DE102008023913A1 - Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems - Google Patents

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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Abstract

Das angeborene Immunsystem von Eukaryoten ist in der Lage, über Toll Like Rezeptoren fremdes genetisches Material zu erkennen und Signaltransduktionskaskaden anzustoßen, die über eine Interferonantwort einen antiviralen Zustand von Zellpopulationen auslösen. Dieser antivirale Zustand ist auch eine Barriere für nicht-virale Genliefersysteme. Wird die Signaltransduktionskaskade intrazellulär oder interzellulär unterbrochen, lassen sich Transfektionseffizienzen von nicht-viralen Genliefersystemen steigern und unerwünschte Änderungen des Expressionsprofils vermeiden. Da die RNA Interferenz zum antiviralen Zustand zuzurechnen ist, ist die RNAi-Maschinerie nach einer Aktivierung des angeborenen Immunsystems ebenfalls aktiviert. Auf diese Weise lassen sich Knockdowneffizienzen bei der Transfektion mit siRNA erhöhen.

Description

  • Stand der Technik
  • Bei Immunantworten des Körpers (Luke A. et al.; Spektrum der Wissenschaft, August 2005, Seiten 68–75) gegen eine infektiöse oder immunologische Herausforderung unterscheidet man zwischen der angeborenen (innate immunity) und der erworbenen Immunantwort (antigen-specific acquired immunity).
  • Die erworbene Immunabwehr wird erst bei einer Infektion mit Krankheitserregern ausgebildet. Sie besitzt eine Art Gedächtnis, sodass es bei einer zweiten Infektion durch denselben Erreger in der Regel nicht mehr zum Ausbruch der Krankheit kommt. Auf diesem Prinzip beruhen Impfstoffe. Gäbe es nur die erworbene Immunabwehr wäre der Organismus vor der ersten Infektion völlig ungeschützt. Das ist jedoch nicht der Fall, da es noch eine weitere sehr ursprüngliche Immunabwehr gibt, die als angeborene Immunabwehr bezeichnet wird und von der Fliege Drosophila bis zu Säugetieren, ja sogar bei Pflanzen gefunden wird.
  • Die angeborene Immunabwehr ist die erste Abwehrfront gegen Krankheitserreger und stellt ein evolutionär sehr altes System dar. Bei der angeborenen Immunabwehr werden über so genannte Toll-like Rezeptoren (TLRs) (Heine H. et al.; Int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 130; 180–192 und Uematsu S. et al., J. Biol. Chem. 2007, May 25; 282 (21); 15319–23) und RIG-I-like Helikasen (RLHs) die krankheitsassozierten molekularen Muster, so genannte pathogen-associated molecular Patterns (PAMPs), erkannt und entsprechende Entzündungs- sowie Immunreaktionen eingeleitet. Dadurch kann der Organismus zwischen „selbst” und „nicht selbst” unterscheiden. RLHs werden ubiquitär im Zytosol exprimiert, wo sie in der Lage sind, die bei viraler Infektion entstehende dsRNA zu erkennen. TLRs und RLHs gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren, die auch als pattern recognition receptors (PRRs) bezeichnet werden.
  • RIG-I-like Helikasen (RLHs)
  • RIG-I (retinoic inducible gene I) ist ein intrazellulärer Rezeptor des angeborenen Immunsystems (Perry A. K. et al; Cell Research 2005; 15(6); 407–422 und Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145). Der Rezeptor gehört zu den Helikasen und ist in der Lage, einzel- und doppelsträngige RNS mit einem Triphosphatrest an 5'-Position zu detektieren. Damit ist er in der Lage, zwischen zelleigenen und viralen Ribonukleinsäuren zu unterscheiden. Wird fremde RNA erkannt, wird über eine Signaltransduktionskaskade eine Immunantwort ausgelöst und am Ende Interferon des Typs I produziert. Wie diese Signaltransduktionskaskade genau funktioniert ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Man vermutet jedoch die Beteiligung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, IRF3, IRF 7 und der Kinasen TBK1 und IKK-i. Eine Gruppe mit ähnlichen Eigenschaften wird unter dem Begriff RIG-Ilike Helikasen zusammengefasst.
  • Toll-like Rezeptoren (TLRs)
  • Toll-like Rezeptoren wurden erstmals in der Mitte der 1990er Jahre entdeckt (Zimmer A. et al.; PNAS, 1999; 96(10), 5780–5785). Der Name ist abgeleitet von einem in Drosophila Melanogaster von Christiane Nusslein-Volhard gefundenem Protein, das Sie „Toll” nannte. TLR-Proteine ähneln diesem Typus und werden damit als „Toll-like”-Proteine bezeichnet. Dabei handelt es sich um Transmembranproteine mit einer extrazellulären, „leucin-reichen repeat” Domäne (LRR) wie auch einer zytoplasmatischen Domäne, die derjenigen der IL-1R Familie homolog ist. Die verschiedenen TLRs reagieren selektiv auf verschiedene molekulare virale und bakterielle Komponenten und steuern über eine Signaltransduktionskaskade eine entsprechende Aktivierung von Genen. Dies geschieht zunächst über so genannte Adaptermoleküle und darauf folgend über Kinasen, die schließlich Transkriptionsfaktoren (z. B. NF-kB und die IRF-Familien) durch Phosphorylierung derselben oder entsprechender intrazellulärer Inhibitoren dieser Transkriptionsfaktoren aktivieren. Letztendlich werden neben einer Vielzahl spezifischer Gene, die eine antimikrobielle Wirkung haben, so genannte Zytokine produziert. Zytokine sind wiederum notwendige Stimulatoren für die erworbene Immunabwehr und damit auch ein Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunabwehr. Die Prinzipien der Ligandenerkennung, Signaltransduktion und Signalweiterleitung sind allerdings erst in Ansätzen verstanden.
  • Bisher sind 13 verschiedene TLRs bekannt (davon 10 beim Menschen), deren Anzahl ausreichend ist für die Erkennung aller pathogenen Erreger, angefangen von Bakterien über Pilze bis zu den Viren. Die Rezeptoren erkennen dabei allen Erregern gemeinsame Strukturen, des Weiteren mitunter auch mehrere Bestandteile gleichzeitig, ohne dass diese sich strukturell ähneln. Beispielsweise erkennt das TLR4 Lipopolysaccharide, aber auch Taxol. Bisher ist nicht bekannt wie die TLRs das leisten können. Die TLRs unterscheiden sich von Spezies zu Spezies nur wenig.
  • Bisher sind folgende Gruppen von Molekülen als Liganden der TLRs bekannt, die zu einer Auslösung von Signaltransduktionskaskaden führen:

    TLR1:
    bildet mit TLR2 ein Heterodimer, ist der Rezeptor von triacyliertem Lipoprotein und Zymosan aus Hefen.

    TLR2: ist der Rezeptor für bestimmte Peptidoglykane, Lipopeptide, Glykolipide und verschiedener Bakterien.

    TLR3:
    erkennt lange dsRNA, wie Sie bei einer Virusreplikation in infizierten Zellen vorkommt.

    TLR4:
    ist der Rezeptor für Lipopolysaccharide (LPS, auch Endotoxine), verschiedene Hüllglykoproteine (auch von Viren) und Taxol. LPS sind Bestandteile von Bakterienzellwänden. Der TLR4 Rezeptor benötigt für seine Funktion ein zusätzliches membrangebundenes Protein (TLR assistierendes Protein). Dabei bindet CD14 z. B. das LPS und führt es dem TLR4 Rezeptor zu. Die Bindung an CD14 alleine löst dabei keine Signaltransduktionskaskade aus.

    TLR5:
    ist der Rezeptor von Flagellin, einem Hauptbestandteil der Geiseln (Flagellae), mit welchen sich Bakterien fortbewegen.

    TLR6:
    bildet mit TLR2 ein Heterodimer, ist der Rezeptor von diacyliertem Lipoprotein und bestimmten Peptidoglykanen. Ein spezielles Lipoprotein (MALP-2 = macrophage-activating lipopeptide) wird mittels Unterstützung durch das membrangebundene Protein CD36 detektiert (TLR assistierendes Protein).

    TLR7&TLR8:
    sind Rezeptoren für Imidazochinolinen und von ssRNA/dsRNA z. B. von RNA-Viren.

    TLR9:
    ist der Rezeptor für bakterielle DNA, bzw. für nicht methylierte CpG Motive, die in bakterieller DNA gehäuft (20 × häufiger als in Säugerzellen) auftritt. Das CpG Motiv ist in Säugerzellen stark methyliert, wodurch es unterschieden werden kann. ähnliches wie für bakterielle DNA gilt auch für virale DNA, die auch von TLR9 detektiert wird. Über die immunstimulatorische Eigenschaft von bakterieller DNA berichtete schon Anfang der 80er Jahre die Gruppe um Dr. Tokunaga. Als zugehöriger Rezeptor wurde von der Gruppe um Dr. Shizuo Akira der TLR9 Rezeptor identifiziert (Aufklärung der Rollen von Toll-Rezeptoren und ihrer Signaltransduktionskaskaden mittels Gen-Targeting, Robert-Koch-Vorlesung von Dr. Shizuo Akira, Allgemeine Presseinformation 2002; www.robert-koch.stiftung.de).

    TLR10:
    Ligand noch nicht bekannt

    TLR11:
    Ist Rezeptor für das urpathogene Bakterium Escherichia coli und dem Profilinähnlichen Protein des Urtierchens Toxoplasma gondii

    TLR12:
    Funktion und Ligand noch unbekannt

    TLR13:
    Funktion und Ligand noch unbekannt
  • Lokalisation der TLR:
  • TLR2, 4, 5 und 6 sitzen insbesondere in den Plasmamembranen von Monozyten, natürlichen Killerzellen, Mastzellen oder myaloiden dendritischen Zellen., 7, 8, und 9 befinden sich insbesondere in Endosomen von Immunzellen (Siegmund-Schultze N., www.aerzteblatt.de). Die Aktivierung der Immunantwort erfordert daher eine intrazelluläre Aufnahme über Endozytose und eine Reifung der Endosomen. Die Signalweiterleitung beginnt hier in einem endosomalen Kompartiment. Für TLR 3 gibt es Hinweise, dass er sich in den Plasmamembranen befindet, allerdings gibt es auch Darstellungen in der Literatur die von einer endosomalen Lokalisation ausgehen. TLRs agieren häufig paarweise und treten bei unterschiedlichen Zelltypen in unterschiedlichen Kombinationen auf.
  • Signaltransduktionskaskaden:
  • Die Signaltransduktionswege der unterschiedlichen TLRs (Perry A. K. et al; Cell Research 2005; 15(6); 407–422 und Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145) sind teilweise zwar ähnlich, weisen aber durchaus auch größere Unterschiede auf, sodass es am Ende zu einer unterschiedlichen Genexpression und damit unterschiedlichen biologischen Reaktionen kommt. Mit Ausnahme von TLR3 geben alle TLRs ihr Signal an das Adapterprotein MyD88 weiter. MyD88 spielt eine entscheidende Rolle bei der Signalübermittlung über den TLR/Interleukin-1 Rezeptor. Die zytosolische Domäne der TLRs zeigt hohe ähnlichkeit zu der des Interleukin-1 Rezeptors und wird daher auch als Toll/IR-1 Rezeptor Domäne (TIR) bezeichnet. MyD88-defiziente Splenozyten zeigten z. B. keine Reaktionen auf Interleukin-1, LPS oder CpG-DNA. Außerdem wurde bei MyD88 defizienten Zellen in Reaktion auf TLR2, TLR7, TLR9-Liganden keine Aktivierung von Signalmolekülen, wie NF-kB oder MAP Kinasen beobachtet. Das ist ein deutlicher Hinweis auf die vollständige Abhängigkeit der TLRs (außer TLR3) von MyD88 für deren Signalweiterleitung. Andere Adaptermoleküle sind z. B. TIRAP (Toll-Interleukin-1-Rezeptor(TIR)-Domäne enthaltendes Adapterprotein (TLR1, TLR2, TLR4 und TLR6), Mal (MyD88-adapter-like), TRIF (TLR3 und TLR4) und TRAM (TLR4).
  • Welche Proteine neben den Adaptermolekülen noch mitwirken hängt vom jeweiligen TLR ab. Allgemein und vereinfacht dargestellt beginnt eine Signatransduktionskaskade in der Regel mit einem Rezeptor an der Zelloberfläche mit einer zytosolischen Domäne, der sein Signal bei Belegung mir einem passenden Liganden über zytosolische Adaptermoleküle an Kinasen weiterleitet, die über Kaskaden Transkriptionsfaktoren aktivieren. Die aktivierten Transkriptionsfaktoren lokalisieren im Kern und lösen die Expression von Proteinen, meistens Zytokinen aus.
  • Signaltransduktionskaskade über TLR1/TLR2, TLR2/TLR2, TLR2/TLR6 Die Rezeptoren, die in entsprechenden Paaren auftreten, lösen bei der Belegung mit passenden Liganden die gleichen Signaltransduktionskaskaden aus. Letztendlich werden unter anderem die Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1 aktiviert, die insbesondere zur Expression von Zytokinen führen. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle RAC-1, TIRAP, MyD88 und TRAF6 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4, TAK1, PI 3K, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
  • Signaltransduktionskaskade über TLR4
  • Der Rezeptor benötigt das membrangebundene Protein CD14 für seine volle Funktion. CD14 bindet entsprechende Agonisten und führt Sie dem Rezeptor zu. Dieser löst bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, AP-1, IRF3 und IRF7 aus und führt wiederum insbesondere zur Expression von Zytokinen. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle TIRAP, MyD88, TRAM, TRIF, TRAF3, TRAF6, NAP1 und RIP1 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, IKKepsilon, TBK1, ERK1, ERK2, JNK, p38 MAPK, MEK1, MEK2 und MKKs beteiligt.
  • Signaltransduktionskaskade über TLR5
  • Der Rezeptor löst bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1, die insbesondere zur Expression von Zytokinen führen. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle MyD88 und TRAF6 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
  • Signaltransduktionskaskade über TLR10,11,12,13
  • Die Rezeptoren lösen bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1, die insbesondere zur Expression von Cytokinen führen. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle MyD88 und TRAF6 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma und MKKs beteiligt.
  • Signaltransduktionskaskade über TLR3:
  • Der Rezeptor löst bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, AP-1, IRF3 und IRF7 aus, wobei wiederum insbesondere Zytokine verstärkt exprimiert werden. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle TRIF, TRAF6, TRAF3, NAP1 und RIP1 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, IKKepsilon, TBK1, PKR, PI K3, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
  • Signaltransduktionskaskaden über TLR7, TLR8 und TLR9
  • Die Rezeptoren, lösen bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, AP-1, IRF1, IRF5 und IRF7 aus, wobei wiederum insbesondere Zytokine verstärkt exprimiert werden. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle MyD88, TRAF6 und TRAF3 beteiligt. Als Kinasen sind IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
  • TLRs sind von großem therapeutischem Interesse. TLR Agonisten werden z. B. als Adjuvantien in Impfstrategien oder in der Krebstherapie eingesetzt. Beispiele sind die Behandlung von Basalzellkarzinom durch die TLR7/8 Agonisten Imiquimod/Resiquimod oder von Blasenkrebs durch einen TLR2 Agonisten. Der TLR9 Rezeptor wird durch ein synthetisches CpG-haltiges Oligonukleotid (CpG 7909 und CpG 10101) für die Therapie von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten angesteuert. Kommerzialisiert werden TLR9 basierende Therapiestrategien von der Firma Coley Pharmaceuticals.
  • TLR7 und TLR8 Agonisten
  • Bekannte kommerzielle erhältliche Agonisten für den TLR7 und TLR8 Rezeptor sind allgemein Immidazochinoline (Schön et al., Oncogene, 2008, 27, 190–199), wie Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine), Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1H-imidazo[4,5-c]quinoline-1-ethanol) und Gardiquimod (1-(4-amino-2-ethylamino methylimidazo[4,5-c]quinolin-1-yl)-2-methylpropan-2-ol), Guanosinanaloga, wie z. B. Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin) und andere wie z. B. Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone). Weitere Immidazochinoline wurden in der Literatur beschrieben (Miller et al. Drug News & Perspectives, 2008, 21(2), 69–87; Gorden et al., J. Immunol., 2005, 174, 1259–1268; Jurk et al., Eur. J. Immunol., 36, 1815–1826; 2006; Gorden et al., J. Immunol., 2006, 177, 8164–8170) und sollen durch Referenz mitaufgenommen sein.
  • Weitere teilweise ebenfalls kommerziell erhältliche Agonisten sind Thiazolochinoline wie CL075 (Gordon KB et al., J. Immunol., 2005, 174(3), 1259–68) und CL097 (Schindler U. et al., Mol. Cell Biol., 1994, 14(9), 5820–5831) und das Guanosinanalogon Isatoribine (7-Thia-8-oxoguanosin) (Horsmans Y. et al., Hepatology, 42(3), 724–731).
  • Bekannte Agonisten für den TLR8 sind ganz allgemein ssRNA, insbesonders einzelsträngiges polyUridin und ssRNA mit U oder GU reichen Sequenzen (Diebold et al, Science, 2004, 303, 1529–1531; Heil et al., Science, 2004, 303, 1526–1529; Lund et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101, 5598–5603). Dabei kann die ssRNA auch als Phosphothioat vorliegen. Besonders zu nennen sind die Sequenzmotive UGUGU und GUCCUUCAA (Hornung et al., Nat. Med., 2005, 11, 263–270; Judge et al., Nat. Biotechnol., 2005, 23, 457–462) die besonders in ssRNA ab einer Länge von 16bp stimulierend sind.
  • Aber auch durch eine Überreaktion der angeborenen Immunabwehr können zahlreiche Krankheiten ausgelöst werden, beispielsweise Autoimmunerkrankungen wie rheumatische Arthritis und systemischer Lupus erythematodes. Hier reagieren TLRs mit Zerfallsprodukten körpereigener Zellen und leiten damit die Immunabwehr fehl.
  • Die TLRs stehen sogar im Verdacht, ursächlich mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen im Zusammenhang zu stehen. Entzündungsreaktionen am Herz können zur Bildung von arteriosklerotischen Plaques beitragen, die letztendlich durch Gefäßverschluss zum Infarkt führen können.
  • Zytokine/Cytokines:
  • Zytokine sind multifunktionale Signalstoffe. Es handelt sich dabei um zuckerhaltige Proteine, die eine regulierende Funktion für das Wachstum und die Differerenzierung von Körperzellen haben. Einige von ihnen werden daher auch als Wachstumsfaktoren bezeichnet. Viele Zytokine spielen zudem eine wichtige Rolle bei immunologischen Reaktionen und werden daher auch Mediatoren genannt. Zytokine werden von den Zellen durch Sekretion in das umgebende Medium abgegeben und stimulieren andere Zellen, wenn diese einen passenden Rezeptor besitzen. Man unterscheidet 5 Hauptgruppen von Zytokinen:
  • 1. Interferone (IFN)
  • Interferone weisen Zellen an, Proteine zu bilden, die eine virale Infektion erschweren oder unterbinden. Auch können Interferone antitumorale Wirkung haben.
  • 2. Interleukine (IL)
  • Interleukine dienen insbesondere der Kommunikation von Immunabwehrzellen untereinander und erhöhen dadurch die Koordination bei der Abwehr von Krankheitserregern und der Tumorbekämpfung
  • 3. Koloniestimulierende Faktoren
  • Koloniestimulierende Faktoren werden in der Niere gebildet. Es handelt sich um Wachstumsfaktoren für Blutkörperchen
  • 4. Tumornekrosefaktoren (TNF)
  • Die wichtigste Funktion von TNFs ist, die Aktivität verschiedener Immunzellen zu regeln. Sie werden hauptsächlich von Makrophagen ausgeschüttet. TNFs können den Zelltod (Apoptose), Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Ausschüttung anderer Zytokine anregen.
  • 5. Chemokine
  • Chemokine sind Chemoattraktoren, die Zellen mit passenden Rezeptoren veranlassen durch Chemotaxis zur Quelle der Chemokine zu wandern Von besonderer Bedeutung als Mediatoren für immunologische Prozesse sind die Interferone (IFN), insbesondere die Interferone vom Typ I. Das erste Interferon dieser Art wurde 1957 von Isaacs und Lindemann gefunden (Isaacs, A. et al.; J. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 147, 258–267). Der Name rührt daher, dass dieses Protein mit der Replikation von Viren interferiert. Typ I Interferone sind Schlüsselzytokine, die eine antivirale Antwort von Zellen auslösen, einen „antiviralen Status” etablieren und Zellen des Immunsystems zu einer antiviralen Antwort stimulieren. Diese Gruppe bindet an einen Rezeptor, den so genannten IFN-alpha Rezeptor (IFNAR), der aus zwei Proteinketten (IFNARI und IFNAR2) besteht. Man unterscheidet verschiedene Untertypen. Diese werden als IFN-alpha, IFN-beta, IFN-kappa, IFN-delta, IFN-epsilon, IFN-tau, IFN-omega und IFN-zeta bezeichnet. wiederum von besonderer Bedeutung sind hier die Interferone des Typs alpha und beta, die von vielen Zellen sekregiert werden, z. B. von Lymphozyten, Makrophagen, Fibroblasten Endothelzellen, Osteoplasten und anderen.
  • Die IFN-alpha Proteine kommen in 13 Subtypen vor, die als IFNAX (x = 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17 und 21) bezeichnet werden. Alle ihre Gene liegen clusterartig auf dem Chromosom 9.
  • Von den IFN-beta Proteinen sind zwei beschrieben. Es handelt sich um IFNB1 und IFNB3. Ein als IFNB2 beschriebenes Protein konnte später als ein bekanntes Interleukin identifiziert werden.
  • Über eine Signaltransduktionskaskade, den sogenannten JAK/STAT Pathway wird nach der Bindung an den in der äußeren Zellmembran liegenden Interferon-Typ-1-Rezeptor der Transkriptionsfaktor „interferone stimulated gene factor 3” (ISGF3), ein Heterotrimer der Transkriptionsfaktoren STAT1, STAT2 und „IFN regulatory factor 9 (IRF9), welche in den Zellkern wandern und dort die Transkription von Hunderten von Effektormolekülen (über so genannte IFN induzierbare Gene) induziert. Diese Effektormoleküle beeinflussen direkt die Proteinsynthese, das Zellwachstum und das Überleben im Prozess der Etablierung des so genannten „antiviralen Status” (antiviral state). In diesem Status wird die Infektiösität der Viren z. B. durch verringerte Replikationsraten abgewehrt oder zumindest verringert.
  • Zusätzlich wird das adaptive Immunsystem aktiviert, indem die Reifung von dendritischen Zellen ausgelöst, die Antikörperantwort der B Zellen und die T Zellantwort aktiviert wird. Es werden Lymphozyten und Monozyten durch induzierte Chemokine zum Ort der Infektion rekrutiert.
  • Auch Stress kann Signaltransduktionswege anstossen, die in einen antiviralen Status münden. Diese Signaltransduktionkaskaden kreuzen die Signaltransduktionkaskaden der TLR.
  • Stress-Signaltransduktionswege:
  • Zellulärer Stress kann ausgelöst werden, durch:
    • – Hitze/Kälte
    • – UV
    • – mechanische Beanspruchung/Scherkräfte
    • – Sauerstoffmangel
    • – Nährstoffmangel
    • – Osmotischer Stress
    • – Oxidativer Stress/Freie Radikale
    • – Entzündungen
    • – biologische und chemische Agentien (z. B. TNFalpha, Chemotherapeutika)
  • Die Zellen reagieren auf Stress mit komplexen Veränderungen in der Aktivität von Signalketten, an welchen spezifische MEK, MSK und MAP Kinasen und verschiedene Transkriptionsfaktoren (z. B. NF-kB), Apoptoseregulatoren und Zellzyklus-regulatoren beteiligt sind. GTP-bindende Proteine (Ras/Rho-Familie) die an der Membran gebunden sind spielen bei der Reaktion der Zellen auf zellulären Stress eine besondere Rolle.
  • Die angeborene Immunantwort erfolgt sowohl intrazellulär als auch interzellulär. Bei der intrazellulären Antwort löst eine durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffene Zelle über PRRs, wie beispielsweise TLRs und RLHs, Signaltransduktionskaskaden aus, wodurch sich der physiologische Status und das Expressionsprofil der Zelle ändern. Daneben gibt es eine interzelluläre Antwort, bei der die durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffene Zelle andere Zellen, die keinem direkten Kontakt mit dem entsprechenden Pathogen ausgesetzt waren, von der ”Infektion” mit dem Pathogen „informiert”. Dabei werden von der durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffenen Zelle Zytokine freigesetzt, die von Zytokinrezeptoren, welche sich auf den anderen nicht mit dem Pathogen in Kontakt gekommen Zellen befinden, detektiert werden. Durch die Bindung der Zytokine an die Zytokinrezeptoren wird eine Signaltransduktionskaskade in den Zellen, die keinem direkten Kontakt mit dem Pathogen ausgesetzt waren, ausgelöst, mit der Folge, dass sich auch deren physiologischer Status und Expressionsprofil ändert, obwohl sie mit dem Pathogen nicht direkt in Berührung gekommen sind. Die änderung des physiologischen Status und des Expressionsprofils der Zellen soll dabei den pathogenen Angriff abwehren und das Überleben der Zellen sichern.
  • Die interzelluläre Antwort grenzt sich von der intrazellulären Antwort durch die unterschiedlichen Rezeptoren und Agonisten ab. Als Rezeptoren fungieren bei der interzellulären Antwort Zytokinrezeptoren und bei der intrazellulären Antwort PRRs. Die Agonisten der interzellulären Antwort sind Zytokine und bei der intrazellulären Antwort sind die Agonisten pathogene Muster.
  • Genliefermethoden
  • Die Transfektion, d. h. das Einbringen von genetischem Material in eukariotische Zellen, insbesondere Säugerzellen, ist heute eine Methode, die aus der modernen Forschung nicht mehr wegzudenken ist (Domb A. J.; Review in Molecules; 2005; 10; 34 und Xiang G; Keun-Sik K.; Dexi L.; Review in The AAPS Journal; 2007; 9(1) Article 9; http://www.aapsj.org). Ohne diese Methode wäre eine Aufklärung der Funktion verschiedener Gene wesentlich erschwert. Nicht zu vergessen ist die Möglichkeit, auf diesem Wege Proteine eukariotischen Ursprungs originalgetreu herzustellen, da die korrekte posttranslationale Modifikation durch die eukariotischen Zellen, im Gegensatz zu früher häufig verwendeten prokariotischen Zellen, sichergestellt wird. Des Weiteren wird für die nahe Zukunft erwartet, dass insbesondere das Einbringen von genetischem Material in humane Zellen, also die Gentherapie, Einzug in die moderne Medizin in Form klinisch getesteter Verfahren und Therapien halten wird. Das Einbringen von genetischem Material ermöglicht es z. B. in eukariotischen Zellen zerstörte DNA Bereiche zu ersetzen und somit Fehlfunktionen zu beheben. Des Weiteren können Suizidgene eingeschleust werden, die beispielsweise Krebszellen zum „Selbstmord” zwingen. Aber auch das Stilllegen (Knock-down) von Genen kann erreicht werden, indem beispielsweise siRNA (small interfering RNA), Ribozyme oder Antisense Moleküle zum Einsatz kommen. Mit der Möglichkeit, auf den genetischen Steuerungsapparat der Zelle zugreifen zu können, steht dem Menschen daher ein wertvolles Mittel zur Verfügung, sein Verständnis aber auch seinen Einfluss auf die natürlich ablaufenden Prozesse in einer Zelle zu vermehren.
  • In den vergangenen Jahren erlangte die Erforschung so genannter Genliefermethoden (Gene Delivery Systems), die sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden können, enorme Bedeutung, da jenen große Chancen eingeräumt werden, der Gentherapie zum Durchbruch zu verhelfen. Ein Schwerpunkt der Gentherapieforschung besteht darin, Viren als Carriersysteme zu nutzen. Da das Einbringen von DNA oder RNA in Fremdzellen ein integraler Bestandteil des Vermehrungszyklus der Viren ist, wurde diese Fähigkeit durch einen natürlichen, evolutiven Prozess in der Entwicklungsgeschichte der Viren soweit verfeinert, dass es bis heute keine effektiveren Gen-Carrier gibt. Die natürlich vorkommenden Viren werden gentechnisch so manipuliert, dass sie Ihre Fähigkeit zur Reproduktion und ihre Pathogenität verlieren, jedoch eine Zelle mit rekombinant eingebrachtem genetischem Material infizieren können. Da Viren außer aus genetischem Material im Wesentlichen aus Proteinen bestehen, bieten Sie dem Immunsystem allerdings eine große Angriffsfläche. Dabei hat das Immunsystem in einem ebenso evolutionären Anpassungsprozess Strategien entwickelt, sich diesen Eindringlingen zur Wehr zu setzen. Daher wird die Immunantwort des Körpers als ein besonders bedeutender Faktor bezumglich gescheiterter Gentherapiestudien genannt.
  • Die gegenwärtig zur Verfügung stehenden Genliefermethoden können in die zwei Hauptgruppen virale Systeme und nicht-virale Systeme unterteilt werden. Die nicht-viralen Systeme können wiederum in chemische und physikalische Methoden unterschieden werden.
  • Von den nicht-viralen Systemen, die auf chemischen Methoden beruhen, sind insbesondere solche erwähnenswert, die auf kationischen Lipiden (sog. Lipofektion) oder kationischen Polymeren (sog. Polyfektion) beruhen. Deren Effizienz liegt in der Regel weit hinter den viralen Systemen. Allseits bekannte kationische Polymere sind beispielsweise Poly-L-Lysin (PLL), ( EP 388758 ) Polyethylenimin (PEI), (J. P. Behr et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1995; 92; 7297 ( WO 9602655 ), Diethylaminoethyldextran (DEAE), (S. C. De Smedt et al.; Phar. Res.; 2000; 17; 113), Starburst Dendrimere (PAMAM), (F. C. Szoka et al.; Bioconjug. Chem.; 1996; 7; 703; WO 9502397 ), Chitosanderivate (W. Guang Liu et al.; J. Control. Release; 2002; 83; 1) oder auch Polydimethylaminoethylmethacrylate (P. van de Wetering et al.; J. Gene Med.; 1999; 1; 156; WO 9715680 ). Auch die weit verbreitete Ca-Phosphat-Präzipitationsmethode nutzt in weiterem Sinne ein „kationisches Polymer” und kann daher zu dieser Gruppe gezählt werden.
  • Kommerziell erhältliche Produkte solcher kationischer Polymere sind z. B. Superfect, Polyfect (Qiagen), ExGen500 (Biomol) und jetPEI (Qbiogene). Ebenso bekannte kationische Lipide (J. P. Behr; Bioconjugate Chem.; 1994; 5; 382) sind beispielsweise DOTMA ( US 4946787 ), DOTAP (Leventis et al.; Biochim. Biophys. Acta; 1990; 1023; 124), DOGS ( EP 394111 ), DOSPA ( WO 9405624 ), DOSPER ( WO 97002419 ), DMRIE ( US 5264618 ) oder DC-Chol (Huang et al; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1991; 179; 280; WO 9640067 ). Solche oder ähnliche Lipide werden als solche oder in Kombination mit so genannten Colipiden (z. B. DOPE) in der Regel in ethanolischen, wässrigen Pufferlösungen als Micellen oder Liposomen formuliert. Als solche, oder auch als Öl oder Festsubstanz zur Eigenformulierung sind sie als kommerziell erhältliche Reagenzien, wie Lipofectin, Lipofectamin, Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Fugene (Roche), Effectene (Qiagen), Transfectam (Promega), Metafectene (Biontex) etc. erhältlich.
  • Kationische Lipide und kationische Polymere bilden in Anwesenheit von DNA oder RNA aufgrund der gegenläufigen Ladungsverhältnisse spontan so genannte Lipoplexe oder Polyplexe. Die DNA wird dabei durch die Kompensation der negativen Ladung am Phosphatrest kondensiert, also in ihrer Größe minimiert. Im Allgemeinen hängt die Transfektionseffizienz von Lipoplexen oder Polyplexen von einer Vielzahl von Parametern ab. Die wichtigsten sind das Mengenverhältnis von genetischem Material zu kationischer Komponente bei der Herstellung der Lipo/Polyplexe, Ionenstärke während der Herstellung der Lipo/Polyplexe, Absolutmenge von Lipo/Polyplexen pro Zelle, Zelltyp, Proliferationszustand der Zellen, physiologischer Status der Zellen, Zellteilungsrate, Inkubationszeit etc. Diese Einflussparameter sind Ausdruck eines komplizierten Transfektionsgeschehens, bei der die Lipo/Polyplexe bzw. die enthaltenen genetischen Materialien eine Vielzahl von zellulären Barrieren überwinden müssen.
  • Die erste Barriere stellt die äußere negativ geladene Zellmembran dar. Es wird angenommen, dass transfektionsaktive Lipoplexe, die eine positive Nettoladung haben müssen, durch adsorptive Endocytose oder Flüssigphasenendocytose in das Innere der Zelle gelangen. Durch die Endocytose, die einen aktiven Transportprozess der Zelle darstellt, wird Material auf der Zelloberfläche mit Zellmembran ummantelt und als Vesikel (Endosom) internalisiert. Durch Verschmelzung mit so genannten Lysosomen, die ein komplexes Gemisch von Enzymen beinhalten, werden die in den Endosomen enthaltenen Stoffe abgebaut. Da zu diesem Abbau ein niedriger pH-Wert nötig ist, besitzen Endosomen Protonenpumpen, die solange Protonen in die Endosomen pumpen, bis ein entsprechender pH-Wert erreicht wird. Um Ladungsneutralität zu wahren, strömen im gleichen Ausmaß Chloridionen in die Endosomen.
  • Viele moderne kationische Lipide oder Polymere besitzen aus diesem Grund Puffereigenschaften. Auf diese Weise wird der niedrige pH-Wert nicht erreicht und es kommt zu einem Eintrag an Ionen in die Endosomen, der die Endosomen durch den entstehenden osmotischen Druck zum Platzen bringt. Auf diese Weise gelangen diese Lipo/Polyplexe in das Cytosol. Da auch eine Reihe transfektionsaktiver Lipide und Polymere ohne Puffereigenschaften bekannt sind, muss ein weiterer Mechanismus existieren, der die Lipo/Polyplexe in das Cytosol gelangen lässt. Man vermutet zumindest im Falle der Lipide eine Fusion der beteiligten Membranen und damit einhergehend eine Destabilisierung. Ob dabei vorwiegend der Lipoplex oder die enthaltende DNA/RNA als solches in das Cytosol gelangt ist unklar. Es wird jedoch vermutet, dass die DNA im Cytosol aus dem Lipoplex freigesetzt wird, da Versuche scheiterten, durch Mikroinjektion von Lipoplexen direkt in den Zellkern eine Proteinexpression zu erreichen. Es scheint, als ob die in den Lipoplexen gebundene DNA dem Transkriptionsapparat nicht zugänglich ist.
  • Handelt es sich um gegen mRNA gerichtete Antisense Moleküle oder siRNA, ist der biologische Wirkort erreicht und die Dauer der Wirkung hängt im wesentlichen von der Konzentration cytosolischer RNasen und der Rate der Freisetzung aus den Lipo/Polyplexen ab. DNA kann als solche nicht in den Zellkern eindringen, was als „Nuclear Barrier” bezeichnet wird. Sie gelangt allerdings während der Zellteilung an ihren Wirkort und führt so zur Expression von Proteinen. Als weitere nicht-virale Methoden, die auf chemischen Methoden basieren, seien Systeme genannt, die ein DNA-bindenden Molekülteil sowie einen Liganden tragen, der rezeptorvermittelte Endozytose auszulösen vermag (Beispiel Transferrinfektion).
  • Das bedeutendste Beispiel einer nicht-viralen Methode, die auf einem physikalischen Verfahren beruht, stellt die Elektroporation dar. Dabei werden die zu transfizierenden Zellen zwischen zwei Elektroden verbracht, an die ein typischer Spannungsverlauf angelegt wird. Auf diese Weise werden die Zellen einem intensiven elektrischen Stromstoß (Puls) ausgesetzt, der zur einer reversiblen öffnung (Poren) der Zellmembran führt. Durch diese Poren können Substanzen, wie z. B. genetisches Material, die sich in unmittelbarer Umgebung der Poren befinden in die Zelle eindringen. Der Puls (also Spannungsverlauf) als einer der wichtigsten Erfolgsparameter muss für jeden Zelltyp optimiert werden. Es gibt inzwischen einige kommerzielle Anbieter für Elektroporatoren (z. B. Eppendorf/Multiporator, US 6008038 , Biorad/Genpulser, US 4750100 , Genetronics Inc., US 5869326 , BTX/ECM Serie), die speziell für eukariotische Zellen entwickelt wurden und eine Anpassung der Pulsparameter an den jeweiligen Zelltyp erlauben. Tatsächlich gibt es inzwischen auch Vorrichtungen die eine in vivo Applikation möglich machen. Bei der in vitro Anwendung werden die Zellen in einem Elektroporationspuffer suspendiert, zusammen mit der zu transfizierenden DNA/RNA in eine mit Elektroden versehene Elektroporationsküvette verbracht und einem oder mehreren Pulsen ausgesetzt. Neben dem Spannungsverlauf sind weitere wichtige Parameter die Beschaffenheit des Puffers, die Temperatur, die Zellkonzentration und die DNA-Konzentration. Nach dem die Zellen dem Puls ausgesetzt wurden, lässt man ihnen eine kurze Zeit zur Regeneration der Zellmembran. Anschließend werden die Zellen in ein Kulturgefäß ausgesäht und wie üblich kultiviert.
  • Als weitere physikalische Methoden seien Mikroinjektion, Hydrodynamische Methoden, ballistische Methoden (Genegun) oder Methoden, die Ultraschall benutzen genannt oder auch die Injektion nackter DNA in verschiedene Organe, die zu geringer Expression der entsprechenden Gene führt.
  • Zu den Verfahren die physikalische Methoden als auch chemische Methoden vereinen, zählt insbesondere auch die Magnetofektion, die DNA-bindende Moleküle auf magnetischen Nanoteilchen nutzt um über eine magnetischen Feldgradienten DNA auch der Oberfläche von Zellen anzureichern und Endozytose auszulösen
  • Den enormen Möglichkeiten, die das Einbringen von genetischem Material in eukariotische Zellen mit sich bringt, steht ein Arsenal von Methoden gegenüber, die nur unbefriedigende Leistungsfähigkeit aufweisen. Die jeweils spezifisch auftretenden Mängel bis dato vorhandener Methoden betreffen im Wesentlichen die wichtigen Parameter Effizienz, Toxizität, Immunogenität, Targeting, Restriktion bzgl. der Größe des genetischen Materials, Möglichkeiten der in vivo/in vitro Anwendung, Möglichkeit von High-Throughput-Anwendungen, Gefahrenpotential, Einfachheit der Methode und Kosten der Methode. Kein Verfahren ist in der Lage, alle diese Parameter ausreichend zu erfüllen. Dem Fehlen eines geeigneten Gen-Carriersystems wird zugeschrieben, dass sich bis heute trotz erheblicher Forschungsaufwendungen keine auf Gentherapie beruhende medizinische Therapie etablieren konnte.
  • Insbesondere kann das angeborene Immunsystem von Eukaryoten eine erhebliche Barriere für nicht-virale Genliefersysteme darstellen. Der Grund dafür ist, dass das angeborene Immunsystem von Eukaryoten in der Lage ist, über Toll Like Rezeptoren fremdes genetisches Material zu erkennen und Signaltransduktionskaskaden anzustoßen, die einen antiviralen Zustand von Zellpopulationen auslösen. Ein derartiger antiviraler Zustand einer Zelle stellt auch eine Barriere für die Transfektion mit einem nicht-viralen Genliefersystem dar, die kaum bzw. nicht überwunden werden kann.
  • So zeigten beispielsweise repetitive Lipofektionsversuche, bei denen zunächst eine Transfektion mit einer spezifisch gegen ein bestimmtes Protein gerichteten siRNA durchgeführt wurde und anschließend eine Plasmidtransfektion mit einem Reportergen folgte, dass der Transfektionserfolg der Plasmidtransfektion ausblieb, obwohl die Zellen einen gesunden Eindruck machten. Nur bei sehr geringen siRNA Mengen konnte eine geringe Menge des Reporterproteins detektiert werden.
  • Um auszuschließen, dass es sich um einen OFF-Target-Effekt der spezifischen siRNA handelt, wurde der Versuch mit einer unspezifischen siRNA wiederholt, die gegen das humane Erbgut „geblastet” wurde. Das Ergebnis blieb jedoch dasselbe.
  • Da bekannt ist, dass auch die Proliferation der Zellen einen Einfluss bei der Lipofektion hat, wurde untersucht, ob die Zellen in Ihrem Proliferationsverhalten durch die Vortransfektion mit siRNA beeinträchtigt wurden. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Proliferationsraten bei höheren siRNA Mengen sinken, jedoch eine ausreichende Proliferation bei den Experimenten gegeben, war, als die der Vortransfektion folgende Plasmidtransfektion fehlschlug. Es schien, als ob die Zellen sich überraschenderweise gegen die zweite Transfektion wehren können.
  • Mit repetitiven Transfektionsversuchen, bei denen zwei Plasmidtransfektionen hintereinander geschaltet wurden, konnte ein ähnliches Ergebnis erhalten werden, wenn auch nicht mit der oben genannten Deutlichkeit. Der zweite Transfektionschritt war häufig entweder sehr ineffizient oder kontraproduktiv. Auch hier wurden ähnliche Untersuchungen, wie oben genannt, durchgeführt, um sicherzustellen, dass es sich nicht um toxische Effekte handelt. Weitere Untersuchungen zeigten, dass es zur Aussschüttung von Interferonen kam.
  • Transfektion von siRNA zum Auslösen von RNA-Interferenz Durch das Einbringen von dsRNA in Zellen können Gene gezielt ausgeschaltet werden, wenn die mRNA eine Sequenzhomologie zu der eingeführten dsRNA aufweist.
  • Der Prozeß wird als RNA-Interferenz bezeichnet (Fire et al., Nature, 1998, 391, 806–811) und läuft meist folgendermaßen ab. Eine in die Zelle eingeschleuste dsRNA mit homologer Sequenz einer zelleigenen mRNA wird durch das Enzym Dicer in viele kleine dsRNA-Fragmente von 21-25 Nukleotiden zerschnitten (Bernstein et al., Nature, 2001, 409, 363–366).
  • Dicer ist eine ATP-abhängige Ribonuclease. Die entstehenden Nukleotidfragmente besitzen am 3'-Ende 2-3 Nukleotide, welche überstehen. Die kleinen RNA-Stücke werden „small interfering RNA” (siRNA) genannt (Elbashir et al., Nature, 2001, 411, 494–498).
  • Die doppelsträngigen siRNAs werden unter ATP-Verbrauch vermutlich mit Hilfe einer Helicase (Dalmay et al., EMBO, 2001, J20, 2069–2078) entwunden. Danach wird ein Einzelstrang in den Proteinkomplex RISC (RNA induced silencing complex) überführt (Kuhlmann et al., Biol. unserer Zeit, 2004, 3, 142–150). Der am RISC verbleibende Strang kann mit einer komplementären RNA (target RNA) hybridisieren. Anschließend wird die target-RNA von einer integralen Endoribonuklease zerschnitten. Da Gene nur über den Umweg von einsträngiger mRNA wirken können, wird dieses Gen dadurch faktisch ausgeschaltet. Es wird zwar noch transkribiert, aber die RNA-Interferenz (RNAi) baut diese mRNA genau so schnell wieder ab. Aus diesem Grund wird die RNA-Interferenz auch als „Posttranscriptional Gene Silencing” (PTGS) bezeichnet.
  • Die RNA-Interferenz findet man bei Protozoen, Pilzen, Pflanzen und Tieren wenn sich auch die einzelnen Mechnismen leicht unterscheiden. Archaebakterien und Prokaryonten verfügen nicht über diese Fähigkeit.
  • Die Frage nach der Funktion ist noch nicht genau geklärt. Man vermutet, dass es zur Abwehr von RNA-Viren dient. Mit Viren infizierte Pflanzen können sich beispielsweise erholen und bei neu entwickelten Blättern schwächen sich die Symptome ab. Symptomfreie Blätter können nicht mehr mit artverwandten Viren infiziert werden. Von den eingedrungenen Viren bzw. von derer RNA werden komplementäre Kopien erstellt, die als Matrize für die Synthese der ursprünglichen RNA dienen. Es bildet sich virusspezifische dsRNA, welche den PTGS Mechanismus auslöst. Da am Anfang die Konzentration an dsRNA zu gering ist, kann sich die Pflanze erst allmählich erholen und die Herrschaft über die Viren erlangen. Es wird vermutet, dass eine zelleigene RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP) das einsträngige Viren-Genom erkennt, in dsRNA umwandelt und dann den RNAi-Vorgang startet. Die These des PTGS zur Abwehr der Viren wurde unterstützt durch den Fund von Inhibitoren gegen das PTGS in Viren. Wie genau diese wirken und ob Pflanzen wiederum Mechanismen gegen diese Inhibitoren entwickelt haben, ist noch nicht bekannt.
  • Die RNA-Interferenz hat in den letzten Jahren eine immense Bedeutung erlangt, da sie die Möglichkeit bietet unerwünschte Gene bzw. Proteine auszuschalten und damit Virus- und andere Krankheiten zu bekämpfen. Desweiteren ist sie auch in der Forschung zur Aufdeckung von Gen-Funktionsbeziehungen zu einem unverzichtbaren Hilfmittel geworden.
  • Die am häufigsten verwendete Variante RNA-Interferenz zu nutzen, besteht in der Transfektion von synthetisch hergestellten siRNA-Molekülen, also doppelsträngiger RNA mit einem 3'-Überhang von 2-3 Nukleotiden. In Säugerzellen bewirkt eine eingeschleuste dsRNA mit mehr als 30bp eine enzymatische Zerstörung aller mRNAs und den Stopp der Proteinsynthese (Kaufmann, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1999, 96, 11693–11695). Nach der Injektion von längerer dsRNA können einige höhere Eukaryonten mit der Produktion von Interferonen reagieren, welches die Expression viraler Gene hemmen und die Zelle in Apoptose lenken können.
  • Will man dies verhindern, so muss für Säugerzellen die Länge der siRNA unter 30 bp liegen (Tuschl et al., Genes Dev., 2001, 15, 188–200).
  • Als Transfektionsmethoden stehen die aus der DNA-Transfektion bekannten Methoden zur Verfügung. Der Unterschied zur DNA Transfektion besteht lediglich im Wirkort des eingeschleusten genetischen Materials. Bei der DNA Transfektion ist dies der Kern. Bei der siRNA Transfektion ist es das Cytosol. Die am häufigsten verwendeten Methoden sind die Elektroporation, die Transfektion durch kationische Polymere und insbesonders die Transfektion durch kationische Lipide. Dabei sind nicht unbedingt die besten Reagentien bei der Plasmidtransfektion auch die besten Reagentien bei der siRNA Transfektion und umgekehrt. Daher werden spezielle für die siRNA Transfektion geeignete Reagentien kommerziell angeboten. Beispiele sind Interferrin (Polyplus), X-treme Gene siRNA (Roche), siPort (Ambion), Silentfect (Biorad), Dharmafect (Dharmacon) und Lipofectamin RNAiMax (Invitrogen).
  • Als Maß für den Transfektionserfolg wird bei der siRNA-Transfektion der relative Knock-down eines Proteins bzw. eines Gens im Vergleich zu einer unbehandelten Probe oder einer mit unspezifischer siRNA (siRNA ohne Target) transfizierten Probe verstanden. Ein Problem bei der siRNA-Transfektion stellen sogenannte OFF-Target-Effekte dar. Darunter versteht man beispielsweise die unbeachsichtigte Beeinträchtigung der Expression eines Gens, das nicht Ziel des Knockdowns ist. Dazu kann es z. B. bei Sequenzähnlichkeiten kommen.
  • Um diese OFF-Target-Effekte möglichst gering zu halten und aus Gründen der Toxizität, besteht eine Anforderung an potentielle siRNA-Transfektionsysteme darin, einen möglichst hohen Knockdown bei einer möglichst geringen Menge eingesetzter siRNA zu erreichen. Eine weitere bevorzugte Anforderung insbesondere für in vivo Anwendungen besteht darin, das Expressionsprofil der Zellen, abgesehen von der Expression des Targetproteins, so wenig wie möglich zu ändern.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das eine effizientere Transfektion ermöglicht. Dies gilt sowohl für eine einfache Transfektion als auch für eine wiederholte, d. h. mindestens zwei- oder mehrmalige Transfektion. Weiter stellt sich die Aufgabe den physiologischen Status der Zellpopulation so wenig wie möglich zu beeinflussen, d. h. das Protein-Expressionsprofil der Zellpopulation sollte sich idealerweise nur bezumglich der Proteine ändern, deren Gene in die Zelle eingeschleust wurden oder deren Expression durch das eingeschleuste genetische Material herabgesetzt oder blockiert werden.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Verbesserung des Transfektionsergebnisses von nicht-viralen Genliefersystemen, dadurch gekennzeichnet, dass man
    • a) die Zellen vor und/oder bei der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt und bei der Transfektion genetisches Material, insbesondere modifizierte und/oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsRNA und/oder modifizierte und/oder unmodifizierte siRNA, in die Zellen einbringt; oder
    • b) die Zellen vor und/oder bei und/oder nach der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt und bei der Transfektion modifizierte und/oder unmodifizierte siRNA in die Zellen einbringt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung des Transfektionsergebnisses kann in vitro und/oder in vivo durchgeführt werden.
  • Durch die zumindest teilweise Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr, d. h. eine der intra- und/oder interzellulären Signaltransduktionskaskaden der angeborenen Immunabwehr wird unterbrochen, lässt sich das Transfektionsergebnis verbessern und/oder unerwünschte änderungen des Expressionsprofils einer transfizierten Zelle vermeiden.
  • Das heißt, dass insbesondere die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade ausgehend von den TLRs, über die Adaptermoleküle, über die entsprechenden Kinasen, welche wiederum über die Aktivierung von Transkriptionfaktoren Zytokine, insbesondere die Interferone induzieren und Membrantransportvorgänge herunterregulieren, unterbrochen oder geschwächt werden kann. Weiter kann die Signalübertragung durch Botenstoffe zwischen den Zellen unterbrochen werden. Da es sich dabei allesamt um Proteine handelt, werden erfindungsgemäß vorzugsweise aktivitätssteigernde oder aktivitätsmindernde Effektoren wie Antikörper, Aptamere, Antagonisten oder Inhibitoren gegen diese Proteine eingesetzt. Dabei können die entsprechenden Wirkstoffe als solches oder mit entsprechenden Hilfsmolekülen an oder in die Zellen verbracht werden, je nach Zellgängigkeit oder Zielort. So können z. B. Wirkstoffe über liposomale Carrier in die Endosomen verbracht werden. Ist der Zielort das Zytosol, bieten sich insbesondere Elektroporation oder spezielle Peptidsequenzen an, die in der Lage sind, die Zellwände zu permeabilisieren. Handelt es sich bei den Wirkstoffen um Peptide oder Proteine, so können diese erfindungsgemäß auch durch Transfektion geeigneten genetischen Materials intrazellulär gebildet werden und falls nötig mit Lokalisationssequenzen zu den entsprechenden Zellkompartimenten dirigiert werden. Will man über siRNA Gene stilllegen, die für entscheidende Proteine des Signatransduktionapparates kodieren, stehen erfindungsgemäß die bekannten Transfektionssysteme zur Verfügung. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Verwendung kann sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden bzw. erfolgen.
  • Es kann dazu angewendet werden die Ausbildung des „antiviralen Status” von Zellen während der Transfektion zu verhindern oder auch schon vorher. Da die Zellen bei der Kultivierung auch mit biologischem Material z. B. Serum oder Trypsin in Verbindung kommen können, das Stoffe beinhalten kann, auf die ein oder mehrere TLR ansprechen (z. B. DNA, RNA, LPS etc.), kann es dazu kommen, dass sich Zellen schon in einem antiviralen Status befinden, bevor mit der Transfektion begonnen wurde.
  • Unter Beachtung dieses Hintergrundes wird auch verständlich, warum es als schwierig gilt, Transfektionsergebnisse zu repoduzieren. Die Qualität von Transfektionsergebnissen hängt stark vom immunologischen Ausgangszustand der Zellen ab, der wiederum von der Vorbehandlung (z. B. Subkultivierung) abhängt.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Zellen bis zu 4 Tage, vorzugsweise bis zu 18 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden vor der Transfektion mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das nicht-virale Genliefersystem ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfassen; und/oder eine Verbindung umfassen, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion, Magnetofektion, Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruhen.
  • Ferner kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Transfektion mindestens zweimal, d. h. zwei- oder mehrfach (3, 4, 5, 6, etc.), ausgeführt werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonisten, Inhibitor und/oder eine siRNA, der/die die Weiterleitung eines intra- und/oder interzellulären Signals der angeborenen Immunabwehr blockiert(en), zumindest teilweise unterdrückt werden. Entsprechende Antikörper, Intrabodies, Aptamere, Antagonisten und Inhibitoren sind kommerziell erhältlich.
  • Weiterhin kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Knock-down mit siRNA zumindest ein Gen ausgeschaltet werden, das für ein zur Signaltransduktion notwendiges Protein codiert. Entsprechende siRNA oder Plasmide, die shRNA (short hairpin RNA) z. B. gerichtet gegen TLRs, Kinasen und Transkriptionsfaktoren sind teilweise kommerziell erhältlich (Imgenex/Invivogen).
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die angeborene Immunabwehr auch durch die Aktivierung des Glucocorticoidrezeptors unmittelbar durch ein Glucocorticoid oder einen Glucocorticoidrezeptor-Antagonisten oder mittelbar durch einen Glucocorticoidvorläufer oder Glucocorticoidrezeptor-Antagonistenvorläufer zumindest teilweise unterdrückt werden.
  • Dabei kann es sich bei dem Glucocorticoid, Glucocorticoidvorläufer, Glucocorticoidrezeptor-Antagonisten oder Glucocorticoidrezeptor-Antagonistenvorläufer insbesondere um Cortison, Cortisol, Cloprednol, Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon, Deflazacort, Flourcortolon, Triamcinolon, Dexamethason oder Betamethason handeln.
  • für die Unterdrückung der angeborenen Immunabwehr ist der Glucocorticoid-Rezeptor und seine Agonisten, die Glucocorticoidsteroide (Glucocorticoide) von besonderer Bedeutung. Diese Glucocorticoide sind sehr leistungsfähige Immunsupressoren und sind in der Lage auf sehr vielen Stufen in die Signaltransduktionskaskaden einzugreifen. Das bekannteste Glucocorticoid ist das Cortisol. Häufig wird auch Cortison eingesetzt, das durch physiologische Prozesse zu Cortison umgewandelt werden kann. Weitere bekannte zum z. T. synthetische (also nicht natürliche) Glucocorticoide bzw. dessen Vorläufersubstanzen sind beispielsweise Cloprednol, Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon, Deflazacort, Flourcortolon, Triamcinolon, Dexamethason oder Betamethason. Allen diesen Glucocorticoiden ist gemeinsam, dass sie durch Bindung an den intrazellulären Glucocorticoidrezeptor, diesen aktivieren.
  • Dieser Rezeptor liegt im Cytosol in einem oligomeren Komplex gebunden an das Hitzeschockprotein HSP90 vor. Durch die Aktivierung wird der Rezeptor aus dem Komplex freigelegt. Dabei wird auch ein „nuclear localisation signal” freigelegt, was eine Translokation der dimeren Form des Rezeptors in den Zellkern zur Folge hat. Dort bindet der dimere Rezeptor an spezifische palindromische Nukleotidsequenzen, sogenannte GRE (Glucocorticoid Response Elements) oder nGRE (negative GRE). In Abhängigkeit dieser Sequenzen findet die Aktivierung und Repression nachfolgender Gene statt. In der Regel werden Zytikone hochreguliert, die immunsupressiv wirken und andere herunterreguliert, die das angeborene Immunsystem ankurbeln.
  • Der Glucocorticoidrezeptor wirkt jedoch nicht nur selbst als Transkriptionsfaktor sondern interagiert auch mit einer großen Vielzahl von Molekülen, die die Transkription regulieren, wie z. B. HAT, CBP, TBP, RNA Pol II usw. (Histone Acetyltransferase, CREB Binding Protein, TATA Box-binding Protein, RNA Polymerase-II) oder die Bestandteile der Signaltransduktionskaskaden des angeborenen Immunsystems sind, wie z. B. NF-kB und AP-1. Insbesonders werden auch die MAPK Subgruppen JNK, ERK1, ERK2 und p38 allesamt negativ reguliert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei Cortison und/oder Cortisol als Glucocorticoid in einer Konzentration von 0,01–10 μg/ml zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 0,01–1 μg/ml und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 0,01–0,1 μg/ml.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr mindestens einer aus der Gruppe TLR 1, TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7, TLR 8, TLR 9, TLR 10, TLR 11, TLR 12, TLR 13, CD14, CD38, RIG-I Helikase und/oder RIG-I-like Helikase blockiert werden. Insbesondere ist es bevorzugt, TLR 1, TLR 2, TLR 4 und/oder TLR 9 zu blockieren. Weiterhin ist es bevorzugt, mehrere der vorstehend genannten Rezeptoren bzw. Proteine zu blockieren.
  • So sind Antikörper gegen die Toll Like Rezeptoren TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 und CD14 bekannt und kommerziell erhältlich. Diese könnten zusammen mit Endozytose auslösenden Lipo- oder Polyplexen als solche oder verpackt in Liposomen in die Endosomen geschleust werden und so die Rezeptoren blockieren. in der Regel reicht aber auch eine Zugabe zum extrazellulären Raum. Die Wahl des zu blockierenden Rezeptors hängt erfindungsgemäß natürlich auch von der Art des zu transfizierenden genetischen Materials ab.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Antikörperkonzentration von 0,01–100 μg/ml durch Zugabe zum Kulturmedium zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 0,01–10 μg/ml und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 0,01–5 μg/ml.
  • Der Antikörper kann aber auch in den Lipoplex integriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Menge von 0,01–10 μg/μg genetischem Material zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Menge 0,01–1 μg/μg und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 0,01–0,3 μg/μg genetischem Material.
  • Aber auch Inhibitoren bzw. Antagonisten für verschiedene TLRs sind bekannt und werden erfindungsgemäß in bevorzugter Weise eingesetzt. So hat man festgestellt, dass bestimmte DNA Sequenzen viralen Ursprungs den TLR9 Rezeptor blockieren können (Krieg A. M. et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1998; 95(21); 12631–6); die entsprechende Offenbarung wird unter Bezugnahme aufgenommen. Diese DNA Sequenz enthält das Motiv TTAGGG in der Regel in wiederholter Form. Entsprechende Antisensemoleküle als nukleaseresistente Phosphorthioate sind ebenfalls kommerziell erhältlich bei der Firma InvivoGen (San Diego, USA). Dieselbe Firma bietet auch Plasmide an, die gegen TLRs und TLR-bezogene Gene shRNA codiert oder verschiedene Inhibitoren für Kinasen wie 2-AminoPurin (PKR/dsRNA activated Protein Kinase Inhibitor), LY294002 (Phosphatidylinositol 3-Kinase Inhibitor), PD098059 (MAPKK Inhibitor), U0126 (MEK1 und MEK2 Inhibitor) sowie SB203580 (p38 MAP Kinase/p30RK MAP Kinase/PDK1/PDK2 Inhibitor). Weitere Kinase Inhibitoren für MAP, MAPK und MAPKK Kinasen sind literaturbekannt und/oder teilweise auch kommerziell erhältlich (z. B. CNI-1493, CEP-1347, SB 202190 (p38 MAP Kinaseinhibitor), SB220025 (p38 MAP Kinaseinhibitor), SB 239063 (p38 MAP Kinaseinhibitor), SP600125 (c-Jun N-terminale Kinaseinhibitor, 3-(2-Aminoethyl)-5-((4-ethoxyphenyl)methylene)-2,4-thiazolidinedione hydrochlorid (ERK Inhibitor)).
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann TLR 9 mit mindestens einer modifizierten oder unmodifizierten DNA Sequenz, insbesondere mit der Basensequenz TTAGGG blockiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei bezogen auf ein 20 Nukleotide enthaltendes ODN eine Menge von 0,1–10 μg/ml zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Menge 0,1–5 μg/ml und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 0,1–2 μg/ml.
  • Weiterhin kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zumindest eines der Adaptermoleküle MyD88, TRIF, TIRAP, TRAM, TRAF6 oder TRAF3 blockiert werden.
  • Inhibitoren, die wichtige Adaptermoleküle wie MyD88, TIRAP, TRAM, TRAF6, TRAF3 und/oder TRIF attackieren, sind bekannt und zum Teil auch kommerziell erhältlich und werden erfindungsgemäß in bevorzugter Weise eingesetzt. So bietet die Firma IMGENEX (San Diego, USA) beispielsweise ein Peptid an, das die zur Wirkung von MyD88 notwendige Homodimerisierung unterbindet. Das dafür bevorzugte Peptidmotiv ist RDVLPGT (Loiarro M. et al.; J. Biol. Chem.; 2005; 16; 15809–14). Das kommerziell angebotene Peptid enthält weiterhin eine PTD Sequenz (protein transduction sequence), welche das gesamte Peptid zellpermeabel macht (Derossi D. at al. J. Biol. Chem. 1994, 269; 10444–10459). ähnliche Produkte bietet die Firma Imgenex gegen die Adaptermoleküle TIRAP, TRAF6, den Transkriptionsfaktor NF-kB und die Kinasen IKKgamma und ERK an, die ebenfalls erfindungsgemäß in bevorzugter Weise eingesetzt werden. Dieselbe Firma bietet im Übrigen auch gegen MyD88 gerichtete Antikörper an, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können.
  • Erfindungsgemäß kann das Adaptermolekül Myd88 durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT oder Teilen desselben blockiert werden. Als Teil desselben wird hierbei ein Peptid verstanden, das
    • – mindestens in 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren identisch zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv ist; oder
    • – mindestens zu 80%, insbesondere mindestens zu 90% identisch ist zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv; oder
    • – mindestens in 6, 7, 8 oder 9 von 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren identisch ist zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Konzentration von 1–1000 μM zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 50–400 μM und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 100–200 μM.
  • Erfindungsgemäß kann das Adaptermolekül TRAF6 durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv DRQIKIWFQNRRMKWKKRKIPTEDEY oder Teilen desselben blockiert werden. Als Teil desselben wird hierbei ein Peptid verstanden, das
    • – mindestens in 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren identisch zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv ist; oder
    • – mindestens zu 80%, insbesondere mindestens zu 90% identisch ist zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv; oder
    • – mindestens in 6, 7, 8 oder 9 von 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren identisch ist zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv. In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Konzentration von 1–1000 μM zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 50–400 μM und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 100–200 μM.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ferner zumindest eine der Kinasen IRF-Kinase TBK1, MAP Kinase, MAPK Kinase, MAPK Kinase, MAPKK Kinase, MAPKKK Kinase, MEK1, MEK2, MEK5, MKK4/SEK, MKK5, MKK6, MKK7, ERK1, ERK2, ERK3, ERK4, ERK5, ERK6, ERK7, ERK8, JAK, JNK1, JNK2, p38 MAP Kinase, RK, p38/RK MAP Kinase, p30/RK MAP Kinase, Phosphatidylinositol 3-Kinase, IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha, IKK-beta, IKKgamma, IKK delta, IKK epsilon, TAK1, PKB Kinase, PKD1, PKD2, MSK1 oder PKR blockiert werden. Bevorzugt wird mindestens eine Kinase ausgewählt aus MAPKKK Kinase, MAPKK Kinase, MAPK Kinase, MAP Kinase, p38 MAP Kinase, MEK1, MEK2, JNK, ERK1 und ERK2 blockiert. Weiterhin ist es bevorzugt, mehrere der vorstehend genannten Kinasen zu blockieren.
  • Erfindungsgemäß kann die Kinase p38 MAPK und/oder PKB durch 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol (SB203580) blockiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Konzentration von 1–500 μM zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 1–100 μM und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 1–30 μM.
  • Weiterhin kann erfindungsgemäß die Kinase MEK1 und/oder MEK2 durch 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-amionophenylmercapto)butadien (U0126) blockiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Konzentration von 1–500 μM zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 1–100 μM und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 1–30 μM.
  • Weiterhin kann erfindungsgemäß die Kinase JNK 1,9-Pyrazoloanthrone (SP600125) blockiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Konzentration von 1–100 μM zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 1–30 μM und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 1–10 μM.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ferner zumindest einer der Transkriptionsfaktoren IRF1, IRF3, IRF7, IRF9, IRF2, IRF4, IRF5, IRF6, IRF8, STAT1, STAT2, NF-kB oder AP-1 blockiert werden.
  • Erfindungsgemäß kann der Transkriptionsfaktor NF-kB durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv DRQIKIWFQNRRMKWKKVQRKRQKLM oder Teilen desselben blockiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Konzentration von 0,1–1000 μM zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 50–400 μM und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 100–200 μM.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch zumindest ein Zytokin, zumindest ein Tumornekrosefaktor (TNF), zumindest ein Interleukin und/oder zumindest ein Interferon blockiert werden, die bei der angeborenen interzellulären Immunabwehr beteiligt sind.
  • Als zu blockierendes Interferon kommt beispielsweise ein Interferon des Typs I, insbesondere zumindest eines der Interferone, ausgewählt aus Interferon–alpha, Interferon-beta, Interferon-gamma oder Interferon-omega in Betracht. Als zu blockierendes Interleukin kommt insbesondere Interleukin-1 in Betracht.
  • Auch kann zumindest ein Rezeptor für Zytokine blockiert werden, insbesondere zumindest ein Rezeptor für Interferone, insbesondere des Typs I, zumindest ein Rezeptor für Interleukine, und/oder zumindest ein Rezeptor für Tumornekrosefaktoren.
  • In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden mehrere der vorstehend erwähnten Rezeptoren und/oder Proteine, die an der Signaltransduktionskaskade zur Auslösung der angeborenen intra- und/oder interzellulären Immunabwehr beteiligt sind, blockiert. So können beispielsweise mehrere Antikörper gegen TLR-Rezeptoren kombiniert werden, um additive Effekte und/oder Synergieeffekte zu nutzen. Ebenso können beispielsweise auch Inhibitoren und/oder Antikörper, und/oder Intrabodys, und/oder Aptamere, und/oder Antagonisten, und oder siRNA gegen TLR-Rezeptoren und/oder TLR assistierende Proteine und/oder Adaptermoleküle und/oder Kinasen und/oder Transkriptionsfaktoren und/oder Zytokine und/oder Zytokinrezeptoren kombiniert werden, um die Signaltransduktionskaskade der angeborenen Immunabwehr zumindest teilweise zu unterbrechen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner dazu benutzt werden, die Transfektionsergebnisse von siRNA Transfektionen mit nicht-viralen Genliefersystemen auf mehrerlei Weise zu verbessern. Dabei kann die siRNA modifiziert oder unmodifiziert sein.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann als Mittel zur Aktivierung der angeborenen Immunabwehr ein Agonist eingesetzt werden.
  • Zum Einen kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu genutzt werden durch eine Anregung des intrazellulären Teils des angeborenen Immunsystems die RNA-Interferenzmaschinerie zu aktivieren. Die Aktivierung gelingt durch die Belegung verschiedener TLR Rezeptoren mit entsprechenden Agonisten, insbesonders aber durch Belegung (und damit Aktivierung) der Rezeptoren TLR7 und TLR8. Die Rezeptoren TLR7 und TLR8 befinden sich in den Endosomen und detektieren ssRNA, wie sie bei einer Infektion eines RNA-Virus zu erwarten ist. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu einem besonders starken „antiviralen Status” zu dem eine aktive RNA-Interferenzmaschinerie zugeordnet werden kann. Die Annahme, dass es sich bei der RNA-Interferenz um einen Mechanismus zur Abwehr von Viren handelt fügt sich zwanglos in das Gesamtbild. Die Verbesserung der Transfektionsergebnisse von siRNA Transfektionen weicht insofern von den Transfektionen mit anderem genetischen Material ab, dass für einen guten Transfektionserfolg eine aktive RNAi-Maschinerie zur Verfügung stehen muss, die Bestandteil des angeborenen Immunsystems ist. Dabei überkompensiert die aktive RNAi-Maschinerie den negativen Einfluss des angeborenen Immunsystems auf die Aufnahme der siRNA.
  • Bevorzugt kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Agonisten für einen TL-Rezeptor, insbesondere durch mindestens einen Agonisten für TLR7 und/oder TLR8, zumindest teilweise aktiviert werden.
  • Erfindungsgemäß kann der mindestens eine Agonist für TLR7 und/oder TLR8 ausgewählt werden aus der Gruppe, umfassend Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone), Imidazochinoline, Thiazolochinoline, Guanosinanaloga und ssRNA.
  • Bevorzugt kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der mindestens eine Agonist Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine), Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1 H-imidazo[4,5-c]quinoline-1-ethanol) oder Gardiquimod (1-(4-amino-2-ethylamino methylimidazo-[4,5-c]quinolin-1-yl)-2-methylpropan-2-ol); oder CL075 oder CL097; oder Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin) oder Isatoribine (7-Thia-8-oxoguanosin); oder ssRNA mit U und/oder GU reichen Sequenzen, insbesondere ssRNA mit den Sequenzmotiven UGUGU und/oder GUCCUUCAA, sein.
  • Imiquimod kann in einer Konzentration von 0,1–100 μg/ml, bevorzugt in einer Konzentration von 0,1–20 μg/ml, und am meisten bevorzugt in einer Konzentration von 0,1–10 μg/ml. Die Zugabe findet bevorzugt zur gleichen Zeit wie die Transfektion und/oder später statt.
  • Vorzugsweise hat dis ssRNA eine Länge von mindestens 15 Basen. Ferner kann die ssRNA ein Phosphothioatrückgrat haben. Beispielsweise kann eine ssRNA mit 20 Nukleotiden Länge in einer Konzentration von 0,1–100 μg/ml, bevorzugt 0,1–20 μg/ml, und am meisten bevorzugt 0,1–10 μg/ml eingesetzt werden. Die Zugabe der ssRNA findet bevorzugt zur gleichen Zeit wie die Transfektion und/oder nach der Transfektion statt.
  • Weiters kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Agonisten für Rezeptoren von antiviralen Zytokinen, insbesondere durch Interferon-beta oder Interferon gamma, zumindest teilweise aktiviert werden.
  • Die zellgängigen Agonisten können vor, während oder nach dem eigentlichen siRNA-Transfektionsschritt direkt zum Medium der Zellen gegeben werden. Die ssRNA und deren Analoga müssen dabei mit geeigneten Transfektionsreagentien komplexiert werden, da sie von Haus aus nicht zellgängig sind und damit die in den Endosomen liegenden TLRs nicht erreichen. Es ist auch möglich die Agonisten in Lipo- oder Polyplexe mitsamt der siRNA miteinzubauen oder durch Derivatisierung mit Alkyketten die Agonisten in die Lipidmembranen der Liposomen bzw. Lipoplexe miteinzubauen, die aus den eigentlichen transfektionsaktiven kationischen Lipiden und möglicher Colipide wie z. B. DOPE bestehen.
  • Zum Zweiten kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu genutzt werden durch eine Anregung des interzellulären Teils des angeborenen Immunsystems die RNA-Interferenzmaschinerie zu aktivieren. Die Aktivierung gelingt über die Belegung von Rezeptoren von antiviralen Zytokinen mit geeigneten Agonisten. In einer bevorzugten Ausführung kommt dabei Interferon beta und/oder Interferon gamma in einer Konzentration von 1–10000 U/ml zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 1–5000 und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 1–2000 U/ml. Die Zugabe findet bevorzugt zur gleichen Zeit wie die Transfektion und/oder später statt.
  • Zum Anderen kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu genutzt werden, Teile des adaptiven Immunsystems zu stimulieren, die für die Aktivierung der siRNA-Maschinerie geeignet sind und gleichzeitig andere Teile zu blockieren, die z. B. durch eine Herunterregelung der Endozytose Enfluss auf die Menge der eingetragenen siRNA haben. Dabei können Synergieffekte genutzt werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Zellen bis zu 4 Tage, vorzugsweise bis zu 18 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden vor der Transfektion mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
  • Ferner können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen bis zu 2 Tage, vorzugsweise bis zu 12 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden nach der Transfektion mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiters dazu genutzt werden eine unerwünschte Reaktion des angeborenen Immunsystems zu verhindern und damit eine veränderte Genexpression der Zelle. Dies ist insbesondere bei in vivo Anwendungen und bei der Aufklärung von Proteinfunktionen durch siRNA Transfektionen in komplexen Signal-Pathways von besonderer Bedeutung. Häufig sind verschiedene Signaltransduktionswege der Zelle auch mit den Signaltransduktionswegen des angeborenen Immunsystems gekoppelt. Bei einem Knockdown eines Proteins, der gleichzeitig den physiologischen Status der Zelle massiv beeinflusst, ist die Zuordung der Funktion zum Protein erschwert. Um dies zu vermeiden kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu genutzt werden, die Antwort des angeborenen Immunsystems teilweise oder vollständig zu blockieren.
  • Erfindungsgemäß wird ferner eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst:
    • a) ein nicht-virales Genliefersystem,
    • b) genetisches Material, und
    • c) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr.
  • Auch wird erfindungsgemäß ein Kit of Parts vorgesehen, der zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst:
    • a) ein nicht-virales Genliefersystem,
    • b) genetisches Material, und
    • c) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr.
  • Erfindungsgemäß umfasst das nicht-virale Genliefersystem insbesondere ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, ein kationisches Protein und/oder eine Verbindung, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann.
  • Erfindungsgemäß kann als genetisches Material beispielsweise genetisches Material zur Reparatur eines Gendefekts, z. B. genetisches Material, insbesondere modifizierte oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNA und/oder modifizierte oder unmodifizierte siRNA eingesetzt werden.
  • Erfindungsgemäß kann als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr zumindest ein aktivitätsmindernder oder aktivitätssteigernder Effektor eingesetzt werden.
  • Weiterhin kann erfindungsgemäß als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr ein Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonist, Inhibitor und/oder eine siRNA eingesetzt werden.
  • Bevorzugt kann der/die als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr verwendete Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonisten, Agonisten, Inhibitor und/oder siRNAzumindest eine Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems blockieren.
  • Weiterhin kann erfindungsgemäß als Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr ein Agonist eingesetzt werden.
  • Bevorzugt kann der/die als Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr verwendete Agonist zumindest eine Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems aktivieren.
  • Weiterhin kann das erfindungsgemäße Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr die Basensequenz TTAGGG umfassen.
  • Auch kann das erfindungsgemäße Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr genetisches Material umfassen, das einen Knock-down eines Proteins einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems bewirken kann.
  • Weiterhin kann das erfindungsgemäße Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr genetisches Material umfassen, das zur Expression eines Proteins führen kann, welches die Aktivität eines Proteins in einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems blockieren kann.
  • Ferner kann das erfindungsgemäße Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr zumindest ein Peptid:
    • (i) DRQIKIWFQNRRMKWKKVQRKRQKLM;
    • (ii) DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT; oder
    • (iii) DRQIKIWFQNRRMKWKKRKIPTEDEY; oder
    • (iv) eine Kombination aus mindestens zwei der Peptide (i) bis (iii); oder
    • (v) ein Peptid, das mindestens in 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren identisch zu (i), (ii) oder (iii) ist; oder
    • (vi) ein Peptid, das mindestens zu 80%, insbesondere mindestens zu 90% identisch ist zu (i), (ii), oder (iii); oder
    • (vii) ein Peptid, das in mindestens 6, 7, 8 oder 9 von 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren identisch ist zu (i), (ii) oder (iii) umfassen.
  • Auch kann das erfindungsgemäße Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr Cortison, Cortisol, Cloprednol, Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon, Deflazacort, Flourcortolon, Triamcinolon, Dexamethason oder Betamethason oder ein anderes Glucocorticoid oder einen anderen Glucocorticoidrezeptoragonist oder einen anderen Glucocoriciodvorläufer oder einen anderen Glucocorticoidrezeptoragonisten-Vorläufer umfassen.
  • Weiterhin kann das erfindungsgemäße Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol (SB203580), 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-amionophenylmercapto)butadien (U0126) oder 1,9-Pyrazoloanthrone (SP600125) umfassen.
  • Als erfindungsgemäßes Mittel zur Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr kann ferner Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine), Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1H-imidazo[4,5-c]quinoline-1-ethanol) oder Gardiquimod (1-(4-amino-2-ethylaminomethylimidazo-[4,5-c]quinolin-1-yl)-2-methylpropan-2-ol), CL075, CL097, Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxoguanosin), Isatoribine (7-Thia-8-oxoguanosin), oder Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone) eingesetzt werden.
  • Ferner kann das Mittel zur Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr eine ssRNA mit U und/oder GU reichen Sequenzen umfassen, vor allem mit den Sequenzmotiven UGUGU und/oder GUCCUUCAA. Bevorzugt kann die ssRNA eine Länge von mindestens 15 Basen haben. Die ssRNA kann auch ein Phosphothioatrückgrat haben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können mehrere der vorstehend genannten Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der Immunabwehr miteinander kombiniert werden, d. h. es können zwei, drei oder mehrere Komponenten in dem erfindungsgemäßen Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr eingesetzt werden. Ebenso ist es möglich mehrere der vorstehend genannten Komponenten a) und/oder b) und/oder c) einzusetzen.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Kit of Parts können:
    • – alle Komponenten getrennt voneinander vorliegen, oder
    • – die Komponenten a) und b) gemeinsam, oder
    • – die Komponenten a) und c) gemeinsam, oder
    • – die Komponenten b) und c) gemeinsam vorliegen.
  • So können die Komponenten entweder getrennt voneinander z. B. in Glas- oder Plastikbehälter vorliegen, die gemeinsam verpackt sind, oder die Komponenten können zu zweit oder zu mehreren in entsprechenden Behältern bereitgestellt werden.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder der erfindungsgemäße Kit of Parts können zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden.
  • Ferner kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung als pharmazeutische Zusammensetzung vorliegen.
  • Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder Kit of parts zur Behandlung einer Krankheit durch Gentherapie verwendet werden.
  • Bei der Krankheit kann es sich beispielsweise um cystische Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie, β-Thalassämie, Krebs, eine Viruserkrankung, eine Degeneration der Macula, Amyotropische Lateral-Sklerose und/oder eine Entzumndungserkrankung handeln.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch dazu genutzt werden Transfektionen durchzuführen, ohne das Expressionprofil der Zellen in einem ungewünschten Ausmaß zu verändern. Von besonderem Interesse ist dies bei in vivo Anwendungen, da hier die Aktivierung des Immunsystems häufig ein Problem darstellt.
  • Besonders auch bei der Untersuchung von Signaltransduktionswegen durch den Knockdown eines beteiligten Proteins durch siRNA ist es unerwünscht, dass übrige Expressionsprofil der Zelle unnötig zu verändern, insbesondere da bekannt ist, dass die Signaltransduktionskaskaden sich gegenseitig häufig beeinflussen.
  • Beispiele
  • Allgemeines Material:
    • 1. Hela Zellen
    • 2. Metafectene Pro, T040-1.0, Biontex Laboratories
    • 3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 92024
    • 4. 48-Well-Platten, Corning Inc., Costar, Produktnummer 3548
    • 5. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-883
    • 6. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-773
    • 7. pCMV-lacZ, Produktnr.: PF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml in WFI
    • 8. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene
    • 9. Hela Luc-Zellen (stabil mit Luciferase transfizierte Zellen)
    • 10. Luciferase Assay Kit, Promega
    • 11. BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, Prod-Nr.: 23227
    • 12. Dimethylsulfoxid (DMSO für die Molekularbiologie), Fluka; No. 41639
    • 13. siRNA, entsalzt, 30 pMol/μl in Universal Buffer (siMAX von MWG) gerichtet gegen Luciferase GL3 (anti-Luciferase-siRNA): Sense Sequence: CUUACGCUGAGUACUUCGAtt Antisense Sequence: UCGAAGUACUCAGCGUAAGtt Non-specific control: Sense Sequence: AGGUAGUGUAAUCGCCUUGtt Antisense Sequence: CAAGGCGAUUACACUACCUtt
  • Beispiel 1
  • Material:
    • 1. Sheep Polyclonal Antibody against human IFNβ, PBL Biomedical Laboratories, Product Number 31400-1, 0,25 mg/ml (estimate), 2 × 104 Units/ml.
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 2,3 × 105 Zellen in ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • Zunächst wird der Antikörper (Sheep Polyclonal Antibody against human IFNβ) aufgetaut. Anschließend wird er mit 400 μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt und sanft gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,05 μg/μl. Anschließend werden die Wells der 24 Well Platte mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
    1 2 3 4 5 6
    A 0 μg (0 μl) 0,25 μg (5 μl) 0,5 μg (10 μl) 1 μg (20 μl) 1,5 μg (30 μl) 3 μg (60 μl)
    B 0 μg (0 μl) 0,25 μg (5 μl) 0,5 μg (10 μl) 1 μg (20 μl) 1,5 μg (30 μl) 3 μg (60 μl)
    C 0 μg (0 μl) 0,25 μg (5 μl) 0,5 μg (10 μl) 1 μg (20 μl) 1,5 μg (30 μl) 3 μg (60 μl)
    D 0 μg (0 μl) 0,25 μg (5 μl) 0,5 μg (10 μl) 1 μg (20 μl) 1,5 μg (30 μl) 3 μg (60 μl)
  • Anschließend wird im Inkubator für 0,5 h inkubiert. Derweilen werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 26 μl DNA (pCMV-lacZ) in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 104 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
  • Am Ende werden jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Am dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Die Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Platten werden so lange entwickelt bis im Mikroplate-Reader eine Gelbfärbung mit einer Absorption von 1-2 gemessen wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader ausgelesen, und der Mittelwert gebildet.
    Ergebnis:
    Inkubationszeit 9,5 min Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4 5 6
    A 0,717 0,689 0,650 0,652 0,635 0,509
    B 0,668 0,672 0,690 0,679 0,714 0,525
    C 0,858 0,823 1,228 1,690 1,852 0,975
    D 1,501 1,805 1,518 1,886 2,017 1,909
  • Die Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    1 2 3 4 5 6
    A&B/2 0,6925 0,6805 0,6700 0,6655 0,6745 0,5170
    C&D/2 1,1810 1,3140 1,3730 1,7880 1,9345 1,4420
  • Figure 00460001
  • Beispiel 2
  • Material:
    • 1. Mouse monoclonal Antibody against Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain 2 (CD118), clone MMHAR-2, Isotype lg2a, C = 0,5 mg/ml in PBS (Phosphat buffered saline) containing 0,1% bovine serum albumin (BSA), PBL Biomedical Laboratories, Product-No: 21385
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • Analog Beispiel 1
  • Abweichungen:
  • Zunächst wird der Antikörper (Mouse monoclonal Antibody against Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain) mit 400 μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt und sanft gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,1 μg/μl. Die Wells der 24 Well Platte werden mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
    1 2 3 4 5 6
    A 0 μg (0 μl) 0,5 μg (5 μl) 1 μg (10 μl) 2 μg (20 μl) 3 μg (30 μl) 6 μg (60 μl)
    B 0 μg (0 μl) 0,5 μg (5 μl) 1 μg (10 μl) 2 μg (20 μl) 3 μg (30 μl) 6 μg (60 μl)
    C 0 μg (0 μl) 0,5 μg (5 μl) 1 μg (10 μl) 2 μg (20 μl) 3 μg (30 μl) 6 μg (60 μl)
    D 0 μg (0 μl) 0,5 μg (5 μl) 1 μg (10 μl) 2 μg (20 μl) 3 μg (30 μl) 6 μg (60 μl)
  • Die Lipoplexzugabe erfolgt nach 5 h Inkubationszeit mit dem Antikörper
    Ergebnis:
    Inkubationszeit: 4 min
  • Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4 5 6
    A 1,269 1,113 1,163 1,185 1,214 1,084
    B 1,132 1,102 1,088 1,229 1,113 1,154
    C 1,127 1,438 1,533 1,378 1,504 1,367
    D 1,395 1,393 1,377 1,417 1,459 1,467
  • Die Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    1 2 3 4 5 6
    A&B/2 1,2005 1,1075 1,1255 1,2070 1,1635 1,1190
    C&D/2 1,2610 1,4155 1,4550 1,3975 1,4815 1,4170
  • Figure 00480001
  • Beispiel 3
  • Material:
  • 1. ODN (Full PTO = Phosphothioatoligo): Seq.: 5'TTT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3'; 0,2 μmol synthesis scale, Purification: HPLC+NAP, lyophilisiert, 213,8 μg; TLR9 Antagonist
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Analog Beispiel 1
  • 2. Tag:
  • Zunächst wird der TLR9 Antagonist (ODN). Anschließend wird es in 956 μl sterilem bidest Wasser gelöst. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,25 μg/μl.
  • Lipoplexherstellung:
  • Lipoplexe folgender Zusammensetzung werden für die Zellen der jeweiligen Wells der 24 Well Platte mit den Zellen hergestellt (DNA = pCMV-LacZ; ODN = TLR9 Antagonist):
    1 2 3 4 5 6
    0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,0 μg (0,0 μl) ODN 2,0 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,1 μg (0,4 μl) ODN 2,4 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,2 μg (0,8 μl) ODN 2,8 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,3 μg (1,2 μl) ODN 3,2 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,4 μg (1,6 μl) ODN 3,6 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,5 μg (2,0 μl) ODN 4,0 μl M. Pro
    0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,0 μg (0,0 μl) ODN 2,0 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,1 μg (0,4 μl) ODN 2,4 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,2 μg (0,8 μl) ODN 2,8 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,3 μg (1,2 μl) ODN 3,2 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,4 μg (1,6 μl) ODN 3,6 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,5 μg (2,0 μl) ODN 4,0 μl M. Pro
    0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,0 μg (0,0 μl) ODN 2,0 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,1 μg (0,4 μl) ODN 2,4 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,2 μg (0,8 μl) ODN 2,8 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,3 μg (1,2 μl) ODN 3,2 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,4 μg (1,6 μl) ODN 3,6 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,5 μg (2,0 μl) ODN 4,0 μl M. Pro
    0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,0 μg (0,0 μl) ODN 2,0 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,1 μg (0,4 μl) ODN 2,4 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,2 μg (0,8 μl) ODN 2,8 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,3 μg (1,2 μl) ODN 3,2 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,4 μg (1,6 μl) ODN 3,6 μl M. Pro 0,5 μg (0,5 μl) DNA 0,5 μg (2,0 μl) ODN 4,0 μl M. Pro
  • Die DNA für jedes Well wird in 100 μl PBS gelöst und die entsprechende Menge ODN zupipettiert und gemischt. Anschließend werden die entsprechenden Mengen Metafectene Pro zupipettiert und nochmals gemischt. Danach wird für 15 min inkubiert und die Lipoplexe auf die Zellen in den korrespondierenden Wells gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Am dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen wiederholt.
  • Des Weiteren werden bei den Zeilen A und B je 500 μl Medium in die Wells hinzugegeben.
  • Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beipiel 1
    Ergebnis:
    Inkubationszeit: 80 min Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4 5 6
    A 0,431 0,400 0,448 0,404 0,419 0,566
    B 0,415 0,453 0,419 0,435 0,696 0,543
    C 0,573 0,966 0,748 1,054 0,820 1,234
    D 0,778 0,898 1,312 1,302 1,195 1,352
  • Die Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    1 2 3 4 5 6
    A&B/2 0,4230 0,4265 0,4335 0,4195 0,5570 0,5545
    C&D/2 0,6575 0,9320 1,0300 1,1780 1,0075 1,2930
  • Figure 00510001
  • Beispiel 4
  • Der TLR 7,8 und 9 detektieren fremde RNA oder DNA in den Endosomen. Auf deren cytosolischer Seite bindet das Adaptermolekül MyD88. Dieses Protein besteht aus zwei Proteinketten, die durch Homodimerierung das biologisch aktive Adaptormolekül bilden. Peptide mit dem Sequenzmotiv RDVLPGT verhindern diese Homodimerisierung, indem sie selbst an die Monomeren binden. Diese Peptide sind allerdings in der Regel nicht zellgängig. Sie können aber mit einer „Protein transduction sequence” (PTO) versehen werden. Eine solche Sequenz ist z. B.
  • DRQIKIWFQNRRMKWKK. Das komplette Peptid ist damit in der Lage in Zellen einzudringen und die Signaltransduktion der TLRs zu unterbindet. Ein solches komplettes Peptid wird von der Firma Imgenex kommerziell angeboten.
  • Material:
    • 1. Imgenex, MyD88 homodimerisation Inhibitory Peptide Set, Product Nr. IMG, 2005-1, 2 mg, lyophilisiert, MW 3100, Sequence: DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesäht. Dabei wird eine Zellzahl von 1,5 × 105 Zellen in ein Well in 200 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • Vorbereiten des Inhibitors:
  • Von dem MyD88-Homodimerisation-Inhibitor Peptid wird, den Angaben des Herstellers folgend, eine 5 mM Lösung in PBS hergestellt.
  • Anschließend werden die Wells mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt, um die entsprechenden Konzentrationen einzustellen:
    1 2 3 4 5 6
    A 0 μl (0 μM) 2 μl (50 μM) 4 μl (100 μM) 8 μl (200 μM) 12 μl (300 μM) 16 μl (400 μM)
  • Anschließend wird für 24 h im CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • Zuerst werden 300 μl komplettes Medium zu jedem Well gegeben.
  • Darauf folgend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl DNA (pCMV-lacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Anschließend werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert. Am Ende werden jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beispiel 1
    Ergebnis: Inkubationszeit: 4 min Mittelwert aller 3 Messungen:
    1 2 3 4 5 6
    A 0,850 1,120 1,268 1,555 1,518 1,442
  • Figure 00530001
  • Beipiel 5
  • Weitere Versuche mit Antikörpern gegen Rezeptoren & Zytokine
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 1,2 × 105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • Der Antikörper wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,05 μg/μl eingestellt.
  • Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
    1 2 3 4
    A 0 μg (0 μl) 0 μg (0 μl) 0 μg (0 μl) 0 μg (0 μl)
    B 0,25 μg (5 μl) 0,25 μg (5 μl) 0,25 μg (5 μl) 0,25 μg (5 μl)
    C 0,5 μg (10 μl) 0,5 μg (10 μl) 0,5 μg (10 μl) 0,5 μg (10 μl)
    D 1 μg (20 μl) 1 μg (20 μl) 1 μg (20 μl) 1 μg (20 μl)
    E 1,5 μg (30 μl) 1,5 μg (30 μl) 1,5 μg (30 μl) 1,6 μg (30 μl)
    F 3 μg (60 μl) 3 μg (60 μl) 3 μg (60 μl) 3 μg (60 μl)
  • Anschließend wird im Inkubator je nach Antikörper für 5 oder 0,5 h inkubiert.
  • Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl DNA (pCMV-lacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
  • Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben.
  • Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Am dritten Tag wird das Medium der Spalten 3 und 4 erneuert. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen wiederholt.
  • Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
    Ergebnisse:
    Antikörper:
    Mouse Anti-human-CD282 Antibody (= anti TLR2), monoclonal, AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2484EL
    Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5 Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4
    A 0,65 0,66 1,08 1,18
    B 0,61 0,68 1,12 1,07
    C 0,72 0,70 1,70 1,21
    D 0,67 0,76 1,82 1,34
    E 0,67 0,86 1,62 1,66
    F 0,64 0,67 1,56 1,34
  • Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    A B C D E F
    1&2/2 0,65 0,64 0,71 0,71 0,76 0,65
    3&4/2 1,13 1,09 1,45 1,58 1,65 1,45
  • Figure 00560001
  • Antikörper:
    Mouse Anti-humanTLR3 Antibody, monoclonal, Lifespan Biosciences Kat-nr.: LS-C18685
    Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5 h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5,5 Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4
    A 0,72 0,64 1,30 1,32
    B 0,64 0,67 1,42 1,30
    C 0,75 0,73 1,54 1,59
    D 0,75 0,86 1,71 1,69
    E 0,89 0,82 1,65 1,95
    F 0,76 0,82 1,83 1,65
  • Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    A B C D E F
    1&2/2 0,68 0,65 0,74 0,80 0,85 0,79
    3&4/2 1,31 1,36 1,56 1,70 1,80 1,74
  • Figure 00580001
  • Antikörper:
    Mouse Anti-human-CD284 Antibody (= anti TLR4), monoclonal, AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2061EL
    Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5 h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5,5 Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4
    A 0,65 0,65 1,03 1,22
    B 0,67 0,65 1,44 1,67
    C 0,74 0,64 1,42 1,17
    D 0,78 0,69 1,57 1,38
    E 0,74 0,73 1,59 1,63
    F 0,78 0,71 1,82 1,56
  • Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    A B C D E F
    1&2/2 0,65 0,66 0,69 0,73 0,73 0,74
    3&4/2 1,12 1,55 1,29 1,47 1,61 1,69
  • Figure 00590001
  • Antikörper:
    Antikörper: Mouse Anti human TLR1 Antibody (monoclonal, 0.05% Natriumazid, 100 μg Lyophilisat); Invivogen, No. Mab-htlr1.
  • Zur Entfernung des Natriumazides wurde der Antikörper gegen PBS dialysiert: Dialysemembran: Spectra/Por DispoDialyser (500 μl, Celluloseestermembran, 25000 Da Molecular Weight Cut-Off); Spectrum Laboratories; No. 135492, Lot 3224004.
    Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5 h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 4 Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4
    A 1,055 1,225 1,683 1,627
    B 1,354 1,328 1,905 1,798
    C 1,346 1,516 2,033 1,914
    D 1,401 1,367 2,106 1,827
    E 1,260 1,488 2,063 1,841
    F 1,085 1,020 1,816 1,712
  • Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    A B C D E F
    1&2/2 1,140 1,341 1,431 1,384 1,374 1,053
    3&4/2 1,655 1,852 1,974 1,966 1,952 1,764
  • Figure 00610001
  • Antikörper:
    Bender Medsystems, Anti-human IFN-omega Antikörper, monoclonal, 100 μg in 100 μl PBS (c = 1 μg/μl), azide free, Kat-nr.: BMS155 (Anikörper-online: ABIN 123937).
    Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 0,5 h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 12 min Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4
    A 0,51 0,52 1,26 1,47
    B 0,50 0,50 1,27 1,19
    C 0,49 0,51 1,14 1,18
    D 0,47 0,50 1,32 1,42
    E 0,50 0,53 1,45 1,46
    F 0,55 0,57 1,71 2,18
  • Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    A B C D E F
    1&2/2 0,51 0,50 0,50 0,48 0,51 0,56
    3&4/2 1,36 1,23 1,16 1,37 1,45 1,94
  • Figure 00620001
  • Beispiel 6
  • Weitere Versuche mit Antagonisten
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Analog Beispiel 5
  • 2.Tag:
  • Der Antagonist wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,025 μg/μl eingestellt.
  • Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
    1 2 3 4
    A 0 ng (0 μl) 0 ng (0 μl) 0 ng (0 μl) 0 ng (0 μl)
    B 0,0625 ng (2.5 μl) 0,0625 ng (2.5 μl) 0,0625 ng (2.5 μl) 0,0625 ng (2.5 μl)
    C 0,125 ng (5 μl) 0,125 ng (5 μl) 0,125 ng (5 μl) 0,125 ng (5 μl)
    D 0,250 ng (10 μl) 0,250 ng (10 μl) 0,250 ng (10 μl) 0,250 ng (10 μl)
    E 0,375 ng (15 μl) 0,375 ng (15 μl) 0,375 ng (15 μl) 0,375 ng (15 μl)
    F 0,75 ng (30 μl) 0,75 ng (30 μl) 0,75 ng (30 μl) 0,75 ng (30 μl)
  • Anschließend wird im Inkubator für 7 inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl DNA (pCMV-lacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
  • Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben.
  • Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Analog Beispiel 5
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
    Ergebnisse:
    Antagonist:
    Human Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1-ra Human), Biomol, Kat.-Nr.: 54592
    Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 7h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 10 Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4
    A 0,436 0,433 0,932 0,820
    B 0,427 0,448 0,791 1,021
    C 0,415 0,435 0,856 1,185
    D 0,393 0,439 1,035 1,026
    E 0,392 0,460 1,076 1,081
    F 0,443 0,455 1,161 1,207
  • Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    A B C D E F
    1&2/2 0,435 0,437 0,425 0,416 0,426 0,449
    3&4/2 0,876 0,906 1,020 1.030 1,078 1,184
  • Figure 00650001
  • Beispiel 7
  • Weiterer Versuch mit einem Kinase-Inhibitor:
    p38 MAP Kinase Inhibitor und PKB Kinase Inhibitor:
    4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol, SB203580, MW = 377,44, 5 mg, Invivogen, Kat.-Nr.: tlrl-sb20.
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 0,8 × 105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • 1 mg Inhibitor wird in 20 μl DMSO gelöst (Stocklösung). Anschließend wird mit PBS 1:100 verdünnt (Arbeistlösung). Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt:
    F E D C B A
    1 0 μM (0 μl) 5 μM (0,95 μl) 10 μM (1,9 μl) 20 μM (3,8 μl) 25 μM (4,75 μl) 30 μM (5,7 μl)
  • Anschließend wird im Inkubator für 2 h inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 5 μl DNA (pCMV-lacZ) in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 20 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
  • Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben.
  • Anschließend wird 48 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
    Ergebnisse:
    Vorinkubationszeit mit dem Inhibitor vor der Transfektion: 2h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 9 Mittelwert von 3 Messungen:
    F E D C B A
    1 1,01 1,16 1,18 1,28 1,36 1,48
  • Figure 00670001
  • Beispiel 8
  • Weiterer Versuch mit einem Kinase-Inhibitor:
    MEK1 und MEK2 Inhibitor:
    U0126, 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-amionophenylmercapto)butadiene, MW = 380,5, Invivogen, Kat.-Nr.: tlr-u0126.
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 0,8 ×105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • 1 mg Inhibitor wird in 100 μl DMSO gelöst (Stocklösung). Anschließend wird mit PBS 1:20 verdünnt (Arbeitslösung). Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt:
    F E D C B A
    1 0 μM (0 μl) 5 μM (0,95 μl) 10 μM (1,9 μl) 25 μM (4,75 μl) 50 μM (9,5 μl) 75 μM (14,25 μl)
  • Anschließend wird im Inkubator für 2 h inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 5 μl DNA (pCMV-lacZ) in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 20 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
  • Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben.
  • Anschließend wird 48 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Am dritten Tag wird das Medium erneuert und die in der Tabelle angegebenen Inhibitormengen ersetzt. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden ohne Inkubationszeit wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
    Ergebnisse:
    Vorinkubationszeit mit dem Inhibitor vor der Transfektion: 2h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 10 Mittelwert von 3 Messungen:
    F E D C B A
    1 0,63 0,72 0,92 0,79 0,90 0,97
  • Figure 00690001
  • Beispiel 9
  • Weiterer Versuch mit Inhibitoren gegen die Adaptermoleküle TRAF6, MyD88, und den Transkriptionsfaktor NF-kB:
    TRAF6 Inhibitory Peptide, Imgenex, Product Nr.: IMG 2002, Sequence: DRQIKIWFQNRRMKWKKRKIPTEDEY, MW 3494, Control-Peptide: DRQIKIWFQNRRMKWKK, MW 2361.
    NF-κB p50 (NLS) Inhibitory Peptide, Imgenex, Product Nr.: IMG 2004, Sequence: DRQIKIWFQNRRMKWKKVQRKRQKLM, MW 3529.
    MyD88 Inhibitory Peptide, Imgenex, Product Nr.: IMG 2005, Sequence: DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT, MW 3100, μ-Slide, ibidi, 80606.
    Plasmid: pCMV-GFP, PlasmidFactory, Produktnr.: PF463-06020, c = 1 mg/ml in WFI.
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 0,8 ×105 Zellen in ein Well in 125 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • Von den Inhibitoren und von dem Control-Peptide werden 5 mM Lösungen in PBS hergestellt.
  • Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte nach folgender Tabelle mit 5 μl Inhibitor oder Control-Peptide versorgt. Die Zeile „leer” bleibt unbehandelt:
    A
    TRAF6 8 200 μM (5 μl)
    NF-κB 7 200 μM (5 μl)
    My-D88 6 200 μM (5 μl)
    Kontrollpeptid 5 200 μM (5 μl)
    leer 4 0 μM (0 μl)
  • Enstrechend resultieren Konzentrationen von 200 μM oder 0 μM. Anschließend wird im Inkubator für 24 h inkubiert.
  • 2. Tag:
  • Vor der Transektion wird das alte Medium entfernt und durch 250 μl frisches Medium ersetzt. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 4 μl DNA (pCMV-GFP) in 200 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 16 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 200 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
  • Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben.
  • Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Am dritten Tag wird das Medium erneuert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Das Medium in den Wells wird entfernt und es wird 1 × mit Trypsinlösung gespült.
  • Anschließend werden die Zellen mit 125 μl Trypsinlösung pro Well für ca. 15 min inkubiert. Die Trypsinierung wird mit 125 μl komplettem Kulturmedium gestoppt und die Zellen durch Klopfen und Pipettieren von der Wachstumsfläche getrennt.
  • Die Zellsuspensionen werden bei 300 g für 5 min zentrifugiert und die erhaltenen Zellpellets in 500 μl PBS resusupendiert. Mit jeder Suspension wird ein μ-Slides befüllt und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops die Transfektionsrate (Anteil fluoreszierender Zellen von der Gasamtzellzahl) bestimmt. Ergebnisse:
    TRAF-6 Ausgewertete Zellzahl 293
    Zahl transfizierter Zellen 157
    NF-kB Ausgewertete Zellzahl 448
    Zahl transfizierter Zellen 232
    MyD88 Ausgewertete Zellzahl 340
    Zahl transfizierter Zellen 191
    Kontrollpeptid Ausgewertete Zellzahl 162
    Zahl transfizierter Zellen 46
    leer Ausgewertete Zellzahl 283
    Zahl transfizierter Zellen 115
  • Das ergibt folgende Transfektionsraten [in %]:
    TRAF-6 53,6
    NF-kB 51,8
    MyD88 56,2
    Kontrollpeptide 28,4
    leer 40,6
  • Figure 00720001
  • Beispiel 10
  • Weiterer Versuch mit einem Glucocorticoid:
    Hydrocortisone (Cortisol; 17-Hydroxycorticosterone); MW = 362,47 Sigma-Aldrich Chemie, Produktnr.: H0888
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 0,8 × 105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • Von dem Cortisol wird eine 0,138 mM Stocklösung hergestellt. Dazu wird 1 mg in Ethanol gelöst und mit PBS 1:20 verdünnt. Anschließend wird mit PBS 1:50 verdünnt (1 ng/μl = Arbeitslösung). Danach werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Arbeitslösung versorgt:
    A B C D E F
    1 0 μl 0,0 ng/μl 2,5 μl 0,01 ng/μl 5 μl 0,02 ng/μl 7,5 μl 0,03 ng/μl 10 μl 0,04 ng/μl 12,5 μl 0,05 ng/μl
  • Danach wird im Inkubator für 2,5 h inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 5 μl DNA (pCMV-lacZ) in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 20 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
  • Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben.
  • Anschließend wird 48 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Zu den Wells werden 250 μl komplettes Medium gegeben
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
    Ergebnisse:
    Vorinkubationszeit mit den Inhibitoren vor der Transfektion: 2,5 h Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 3 Mittelwert von 3 Messungen:
    A B C D E F
    1 0,867 0,991 1,026 1,170 1,216 1,344
  • Figure 00740001
  • Beispiel 11
  • Weiterer Versuch mit HepG2 Zellen
  • Durchführung anlalog Beipiel 5
    Abweichungen: HepG2 Zellen, Antikörperkonzentration 0,1 μg/μl statt 0,05 μg/μl in PBS, Lipoplexbildung in serumfreien DMEM statt in PBS
    Antikörper:
    Mouse Anti-human-CD282 Antibody (= anti TLR2), monoclonal, AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2484EL
    Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 4 Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4
    A 1,680 1,486 1,649 1,815
    B 1,884 1,792 1,999 2,267
    C 2,095 1,960 2,111 2,297
    D 2,036 1,936 1,911 2,184
    E 1,964 1,930 1,987 2,164
    F 1,719 1,935 1,930 2,224
  • Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    A B C D E F
    1&2/2 1,583 1,838 2,028 1,986 1,947 1,827
    3&4/2 1,732 2,133 2,204 2,048 2,076 2,077
  • Figure 00760001
  • Beispiel 12
  • Weiterer Versuch mit einem Antikörper gegen TLR9 mit Einbau in einen Lipoplex
  • Antikörper:
    Rabbit Anti-human-TLR9 Antibody (= anti TLR9), polyclonal, 0,5 μg/μl in PBS, 0,2% Gelatine, 0,05% Natriumazid, Lifespan Biosciences, Kat-nr.: MCA2484EL.
  • Zur Entfernung des Natriumazides wurde der Antikörper gegen PBS dialysiert: Dialysemembran: Spectra/Por DispoDialyser (500 μl, Celluloseestermembran, 25000 Da Molecular Weight Cut-Off); Spectrum Laboratories; No. 135492, Lot 3224004.
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 1,0 × 105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • Der Antikörper wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,1 μg/μl eingestellt.
  • 15 μg DNA (pCMVβGal) und 60 μl Metafectene Pro werden jeweils in 300 μl serumfreien DMEM gelöst. Durch sanftes Auf- und Abpipettieren werden die einzelnen Lösungen gemischt. Anschließend werden Lipoplexe folgender Zusammensetzung hergestellt.
    Lösung 1 2 3 4 6
    Antikörperlösung [μl] 0 11 22 44 66
    Metafectene Pro-Lösung [μl] 44 44 44 44 44
    DNA-Lösung [μl] 44 44 44 44 44
    Serumfreies DMEM [μl] 132 121 110 88 66
  • Dabei wird zunächst die Metafectene Pro-Lösung mit der Antikörperlösung vereint und für fünf Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wird die DNA-Lösung und das serumfreie DMEM hinzugegeben und weitere 15 Minuten bei RT inkubiert.
  • Jeweils 50 μl der DNA-Antikörper-Lipidkomplexe werden in die Wells pipettiert.
  • Dabei wird die Lösung 1 in vier Wells der Spalte 1 pipettiert. Lösung 2 in vier Wells der Spalte 2 und so weiter. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag
  • Das Medium aller Zeilen wird erneuert. für die Zeilen C und D wird eine zweite Transfektion analog der Transfektion am ersten Tag durchgeführt.
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
    Ergebnisse: Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4
    A 0,819 1,671 1,419 1,845
    B 0,860 1,591 1,604 1,858
    C 1,005 2,185 1,940 2,267
    D 1,472 2,650 2,264 2,401
  • Die Zeien 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    1 2 3 4
    A&B 0,840 1,631 1,512 1,852
    C&D 1,239 2,417 2,102 2,334
  • Die zugegebene Antikörpermenge enspricht folgenden Mengen Antikörper pro Well:
    1 2 3 4
    μg 0 0,5 1,0 1,5
  • Figure 00790001
  • Beispiel 13
  • Weiterer Versuch mit einem Kinase-Inhibitor:
    JNK Inhibitor:
    SP600125, 1,9-Pyrazoloenthrone (Pyrazolanthrone), MW = 220,2, Sigma, Kat.-Nr.: S5567
    Zelltyp: HepG2
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HepG2 Zellen in eine 48 Well Platten ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 0,8 × 105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • 1 mg Inhibitor wird in 227 μl DMSO gelöst (Stocklösung 20 mM). Anschließend wird mit PBS 1:60 verdünnt (Arbeitslösung). Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt:
    1 2 3 4 5
    A 0 μM (0 μl) 1,3 μM (1 μl) 3,3 μM (2,5 μl) 13,3 μM (10 μl) 26,6 μM (20 μl)
    B 0 μM (0 μl) 1,3 μM (1 μl) 3,3 μM (2,5 μl) 13,3 μM (10 μl) 26,6 μM (20 μl)
    C 0 μM (0 μl) 1,3 μM (1 μl) 3,3 μM (2,5 μl) 13,3 μM (10 μl) 26,6 μM (20 μl)
    D 0 μM (0 μl) 1,3 μM (1 μl) 3,3 μM (2,5 μl) 13,3 μM (10 μl) 26,6 μM (20 μl)
  • Anschließend wird im Inkubator für 2 h inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 12 μl DNA (pCMV-lacZ) in 600 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 48 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 600 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
  • Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben.
  • Anschließend wird 48 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Am dritten Tag wird das Medium aller Wells erneuert und für die Zeilen C und D die in der Tabelle angegebenen Inhibitormengen ersetzt. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen ohne Inkubationszeit wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Reportergenassay:
    Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
    Ergebnisse:
    Vorinkubationszeit mit dem Inhibitor vor der Transfektion: 2h
    Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 2,5 Mittelwert von 3 Messungen:
    1 2 3 4 5
    A 1,116 1,702 2,285 1,261 1,070
    B 1,107 1,221 1,394 0,977 0,981
    C 0,832 1,149 1,128 0,862 0,762
    D 1,017 0,986 0,909 0,895 0,937
  • Die Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
    1 2 3 4 5
    A&B/2 1,112 1,461 1,840 1,119 1,026
    C&D/2 0,925 1,067 1,019 0,879 0,849
  • Figure 00820001
  • Beispiel 14
  • siRNA Transfektion in Anwesenheit der Kinase Inhibitoren:
    • – p38/RK MAPK-Inhibitor: SB203580, Invivogen; No. tlrl-sb20
    • – MEK-Inhibitor: U0126, Invivogen, No. tlr-u0126
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • 1. Tag:
  • Es werden HeLa-Luc Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 1,5 × 104 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 2. Tag:
  • Zuerst werden die Inhibitoren vorbereitet:
    SB203580 (M = 377,43 g/mol): 1 mg wird in 20 μl DMSO gelöst. Die Stocklösung wird mit PBS 1:105 verdünnt.
    U0126 (M = 380,49 g/mol): 1 mg des Inhibitors wird in 100 μl DMSO gelöst. Die Stocklösung wird mit PBS 1:20 verdünnt.
  • Die Wells der 48 Well Platte werden mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt:
    U0126 SB203580
    F E D C
    1 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl)
    2 5 μM (1 μl) 5 μM (1 μl) 5 μM (1 μl) 5 μM (1 μl)
    3 10 μM (2 μl) 10 μM (2 μl) 10 μM (2 μl) 10 μM (2 μl)
    4 25 μM (5 μl) 25 μM (5 μl) 20 μM (4 μl) 20 μM (4 μl)
    5 50 μM (10 μl) 50 μM (10 μl) 30 μM (6 μl)) 30 μM (6 μl)
    6 75 μM (15 μl) 75 μM (15 μl) 40 μM (8 μl) 40 μM (8 μl)
    7 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl)
    8 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl) 0 μM (0 μl)
  • Anschließend wird im Inkubator für 2 h inkubiert. Danach werden die Lipoplexe hergestellt.
  • Dazu wird 1 μl anti-Luciferase-siRNA Stocklösung in 300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. Von dieser Lösung werden nur 240 μl weiterverwendet. 1 μl non-specific-control-siRNA wird in 300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. Von dieser Lösung werden nur 40 μl weiterverwendet.
  • 3 μl Metafectene Pro werden in 225 μl PBS einpipettiert und ebenfalls durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden 190 μl zur anti-Luciferase-siRNA Arbeitslösung und 35 μl zur non-specific-control-siRNA Arbeitslösung pipettiert. Die Lösungen werden gemischt und 15 min inkubiert. Es resultieren Lipoplexe mit einem siRNA-Reagenzverhältnis von 1:5 μg/μl.
  • Am Ende werden jeweils 15 μl der anti-Luciferase-siRNA-Lipoplexlösung in die ersten 6 Reihen der Platte gegeben. 15 μl der non-specific-control-siRNA-Lipoplexlösung werden in die 7. Reihe der Platte gegeben. Es resultiert eine siRNA Menge von 1 pMol/Well. Die Reihe 8 bleibt untransfiziert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 3. Tag:
  • Am dritten Tag wird das Medium aller Wells erneuert und die in der Tabelle angegebenen Inhibitormengen ersetzt. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden nach der Inhibitorzugabe für die Spalten E und C wiederholt. Anschließend wird weitere 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
  • 4. Tag
  • Luciferase-Assay und BCA Protein Assay:
  • Beide Assays werden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt.
  • Auswertung:
  • Von der 48 Well Platte wir das Medium entfernt und die Zellen mit 100 μl PBS gewaschen. Anschließend werden 120 μl Luciferase-Lysispuffer hinzugegeben. Die Platte wird auf Eis ca. 30 Minuten inkubiert und 20–30 Sekunden durch vorsichtiges Schütteln (Klopfen) gemischt. Nun werden von dieser 48 Well Platte pro Well 25 μl entfernt und mit analoger Belegung in eine zweite 48 Well Platte gegeben. Mit der ersten Platte wird der Luciferase Assay mit der zweiten Platte der BCA Test durchgeführt.
  • Luciferase Assay:
  • Parametereinstellungen des Luminometers:
    • – Messzeit: 15 sec
    • – Zeitintervall zwischen Lösungsinjektionen: 0,5 sec
    • – Intervall zwischen Lösungsinjektion und Messung: 0,1 sec
  • BCA Protein Assay:
    • – Auswertung bei Wellenlänge 562 nm
  • Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt. Im Fall des Luciferase Assays dreimal mit drei neuen Zellextrakten. Die erhaltenen Werte des Luciferase-Assays (RLU) wurden auf 1 μl Zellextrakt und 1 sec Messzeit normiert. Die erhaltenen Werte des BCA Protein Assays wurden ebenfalls auf 1 μl Zellextrakt normiert.
    Luciferase Assay:
    RLU/μl Zellextrakt/sec Mittelwert von 3 × 3 Messungen:
    F E D C
    1 1157 1001 1027 976
    2 375 641 693 696
    3 567 162 747 656
    4 268 179 630 617
    5 193 171 671 587
    6 260 103 669 610
    7 1829 2290 2029 2135
    8 1674 2249 2504 2531

    BCA Assay:
    ABS/μl Zellextrakt Mittelwert von 3 Messungen:
    F E D C
    1 0,0196 0,0196 0,0192 0,0192
    2 0,0192 0,0204 0,0193 0,0189
    3 0,0189 0,0196 0,0193 0,0187
    4 0,0183 0,0188 0,0186 0,0186
    5 0,0182 0,0191 0,0183 0,0186
    6 0,0182 0,0190 0,0184 0,0192
    7 0,0184 0,0186 0,0183 0,0184
    8 0,0184 0,0178 0,0181 0,0187
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Beispiel 15
  • siRNA Transfektion in Anwesenheit der TLR7/8 Agonisten:
    • – Imiquimod, InvivoGen, Kat.-Nr.: tlrl-imq
    • – ssRNA40/LyoVec, InvivoGen, Kat.-Nr.: tlrl-Irna-40
  • Detaillierte Versuchsbeschreibung:
  • Tag 1:
  • Vorbereiten der Zellen:
  • Es soll eine Zellzahl von 2 × 104 Zellen/cm2 in ein Well in 250 μl komplettem Medium ausplattiert werden.
  • Herstellung der Lipoplexe:
  • Zunächst werden die ersten 5 Wells der ersten 3 Reihen einer 48 Well Platte mit jeweils 30 μl PBS gefüllt.
  • Die Stocklösung der anti-Luciferase-siRNA und der non-specific-control-siRNA wird mit PBS auf eine Konzentration von 1 pmol/10 μl eingestellt. Anschließend werden jeweils 10 μl der Arbeitslösung der anti-Luciferase-siRNA in die ersten 3 Wells der der ersten drei Reihen der 48 Well Platte pipettiert. In die jeweils vierten Wells werden jeweils 10 μl der Arbeitslösung der non-specific-control-siRNA pipettiert.
  • Das Metafectene Pro Reagenz wird mit PBS 1:300 verdünnt. Von dieser Verdünnung werden jeweils 20 μl in jedes Well mit siRNA gegeben.
  • Anschließend werden die Lipoplexe für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden pro Well 250 μl Zellsuspension zugegeben. Analog wird eine zweite Platte bestückt.
  • Zugabe der Agonisten:
  • In die ersten 2 Spalten der beiden 48 Well Platte werden 2 verschiedene Agonisten hinzugegeben. Dabei werden 3 verschiedene Arbeitskonzentrationen der Agonisten verwendet. Die Agonisten liegen lyophilisiert vor. Sie werden mit endotoxin-freiem Wasser zu Stocklösungen mit der Konzentration 100 μg/ml gelöst. Die Stocklösungen werden jeweils 1:10 mit Wasser zu Arbeitslösungen verdünnt.
  • Von der Imiquimod-Arbeitslösung werden in A1 0,78 μl (= 0,25 μg/ml Endkonzentration), in A2 15,5 μl (= 5 μg/ml) und in A3 31 μl (= 10 μg/ml) pipettiert. Von der ssRNA40/LyoVec-Arbeitslösung werden in B1 0,78 μl (= 0,5 μg/ml Endkonzentration ssRNA40), in B2 15,5 μl (= 5 μg/ml) und in B3 31 μl (= 10 μg/ml) pipettiert.
  • Nach der Zugabe der Agonisten werden die beiden 48 Well Platten für 48 Stunden im CO2-Inkubator inkubiert.
  • Tag 3:
  • Vitalitätsbestimmung:
  • Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden werden die Zellen einer Platte trypsiniert und mittels einer Neubauer-Zählkammer eine Vitalitätbestimmung mit Trypanblau für jedes Well durchgeführt.
  • Luciferase-Assay und BCA Protein Assay: Analog Beispiel 13
  • Ergebnisse
  • Trypanblaufärbung:
  • Es wurden zwischen 40 und 70 Zellen ausgewertet.
    Vitalität [%]
    Imiquimod 0,5 μg/ml + anti-Luciferase-siRNA/Metafectene Pro 98,6
    Imiquimod 5 μg/ml + anti-Luciferase-siRNA/Metafectene Pro 88,7
    Imiquimod 10 μg/ml + anti-Luciferase-siRNA/Metafectene Pro 88,6
    ssRNA40/LyoVec 0,5 μg/ml + anti-Luciferase-siRNA/Metafectene Pro 97,8
    ssRNA40/LyoVec 5 μg/ml + anti-Luciferase-siRNA/Metafectene Pro 81,5
    ssRNA40/LyoVec 10 μg/ml + anti-Luciferase-siRNA/Metafectene Pro 83,0
    anti-Luciferase-siRNA/Metafectene Pro 87,7
    non-specific-control-siRNA/Metafectene Pro 92,6
    Blindprobe 95,9

    Luciferase Assay:
    RLU/μl Zellextrakt/sec Mittelwert von 3 × 3 Messungen:
    1 2 3 4 5
    A 676 1023 1604 3016 2936
    B 349 223 1302 2753 2673
    C 116 98 1481 2822 2476

    BCA Assay ABS/μl Zellextrakt Mittelwert von 3 × 3 Messungen:
    1 2 3 4 5
    A 0,0086 0,0080 0,0080 0,0087 0,0093
    B 0,0069 0,0068 0,0078 0,0080 0,0092
    C 0,0073 0,0069 0,0078 0,0080 0,0088
  • Figure 00910001
  • Die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Beispiele lassen auch den Schluss zu, dass nicht nur das genetische Material, sondern auch die chemischen Agentien wie z. b. kationische Lipide und kationische Polymere von den TLRs detektiert werden. Nach den vorliegenden Ergebnissen muss man davon ausgehen, dass im Fall von Hela Zellen, Metafectene Pro als Transfektionsreagenz und DNA (Plasmid) hoher Qualität folgende TLRs involviert sind. TLR 4 detektiert Spuren von LPS in der Plasmidlösung. TLR9 und TLR3 detektieren genetisches Material, also in diesem Fall Plasmide oder entsprechende Verunreinigungen. TLR1 und TLR2 detektieren das Transfektionsreagenz.
  • Zwanglos lässt sich damit möglicherweise auch erklären, dass unterschiedliche Zellen bei unterschiedlichen Verhältnissen von genetischem Material und Transfektionsreagenz optimale Ergebnisse zeigen. Zellen die z. B. sehr viele TLR9 und wenige TLRs für die Reagentien exprimieren, sollten demnach bei einem Verhältniss optimale Ergebnisse zeigen, bei dem wenig DNA auf viel Reagenz trifft.
  • Es ist einleuchtend, das die Aktivierung der TLRs vor und während der Transfektion von vielen Faktoren abhängt. Je nach Expressionsprofil der Zielzelle kann dabei z. B. eine besondere Empfindlichkeit der Zellen gegenüber bestimmten PAMPs gegeben sein. Weiter können unterschiedliche Reagentien und unterschiedliches genetisches Material unterschiedliche TLRs aktivieren. Selbst unterschiedliche DNA Sequenzen können je nach CpG Gehalt Einfluss auf die Transfektionsergebnisse nehmen. Nicht zuletzt spielen auch Verunreinigungen eine nicht zu unterschätzende Rolle. So kann DNA bakteriellen Ursprungs beispielsweise mit LPS oder Flagellin oder RNA verunreinigt sein. ssRNA kann mit dsRNA verunreinigt sein und damit ausser TLR7/8 auch TLR3 ansprechen und umgekehrt. Unterschiedliche Behandlung der Zellen kann durch Stress-Signaltransduktionkaskaden zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Zusammefasst kann gesagt werden, dass für unterschiedliche Transfektionsexperimente unterschiedliche Blockierungsstrategien erforderlich sind.
  • Die unterschiedlichen Transfektioneergebnisse zur Blockierung des angeborenen Immunsystems bezumglich einfache und repetitiver Transfektion lassen sich ebenflas deuten. Es ist bekannt, dass die Endozytose, also der äußere Membrantransport, stark durch Kinasen reguliert ist. Über den schnellen Weg der Phosphorylierung kann die die Zelle bei der Detektion pathogen assoziierter Muster die Endozytose herunterregulieren und damit ein Enfallstor für Pathogene schliessen. Da die Signaltransdukionskaskaden auch über Kinasen das Signal weiterleiten, ist hier ein Zusammenhang zu vermuten. Deutliche Zuwächse der Transfektionseffizienz schon bei der ersten Transfektion deuten darauf hin, dass schnelle Abwehrprozesse unterbunden wurden, also vermutlich auch der Memrantransport. Abwehrprozesse, die über die Expression spezielle Proteine oder Zytokine laufen, dauern erheblich länger und sind dabei in einem Zeitschema erst bei einer Doppeltransfektion wirksam. Eine Steigerung der Transfektionseffizienz nach einem Tag durch eine repetitive Transfektion deutet auf eine reduzierte Expression eines oder mehrerer für den Abwehrprozess wichtigen Proteine hin.
  • Wie bereits ausgeführt, kann die Erfindung zu Therapiezwecken eingesetzt werden. Insbesondere kann die Erfindung für die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie, β-Thalassämie und Krebs genutzt werden. Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant, wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. für die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels der Erfindung effektiv in Zellen gebracht werden, in denen diese DNA die gewünschte Wirkung entfalten kann ohne dabei zu unerwünschten Nebenwirkungen zu führen. Die gewünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel durch Antisense-DNA/RNA oder siRNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten Zelttyp sein. Auf diese Weise können z. B. tumorunterdrückende Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung cholesterolregulierender Gene ein Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und Blutgefäßkrankheiten geleistet werden. Weiters kann DNA, welche Ribozyme, siRNA oder shRNA kodiert, oder Ribozyme oder siRNA selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation der DNA erzeugt aktive Ribozyme oder siRNA, die an spezifischen Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel virale m-RNA gespalten werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehrungszyklus von Viren (HIV, Herpes, Hepatitis B und C, respiratorisches Syncytial Virus) kann auf diesem Wege unterbrochen werden. Weitere Erkrankungen, die speziell über die Behandlung mit siRNA geheilt werden sollen sind die altersbedingte Degeneration der Macula (Augenerkrankung), Leberkrebs, solide Tumoren, Amyotropische Lateral-Sklerose und Entzünndungserkrankungen. Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion beispielsweise zur Herstellung von Krebsvakzinen eine immer größer werdende Rolle. Damit ist jene auch mögliches Anwendungsgebiet für die Erfindung.
  • Eine weitere Anwendung kann die Erfindung zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogene Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden z. B. Lipid/DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt. Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expression des immunogenen Peptids und löst somit die adaptive Immunantwort aus.
  • Im folgenden werden erfindungsgemäß beispielhafte, aber keinesfalls beschränkende Definitionen aufgeführt:
    Transfektion:
    Einschleusen von genetischem Material in eine eukariotische Zelle.
  • Transfektionsergebnis/Transfektionseffizienz
  • Menge einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches unter anderem dieses exprimierte Protein codiert oder Ausmaß eines Knock-downs einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches einen solchen Knock-Down auslösen kann, insbesondere siRNA oder Ribozyme oder DNA, die für shRNA oder Ribozyme codiert oder Anteil der Zellen einer Gesamtpopulation von Zellen, die die biologische Wirksamkeit des eingeschleusten genetischen Materials in Folge von Transfektionsprozessen zeigt. Gleichzeitig soll der physiologische Status der Zellpopulation so wenig wie möglich beeinflusst werden, das heisst das Protein-Expressionsprofil der Zellpopulation soll sich idealerweise nur bezumglich der Proteine ändern, deren Gene in die Zelle eingeschleust wurden oder deren Expression durch das eingeschleuste genetisches Material herabgesetzt oder verhindert werden soll.
  • Nicht-virales Genliefersystem:
  • Nicht-virale Genliefersysteme werden nicht durch Rekombination genetischen Materials von natürlich vorkommenden Viren erzeugt. Sie sind in der Lage genetisches Material in eukariotische Zellen einzuschleusen. Insbesondere handelt es sich bei den nicht-viralen Genliefersystemen um physikalische Methoden und chemische Methoden. Physikalische Methoden lokalisieren mindestens das genetische Material in der Nähe der Zelle, insbesondere nutzen physikalische Verfahren jedoch Energiezufuhr insbesondere in Form von thermischer, kinetischer, elektrischer oder sonstiger Energie um einen Transport des genetischen Materials durch die Zellmembran zu vermitteln. Chemische Methoden beruhen entweder auf einer chemischen Veränderung oder Derivatisierung der Nukleinsäuren, die sie insbesondere zellgängig machen oder bestehen insbesondere aus Stoffen, die DNA binden und einen Transport durch die Zellmembran vermitteln können. Insbesondere nutzen diese zur Bindung der Nukleinsäuren elektrostatische Kräfte oder Wasserstoffbrückenbindungen. wiederum insbesondere geschieht der Transport der DNA durch die Zellmembran durch einen aktiven Transportmechanismus der Zelle, der Endozytose. Stoffe, die diese Eigenschaften aufweisen enthalten insbesondere kationische Lipide, kationische Polymere, kationische Peptide oder auch Moleküle die eine Domäne haben, die DNA oder RNA binden kann und zugleich eine zweite Domäne haben, die eine Liganden enthält, der von einem Rezeptor auch der Zelloberfläche erkannt wird und durch diesen Erkennungsprozess Endozytose auslöst. Die Stoffe können auch besonders formuliert sein, insbesondere als Micellen oder Liposomen und auch aus mehreren Komponenten insbesondere mit unterschiedlicher Funktion bestehen.
  • Gentherapie
  • Therapie zur Heilung oder Linderung von Krankheiten bei der als Wirkstoff modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren eingesetzt werden.
  • Angeborene Immunabwehr
  • Die angeborene Immunabwehr grenzt sich von der erworbenen oder adaptiven Immunabwehr dahingehen ab, dass sie einen Erreger abwehrt, ohne dass es vorher jemals zu einem Kontakt mit dem Erreger gekommen sein muss, um das Immunsystem zu schulen. Die angeborene Immunabwehr ist den meisten Zelltypen zu eigen und besteht aus zwei Teilen, dem intrazellulären und dem interzellulären Anteil. Der intrazelluläre Anteil nutzt die Erkennung von Pathogenen zuzuordnenden molekularen Strukturen durch Rezeptoren. Diese Rezeptoren stoßen insbesondere Signaltransduktionskaskaden an, die insbesondere durch Expression vieler zelleigener Gene und Phosphorylierung wichtiger Proteine in einem geänderten physiologischen Status (z. B. „antiviralen Status”) der direkt betroffenen Zellen münden. Zusätzlich werden Zytokine ausgeschüttet.
  • Über den interzellulären Anteil des angeborenen Immunsystems benachrichtigen betroffene Zellen über diese Botenstoffe (Zytokine) nichtbetroffene Zellen und lösen auch dort einen geänderten physiologischen Status (z. B. „Antiviralen Status”) aus. Dabei docken die Zytokine an Zytokin-Rezeptoren der anderen Zellen an und lösen wiederum eine Signaltransduktionskaskade aus. Der interzelluläre Anteil grenzt sich also vom intrazellulären Anteil durch die unterschiedlichen Rezeptoren (Zytokinrezeptoren statt PRRs (pattern recognition receptors) und Agonisten (Zytokine statt pathogene Muster) ab.
  • Antiviraler Status
  • Status von Zellen, der sich dadurch auszeichnet, dass die Zelle versucht die mögliche biologische Wirksamkeit von fremdem genetischen Material durch Gegenmaßnahmen zu unterbinden.
  • Transfektion in vivo
  • Das Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet in einem lebenden Organismus statt.
  • Transfektion in vitro
  • Das Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet außerhalb eines lebenden Organismus statt, insbesondere in Gefäßen, die sich zur Kultivierung von eukariotischen Zellen eignen Genetisches Material Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren, die insbesondere aus zwei wenigstens teilweise komplementären Strängen (doppelsträngig = ds) bestehen z. B. dsDNA und dsRNA, oder die insbesondere aus einem Strang (einzelsträngig = ss) besteht, z. B. ssDNA und ssRNA, der teilweise komplentäre Bereiche aufweisen kann, die über Wasserstoffbrückenbindung miteinander verbunden sein können.
  • Modifiziertes genetisches Material
  • Natürliche Nukleinsäuren die durch Modifikation in ihren Eigenschaften verändert wurden. Dabei können diese Modifikationen insbesondere chemische Veränderungen sein, die insbesondere das Phosphatgerüst, die Zucker oder Basen betreffen, was insbesondere die Stabilität der Nukleinsäuren gegen Nukleasen und Ribonukleasen erhöhen soll. Weiters können Moleküle (Labels) an die Nukleinsäuren kovalent oder nicht-kovalent angeheftet werden, die zu neuen Eigenschaften der Nukleinsäuren führen, insbesondere zu optischer Verfolgbarkeit durch Fluoreszenzlabels oder Labels, die die Nukleinsäuren zu einen bestimmen Ort in der Zelle dirigieren (Lokalisationselemente) oder Labels, die den Durchtritt von Nukleinsäuren durch Membranen vermitteln und so Nukleinsäuren beispielsweise zellgängig machen.
  • siRNA (short interfering RNA):
  • Kurze dsRNA (bis 28 bp) die durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines Proteins bewirken kann.
  • shRNA (short hairpin RNA):
  • Kurze ssRNA, die am 3'-Ende und am 5'-Ende komplementäre Bereiche besitzt und dadurch über Wasserstoffbrückenbindung hybridisieren und eine Haarnadelstruktur ausbilden kann. shRNA kann durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines Proteins bewirken.
  • Rezeptor:
  • Molekül, das in der Lage ist einen Stoff (Agonist) zu detektieren und damit eine biologische Reaktion auslöst, Insbesondere handelt es sich bei Rezeptoren um Proteine.
  • Blockierung:
  • Verhinderung der biologischen Funktion, insbesondere von Proteinen.
  • Unterdrückung:
  • Unterbrechung des Kommunikationsnetzes der Immunabwehr, d. h. von einer oder mehreren eine Immunantwort auslösenden Signaltransduktionskaskade(n), insbesondere der angeborenen intra- und/oder interzellulären Immunabwehr. Durch diese Unterbrechung wird die Immunabwehr geschwächt, wodurch sich die Immunantwort verringert.
  • DNA/RNA-bindende Domäne:
  • Bereich in einem Molekül das DNA kovalent oder über nicht kovalente Wechselwirkungen gebunden trägt, insbesondere sind die nicht kovalenten Wechselwirkungen elektrostatische Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen.
  • Signaltransduktionskaskade
  • Ausgehend von einem Rezeptor, der die Anwesenheit eines Stoffes durch Anlagerung dieses Stoffes an den Rezeptor detektiert, wird die Information über die Anwesenheit dieses Stoffes in ein Signal umgewandelt und über eine Kette von Molekülen durch Signaltransduktion weitergetragen. Am Ende steht eine biologische Reaktion. Insbesondere wird das durch den Rezeptor erzeugte Signal von Adaptermolekülen aufgenommen und insbesondere über Kinasen insbesondere an Transkriptionsfaktoren weitergetragen. Die Transkriptionsfaktoren stimulieren die Expression von Genen, die die biologische Reaktion vermitteln. Knock-down Abschwächung oder Ausschaltung der Translation einer mRNA zu einem Protein bei der Proteinbiosynthese.
  • Antikörper
  • Moleküle, insbesondere Proteine, die in der Lage sind molekulare Strukturen, insbesondere andere Proteine, zu erkennen und durch Bindung dessen biologische Wirkung beeinflussen.
  • Intrabodies
  • Intrazellular exprimierte Antikörper.
  • Aptamere
  • RNA-Moleküle, die durch Ausbildung einer Tertiärstruktur in der Lage sind molekulare Strukturen, insbesondere Proteine, ähnlich einem Antikörper zu erkennen und durch Bindung dessen biologische Wirkung beeinflussen. Aptamere können aus modifizierter oder unmodifizierter RNA oder DNA bestehen.
  • Antagonist
  • Substanz, die einen Agonisten durch Blockierung eines entsprechenden Rezeptors in seiner Wirkung hemmt, ohne selbst einen Effekt auszulösen.
  • Agonist
  • Ein Agonist ist in der Lage durch Bindung an einen Rezeptor eine biologische Wirkung zu erzielen.
  • Antivirale Zytokine
  • Zytokine, die bei einer Infektion einer eukariotischen Zelle mit Viren exprimiert werden. Beispiele sind Interferon alpha, Interferon beta, Interferon gamma, TNF alpha, TFN beta, Interleukin 6,8,15,28 und 29.
  • Inhibitoren
  • Moleküle, die die biologische Wirkung eines anderen Moleküls, insbesondere von Proteinen inhibieren können. Insbesondere sind die Inhibitoren selbst Proteine, modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren oder kleine organische Moleküle.
  • TLRs, RIG-I-Helikase, RIG-I-like Helikase
  • Rezeptoren die speziesübergreifend in Gruppen nach ihrer Funktion zusammengefasst werden.
  • Adaptermoleküle
  • Moleküle die ein Signal von Rezeptoren übernehmen und die speziesübergreifend in Gruppen nach ihrer Funktion zusammengefasst werden.
  • Glucocorticoidvorläufer
  • Eine Substanz die durch den natürlichen Stoffwechsel der Zellen in das eigentliche Glucocorticoid umgewandelt wird.
  • Abkürzungen
    • AP-1
      = Activated protein-1
      ERK
      = Extracellular-signal Regulated Kinase
      IkB
      = Inhibitory-binding protein kB
      IKK
      = IkappaBKinase = inhibitory-binding protein κB kinase
      IKKa
      = Ikkalpha = I Kappa Kalpha = IKK1
      IKKb
      = IKKbeta = I Kappa Kbeta = IKK2
      IKKd
      = IKKdelta = I Kappa Kdelta
      IKKe
      = IKKepsilon = I Kappa Kepsilon
      IKKg
      = IKK gamma = I Kappa Kgamma = IKK3
      IKKi
      = IKK epsilon
      IRAK1
      = Interleukin 1 Receptor-Associated Kinase 1
      IRAK4
      = interleukin-1 receptor-associated kinase 4
      IRF
      = Interferon regulating Factor
      JNK
      = c-Jun N-terminal Kinase
      JAK
      = Janus activated Kinaste
      Mal
      = TIRAP = MyD88-adapter-like
      MAPK
      = Mitogen activated Protein Kinase
      MEK
      = MAPK/ERK kinase
      MKK
      = MAP Kinase Kinase
      MKK
      = Mitogen-activated protein kinase kinase
      MSK
      = Mitogen and stress activated kinase
      MyD88
      = Myeloid differentiation factor 88
      NAP1
      = Nck-associated protein 1
      NEMO
      = IKK gamma
      NF-kB
      = Nuclear Factor kappaB
      P1
      3K = Phosphoinositol-3-Kinase
      PKR
      = Protein Kinase R = Protein Kinase RNA-activated
      PKB
      = Protein Kinase B
      PDK1
      = Phosphoinositide-dependend Protein Kinase 1
      PDK2
      = Phosphoinositide-dependend Protein Kinase 1
      Rac1
      = Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1
      RIP1
      = Receptor-interacting protein 1
      STAT
      = Signal Transducers and Activators of Transcription
      TAK1
      = Transforming growth factor-β-activated kinase
      TBK1
      = IKKd = TANK-binding Kinase
      TIRAP
      = Mal = Toll-interleukin 1 receptor (TIR) domain-containing adapter protein
      TRAF3
      = TNF receptor-associated factor 3
      TRAF6
      = TNF receptor-associated factor 6
      TRAM
      = TRIF-related adaptor molecule
      TRIF
      = Toll/IL-1 receptor domain–containing adaptor inducing interferon-b adaptor protein
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (50)

  1. Verfahren zur Verbesserung des Transfektionsergebnisses von nicht-viralen Genliefersystemen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Zellen vor und/oder bei der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt und bei der Transfektion genetisches Material, insbesondere modifizierte und/oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsRNA und/oder modifizierte und/oder unmodifizierte siRNA, in die Zellen einbringt; oder b) die Zellen vor und/oder bei und/oder nach der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt und bei der Transfektion modifizierte und/oder unmodifizierte siRNA in die Zellen einbringt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen bis zu 4 Tage, vorzugsweise bis zu 18 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden vor der Transfektion mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen gleichzeitig mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden und mit dem nicht-viralen Genliefersystem in Kontakt gebracht werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen bis zu 2 Tage, vorzugsweise bis zu 12 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden nach der Transfektion mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
  5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-virale Genliefersystem (i) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfasst; und/oder (ii) eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder (iii) auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion, Magnetofektion, Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruht.
  6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr einen Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonisten, Inhibitor und/oder eine siRNA umfasst.
  7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass durch Knock-down mit siRNA zumindest ein Gen ausgeschaltet wird, das für ein zur Signaltransduktion über TLR notwendiges Protein codiert.
  8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch die Aktivierung des Glucocorticoidrezeptors mit einem Glucocorticoid, einem Glucocorticoidrezeptor-Antagonisten, einem Glucocorticoidvorläufer oder Glucocorticoidrezeptor-Antagonistenvorläufer zumindest teilweise unterdrückt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Glucocorticoid, der Glucocorticoidvorläufer, Glucocorticoidrezeptor-Antagonist oder Glucocorticoidrezeptor-Antagonistenvorläufer Cortison, Cortisol, Cloprednol, Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon, Deflazacort, Flourcortolon, Triamcinolon, Dexamethason oder Betamethason ist.
  10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem aus der Gruppe TLR 1, TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7, TLR 8, TLR 9, TLR 10, TLR 11, TLR 12, TLR 13, CD14, CD38, RIG-I Helikase und RIG-I-like Helikase, insbesondere durch die Blockierung von mindestens einem aus der Gruppe TLR 1, TLR 2, TLR 4 und TLR 9, zumindest teilweise unterdrückt wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass TLR 9 mit mindestens einer modifizierten oder unmodifizierten DNA Sequenz, insbesondere mit der Basensequenz TTAGGG blockiert wird.
  12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Adaptermoleküle aus der Gruppe MyD88, TRIF, TIRAP, TRAM, TRAF6 oder TRAF3 zumindest teilweise unterdrückt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass (i) das Adaptermolekül Myd88 durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT oder Teilen desselben blockiert wird; und/oder (ii) das Adaptermolekül TRAF6 durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv DRQIKIWFQNRRMKWKKRKIPTEDEY oder Teilen desselben blockiert wird.
  14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einer Kinase aus der Gruppe IRF-Kinase TBK1, MAP Kinase, MAPK Kinase, MAPKK Kinase, MAPKKK Kinase, MEK1, MEK2, MEK5, MKK4/SEK, MKK5, MKK7, ERK1, ERK2, ERK3, ERK4, ERK5, ERK6, ERK7, ERK8, JAK, JNK1, JNK2, p38 MAP Kinase, RK, p38/RK MAP Kinase, p30/RK MAP Kinase, Phosphatidylinositol 3-Kinase, IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha, IKK-beta, IKKgamma, IKK delta, IKK epsilon, TAK1, PKB Kinase, PKD1, PKD2, MSK1 und PKR, insbesondere mindestens einer Kinase ausgewählt aus MAPKKK Kinase, MAPKK Kinase, MAPK Kinase, MAP Kinase, p38 MAP Kinase, MEK1, MEK2, JNK, ERK1 und ERK2, zumindest teilweise unterdrückt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass (i) die Kinase(n) p38 MAPK und/oder PKB durch 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol (SB203580) blockiert wird/werden; und/oder (ii) die Kinase(n) MEK1 und/oder MEK2 durch 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(oamionophenylmercapto)butadien (U0126) blockiert wird/werden; und/oder (iii) die Kinase JNK durch 1,9-Pyrazoloanthrone (SP600125) blockiert wird.
  16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Transkriptionsfaktor aus der Gruppe IRF1, IRF3, IRF7, IRF9, IRF2, IRF4, IRF5, IRF6, IRF8, STAT1, STAT2, NF-kB oder AP-1 zumindest teilweise unterdrückt wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Transkriptionsfaktor NF-kB durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv DRQIKIWFQNRRMKWKKVQRKRQKLM oder Teilen desselben blockiert wird.
  18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Zytokin zumindest teilweise unterdrückt wird.
  19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Tumornekrosefaktor zumindest teilweise unterdrückt wird.
  20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Interleukin zumindest teilweise unterdrückt wird.
  21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Interferon zumindest teilweise unterdrückt wird.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein Interferon des Typs I blockiert wird.
  23. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eines der Interferone aus der Gruppe Interferon-alpha, Interferon-beta, Interferon-gamma und Interferon-omega blockiert wird.
  24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 5 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Rezeptor aus der Gruppe der Zytokinrezeptoren, Interferonrezeptoren, insbesondere Rezeptoren für Interferone des Typs I, Interleukinrezeptoren und Tumornekrosefaktorrezeptoren zumindest teilweise unterdrückt wird.
  25. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Aktivierung der angeborenen Immunabwehr ein Agonist ist.
  26. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 und 25, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Agonisten für einen TL-Rezeptor, insbesondere durch mindestens einen Agonisten für TLR7 und/oder TLR8, zumindest teilweise aktiviert wird.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Agonist für TLR7 und/oder TLR8 ausgewählt wird aus der Gruppe, umfassend Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone), Imidazochinoline, Thiazolochinoline, Guanosinanaloga und ssRNA.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Agonist (i) Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine), Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1H-imidazo[4,5-c]quinoline-1-ethanol) oder Gardiquimod (1-(4-amino-2-ethylamino methylimidazo-[4,5-c]quinolin-1-yl)-2-methylpropan-2-ol) ist; oder (ii) CL075 oder CL097 ist; oder (iii) Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin) oder Isatoribine (7-Thia-8-oxoguanosin) ist; oder (iv) ssRNA mit U und/oder GU reichen Sequenzen ist, insbesondere ssRNA mit den Sequenzmotiven UGUGU und/oder GUCCUUCAA.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die ssRNA eine ssRNA mit Phosphothioatrückgrat ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass die ssRNA mindestens 15 Basen umfasst.
  31. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 sowie 25 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Agonisten für Rezeptoren von antiviralen Zytokinen, insbesondere durch Interferon-beta oder Interferon gamma, zumindest teilweise aktiviert wird.
  32. Zusammensetzung, die zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst: a) ein nicht-virales Genliefersystem, b) genetisches Material, und c) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr.
  33. Kit of Parts, der zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst: a) ein nicht-virales Genliefersystem, b) genetisches Material, und c) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr.
  34. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 oder 33, wobei das nicht-virale Genliefersystem a): (i) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfasst; und/oder (ii) eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann.
  35. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass das genetische Material b), insbesondere modifizierte oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNS und/oder modifizierte oder unmodifizierte siRNA umfasst.
  36. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass das in c) definierte Mittel zumindest einen aktivitätsmindernden oder aktivitätssteigernden Effektor umfasst.
  37. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass das in c) definierte Mittel einen Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonisten, Agonisten, Inhibitor und/oder eine siRNA umfasst.
  38. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonist, Inhibitor oder die siRNA zumindest eine Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems blockiert.
  39. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Agonist zumindest eine Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems aktiviert.
  40. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass das in c) definierte Mittel die Basensequenz TTAGGG umfasst.
  41. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass das in c) definierte Mittel genetisches Material umfasst, das einen Knock-down eines Proteins einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems bewirkt.
  42. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass das in c) definierte Mittel genetisches Material umfasst, das zur Expression eines Proteins führt, welches die Aktivität eines Proteins einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems blockiert.
  43. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass das in c) definierte Mittel zumindest ein Peptid: (i) DRQIKIWFQNRRMKWKKVQRKRQKLM; (ii) DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT; oder (iii) DRQIKIWFQNRRMKWKKRKIPTEDEY; oder (iv) eine Kombination aus mindestens zwei der Peptide (i) bis (iii); oder (v) ein Peptid, das mindestens in 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren identisch zu (i), (ii) oder (iii) ist; oder (vi) ein Peptid, das mindestens zu 80%, insbesondere mindestens zu 90% identisch ist zu (i), (ii), oder (iii); oder (vii) ein Peptid, das in mindestens 6, 7, 8 oder 9 von 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren identisch ist zu (i), (ii) oder (iii) umfasst.
  44. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass das in c) definierte Mittel: (i) Cortison, Cortisol, Cloprednol, Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon, Deflazacort, Flourcortolon, Triamcinolon, Dexamethason oder Betamethason oder ein anderes Glucocorticoid oder einen anderen Glucocorticoidrezeptoragonist oder einen anderen Glucocoriciodvorläufer oder einen anderen Glucocorticoidrezeptoragonisten-Vorläufer umfasst; und/oder (ii) 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol (SB203580) oder 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-amionophenylmercapto)butadien (U0126) umfasst; und/oder (iii) Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine), Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1H-imidazo[4,5-c]quinoline-1-ethanol) oder Gardiquimod (1-(4-amino-2-ethylamino methylimidazo-[4,5-c]quinolin-1-yl)-2-methylpropan-2-ol), CL075, CL097, Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin), Isatoribine (7-Thia-8- oxoguanosin), oder Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone) umfasst; und/oder (iv) eine modifizierte oder unmodifizierte ssRNA mit U und/oder GU reichen Sequenzen, insbesondere mit den Sequenzmotiven UGUGU und/oder GUCCUUCAA, und einer Länge von mindestens 15 Basen.
  45. Zusammensetzung oder Kit of Parts nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass das in c) definierte Mittel ein antivirales Zytokin, insbesondere Interferon beta oder Interferon gamma ist.
  46. Kit of Parts nach einem der Ansprüche 33 bis 45, wobei entweder: – alle Komponenten getrennt voneinander vorliegen, oder – die Komponenten a) und b) gemeinsam, oder – die Komponenten a) und c) gemeinsam, oder – die Komponenten b) und c) gemeinsam vorliegen.
  47. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 32 bis 45 umfasst.
  48. Pharmazeutischer Kit of Parts, der einen Kit of Parts nach einem der Ansprüche 33 bis 46 umfasst.
  49. Verwendung einer Zusammensetzung oder eines Kit of Parts nach einem der Ansprüche 32 bis 48 zur Behandlung einer Krankheit durch Gentherapie.
  50. Verwendung nach Anspruch 49, wobei es sich bei der Krankheit um cystische Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie, β-Thalassämie, Krebs, eine Viruserkrankung, eine Degeneration der Macula, Amyotropische Lateral-Sklerose und/oder eine Entzumndungserkrankung handelt.
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