PT770140E - Composição contendo ácidos nucleicos e polímeros catiónicos, sua preparação e utilização - Google Patents

Composição contendo ácidos nucleicos e polímeros catiónicos, sua preparação e utilização Download PDF

Info

Publication number
PT770140E
PT770140E PT95925026T PT95925026T PT770140E PT 770140 E PT770140 E PT 770140E PT 95925026 T PT95925026 T PT 95925026T PT 95925026 T PT95925026 T PT 95925026T PT 770140 E PT770140 E PT 770140E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
composition according
nucleic acid
polymer
pei
composition
Prior art date
Application number
PT95925026T
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel Scherman
Otmane Boussif
Jean-Paul Behr
Barbara Demeneix
Franck Lezoualch
Mojgan Mergny
Original Assignee
Centelion
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9465376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT770140(E) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centelion filed Critical Centelion
Publication of PT770140E publication Critical patent/PT770140E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)

Description

DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÃO CONTENDO ÁCIDOS NUCLEICOS E POLÍMEROS CATIÓNICOS, SUA PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO A presente invenção refere-se a composições à base de ácidos nucleicos, sua preparação e sua utilização. Mais particularmente, ela refere-se a composições compreendendo pelo menos um ácido nucleico e certos polímeros catiónicos, e a sua utilização para a transferência de ácidos nucleicos nas células, especialmente em terapia génica. A terapia génica consiste em corrigir uma deficiência ou uma anomalia (mutação, expressão aberrante, etc) ou assegurar a expressão de uma proteína de interesse terapêutico por introdução de uma informação genética na célula ou no órgão afectado. Esta informação genética pode ser introduzida ou in vitro numa célula extraída do órgão, sendo a célula modificada então re-introduzida no organismo, ou directamente in vivo no tecido apropriado. Foram descritas técnicas diferentes para a transferência desta informação genética, entre as quais técnicas diversas de transfecção que implicam complexos de ADN e de DEAE-dextrano (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), de ADN e de proteínas nucleares (Kaneda et al., Science 243 (1989) 357), de ADN e de lípidos (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), de ADN e de poli-lisina, a utilização de lipossomas (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), etc. Mais recentemente, a utilização de vírus como vectores para a transferência de genes surgiu como uma alternativa promissora a estas técnicas fisico-químicas de transfecção. A este respeito, foram testados diferentes vírus relativamente à sua capacidade de infectar certas populações celulares. Em particular, os retrovírus (RSV, HMS, MMS, etc), o vírus HSV, os vírus adeno-associados, e os adenovírus. 1
No entanto, as técnicas desenvolvidas até à data não permitem resolver de modo satisfatório as dificuldades ligadas à transferência de genes nas células e ou no organismo. Em particular, os problemas ligados à penetração do ácido nucleico nas células não estão completamente resolvidos. Com efeito, a natureza polianiónica dos ácidos nucleicos, especialmente, previne a sua passagem através das membranas celulares. Se foi mostrado que os ácidos nucleicos nus são capazes de atravessar a membrana plasmática de certos tipos celulares in vivo (ver especialmente o pedido n° WO90/11092), a eficácia de transfecção permanecer bastante fraca. Além disso, os ácidos nucleicos nus têm uma meia-vida plasmática curta, devido à sua degradação pelas enzimas e à sua eliminação pelas vias urinárias. Por outro lado, se os vírus recombinantes permitem melhorar a eficácia de transferência dos ácidos nucleicos, a sua utilização apresenta certos riscos tais como a patogenicidade, a transmissão, a replicação, a recombinação, a transformação, a imunogenicidade, etc. Além disso a sua produção segundo normas de Boas Práticas de fabrico apresenta certas dificuldades. 0 pedido de patente WO A 93 20090 divulga conjugados polímeros catiónicos-oligonucleótidos acoplados entre si através de uma ligação covalente por intermédio de um agente de ligação, estando a razão catiões em relação aos aniões dos referidos conjugados compreendida entre 0,8 e 2. O pedido de patente EPA 0424688 divulga um método para a modificação das células vegetais de modo a incorporar um ADN estranho. Este modo compreende uma etapa de pré-tratamento das células com um policatião, e ainda o tratamento da 2 referida célula pré-tratada com uma suspensão compreendendo ácido nucleico e lipossomas catiónicos. A presente invenção traz uma solução vantajosa para estes diferentes problemas. Com efeito, a requerente mostrou que certos polímeros catiónicos possuem propriedades particularmente vantajosas para a transferência de ácidos nucleicos nas células, tanto in vitro como in vivo. Por outro lado, estes polímeros apresentam a vantagem de serem facilmente acessíveis e pouco onerosos. A utilização dos polímeros catiónicos segundo a invenção permite igualmente evitar os inconvenientes ligados à utilização de vectores virais (perigos potenciais, tamanho limitado do gene transferido, preço elevado, etc).
Mais particularmente, a presente invenção reside em colocar em evidência propriedades transfectantes dos polímeros de fórmula (I): Γ
L
i K
m na qual R pode ser um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula
1
n é um número inteiro compreendido entre 2 e 10; p e q são números inteiros,
Entendendo-se que a soma p+q é tal que o peso molecular médio do polímero está compreendido entre 100 e 107 Da, e as 3 proporções respectivas do polímero e do ácido nucleico são escolhidas de modo que a razão R aminas do polímero / fosfatos do ácido nucleico esteja compreendida entre 5 e 30.
Entende-se que, na fórmula (I) o valor n pode variar entre as diferentes unidades p. Assim, a fórmula (I) aqrupa simultaneamente os homopolímeros e os heteropolímeros.
Um primeiro objecto da invenção reside então numa composição constituída por um ácido nucleico e por uma solução de um polímero catiónico reunidas e homogeneizadas, tendo o polímero catiónico uma fórmula geral (I) tal como definida acima. A invenção refere-se igualmente à utilização dos polímeros catiónicos de fórmula (I) para a transferência de ácidos nucleicos nas células.
Mais preferentemente, na fórmula (I), n está compreendido entre 2 e 5. Em particular, os polímeros de polietileno imina (PEI) e propileno imina (PPI) apresentam propriedades perfeitamente vantajosas.
Os polímeros preferidos para a realização da presente invenção são aqueles cujo peso molecular está compreendido entre 103 e 5.106 Da. A título de exemplo, pode-se citar a polietileno imina de peso molecular médio de 50 000 Da (PEI50K) ou a polietileno imina de peso molecular médio de 800 000 Da (PEI800K).
Os polímeros utilizados no quadro da presente invenção podem ser obtidos de diferentes modos. Podem primeiramente ser sintetizados quimicamente a partir do monómero 4 correspondente, em condições de polimerização aniónica (por exemplo polimerização da etileno imina), ou por redução de poliamidas obtidas por policondensação de diácidos com diaminas, ou ainda por redução de iminas obtidas por policondensação de dialdeidos com diaminas. Por outro lado, um certo numero destes polímeros são acessíveis comercialmente, tais como especialmente ο PEI50K ou PEI800K.
Para obter um efeito óptimo das composições da invenção, as proporções respectivas do polímero e do ácido nucleico são de preferência determinadas de modo a que a razão molar R = aminas do polímero/fosfatos do ácido nucleico seja compreendida entre 0,5 e 50; mais preferencialmente entre 5 e 30. Resultados particularmente vantajosos são obtidos utilizando de 5 a 15 equivalentes de aminas de polímero por carga de ácido nucleico. Esta razão pode, naturalmente, ser adaptada pelo perito na técnica em função do polímero utilizado, da presença de um adjuvante (ver de seguida), do ácido nucleico, da célula alvo e do modo de administração utilizado.
Nas composições da presente invenção, o ácido nucleico pode ser tanto um ácido desoxirribonucleico como um ácido ribonucleico. Pode tratar-se de sequências de origem natural ou artificial, e especialmente ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt e ARNr, sequências híbridas ou sequências sintéticas ou semi-sintéticas. Por outro lado, o ácido nucleico pode ter uma dimensão muito variável, indo do oligonucleótido ao cromossoma. Estes ácidos nucleicos podem ter origem humana, animal, vegetal, bacteriana, virai, etc. Podem ser obtidos por qualquer técnica conhecida pelo perito na técnica, e especialmente por rastreio de bancos, por síntese química, ou ainda por métodos mistos incluindo a modificação química ou 5 enzimática de sequências obtidas por rastreio de bancos. Podem por outro lado ser incorporadas em vectores, tais como vectores plasmidicos.
Relativamente mais particularmente aos ácidos desoxirribonucleicos, podem ser de cadeia simples ou dupla. Estes ácidos desoxirribonucleicos podem conter genes terapêuticos, sequências reguladoras da transcrição ou da replicação, sequências anti-senso, regiões de ligação a outros componentes celulares, etc.
No sentido da invenção, entende-se por gene terapêutico especialmente qualquer gene que codifica para um produto protéico com um efeito terapêutico. 0 produto protéico assim codificado pode ser uma proteína, um péptido, etc. Este produto protéico pode ser homólogo em relação à célula alvo (ou seja, um produto que é normalmente expresso na célula alvo quando esta não apresenta qualquer patologia). Neste caso, a expressão de uma protéina permite, por exemplo, mitigar uma expressão insuficiente na célula ou à expressão de uma proteína inactiva ou fracamente activa devido a uma modificação, ou ainda sobre-expressar a referida proteína. 0 gene terapêutico pode também codificar para um mutante de uma protéina celular, com uma estabilidade acrescida, uma actividade modificada, etc. 0 produto proteico pode igualmente ser heterólogo em relação à célula alvo. Neste caso, uma proteína expressa pode por exemplo completar ou aportar uma actividade deficiente na célula, permitindo-lhe lutar contra uma patologia, ou estimular uma resposta imunitária. 0 gene terapêutico pode igualmente codificar para uma proteína secretada no organismo.
Entre os produtos terapêuticos no sentido da presente 6 invenção, pode-se citar mais particularmente as enzimas, os derivados sanguíneos, as hormonas, as linfocinas: interleucinas, interferões, TNF, etc (FR 9203120), os factores de crescimento, os neurotransmissores ou seus precursores ou enzimas de síntese, os factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleitrofina, etc; as apolipoproteínas: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 9305125) , a distrofina ou uma minidistrofina (FR 9111947), a proteína CFTR associada à mucoviscidose, os genes supressores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-ver, etc (FR 93 04745), os genes que codificam para factores implicados na coagulação: Factores VII, VIII, IX, os genes que intervêm na reparação do ADN, os genes suicidas (timidina cinase, citosina desaminase), etc. O gene terapêutico pode igualmente ser um gene ou uma sequência anti-senso, cuja expressão na célula alvo permite cotnrolar a expressão de genes ou da transcrição de ARNm celulares. Tais sequências podem, por exemplo, ser transcritas na célula alvo em ARN complementares de ARNm celulares e assim bloquear a sua tradução em proteína, de acordo com a técnica descrita na patente EP 140 308. Podem tratar-se também de oligonucleótidos sintéticos, eventualmente modificados (EP 92 574) . Os anti-sensos compreendem igualmente as sequências que codificam para ribossomas, que são capazes de destruir selectivamente ARN alvo (EP 321301).
Como é indicado acima, o ácido nucleico pode igualmente compreender um ou vários genes que codificam para um péptido antigénico, capaz de gerar no homem ou num animal uma resposta imunitária. Neste modo particular de realização, a invenção permite então a realização ou de vacinas ou de 7 tratamentos imunoterapêuticos aplicados ao homem ou ao animal, especialmente contra microrganismos, vírus ou cancros. Podem tratar-se especialmente de péptidos antigénicos específicos do vírus de Epstein Barr, do vírus HIV, do vírus da hepatite B (EP 185 573), do vírus da pseudo-raiva, ou ainda específicos de tumores (EP 259 212) .
Preferentemente, o ácido nucleico compreende igualmente sequências que permitem a expressão do gene terapêutico e/ou do gene que codifica para o péptido antigénico na célula ou do órgão desejado. Pode tratar-se de sequências que são naturalmente responsáveis para a expressão do gene considerado quando estas sequências são susceptíveis de funcionar na célula infectada. Pode igualmente tratar-se de sequências de origem diferente (responsáveis pela expressão de outras proteínas, ou mesmo sintéticas). Especialmente, pode tratar-se de sequências promotoras de genes eucariotas ou virais. Por exemplo, pode tratar-se de sequências promotoras provenientes do genoma da célula que se pretende infectar. Igualmente, pode tratar-se de sequências promotoras provenientes do genoma de um virus. A este respeito, pode citar-se por exemplo os promotores dos genes EIA, MLP, CMV, RSV, etc. Por outro lado, essas sequências de expressão podem ser modificadas através da adição de sequências de activação, de regulação, ou permitem uma expressão específica a um tecido.
Por outro lado, o ácido nucleico pode igualmente compreender, em particular a montante do gene terapêutico, uma sequência sinal que dirige o produto terapêutico sintetizado em vias de secreção da célula alvo. Esta sequência sinal pode ser a sequência sinal natural do produto terapêutico, mas pode igualmente tratar-se de qualquer outra sequência sinal funcional, ou de uma sequência sinal artificial.
Por outro lado ainda, o ácido nucleico pode igualmente compreender, em particular a montante do gene terapêutico, uma sequência que dirige o produto terapêutico sintetizado para um compartimento celular preferencial, como uma sequência de localização nuclear.
As composições segundo a invenção podem ser utilizadas tais qual ou em associação com outros compostos. Assim, num modo particular de realização, as composições segundo a presente invenção compreendem ainda um adjuvante capaz de se associar ao complexo polimero/ácido nucleico e melhorar o poder transfectante, sendo o referido adjuvante escolhido entre os lipidos, proteínas, lipopoliaminas e polímeros sintéticos capazes de se associarem ao complexo polimero/ácido nucleico. Como ilustrado nos exemplos do presente pedido, esta melhoria manifesta-se tanto in vitro como in vivo.
Os adjuvantes utilizados preferencialmente nas composições segundo a invenção são lipidos catiónicos (compreendendo uma ou várias cargas catiónicas na sua porção polar) ou lipidos neutros.
Relativamente aos lipidos catiónicos, podem tratar-se mais particularmente de lipopoliaminas, ou seja de qualquer molécula anfifílica compreendendo pelo menos uma região hidrofílica poliamina e uma região lipofílica ligadas covalentemente entre si através de um braço químico. Com vantagem, a região poliamina das lipopoliaminas utilizadas no quadro da invenção responde à fórmula geral H2N-(-CH) m-NH-) i-H na qual m é um número inteiro superior ou igual a 2 e 1 é um 9 número inteiro superior ou igual a 1, podendo m variar entre os diferentes grupos de carbono compreendidos entre duas aminas. Preferencialmente, m está compreendido entre 2 e 6 inclusivamente e 1 está compreendido entre 1 e 5 inclusivamente. Ainda mais preferencialmente, a região poliamina está representada pela espermina ou um análogo da espermina que tenha conservado as suas propriedades de ligação ao ADN. A região lipofilica pode ser uma ou várias cadeias hidrocarbonadas, saturadas ou não, colesterol, um lípido natural ou um lipido sintético capazes de formar fases lamelares ou hexagonais.
Com vantagem, utiliza-se no quadro da presente invenção lipopoliaminas tais como definidas no pedido de patente EP 394 111. Este pedido descreve igualmente um processo que pode ser utilizado para a preparação destas lipopoliaminas. De modo particularmente vantajoso, utiliza-se no quadro da invenção a dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) ou a 5-carboxiespermilamida da palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPFS).
Outros adjuvantes particularmente preferidos para a realização das composições da invenção são representados por lípidos neutros. A utilização de lipidos neutros é particularmente vantajosa quando a razão das cargas R (aminas/fosfatos) é baixa. Mais preferencialmente, os lipidos neutros utilizados no quadro da presente invenção são lipidos com 2 cadeias gordas.
De modo particularmente vantajoso, utilizam-se lipidos naturais ou sintéticos, zwitteriónicos ou desprovidos de 10 qualquer carga iónica nas condições fisiológicas. Podem ser escolhidos mais particularmente entre a dioleoilfosfatidil-etanolamina (DOPE), a oleoil-palmitoil-fosfatidiletanolamina (POPE), o di-estaroil, -palmitoil, -miristoil fosfatidil-etanolamina, assim como os seus derivados N-metilados 1 a 3 vezes; os fosfatidilgliceróis, os diacilgliceróis, os glicosildiacilgliceróis, os cerebrósidos (tais como especialmente os galactocerebrósidos), os esfingolipidos (tais como especialmente as esfingomielinas) ou ainda os asialogangliósidos (tais como especialmente os asialo GMl e GM2) .
Estes diferentes lipidos podem ser obtidos seja por síntese, seja por extracção a partir de órgãos (exemplo: o cérebro) ou de ovos, por técnicas clássicas bem conhecidas do perito na técnica. Em particular, a extracção de lipidos naturais pode ser realizada por intermédio de solventes orgânicos (ver igualmente Lehninger, Biochemistry).
Preferencialmente, as composições da invenção compreendem, além do polímero catiónico nas razões citadas adiante, de 0,1 a 20 equivalentes molares de adjuvante para 1 equivalente molar de fosfato do ácido nucleico, e, mais preferencialmente, de 1 a 5.
Num modo de realização particularmente vantajoso, as composições da presente invenção compreendem um elemento de definição de alvos que permite orientar a transferência do ácido nucleico. Este elemento de definição de alvos pode ser um elemento de definição de alvos extracelular, que permite orientar a transferência do ácido nucleico para certos tipos de células ou certos tecidos desejados (células tumorais, células hepáticas, células hematopoiéticas, etc). Pode 11 igualmente tratar-se de um elemento de definição de alvos intracelular, que permite orientar a transferência do ácido nucleico para certos compartimentos celulares privilegiados (mitocôndrias, núcleo, etc).
Mais preferencialmente, o elemento de definição de alvos é ligado, de modo covalente ou não covalente, ao polímero de fórmula (I) . A ligação pode especialmente ser obtida por interacção iónica com os iões amónio, ou por ataque nucleofílico das aminas do polímero em elementos de definição de alvos que compreendem um grupo nucleófugo (halogéneo, tosilato, etc.), um éster activado (hidroxisuccinimida, etc) ou ainda um isotiocianato. 0 elemento de definição de alvos pode igualmente estar ligado ao ácido nucleico.
Entre os elementos de definição de alvos que podem ser utilizados no quadro da invenção, podem citar-se os açúcares, os péptidos, os oligonucleótidos ou os lípidos. Preferencialmente, tratam-se de açúcares e/ou péptidos tais como anticorpos ou fragmentos de anticorpos, ligandos de receptores celulares ou fragmentos destes, receptores ou fragmentos de receptores, etc. Em particular, pode tratar-se de ligandos de receptores de factores de crescimento, de receptores de citocinas, de receptores de lecitinas celulares ou de receptores de proteínas de adesão. Pode-se igualmente citar o receptor da transferrina, os HDL e os LDL. 0 elemento de definição de alvos pode igualmente ser um açúcar que permite definir como alvos os receptores asialoglicoprotéicos, ou ainda um fragmento Fab de anticorpo que permita definir como alvo um receptor do fragmento Fc das imunoglobulinas. 12
As composições segundo a invenção que podem ser formuladas em vista de administrações por via tópica, cutânea, oral, rectal, vaginal, parentérica, internasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-ocular, transdérmica, etc. De preferência, as composições farmacêuticas da invenção que contêm um veiculo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável, especialmente para uma injecção directa ao nivel do órgão desejado, ou para uma administração por via tópica (sobre a pele e/ou a mucosa) . Pode tratar-se em particular de soluções estéreis, isotónicas, ou de composições secas, especialmente liofilizadas, as quais, por adição segundo o caso de água esterilizada ou de soro fisiológico, permitem a constituição de solutos injectáveis. As doses de ácido nucleico utilizadas para a injecção assim como o número de administrações podem ser adaptadas em função de diferentes parâmetros, e especialmente em função do modo de administração utilizado, da patologia envolvida, do gene a expressar, ou ainda da duração do tratamento procurada.
Como indicado adiante, as composições segundo a invenção podem ser utilizadas para a transferência de ácidos nucleicos nas células in vivo, in vitro ou ex vivo. Em particular, os exemplos mostram que os polímeros catiónicos da invenção podem ser utilizados para transferir de modo muito eficaz ácidos nucleicos em diversos tipos de células, e em particular em certos tipos de células habitualmente difíceis de transfectar. Entre os tipos de células testados pode-se citar especialmente os fibroblastos, as células hepáticas, os carcinomas, as células renais e os neurónios. Entre outros aspectos, os exemplos apresentados adiante ilustram igualmente a eficácia dos polímeros da invenção para a transferência de genes in vivo. Os resultados obtidos com os vectores da invenção são superiores àqueles observados nas 13 mesmas condições com outros agentes de transfecção, e demonstram assim as potencialidades elevadas das composições da invenção. 0 pedido descreve um método particularmente vantajoso para o tratamento de doenças, compreendendo a administração in vivo de um ácido nucleico apto a corrigir a referida doença associado a um polímero catiónico tal como definido adiante. Mais particularmente, este método é aplicável às doenças que resultam de uma deficiência num produto proteico ou nucleico e o ácido nucleico administrado codifica para o referido produto proteico ou contém o referido produto nucleico.
As composições farmacêuticas da invenção constituem assim ferramentas particularmente vantajosas para a administração e a transferência de ácidos nucleicos in vivo. A presente invenção será mais completamente descrita com auxílio dos exemplos que se seguem, que devem ser considerados como ilustrativos.
Legenda das figuras:
Figura 1: Eficácia de transfecção do PEI800K a pH 7 em função da razão R (aminas do polímero / fosfatos do ácido nucleico)
Figura 2: Eficácia de transfecção do PEI800K a pH 6 em função da quantidade de ADN
Figura 3: Eficácia de transfecção do PEI800K a pH 6 em função da razão R
Figura 4 Figura 5 Figura 6
Eficácia de transfecção do PEI800K em função do pH Comparação entre ο PEI800K e a polilisina Teste de citotoxicidade do PEI50K 14
Figura 7: Eficácia de transfecção do PEI50K na presença de adjuvantes
Figura 8: Eficácia do PEI para a transfecção das células HeLa Figura 9: Eficácia do PEI para a transfecção das células hepáticas e renais
Figura 10:Eficácia do PEI para a transferência do ADN plasmidico nos neurónios embrionários Figura 11: Eficácia do PEI para a transferência de oligonucleótidos nos neurónios embrionários Figura 12: Eficácia do PEI para a transferência do ADN in vivo EXEMPLO 1 - Plasmídeos utilizados para a transferência de genes in vivo
Foram utilizados três tipos de construções para evidenciar a actividade das composições da invenção: Plasmídeos que comportam o gene que codifica para a luciferase (Luc), plasmídeos que comportam o gene que codifica para a β-galactosidase (gene LacZ) e plasmídeos que comportam o gene que codifica para a cloramfenicol acetil transferase (CAT). 1.1. Plasmídeos que comportam o gene Luc 0 plasmídeo pCMV-luc comporta o promotor do Citomegalovírus (CMV), extraído do plasmídeo vector pcDNA3 (Invitrogen) por corte com os enzimas de restrição MluI e HindIII, situado a montante do gene que codifica para a luciferase, inserido nos locais MluI e HindIII no vector pGL basic Vector (Promega) . 0 plasmídeo pGL2-Luc é de origem comercial (Promega). 15 0 plasmideo T3E-Luc contém um oligonucleótido sintético que corresponde a um elemento de resposta palindrómico à hormona da tiróide (Glass et al., Cell 56 (1989) 697).
1.2 Plasmideos comportando o gene LacZ 0 plasmideo pCMV-pGal (Clontech) comporta o promotor CMV situado a montante do gene LacZ que codifica para a β-galactosidase de Escherichia coil. 0 vector pSV-nls LacZ (pAOnlsLacZ) comporta o mesmo promotor, uma sequência de localização nuclear (proveniente do vírus SV40) localizada em fase e a montante do gene LacZ. Esta construção permite a expressão da proteína de fusão nls-p-galactosidase no núcleo das células (cf. De Luze et al., PNAS 90 (1993) 7322).
1.3. Plasmideos comportando o gene CAT
Os plasmideos que têm como gene repórter o gene que codifica para a cloramfenicol acetil transferase (CAT) sob o controlo dos promotores RSV (pRSV-CAT) e SV40 (pSV40-CAT) foram publicados (Boutiller et al., Prog. NeuroPhyschoPharmacol. Et Biol. Psychuat. 16 (1992) 959; de Luze et al. PNAS 90 (1993) 7322) . EXEMPLO 2 - Transferência do ácido nucleico em fibroblastos.
Este exemplo descreve a transferência do plasmideo pGL2-luc para o interior de fibroblastos 3T3 por intermédio de polietileno imina 800 000 Da.
Protocolo: Uma solução 5,375 μΜ de PEI 800K é preparada e o pH é ajustado a 7 graças a uma solução de ácido clorídrico 16 IN. Esta solução é utilizada para as experiências de transferência de genes.
Protocolo de transfecção: Os fibroblastos 3T3 são inoculados numa placa de 24 poços 24 horas antes da transfecção (50000 por poço) . São transfectados com 2 pg de plasmideo pGL2-Luc por poço segundo o seguinte protocolo:
Diluem-se separadamente e misturam-se 2 pg de plasmideo e diferentes volumes da solução 5,375 pM de PEI 800K (em função da razão de equivalentes de carga desejada) em 50 pL de NaCl a 150 mM. Após 10 minutos, as duas soluções são reunidas e homogeneizadas. Após um novo período de 10 minutos, adicionam-se 900 pL de DMEM. A solução assim obtida é homogeneizada e após 10 minutos, é repartida sobre as células previamente lavadas com meio DMEM sem soro. Ao fim de 2 horas de transfecção, adiciona-se 100 pL de SFB (soro fetal bovino) por poço. A expressão é parada 24 horas depois.
Dosagem de luciferase. Para tal, o sobrenadante foi incubado na presença de um tampão compreendendo luciferina, coenzima A e ATP, e a luz emitida (geralmente durante 10 segundos) foi medida com um luminómetro (Wood K. (1990) Promega Notes, 28) .
Os resultados obtidos são apresentados na figura 1. Mostram que o PEI permite transferir de modo eficaz o plasmideo pGL2-luc para fibroblastos. Mostram igualmente que a actividade em unidades de luz relativa (RLU = "relative light unit") é particularmente boa quando se utilizam entre 5 e 20 equivalentes de aminas do PEI em relação aos fosfatos do ADN. Numa experiência controlo, o plasmideo isolado origina um sinal de cerca de 100 RLU. 17 EXEMPLO 3 - Efeito da quantidade de ADN na eficácia da transfecção
Este exemplo descreve o efeito da quantidade de ácido nucleico sobre a eficácia da transferência para fibroblastos 3T3 pelo PEI800K.
Os fibroblastos 3T3 são inoculados numa placa de 24 poços 24 horas antes da transfecção (50000 por poço). São transfectados com quantidades crescentes de plasmideo pCMV-Luc por poço e uma razão de cargas constante (9 equivalentes) segundo o protocolo descrito anteriromente. Dois pontos foram realizados completando a quantidade de plasmideo a dois pg por poço do plasmideo pGEM (PROMEGA) não contendo o gene estudado. Ao fim de 3 horas de transfecção, adiciona-se 100 pL de soro SFB por poço. A expressão é parada 24 horas depois.
Os resultados obtidos são representados na figura 2. A eficácia de transfecção aumenta com a quantidade de plasmideo utilizada aquando da transfecção. A adição de ADN veiculo não transcrito (pGEM) não contribui para a transfecção. EXEMPLO 4 - Transferência de ácidos nucleicos em fibroblastos: Estudo da influência da razão aminas/fosfatos.
Este exemplo descreve a transferência de ácidos nucleicos em fibroblastos a pH 6 por intermédio de uma composição segundo a invenção compreendendo o ácido nucleico e ο PEI800K em diferentes razões R (aminas/fosfatos). 18
Protocolo: Uma solução 5,375 μΜ de PEI 800 K é preparada e o pH é ajustado a 6 graças a uma solução de ácido clorídrico 1 N. Esta solução é utilizada para as experiências de transferência de genes.
Os fibroblastos 3T3 são inoculados numa placa de 24 poços 18 horas antes da transfecção (50000 por poço). São transfectados com 2 pg de plasmídeo pGL2-Luc por poço segundo o protocolo utilizado no exemplo 2.
Os resultados obtidos são apresentados na figura 3. Estes mostram que as composições segundo a invenção são particularmente eficazes em toda uma gama de razões R compreendida entre 6 e 22.
EXEMPLO 5 - Eficácia de transfecção em função do pH
Este exemplo descreve a transferência de ácidos nucleicos em fibroblastos por intermédio de uma composição segundo a invenção compreendendo o ácido nucleico e o PEI 800K, em diferentes condições de pH. O protocolo utilizado é idêntico àquele descrito no exemplo 2. O pH é ajustado por adição a uma solução de ácido clorídrico 1 N.
Os resultados obtidos são apresentados na figura 4. Estes mostram que as composições segundo a invenção podem ser utilizadas a diferentes pH e especialmente em zonas de pH fisiológico (pH 5-8) . EXEMPLO 6 - Comparação da eficácia de transfecção do PEI e da polilisina 19
Este exemplo descreve os resultados comparativos obtidos com uma composição segundo a invenção e com um outro polímero catiónico, a polilisina, para a transferência de ácidos nucleicos em fibroblastos.
Protocolo: A polilisina (PLL) utilizada nesta experiência é polilisina, HBr de peso médio 50 K. A concentração final em cloroquina é 100 μΜ. O PEI está a pH 6.
Protocolo: Os fibroblastos 3T3 são inoculados numa placa de 24 poços 18 horas antes da transfecção (50000 por poço) . São transfectados com plasmídeo pCMV-Luc segundo o protocolo utilizado no exemplo 2. As células transfectadas com a PLL na presença de cloroquina são lavadas ao fim de 2 horas e colocadas em meio com 10% de soro. A expressão é parada 24 horas depois.
Os resultados obtidos são apresentados na figura 5. Estes demonstram claramente que as composições segundo a invenção que permitem transferir ácidos nucleicos em fibroblastos com uma eficácia bem superior aos vectores poliméricos catiónicos anteriores tais como a polilisina. EXEMPLO 7 - Comparação da eficácia de transfecção dos
Fibroblastos NIH 3T3 pelo PEI 50K e o PEI 800K
Este exemplo descreve a utilização e a comparação de dois polímeros de PEI (PEI 50K e PEI 800K) , para a transferência de ácidos nucleicos em células.
Protocolo: As células são inoculadas 24 horas antes de transfecção com 50000 células em poços de 16 mm. São 20 transfectadas com o plasmídeo pCMV Luc complexado com o PEI. A razão de equivalente molar amina de PEI/fosfato de ácido nucleico varia de 6 a 45 equivalentes. Para cada poço, dilui-se separadamente o PEI e 2 pg de ADN em 50 pL de NaCl (150 mM) . As soluções são de seguida misturadas e depois homogeneizadas. Após 10 minutos, este volume é adicionado às células. Após 24 horas, as células são lisadas, a solução de lise é centrifugada, e o sobrenadante é utilizado para dosear a actividade de luciferase. O doseamento da proteína é efectuado numa alíquota deste sobrenadante pelo teste de BCA. A actividade de luciferase é expressa em unidade de luz (RLU)/10 segundos de integração/mg de proteína.
Os resultados obtidos são apresentados na tabela abaixo. R 0 6 eq 9 eq 18 eq 45 eq PEI 50K RLU/lOs/mg 7100 11000 760000 12000000 2450000 Prot PEI 800K 6253 200000 16700000 5640000 525000 RLU/lOs/mg Prot
Estes resultados indicam claramente que o PEI 50K possui propriedades transfectantes tão vantajosas como o PEI 800 K.
EXEMPLO 8 - Teste de citotoxicidade do PEI
Pretendemos estudar a toxicidade eventual do PEI 50K nos fibroblastos NIH3T3. Para este estudo, escolhemos o teste MTT que permite avaliar a capacidade das células de reduzir o tetrazólio de MTT em formazano de MTT, através da enzima mitocondrial succinato desidrogenase. O protocolo de transfecção é o mesmo que no exemplo 7 (a quantidade de ADN por poço permanece fixa (2 pg), variando o número de 21 equivalentes molar amina de PEI/fosfato de ADN de 9 a 24) . Após 24 horas de transfecção, as células são lavadas três vezes com PBS, depois são incubadas durante 90 minutos com 0,05 mg/mL de MTT. No final desta incubação, o meio das células é eliminado, as células são lavadas três vezes com PBS, depois dissolvidas em 1 mL de SDS a 10% durante 10 minutos. A densidade óptica das amostras é lida a 540 nm.
Os resultados são apresentados na figura 6. Estes mostram que nas condições do nosso estudo o PEI 50K não provoca uma mortalidade significativa para os fibroblastos NIH 3T3. EXEMPLO 9 - Utilização de um adjuvante para melhorar o poder transfectante
Este exemplo descreve a utilização de composições segundo a invenção compreendendo um polímero catiónico e um adjuvante. O adjuvante utilizado é ou um lípido neutro (a DOPE); ou uma lipopoliamina (o DOGS).
Protocolo: adição da DOPE:
Foram estudadas quatro razões equivalentes molares de amina de PEI/fosfato de ADN: 6, 9, 18 e 21. Para cada poço, adicionam-se 12 nanomoles de DOPE à mistura PEI e ADN. Esta solução é de seguida utilizada para a transfecção como descrito no exemplo 7.
Adição do DOGS: Para cada poço, adiciona-se 4 equivalentes molares de amina de DOGS/fosfato de ADN (ou seja 6 nanomoles de DOGS para 6 nanomoles de fosfatos) à solução de PEI antes da etapa de complexação com o ADN- A transfecção é efectuada de seguida como descrito no exemplo 7. 22
Os resultados obtidos são apresentados na figura 7. Estes mostram claramente que a adição de DOPE ou de DOGS permite aumentar as propriedades de transfecção, especialmente para baixas razões de equivalentes molares de amina de PEI/fosfatos de ADN. EXEMPLO 10 - Transferência de gene nas Células HeLa
Este exemplo demonstra que as composições segundo a invenção podem ser utilizadas para a transferência de genes em diferentes tipos de células, e especialmente em células de carcinoma uterino HeLa.
Protocolo: As células HeLa são inoculadas 24 horas antes da transfecção a 50000 células por poços de 16 mm. São de seguida transfectadas com o plasmideo pCMV Luc complexado ou com o PEI ou com a lipopoliamina (DOGS) . Quatro razões de equivalentes molares de amina de PEI 50K ou PEI 800K/fosfato de ADN foram estudadas: 6, 9, 18, 21. A lipopoliamina é utilizada a 8 equivalentes molares de amina/fosfato (12 nanomoles de DOGS).
Os resultados obtidos são apresentados na figura 8. Mostram claramente que as composições segundo a invenção compreendem um polímero catiónico eventualmente associado a um adjuvante, permitindo transfectar as células HeLa de modo muito mais eficaz que os sistemas anteriores (a lipopoliamina, especialmente DOGS). EXEMPLO 11 - Transferência de genes em diferentes tipos de células. 23
Este exemplo mostra ainda que as composições segundo a invenção podem ser utilizadas para a transferência de genes em tipos de células muito variados, tais como fibroblastos, carcinomas uterinos, hepatocitomas ou células renais. Mais particularmente, este exemplo descreve a transfecção das células HepG2, K 562 e de culturas primárias de músculo liso de coelho por PEI com 9 equivalentes de cargas a pH 6.
As células HepG2 são inoculadas em placas de 24 poços 24 horas antes da transfecção (50000 células por poço) . São transfectadas com o plasmídeo pCMV-Luc segundo o protocolo descrito no exemplo 2. Ao fim de 4 horas de transfecção, adiciona-se 100 pL de soro SFB por poço. A expressão é parada 30 horas depois.
As células K 562 são inoculadas em placas de 24 poços, em 0,5 mL de meio RPMI sem soro uma hora antes de transfecção. São transfectadas com o plasmideo pCMV-Luc sefundo o protocolo seguinte: A quantidade de plasmideo desejada e o PEI são diluídos separadamente em 50 pL de NaCl a 150 mM e misturados. Após 10 minutos, as duas soluções são reunidas e homogeneizadas. Após um novo período de 10 minutos, adiciona-se 400 pL de RPMI. A solução assim obtida é homogeneizada e após 10 minutos ela é repartida sobre as células. Ao fim de 4 horas de transfecção, adiciona-se 100 pL de soro SFB por poço. A expressão é parada 30 horas depois.
As culturas primárias de músculo liso de coelho foram preparadas como descrito por Fallier-Becker. As células foram de seguida transfectadas seja com 1 pg seja com 2 pg de plasmídeo pCMV-Luc complexado com o PEI (segundo o protocolo descrito no exemplo 7) . A expressão da luciferase é parada 24 ou 48 horas após a transfecção. 24
Os resultados obtidos são apresentados na figura 9. Estes mostram claramente que as composições segundo a invenção permitem a transfecção eficaz de tipos de células muito variados e diferentes. EXEMPLO 12 - Transferência de ADN plasmidico numa cultura primária de neurónios embrionários: demonstração de uma actividade biológica.
As culturas primárias de neurónios foram preparadas como descrito por Lezoualc'h et al. Após 36 h, as culturas foram transfectadas com 2 pg de plasmideo TRE-Luc (comportando o gene Luc sob controlo de um elemento de resposta à hormona da tiróide T3) e 0,5 pg de ADN veiculo por poço.
Foram estudadas duas condições experimentais: 9 equivalentes de aminas em relação aos fosfatos: 1 pg de plasmideo foi introduzido em 2,28 pL de uma solução aquosa de PEI800K a 100 mM, pH 7. 13 equivalentes de aminas em relação aos fosfatos: 1 pg de plasmideo foi introduzido em 3,33 pL de uma solução aquosa de PEI800K a 100 mM, pH 7.
Previamente à complexação, o plasmideo foi diluído em 50 pL de NaCl 150 mM, e o PEI foi igualmente diluído numa segunda alíquota de 5 pL de NaCl a 150 mM. As soluções foram de seguida misturadas e aplicadas em células durante 1 h. O meio de transfecção foi de seguida removido e substituído pelo meio de cultura fresco, com ou sem T3 (1 nM) . Após 24 h, as células foram lisadas, a solução de lise foi centrifugada, e o sobrenadante foi utilizado para dosear a actividade de luciferase. 25
Os resultados obtidos são apresentados na figura 10. Estes mostram claramente que as composições segundo a invenção permitem transferir ADN em células neuronais, e que o ADN assim transfectado é funcional dado que a sua actividade é amplificada na presença de T3. Na experiência controlo efectuada na presença apenas do plasmídeo, não foi detectada qualquer actividade de luciferase. EXEMPLO 13 - Transferência de oligonucleótidos anti-senso numa cultura primária de neurónios embrionários.
As experiências foram realizadas em culturas primárias de neurónios preparadas como no exemplo 12. Após 36 horas, as culturas foram transfectadas com 2 μΜ de oligonucleótido antisenso 18ómero (ODN) complexado com 9 equivalentes de aminas em relação aos fosfatos de PEI800K. O ODN utilizado é dirigido contra uma região do gene que codifica para o receptor alfa das hormonas da tiróide. A sua sequência é a seguinte: 5'-GCTGGGCTTCTGTTCCAT-3'
Para 4 poços de 250 pL de meio de cultura, foram utilizados os produtos seguintes: pL de uma solução de ODN a 0,25 mM diluídos em 10 pL de NaCl a 150 mM, e, 20,8 pL de uma solução aquosa de PEI800K a 12 mM, pH 7, previamente diluídas numa segunda alíquota de 51,2 pL de NaCl a 150 mM. 26
As soluções foram de seguida misturadas e 20 pL da mistura foram aplicados nas células durante 45 min. O meio de transfecção foi de seguida removido e substituído por meio de cultura fresco. As células foram de seguida fixadas numa solução de paraformaldeído a 4%, lavadas, montadas em Mowiol, e examinadas com um microscópio de fluorescência.
Os resultados obtidos são apresentados na figura 11. Estes mostram claramente que as composições segundo a invenção permitem transferir oligonucleótidos anti-senso nas células neuronais. Na experiência controlo efectuada na presença apenas do oligonucleótido, não foi detectada nenhuma fluorescência. EXEMPLO 14 - Utilização das composições da invenção para a transferência de ácidos nucleicos in vivo, no cérebro de ratinhos recém-nascidos.
Este exemplo descreve a transferência do plasmídeo pCMV-Luc in vivo, no cérebro de ratinhos recém-nascidos. Demonstra as propriedades particularmente vantajosas das composições segundo a invenção, especialmente para aplicações de terapia génica.
Diluíram-se 30 pg de plasmídeo pCMV-luc (7,5 de uma solução de armazenagem a 4 pg/pL) em 22,5 pL de glucose a 5% estéril (concentração final de 1 pg/pL). De seguida, adicionaram-se 8,5 pL de PEI800K a 100 mM (preparada em água e tamponizada a pH 6,9). A composição assim obtida contém 9 equivalentes de aminas em relação aos fosfatos. A mistura foi rapidamente agitada num vórtex e utilizada para injecções intracerebrais em ratinhos recém-nascidos. Para 27 tal, os ratinhos foram anestesiados pelo frio (colocados sobre uma folha de alumínio em contacto com gelo), e depois injectaram-se 2 pL de mistura (2 pg de ácido nucleico) por ratinho. As injecções foram realizadas no córtex, com auxílio de um micro-manipulador e uma micro-seringa ligados a um micro-eléctrodo.
Os cérebros foram recolhidos 48 horas mais tarde, homogeneizados, centrifugados e o sobrenadante foi utilizado para o doseamento da luciferase. Para tal, o sobrenadante foi incubado na presença de um tampão comrpeendendo luciferina, coenzima A e ATP, e a luz emitida (geralmente durante 10 segundos) foi medida com um luminómetro (Wood K. (1990) Promega Notes, 28) .
Os resultados obtidos são apresentados na figura 12. Estes mostram claramente que as composições que permitem transferir eficazmente o plasmídeo no cérebro de ratinhos enquanto que não é observada qualquer actividade significativa de luciferase quando a transferência é realizada por intermédio do plasmídeo isolado. 08-10-2007 28

Claims (28)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição constituída por uma solução de um ácido nucleico e por uma solução de um plasmídeo catiónico reunidas e homogeneizadas, tendo o polímero catiónico a fórmula geral (I) : r^CH5> m na qual - R pode ser um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula - n é um número inteiro compreendido entre 2 e 10; - p e q são números inteiros, entendendo-se que a soma p+q é tal que o peso molecular médio do polímero está compreendido entre 100 e 107 Da, e as proporções respectivas do polímero e do ácido nucleico são escolhidas de modo que a razão R aminas do polímero fosfatos do ácido nucleico esteja compreendida entre 5 e 30.
  2. 2. Composição segundo a reivindicação 1 caracterizada por na fórmula (1), n estar compreendido entre 2 e 5. 1
  3. 4. Composição segundo uma das reivindicações 1 a 3 caracterizada pelo polímero ser escolhido entre a polietileno imina (pei) e a polipropileno imina (PPI).
  4. 5. Composição segundo a reivindicação 4 caracterizada pelo polímero ser escolhido entre a polietileno imina de peso molecular 50000 (PEI50K) e a polietileno imina de peso molecular médio 800000 (PEI800K).
  5. 6. Composição segundo a reivindicação 5 caracterizada pela razão R ser compreendida entre 5 e 15.
  6. 7. Composições segundo uma das reivindicações precedentes caracterizada por compreender ainda um ou vários adjuvantes capazes de se associarem ao complexo polímero/ácido nucleico e melhorar o poder transfectante sendo escolhido entre lípidos, protéinas, lipopoliaminas e polímeros sintéticos.
  7. 8. Composições segundo a reivindicação 7 caracterizada pelo adjuvante ser um lípido catiónico.
  8. 9. Composição segundo a reivindicação 8 caracterizada pelo lípido catiónico ser uma ou várias lipopoliaminas.
  9. 10. Composição segundo a reivindicação 9 caracterizada pela lipopoliamina corresponder à fórmula geral H2N-(-CH)m-NH-) i-H na qual m é um número inteiro compreendido entre 2 e 6 e 1 é um número inteiro compreendido entre 1 e 5, podendo m variar entre os diferentes grupos de carbono compreendidos entre duas aminas.
  10. 11. Composição segundo a reivindicação 10 caracterizada pela lipopoliamina ser escolhida entre a dioctadecilamidoglicil 2 espermina (DOGS) ou a 5-carboxiespermilamida da palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPFS).
  11. 12. Composição segundo a reivindicação 7 caracterizada pelo adjuvante ser um ou vários lipidos neutros.
  12. 13. Composição segundo a reivindicação 12 caracterizada pelo ou pelos lipidos neutros serem escolhidos entre os lipidos sintéticos ou naturais, zwitteriónicos ou desprovidos de carga iónica nas condições fisiológicas.
  13. 14. Composição segundo a reivindicação 12 caracterizada pelo ou pelos lipidos neutros serem escolhidos entre a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), a oleoil-palmitoil-fosfatidiletanolamina (POPE), o di-estaroil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina, assim como os seus derivados N-metilados 1 a 3 vezes; os fosfatidilgliceróis, os diacilgliceróis, os glicosildiacil-gliceróis, os cerebrósidos (tais como especialmente os galactocerebrósidos), os esfingolipidos (tais como especialmente as esfingomielinas) ou ainda os asialogangliósidos (tais como especialmente os asialo GMl e GM2).
  14. 16. Composição segundo a reivindicação 1 caracterizada pelo ácido nucleico ser um ácido desoxirribonucleico.
  15. 17. Composição segundo a reivindicação 1 caracterizada pelo ácido nucleico ser um ácido ribonucleico.
  16. 18. Composição segundo a reivindicação 16 ou 17 caracterizada pelo ácido nucleico ser modificado quimicamente. 3
  17. 19. Composição segundo a reivindicação 16 a 18 caracterizada pelo ácido nucleico ser um anti-senso.
  18. 20. Composição segundo uma das reivindicações 16 a 18 caracterizada pelo ácido nucleico comportar um gene terapêutico.
  19. 21. Composição segundo uma das reivindicações 16 a 19 caracterizada pelo ácido nucleico codificar para uma proteína antigénica.
  20. 22. Composição segundo a reivindicação 21 caracterizada pelo ácido nucleico codificar para uma proteína virai.
  21. 23. Composição segundo a reivindicação 7 caracterizada por compreender de 0,1 a 20 equivalentes molares de adjuvante por 1 equivalente molar de fosfatos do ácido nucleico, e, mais preferencialmente, de 1 a 5.
  22. 24. Composição segundo qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por compreender ainda um elemento de definição de alvos constituído por um açúcar e/ou um péptido, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um ligando de receptor celular ou um fragmento deste, ou receptor ou fragmento de receptor.
  23. 25. Composição segundo a reivindicação 22 ou 25 caracterizada pelo elemento de definição de alvos estar ligado de modo covalente ao polímero de fórmula (I).
  24. 26. Composição segundo qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por compreender pelo menos um 4 veículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável.
  25. 27. Composição segundo qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para uma aplicação sobre a pele e/ou as mucosas.
  26. 28. Composição tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 para utilização como medicamento.
  27. 29. Composição tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 para utilização como vacina.
  28. 30. Utilização de um polímero catiónico tal como definido na reivindicação 1 para a transferência in vitro de ácidos nucleicos em células. 08-10-2007 5
PT95925026T 1994-07-13 1995-07-07 Composição contendo ácidos nucleicos e polímeros catiónicos, sua preparação e utilização PT770140E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9408735A FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1994-07-13 Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT770140E true PT770140E (pt) 2007-10-19

Family

ID=9465376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT95925026T PT770140E (pt) 1994-07-13 1995-07-07 Composição contendo ácidos nucleicos e polímeros catiónicos, sua preparação e utilização

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6013240A (pt)
EP (1) EP0770140B1 (pt)
JP (1) JP4275728B2 (pt)
KR (1) KR100424802B1 (pt)
AT (1) ATE367448T1 (pt)
AU (1) AU2930795A (pt)
CA (1) CA2194797C (pt)
DE (1) DE69535540T9 (pt)
DK (1) DK0770140T3 (pt)
ES (1) ES2290952T3 (pt)
FI (1) FI119738B (pt)
FR (1) FR2722506B1 (pt)
IL (1) IL114566A (pt)
MX (1) MX9700270A (pt)
NO (1) NO323110B1 (pt)
PT (1) PT770140E (pt)
WO (1) WO1996002655A1 (pt)
ZA (1) ZA955849B (pt)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
IL122290A0 (en) * 1995-06-07 1998-04-05 Inex Pharmaceuticals Corp Lipid-nucleic acid complex its preparation and use
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
FR2739292B1 (fr) * 1995-09-28 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations
GB2324534B (en) * 1996-01-06 2000-05-10 Danbiosyst Uk Composition for delivery of nucleic acid to a cell
EP0934082B1 (de) * 1996-10-23 2002-07-17 SKW Trostberg Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von biologisch aktiven polymernanopartikel-nucleinsäure-konjugaten
US6071533A (en) 1996-11-12 2000-06-06 The Regents Of The University Of California Preparation of stable formulations of lipid-nucleic acid complexes for efficient in vivo delivery
US6884430B1 (en) 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
EP0973928B1 (en) 1997-03-11 2010-05-05 Regents Of The University Of Minnesota Dna-based transposon system for the introduction of nucleic acid into dna of a cell
US5912225A (en) 1997-04-14 1999-06-15 Johns Hopkins Univ. School Of Medicine Biodegradable poly (phosphoester-co-desaminotyrosyl L-tyrosine ester) compounds, compositions, articles and methods for making and using the same
US6524613B1 (en) 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
KR100615117B1 (ko) 1997-09-15 2006-08-22 제네틱 이뮤너티, 엘엘씨. 피부의 항원제시 세포에 유전자를 전달하는 방법
US20020022034A1 (en) * 1997-09-15 2002-02-21 Julianna Lisziewicz Therapeutic DNA vaccination
DE19743135A1 (de) * 1997-09-30 1999-04-01 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Biologisch verträgliche niedermolekular Polyethylenimine
WO1999065531A1 (en) * 1998-06-18 1999-12-23 Johns Hopkins University School Of Medicine Polymers for delivery of nucleic acids
US6916490B1 (en) 1998-07-23 2005-07-12 UAB Research Center Controlled release of bioactive substances
EP1044679B1 (en) * 1998-11-02 2012-12-26 Terumo Kabushiki Kaisha Stable Liposomes for Targeted Drug Delivery
US7160682B2 (en) * 1998-11-13 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid transfer vector for the introduction of nucleic acid into the DNA of a cell
ATE338540T1 (de) * 1999-04-02 2006-09-15 Res Dev Foundation Polyethyleneimine: dns-formulierungen für die aerosol-verabreichung
US6770740B1 (en) 1999-07-13 2004-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods
FR2797402B1 (fr) 1999-07-15 2004-03-12 Biomerieux Stelhys Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
DE19960206A1 (de) * 1999-12-14 2001-07-19 Frank Czubayko Komplexierung von RNS mit Polyethyleniminen zur deren Stabilisierung und zellulären Einschleusung
EP1156832A1 (en) 1999-12-28 2001-11-28 Transgene S.A. Use of lithium (li?+ ) for the preparation of a composition for transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy
JP2003519199A (ja) * 1999-12-30 2003-06-17 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 遺伝子治療のための新規なコロイド合成ベクター
FR2805271B1 (fr) * 2000-02-18 2002-04-26 Aventis Pharma Sa Procede de preparation de polyalkylenimines fonctionnalises, compositions les contenant et leurs utilisations
HUP0303379A3 (en) * 2000-09-05 2004-03-01 Gencell Sa Acid-sensitive compounds, use thereof and pharmaceutical compositions containing them
FR2813605B1 (fr) * 2000-09-05 2002-10-18 Aventis Pharma Sa Composes acidosensibles, leur preparation et utilisations
FR2814370B1 (fr) 2000-09-22 2004-08-20 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau
DE10145134A1 (de) * 2000-10-09 2002-05-16 Bayer Ag Komplexe zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen
AU2001289943A1 (en) * 2000-10-09 2002-04-22 Bayer Aktiengesellschaft Complexes for transferring nucleic acids into cells
US20020091242A1 (en) 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
CA2437555A1 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Yiyu Zou Stabilised polymeric aerosols for pulmonary gene delivery
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
US20040234586A1 (en) * 2001-06-11 2004-11-25 Sylvain Meloche Compositions and methods for enhancing nucleic acid transfer into cells
AU2002339224B2 (en) 2001-09-14 2008-10-09 Kuros Us Llc Packaging of immunostimulatory substances into virus-like particles: method of preparation and use
JP2005508396A (ja) * 2001-11-02 2005-03-31 イントラディグム、コーポレイション 核酸送達ビヒクルのための治療方法
HUE036402T2 (hu) 2002-01-17 2018-07-30 Alfa Laval Corp Ab Merülõpárologtató, amely lemezes hõcserélõt és hengeres házat tartalmaz, ahol a lemezes hõcserélõ el van helyezve
WO2003089618A2 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Regents Of The University Of Minnesota Transposon system and methods of use
WO2003099225A2 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Mirus Corporation Compositions for delivering nucleic acids to cells
ATE485031T1 (de) 2002-06-28 2010-11-15 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
CA2498777C (en) * 2002-09-13 2015-01-13 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
CA2445204C (en) 2002-10-16 2014-08-12 Streck Laboratories, Inc. Method and device for collecting and preserving cells for analysis
US7153905B2 (en) * 2003-03-21 2006-12-26 The General Hospital Corporation Hyperbranched dendron and methods of synthesis and use thereof
EP2567693B1 (en) 2003-07-16 2015-10-21 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
NZ592917A (en) 2003-09-15 2012-12-21 Protiva Biotherapeutics Inc Stable polyethyleneglycol (PEG) dialkyloxypropyl (DAA) lipid conjugates
EP1737956A2 (en) * 2004-03-01 2007-01-03 Massachusetts Institute of Technology Rnai-based therapeutics for allergic rhinitis and asthma
WO2005089123A2 (en) * 2004-03-04 2005-09-29 Massachusetts Institute Of Technology Therapeutic anti-cancer dna
US20060026699A1 (en) * 2004-06-04 2006-02-02 Largaespada David A Methods and compositions for identification of genomic sequences
US7799565B2 (en) 2004-06-07 2010-09-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
US7745651B2 (en) 2004-06-07 2010-06-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
US7807815B2 (en) 2004-07-02 2010-10-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions comprising immunostimulatory siRNA molecules and DLinDMA or DLenDMA
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US20080312174A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
JP2010539245A (ja) * 2007-09-14 2010-12-16 日東電工株式会社 薬物担体
EP2047858A1 (en) 2007-10-10 2009-04-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Combination products for treating cancer
DE102008016275A1 (de) 2008-03-28 2009-11-19 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
DE102007056488A1 (de) 2007-11-22 2009-07-23 Biontex Laboratories Gmbh Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems
WO2009065618A2 (de) 2007-11-22 2009-05-28 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von transfektionsergebnissen nicht-viraler genliefersysteme durch beeinflussung des angeborenen immunsystems
DE102008023913A1 (de) 2008-05-16 2009-11-19 Biontex Laboratories Gmbh Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems
GB0724253D0 (en) 2007-12-12 2008-01-30 Fermentas Uab Transfection reagent
US9006191B2 (en) 2007-12-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
US7687027B2 (en) * 2008-02-27 2010-03-30 Becton, Dickinson And Company Cleaning compositions, methods and materials for reducing nucleic acid contamination
FR2928373B1 (fr) 2008-03-05 2010-12-31 Centre Nat Rech Scient Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene.
JP2011516094A (ja) 2008-04-15 2011-05-26 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 干渉ｒｎａを用いたｃｓｎ５遺伝子発現のサイレンシング方法
WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
EP2285969B1 (en) * 2008-05-15 2013-01-16 National Research Council Of Canada Use of protein kinase b and valproic acid to increase heterologous gene expression in mammalian cells
US9139554B2 (en) 2008-10-09 2015-09-22 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
WO2010078194A1 (en) * 2008-12-30 2010-07-08 Streck, Inc. Method for screening blood using a preservative that may be in a substantially solid state form
US11634747B2 (en) * 2009-01-21 2023-04-25 Streck Llc Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma
DE102009006606A1 (de) 2009-01-29 2010-08-05 Philipps-Universität Marburg Nicht-virales Transfektionsmittel
NO2398912T3 (pt) 2009-02-18 2018-02-10
WO2010125544A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Genetic Immunity Kft. Immunogenic nanomedicine composition and preparation and uses thereof
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
CA2767127A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
WO2011046983A2 (en) 2009-10-12 2011-04-21 Smith Holdings, Llc Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
GB0917792D0 (en) * 2009-10-12 2009-11-25 Fermentas Uab Delivery agent
US9856456B2 (en) 2009-10-12 2018-01-02 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Delivery agent
WO2011057184A1 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Streck, Inc. Stabilization of rna in and extracting from intact cells within a blood sample
ES2640906T3 (es) 2010-03-24 2017-11-07 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Modelo primate de la familia de los cercopitécidos infectado por una cepa del VHB de genotipo humano
WO2011120953A1 (en) 2010-03-29 2011-10-06 Universite De Strasbourg Polymers for delivering molecules of interest
AU2011268146A1 (en) 2010-06-17 2013-01-10 Actogenix Nv Compositions and methods for treating inflammatory conditions
SI3135301T1 (en) 2010-06-22 2018-08-31 Onxeo OPTIMIZED SYSTEM OF DELIVERY AND VIVO WITH ENDOSOMOLITIC MEANS FOR KONJUGATE NUCLEIC ACIDS
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012151391A2 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Streck, Inc. Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions
US20140234373A1 (en) 2011-09-16 2014-08-21 Georfia Regents University Methods of Promoting Immune Tolerance
US20150240238A1 (en) 2011-11-17 2015-08-27 The Regents Of The University Of California Therapeutic rna switches compositions and methods of use
CA2856455C (en) 2011-11-24 2022-08-23 Genethon Scalable lentiviral vector production system compatible with industrial pharmaceutical applications
US9035039B2 (en) 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
ES2826203T3 (es) * 2012-06-08 2021-05-17 Ethris Gmbh Suministro pulmonar de ARN mensajero
CN103059295B (zh) * 2012-09-26 2016-01-13 上海交通大学 疏水修饰的聚乙烯亚胺及其作为蛋白质载体的用途
DK2903652T3 (da) 2012-10-05 2022-07-04 Biontech Delivery Tech Gmbh Hydroxylerede polyaminderivater som transfektionsreagenser
US9677078B2 (en) 2012-10-08 2017-06-13 Lipocalyx Gmbh Carboxylated polyamine derivatives as transfection reagents
DE102012111891A1 (de) * 2012-12-06 2014-06-12 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Verbesserung der Zielfindungskapazität von Stammzellen
CA2917912C (en) 2013-07-24 2019-09-17 Streck, Inc. Compositions and methods for stabilizing circulating tumor cells
US20160296632A1 (en) 2013-11-13 2016-10-13 Aequus Biopharma, Inc. Engineered glycoproteins and uses thereof
KR20170075742A (ko) 2014-10-02 2017-07-03 프로티바 바이오쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 제거하는 조성물 및 방법
EP3034539A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
US11168351B2 (en) 2015-03-05 2021-11-09 Streck, Inc. Stabilization of nucleic acids in urine
BR112017023788A2 (pt) 2015-05-05 2018-10-16 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd composições de ácido nucleico?polímero catiônico e processo para a preparação de dita composição
WO2016197132A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
CN108350455A (zh) 2015-07-29 2018-07-31 阿布特斯生物制药公司 用于使b型肝炎病毒基因表达沉默的组合物和方法
US20170145475A1 (en) 2015-11-20 2017-05-25 Streck, Inc. Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative
US10010627B2 (en) 2016-06-03 2018-07-03 International Business Machines Corporation Modified polycationic polymers
WO2018022991A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Streck, Inc. Suspension composition for hematology analysis control
EP3541420A2 (en) 2016-11-16 2019-09-25 Immunomic Therapeutics, Inc. Nucleic acids for treatment of allergies
EP3570814B1 (en) 2017-01-19 2023-11-29 Universiteit Gent Molecular adjuvants for enhanced cytosolic delivery of active agents
KR102637960B1 (ko) 2017-04-22 2024-02-21 이뮤노믹 쎄라퓨틱스, 인크. 개선된 lamp 구축물
EP3618854A1 (en) 2017-05-02 2020-03-11 Immunomic Therapeutics, Inc. Lamp (lysosomal associated membrane protein) constructs comprising cancer antigens
US20210261647A1 (en) 2018-05-15 2021-08-26 Immunomic Therapeutics, Inc Lamp constructs comprising allergens
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
AU2020366515A1 (en) 2019-10-18 2022-04-21 Immunomic Therapeutics, Inc. Improved lamp constructs comprising cancer antigens
AU2020385683A1 (en) 2019-11-18 2022-06-30 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
WO2022009049A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
EP4176087A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment
CN112237633B (zh) * 2020-10-22 2023-06-27 林君玉 一种pei/on复合物及其制备方法和用途
AU2021385572A1 (en) 2020-11-25 2023-06-22 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
IL308705A (en) 2021-06-08 2024-01-01 Touchlight Ip Ltd LENTIVIRAL vector
GB202108176D0 (en) 2021-06-08 2021-07-21 Touchlight Ip Ltd Vector
WO2023201201A1 (en) 2022-04-10 2023-10-19 Immunomic Therapeutics, Inc. Bicistronic lamp constructs comprising immune response enhancing genes and methods of use thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5286634A (en) * 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
WO1993020090A1 (en) * 1992-04-06 1993-10-14 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Paired-ion oligonucleotides and methods for preparing same
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids

Also Published As

Publication number Publication date
NO970049D0 (no) 1997-01-07
US6013240A (en) 2000-01-11
JP4275728B2 (ja) 2009-06-10
KR970704889A (ko) 1997-09-06
DE69535540T2 (de) 2008-06-19
CA2194797C (fr) 2010-03-23
FI119738B (fi) 2009-02-27
IL114566A (en) 2005-08-31
EP0770140B1 (fr) 2007-07-18
WO1996002655A1 (fr) 1996-02-01
JPH10502918A (ja) 1998-03-17
ZA955849B (en) 1996-02-21
NO323110B1 (no) 2007-01-02
FI970115A (fi) 1997-01-10
DK0770140T3 (da) 2007-11-19
IL114566A0 (en) 1995-11-27
ATE367448T1 (de) 2007-08-15
DE69535540D1 (de) 2007-08-30
FI970115A0 (fi) 1997-01-10
KR100424802B1 (ko) 2004-06-23
FR2722506A1 (fr) 1996-01-19
ES2290952T3 (es) 2008-02-16
MX9700270A (es) 1997-05-31
EP0770140A1 (fr) 1997-05-02
DE69535540T9 (de) 2012-03-15
FR2722506B1 (fr) 1996-08-14
NO970049L (no) 1997-01-07
AU2930795A (en) 1996-02-16
CA2194797A1 (fr) 1996-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT770140E (pt) Composição contendo ácidos nucleicos e polímeros catiónicos, sua preparação e utilização
US5846947A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and uses
JP4074338B2 (ja) 安定な脂質含有薬剤送達複合体及びこれらの製造方法
US5945400A (en) Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof
Li et al. Nonviral gene therapy
US5990089A (en) Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
ES2265569T3 (es) Composicion farmaceutica que mejora la transferencia de genes in vivo.
JP2007521247A (ja) 生体適合性−遺伝子送達剤としての新規カチオン性リポポリマー
JP2000516209A (ja) カチオン性両親媒性物質／ｄｎａ複合体
JP2005511533A (ja) 標的デリバリ用デントリマ
KR19990063814A (ko) 핵산 형질감염용으로 유용한 약학 조성물 및 이의 용도
AU737314B2 (en) Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same
RU2537262C2 (ru) Молекулярные конъюгаты с поликатионным участком и лигандом для доставки в клетку и ядро клетки днк и рнк
JP2000135082A (ja) 核酸との複合体および関連組成物の調製のためのカチオンポリマ―の使用
Gao Cationic liposome-and polymer-mediated gene transfer
MXPA97006016A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
Furgeson Structural and functional effects of polyethylenimine gene carriers
Singh Targeted gene transfer to mammalian systems using liposome constructs containing cholesterol components with or without biotinylated molecular accessories.
Song Intravenous transfection using cationic liposomes as a carrier
MXPA98001920A (en) Pharmaceutical composition useful for the transfection of nucleic acids and its u