JP4275728B2 - 核酸を含有する組成物、その製造および使用 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸を基材とする組成物、それらの製造およびそれらの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、少なくとも１種の核酸および幾つかのカチオン性ポリマーを含んでなる組成物、および細胞中への核酸の移入、特に遺伝子治療での利用に関する。
遺伝子治療は、欠失または異常（突然変異、異常発現など）を修正すること、または遺伝情報を感染細胞もしくは器官中に導入することによって治療的価値をもつタンパク質を発現させることにある。この遺伝子情報は、器官から抽出された細胞中に生体外で導入し次いで改変細胞を体内に再導入するか、または適切な組織中に生体内で直接に導入することができる。この遺伝情報を移入するために、ＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合体（Ｋａｎｅｄａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，８４（１９８７）７４１３）、ＤＮＡとポリリジンとの複合体、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５（１９８０）１０４３１）などを含む各種トランスフェクション技術を含む各種技術が記載されてきた。さらに最近では、遺伝子移入のためのベクターとして、ウイルスの使用が、これらの物理化学的なトランスフェクション技術に代わる有望な別法であることが分かった。この関係において、種々のウイルスが、ある一定の細胞集団に感染する能力について試験された。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ関連ウイルスおよびアデノウイルスを挙げることができる。
しかし、現在までに開発された技術によっては、細胞および／または体内への遺伝子移入に伴う困難性を満足に解決することはできない。特に、細胞中への核酸の移入に関連する問題点は完全には解決されない。実際に、特に核酸のポリアニオン的性質によって、それらの核酸が細胞膜を通過することが妨害される。裸の核酸は生体内で幾つかの細胞型の原形質膜を通過することができることが分かっているが（特に、国際公開第９０／１１０９２号明細書を参照のこと）、トランスフェクションの効率はむしろ低い。さらに、裸の核酸は、酵素による分解および尿中への排出のために、血漿中半減期が短い。さらに、組換えウイルスによって、核酸の移入効率を改善することができるが、それらの使用は、病原性、伝染、複製、組換え、形質転換、免疫抗原性などのような幾つかの危険性がある。さらに、医薬品製造基準の説明書に従ってそれらを製造する際に幾つかの困難点がある。
本発明は、これらの種々の問題点に対する有利な解決法を提供する。出願人は実際に、幾つかのカチオン性ポリマーが、生体外および生体内で細胞中への核酸の移入のために特に有利な性質を有することを示した。さらに、これらのポリマーは容易に入手できそして安価であるという利点を有する。また、本発明のよるカチオン性ポリマーの使用によって、ウイルス性ベクターの使用に関連する欠点（潜在的危険性、移入される遺伝子の大きさの限定、高い経費など）を回避することができる。
さらに具体的には、本発明は、式（Ｉ）
（式中、
−Ｒは水素原子または式
で示される基であることができ、
−ｎは２〜１０の間の整数であり、
−ｐおよびｑは整数であるが、
ただし、合計ｐ＋ｑが、ポリマーの平均分子量が１００〜１０7Ｄａの間になるようなものであることを理解するものとする）
で示されるポリマーのトランスフェクション特性を示すことにある。
式（Ｉ）において、ｎの値が種々の単位ｐの間を変化することができることは理解される。従って、式（Ｉ）はホモポリマーおよびヘテロポリマーの両方を包含する。
それ故、本発明の第一の主題は、少なくとも１種の核酸および上記の一般式（Ｉ）で示されるカチオン性ポリマーを含んでなる組成物である。
本発明はまた、核酸の細胞中への移入のために、式（Ｉ）で示されるカチオン性ポリマーを使用することに関する。
さらに好適には、式（Ｉ）では、ｎは２〜５の間である。特に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーおよびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）ポリマーは共に有利な性質を有する。
本発明を行うために好適なポリマーは、分子量が１０3〜５×１０6の間にあるポリマーである。例として、平均分子量５０，０００Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ）または平均分子量８００，０００Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ８０Ｋ）を挙げることができる。
本発明に関して使用されるポリマーは種々の方法で得ることができる。それらは、まず第一に、対応するモノマーからアニオン性重合条件下か（例えば、エチレンイミンの重合）、または二酸とジアミンとの重縮合によって得られたポリアミドの還元によってか、または
別法としてジアルデヒドとジアミンとの重縮合によって得られたイミンの還元によって、化学的に合成することができる。さらに、特にＰＥＩ５０ＫまたはＰＥＩ８００Ｋのような多くのこれらのポリマーは市販されている。
本発明の組成物の最適効果を得るためには、ポリマーと核酸との各比率は好適には、ポリマーアミン／核酸リン酸エステルが（モル比Ｒ＝）０．５〜５０の間、さらに好適には５〜３０の間であるように決定される。最も特に有利な結果は、核酸電荷当たり５〜１５当量のポリマーアミンを使用して得られる。この比率はもちろん、当業者によって、使用ポリマー、補助剤（下記を参照のこと）の存在、核酸、標的細胞および使用した投与方式に従って、適用されることができる。
本発明の組成物では、核酸はデオキシリボ核酸またはリボ核酸であることができる。問題の配列は天然起源または人工起源のもの、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列または合成もしくは半合成配列であることができる。さらに、核酸の大きさは、オリゴヌクレオチドから染色体までの範囲に亙って、非常に可変的であることができる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどの起源のものであることができる。それらは、当業者に既知であるいずれの技術によっても、特にライブラリーのスクリーニングによって、化学的合成によって、または別法として、ライブラリーのスクリーニングにより得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む組み合わせ方法によって得ることができる。さらに、それらは、プラスミドベクターのようなベクター中に取り込まれることができる。
さらに特に、デオキシリボ核酸に関して、後者は一本鎖または二本鎖であることができる。これらのデオキシリボ核酸は治療的遺伝子、転写または複製を調節する配列、アンチセンス配列、他の細胞成分に結合するための領域などを有することができる。
本発明の目的のためには、治療的遺伝子は特に、治療効果を有するタンパク質性生成物をコードしているいずれの遺伝子をも意味すると理解される。このようにコードされたタンパク質性生成物は、タンパク質、ペプチドなどであることができる。このタンパク質性生成物は標的細胞に関して相同的であることができる（即ち、標的細胞がいずれの疾病にも罹患していない場合、その標的細胞中で通常に発現する生成物）。この場合、タンパク質の発現によって、例えば、細胞中での不十分な発現または修飾のために不活性かもしくはわずかに活性であるタンパク質の発現を治すか、或いは別法として前記タンパク質を過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）することが可能になる。治療的遺伝子はまた、安定性が増強され、活性などが改変された細胞タンパク質の変異体をコードすることができる。タンパク質性生成物はまた、標的細胞に関して不均質であることができる。この場合、発現したタンパク質は、例えば、細胞中で欠失している活性を補足または供給することができ、そのことによって細胞が疾病を駆除するかまたは免疫応答を刺激することができる。治療的遺伝子はまた体内に分泌されたタンパク質をコードすることができる。
本発明の目的のための治療的生成物として、さらに具体的に、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、即ちインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（フランス特許出願公開第９２／０３１２０号明細書）、増殖因子、神経伝達物質またはそれらの前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子、即ちＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プリオトロンピンなど；アポリタンパク質、即ちＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど（フランス特許出願公開第９３／０５１２５号明細書）、ジストロピンもしくはミニジストロピン（フランス特許出願公開第９１／１１９４７号明細書）、嚢胞性繊維症に関連するＣＦＴＲタンパク質、腫瘍抑圧遺伝子、即ちＰ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（フランス特許出願公開第９３／０４７４５号明細書）、血液凝固に関与する因子をコードしている遺伝子、即ち因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＤＮＡ修復に参加する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）などを挙げることができる。
治療的遺伝子はまた、アンチセンス遺伝子または配列であることができ、標的細胞中でのその発現によって、遺伝子の発現または細胞性ｍＲＮＡの転写が調節される。かかる発現は、例えば、標的細胞中で、細胞性ｍＲＮＡに対して相補的であるＲＮＡ中に転写されることができ、従って欧州特許第１４０，３０８号明細書に記載の技術に従って、タンパク質へのそれらの翻訳を遮断することができる。他の可能な発現として、場合により修飾された合成オリゴヌクレオチド（欧州特許第９２，５７４号明細書）が挙げられる。アンチセンス発現はまた、標的ＲＮＡを選択的に破壊することができるリボザイムをコードしている配列を含んでなる（欧州特許第３２１，２０１号明細書）。
上記のように、核酸はまた、人体または動物中で免疫応答を発生させることができる抗原ペプチドをコードしている一つまたはそれ以上の遺伝子を含有することができる。この特定の態様では、それ故、本発明は、ワクチンの製造または特に微生物、ウイルスまたは癌に対して人体または動物に応用される免疫治療的処置剤の製造を可能にする。かかるペプチドとして、特にエプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂウイルス（欧州特許第１８５，５７３号明細書）または仮性狂犬病ウイルスに特異的な抗原ペプチド、またはその他として腫瘍特異性ペプチド（欧州特許第２５９，２１２号明細書）が挙げられる。
好適には、核酸はまた、治療的遺伝子の発現および／または所望の細胞もしくは器官中の抗原ペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にする配列を含んでなる。これらの配列は、これらの配列が感染細胞中で機能することができる場合、本来問題の遺伝子の発現の原因となるものであることができる。それらはまた、種々の起源の配列（他のタンパク質または合成配列の発現の原因である）であることができる。特に、それらは真核生物遺伝子またはウイルス遺伝子のプロモーター配列であることができる。例えば、それらは、感染することが望まれる細胞のゲノムから生成するプロモーター配列であることができる。同様に、それらは、ウイルスのゲノムから生成するプロモーター配列であることができる。この点において、例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶなど遺伝子のプロモーターを挙げることができる。さらに、これらの発現配列は、活性化もしくは調節配列または組織特異性発現を可能にする配列の添加によって、改変されることができる。
さらに、核酸はまた、特に治療的遺伝子の上流に、合成された治療的生成物を標的細胞の分泌の経路中に指向するシグナル配列を含有することができる。このシグナル配列は治療的生成物の天然シグナル配列であることができるが、それはまたいずれの他の機能的シグナル配列または人工シグナル配列であることもできる。
さらに、核酸はまた、特に治療的遺伝子の上流に、核局在配列のような、合成された治療的生成物を選択細胞区画の方向に指向させる配列を含有することができる。
本発明による組成物は、そのまままたは他の化合物と組合せて使用することができる。従って、特定の態様では、本発明による態様は、さらに、ポリマー／核酸複合体と配合することができ、そしてトランスフェクション力を増強することができる補助剤を含んでなる。出願人は、実際に、本発明の組成物のトランスフェクション力が、ポリマー／核酸複合体と配合することができるある一定の補助剤（例えば、脂質、タンパク質、リポポリアミン、合成ポリマー）の存在下でさらに増強されることができることを示した。本明細書の実施例で示されるように、この増強は生体外および生体内で現れる。
本発明による組成物中で優先的に使用される補助剤は、カチオン性脂質（それらの極性部分中に一つまたはそれ以上のカチオン性電荷を含有する）および中性脂質である。
カチオン性脂質に関して、それらは、さらに特別に、リポポリアミン、即ち化学的腕を介して相互に共有結合的に結合している少なくとも１種のポリアミン親水性領域および１種の親油性領域を含んでなるいずれの両親媒性分子であることもできる。有利的には、本発明に関して使用されるリポポリアミンのポリアミン領域は、一般式Ｈ2Ｎ−（−（ＣＨ）m−ＮＨ−）l−Ｈ（式中、ｍは２を超えるかまたは等しい整数であり、ｌは１を超えるかまたは等しい整数であるが、ただしｍは２つのアミンの間に在る各種炭素基の間を変化することが可能である）に対応する。好適には、ｍは２から６までの間であり、ｌは１から５までの間である。さらにもっと好適には、ポリアミン領域は、ＤＮＡに結合する性質を保持したスペルミンまたはスペルミン相似体によって表される。
親油性領域は、層状または六角相を形成することができる１種もしくは数種の飽和または不飽和炭化水素鎖、コレステロール、天然脂質または合成脂質であることができる。
有利的には、欧州特許第３９４，１１１号明細書に記載のようなリポポリアミンは本発明の文脈で使用される。この特許出願はまた、これらのリポポリアミンの製造に使用することができる方法を記載している。本発明の文脈では、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）またはパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）を使用することが特に有利である。
本発明の組成物を製造するのに特に好適である他の補助剤は中性脂質によって表される。中性脂質の使用は、（アミン／リン酸エステル）電荷比Ｒが低い場合、特に有利である。さらに好適には、本発明の文脈で使用される中性脂質は、２つの脂肪鎖を含有する脂質である。
両性イオンであるかまたは生理学的条件下でイオン性電荷を欠く天然または合成脂質を使用することは特に有利である。さらに特別に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイル−、−パルミトイル−および−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン並びにそれらの１〜３重Ｎメチル化誘導体；ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特に、ガラクトセレブロシドのような）、スフィンゴ脂質（特に、スフィンゴミエリンのような）またはその他としてアシアロガングリオシド（特に、アシアロＧＭ１および−ＧＭ２のような）から選択することができる。
これらの各種脂質は、合成的かまたは器官（例えば、脳）もしくは卵からの抽出によって、当業者によく知られている標準技術によって得ることができる。特に、天然脂質の抽出は有機溶媒によって行うことができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照のこと）。
好適には、本発明の組成物は、上記の比率のカチオン性ポリマーの外に、核酸リン酸エステルのモル当量当たり０．１〜２０モル当量、さらに好適には１〜５モル当量の補助剤を含んでなる。
特に有利な態様では、本発明の組成物は、核酸の移入を誘導することができる標的指向要素（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでなる。この標的指向要素は、核酸の移入を、ある一定の細胞型またはある一定の所望の組織（腫瘍細胞、肝臓細胞、造血細胞など）の方向に誘導することができる細胞外の標的指向要素であることができる。それはまた、核酸の移入を、ある一定の所望の細胞区画（ミトコンドリア、核など）の方向に誘導することができる細胞内の標的指向要素であることができる。
さらに好適には、標的指向要素は、式（Ｉ）で示されるポリマーに共有結合的または非共有結合的に結合する。この結合は、特に、アンモニウム基とのイオン性相互作用によってか、または求核性基（ハロゲン、トシラートなど）、活性化エステル（ヒドロキシスクシンイミドなど）、またはその他としてイソチオシアナートを含有する標的指向要素へのポリマーアミンの求核性攻撃によって得ることができる。標的指向要素はまた核酸に結合することができる。
本発明に関して使用することができる標的指向要素として、糖、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは脂質を挙げることができる。好適には、これらの要素は、抗体または抗体断片、細胞受容体リガンドまたはそれらの断片、受容体またはそれらの受容体断片などのような糖および／またはペプチドである。特に、それらは、増殖因子受容体のための、サイトカイニン受容体のための、細胞レクチン受容体のための、または接着タンパク質受容体のためのリガンドであることができる。トランスフェリン、ＨＤＬおよびＬＤＬ受容体もまた挙げることができる。標的指向要素はまた、アシアロ糖タンパク質受容体を標的にすることができる糖、またはその他として免疫グロブリンＦｃ断片受容体を標的にすることができる抗体Ｆａｂ断片であることができる。
本発明による組成物は、局所的、経皮、経口、経直腸、経膣、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、皮内などの投与を勘案して配合することができる。好適には、本発明の医薬組成物は、注射剤、特に所望の器官中への直接注射のためか、または局所投与（皮膚および／または粘膜に）のための薬学的に許容される賦形剤を含有する。問題の生成物は、特に、等張無菌溶液、または滅菌水または生理食塩水を適切に添加すると、注射液を生成することができる乾燥、特に凍結乾燥組成物であることができる。注射に使用される核酸の用量、並びに投与回数は、種々のパラメーターに従って、特に使用される投与方式、問題の疾病、発現する遺伝子またはその他として治療の所望期間に従って適用することができる。
上記のように、本発明の組成物は、生体内、生体外または半生体内で、核酸の細胞中への移入のために使用することができる。特に、実施例は、本発明のカチオン性ポリマーが、核酸を多種類の細胞型中に特にトランスフェクションが通常困難であるある一定の細胞型中に極めて効率的に移入させるのに使用することができることを示している。試験された細胞型として、繊維芽細胞、肝細胞、癌腫、腎細胞およびニューロンを特に挙げることができる。さらに、下記の実施例はまた、生体内で遺伝子の移入のための本発明のポリマーの効能を示す。本発明のベクターを用いて得られた結果は、同一条件下で他のトランスフェクション剤を用いて得られた結果より優れたものであり、従って本発明の組成物の高い可能性を示す。
本発明は、特に、前記疾患を補正することができ、上記のようにカチオン性ポリマーと組合わされる核酸の生体内投与を含んでなる、疾患の治療のための特に有利な方法を提供する。さらに特別には、この方法は、タンパク質性または核酸生成物の欠失に起因する疾患に適用でき、そして投与された核酸は前記タンパク質性生成物をコードするかまたは前記核酸生成物を含有する。
従って、本発明の製薬学的組成物は、投与および生体内での核酸の移入のために特に有利な道具を構成する。
以下の実施例によって本発明をさらに完全に記載するが、それは本発明を説明ものであって、限定するものではないと考えるべきである。
図の説明：
図１：（ポリマーアミン／核酸リン酸エステル）比Ｒの観点からのｐＨ７でのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。
図２：ＤＮＡ量の観点からのｐＨ６でのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。
図３：比率Ｒの観点からのｐＨ６でのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。
図４：ｐＨの観点からのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。
図５：ＰＥＩ８００Ｋとポリリジンとの比較。
図６：ＰＥＩ５０Ｋの細胞毒性の試験。
図７：補助剤の存在下でのＰＥＩ５０Ｋのトランスフェクションの効率。
図８：ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションにおけるＰＥＩの効率。
図９：肝細胞および腎細胞のトランスフェクションにおけるＰＥＩの効率。
図１０：プラスミドＤＮＡの胚ニューロン中への移入におけるＰＥＩの効率。
図１１：オリゴヌクレオチドの胚ニューロン神経細胞中への移入におけるＰＥＩの効率。
図１２：生体内ＤＮＡ移入のためのＰＥＩの効率。
実施例１：生体内遺伝子移入に使用されたプラスミド本発明の組成物の活性を示すのに、３種類の構築物を使用した。即ち、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードしている遺伝子を含有するプラスミド、β−ガラクトシダーゼをコードしている遺伝子（ＬａｃＺ遺伝子）を含有するプラスミドおよびクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードしている遺伝子を含有するプラスミド。
１．１．Ｌｕｃ遺伝子を含有するプラスミド
プラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃは、制限酵素ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断によってベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から抽出され、ルシフェラーゼをコードしている遺伝子の上流に位置し、ベクターｐＧＬ基本（ｂａｓｉｃ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター含有する。
プラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃは市販起源のものである（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
プラスミドＴ３ＲＥ−Ｌｕｃは、甲状腺ホルモンに対する応答のためのパリンドローム要素に対応する合成オリゴヌクレオチドを含有する（Ｇｌａｓｓ等、Ｃｅｌｌ，５６（１９８９）６９７）。
１．２．ＬａｃＺ遺伝子を含有するプラスミド
プラスミドｐＣＭＶ−βＧａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼをコードしているＬａｃＺ遺伝子の上流に位置するＣＭＶプロモーターを含有する。ベクターｐＳＶ−ｎｌｓ ＬａｃＺ（ｐＡＯｎｌｓＬａｃＺ）は、同一のプロモーター、ＬａｃＺ遺伝子の枠中でかつ上流に局在する核局在配列（ＳＶ４０ウイルスから生成する）を含有する。この構築によって、細胞の核中での融合タンパク質ｎｌｓ−β−ガラクトシダーゼの発現が可能になる（Ｄｅ Ｌｕｚｅ等，ＰＮＡＳ，９０（１９９３）７３２２を参照のこと）。
１．３．ＣＡＴ遺伝子を含有するプラスミド
リポーター遺伝子として、ＲＳＶプロモーター（ｐＲＳＶ−ＣＡＴ）およびＳＶ４０プロモーター（ｐＳＶ４０−ＣＡＴ）の制御下にあるクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードしている遺伝子を有するプラスミドは公開されている（Ｂｏｕｔｉｌｌｅｒ等，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏ−ＰｈｙｃｈｏＰｈａｒｍａｃｏｌ．ｅｔ Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．，１６（１９９２）９５９；ｄｅ Ｌｕｚｅ等，ＰＮＡＳ，９０（１９９３）７３２２）。
実施例２：核酸の繊維芽細胞中への移入
この実施例は、８００，０００Ｄａポリエチレンイミンによる、プラスミドｐＧＬ２−ｌｕｃの３Ｔ３繊維芽細胞中への移入について記載する。
プロトコール：ＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液を調製し、１Ｎ塩酸溶液を使用してｐＨを７に調節する。この溶液を遺伝子移入実験に使用する。
トランスフェクション・プロトコール：トランスフェクションの２４時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、以下のプロトコールに従って、ウエル当たり２μｇのプラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃでトランスフェクトする。
プラスミドの２μｇおよびＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液の種々の容量を、別々に１５０ｍＭ ＮａＣｌの５０μｌ中に希釈し、混合する。１０分後、２つの溶液を一緒にして、そしてホモジナイズする。さらに１０分後、９００μｌのＤＭＥＭを添加する。このようにして得た溶液をホモジナイズして、１０分後に、前もって無血清ＤＭＥＭ培地ですすいだ細胞上に散布する。トランスフェクトの２時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加する。２４時間後に発現を停止させる。
ルシフェラーゼ測定：この目的のために、上澄液を、ルシフェリン、補酵素ＡおよびＡＴＰを含有する緩衝液の存在下でインキュベートし、放射された光（一般的に１０秒間）を光度計（Ｗｏｏｄ Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ，２８）で測定した。
得られた結果を図１に示す。それらは、ＰＥＩによって、プラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃが繊維芽細胞中に効率的に移入せれることを示している。それらはまた、ＤＮＡリン酸エステルに対して５〜２０当量の間のＰＥＩアミンを使用する場合、相対光単位（ＲＬＵ）の活性が特に良好であることを示している。対照実験では、プラスミド単独は約１００ＲＬＵの信号を与える。
実施例３：トランスフェクションの効率に及ぼすＤＮＡ量の効果
この実施例はＰＥＩ８００Ｋによる核酸の３Ｔ３繊維芽細胞中への移入の効率に及ぼす核酸量の効果について記載する。
トランスフェクションの２４時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、上記のプロトコールに従って、ウエル当たり増加する量のプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃおよび一定電荷比（９当量）でトランスフェクトする。研究中の遺伝子を含有しないプラスミドｐＧＥＭ（ＰＲＯＭＥＧＡ）でプラスミド量をウエル当たり２μｇまで補充することによって、２ポイントを製造した。トランスフェクションの３時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清を添加する。２４時間後発現を停止させる。
得られた結果を図２に示す。
トランスフェクションの効率はトランスフェクション中に使用したプラスミド量にしたがって増加する。非転写性キャリヤーＤＮＡ（ｐＧＥＭ）を添加してもトランスフェクションへの寄与はない。
実施例４：核酸の繊維芽細胞中への移入：アミン／リン酸エステル比の影響の研究
この実施例は、種々の（アミン／リン酸エステル）比Ｒで核酸およびＰＥＩ８００Ｋを含んでなる本発明による組成物を用いる、ｐＨ６での、核酸の繊維芽細胞中への移入について記載する。
プロトコール：ＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液を調製し、１Ｎ塩酸溶液を使用してｐＨを６に調節する。この溶液を遺伝子移入実験に使用する。
トランスフェクションの１８時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、実施例２で使用したプロトコールに従って、ウエル当たり２μｇのプラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃでトランスフェクトする。
得られた結果を図３に示す。それらは、本発明による組成物が６〜２２の間の比率Ｒの全範囲に亙って特に効率的であることを示している。
実施例５：ｐＨに観点からのトランスフェクションの効率
この実施例は、核酸およびＰＥＩ８００Ｋを含んでなる本発明による組成物による、種々のｐＨ条件下での、核酸の繊維芽細胞への移入について記載する。
使用したプロトコールは実施例２に記載したものと同一である。ｐＨは１Ｎ塩酸を添加して調節する。
得られた結果を図４に示す。それらは、本発明による組成物が種々のｐＨ値、特に生理学的ｐＨ範囲内（ｐＨ５−８）で使用することができることを示している。
実施例６：ＰＥＩおよびポリリジンのトランスフェクションの効率の比較
この実施例は、核酸の繊維芽細胞中への移入において、本発明による組成物および他のカチオン性ポリマー、ポリリジンを用いて得た比較結果について記載する。
プロトコール：この実験で使用したポリリジン（ＰＬＬ）は平均分子量５０Ｋのポリリジン・ＨＢｒである。最終クロロキン濃度は１００μＭである。ＰＥＩはｐＨ６である。
プロトコール：トランスフェクションの１８時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、実施例２で使用したプロトコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。クロロキンの存在下でＰＬＬでトランスフェクトされた細胞を、２時間後にすすぎ、１０％の血清をもつ培地中入れる。２４時間後に発現を停止させる。
得られた結果を図５に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって、ポリリジンのような前者のカチオン性ポリマーベクターよりももっと高い効率で、核酸が繊維芽細胞中に移入されることを示している。
実施例７：ＰＥＩ５０ＫおよびＰＥＩ８００ＫによるＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞のトランスフェクションの効率の比較
この実施例は、核酸の細胞中への移入における２種類のポリマー（ＰＥＩ５０ＫおよびＰＥＩ８００Ｋ）の使用および比較について記載する。
プロトコール：１６ｍｍウエル当たり５０，０００細胞を使用するトランスフェクションの２４時間前に、細胞をインキュベートする。それらを、ＰＥＩと複合させたプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。ＰＥＩアミン／核酸リン酸エステルのモル当量比は６当量から４５当量まで変化する。各ウエルについて、ＰＥＩおよび２μｇのＤＮＡを別々に５０μｌのＮａＣｌ（１５０ｍＭ）中に希釈する。次いで溶液を混合し、その後ホモジナイズする。１０分後、この液を細胞に添加する。２４時間後、細胞は細胞溶解し、細胞溶解液を遠心分離して、上澄液をルシフェラーゼ活性の測定に使用する。タンパク質測定は、この上澄液のアリコートについて、ＢＣＡ試験法によって行う。ルシフェラーゼ活性は、光単位（ＲＬＵ）／１０秒の積分／ｍｇのタンパク質で表す。
得られた結果を以下の表に示す。
これらの結果は明らかに、ＰＥＩ５０ＫがＰＥＩ８００Ｋのそれらと同程度に有利であるトランスフェクション特性を有することを示している。
実施例８：ＰＥＩの細胞毒性の試験
ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞に対するＰＥＩ５０Ｋのあるかも知れない毒性を研究したいと思った。この研究の場合、ＭＴＴ試験法を選択するが、この試験法によって、ミトコンドリア酵素のコハク酸デヒドロゲナーゼによってＭＴＴテトラゾリウムをＭＴＴホルマザンに還元する細胞の能力を評価することができる。トランスフェクションのプロトコールは実施例７と同一である（ウエル当たりのＤＮＡ量は固定し（２μｇ）、ＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エステルのモル当量数は９から２４まで変化する。）。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．０５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴで９０分間インキュベートする。このインキュベーションの終結時に、細胞培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ中に１０分間で溶解させた。試料の光学濃度を５４０ｎｍで読む。
結果を図６に示す。それらは、本研究の条件下で、ＰＥＩ５０ＫがＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞に対し有意の死亡率を起さないことを示している。
実施例９：トランスフェクション力を増強する補助剤の使用
この実施例は、カチオン性ポリマーおよび補助剤を含んでなる本発明による組成物の使用について記載する。使用された補助剤は中性脂質（ＤＯＰＥ）またはリポポリアミン（ＤＯＧＳ）のいずれかである。
プロトコール：ＤＯＰＥの添加：
ＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エステルの４つのモル当量比：６、９、１８および２１について研究した。各ウエルについて、１２ナノモルのＤＯＰＥをＰＥＩおよびＤＮＡの混合物に添加する。次いで、この溶液を、実施例７に記載のように、トランスフェクションに使用する。
ＤＯＧＳの添加：各ウエルについて、ＤＯＧＳアミン／ＤＮＡリン酸エステルの４モル当量（６ナノモルのリン酸エステルの場合、６ナノモルのＤＯＧＳの当量）を、ＤＮＡと複合させる工程の前に、ＰＥＩ溶液に添加する。次いでトランスフェクションを実施例７に記載のように行う。
得られた結果を図７に示す。それらは明らかに、ＤＯＰＥまたはＤＯＧＳの添加によって、トランスフェクション特性が、特にＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エステルの低モル当量比の場合、さらに増加することを示している。
実施例１０：Ｈｅｌａ細胞中への遺伝子移入
この実施例は、本発明による組成物が、種々の細胞型、特にＨｅｌａ子宮癌細胞中への遺伝子の移入のために使用することができることを示す。
プロトコール：１６ｍｍウエル当たり５０，０００細胞を使用するトランスフェクションの２４時間前に、Ｈｅｌａ細胞をインキュベートする。次いで、それらを、ＰＥＩまたはリポポリアミン（ＤＯＧＳ）のいずれかと複合させたプラスミドｐＣＭＶ Ｌｕｃでトランスフェクトする。ＰＥＩ８００Ｋアミン／ＤＮＡリン酸エステルの４つのモル当量比：６、９、１８、２１について研究した。アミン／リン酸エステルの８モル当量（１２ナノモルのＤＯＧＳ）で、リポポリアミンを使用する。
得られた結果を図８に示す。それらは明らかに、場合により補助剤と組合わされたカチオン性ポリマーを含んでなる本発明による組成物によって、従来のシステム（特にリポポリアミンＤＯＧＳ）よりもずっとさらに効率的に、Ｈｅｌａ細胞がトランスフェクトされることを示している。
実施例１１：遺伝子の各種細胞型への移入
この実施例は再び、本発明による組成物が、繊維芽細胞、子宮癌、肝細胞腫または腎細胞のような多種類の細胞型中への遺伝子の移入のために使用することができることを示す。さらに詳しくは、この実施例は、ＨｅｐＧ２とＫ５６２およびウサギ平滑筋初代培養細胞を、９電荷当量を含有するＰＥＩで、ｐＨ６でトランスフェクトすることを記載する。
トランスフェクションの２４時間前に（ウエル当たり５０，０００細胞）、ＨｅｐＧ２細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする。それらを、実施例２に記載のプロトコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。トランスフェクションの４時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清を添加する。３０時間後に発現を停止させる。
トランスフェクションの１時間前に、Ｋ５６２細胞を、２４ウエル皿中で、無血清ＲＰＭＩ培地の０．５ｍｌ中でインキュベートする。それらを、以下のプロトコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。即ち、所望量のプラスミドおよびＰＥＩを別々に５０μｌの１５０ｍｍ ＮａＣｌ中に希釈し、混合する。１０分後、２つの溶液を一緒にして、ホモジナイズする。さらに１０分間の後、４００μｌのＲＰＭＩを添加する。このようにして得た溶液をホモジナイズし、１０分後、細胞上に散布する。トランスフェクションの４時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清を添加する。３０時間後、発現を停止させる。
ウサギ平滑筋初代培養物を、Ｆａｌｌｉｅｒ−Ｂｅｃｋｅｒによる記載の通りに調製する。次いで、細胞を、（実施例７に記載のプロトコールに従って）ＰＥＩと複合したプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃの１μｇまたは２μｇのいずれかでトランスフェクトする。トランスフェクションの２４または４８時間後に、ルシフェラーゼの発現を停止させる。
得られた結果を図９に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって、多種類の相違する細胞型を効率的にトランスフェクトすることができることを示している。
実施例１２：胚ニューロン初代培養物中へのプラスミドＤＮＡの移入：生物学的活性の提示
Ｌｅｚｏｕａｌｃ′ｈ等による記載の通りに、ニューロン初代培養物を調製した。３６時間後、培養物を、２μｌのプラスミドＴＲＥ−Ｌｕｃ（甲状腺ホルモンＴ３応答要素の制御下のＬｕｃ遺伝子を含有する）およびウエル当たり０．５μｇのキャリヤーＤＮＡでトランスフェクトした。
２つの実験条件について研究した。即ち、
−リン酸エステルに対して９当量のアミン：１μｌのプラスミドを、ＰＥＩ８００Ｋの１００ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の２．２８μｌ中に導入した。
−リン酸エステルに対して１３当量のアミン：１μｇのプラスミドを、ＰＥＩ８００Ｋの１００ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の３．３３μｌ中に導入した。
複合する前に、プラスミドを５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈し、そしてＰＥＩも第二の５０μｌアリコートの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈した。次いで溶液を混合し、細胞に１時間適用した。次いで、トランスフェクション培地を除去し、Ｔ３（１ｎＭ）を持つかまたは持たない新しい培養培地に交換した。２４時間後、細胞は細胞溶解し、細胞溶解溶液を遠心分離し、上澄液をルシフェラーゼ活性の測定に使用した。
得られた結果を図１０に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって、ＤＮＡがニューロン細胞中にトランスフェクトされ、そしてこのようにトランスフェクトされたＤＮＡは、活性がＴ３の存在下で増幅されるから、機能的であることを示している。プラスミド単独の存在下で行った対照実験では、ルシフェラーゼ活性は全く検出されなかった。
実施例１３：胚ニューロン初代培養物中へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの移入
実施例１２の通りに調製したニューロン初代培養物について実験を行った。３６時間後、培養物を、ＰＥＩ８００Ｋに対して９当量のアミンと複合された２μＭ １８マー（ｍｅｒ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）でトランスフェクトした。
使用したＯＤＮは、甲状腺ホルモンα−受容体をコードしている遺伝子の領域に対して指向する。その配列は以下の通りである。
２５０μｌの培養培地の４つのウエルの場合、以下の生成物を使用した。即ち、
−１５０ｍＭ ＮａＣｌの１０μｌ中に希釈されたＯＤＮの０．２５ｍＭ溶液の８μｌ、および
−前もって第二の１５０ｍＭ ＮａＣｌの５１．２μｌアリコート中に希釈されたＰＥＩ８００Ｋの１２ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の２０．８μｌ。
次いで、溶液を混合し、混合物の２０μｌを細胞に４５分間適用した。次いでトランスフェクション培地を除去し、新しい培養培地に交換した。次いで細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液中に固定し、すすぎ、Ｍｏｗｉｏｌ中に取り付け、蛍光顕微鏡下で検査した。
得られた結果を図１１に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドがニューロン細胞中にトランスフェクトされることを示している。オリゴヌクレオチド単独の存在下で行った対照実験では、蛍光は全く検出されなかった。
実施例１４：新生マウスの脳中への核酸の生体内移入のための本発明の組成物の使用
この実施例は、新生マウスの脳中へのプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃの生体内移入について記載する。それは、特に遺伝子治療の応用の場合の本発明による組成物の特に有利な特性を示す。
３０μｌのプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（４μｇ／μｌを含有するストック溶液の７．５μｌ）を２２．５μｌの無菌５％グルコース中に希釈した（最終濃度１μｇ／μｌ）。次いで１００ｍＭ ＰＥＩ８００Ｋ（水中で調製され、そしてｐＨ６．９に緩衝化された）の８．５μｌを添加した。それ故、このようにして得た組成物はリン酸エステルに対して９当量のアミンを含有する。
この混合物を急速に渦撹拌し、新生マウス中への大脳内注射のために使用した。この目的のために、マウスを低温度（氷と接触しているアルミニウム箔上に置かれた）によって麻酔し、次いでマウス当たり２μｌの混合物（２μｇの核酸）を注射した。注射は、皮質中に、両者とも微小電極に連結したマイクロマニピュレータおよびマイクロシリンジを使用して行った。
４８時間後に脳を取出し、ホモジナイズし、遠心分離し、上澄液をルシフェラーゼの測定に使用した。この目的のために、上澄液を、ルシフェリン、補酵素ＡおよびＡＴＰを含む緩衝液の存在下でインキュベートし、放射した光（一般的に１０秒間）を光度計（Ｗｏｏｄ Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ，２８）で測定した。
得られた結果を図１２に示す。それらは明らかに、組成物によって、プラスミドがマウスの脳中に効率的に移入され、一方プラスミド単独によって移入が行われる場合、有意のルシフェラーゼ活性は全く観察されないことを示している。
遺伝子治療は、欠失または異常（突然変異、異常発現など）を修正すること、または遺伝情報を感染細胞もしくは器官中に導入することによって治療的価値をもつタンパク質を発現させることにある。この遺伝子情報は、器官から抽出された細胞中に生体外で導入し次いで改変細胞を体内に再導入するか、または適切な組織中に生体内で直接に導入することができる。この遺伝情報を移入するために、ＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合体（Ｋａｎｅｄａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，８４（１９８７）７４１３）、ＤＮＡとポリリジンとの複合体、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５（１９８０）１０４３１）などを含む各種トランスフェクション技術を含む各種技術が記載されてきた。さらに最近では、遺伝子移入のためのベクターとして、ウイルスの使用が、これらの物理化学的なトランスフェクション技術に代わる有望な別法であることが分かった。この関係において、種々のウイルスが、ある一定の細胞集団に感染する能力について試験された。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ関連ウイルスおよびアデノウイルスを挙げることができる。
しかし、現在までに開発された技術によっては、細胞および／または体内への遺伝子移入に伴う困難性を満足に解決することはできない。特に、細胞中への核酸の移入に関連する問題点は完全には解決されない。実際に、特に核酸のポリアニオン的性質によって、それらの核酸が細胞膜を通過することが妨害される。裸の核酸は生体内で幾つかの細胞型の原形質膜を通過することができることが分かっているが（特に、国際公開第９０／１１０９２号明細書を参照のこと）、トランスフェクションの効率はむしろ低い。さらに、裸の核酸は、酵素による分解および尿中への排出のために、血漿中半減期が短い。さらに、組換えウイルスによって、核酸の移入効率を改善することができるが、それらの使用は、病原性、伝染、複製、組換え、形質転換、免疫抗原性などのような幾つかの危険性がある。さらに、医薬品製造基準の説明書に従ってそれらを製造する際に幾つかの困難点がある。
本発明は、これらの種々の問題点に対する有利な解決法を提供する。出願人は実際に、幾つかのカチオン性ポリマーが、生体外および生体内で細胞中への核酸の移入のために特に有利な性質を有することを示した。さらに、これらのポリマーは容易に入手できそして安価であるという利点を有する。また、本発明のよるカチオン性ポリマーの使用によって、ウイルス性ベクターの使用に関連する欠点（潜在的危険性、移入される遺伝子の大きさの限定、高い経費など）を回避することができる。
さらに具体的には、本発明は、式（Ｉ）
−Ｒは水素原子または式
−ｎは２〜１０の間の整数であり、
−ｐおよびｑは整数であるが、
ただし、合計ｐ＋ｑが、ポリマーの平均分子量が１００〜１０7Ｄａの間になるようなものであることを理解するものとする）
で示されるポリマーのトランスフェクション特性を示すことにある。
式（Ｉ）において、ｎの値が種々の単位ｐの間を変化することができることは理解される。従って、式（Ｉ）はホモポリマーおよびヘテロポリマーの両方を包含する。
それ故、本発明の第一の主題は、少なくとも１種の核酸および上記の一般式（Ｉ）で示されるカチオン性ポリマーを含んでなる組成物である。
本発明はまた、核酸の細胞中への移入のために、式（Ｉ）で示されるカチオン性ポリマーを使用することに関する。
さらに好適には、式（Ｉ）では、ｎは２〜５の間である。特に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーおよびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）ポリマーは共に有利な性質を有する。
本発明を行うために好適なポリマーは、分子量が１０3〜５×１０6の間にあるポリマーである。例として、平均分子量５０，０００Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ）または平均分子量８００，０００Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ８０Ｋ）を挙げることができる。
本発明に関して使用されるポリマーは種々の方法で得ることができる。それらは、まず第一に、対応するモノマーからアニオン性重合条件下か（例えば、エチレンイミンの重合）、または二酸とジアミンとの重縮合によって得られたポリアミドの還元によってか、または
別法としてジアルデヒドとジアミンとの重縮合によって得られたイミンの還元によって、化学的に合成することができる。さらに、特にＰＥＩ５０ＫまたはＰＥＩ８００Ｋのような多くのこれらのポリマーは市販されている。
本発明の組成物の最適効果を得るためには、ポリマーと核酸との各比率は好適には、ポリマーアミン／核酸リン酸エステルが（モル比Ｒ＝）０．５〜５０の間、さらに好適には５〜３０の間であるように決定される。最も特に有利な結果は、核酸電荷当たり５〜１５当量のポリマーアミンを使用して得られる。この比率はもちろん、当業者によって、使用ポリマー、補助剤（下記を参照のこと）の存在、核酸、標的細胞および使用した投与方式に従って、適用されることができる。
本発明の組成物では、核酸はデオキシリボ核酸またはリボ核酸であることができる。問題の配列は天然起源または人工起源のもの、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列または合成もしくは半合成配列であることができる。さらに、核酸の大きさは、オリゴヌクレオチドから染色体までの範囲に亙って、非常に可変的であることができる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどの起源のものであることができる。それらは、当業者に既知であるいずれの技術によっても、特にライブラリーのスクリーニングによって、化学的合成によって、または別法として、ライブラリーのスクリーニングにより得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む組み合わせ方法によって得ることができる。さらに、それらは、プラスミドベクターのようなベクター中に取り込まれることができる。
さらに特に、デオキシリボ核酸に関して、後者は一本鎖または二本鎖であることができる。これらのデオキシリボ核酸は治療的遺伝子、転写または複製を調節する配列、アンチセンス配列、他の細胞成分に結合するための領域などを有することができる。
本発明の目的のためには、治療的遺伝子は特に、治療効果を有するタンパク質性生成物をコードしているいずれの遺伝子をも意味すると理解される。このようにコードされたタンパク質性生成物は、タンパク質、ペプチドなどであることができる。このタンパク質性生成物は標的細胞に関して相同的であることができる（即ち、標的細胞がいずれの疾病にも罹患していない場合、その標的細胞中で通常に発現する生成物）。この場合、タンパク質の発現によって、例えば、細胞中での不十分な発現または修飾のために不活性かもしくはわずかに活性であるタンパク質の発現を治すか、或いは別法として前記タンパク質を過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）することが可能になる。治療的遺伝子はまた、安定性が増強され、活性などが改変された細胞タンパク質の変異体をコードすることができる。タンパク質性生成物はまた、標的細胞に関して不均質であることができる。この場合、発現したタンパク質は、例えば、細胞中で欠失している活性を補足または供給することができ、そのことによって細胞が疾病を駆除するかまたは免疫応答を刺激することができる。治療的遺伝子はまた体内に分泌されたタンパク質をコードすることができる。
本発明の目的のための治療的生成物として、さらに具体的に、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、即ちインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（フランス特許出願公開第９２／０３１２０号明細書）、増殖因子、神経伝達物質またはそれらの前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子、即ちＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プリオトロンピンなど；アポリタンパク質、即ちＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど（フランス特許出願公開第９３／０５１２５号明細書）、ジストロピンもしくはミニジストロピン（フランス特許出願公開第９１／１１９４７号明細書）、嚢胞性繊維症に関連するＣＦＴＲタンパク質、腫瘍抑圧遺伝子、即ちＰ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（フランス特許出願公開第９３／０４７４５号明細書）、血液凝固に関与する因子をコードしている遺伝子、即ち因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＤＮＡ修復に参加する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）などを挙げることができる。
治療的遺伝子はまた、アンチセンス遺伝子または配列であることができ、標的細胞中でのその発現によって、遺伝子の発現または細胞性ｍＲＮＡの転写が調節される。かかる発現は、例えば、標的細胞中で、細胞性ｍＲＮＡに対して相補的であるＲＮＡ中に転写されることができ、従って欧州特許第１４０，３０８号明細書に記載の技術に従って、タンパク質へのそれらの翻訳を遮断することができる。他の可能な発現として、場合により修飾された合成オリゴヌクレオチド（欧州特許第９２，５７４号明細書）が挙げられる。アンチセンス発現はまた、標的ＲＮＡを選択的に破壊することができるリボザイムをコードしている配列を含んでなる（欧州特許第３２１，２０１号明細書）。
上記のように、核酸はまた、人体または動物中で免疫応答を発生させることができる抗原ペプチドをコードしている一つまたはそれ以上の遺伝子を含有することができる。この特定の態様では、それ故、本発明は、ワクチンの製造または特に微生物、ウイルスまたは癌に対して人体または動物に応用される免疫治療的処置剤の製造を可能にする。かかるペプチドとして、特にエプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂウイルス（欧州特許第１８５，５７３号明細書）または仮性狂犬病ウイルスに特異的な抗原ペプチド、またはその他として腫瘍特異性ペプチド（欧州特許第２５９，２１２号明細書）が挙げられる。
好適には、核酸はまた、治療的遺伝子の発現および／または所望の細胞もしくは器官中の抗原ペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にする配列を含んでなる。これらの配列は、これらの配列が感染細胞中で機能することができる場合、本来問題の遺伝子の発現の原因となるものであることができる。それらはまた、種々の起源の配列（他のタンパク質または合成配列の発現の原因である）であることができる。特に、それらは真核生物遺伝子またはウイルス遺伝子のプロモーター配列であることができる。例えば、それらは、感染することが望まれる細胞のゲノムから生成するプロモーター配列であることができる。同様に、それらは、ウイルスのゲノムから生成するプロモーター配列であることができる。この点において、例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶなど遺伝子のプロモーターを挙げることができる。さらに、これらの発現配列は、活性化もしくは調節配列または組織特異性発現を可能にする配列の添加によって、改変されることができる。
さらに、核酸はまた、特に治療的遺伝子の上流に、合成された治療的生成物を標的細胞の分泌の経路中に指向するシグナル配列を含有することができる。このシグナル配列は治療的生成物の天然シグナル配列であることができるが、それはまたいずれの他の機能的シグナル配列または人工シグナル配列であることもできる。
さらに、核酸はまた、特に治療的遺伝子の上流に、核局在配列のような、合成された治療的生成物を選択細胞区画の方向に指向させる配列を含有することができる。
本発明による組成物は、そのまままたは他の化合物と組合せて使用することができる。従って、特定の態様では、本発明による態様は、さらに、ポリマー／核酸複合体と配合することができ、そしてトランスフェクション力を増強することができる補助剤を含んでなる。出願人は、実際に、本発明の組成物のトランスフェクション力が、ポリマー／核酸複合体と配合することができるある一定の補助剤（例えば、脂質、タンパク質、リポポリアミン、合成ポリマー）の存在下でさらに増強されることができることを示した。本明細書の実施例で示されるように、この増強は生体外および生体内で現れる。
本発明による組成物中で優先的に使用される補助剤は、カチオン性脂質（それらの極性部分中に一つまたはそれ以上のカチオン性電荷を含有する）および中性脂質である。
カチオン性脂質に関して、それらは、さらに特別に、リポポリアミン、即ち化学的腕を介して相互に共有結合的に結合している少なくとも１種のポリアミン親水性領域および１種の親油性領域を含んでなるいずれの両親媒性分子であることもできる。有利的には、本発明に関して使用されるリポポリアミンのポリアミン領域は、一般式Ｈ2Ｎ−（−（ＣＨ）m−ＮＨ−）l−Ｈ（式中、ｍは２を超えるかまたは等しい整数であり、ｌは１を超えるかまたは等しい整数であるが、ただしｍは２つのアミンの間に在る各種炭素基の間を変化することが可能である）に対応する。好適には、ｍは２から６までの間であり、ｌは１から５までの間である。さらにもっと好適には、ポリアミン領域は、ＤＮＡに結合する性質を保持したスペルミンまたはスペルミン相似体によって表される。
親油性領域は、層状または六角相を形成することができる１種もしくは数種の飽和または不飽和炭化水素鎖、コレステロール、天然脂質または合成脂質であることができる。
有利的には、欧州特許第３９４，１１１号明細書に記載のようなリポポリアミンは本発明の文脈で使用される。この特許出願はまた、これらのリポポリアミンの製造に使用することができる方法を記載している。本発明の文脈では、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）またはパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）を使用することが特に有利である。
本発明の組成物を製造するのに特に好適である他の補助剤は中性脂質によって表される。中性脂質の使用は、（アミン／リン酸エステル）電荷比Ｒが低い場合、特に有利である。さらに好適には、本発明の文脈で使用される中性脂質は、２つの脂肪鎖を含有する脂質である。
両性イオンであるかまたは生理学的条件下でイオン性電荷を欠く天然または合成脂質を使用することは特に有利である。さらに特別に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイル−、−パルミトイル−および−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン並びにそれらの１〜３重Ｎメチル化誘導体；ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特に、ガラクトセレブロシドのような）、スフィンゴ脂質（特に、スフィンゴミエリンのような）またはその他としてアシアロガングリオシド（特に、アシアロＧＭ１および−ＧＭ２のような）から選択することができる。
これらの各種脂質は、合成的かまたは器官（例えば、脳）もしくは卵からの抽出によって、当業者によく知られている標準技術によって得ることができる。特に、天然脂質の抽出は有機溶媒によって行うことができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照のこと）。
好適には、本発明の組成物は、上記の比率のカチオン性ポリマーの外に、核酸リン酸エステルのモル当量当たり０．１〜２０モル当量、さらに好適には１〜５モル当量の補助剤を含んでなる。
特に有利な態様では、本発明の組成物は、核酸の移入を誘導することができる標的指向要素（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでなる。この標的指向要素は、核酸の移入を、ある一定の細胞型またはある一定の所望の組織（腫瘍細胞、肝臓細胞、造血細胞など）の方向に誘導することができる細胞外の標的指向要素であることができる。それはまた、核酸の移入を、ある一定の所望の細胞区画（ミトコンドリア、核など）の方向に誘導することができる細胞内の標的指向要素であることができる。
さらに好適には、標的指向要素は、式（Ｉ）で示されるポリマーに共有結合的または非共有結合的に結合する。この結合は、特に、アンモニウム基とのイオン性相互作用によってか、または求核性基（ハロゲン、トシラートなど）、活性化エステル（ヒドロキシスクシンイミドなど）、またはその他としてイソチオシアナートを含有する標的指向要素へのポリマーアミンの求核性攻撃によって得ることができる。標的指向要素はまた核酸に結合することができる。
本発明に関して使用することができる標的指向要素として、糖、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは脂質を挙げることができる。好適には、これらの要素は、抗体または抗体断片、細胞受容体リガンドまたはそれらの断片、受容体またはそれらの受容体断片などのような糖および／またはペプチドである。特に、それらは、増殖因子受容体のための、サイトカイニン受容体のための、細胞レクチン受容体のための、または接着タンパク質受容体のためのリガンドであることができる。トランスフェリン、ＨＤＬおよびＬＤＬ受容体もまた挙げることができる。標的指向要素はまた、アシアロ糖タンパク質受容体を標的にすることができる糖、またはその他として免疫グロブリンＦｃ断片受容体を標的にすることができる抗体Ｆａｂ断片であることができる。
本発明による組成物は、局所的、経皮、経口、経直腸、経膣、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、皮内などの投与を勘案して配合することができる。好適には、本発明の医薬組成物は、注射剤、特に所望の器官中への直接注射のためか、または局所投与（皮膚および／または粘膜に）のための薬学的に許容される賦形剤を含有する。問題の生成物は、特に、等張無菌溶液、または滅菌水または生理食塩水を適切に添加すると、注射液を生成することができる乾燥、特に凍結乾燥組成物であることができる。注射に使用される核酸の用量、並びに投与回数は、種々のパラメーターに従って、特に使用される投与方式、問題の疾病、発現する遺伝子またはその他として治療の所望期間に従って適用することができる。
上記のように、本発明の組成物は、生体内、生体外または半生体内で、核酸の細胞中への移入のために使用することができる。特に、実施例は、本発明のカチオン性ポリマーが、核酸を多種類の細胞型中に特にトランスフェクションが通常困難であるある一定の細胞型中に極めて効率的に移入させるのに使用することができることを示している。試験された細胞型として、繊維芽細胞、肝細胞、癌腫、腎細胞およびニューロンを特に挙げることができる。さらに、下記の実施例はまた、生体内で遺伝子の移入のための本発明のポリマーの効能を示す。本発明のベクターを用いて得られた結果は、同一条件下で他のトランスフェクション剤を用いて得られた結果より優れたものであり、従って本発明の組成物の高い可能性を示す。
本発明は、特に、前記疾患を補正することができ、上記のようにカチオン性ポリマーと組合わされる核酸の生体内投与を含んでなる、疾患の治療のための特に有利な方法を提供する。さらに特別には、この方法は、タンパク質性または核酸生成物の欠失に起因する疾患に適用でき、そして投与された核酸は前記タンパク質性生成物をコードするかまたは前記核酸生成物を含有する。
従って、本発明の製薬学的組成物は、投与および生体内での核酸の移入のために特に有利な道具を構成する。
以下の実施例によって本発明をさらに完全に記載するが、それは本発明を説明ものであって、限定するものではないと考えるべきである。
図の説明：
図１：（ポリマーアミン／核酸リン酸エステル）比Ｒの観点からのｐＨ７でのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。
図２：ＤＮＡ量の観点からのｐＨ６でのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。
図３：比率Ｒの観点からのｐＨ６でのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。
図４：ｐＨの観点からのＰＥＩ８００Ｋのトランスフェクションの効率。
図５：ＰＥＩ８００Ｋとポリリジンとの比較。
図６：ＰＥＩ５０Ｋの細胞毒性の試験。
図７：補助剤の存在下でのＰＥＩ５０Ｋのトランスフェクションの効率。
図８：ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションにおけるＰＥＩの効率。
図９：肝細胞および腎細胞のトランスフェクションにおけるＰＥＩの効率。
図１０：プラスミドＤＮＡの胚ニューロン中への移入におけるＰＥＩの効率。
図１１：オリゴヌクレオチドの胚ニューロン神経細胞中への移入におけるＰＥＩの効率。
図１２：生体内ＤＮＡ移入のためのＰＥＩの効率。
実施例１：生体内遺伝子移入に使用されたプラスミド本発明の組成物の活性を示すのに、３種類の構築物を使用した。即ち、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードしている遺伝子を含有するプラスミド、β−ガラクトシダーゼをコードしている遺伝子（ＬａｃＺ遺伝子）を含有するプラスミドおよびクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードしている遺伝子を含有するプラスミド。
１．１．Ｌｕｃ遺伝子を含有するプラスミド
プラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃは、制限酵素ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断によってベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から抽出され、ルシフェラーゼをコードしている遺伝子の上流に位置し、ベクターｐＧＬ基本（ｂａｓｉｃ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター含有する。
プラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃは市販起源のものである（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
プラスミドＴ３ＲＥ−Ｌｕｃは、甲状腺ホルモンに対する応答のためのパリンドローム要素に対応する合成オリゴヌクレオチドを含有する（Ｇｌａｓｓ等、Ｃｅｌｌ，５６（１９８９）６９７）。
１．２．ＬａｃＺ遺伝子を含有するプラスミド
プラスミドｐＣＭＶ−βＧａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼをコードしているＬａｃＺ遺伝子の上流に位置するＣＭＶプロモーターを含有する。ベクターｐＳＶ−ｎｌｓ ＬａｃＺ（ｐＡＯｎｌｓＬａｃＺ）は、同一のプロモーター、ＬａｃＺ遺伝子の枠中でかつ上流に局在する核局在配列（ＳＶ４０ウイルスから生成する）を含有する。この構築によって、細胞の核中での融合タンパク質ｎｌｓ−β−ガラクトシダーゼの発現が可能になる（Ｄｅ Ｌｕｚｅ等，ＰＮＡＳ，９０（１９９３）７３２２を参照のこと）。
１．３．ＣＡＴ遺伝子を含有するプラスミド
リポーター遺伝子として、ＲＳＶプロモーター（ｐＲＳＶ−ＣＡＴ）およびＳＶ４０プロモーター（ｐＳＶ４０−ＣＡＴ）の制御下にあるクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードしている遺伝子を有するプラスミドは公開されている（Ｂｏｕｔｉｌｌｅｒ等，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏ−ＰｈｙｃｈｏＰｈａｒｍａｃｏｌ．ｅｔ Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．，１６（１９９２）９５９；ｄｅ Ｌｕｚｅ等，ＰＮＡＳ，９０（１９９３）７３２２）。
実施例２：核酸の繊維芽細胞中への移入
この実施例は、８００，０００Ｄａポリエチレンイミンによる、プラスミドｐＧＬ２−ｌｕｃの３Ｔ３繊維芽細胞中への移入について記載する。
プロトコール：ＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液を調製し、１Ｎ塩酸溶液を使用してｐＨを７に調節する。この溶液を遺伝子移入実験に使用する。
トランスフェクション・プロトコール：トランスフェクションの２４時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、以下のプロトコールに従って、ウエル当たり２μｇのプラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃでトランスフェクトする。
プラスミドの２μｇおよびＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液の種々の容量を、別々に１５０ｍＭ ＮａＣｌの５０μｌ中に希釈し、混合する。１０分後、２つの溶液を一緒にして、そしてホモジナイズする。さらに１０分後、９００μｌのＤＭＥＭを添加する。このようにして得た溶液をホモジナイズして、１０分後に、前もって無血清ＤＭＥＭ培地ですすいだ細胞上に散布する。トランスフェクトの２時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加する。２４時間後に発現を停止させる。
ルシフェラーゼ測定：この目的のために、上澄液を、ルシフェリン、補酵素ＡおよびＡＴＰを含有する緩衝液の存在下でインキュベートし、放射された光（一般的に１０秒間）を光度計（Ｗｏｏｄ Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ，２８）で測定した。
得られた結果を図１に示す。それらは、ＰＥＩによって、プラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃが繊維芽細胞中に効率的に移入せれることを示している。それらはまた、ＤＮＡリン酸エステルに対して５〜２０当量の間のＰＥＩアミンを使用する場合、相対光単位（ＲＬＵ）の活性が特に良好であることを示している。対照実験では、プラスミド単独は約１００ＲＬＵの信号を与える。
実施例３：トランスフェクションの効率に及ぼすＤＮＡ量の効果
この実施例はＰＥＩ８００Ｋによる核酸の３Ｔ３繊維芽細胞中への移入の効率に及ぼす核酸量の効果について記載する。
トランスフェクションの２４時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、上記のプロトコールに従って、ウエル当たり増加する量のプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃおよび一定電荷比（９当量）でトランスフェクトする。研究中の遺伝子を含有しないプラスミドｐＧＥＭ（ＰＲＯＭＥＧＡ）でプラスミド量をウエル当たり２μｇまで補充することによって、２ポイントを製造した。トランスフェクションの３時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清を添加する。２４時間後発現を停止させる。
得られた結果を図２に示す。
トランスフェクションの効率はトランスフェクション中に使用したプラスミド量にしたがって増加する。非転写性キャリヤーＤＮＡ（ｐＧＥＭ）を添加してもトランスフェクションへの寄与はない。
実施例４：核酸の繊維芽細胞中への移入：アミン／リン酸エステル比の影響の研究
この実施例は、種々の（アミン／リン酸エステル）比Ｒで核酸およびＰＥＩ８００Ｋを含んでなる本発明による組成物を用いる、ｐＨ６での、核酸の繊維芽細胞中への移入について記載する。
プロトコール：ＰＥＩ８００Ｋの５．３７５μＭ溶液を調製し、１Ｎ塩酸溶液を使用してｐＨを６に調節する。この溶液を遺伝子移入実験に使用する。
トランスフェクションの１８時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、実施例２で使用したプロトコールに従って、ウエル当たり２μｇのプラスミドｐＧＬ２−Ｌｕｃでトランスフェクトする。
得られた結果を図３に示す。それらは、本発明による組成物が６〜２２の間の比率Ｒの全範囲に亙って特に効率的であることを示している。
実施例５：ｐＨに観点からのトランスフェクションの効率
この実施例は、核酸およびＰＥＩ８００Ｋを含んでなる本発明による組成物による、種々のｐＨ条件下での、核酸の繊維芽細胞への移入について記載する。
使用したプロトコールは実施例２に記載したものと同一である。ｐＨは１Ｎ塩酸を添加して調節する。
得られた結果を図４に示す。それらは、本発明による組成物が種々のｐＨ値、特に生理学的ｐＨ範囲内（ｐＨ５−８）で使用することができることを示している。
実施例６：ＰＥＩおよびポリリジンのトランスフェクションの効率の比較
この実施例は、核酸の繊維芽細胞中への移入において、本発明による組成物および他のカチオン性ポリマー、ポリリジンを用いて得た比較結果について記載する。
プロトコール：この実験で使用したポリリジン（ＰＬＬ）は平均分子量５０Ｋのポリリジン・ＨＢｒである。最終クロロキン濃度は１００μＭである。ＰＥＩはｐＨ６である。
プロトコール：トランスフェクションの１８時間前に、３Ｔ３繊維芽細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする（ウエル当たり５０，０００細胞）。それらを、実施例２で使用したプロトコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。クロロキンの存在下でＰＬＬでトランスフェクトされた細胞を、２時間後にすすぎ、１０％の血清をもつ培地中入れる。２４時間後に発現を停止させる。
得られた結果を図５に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって、ポリリジンのような前者のカチオン性ポリマーベクターよりももっと高い効率で、核酸が繊維芽細胞中に移入されることを示している。
実施例７：ＰＥＩ５０ＫおよびＰＥＩ８００ＫによるＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞のトランスフェクションの効率の比較
この実施例は、核酸の細胞中への移入における２種類のポリマー（ＰＥＩ５０ＫおよびＰＥＩ８００Ｋ）の使用および比較について記載する。
プロトコール：１６ｍｍウエル当たり５０，０００細胞を使用するトランスフェクションの２４時間前に、細胞をインキュベートする。それらを、ＰＥＩと複合させたプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。ＰＥＩアミン／核酸リン酸エステルのモル当量比は６当量から４５当量まで変化する。各ウエルについて、ＰＥＩおよび２μｇのＤＮＡを別々に５０μｌのＮａＣｌ（１５０ｍＭ）中に希釈する。次いで溶液を混合し、その後ホモジナイズする。１０分後、この液を細胞に添加する。２４時間後、細胞は細胞溶解し、細胞溶解液を遠心分離して、上澄液をルシフェラーゼ活性の測定に使用する。タンパク質測定は、この上澄液のアリコートについて、ＢＣＡ試験法によって行う。ルシフェラーゼ活性は、光単位（ＲＬＵ）／１０秒の積分／ｍｇのタンパク質で表す。
得られた結果を以下の表に示す。
実施例８：ＰＥＩの細胞毒性の試験
ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞に対するＰＥＩ５０Ｋのあるかも知れない毒性を研究したいと思った。この研究の場合、ＭＴＴ試験法を選択するが、この試験法によって、ミトコンドリア酵素のコハク酸デヒドロゲナーゼによってＭＴＴテトラゾリウムをＭＴＴホルマザンに還元する細胞の能力を評価することができる。トランスフェクションのプロトコールは実施例７と同一である（ウエル当たりのＤＮＡ量は固定し（２μｇ）、ＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エステルのモル当量数は９から２４まで変化する。）。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．０５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴで９０分間インキュベートする。このインキュベーションの終結時に、細胞培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ中に１０分間で溶解させた。試料の光学濃度を５４０ｎｍで読む。
結果を図６に示す。それらは、本研究の条件下で、ＰＥＩ５０ＫがＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞に対し有意の死亡率を起さないことを示している。
実施例９：トランスフェクション力を増強する補助剤の使用
この実施例は、カチオン性ポリマーおよび補助剤を含んでなる本発明による組成物の使用について記載する。使用された補助剤は中性脂質（ＤＯＰＥ）またはリポポリアミン（ＤＯＧＳ）のいずれかである。
プロトコール：ＤＯＰＥの添加：
ＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エステルの４つのモル当量比：６、９、１８および２１について研究した。各ウエルについて、１２ナノモルのＤＯＰＥをＰＥＩおよびＤＮＡの混合物に添加する。次いで、この溶液を、実施例７に記載のように、トランスフェクションに使用する。
ＤＯＧＳの添加：各ウエルについて、ＤＯＧＳアミン／ＤＮＡリン酸エステルの４モル当量（６ナノモルのリン酸エステルの場合、６ナノモルのＤＯＧＳの当量）を、ＤＮＡと複合させる工程の前に、ＰＥＩ溶液に添加する。次いでトランスフェクションを実施例７に記載のように行う。
得られた結果を図７に示す。それらは明らかに、ＤＯＰＥまたはＤＯＧＳの添加によって、トランスフェクション特性が、特にＰＥＩアミン／ＤＮＡリン酸エステルの低モル当量比の場合、さらに増加することを示している。
実施例１０：Ｈｅｌａ細胞中への遺伝子移入
この実施例は、本発明による組成物が、種々の細胞型、特にＨｅｌａ子宮癌細胞中への遺伝子の移入のために使用することができることを示す。
プロトコール：１６ｍｍウエル当たり５０，０００細胞を使用するトランスフェクションの２４時間前に、Ｈｅｌａ細胞をインキュベートする。次いで、それらを、ＰＥＩまたはリポポリアミン（ＤＯＧＳ）のいずれかと複合させたプラスミドｐＣＭＶ Ｌｕｃでトランスフェクトする。ＰＥＩ８００Ｋアミン／ＤＮＡリン酸エステルの４つのモル当量比：６、９、１８、２１について研究した。アミン／リン酸エステルの８モル当量（１２ナノモルのＤＯＧＳ）で、リポポリアミンを使用する。
得られた結果を図８に示す。それらは明らかに、場合により補助剤と組合わされたカチオン性ポリマーを含んでなる本発明による組成物によって、従来のシステム（特にリポポリアミンＤＯＧＳ）よりもずっとさらに効率的に、Ｈｅｌａ細胞がトランスフェクトされることを示している。
実施例１１：遺伝子の各種細胞型への移入
この実施例は再び、本発明による組成物が、繊維芽細胞、子宮癌、肝細胞腫または腎細胞のような多種類の細胞型中への遺伝子の移入のために使用することができることを示す。さらに詳しくは、この実施例は、ＨｅｐＧ２とＫ５６２およびウサギ平滑筋初代培養細胞を、９電荷当量を含有するＰＥＩで、ｐＨ６でトランスフェクトすることを記載する。
トランスフェクションの２４時間前に（ウエル当たり５０，０００細胞）、ＨｅｐＧ２細胞を２４ウエル皿中でインキュベートする。それらを、実施例２に記載のプロトコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。トランスフェクションの４時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清を添加する。３０時間後に発現を停止させる。
トランスフェクションの１時間前に、Ｋ５６２細胞を、２４ウエル皿中で、無血清ＲＰＭＩ培地の０．５ｍｌ中でインキュベートする。それらを、以下のプロトコールに従って、プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃでトランスフェクトする。即ち、所望量のプラスミドおよびＰＥＩを別々に５０μｌの１５０ｍｍ ＮａＣｌ中に希釈し、混合する。１０分後、２つの溶液を一緒にして、ホモジナイズする。さらに１０分間の後、４００μｌのＲＰＭＩを添加する。このようにして得た溶液をホモジナイズし、１０分後、細胞上に散布する。トランスフェクションの４時間後、ウエル当たり１００μｌのＦＣＳ血清を添加する。３０時間後、発現を停止させる。
ウサギ平滑筋初代培養物を、Ｆａｌｌｉｅｒ−Ｂｅｃｋｅｒによる記載の通りに調製する。次いで、細胞を、（実施例７に記載のプロトコールに従って）ＰＥＩと複合したプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃの１μｇまたは２μｇのいずれかでトランスフェクトする。トランスフェクションの２４または４８時間後に、ルシフェラーゼの発現を停止させる。
得られた結果を図９に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって、多種類の相違する細胞型を効率的にトランスフェクトすることができることを示している。
実施例１２：胚ニューロン初代培養物中へのプラスミドＤＮＡの移入：生物学的活性の提示
Ｌｅｚｏｕａｌｃ′ｈ等による記載の通りに、ニューロン初代培養物を調製した。３６時間後、培養物を、２μｌのプラスミドＴＲＥ−Ｌｕｃ（甲状腺ホルモンＴ３応答要素の制御下のＬｕｃ遺伝子を含有する）およびウエル当たり０．５μｇのキャリヤーＤＮＡでトランスフェクトした。
２つの実験条件について研究した。即ち、
−リン酸エステルに対して９当量のアミン：１μｌのプラスミドを、ＰＥＩ８００Ｋの１００ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の２．２８μｌ中に導入した。
−リン酸エステルに対して１３当量のアミン：１μｇのプラスミドを、ＰＥＩ８００Ｋの１００ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の３．３３μｌ中に導入した。
複合する前に、プラスミドを５０μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈し、そしてＰＥＩも第二の５０μｌアリコートの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈した。次いで溶液を混合し、細胞に１時間適用した。次いで、トランスフェクション培地を除去し、Ｔ３（１ｎＭ）を持つかまたは持たない新しい培養培地に交換した。２４時間後、細胞は細胞溶解し、細胞溶解溶液を遠心分離し、上澄液をルシフェラーゼ活性の測定に使用した。
得られた結果を図１０に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって、ＤＮＡがニューロン細胞中にトランスフェクトされ、そしてこのようにトランスフェクトされたＤＮＡは、活性がＴ３の存在下で増幅されるから、機能的であることを示している。プラスミド単独の存在下で行った対照実験では、ルシフェラーゼ活性は全く検出されなかった。
実施例１３：胚ニューロン初代培養物中へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの移入
実施例１２の通りに調製したニューロン初代培養物について実験を行った。３６時間後、培養物を、ＰＥＩ８００Ｋに対して９当量のアミンと複合された２μＭ １８マー（ｍｅｒ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）でトランスフェクトした。
使用したＯＤＮは、甲状腺ホルモンα−受容体をコードしている遺伝子の領域に対して指向する。その配列は以下の通りである。
−１５０ｍＭ ＮａＣｌの１０μｌ中に希釈されたＯＤＮの０．２５ｍＭ溶液の８μｌ、および
−前もって第二の１５０ｍＭ ＮａＣｌの５１．２μｌアリコート中に希釈されたＰＥＩ８００Ｋの１２ｍＭ水溶液、ｐＨ７、の２０．８μｌ。
次いで、溶液を混合し、混合物の２０μｌを細胞に４５分間適用した。次いでトランスフェクション培地を除去し、新しい培養培地に交換した。次いで細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液中に固定し、すすぎ、Ｍｏｗｉｏｌ中に取り付け、蛍光顕微鏡下で検査した。
得られた結果を図１１に示す。それらは明らかに、本発明による組成物によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドがニューロン細胞中にトランスフェクトされることを示している。オリゴヌクレオチド単独の存在下で行った対照実験では、蛍光は全く検出されなかった。
実施例１４：新生マウスの脳中への核酸の生体内移入のための本発明の組成物の使用
この実施例は、新生マウスの脳中へのプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃの生体内移入について記載する。それは、特に遺伝子治療の応用の場合の本発明による組成物の特に有利な特性を示す。
３０μｌのプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（４μｇ／μｌを含有するストック溶液の７．５μｌ）を２２．５μｌの無菌５％グルコース中に希釈した（最終濃度１μｇ／μｌ）。次いで１００ｍＭ ＰＥＩ８００Ｋ（水中で調製され、そしてｐＨ６．９に緩衝化された）の８．５μｌを添加した。それ故、このようにして得た組成物はリン酸エステルに対して９当量のアミンを含有する。
この混合物を急速に渦撹拌し、新生マウス中への大脳内注射のために使用した。この目的のために、マウスを低温度（氷と接触しているアルミニウム箔上に置かれた）によって麻酔し、次いでマウス当たり２μｌの混合物（２μｇの核酸）を注射した。注射は、皮質中に、両者とも微小電極に連結したマイクロマニピュレータおよびマイクロシリンジを使用して行った。
４８時間後に脳を取出し、ホモジナイズし、遠心分離し、上澄液をルシフェラーゼの測定に使用した。この目的のために、上澄液を、ルシフェリン、補酵素ＡおよびＡＴＰを含む緩衝液の存在下でインキュベートし、放射した光（一般的に１０秒間）を光度計（Ｗｏｏｄ Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ，２８）で測定した。
得られた結果を図１２に示す。それらは明らかに、組成物によって、プラスミドがマウスの脳中に効率的に移入され、一方プラスミド単独によって移入が行われる場合、有意のルシフェラーゼ活性は全く観察されないことを示している。
Claims (28)
- 核酸の溶液およびカチオン性ポリマーの溶液の均一な混合物を含む、細胞に遺伝子を移入するための組成物であって、該カチオン性ポリマーが、一般式（Ｉ）：
（式中、
−Ｒは水素原子または式：
で示される基であることができ、
−ｎは２〜１０の間の整数であり、
−ｐおよびｑは整数であるが、ただし、合計ｐ＋ｑが、ポリマーの平均分子量が１００〜１０7Ｄａの間になるものである）
を有し、
該カチオン性ポリマーと核酸との比率が、ポリマーアミン／核酸リン酸エステルの比率Ｒが５〜３０の間になるように選択されることを特徴とする組成物。 - 式（Ｉ）中で、ｎが２〜５の間にあることを特徴とする請求の範囲１に記載の組成物。
- 前記ポリマーが１０3〜５×１０6の間の平均分子量を有することを特徴とする請求の範囲１または２に記載の組成物。
- 前記ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）から選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ポリマーが平均分子量５０，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ５０Ｋ）および平均分子量８００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００Ｋ）から選ばれることを特徴とする請求の範囲４に記載の組成物。
- 前記ポリマーと核酸との各比率が、ポリマーアミン／核酸リン酸エステルの比率Ｒが５〜１５の間になるように選択されることを特徴とする請求の範囲１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
- さらに、ポリマー／核酸複合体と組合せることができ、そしてトランスフェクション力を増強することができる１種またはそれ以上の補助剤を含んでなり、前記補助剤がカチオン性脂質又は１種またはそれ以上の中性脂質であることを特徴とする請求の範囲１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が１種またはそれ以上のリポポリアミンであることを特徴とする請求の範囲７に記載の組成物。
- 前記リポポリアミンのポリアミン領域が、一般式Ｈ2Ｎ−（−（ＣＨ2）m−ＮＨ−）l−Ｈ（式中、ｍは２〜６の間の整数であり、ｌは１〜５の間の整数であるが、ただしｍは２つのアミンに挟まれて存在する各種炭素基の間で同一であっても異なっていてもよい）で示されることを特徴とする請求の範囲８に記載の組成物。
- 前記リポポリアミンが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）またはパルミトイルホスファチジルエタノールアミン＝５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）から選ばれることを特徴とする請求の範囲９に記載の組成物。
- 前記中性脂質または中性脂質類が、両性イオンであるかまたは生理学的条件下でイオン性電荷を欠く合成または天然脂質から選ばれることを特徴とする請求の範囲７に記載の組成物。
- 前記中性脂質または中性脂質類が２つの脂肪鎖を含有する脂質であることを特徴とする請求の範囲１１に記載の組成物。
- 前記中性脂質または中性脂質類がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイル−、−パルミトイル−および−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン並びにそれらの１〜３重Ｎメチル化誘導体；ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド、スフィンゴ脂質またはアシアロガングリオシドから選ばれることを特徴とする請求の範囲１１に記載の組成物。
- 前記セレブロシドが、ガラクトセレブロシドである、請求の範囲１３に記載の組成物。
- 前記スフィンゴ脂質が、スフィンゴミエリンである、請求の範囲１３に記載の組成物。
- 前記アシアロガングリオシドが、アシアロGM1またはアシアロGM2である請求の範囲１３に記載の組成物。
- 前記核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする請求の範囲１に記載の組成物。
- 前記核酸がリボ核酸であることを特徴とする請求の範囲１に記載の組成物。
- 前記核酸が化学的に修飾されることを特徴とする請求の範囲１７または１８に記載の組成物。
- 前記核酸がアンチセンス配列であることを特徴とする請求の範囲１７〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸が治療的遺伝子を含有することを特徴とする請求の範囲１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸リン酸エステルのモル当量当たり０．１〜２０モル当量の補助剤を含んでなることを特徴とする請求の範囲７に記載の組成物。
- 核酸リン酸エステルのモル当量当たり１〜５モル当量の補助剤を含んでなることを特徴とする請求の範囲７に記載の組成物。
- 増殖因子受容体のための、サイトカイン受容体のための、細胞レクチン受容体のための、または接着タンパク質受容体のためのリガンド；トランスフェリン受容体、ＨＤＬまたはＬＤＬ受容体のためのリガンド；アシアロ糖タンパク質受容体を標的にすることができる糖；または免疫グロブリンＦｃ断片受容体を標的にすることができる抗体Ｆａｂ断片から選択される糖ならびに／またはペプチドからなる標的指向要素（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでなることを特徴とする請求の範囲１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記標的指向要素が、式（Ｉ）で示されるポリマーに共有結合的に結合していることを特徴とする請求の範囲２４に記載の組成物。
- 注射剤のための薬学的に許容される賦形剤を含んでなることを特徴とする請求の範囲１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
- 皮膚および／または粘膜への適用のための薬学的に許容される賦形剤を含んでなることを特徴とする請求の範囲１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸の細胞中への移入のための、請求の範囲１に記載の組成物のin vitro使用。
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