KR100424802B1 - 핵산-함유조성물,이의제조방법및용도 - Google Patents

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Abstract

하나 이상의 핵산 및 양이온 중합체를 함유하는 조성물, 및 특히 생체내 핵산 전달을 위한 유전자 치료에서의 이의 용도.

Description

핵산-함유 조성물, 이의 제조 방법 및 용도
유전자 치료는 결함 또는 비정상(돌연변이, 이상 발현등)을 교정하거나 질병에 걸린 세포 또는 기관내로 유전 정보를 도입하므로써 치료학적 가치의 단백질 발현을 달성하는데 있다. 이러한 유전 정보는 시험관내에서 기관으로부터 추출된 세포로 도입하고, 이어서 변형된 세포를 체내로 재도입하거나, 생체내에서 적당한 조직내로 직접 도입될 수 있다. DNA와 DEAE-덱스트란[참조문헌: Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], DNA와 핵단백질 [참조문헌: Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], DNA와 지질 [참조문헌: Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413] 및 DNA와 폴리리신의 복합물, 리포솜의 사용 [참조문헌: Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431]등을 수반하는 다양한 형질감염 기술을 포함하는, 이러한 유전 정보를 전달하기 위한 상이한 기술이 서술되어왔다. 최근에, 유전자 전달을 위한 백터로서 바이러스의 사용이 이러한 물리화학적 형질감염 기술의 유망한 대안으로서의 조짐을 보인다. 이와 관련하여, 다른 바이러스들은 특정 세포군을 감염시키기 위한 이들의 액량에 대해 시험되었다. 특히, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스가 언급될 수 있다.
그러나, 지금까지 개발된 기술은 세포 및/또는 체내로의 유전자 전달과 연관된 어려움을 만족스럽게 해결할 수 없다. 특히, 세포내로의 핵산 도입과 연관된 문제점은 완전하게 해결되지 않는다. 실제로, 핵산의 다가음이온성은 특히, 세포막을 통한 이들의 통과를 막는다. 네이키드(naked) 핵산은 생체내에서 일부 세포 유형의 원형질막을 통하여 통과할 수 있지만(특히, 출원 제 WO90/11092 를 참조), 형질감염의 효율은 오히려 낮게 유지되는 것으로 나타났다. 더구나, 네이키드 핵산은 효소에 의한 이들의 분해 및 뇨에서의 이들의 제거로 인해 짧은 혈장 반감기를 갖는다. 더구나, 재조합 바이러스는 핵산의 전달 효율을 개선시킬 수 있지만, 이들의 사용은 병원성, 유전, 복제, 재조합, 형질전환, 면역원성등과 같은 일부 위험이 존재한다. 게다가, 우수한 제조 실행의 명세서에 따른 이들의 생성에 일부 어려움이 존재한다.
본 발명은 핵산을 기본으로 하는 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 적어도 하나의 핵산 및 일부 양이온 중합체를 포함하는 조성물, 및 특히 유전자 치료에서의 세포내로의 핵산 전달에 대한 이들의 용도에 관한 것이다.
도 1: (중합체 아민/핵산 포스페이트) 비 R로 나타낸 pH7에서 PEI800K의 형질감염 효율.
도 2: DNA의 양으로 나타낸 pH6에서 PEI800K의 형질감염 효율.
도 3: 비 R로 나타낸 pH6에서 PEI800K의 형질감염 효율.
도 4: pH로 나타낸 PEI800K의 형질감염 효율.
도 5: PEI800K와 폴리리신간의 비교.
도 6: PEI50K의 세포독성 시험.
도 7: 보조제의 존재하에 PEI50K의 형질감염 효율.
도 8: HeLa 세포의 형질감염에 대한 PEI의 효율.
도 9: 간 및 신장 세포의 형질감염에 대한 PEI의 효율.
도 10: 태아 뉴런내로의 플라즈미드 DNA의 전달에 대한 PEI의 효율.
도 11: 태아 뉴런내로의 올리고뉴클레오티드의 전달에 대한 PEI의 효율.
도 12: 생체내 DNA 전달에 대한 PEI의 효율.
본 발명은 이러한 다른 문제점에 대한 유리한 해결책을 제공한다. 본 출원인은 일부 양이온 중합체가 시험관 및 생체내 모두에서 세포내로 핵산을 전달하기 위한 특히 유리한 성질을 가지고 있음을 실제로 보인다. 추가로, 이러한 중합체는 손쉽게 구할 수 있고 가격이 저렴하다는 이점을 갖는다. 본 발명에 따른 양이온 중합체의 사용으로 또한 바이러스성 벡터의 사용과 연관된 단점(잠재적 위험, 전달된 유전자의 제한된 크기, 높은 가격 등)을 피할 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명은 화학식 (I)의 중합체의 전달 특성을 설명하는 데 있다:
Figure pct00001
상기식에서,
R은 수소원자 또는 화학식
Figure pct00002
의 그룹일 수 있고,
n은 2 내지 10의 정수이며;
p 및 q는 정수이며,
p와 q의 합은 중합체의 평균 분자량 100 내지 107Da이 되도록 하는 값이다.
화학식 (I)에서, n의 값은 상이한 단위 p사이에서 변할 수 있는 것으로 이해되어진다. 따라서, 화학식 (I)은 동종중합체 및 이종중합체 모두를 포함한다.
따라서, 본 발명의 제 1 요지는 상술된 적어도 하나의 핵산 및 화학식 (I)의 양이온 중합체를 포함하는 조성물이다.
본 발명은 또한 세포내로의 핵산 전이를 위한 화학식 (I)의 양이온 중합체의용도에 관한 것이다.
보다 바람직하게는, 화학식 (I)에서 n은 2 내지 5이다. 특히, 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리프로필렌이민(PPI) 중합체는 모두 유리한 성질을 갖는다.
본 발명을 수행하기 위한 바람직한 중합체는 분자량이 103내지 5×106인 것들이다. 예를 들면, 평균 분자량 50,000 Da의 폴리에틸렌이민 (PEI50K) 또는 평균 분자량 800,000 Da의 폴리에틸렌이민(PEI800K)이 언급될 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용된 중합체는 상이한 방식으로 수득될 수 있다. 이들은 우선, 음이온 중합 조건(예를 들면, 에틸렌이민의 중합)하에 상응하는 단량체로부터, 또는 이가산과 디아민의 중축합에 의해 수득된 폴리아미드의 환원에 의해, 또는 대안적으로 디알데히드와 디아민의 중축합에 의해 수득된 이민의 환원에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 더구나, 많은 이러한 중합체가 특히, PEI50K 또는 PEI800K 같이 시판되고 있다.
본 발명의 조성물의 최적 효과를 얻기 위해서, 중합체 및 핵산의 각각의 비율은 바람직하게는 몰비 R = 중합체 아민/핵산 포스페이트가 0.5 내지 50, 보다 바람직하게는 5 내지 30인 방식으로 결정된다. 가장 특별하게 이로운 결과는 핵산 전하당 5 내지 15 당량의 중합체 아민을 이용하여 얻어진다. 이러한 비는 사용된 보조제(하기 참조)의 존재, 핵산, 표적 세포 및 사용된 투여 모드에 따라 당해분야의 기술자에 의해 자연스럽게 적용될 수 있다.
본 발명의 조성물에서, 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 당해 서열은 천연또는 인위적 기원, 특히 게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, 하이브리드 서열 또는 합성되거나 반-합성된 서열일 수 있다. 추가로, 핵산은 올리고뉴클레오티드에서 염색체에 걸쳐, 크기면에서 아주 가변적일 수 있다. 이러한 핵산은 사람, 동물, 식물, 세균, 바이러스 등의 기원일 수 있다. 이들은 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 기술, 특히 라이브러리의 스크리닝, 화학적 합성 또는 대안적으로 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득된 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합된 방법에 의해 수득될 수 있다. 이들은 더구나, 플라즈미드 벡터 같은 벡터내로 혼입될 수 있다.
보다 상세하게, DNA와 관련하여, 이는 일본쇄- 또는 이본쇄일 수 있다. 이러한 DNA는 치료 유전자, 전사 또는 복제 조절 서열, 안티센스 서열, 다른 세포 성분과 결합하기 위한 영역등을 운반할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해서, 치료 유전자는 특히, 치료 효과를 갖는 단백질성 생성물을 암호화하는 여타의 유전자로 이해될 수 있다. 따라서, 암호화된 단백질성 생성물은 단백질, 펩티드 등일 수 있다. 이러한 단백질성 생성물은 표적 세포와 관련하여 상동성일 수 있다(즉, 표적세포가 어떠한 병리로 손상을 입지 않을 때, 표적 세포에서 정상적으로 발현되는 생성물). 이러한 경우에, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포내 불충분한 발현 또는 변형때문에 불활성이거나 약하게 활성인 단백질의 발현을 교정하거나, 또는 단백질을 과발현시키는 것이 가능하다. 치료 유전자는 또한 향상된 안정성, 변형된 활성 등을 갖는 세포 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수 있다. 단백질성 생성물은 또한 표적 세포에 대해 이종일 수 있다. 이러한 경우에, 발현된 단백질은, 예를 들면 세포내 결핍된 활성을 보충하거나 공급하여, 병리와 싸우는 것을 가능하게 하며, 또는 면역 반응을 자극할 수 있다. 치료 유전자는 또한 체내로 분비되는 단백질을 암호화할 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 치료 생성물 중에는, 특히 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인, 즉 인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 92/03120), 성장 인자, 신경 전달물질 또는 이들의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자, 즉 BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/ 플레이오트로핀 등; 아포리포프로틴, 즉 ApoAI, ApoAIV, ApoE 등(FR 93/05125), 다이스트로핀 또는 미니다이스트로핀(FR 91/11947), 낭포성 섬유증과 연관된 CFTR 단백질, 종양-억제 유전자, 즉 p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev 등(FR 93/04745), 응고에 관여된 인자를 암호화하는 유전자, 즉 인자 VII, VIII, IX, DNA 수선에 참여하는 유전자, 자기불활화 유전자(티미딘 키나아제, 시토신 데아미나아제) 등이라 할 수 있다.
치료 유전자는 또한 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있으며, 표적 세포내 이들의 발현은 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있다. 그러한 서열은 특허 EP 140,308호에 기재된 기술에 따라, 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있고, 따라서 단백질로의 이들의 해독을 차단할 수 있다. 다른 가능한 서열은 임의로 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 포함한다(EP 92,574). 안티센스 서열은 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 리보자임을 암호화하는 서열을 포함한다(EP 321,201).
전술한 바와 같이, 핵산은 또한 사람 또는 동물에 면역 반응을 유도할 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 특별한 양태에서, 본 발명은 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대해 사람 또는 동물에 적용되는 백신 또는 면역치료제의 생성을 가능하게 한다. 그러한 펩티드에는 특히, Epstein Barr 바이러스, HIV 바이러스, 감염 B (EP 185,573) 또는 의-광견병(pseudorabies) 바이러스, 또는 종양-특이성 펩티드 (EP 259,212)에 특이성을 갖는 항원성 펩티드가 포함된다.
바람직하게는, 핵산은 또한 치료 유전자 및/또는 목적하는 세포 또는 기관내 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 이들이 감염 세포내에서 기능할 수 있을 때, 당해 유전자의 발현에 본질적으로 책임이 있는 것들일 수 있다. 이들은 또한 상이한 기원의 서열일 수 있다(다른 단백질의 발현에 책임이 있거나, 합성 서열). 특히, 이들은 진핵세포 또는 바이러스성 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 기원하는 프로모터 서열일 수 있다. 이와 유사하게, 이들은 바이러스 게놈으로부터 기원하는 프로모터 서열일 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들면, ElA, MLP, CMV, RSV 등의 유전자의 프로모터가 언급될 수 있다. 또한, 이러한 발현 서열은 활성화 또는 조절 서열, 또는 조직-특이성 발현을 허용하는 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
더구나, 핵산은 또한 특히 치료 유전자의 업스트림, 즉 합성된 치료 생성물을 표적 세포의 분비 경로로 향하게 하는 시그널 서열을 포함할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 치료 생성물의 천연의 시그널 서열일 수 있지만, 그것은 또한 여타의 다른 작용선 시그널 서열, 또는 합성 시그널 서열일 수 있다.
더구나, 추가로, 핵산은 또한 특히, 치료 유전자의 업스트림, 즉 바람직한 세포 구획을 향해서 합성된 치료 생성물을 지정하는, 핵 편재 서열같은 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 이들 자체로 또는 다른 화합물과 병행하여 사용될 수 있다. 따라서, 특별한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 중합체/핵산 복합물과 결합할 수 있고 형질감염력을 개선시킬 수 있는 보조제를 추가로 포함한다. 본 출원인은 실제로 본 발명의 조성물의 형질감염력을 중합체/핵산 복합물과 결합할 수 있는 특정 보조제(예를 들면, 지질, 단백질, 리포폴리아민, 합성 중합체)의 존재하에 추가로 개선시킬 수 있음을 보인다. 본 출원의 실시예에서 보인 바와 같이, 이러한 개선은 시험관내 및 생체내 모두에서 그 개선이 증명된다.
본 발명에 따른 조성물에서 바람직하게 사용된 보조제는 양이온 지질(이들의 극성 부분에 하나 이상의 양이온 전하를 띔) 또는 중성 지질이다.
양이온 지질에 관해서, 이들은 보다 상세하게 리포폴리아민, 즉 화학적 아암을 경유하여 서로 공유 결합하는 적어도 하나의 폴리아민 친수성 영역 및 하나의 친지성 영역을 포함하는 양성(amphiphilic) 분자을 말한다. 유리하게는, 본 발명과 관련하여 사용된 리포폴리아민의 폴리아민 영역은 화학식 H2N-(-(CH)m-NH-)l-H에 상응하며, 여기서 m은 2이상의 정수이고, l은 1이상의 정수로서, m은 두개의 아민사이에 놓인 상이한 탄소 그룹사이에서 변화가 가능하다. 바람직하게는, m은 2내지 6 이고, l은 1 내지 5 이다. 보다 더 바람직하게는, 폴리아민 영역은 DNA에 결합하는 성질을 보유하는 스퍼민 또는 스퍼민 동족체에 의해 나타내어진다.
친지성 영역은 박판 또는 육각형 상을 형성할 수 있는 하나 또는 몇몇 포화 또는 불포화 탄화수소 쇄, 콜레스테롤, 천연 지질 또는 합성 지질일 수 있다.
유리하게는, 특허 출원 제 EP 394,111호에 정의된 것과 같은 리포폴리아민이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 상기 출원은 또한 이러한 리포폴리아민의 제조에 사용될 수 있는 과정을 기술한다. 본 발명과 관련하여, 디옥타데실아미도글리실스퍼민(DOGS) 또는 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES)를 사용하는 것이 특히 유리하다.
본 발명의 조성물을 생성하기 위해 특히 바람직한 다른 보조제는 중성 지질로 나타내어진다. 중성 지질의 사용은 (아민/포스페이트) 전하비 R이 낮을 때, 특히 유리하다. 보다 바람직하게는, 본 발명과 관련하여 사용된 중성 지질은 2개의 지방 쇄를 포함하는 지질이다.
양쪽성이거나 생리학적 조건하에서 이온 전하가 부족한 천연 또는 합성 지질이 특히 유리하다. 보다 특별하게는, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올리오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디스테아로일-, -팔리토일- 및 -미리스토일포스파티딜에탄올아민 및 이들의 1- 내지 3-중 N-메틸화된 유도체; 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드(예를 들면, 특히 갈락토세레브로시드), 스핑고리피드(예를 들면, 특히 스핑고미엘린) 또는 아시알로강글리오시드(예를 들면, 특히 아시알로GM1 및 GM2)로부터 선택될 수 있다.
이러한 상이한 지질은 합성적으로 또는 기관(예를 들면, 뇌) 또는 난으로부터의 추출에 의해, 당해분야의 기술자에게 익히 공지된 표준 기술에 의해 수득될 수 있다. 특히, 천연 지질의 추출은 유기 용매에 의해 수행될 수 있다(Lehninger, Biochemistry를 또한 참조).
바람직하게는 본 발명의 조성물은 상기 언급된 비의 양이온 중합체뿐만 아니라, 핵산 포스페이트 1몰 당량당 0.1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 5 당량을 포함한다.
특히 유리한 양태에서, 본 발명의 조성물은 핵산의 전달이 인도될 수 있게하는 표적화 요소를 포함한다. 이러한 표적화 요소는 핵산의 전달이 특정 세포 유형 또는 특정의 목적 조직(종양 세포, 간 세포, 조혈 세포 등)을 향해 인도될 수 있도록 하는 세포외 표적 요소일 수 있다. 이는 또한 특정의 선호하는 세포 구획(미토콘드리아, 핵 등)을 향해 핵산의 이동이 인도될 수 있도록 하는 세포의 표적화 요소일 수 있다.
보다 바람직하게는, 표적화 요소는 화학식(I)의 중합체에 공유 또는 비-공유 결합된다. 결합은 특히, 암모늄 그룹과의 이온 작용에 의해, 또는 이핵성(離核性) 그룹(할로겐, 토실레이트 등), 활성화된 에스테르(히드록시숙신이미드 등) 또는 이소티오시아네이트를 함유하는 표적화 요소상에의 중합체 아민의 친핵성 공격에 의해 수득될 수 있다. 표적화 요소는 또한 핵산과 결합할 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 표적화 요소중에서, 당, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 지질이 언급될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 요소는 당 및/또는 항체 또는 항체 단편, 세포 수용체 리간드 또는 이의 단편, 수용체 또는 수용체 단편 등과 같은 펩티드이다. 특히, 이들은 성장 인자 수용체, 시토킨 수용체, 세포 렉틴 수용체, 또는 부착 단백질 수용체를 위한 리간드일 수 있다. 트랜스페린, HDL 및 LDL 수용체가 또한 언급될 수 있다. 표적화 요소는 또한 아시알로글리코프로틴 수용체를 표적화할 수 있는 당 또는 면역글로불린 Fc 단편 수용체를 표적화할 수 있는 항체 Fab 단편일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 국소피부, 경구, 직장, 질, 비경구, 내비, 정맥내, 근육내, 피하, 내안, 경피 등과 같은 투여의 목적으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 주사용 제제, 특히 목적하는 기관내 직접 주사 또는 국소 투여(피부 및/또는 점막)에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 생성물은 특히, 등장 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리식염수의 첨가시, 주사액을 형성할 수 있는 건조, 특히 동결 건조 조성물일 수 있다. 주입에 사용된 핵산의 투여량 및 투여의 횟수는 상이한 파라미터에 따라, 특히 사용된 투여 양식, 문제의 병리, 발현될 유전자 또는 치료의 목적하는 기간에 따라서 적용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 세포내로 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 실시예는 본 발명의 양이온 중합체를 많은 세포 유형내로, 특히 통상적으로 형질감염시키기 곤란한 특정 세포 유형내로 매우 효과적으로 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 시험된 세포 유형 가운데, 섬유아세포, 간 세포, 암종, 신장 세포 및 뉴런이 특히 언급될 수 있다. 추가로, 하기에 나타낸 실시예는 또한 생체내에서 유전자의 전달을 위한 본 발명의 중합체의 효능을 예시한다. 본 발명의 벡터로 수득된 결과는 다른 형질감염제를 사용하여 동일한 조건하에서 수득된 것보다 더 우수하며, 따라서 본 발명의 조성물의 높은 잠재성을 보여준다.
본 발명은 특히, 전술한 바와 같이 양이온 중합체와 결합하여, 장해와 교정할 수 있는 핵산의 생체내 투여를 포함하는 장해의 치료를 위해 특히 유리한 방법을 제공한다. 보다 특별하게, 이러한 방법은 단백질성 또는 핵산 생성물의 결핍으로부터 생겨난 장해에 적용될 수 있고, 투여된 핵산은 단백질성 생성물을 암호화하거나 핵산 생성물을 함유한다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은 생체내 핵산의 투여 및 전달을 위한 특히 유리한 도구를 구성한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 보다 완전하게 기술되며, 예시적이고 이로써 제한되지 않는다.
실시예 1:
생체내 유전자 전달에 사용된 플라즈미드
세가지 유형의 작제물이 본 발명의 조성물을 설명하기 위해 사용된다: 루시퍼라제(Luc)를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라즈미드, β-갈락토시다제 (LacZ 유전자)를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라즈미드 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라즈미드.
1.1. Luc 유전자를 함유하는 플라즈미드
플라즈미드 pCMV-luc는 제한 효소 MluI 및 HindIII로 절단함으로써 벡터 플라즈미드 pcDNA3(인비트로겐)로부터 추출되고, 루시퍼라제를 암호화하는 유전자의 상부에 위치하며, 벡터 pGL 기본 벡터(프로메가)내에 MluI 및 HindIII 부위에 삽입된 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 함유한다.
플라즈미드 pGL2-Luc는 시판되고 있다(프로메가).
플라즈미드 T3RE-Luc는 타이로이드 호르몬에 반응하기 위한 회문(回文) 요소에 상응하는 합성 올리고뉴클레오티드를 함유한다[참조문헌: Glass et al., Cell 56 (1989) 697].
1.2. LacZ 유전자를 함유하는 플라즈미드
플라즈미드 pCMV-βGal(클론테크)는 에스체리키아(Escherichia) 콜라이의 β-갈락토시다제를 암호화하는 LacZ 유전자의 상부에 위치한 CMV 프로모터를 함유한다. 벡터 pSV-nls LacZ (pAOnlsLacZ)는 동일한 프로모터, LacZ 유전자의 프레임중에 상류에 위치한 핵 편재 서열(SV40 바이러스로부터 기원)을 함유한다. 이러한 구성은 세포의 핵에서 융합 단백질 nls-β-갈락토시다제의 발현을 허용한다[참조문헌: De Luze et al., PNAS 90 (1993) 7322].
1.3. CAT 유전자를 함유하는 플라즈미드
RSV 프로모터 (pRSV-CAT) 및 SV40 프로모터 (pSV40-CAT)의 조절하에 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT)를 암호화하는 유전자를 리포터 유전자로서 갖는 플라즈미드가 공개된다 [참조문헌: Boutiller et al., Prog. Neuro-PhychoPharmacol. et Biol. Psychiat. 16 (1992) 959; de Luze et al. PNAS 90 (1993) 7322].
실시예 2:
섬유아세포내로의 핵산 전달
본 실시예는 800,000 Da의 폴리에틸렌이민에 의해 3T3 섬유아세포내로 플라즈미드 pGL2-luc의 전달을 기술한다.
프로토콜: 5.375μM의 PEI800K 용액을 제조하고, pH를 1N의 염산 용액을 사용하여 7로 조정한다. 이 용액을 유전자 전달 실험을 위해 사용한다.
형질감염 프로토콜: 3T3 섬유아세포를 형질감염 24시간 전에 24-웰 디시내로 접종시킨다(50,000세포/웰). 이들은 하기 프로토콜에 따라서 웰당 2㎍의 플라즈미드 pGL2-Luc로 형질감염 시킨다:
2㎍의 플라즈미드 및 5.375μM의 PEI800K 용액의 상이한 부피(목적하는 전하 당량에 따라)를 50㎕의 150mM NaCl에서 개별적으로 희석시켜 혼합한다. 10분 후에, 두 용액을 합하여 균질하게 한다. 다시 10분 후에, 900㎕의 DMEM을 첨가한다. 그로인해 수득된 용액을 균질화시키고, 10분 후에, 혈청없이 DMEM 배지로 사전에 세정된 세포상에 분포시킨다. 형질감염 2시간 후에, 100㎕의 FCS(태송아지 혈청)를 웰마다 첨가한다. 발현은 24시간 후에 멈춘다.
루시퍼라제 분석: 이러한 목적을 위해서, 상등액을 루시페린, 조효소 A 및 ATP를 포함하는 완충액의 존재하에 배양시키고, 방출된 빛(일반적으로 10초 동안)을 광도계로 측정한다[참조문헌: Wood K. (1990) Promega Notes, 28].
수득된 결과를 도 1에 도시한다. 이들은 PEI가 플라즈미드 pGL2-Luc를 섬유아세포내로 효율적으로 전달될수 있게 함을 보인다. 이들은 또한 상대적 광단위(RLU)로 나타낸 활성이 PEI 아민의 5 내지 20 당량을 DNA 포스페이트에 관해서 사용할때 특히 우수함을 보인다. 통제된 실험에서, 플라즈미드 단독으로는 약 100 RLU의 시그널을 부여한다.
실시예 3:
형질감염 효율에 미치는 DNA 양의 영향
본 실시예는 PEI800K에 의한 3T3 섬유아세포내로의 전달 효율에 미치는 핵산의 양의 영향을 기술한다.
3T3 섬유아세포를 형질감염 24시간 전에 24-웰 디시내에서 접종시킨다(50,000 세포/웰). 이들을 앞서 기술된 프로토콜에 따라, 웰당 증가량의 플라즈미드 pCMV-Luc 및 일정 전하비(9 당량)를 형질감염시킨다. 연구하에 있는 유전자를 함유하지 않는 플라즈미드 pGEM(PROMEGA)로 웰당 2㎍까지 플라즈미드의 양을 보충함으로써 두개의 포인트가 생성된다. 형질감염 3시간 후에, 100㎕의 FCS 혈청을 웰마다 첨가한다. 발현은 24시간 후에 멈춘다.
수득된 결과를 도 2에 도시한다.
형질감염 효율은 형질감염중에 사용된 플라즈미드 양과 함께 증가한다. 전사되지 않은 운반체 DNA (pGEM)의 첨가는 형질감염에 어떠한 기여도 하지 않는다.
실시예 4:
섬유아세포내로의 핵산 전달: 아민/포스페이트 비의 영향 연구
본 실시예는 상이한 (아민/포스페이트) 비 R로 핵산 및 PEI800K를 함유하는 본 발명에 따른 조성물에 의해 pH6에서 섬유아세포내로의 핵산 전달을 기술한다.
프로토콜: 5.375μM의 PEI800K 용액을 제조하고, pH를 1N의 염산 용액을 사용하여 6으로 조정한다. 이 용액을 유전자 전달 실험을 위해 사용한다.
3T3 섬유아세포를 형질감염 18시간 전에 24-웰 디시내에 접종시킨다(50,000세포/웰). 이들은 실시예 2에서 사용된 프로토콜에 따라서 웰당 2㎍의 플라즈미드 pGL2-Luc로 형질감염시킨다.
수득된 결과를 도 3에 도시한다. 이들은 본 발명에 따른 조성물이 6 내지 22사이의 비 R의 전체 범위에 걸쳐서 특히 효율적임을 보인다.
실시예 5:
pH에 의한 형질감염의 효율
본 실시예는 상이한 pH 조건하에서 핵산 및 PEI800K를 포함하는 본 발명에 따른 조성물에 의한 섬유아세포내로의 핵산 전달을 기술한다.
사용된 프로토콜을 실시예 2에서 기술된 것과 동일하다. pH는 1N의 염산 용액을 첨가하여 조정한다.
수득된 결과를 도 4에 도시한다. 이들은 본 발명에 따른 조성물이 상이한 pH 값, 특히 생리학적 pH 범위 (pH 5-8)내에서 사용될 수 있음을 보인다.
실시예 6:
PEI와 폴리리신의 형질감염 효율의 비교
본 실시예는 섬유아세포내로의 핵산 전달에 있어서 본 발명에 따른 조성물로 수득된 결과와 다른 양이온 중합체, 폴리리신으로 수득된 결과를 비교한 것이다.
프로토콜: 본 실험에 사용된 폴리리신(PLL)은 평균 중량 50 K의 폴리리신.HBr 이다. 최종 클로로퀸 농도는 100μM이다. PEI는 pH6에서 존재한다.
프로토콜: 3T3 섬유아세포를 형질감염 18시간 전에 24-웰 디시내에 접종시킨다(50,000세포/웰). 이들은 실시예 2에서 사용된 프로토콜에 따라서 플라즈미드pGMV-Luc로 형질감염시킨다. 클로로퀸의 존재하에 PLL로 형질감염된 세포를 2시간 후에 세정하고 10%의 혈청을 갖는 배지에 둔다. 발현은 24시간 후에 멈춘다.
수득된 결과를 도 5에 도시한다. 이들은 본 발명에 따른 조성물이 핵산을 폴리리신같은 전술한 양이온 중합체 벡터보다 훨씬 더 큰 효율로 섬유아세포내로 전달될 수 있도록 함을 분명하게 설명한다.
실시예 7:
PEI50K 및 PEI800K를 사용한 NIH 3T3 섬유아세포의 형질감염 효율의 비교
본 실시예는 세포내로의 핵산 전달을 위한 두 PEI 중합체 (PEI50K 및 PEI800K)의 사용 및 비교를 기술한다.
프로토콜: 세포를 50,000 세포/16㎜ 웰을 사용하여 형질감염 24시간 전에 접종시킨다. 이들을 PEI와 복합된 플라즈미드 pCMV-Luc로 형질감염시킨다. PEI 아민/핵산 포스페이트 몰 당량비는 6 내지 45 당량으로 변한다. 각 웰에 있어서, PEI 및 2㎍의 DNA를 50㎕의 NaCl (150mM)로 각각 희석시킨다. 이어서 용액을 혼합하고, 그후에 균질화한다. 10분 후에, 이 부피를 세포에 첨가한다. 24시간 후에, 세포를 용해시킨 다음, 용해 용액을 윈심분리시키고 상등액을 루시퍼라제 활성을 분석하기 위해 사용한다. 단백질 분석을 이러한 상등액의 분취량에 대하여 BCA 시험에 의해 수행한다. 루시퍼라제 활성은 광단위 (RLU)/10초의 통합/㎎ 단백질로 표현된다.
수득된 결과를 아래 표에 나타내었다.
R O 6eq 9eq 18eq 45eq
PEI50KRLU/10s/㎎ Prot 7,100 11,000 760,000 12,000,000 2,450,000
PEI800KRLU/10s/㎎ Prot 6,253 200,000 16,700,000 5,650,000 525,000
이러한 결과는 PEI50K가 PEI800K만큼 유리하게 형질감염 성질을 가지고 있음을 분명하게 보인다.
실시예 8:
PEI의 세포독성 시험
본 발명자는 NIH 3T3 섬유아세포에 대한 PEI50K의 가능한 독성을 연구하기를 원하였다. 이러한 연구를 위해서, 본 발명자는 미토콘드리아 효소 숙시네이트 디히드로게나제에 의한 세포의 MTT 테트라졸륨에서 MTT 포마잔으로의 환원능이 평가될 수 있는 MTT 시험을 선택하였다. 형질감염 프로토콜은 실시예 7에서와 동일하다(웰당/DNA의 양이 고정되며(2㎍), PEI 아민/ DNA 포스페이트 몰 당량의 수가 9내지 24로 변한다). 형질감염 24시간 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하여 0.05 ㎎/㎖의 MTT로 90분 동안 배양한다. 이러한 배양의 말기에서, 세포 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 3회 세척하여 1㎖의 10% SDS에 10분 동안 용해시킨다. 샘플의 광학 밀도를 540㎚에서 판독한다.
결과를 도 6에 나타내었다. 이들은 발명자의 연구 조건하에, PEI50K가 NIH 3T3 섬유아세포에 대해 유의할 만한 치사를 가져오지 않음을 보인다.
실시예 9:
형질감염력을 개선시키기 위한 보조제의 사용
본 실시예는 양이온 중합체 및 보조제를 포함하는 본 발명에 따른 조성물의 사용을 기술한다. 사용된 보조제는 천연 지질(DOPE) 또는 리포폴리아민(DOGS)이다.
프로토콜: DOPE의 첨가:
네개의 PEI 아민/DNA 포스페이트 몰당량비를 연구한다: 6, 9, 18 및 21. 각 웰에대해서, 12n㏖의 DOPE를 PEI 및 DNA의 혼합물에 첨가한다. 이어서, 이 용액을 실시예 7에 기술한 바와 같이 형질감염에 사용한다.
DOGS의 첨가: 각 웰에 대해서, 4 DOGS 아민/DNA 포스페이트 몰당량비(6n㏖의 포스페이트에 대한 6n㏖의 DOGS 당량)을 DNA와의 복합체 형성단계 전에 PEI 용액에 첨가한다. 이어서, 형질감염을 실시예 7에서 기술된 바와 같이 수행한다.
수득된 결과를 도 7에서 보인다. 이들은 DOPE 및 DOGS의 첨가가 형질감염 성질을 더욱, 특히 낮은 PEI 아민/DNA 포스페이트 몰당량비에 있어서 증가시킬 수 있음을 분명하게 보인다.
실시예 10:
헬라(Hela) 세포내로의 유전자 전달
본 실시예는 본 발명에 따른 조성물이 상이한 세포 유형내로의, 특히 헬라 자궁암 세포내로의 유전자 전달에 사용될 수 있다.
프로토콜: 헬라 세포를 50,000 세포/16㎜ 웰을 이용하여 형질감염 24시간 전에 접종한다. 이어서 이들을 PEI 또는 리포폴리아민(DOGS)과 복합체를 이룬 플라즈미드 pCMV Luc로 형질감염시킨다. 네개의 PEI50K 또는 PEI800K 아민/DNA 포스페이트 몰당량비를 연구한다: 6, 9, 18, 21. 리포폴리아민을 8 아민/포스페이트 몰당량으로 사용한다(12n㏖의 DOGS).
수득된 결과를 도 8에서 보인다. 이들은 보조제와 임의로 배합된 양이온 중합체를 포함하는 본 발명에 따른 조성물이 헬라 세포를 앞서의 시스템(특히 리포폴리아민 DOGS)보다 훨씬 효율적으로 형질감염시킴을 분명하게 보인다.
실시예 11:
상이한 세포 유형내로의 유전자 전달
본 실시예는 본 발명에 따른 조성물이 섬유아세포, 자궁암, 간암 또는 신장 세포 같은 광범위 세포 유형내로의 유전자 전달에 사용될 수 있음을 보인다. 보다 상세하게, 본 실시예는 9 전하 당량을 함유하는 PEI를 사용한 pH6에서 HepG2와 K562 세포 및 토끼 팽활근 일차 배양 세포의 형질감염을 기술한다.
HepG2 세포를 형질감염 24시간 전에 24-웰 디시내에 접종시킨다(50,000 세포/웰). 이들은 실시예 2에서 기술된 프로토콜에 따라 플라즈미드 pCMV-Luc로 형질감염시킨다. 형질감염 4시간 후에, 100㎕의 FCS 혈청을 웰마다 첨가한다. 발현은 30시간 후에 멈춘다.
K562 세포를 형질감염 1시간 전에 혈청없이 0.5㎖ RPMI 배지로, 24-웰 디시에 접종시킨다. 이들을 다음의 프로토콜에 따라서 플라즈미드 pCMV-Luc로 형질감염시킨다: 플라즈미드 및 PEI의 목적하는 양을 50㎕의 150mM NaCl에 각각 희석시켜 혼합한다. 10분 후에, 두 용액을 합하여 균질하게 한다. 다시 10분 후에, 400㎕의 RPMI을 첨가한다. 그로인해 수득된 용액을 균질화하고, 10분 후에, 세포상에 분포시킨다. 형질감염 4시간 후에, 100㎕의 FCS 혈청을 웰마다 첨가한다. 발현은 30시간 후에 멈춘다.
토끼 팽활근 일차 배양액을 Fallier-Becker에 의해 기술된 바와 같이 제조한다. 이어서, 세포를 PEI와 복합체를 이룬 1㎕ 또는 2㎕의 플라즈미드 pCMV-Luc로 형질감염시킨다(실시예 7에 기술된 프로토콜에 따라). 루시퍼라제의 발현은 형질감염 24 또는 48시간 후에 멈춘다.
수득된 결과를 도 9에 도시한다. 이들은 본 발명에 따른 조성물이 광범위하게 상이한 세포 유형의 효과적 형질감염을 허용함을 분명하게 보인다.
실시예 12:
태아 뉴런 일차 배양액내로 플라즈미드 DNA의 전달: 생물학적 활성의 입증
뉴런 일차 배양액을 Lezoualc'h et al.에 의해 기술된 바와 같이 제조한다. 36시간 후에, 배양액을 웰당 2㎍의 플라즈미드 TRE-Luc(타이로이드 호르몬 T3 반응 요소의 조절하에 Luc 유전자 함유) 및 0.5㎍의 운반체 DNA로 형질감염시킨다.
두개의 실험 조건을 연구한다:
- 포스페이트에 대한 9 당량의 아민: 1㎍의 플라즈미드를 pH 7의 2.28㎕의 100mM PEI800K 수용액내로 도입시킨다.
- 포스페이트에 대한 13 당량의 아민: 1㎍의 플라즈미드를 pH 7의 3.33㎕의 100mM PEI800K 수용액내로 도입시킨다.
복합체를 형성하기전에, 플라즈미드를 50㎕의 150mM NaCl에 희석시키고, PEI를 또한 두번째 50㎕ 분취량의 150mM NaCl에 희석시킨다. 이어서, 용액을 혼합하고 1시간 동안 세포에 적용한다. 이어서 형질감염 배지를 제거하고 T3 (1nM)가 있거나 없는, 신선한 배양 배지로 대치시킨다. 24시간 후에, 세포를 용해시키고, 용해 용액을 원심분리시키고, 상등액을 루시퍼라제 활성을 분석하기 위해 사용한다.
수득된 결과를 도 10에 도시한다. 이들은 본 발명에 따른 조성물이 DNA를 뉴런 세포내로 형질감염시킬 수 있고, 이렇게 형질감염된 DNA가 그들의 활성이 T3의 존재하에서 증폭되기 때문에, 기증할 수 있음을 분명하게 보인다. 플라즈미드만의 존재하에 수행된 대조군 실험에서는, 어떠한 루시퍼라제의 활성도 검출되지 않는다.
실시예 13:
태아 뉴런 일차 배양액내로 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전달
실험은 실시예 12에서와 같이 제조된 뉴런 일차 배양액상에서 수행된다. 36시간 후에, 배양액을 PEI800K 포스페이트에 대해 9당량의 아민과 복합체를 이룬 2μM 18mer 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN)로 형질감염시킨다.
사용된 ODN을 타이로이드 호르몬 알파-수용체를 암호화하는 유전자의 영역에 대해서 지시한다.
이의 서열은 다음과 같다:
5´- GCTGGGCTTCTGTTCCAT-3´
250㎕의 배양 배지의 4 웰에 대해, 다음 생성물이 사용된다:
- 10㎕의 150mM NaCl에서 희석된 8㎕의 0.25mM ODN 용액,
- 두번째 51.2㎕ 분취량의 150mM NaCl에 희석시킨 pH 7의 20.8㎕의 12mM PEI800K 수용액.
이어서, 용액을 혼합하고, 20㎕의 혼합물을 45분 동안 세포에 적용한다. 이어서, 형질감염 배지를 제거하고 신선한 배양 배지로 대치시킨다. 이어서, 세포를 4%의 파라포름알데히드 용액에서 고정시키고, 세정하여, 모위올(Mowiol)에 고정한 다음 형광 현미경하에 검사한다.
수득된 결과를 도 11에 도시한다. 이들은 본 발명에 따른 조성물이 안티센스 올리고뉴클레오티드를 뉴런 세포내로 형질감염될 수 있도록 함을 분명하게 보인다. 올리고뉴클레오티드 단독 존재하에 수행된 대조군 실험에서는 전혀 형광이 검출되지 않았다.
실시예 14:
생체내에서 신생 마우스의 뇌내로 핵산을 전달하기 위한 본 발명의 조성물의 사용
본 실시예는 생체내에서 신생 마우스 뇌내로의 플라즈미드 pCMV-Luc의 전달을 기술한다. 이는 본 발명에 따른 조성물의 특히 유전자 치료 적용을 위한 특히 유리한 성질을 설명한다.
30㎍의 플라즈미드 pCMV-luc (4㎍/㎕를 함유하는 7.5㎕의 스톡용액)를 22.5㎕의 멸균 5% 글루코즈에서 희석시킨다(최종 농도 1㎍/㎕). 이어서, 8.5㎕의 100mM PEI800K(물에서 제조되고 pH 6.9로 완충)를 첨가한다. 이렇게하여 수득된 조성물은 포스페이트에 대해 9당량의 아민을 함유한다.
혼합물을 빠르게 와동시키고 신생 마우스에 뇌내 주사용으로 사용한다. 이말기에서, 마우스를 냉각(얼음과 접촉한 알루미늄 포일상에 둠)에 의해 마취시킨 다음, 2㎕의 혼합물(2㎍의 핵산)을 마우스마다 주사한다. 주사는 모두 미세전극과 연결된 현미조작기 및 미세주사기를 사용하여 피질내로 수행된다.
뇌를 48시간 후에 적출하고, 균질화하여 원심분리시키고, 상등액을 루시퍼라제의 분석에 사용한다. 이 말기에서, 상등액을 루시페린, 조효소 A 및 ATP을 포함하는 완충액의 존재하에 배양시키고, 방출된 빛(일반적으로 10초동안)을 광도계로 측정한다[참조문헌: Wood K. (1990) Promega Notes, 28].
수득된 결과를 도 12에 도시한다. 이들은 조성물이 플라즈미드를 마우스의 뇌내로 효율적으로 전달될 수 있도록 함을 분명하게 보이지만, 플라즈미드 단독으로 전달될 때는 뚜렷한 루시퍼라제 활성이 관찰되지 않음을 극명하게 보인다.

Claims (33)

  1. 하나 이상의 핵산 및 화학식(Ⅰ)의 양이온 중합체의 혼합물을 포함하는 조성물로서,
    [화학식 Ⅰ]
    Figure pct00003
    상기 식에서,
    R은 수소 원자 또는 화학식
    Figure pct00004
    의 그룹이고,
    n은 2 내지 10의 정수이며;
    p 및 q는 정수이고, p와 q의 합은 중합체의 평균 분자량이 100 내지 107이 되게 하는 값인 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 화학식 (I)에서 n이 2 내지 5인 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 중합체가 103내지 5×106의 평균 분자량을 갖는 조성물.
  4. 제 1 내지 3 항중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 폴리프로필렌이민(PPI)인 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 중합체가 평균 분자량 50,000의 폴리에틸렌이민(PEI50K) 또는 평균 분자량 800,000의 폴리에틸렌이민(PEI800K)인 조성물.
  6. 제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 및 핵산의 각 부분이 중합체 아민/핵산 포스페이트의 비(R)가 0.5 내지 50 사이가 되도록 선택되는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, R이 2 내지 50인 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, R이 5 내지 30인 조성물.
  9. 제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체/핵산 복합체와 배합될 수 있고 형질 감염력을 개선시킬 수 있는 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 보조제가 지질, 단백질, 리포폴리아민 또는 합성 중합체인 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 보조제가 양이온 지질인 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 양이온 지질이 하나 이상의 리포폴리아민을 포함하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 리포폴리아민이 화학식 H2N-(-(CH)m-NH-)l-H 에 상응하며, 상기 식에서 m은 2 이상의 정수이고 l이 1 이상의 정수이며, m은 두개의 아민사이에 위치한 상이한 탄소그룹 사이에서 변화 가능한 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 리포폴리아민이 디옥타데실아미도글리실스퍼민(DOGS) 또는 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES)인 조성물.
  15. 제 10 항에 있어서, 보조제가 하나 이상의 중성 지질을 포함하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 중성 지질이 양쪽성이거나 생리학적 조건하에 이온 전하가 부족한 합성 또는 천연 지질인 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 중성 지질이 2개의 지방 사슬을 함유하는 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서, 중성 지질이 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디스테아로일-, 팔미토일- 및 미리스토일포스파티딜에탄올아민 및 이들의 1- 내지 3-중 N-메틸화된 유도체; 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드, 스핑고리피드 또는 아시알로강글리오시드인 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 세레브로시드가 갈락토세레브로시드이고, 스핑고리피드가 스핑고미엘린이며, 아시알로강글리오시드가 아시알로-GM1 및 -GM2인 조성물.
  20. 제 1 항에 있어서, 핵산이 DNA인 조성물.
  21. 제 1 항에 있어서, 핵산이 RNA인 조성물.
  22. 제 20 또는 21 항에 있어서, 핵산이 화학적으로 변형되는 조성물.
  23. 제 20 내지 21 항에 있어서, 핵산이 안티센스 서열인 조성물.
  24. 제 20 내지 21 항에 있어서, 핵산이 치료 유전자를 함유하는 조성물.
  25. 제 9 항에 있어서, 핵산 포스페이트의 몰당량 당 0.1 내지 20 몰당량의 보조제를 포함하는 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 핵산 포스페이트의 몰당량 당 1 내지 5 몰당량의 보조제를 포함하는 조성물.
  27. 제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 요소를 포함하는 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, 표적화 요소가 당 및/또는 펩티드, 세포 수용체 리간드 또는 이의 단편, 또는 수용체 또는 수용체 단편으로 이루어지는 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 펩티드가 항체 또는 항체 단편인 조성물.
  30. 제 27 항에 있어서, 표적화 요소가 화학식 (I)의 중합체와 공유 결합하는 조성물.
  31. 제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사제용으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  32. 제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 점막에 적용하기 위해 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  33. 핵산을 세포 내로 전달하는 제 1 항에 따른 양이온 중합체.
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