KR100377889B1 - 핵산을함유하는조성물,제조및용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 핵산 및 하나의 리포폴리아민으로 구성되는 조성물, 및 유전자 치료법에서, 특히 핵산의 생체내 전이를 위한 그의 이용에 관한 것이다.

Description

핵산을 함유하는 조성물, 제조 및 용도
본 발명은 핵산을 기재로 한 조성물, 그의 제조 및 용도에 관한 것이다. 보다 특별히, 본 발명은 적어도 하나의 핵산 및 하나의 리포폴리아민으로 구성되는 조성물 및 유전자 치료에서, 특별히 핵산의 전이를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
유전자 치료는 결함 또는 기형(돌연변이, 이상 발현등)을 교정하거나, 감염된 세포 또는 기관내로 유전 정보를 도입하므로써 치료학적으로 관심이 있는 단백질의 발현을 제공하는데 있다. 이 유전 정보는 기관으로부터 추출된 세포내로 시험관내에 (이때, 변형된 세포는 유기체내로 재도입된다) 또는 적당한 조직내로 생체내에 직접 도입될 수 있다. DNA와 DEAE-덱스트란(Pagano 일행, J. Virol., 1 (1967), 891), DNA와 핵 단백질(Kaneda 일행, Science, 243 (1989), 375), DNA와 지질(Felgner 일행, PNAS, 84 (1987), 7413) 및 DNA와 폴리리신의 복합체를 수반하는 여러가지 형질감염 기술, 리포좀의 사용(Fraley 일행, J. Biol. Chem., 255 (1980), 10431) 등을 포함하는 이러한 유전 정보의 전이를 위한 여러가지 기술이 서술되어 왔다. 보다 최근에, 유전자 전이용 벡터로서 바이러스의 사용은 이들 물리화학적 형질감염 기술에 대한 가망있는 대안으로 나타났다. 이 면에서, 여러가지 바이러스는 특정 세포 집단을 감염시키는 그들의 능력에 대해 테스트되었다. 특히, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스.
그러나, 이제까지 개발된 기술로 세포 및/또는 유기체내로의 유전자 전이에 관련된 어려움을 만족스럽게 해결하는 것이 가능하지 않다. 특히, 세포내로의 핵산의 침투에 관련된 문제점은 완전히 해결되지 않는다. 사실, 핵산의 다중음이온 성질은 세포막을 통한 그들의 통과를 막는다. 네이키드 핵산이 생체내 특정 세포 유형의 원형질막을 통해 통과할 수 있다는 것이 보여지는 한편(특별히, 출원 제 WO 90/11092 호 참고), 형질감염 효능은 꽤 낮은채 남아 있다. 더욱이, 네이키드 핵산은 효소에 의한 그들의 분해 및 요 경로에 의한 그들의 제거에 기인하여 짧은 혈장 반감기를 갖는다. 더욱이, 재조합 바이러스가 핵산의 전이 효능을 개선시키는 것을 가능하게 하는 한편, 그들의 사용은 병원성, 전반(傳搬), 복제, 재조합, 형질전환, 면역원성등 같은 특정 위험을 제공한다.
본 발명은 이들 여러가지 문제점에 대한 유리한 해답을 소개한다. 출원인 회사는 사실 핵산 및 리포폴리아민으로 구성되는 특정 조성물이 높온 효율과 독성이 없이 세포 및/또는 기관내로의 상기 핵산의 생체내 전이를 가능하게할 수 있다는 것이 보여졌다. 본 발명의 조성물은 바이러스 벡터의 사용에 연관된 불리점(잠재적 위험, 전이된 유전자의 제한된 크기, 높은 비용 등)을 피하는 것을 가능하게 한다.
세포 배양균의 시험관내 형질감염을 위한 특정 리포폴리아민의 사용은 이미 선행 기술에서 서술되었다. 이리하여, 출원 EP 394,111는 세포주의 시험관내 형질감염을 위한 특정 리포폴리아민의 사용을 서술한다. 또한, Demeneix 일행 (Int. J. Dev. Biol., 35 (1991), 481)에 의한 논문은 핵산의 생체내 형질감염을 위한 리포폴리아민(디옥타데실아미도글리실스페르민, DOGS)의 사용을 서술한다. 이들 문헌에따라, 리포폴리아민은 리포폴리아민의 양 전하/핵산의 음 전하 비가 2 내지 5이고, 바람직하게 3 또는 4와 같도록 하는 조건하에 사용되어야 한다. 그러나, 놀랍게도 본 명세서의 실시예 8 및 9에서 보여지는 바와 같이, 이들 문헌에서 서술되는 조건들중 어느 것도 핵산의 생체내 형질감염을 가능하게 하지 않는다. 음이온 고분자 또는 조직의 세포외 매트릭스와의 상호작용에 기인하여, 이들 조건들 하에 형성된 입자들도 사실 적용 부위로부터 확산될 수 없고 이에 따라 핵산을 생체내에서 전이할 수 없다. 더욱이, 이들 문헌에서 서술된 제조 조건은 유의한 양의 핵산을 함유하는 제약학적 조성물의 생성에 적용될 수 없다. 이제, 출원인 회사는 특정 조건하에, 리포폴리아민이 핵산의 생체내 형질감염을 위해 사용될 수 있다는 것을 보였다. 보다 특별히, 출원인 회사는 리포폴리아민의 양 전하/핵산의 음 전하 비가 2 이하도록 하는 조건하에 핵산 및 리포폴리아민으로 구성되는 조성물이 놀랍게도 높은 효율로 상기 핵산의 생체내 형질감염을 가능하게 한다는 것을 발견했다. 더욱이, 출원인 회사는 유의한 양의 핵산을 혼입하는 이들 제약학적 조성물의 제조를 가능하게 하는 특정 조건을 개발했다. 이리하여, 본 발명의 제약학적 조성물은 생체내 핵산의 투여 및 전이를 위한 특히 유리한 수단을 구성한다.
이리하여, 본 발명의 첫번째 목적은 비 R = 리포폴리아민의 양 전하/핵산의 음 전하가 2 이하인 적어도 하나의 핵산 및 하나의 리포폴리아민으로 구성되는 조성물에 있다.
본 발명의 의미내에, 용어 리포폴리아민은 적어도 하나의 친수성 폴리아민 영역 및 하나의 지질친화성 영역으로 구성되는 임의 양친매성 분자를 가리킨다. 리포폴리아민의 양이온으로 하전된 폴리아민 영역은 음으로 하전된 핵산과 가역적으로 결합할 수 있다. 이 상호작용은 핵산을 강하게 밀집시킨다. 지질치화성 영역은 지질층으로 형성된 핵지질 입자를 덮으므로써 이 이온성 상호작용을 외부 매질에 민감하지 않게 만든다.
유리하게, 본 발명의 문맥에서 사용된 리포폴리아민의 폴리아민 영역은 하기 일반식에 상응한다:
여기서, m은 2 이상의 정수이고, n은 1 이상의 정수이고, 이때 m이 두 아민들 사이에 포함된 다른 탄소기들 사이에 변하는 것이 가능하다. 우선적으로, m은 2 내지 6이고, n은 1 내지 5 이다. 훨씬 더 우선적으로, 폴리아민 영역은 DNA에 결합하는 특성을 보유한 스페르민 또는 스페르민 동족체로 대표된다.
지방친화성 영역은 층상 또는 육방정계 상을 형성할 수 있는 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬, 콜레스테롤, 천연 지질 또는 합성 지질일 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 특허 출원 EP 394,111에서 정의된 바와 같은 리포폴리아민이 유리하게 사용된다. 이 출원은 또한 이들 리포폴리아민의 제조를 위해 사용될 수 있는 방법을 서술한다.
본 발명의 문맥에서, 특히 유리하게 디옥타데실아미도글리실스페르민(DOGS) 또는 팔미토일포스파티딜에탄올아민의 5-카르복시스페르밀아미드(DPPES)가 사용된다.
본 발명의 조성물의 최적 효과를 얻기 위해, 폴리아민 및 핵산의 각각의 비율은 바람직하게 리포폴리아민의 양 전하/핵산의 음 전하 비 R이 0.1 내지 1.9이고, 보다 우선적으로 0.5 내지 1.5 이도록 결정된다.
본 발명의 조성물에서, 핵산은 데옥시리보핵산 및 리보핵산 모두일 수 있다. 천연 또는 인공 기원의 서열 및 특별히 게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반-합성 서열이 존재할 수 있다. 이들 핵산은 사람, 동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스 기원등의 것일 수 있다. 그들은 당업자에게 공지된 임의 기술 및 특별히 스크리닝 뱅크, 화학적 합성, 또는 대안적으로 스크리닝 뱅크에 의해 얻어진 서열의 화학적 또는 효소 변형을 포함하는 혼합된 방법에 의해 얻어질 수 있다. 그들은 더욱이 폴라스미드 벡터같은 벡터내에 혼입될 수 있다.
보다 특별히 데옥시리보핵산에 관해, 그들은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이들 데옥시리보핵산은 치료학적 유전자, 전사 또는 복제를 조절하는 서열, 안티센스 서열, 다른 세포 성분에 대한 결합을 위한 영역등을 운반할 수 있다.
본 발명의 의미내에, 치료학적 유전자는 특별히 치료학적 효과를 갖는 단백질 생성물에 대한 임의 유전자 암호화를 의미하는 것으로 이해된다. 이렇게 암호화된 단백질 생성물은 단백질, 펩티드등일 수 있다. 이 단백질 생성물(즉, 표적 세포가 임의 병변을 보이지 않을 때 표적 세포내 정상적으로 발현된 생성물)은 표적 세포에 대해 상동일 수 있다. 이 경우에, 단백질의 발현은 예컨대 반형에 기인하여 불활성 또는 약하게 활성인 단백질의 발현 또는 세포내 불충분한 발현을 극복하거나, 또는 대안적으로 상기 단백질을 과발현시키는 것을 가능하게 한다. 치료학적 유전자는 또한 증가된 안정도, 변형된 활성등을 갖는 세포 단백질의 돌연변이체를암호화할 수 있다. 단백질 생성물은 또한 표적 세포에 대해 이종일 수 있다. 이 경우에, 발현된 단백질은 예컨대 세포내 부족한 활성을 보충하거나 기여할 수 있고, 이는 그것이 병변을 억제하거나 면역 반응을 촉진하는 것을 가능하게 한다.
보다 특별히, 본 발명의 의미내의 치료학적 생성물중에, 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포킨: 인터루킨, 인터페론, TNF등 (FR 9,203,120), 성장 인자, 신경 전달 물질 또는 그들의 전구체 또는 합성을 위한 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀(pleiotrophin)등, 아포리포프로테인: ApoAI, ApoAIV, ApoE 등 (FR 93 05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91 11947), 췌장섬유증과 연관된 단백질 CFTR, 종양-억제인자 유전자: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev 등 (FR 93 04745), 응혈에 연관된 인자를 암호화하는 유전자: Factors Ⅶ, Ⅷ 또는 Ⅸ, DNA의 수복에 참여하는 유전자, 자기 불활화 유전자(티미딘 키나제, 시토신 디아미나제)등이 언급될 수 있다.
치료학적 유전자는 또한, 표적 세포내 발현이 세포 mRNA 전사 또는 유전자 발현을 조절하는 것을 가능하게 하는 안티센스 서열 또는 유전자일 수 있다. 예컨대, 상기 서열은 특허 EP 140 308에서 서술된 기술에 따라, 세포 mRNA의 상보적 RNA로서 표적 세포내에서 전사되어 단백질로의 그들의 해독을 차단할 수 있다. 안티센스 서열은 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 리보짐을 암호화하는 서열을 포함한다(EP 321,201).
상기 언급되는 바와 같이, 핵산은 또한 사람 또는 동물에 면역 반응을 생성할 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 하나 또는 많은 유전자를 포함할 수 있다. 이 특별한 실시양태에서, 본 발명은 사람 또는 동물에, 특별히 미생물, 바이러스 또는 암에 대해 적용된 백신 또는 면역치료학적 치료제의 생산을 가능하게 한다. 그것은 또한 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스, (EP 185,573) 또는 의-광견병 바이러스에 특이적인 또는 대안적으로 종양(EP 259,212)에 특이적인 항원성 펩티드에 관여할 수 있다.
핵산은 또한 우선적으로 치료학적 유전자 및/또는 원하는 세포 또는 기관 내 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 가능하게 하는 서열을 포함한다. 이들은 이들 서열이 감염된 세포에서 작업할 수 있을 때 고려하에 유전자의 발현에 천연적으로 책임이 있는 서열일 수 있다. 그들은 또한 (다른 단백질 또는 합성 단백질의 발현에 책임이 있는) 다른 기원의 서열일 수 있다. 그들은 특별히 진핵 세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예컨대, 그들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 결과된 프로모터 서열일 수 있다. 달리, 그들은 바이러스의 게놈으로부터 결과되는 프로모터 서열일 수 있다. 이 면에서, 예컨대, E1A, MLP, CMV 또는 RSV 유전자등의 프로모터가 언급될 수 있다. 이들 발현 서열은 부가적으로 활성화 서열, 조절 서열등의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
더욱이, 핵산은 또한 특히 치료학적 유전자의 업스트림, 즉 합성된 치료학적 생성물을 표적 세포의 분비 경로에서 지시하는 시그날 서열을 포함한다. 이 시그날 서열은 치료학적 생성물의 천연 시그날 서열일 수 있으나, 그것은 또한 임의 다른 기능적 시그날 서열 또는 인공 시그날 서열일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 핵산, 리포폴리아민 및 리포폴리아민/핵산 복합체와 결합하고 형질감염 능력을 향상시킬 수 있는 보조제로 구성되는 조성물에 관한 것이다. 출원인 회사는 사실 리포폴리아민의 형질감염 능력이 리포폴리아민/핵산 복합체와 결합할 수 있는 특정 보조제(예컨대, 지질 또는 단백질)의 존재하에 기대치 않게 증가될 수 있다는 것을 보였다. 본 명세서의 실시예 4 내지 7에서 보여지는 바와 같이, 이 개선점은 시험관내 및 생체내 모두에서 나타난다.
보다 우선적으로, 본 발명의 조성물은 보조제로서 하나의 또는 많은 중성 지질을 포함한다. 상기 조성물은 특별히 비 R이 낮을 때 특히 유리하다. 출원인 회사는 사실 중성 지질의 첨가가 핵지질 입자의 형성을 개선하고, 놀랍게도 그의 말을 불안정화 시키므로써 세포 내로의 입의 침투를 촉진하는 것을 가능하게 한다는 것을 보였다.
보다 우선적으로, 본 발명의 문맥에서 사용된 중성 지질을 2개의 지방산 사슬을 함유하는 지질이다.
특히 유리한 방식에서, 생리학적 조건하에 쯔비터 이온성이거나 또는 이온 전하가 없는 천연 또는 합성 지질이 사용된다. 그것은 보다 특별히 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디스테아로일-, -팔미토일 또는 -미리스토일포스파티딜- 에탄올아민 및 그들의 1 내지 3 배 N-메틸화 유도체 ; 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드 (예컨대, 특별히 갈락토세레브로시드), 스핀고리피드(예컨대, 특별히 스핀고미엘린) 또는 대안적으로 아시알로간글리오사이드 (예컨대, 특별히아시알로GM1 및 아시알로GM2)로 부터 선택될 수 있다.
이들 여러 가지 지질은 당업자에게 잘 공지된 통상의 기술에 의해 기관(예컨대 : 뇌) 또는 난으로부터 합성 또는 추출에 의해 얻어질 수 있다. 특히, 천연 지질의 추출은 유기 용매에 의해 수행될 수 있다(또한, Lehninger, Biochemistry 참고).
본 발명의 조성물은 우선적으로 리포폴리아민의 1 당량 당 0.1 내지 20 당량, 및 보다 우선적으로 1 내지 5 당량의 보조제를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 국소적, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구적, 비내(鼻內), 정맥내, 근육내, 피하, 안내(眼內) 및 경피 투여등의 목적을 위해 배합될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물은 바람직하게 주입가능한 배합물에 대해, 특별히 원하는 기관내로 직접 주입을 위해 또는 국소적 투여(피부 및/또는 점막상에)를 위해 허용가능한 제약학적 부형제를 함유한다. 그들은 특히, 상황에 따라 멸균수 또는 생리학적 혈청의 첨가로써 주입가능한 용액을 제조하는 것을 가능하게 하는 등장성 멸균 용액 또는 특별히 동결건조된 건조한 조성물일 수 있다. 주입에 사용된 핵산의 투여량뿐만 아니라 투여 횟수는 여러가지 파라미터에 따라, 특별히 사용된 투여 방법, 고려점하에 병변, 발현될 유전자 또는 대안적으로 원하는 치료 기간의 함수로서 변할 수 있다.
이리하여, 본 발명은 특히 상기 정의된 조건하에 리포폴리아민과 함께 상기 질병을 고칠 수 있는 핵산의 생체내 투여로 구성되는 질병의 치료를 위한 유리한 방법을 제공한다. 보다 특별히, 이 방법은 단백질 또는 핵 생성물 결핍으로 인한질병에 적용될 수 있고, 투여된 핵산은 상기 단백질 생성물을 코팅하거나, 상기 핵 생성물을 함유한다.
본 발명은 하기 실시예를 사용하여 보다 완전히 서술될것이고, 이는 설명적이고 제한적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1 - 생체내 유전자 전이를 위해 사용된 플라스미드
본 발명의 조성물의 활성을 증명하기 위해 세유형의 작제물을 사용했다 : 루시페라제(LUC)를 코팅하는 유전자를 함유하는 플라스미드, β-갈락토시다제를 코팅하는 유전자(LacZ 유전자)를 함유하는 플라스미드 및 클로람페니콜 아세틸트란스페라제(CAT)를 코팅하는 유전자를 함유하는 플라스미드.
1.1 Luc 유전자를 함유하는 플라스미드
pCMV-luc 플라스미드는 제한 효소 Mlu Ⅰ및 Hind Ⅲ로 절단하므로써 플라스미드 벡터 pcDNA3(Invitrogen)로 부터 추출되고, 루시페라제를 암호화하는 유전자의 업스트림에 위치되고, 벡터 pGL 기본 벡터(Promega) 내 Mlu Ⅰ및 Hind Ⅲ부위에서 삽입되는 시토메갈로바이러스(CMV)의 프로모터를 함유한다.
1.2. LacZ 유전자를 함유하는 플라스미드 pCMV-βGal 플라스미드(Clontech)는 대장균 (Escherichia coli)의 β-갈락토시다제를 암호화하는 LacZ 유전자의 업스트림에 위치된 CMV 프로모터를 함유한다. pSV-nls LacZ (pAOnlsLacZ) 벡터는 같은 프로모터 및 LacZ 유전자의 업스트림에 상으로 위치된 (SV40 바이러스로 부터 결과된) 핵내 국재 서열을 함유한다. 이 작제 세포의 핵내 nls-β-갈락토시다제 융합단백질의 발현을 가능하게 한다(참조. De Luze 일행, PNAS, 90 (1993), 7322).
1.3. CAT 유전자를 함유하는 플라스미드
리포터(reporter) 유전자에 대해, RSV (pRSV-CAT) 및 SV40(PSV40-CAT) 프로모터의 조절하에 클로람페니콜 아세틸트란스페라제(CAT)를 암호화하는 유전자를 갖는 플라스미드가 발표되었다(Boutiller 일행, Drog. NeuroPhychopharmacol 및 Biol. Psychiat, 16(192), 959 ; de Luze 일행, PNAS, 90(1993), 7322).
실시예 2 - 비 R=0.8로의 리포폴리아민의 사용에 의한 신생 마우스의 뇌로의 핵산의 생체내 전이
본 실시예는 신생 마우스의 뇌내로 pCMV-luc 플라스미드를 생체내 전이시키는 것을 서술한다.
pCMV-luc 플라스미드(실시예 1.1) 30㎍을 150mM 멸균 NaCl (1㎍/㎕의 농도) 30㎕에 희석시켰다. 그리고나서 100% 에탄올내 제조된 40mM 디옥타데실아미도글리실스폐르민(DOGS) 0.6㎕를 첨가했다.
혼합물을 빨리 휘젓고 신생 마우스내에 뇌내 주입을 위해 사용했다. 이를 행하기 위해, 마우스를 냉각에 의해 마취시키고 (얼음과 접촉하여 알루미늄 시이트상에 놓여지고), 그후에 혼합물 2㎕ (핵산 2㎍)을 마우스마다 주사했다. 마이크로전극에 연결된 미량 주사기 및 미량 조작기를 사용하여 피질내로 주사했다.
뇌를 48시간 후에 적출하고, 균질화시키고, 원심분리시키고, 상등액을 루시페라제를 정량적으로 측정하기 위해 사용했다. 이를 행하기 위해, 상등액을 루시페린, 조효소 A 및 ATP로 구성되는 완충액의 존재하에 항온처리하고, (일반적으로 10초 동안) 방출된 빛을 광온도계로 측정했다(Wood K. (1990) Promega Notes, 28).
얻어진 결과는 전이가 플라스미드 단독에 의해 수행될때 100 RLU/뇌(10마리 동물의 평균) (RLU = 상대 광 단위)의 표준 활성에 대한, R=0.8인 본 발명에 따른 조성물에 의해 전이가 수행될 때 425 RLU/뇌(10마리 동물의 평균)의 표준 상대 광 단위로서 활성을 보인다.
실시예 3 - 비 R-1.5 및 0.8로의 리포폴리마민의 사용예 의한 신생 마우스의 뇌내로의 핵산의 생체내 전이의 비교
3.1 pCMV-luc 플라스미드의 전이
비 R=0.8에 대해, 조건은 실시예 2의 조건이다. 비 R=1.5에 대해, pCMV-luc 플라스미드(실시예 1.1) 30㎍을 150mM 멸균 NaCl (1㎍/㎕의 농도) 30㎕에 희석시켰다. 그리고나서 100% 에탄올에서 제조된 40mM 디옥타데실아미도글리실스페르민(DOGS) 1.13㎕를 첨가했다.
혼합물을 빨리 휘젓고 신생 마우스내에 뇌내 주입을 위해 사용했다. 이를 행하기 위해, 마우스를 냉각에 의해 마취시키고 (얼음과 접촉하여 알루미늄 시이트상에 놓여지고), 그후에 혼합물 2㎕ (핵산 2㎍)을 마우스마다 주사했다. 마이크로전극에 연결된 미량 주사기 및 미량 조작기를 사용하여 피질내로 주사했다. 실시예 2에서 서술된 절차에 따라, 뇌를 48시간 후에 적출하고, 균질화시키고, 원심분리시키고, 상등액을 루시페라제를 정량적으로 측정하기 위해 사용했다. 얻어진 결과는 비 R=0.8의 본 발명의 조성물에 의해 전이가 수행될 때 100 RUL/뇌 (11마리 동물의 평균)의 표준 활성에 대한, 비 R=1.5인 본 발명의 조성물에 의해 전이가 수행될때89 RLU/뇌 (12마리 동물의 평균)의 표준활성을 보인다.
3.2. PSV-nls LacZ 플라스미드의 전이
SV40(simian virus 40) 포르모터의 조절하에 β-갈라토시다제를 암호화하는 LacZ 유전자를 함유하는 pSV-nls LacZ 플라스미드를 형질감염하기 위해 상기 실시예 3.1. 에서와 같은 절차를 사용했다. 이 작제물 (실시예 1.2.)은 또한 핵내 국재를 신호하는 펩티드틀 암호화한다. 이리하여, 효소 β-갈락토시다제를 핵을 향해 수송하고, 핵산에 의해 생성될 효소 반응은 이 아세포 영역에 제한된다. pCMV-luc 플라스미드에 대해서와 같은 방식으로 주사하고, 뇌를 48시간 후-형질감염에 적출하고, 24시간동안 파라포름알데히드(2%)내에서 고정시키고나서, β-갈락토시다제 반응에 대해 처리했다. 그리고나서, 뇌를 발현 부위에 대해 시험하고, 양의 영역을 저온조(15㎛)내에서 절단하고, 슬라이드에 놓고, 사진찍었다. 2개의 독립된 일련의 실험에서, 10중 3마리의 동물이, 주사 영역주위에 위치된 영역에서, 핵이 β-갈락토시다제 활성의 특징인 매우 뚜렷한 푸른 착색을 갖는 세포 그룹을 보인다.
실시예 4 - 핵산의 시험관내 전이 :
리포폴리아민/보조제 비의 최적화
본 실시예는 여러 조건하에 핵산, 리포폴리아민 및 보조제(중성 지질)로 구성되는 본 발명에 따른 조성물에 의한 (세로 배양액상) 핵산의 시험관내 전이를 서술한다. 105세포의 3T3 섬유아세포 및 HepG2 사람 간암세포주를
-하전비 R=1 및 1.5으로 DOGS의 존재하에
-1,2,5 또는 10 당량의 보조제(DOPE)의 부재 또는 존재하에 여러 조건하에 각각 pCMV-βGal 또는 pCMV-Luc 플라스미드 1 및 2㎍의 존재하에 항온처리했다.
그리고나서, 형질감염 능력을 루시페라제에 대해 실시예 2에서 서술된 조건하에 또는 LacZ 활성에 대해 뚜렸한 청색 착색을 갖는 세포의 백분율을 측정하므로써 결정했다. 얻은 결과를 하기 표에서 제공한다.
실시예 5 - 비 R = 1 로의 리포폴리아민 및 중성 지질의 사용에 의한 신생 마우스의 뇌내로의 핵산의 생체내 전이
본 실시예에서, DOGS 의 40 mM 에탄올 용액을 클로로포름/에탄올(1/5) 혼합물내에서 제조된 80 mM 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)용액 동량과 혼합했다. 이리하여, 1 당량의 DOGS 에 대해, 조성물은 2 당량의 DOPE 를 함유한다.
pCMV-luc 플라스미드 (실시예 1.1) 30 ㎍ 을 150 mM 멸균 NaCl (1
㎍/㎕ 의 농도) 30㎕ 내에서 희석시켰다. 그리고나서, 상기 제조한 DOGS/DOPE 혼합물 1.5㎕ 를 첨가했다.
절차의 나머지 (주사, 적출, 정량적인 결정)는 실시예 3.1 에서 서술한 것과 동일하다. 얻어진 결과는 같은 하전비 R = 1 로 DOGS 단독의 존재 하에 전이될 때 100 RLU/뇌 (13 마리 동물의 평균)의 표준화된 활성에 대해, 보조제 (중성 지질)의 존재하에 전이될 때 241 RLU/뇌 (13 마리 동물의 평균)의 표준 활성을 보인다.
실시예 6 - 비 R = 1.25 로의 리포폴리아민 및 중성 지질의 사용에 의한 신생 마우스의 뇌내로의 핵산의 생체내 전이
본 실시예에서, 40 mM 에탄올 DOGS 용액을 클로로포름/에탄올(1/5) 혼합물내에서 제조된 80 mM 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)용액 동량과 혼합했다. 이리하여, 1 당량의 DOGS 에 대해, 조성물은 2 당량의 DOPE 를 함유한다.
pCMV-luc 플라스미드 (실시예 1.1) 30 ㎍ 을 150 mM 멸균 NaCl (1㎍/㎕ 의 농도) 30㎕ 내에서 희석시켰다. 그리고나서, 상기 제조한 DOGS/DOPE 혼합물 1.87㎕ 를 첨가했다.
절차의 나머지 (주사, 적출, 정량적인 결정)는 실시예 3.1 에서 서술한 것과 동일하다. 얻어진 결과는 같은 하전비 R = 1.25 로 DOGS 단독의 존재하에 전이될 때 100 RLU/뇌 (8 마리 동물의 평균)의 표준화된 활성에 대해, 보조제의 존재 하에 전이될 때 405 RLU/뇌 (8 마리 동물의 평균)의 표준 활성을 보인다.
실시예 7 - 비 R = 1.5 로의 리포폴리아민 및 중성 지질의 사용에 의한 신생마우스의 뇌내로의 핵산의 생체내 전이
본 실시예에서, 40 mM 에탄올 DOGS 용액을 클로로포름/에탄올(1/5) 혼합물내에서 제조된 80 mM 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)용액 동량과 혼합했다. 이리하여, 1 당량의 DOGS 에 대해, 조성물은 2 당량의 DOPE 를 함유한다.
pCMV-luc 플라스미드 (실시예 1.1) 30 ㎍ 을 150 mM 멸균 NaCl (1㎍/㎕ 의 농도) 30㎕ 내에서 희석시켰다. 그리고나서, 상기 제조한 DOGS/DOPE 혼합물 2.26㎕ 를 첨가했다.
절차의 나머지 (주사, 적출, 정량적인 결정)는 실시예 4.1 에서 서술한 것과 동일하다. 얻어진 결과는 같은 하전비 (R = 1.5)로 DOGS 단독에 의해 전이될때 100 RLU/뇌 (11마리 동물의 평균)의 표준화된 활성에 대해, 보조제 (중성 지질)를 함유하는 본 발명의 조성물에 의해 전이될때 165 RLU/뇌 (10 마리 동물의 평균)의 표준 활성을 보인다.
실시예 8 - 비 R = 3 로의 리포폴리아민의 사용에 의한 마우스내 핵산의 생체내 전이
본 실시예는 성숙한 마우스에 pCMV-luc 플라스미드의 생체내 전이를 서술한다. 펜토바르비탈로 마취된 성숙한 마우스를 실험했다.
8.1 정맥 경로에 의한 전이
각 마우스에 대해, pCMV-luc 플라스미드 100㎍ 을 150mM NaCl 100㎕ 내에서 희석시켰다. 그리고나서, 40mM DOGS 7.5㎕ 를 용액에 첨가했다. 그리고나서, 마우스의 경정맥을 해부에 의해 노출시키고, 상기 용액을 심장 방향으로 경정맥내로 주입했다. 그리고나서, 피부를 클립으로 다시 밀폐했다. 주사 48 시간 후에, 마우스는 경부 탈구에 의해 죽고 간, 폐, 비장, 뇌, 신장 및 골격근의 샘플을 적출했다. 균질화 및 원심분리후에, 상등액을 루시페라제를 정량적으로 결정하기 위해 사용했다. 이 실험을 4 마리 마우스에 대해 수행했다. 루시페라제의 발현은 테스트된 여러 조직에서 나타나지 않았다.
8.2 근육내 경로에 의한 전이
pCMV-luc 플라스미드 60㎍ 을 150mM NaCl 300㎕ 내에 희석시켰다. 그리고나서, 40mM DOGS 4.5㎕ 를 용액에 첨가했다. 그리고나서, 상기 제조한 혼합물 50㎕ (DNA 10㎍)을 각 마우스에 피부를 통해 전방 경골근내로 주사했다. 주사 48시간 후에, 마우스는 경부 탈구에 의해 죽고, 주사된 근육을 적출했다. 균질화 및 원심분리후에, 상등액을 루시페라제를 정량적으로 결정하기 위해 사용했다. 이 실험을 6 마리 마우스에 대해 수행했다. 루시페라제의 발현은 감지되지 않았다.
실시예 9 - 비 R = 4 로의 리포폴리아민의 사용에 의한 마우스내 핵산의 생체내 전이
본 실시예는 성숙한 마우스에 pCMV-luc 플라스미드의 생체내 전이를 서술한다. 펜토바르비탈로 마취된 성숙한 마우스를 실험했다.
9.1 정맥 경로에 의한 전이
각 마우스에 대해, pCMV-luc 플라스미드 100㎍ 을 150mM NaCl 100㎕ 내에서 희석시켰다. 그리고나서, 40mM DOGS 10㎕ 를 용액에 첨가했다. 그리고나서, 마우스의 경정맥을 해부에 의해 노출시키고, 상기 용액을 심장 방향으로 경정맥내로 주입했다. 그리고나서, 피부를 클립으로 다시 밀폐했다. 주사 48 시간 후에, 마우스는 경부 탈구에 의해 죽고 간, 폐, 비장, 뇌, 신장 및 골격근의 샘플을 적출했다. 균질화 및 원심분리후에, 상등액을 루시페라제를 정량적으로 결정하기 위해 사용했다. 이 실험을 4 마리 마우스에 대해 수행했다. 루시페라제의 발현은 테스트된 여러 조직에서 나타나지 않았다.
9.2 근육내 경로에 의한 전이
pCMV-luc 플라스미드 60㎍ 을 150mM NaCl 300㎕ 내에 희석시켰다. 그리고나서, 40mM DOGS 6㎕ 를 용액에 첨가했다. 그리고나서, 상기 제조한 혼합물 50㎕ (DNA 10㎍)을 각 마우스에 피부를 통해 전방 경골근내로 주사했다. 주사 48 시간 후에, 마우스는 경부 탈구에 의해 죽고, 주사된 근육을 적출했다. 균질화 및 원심분리후에, 상등액을 루시페라제를 정량적으로 결정하기 위해 사용했다. 이 실험을 6 마리 마우스에 대해 수행했다. 루시페라제의 발현은 감지되지 않았다.

Claims (22)

  1. 핵산의 음 전하에 대한 리포폴리아민의 양전하의 비(R)가 2 이하이고, 핵산 및 리포폴리아민을 포함하며, 핵산의 세포에 대한 생체내(in vivo) 형질 감염에 효과적인 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 리포폴리아민이 일반식
    H2N-(-(CH)m-NH-)n-H (여기서, m은 2 이상의 정수이고, n은 1 이상의 정수이며, 이때 m은 2개의 아민들 사이에 포함된 다른 탄소기들 사이에 변하는 것이 가능하다)의 적어도 하나의 친수성 폴리아민 영역 및 충상 또는 육방정계 상을 형성할 수 있는 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬, 콜레스테롤, 천연 지질 또는 합성 지질일 수 있는 지질친화성 영역으로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, m이 2 내지 6이고, n이 1 내지 5인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 폴리아민 영역이 DNA에 결합하는 특성을 보유한 스페르민 또는 스페르민의 동족체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 리포폴리아민이 DOGS 및 DPPES로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 핵산이 리보핵산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 핵산이 화학적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 안티센스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 치료 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비 R이 0.1 내지 1.9인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 비 R이 0.5 내지 1.5인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 핵산, 제2항에서 정의된 바와 같은 리포폴리아민 및 리포폴리아민/핵산 복합체와 결합할 수 있고 그의 형질감염능을 향상시킬 수 있는 보조제로 구성되는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 보조제가 하나 또는 많은 중성 지질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 중성 지질이 생리학적 조건하에 쯔비터 이온성이거나 이온 전하가 없는 합성 또는 천연 지질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 중성 지질이 2개의 지방산 사슬을 함유하는 지질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 중성 지질이 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디스테아로일-, -팔미토일- 또는 -미리스토일포스파티일-에탄올아민 및 그들의 1 내지 3배 N-메틸화 유도체; 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드(예컨대, 특별히 갈락토세레브로시드), 스핀고리피드(예컨대, 특별히 스핀고리엘린) 및 아시알로간글리오사이드(예컨대, 특별히 아시알로GM1 및 아새알로GM2)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 리포폴리아민이 제3항 내지 제5항중 어느 한 항에 따라 정의되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제13항에 있어서, 핵산의 음 전하에 대한 리포폴리아민의 양전하의 비(R)가 2이하인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제13항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 리포폴리아민 1 당량당 0.1 내지 20 당량, 보다 우선적으로 1 내지 5 당량의 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 가능한 배합물에 대해 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 점막상에 적용하기 위해 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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