule dvojšroubovicové DNA je sekvence homopurin-homopyrimidin.

   7 . Vektor pro ' přenos nukleových- kyselin z nároků ,1 až 5, kde specifická podle kteréhokoliv sekvence přítomná φφ φφ • ♦ · « φ φ # « φ · φ <

   φφφ <

   φφ ··

   41 Φ ΦΦΦΦ <1 Φ Φ Φ Φ · φφφ φφ φ φφφ φ φ ♦ φ φφ φφ φφ

   - ,51 v molekule dvojšroubovicové DNA je sekvence přirozeně se. . vyskytující v. dvojšroubovicové' DNA nebo je to syntetická nebo· přírodní sekvence umělým, způsobem, vložená .do • -dvoj šroubovicové DNA.

   8 .Vektor pro.-přenos nukléových kyselin podle kteréhokoliv z nároků. 1 až Ί, kde oligonukleotid obsahuje sekvenci poly-CTT a specifická sekvence .přítomná v molekule dvoj šroubovicové , DNA j'e poly^GAA. '

   9. Vektor pro přenos.' nukléových kyselin podle- kteréhokoliv '•.z nároků 1, až 7, kde- oligonukleotid obsahuje sekvenci •‘GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (sekvence id. č. '1) nebo .sekvenci . (CTT) ? (sekvence id. č. 2).

   1,0.-.Vektor pro přenes nukléových kyselin ' z nároků 1 až 7, kde specifická·.

   v molekule· dvojšroubovicové DNA 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (sekvence a oligonukleotid > ' ' obsahuje podle - kt sekvence obsahuje id.:

   í.réhokoliv přítomná sekvenci č. 3 j sekvenci

   5 '-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3 ' 5' -TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3¹ (sekvence ' id sekvence id. č

   4) nebo

   11..Vektor pro přenos nukléových. kyselin podle, kteréhokoliv

   -, z nároků _? 1 až 7, kde specifická, sekvence přítomná - v molekule' dvojšroubovicové DNA obsahuje ' sekvenci část nebo cělou sekvenci, 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (sekvence id.č. 6) přítomné v.replikačním(počátku ColEl- z· e. coli, a oligonukleotid . obsahuje . sekvenci

   5' -GAAGGGTT.CTTCCCTCTTTCC-3 ' (sekvence id. č. 7).

   • ·· 44 ·· 44 ·· ·· ι» · 4 4 4 4 4 4 · ·

   4 4 4 4444 4 · · ·

   4 444 4 4 4 444 4 4 4 4 ·

   4 4 4 4 4 4 4 4 4

   444 44 44 44 4< ··

   - 52 12.- Vektor .pro- přenos.-nukleových kyselin podle' kteréhokoliv z nároků Γ až .7, kde ·, specifická - sekvence přítomná v molekule dvojšroubovicové. < DNA obsahuj,e. sekvenci 5 ’-GAAAAAGGAAGAG-3- (sekvence . id. č. 8) nebo sekvenci 5' -AAAAAAGGGAATAAGGG^-3 ’ (sekvence id. , č. 10) přítomnou v genu β-laktamázy z E. coli plazmidu pBR322.

   13. Vektor pro přenos nukleových kyselin podle kteréhokoliv .'z nároků 1. až 7, kde specifická sekvence přítomná' v molekule dvo j,šroubovicové' DNA obsahuje sekvenci . .-5' -AAGAAAÁAAAAGAA-3'· , (sekvence · id.. č. 9) přítomnouv replikačním. počátku γ 'plazmidu- s, podmíněným replikačním počátkem jako, je pCOR. . .

   14. Vektor·: pro přenos .nukleových kyselin-.'podle kteréhokoliv ^; . z . nároků .. i -až· -13, kde- oligonukleotid obsahuje aiesp.oň· 3 páry baží \

   15. Vektor, pro přenos nukleových. kyselin podle· kteréhokoliv, z nároků 1 až 14,1 kde oligonukleotid obsahuje 5 až 30 párů baží. .·'

   16. Vektor- pro ’přehos nukleových kyselin·, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15,' kde oligonukleotid obsahuje, alespoň jednu chemickou . modifikaci, která· ho činí rezistentním k nukleázám nebo ho ochraňuje před nukleázami, nebo zvyšuje jeho afinitu ke specifické sekvenci · přítomné v molekule dvo j šrouboví cd vé··- DNA...

   17 . Vektor ' pro přenos nukleových kyselin ' podlé kteréhokoliv, z nároků 1 áž 16, kde oligonukleotid je sledem nukleosidů s modifikovanou kostrou.

   • ·« ·· ·· ·· ·· ·· ι. · · ·· · · »· · ·« · « ·· · · ·· · • »·· e · · ··· · · · · · • · *· · ·»«· • · · ·· ·· ·· ·· ··

   18. Vektor pro přenos nukleúvých kyselin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 1'6, kde oligonukleotid je spojen s alkýlujícím činidlem .vytvářejícím kovalentní vazby na úrovhi baží v, dvoj šroubovicové DNA.·

   19. Vektor pro přenos nukleóvých kyselin, podle nároku 18, kde alkylující činidlo je fotoaktivovatelné.

   20. Vektor pro přenos ,nukleóvých kyselin' podle- nároku 18 a Í9, kde al-kylující činidlo je psoralen. 21. Vektor pro přenos nukleóvých kyselin .podle kteréhokoliv • z nároků . 1 .až.. 20, kde směrovací signál interaguje se složkami extracelulární .matrix, receptorem v plazmatické ; membráně/ -.1 Zaměřuj e. intracelulární y kompartměnt . a/nebo zlepšuje intracelulární tok dvojšroubovicové DNA.

   22. Vektor pro přenos nukleóvých kyselin podle nároku ,21, kde ' směrovací, signál obsahuje růstové faktory (EGF, PDGF,

   TGFp, NGF, IGF, 1/ FGF), 'cyt.okiny (IL-l, IL-2, TNF,. interferon, OSF), hormony (inzulín/ růstový hormon, • prolaktin, glukagon, thyroidní hormon, steroidní hormony)', cukry, rozpoznávající lektiny,. .imunoglobuliny, transf errin, lipoproteiny., vitamíny jako je B12, peptidové nebo neuropeptidové hormony (tachykiniy, neurotensin, VIP,, endotelin,. CGRP, CCK, a. další), nebo jakoukoliv jednotku' rozpoznávanou integriny, '.např. peptid RGD, nebo. dalšími proteiny na povrchu buněčné membrány.

   V

   23. Vektor pro přenos nukleóvých kyselin podle nároku 21, kde směrovací signál je intrácelulářní směrovací signál jako

   - 54 • ·· ·· ·· . »·' ·· »· · · · · · ·. · · · · · · · · · · · · ·· · • ··· · · · ··· · · · · · • .· · · ···· ····· ·· ·· ·♦ ·· je např. jaderná'lokalizační sekvence (NLS).

   24. Vektor pro přenos nukíeových kyselin podle nároku 23, kde· jaderná lokalizační sekvence je NLS sekvence T antigenů

   SV40. ,

   25. -Vektor pro přenos nukíeových - kyselin podle' nároku· 21, kde směrovací ' signál dovoluje . jak extracelulární tak intracelulární směrování.

   26. Vektor pro.přenos nukíeových kyselin. podle kteréhokoliv z nároků 1 '.až 25, kde vazby směrovacího , signálu s oligonukleotidem je dosaženo ' syntézou na) pevné fázi nebo v roztoku, . zejména vznikem disulfidických, ’ thioéterových, esterových, amidových· nebo aminových vazeb,. -'- · _; ' · · . ·

   27.. Přípravek v y z n a č u j · i c 1' se t i m> že obsahuje alespoň jeden vektor'..podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26.

   23Přípravek podle nároku 27 vyzná -č u j i c i se t i. m, že navíc obsahuje jedno nebo několik' transfekčních . činidel. . ' '

   29. Přípravek podle nároku t i m, ' že transfekční .28 , v y z n a č u j i c i s, e činidlo je -kationtový. lipid,lipopolyamin,něbo kationtový' polymer.

   30, Přípravek podlé, nároků 27. až 29 v y z- n a . č ují o i se ti m, že- navíc obsahuje jedno nebo několik adjuvans, která. jsou schopna kombinace s komplexem tvořeným vektorem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 24 • · · ·· ·· 99 99 • ·· · · · · ·

   9 9 9 9 9 9 9 9

   99 999999 99 9

   9 9 9 · ' 9 9 9 9

   9 9 9 99 99 9 9 ' ··

   55 a tranšfekčhim činidlem.

   31. Přípravek podle nároku t í m, . že adjuvans je

   30 v y z n a č u jící , se jeden,' nebo několik 'neutrálních lipidů-' vybraných . z přírodních nebo - syntetických' lipidů, které mají povahu zwitteridrttu nebo za .fyziologických podmínek postrádej i iontový náboj. . ¹

   32. Přípravek podle nároku 30 nebo 31 vyznačující se t í m, že -neutrální, lipid (lipidy) je' vybrán (jsou .- vybrány/ z lipidů obsahujících dva -mastné: řetězce. ,

   33. Přípravek -podle kteréhokoliv z-nároků - 30 až 32 vy z.n a č.u j i c i s e t i m,' že lipidy jsou vybrány ze ; skupiny obsahující * dioleoylfosfatidyletfanolamin (D.OPE)-,,-. , oleo.ylpalmitoylfosfatidyíetanolamin . ' (POPE.), di-steároyl, -palmltoyl, -mirystoylfosfatidyletanolaminy 'a jejich deriváty,’ .které jsou 1' až 3 x N-metylovaně,

   .fo.sfatidylglyderoly, ' diacylglycerolyz ’ glykosyldiacylglyceroly, ceřebrosidy (např. zejména y galaktocerebr.osidy) , sfingolipidy- (např..· zejména- sfingomveliny) nebo asialogangliosidy·(např. 'zejména asialoGMl a GM2).

   Přípravek ť i. m, že sloučeninu

   - podle ' 'nároku 30 adjuvans. buďto , která.se podílí na v y zna s auto -je kondenza č

   a ci u j· i c nebo

   DNA.

   i se' obsahuj e( ‘35. Přípravekpodle'' nároku' 34 vyznačuj i ,d i se (t i lůz že sloučenina je, zcela nebo částečně,, odvozena z histónu, nukleolinu a/.nebo protaminu, nebo, se skládá, zcela nebo' částečně·, z- peptidových' jednotek , (KTPKKAKKP) a/nebo (ATPAKKAA), opakovaných ve sledu . nepřerušené za

   - 56 » 99 99 ·· »· ·· ·· 0 · · · · · · · · ·

   9 4» 9 9 · · · ····' • ··♦ Ο · · ··· · · 9 « * « · 9 9 9 9 9 9 9

   999 99 99 '99 99 99.

   sebou nebo jinak, přičemž-jejichž počet je 2 až

   10.

   36, Přípravek . podle kteréhokoliv z nároků vyznačující' se tím,' farmaceuticky přijatelné vehikulum pro farmaceutické přípravky.

   27 až 35 že obsahuje inj ikovatelné

   37. Přípravek podle- kteréhokoliv z nároků 27 až · 35 vy značující se tím, že-- obsahuje farmaceuticky přijatelné- vehikulum pro aplikaci přípravku . na kůži a/nebo slizni-ce.

   33. Použití vektoru' pro. přenos nukleových kyselin podle kteréhokoliv z nároků '1 až . 26 pro . výrobu léku. ‘k léčení nemocí.

   '39. Způsob -transfekce vyznačující nukleových kyselin do buněk se ť i m, ze obsahuje krok, kdy se. ...

   1) syntetizuje chiméra oligonukleotid-směrovcí signál,

   -2). -chiméra připravená v kroku 1 'se přivede do kontaktu ,s dvojšroubovicovou DNA, takže vytvořítroj šroubovací,
3. 3) volitelné,' připraví se komplex vektoru získaného v kroku 2 s’jedním nebo několika transfekčními činidly a/nebo jedním nebo několika adjuvans, a . ' ¹
4. 4) . buňky, se .přivedou do kontaktu s komplexem- vytvořeným v kroku.2 nebo, je-li to vhodné, v kroku 3.

   40. Způsob léčení - nemocí spóčíváj ící · ' v tom, že se podává - vektor pro přenos nukleových kyselin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 6 obsahující', dvojšroubovicovou DNA schoonou léčení nemoci.

   - 57 ·· φ · • · φφφ «

   • ΦΦ φφ·. ΦΦ « · φ φ φ φ φ φ • · φ φφφ * φ ' φ

   ΦΦ ΦΦ • Φ . ΦΦ φφφ φ φ φ · · φφφ φ φ φφφ «φ ΦΦ

   41 ...Rekombinantní buňky, které obsahují vektor pro' přenos nukleových kyselin podle kteréhokoliv z nároků 1 až -26.

   42. Rekombinantní buňky podle nároku 41, ..které 'jsou eukaryotické buňky.