EP2212425A2 - Verbesserung von transfektionsergebnissen nicht-viraler genliefersysteme durch beeinflussung des angeborenen immunsystems - Google Patents

Verbesserung von transfektionsergebnissen nicht-viraler genliefersysteme durch beeinflussung des angeborenen immunsystems

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EP2212425A2
EP2212425A2 EP08851432A EP08851432A EP2212425A2 EP 2212425 A2 EP2212425 A2 EP 2212425A2 EP 08851432 A EP08851432 A EP 08851432A EP 08851432 A EP08851432 A EP 08851432A EP 2212425 A2 EP2212425 A2 EP 2212425A2
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EP
European Patent Office
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tlr
transfection
receptor
cells
antibody
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08851432A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Roland KLÖSEL
Stefan König
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Biontex Laboratories GmbH
Original Assignee
Biontex Laboratories GmbH
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Publication date
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Priority claimed from DE102008016275A external-priority patent/DE102008016275A1/de
Priority claimed from DE102008023913A external-priority patent/DE102008023913A1/de
Application filed by Biontex Laboratories GmbH filed Critical Biontex Laboratories GmbH
Priority to EP11001260A priority Critical patent/EP2363494A1/de
Publication of EP2212425A2 publication Critical patent/EP2212425A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins

Definitions

  • Immune responses of the body (Luke A. et al., Spectrum of Science, August 2005, pages 68-75) against an infectious or immunological challenge differentiate between innate immunity and acquired immune response. ,
  • the acquired immune defense is trained only when an infection with pathogens. It has a kind of memory, so that in a second infection by the same pathogen usually no longer comes to the onset of the disease. Vaccines are based on this principle. If only the acquired immune defense were present, the organism would be completely unprotected before the first infection. However, this is not the case, as there is another very original immune defense called innate immune defense, found from the fly Drosophila to mammals, and even plants.
  • TLRs Toll-like receptors
  • RIG-I-like helicases RIG-I-like helicases
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • TLRs Toll-like receptors
  • Toll-like receptors were first discovered in the mid-1990s (Zimmer A. et al., PNAS, 1999; 96 (10), 5780-5785). The name is derived from a protein found in Drosophila Melanogaster by Christiane Nüsslein-Volhard, which you called "Toll.” TLR proteins are similar to this type and are referred to as "Toll-Iike" proteins.
  • LRR leucine-rich repeat domain
  • cytoplasmic domain homologous to that of the IL-1 R family, which selectively respond to different molecular viral and bacterial components and direct gene activation via a signal transduction cascade
  • adapter molecules and, subsequently, kinases that ultimately activate transcription factors eg NF-kB and the IRF families
  • Cytokines are once again necessary stimulators of the acquired immune defense and thus also a link between innate and acquired immune defense, although the principles of ligand recognition, signal transduction and signal transduction are still in the offing understood.
  • TLRs 13 different TLRs are known (10 of them in humans), whose number is sufficient for the detection of all pathogens, ranging from bacteria to fungi to the virus.
  • the receptors recognize all the pathogens common structures, and sometimes also several components at the same time, without these structurally similar.
  • the TLR4 recognizes lipopolysaccharides, but also taxol. So far it is not known how the TLRs can do that.
  • the TLRs differ little from species to species.
  • TLR1 forms a heterodimer with TLR2, is the receptor of triacylated lipoprotein and yeast zymosan.
  • TLR2 is the receptor for certain peptidoglycans, lipopeptides, glycolipids and various bacteria.
  • TLR3 Detects long dsRNA, as occurs in virus replication in infected cells.
  • TLR4 is the receptor for lipopolysaccharides (LPS, also endotoxins), various envelope glycoproteins (also of viruses) and taxol.
  • LPS lipopolysaccharides
  • TLR4 receptor requires an additional membrane-bound protein (TLR assisting protein) for its function.
  • CD14 binds eg. the LPS and deliver it to the TLR4 receptor. Binding to CD14 alone does not trigger a signal transduction cascade.
  • TLR5 is the receptor of flagellin, a major constituent of hostages (flagellae), with which bacteria move.
  • TLR6 forms a heterodimer with TLR2, is the receptor of diacylated lipoprotein and certain peptidoglycans.
  • CD36 membrane-bound protein CD36
  • TLR7 & TLR8 are receptors for imidazoquinolines and ssRNA / dsRNA, e.g. of RNA viruses.
  • TLR9 is the receptor for bacterial DNA, or for non-methylated CpG motifs that accumulates in bacterial DNA (20 times more abundant than in mammalian cells). The CpG motif is highly methylated in mammalian cells, allowing it to be distinguished. Similar to bacterial DNA also applies to viral DNA, which is also detected by TLR9. About the immunostimulatory property of bacterial DNA reported in the early 80s, the group around Dr. med. Tokunaga. As an associated receptor was from the group around Dr. med. Shizuo Akira identified the TLR9 receptor (elucidation of the roles of Toll receptors and their signal transduction cascades by gene targeting, Robert Koch Lecture by Dr. Shizuo Akira, General Press Release 2002, www.robert-koch.stattung.de).
  • TLR2 4, 5 and 6 are located in particular in the plasma membranes of monocytes, natural killer cells, mast cells or myotonic dendritic cells., 7, 8, and 9 are particularly in endosomes of immune cells (Siegmund-Schultze N., www.aeticianblatt.de ). Activation of the immune response therefore requires intracellular uptake via endocytosis and maturation of the endosomes. Signal transmission begins here in an endosomal compartment. For TLR 3 there is evidence that it is in the plasma membranes, but there are also representations in the literature that assume endosomal localization. TLRs often act in pairs and occur in different combinations of different cell types.
  • TLR3 The signal transduction pathways of the different TLRs (Perry AK et al; Cell Research 2005; 15 (6); 407-422 and Kawai T. et al., J. Biochem; 2007; 141; 137-145) are in part similar, but suggest There are also larger differences, so that in the end different gene expression and thus different biological reactions occur. With the exception of TLR3, all TLRs pass their signal to the adapter protein MyD88. MyD88 plays a critical role in signal transduction via the TLR / interleukin-1 receptor. The cytosolic domain of TLRs is highly similar to that of the interleukin-1 receptor and is therefore also referred to as the Toll / IR-1 Receptor Domain (TIR).
  • TIR Toll / IR-1 Receptor Domain
  • MyD88-deficient splenocytes showed e.g. no reactions to interleukin-1, LPS or CpG DNA.
  • signaling molecules such as NF-kB or MAP kinases was observed in MyD88 deficient cells in response to TLR2, TLR7, TLR9 ligands. This is a clear indication of the complete dependency of the TLRs (except TLR3) of MyD88 for their signal forwarding.
  • Other adapter molecules are e.g.
  • TIRAP Toll Interleukin-i Receptor domain-containing adapter protein (TLR1, TLR2, TLR4 and TLR6), Mal (MyD88 adapter-like), TRIF (TLR3 and TLR4) and TRAM (TLR4).
  • a signal transduction cascade usually begins with a receptor on the cell surface with a cytosolic domain that, when mapped to a suitable ligand, transduces its signal through cytosolic adapter molecules to kinases that activate cascade transcription factors.
  • the activated transcription factors localize in the nucleus and trigger the expression of proteins, mostly cytokines.
  • TLR1 / TLR2, TLR2 / TLR2, TLR2 / TLR6 The receptors that occur in corresponding pairs trigger the same signal transduction cascades when occupied with suitable ligands.
  • the transcription factors NF-kB and AP-1 are activated, leading in particular to the expression of cytokines.
  • the adapter molecules RAC-1, TIRAP, MyD88 and TRAF6 are involved in the signal transmission.
  • the kinases involved are at least IRAK1, IRAK4, TAK1, PI3K, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK and MKKs.
  • the receptor requires the membrane-bound protein CD14 for its full function.
  • CD14 binds appropriate agonists and leads you to the receptor. This triggers the activation of the transcription factors NF-kB, AP-1, IRF3 and IRF7 in the assignment with suitable ligands and in turn leads in particular to the expression of cytokines.
  • the adapter molecules TIRAP, MyD88, TRAM, TRIF, TRAF3, TRAF6, NAP1 and RIP1 are involved in the signal transmission.
  • the kinases involved are at least IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, IKKepsilon, TBK1, ERK1, ERK2, JNK, p38 MAPK, MEK1, MEK2 and MKKs.
  • the receptor ultimately solves the activation of the transcription factors NF-kB and AP-1, which lead in particular to the expression of cytokines.
  • the adapter molecules MyD88 and TRAF6 are involved in the signal transmission.
  • the kinases involved are at least IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK and MKKs.
  • the receptors finally resolve the activation of the transcription factors NF-kB and AP-1, which lead in particular to the expression of cytokines in the assignment with suitable ligands.
  • the adapter molecules MyD88 and TRAF6 are involved in the signal transmission.
  • the receptor triggers the activation of the transcription factors NF-kB, AP-1, IRF3 and IRF7 in the assignment with suitable ligands, in turn, in particular, cytokines are increasingly expressed.
  • the adapter molecules TRIF 1 TRAF6, TRAF3, NAP1 and RIP1 are involved in the signal transmission.
  • As kinases at least IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, IKKepsilon, TBK1, PKR, PI K3, JNK, p38 MAPK and MKKs are involved.
  • the receptors in the assignment with suitable ligands ultimately trigger the activation of the transcription factors NF-kB, AP-1, IRF1, IRF5 and IRF7, again in particular cytokines are increasingly expressed ..
  • the adapter molecules MyD88, TRAF6 and TRAF3 involved.
  • IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK and MKKs are involved.
  • TLRs are of great therapeutic interest.
  • TLR agonists are used e.g. used as an adjuvant in vaccination strategies or in cancer therapy. Examples are the treatment of basal cell carcinoma by the TLR7 / 8 agonist imiquimod / resiquimod or bladder cancer by a TLR2 agonist.
  • the TLR9 receptor is driven by a synthetic CpG-containing oligonucleotide (CpG 7909 and CpG 10101) for the treatment of autoimmune diseases, cancer and infectious diseases.
  • CpG 7909 and CpG 10101 synthetic CpG-containing oligonucleotide
  • TLR7 and TLR8 receptors are generally immidazoquinolines (Schoen et al., Oncogene, 2008, 27, 190-199), such as imiquimod (R837, 1- (2-methylpropyl) -1H-imidazole [4, 5-c] quinoline-4-amine), resiquimod (R848, 4-amino-2- (ethoxymethyl) - ⁇ , ⁇ -dimethyl-1H-imidazo [4,5-c] quinoline-1-ethanol) and gardiquimod (1- (4-amino-2-ethylamino-methyl-imidazo [4,5-c] quinolin-1-yl) -2-methyl-propan-2-ol),
  • Guanosine analogs such as. Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosine) and others such as. Bropyrimines (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinones).
  • Other immidazoquinolines have been described in the literature (Miller et al Drug News & Perspectives, 2008, 21 (2), 69-87; Gorden et al., J. Immunol., 2005, 174, 1259-1268; Jurk et al. , Eur. J. Immunol., 36, 1815-1826; 2006; Gorden et al., J.
  • ssRNA especially single stranded poly-uridine and ssRNA with U or GU rich sequences
  • the ssRNA can also be present as phosphothioate. Particular mention should be made of the sequence motifs UGUGU and GUCCUUCAA (Hornung et al., Nat. Med., 2005, 11, 263-270, Judge et al., Nat.
  • ssRNA are stimulating from a length of 16bp.
  • the ssRNAs must be transported into the endosomes to reach the TLR8. In general, this is done with the usual transfection reagents.
  • the company InvivoGen offers a ssRNA40 complexed with a cationic lipid (Lyovec) as a TLR8 agonist.
  • TLRs react with decay products of the body's own cells and thus cause the immune system to fail.
  • the TLRs are even suspected to be causally related to cardiovascular disease. Inflammatory reactions in the heart can contribute to the formation of atherosclerotic plaques, which can ultimately lead to an infarct by vascular occlusion.
  • Cytokines are multifunctional signaling substances. These are sugary proteins that have a regulatory function for the growth and differentiation of body cells. Some of them are therefore also referred to as growth factors. Many cytokines also play an important role in immunological reactions and are therefore also called mediators. Cytokines are released from the cells into the surrounding medium by secretion and stimulate other cells if they have an appropriate receptor. There are five main groups of cytokines:
  • Interferons instruct cells to produce proteins that complicate or prevent viral infection. Also, interferons may have antitumoral activity.
  • Interleukins serve in particular the communication of immune defense cells with one another and thereby increase the coordination in the defense of pathogens and the fight against tumors
  • Colony stimulating factors are formed in the kidney. These are growth factors for blood cells
  • TNF Tumor Necrosis Factors
  • TNFs The most important function of TNFs is to regulate the activity of different immune cells. They are mainly released by macrophages. TNFs can stimulate cell death (apoptosis), cell proliferation, cell differentiation and release of other cytokines.
  • Chemokines are chemoattractants that cause cells with matching receptors to migrate through chemotaxis to the source of chemokines
  • interferons IFN
  • the first interferon of this type was found by Isaacs and Lindemann in 1957 (Isaacs, A. et al., J. Proc Lond B. Biol., 147, 258-267). The name comes from the fact that this protein interferes with the replication of viruses.
  • Type I interferons are key cytokines that elicit antiviral cell responses, establish "antiviral status,” and stimulate immune system cells to produce an antiviral response that binds to a receptor known as the IFN-alpha receptor (IFNAR)
  • IFN-alpha receptor IFN-alpha receptor
  • IFN-alpha receptor IFN-alpha receptor
  • IFN-beta IFN-kappa
  • IFN-delta IFN-epsilon
  • IFN-tau IFN-omega
  • IFN-zeta IFN-alpha receptor
  • IFN-beta proteins two are described. These are IFNB1 and IFNB3. A protein described as IFNB2 could later be identified as a known interleukin.
  • the so-called JAK / STAT pathway After binding to the interferon stimulated gene factor 3 (ISGF3), which is located in the outer cell membrane, the interferon stimulated gene factor 3, a heterotrimer of the transcription factors STAT1, STAT2 and " IFN regulatory factor 9 (IRF9), which migrates into the nucleus and induces the transcription of hundreds of effector molecules (known as IFN inducible genes), which directly influence protein synthesis, cell growth, and survival in the process of establishing the so-called "Antiviral status" (antiviral state). In this status, the infectivity of the viruses, e.g. prevented or at least reduced by reduced replication rates.
  • ISGF3 interferon stimulated gene factor 3
  • IRF9 IFN regulatory factor 9
  • the adaptive immune system is activated by triggering the maturation of dendritic cells, activating the B cell antibody response, and the T cell response. Lymphocytes and monocytes are recruited to the site of infection by induced chemokines.
  • Stress can also trigger signal transduction pathways leading to antiviral status. These signal transduction cascades cross the signal transduction cascades of the TLR.
  • Cellular stress can be triggered by:
  • inflammation biological and chemical agents eg TNFalpha, chemotherapeutic agents
  • the cells respond to stress with complex changes in signal chain activity involving specific MEK, MSK and MAP kinases and various transcription factors (eg NF-kB), apoptosis regulators and cell cycle regulators.
  • GTP-binding proteins (Ras / Rho family) bound to the membrane play a special role in the cell's response to cellular stress.
  • the innate immune response occurs both intracellularly and intercellularly.
  • a cell affected by contact with a pathogen triggers signal transduction cascades via PRRs, such as TLRs and RLHs, thereby altering the physiological status and expression profile of the cell.
  • PRRs such as TLRs and RLHs
  • the intercellular response is different from the intracellular response by the different receptors and agonists. Cytokine receptors at the intercellular response and PRRs at the intracellular response act as receptors.
  • the agonists of the intercellular response are cytokines and in the intracellular response the agonists are pathogenic patterns.
  • Transfection ie the introduction of genetic material into eukaryotic cells, especially mammalian cells, is today a method that has become indispensable in modern research (Domb AJ, Review in Molecules, 2005; 10; 34 and Xiang G; Keun- Sik K .; Dexi L., Review in The AAPS Journal; 2007; 9 (1) Article 9; http://www.aapsj.org). Without this method, elucidating the function of different genes would be essential difficult. Not to be forgotten is the possibility to faithfully produce proteins of eukaryotic origin, as the correct posttranslational modification by the eukaryotic cells, unlike previously used prokaryotic cells, is ensured.
  • viruses as carrier systems. Since the introduction of DNA or RNA into foreign cells is an integral part of the multiplication cycle of the viruses, this ability has been refined by a natural, evolutionary process in the history of the virus to such an extent that to date there are no more effective gene carriers.
  • the naturally occurring viruses are genetically engineered to lose their ability to reproduce and be pathogenic, yet infect a cell with recombinant genetic material. Because viruses, except for genetic material, consist essentially of proteins, they offer the immune system a large attack surface. The immune system has developed strategies to resist these invaders in an evolutionary adjustment process. Therefore, the body's immune response is cited as a particularly significant factor in failed gene therapy studies.
  • the currently available gene delivery methods can be divided into the two main groups of viral systems and non-viral systems.
  • the non-viral systems can in turn be differentiated into chemical and physical methods.
  • those which are based on cationic lipids (so-called lipofection) or cationic polymers (so-called polyfection) are particularly worth mentioning. Their efficiency is usually far behind the viral systems.
  • Well-known cationic polymers are, for example, poly-L-lysine (PLL), (EP 388758) polyethylenimine (PEI), (JP Behr et al., Proc. Natl. Acad., See, USA; 1995; 92; 7297; WO 9602655). , Diethylaminoethyldextran (DEAE), (SC De Smedt et al, Phar Res, 2000, 17, 113), Starburst Dendrimers (PAMAM), (FC Szoka et al, Bioconjug Chem, 1996; 7; 703; WO 9502397), chitosan derivatives (W.Gu Liu, Li et al, J.
  • cationic lipids are, for example, DOTMA (US 4946787), DOTAP (Leventis et al., Biochim., Biophys., Acta, 1990, 1023, 124), DOGS (EP 394111 ), DOSPA (WO 9405624), DOSPER (WO 97002419), DMRIE (US 5264618) or DC-Chol (Huang et al; Biochem Biophys Res Commun, 1991; 179; 280; WO 9640067).
  • Such or similar lipids are usually formulated in ethanolic aqueous buffer solutions as micelles or liposomes.
  • colipids e.g., DOPE
  • lipids are usually formulated in ethanolic aqueous buffer solutions as micelles or liposomes.
  • colipids e.g., DOPE
  • they are commercially available as reagents, such as Lipofectin, Lipofectamin, Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Fugene (Roche), Effectene (Qiagen), Transfectam (Promega), Metafectene (Biontex) etc. available.
  • Cationic lipids and cationic polymers spontaneously form so-called lipoplexes or polyplexes in the presence of DNA or RNA due to the opposing charge ratios.
  • the DNA is condensed by the compensation of the negative charge on the phosphate radical, so minimized in size.
  • the transfection efficiency of lipoplexes or polyplexes depends on a variety of parameters. The most important are the quantitative ratio of genetic material to cationic component in the production of the lipo / polyplexes, ionic strength during the preparation of the lipo / polyplexes, absolute amount of lipo / polyplexes per cell, cell type, proliferation state of the cells, physiological status of the cells, cell division rate, Incubation time, etc. These influence parameters are an expression of a complicated Trans Stammionsholds, in which the lipo / polyplexes or the genetic material contained must overcome a variety of cellular barriers.
  • the first barrier is the outer negatively charged cell membrane. It is believed that transfection-active lipoplexes, which must have a net positive charge, enter the interior of the cell by adsorptive endocytosis or liquid phase endocytosis.
  • endocytosis which is an active transport process of the cell, material is encased on the cell surface with cell membrane and intemalized as a vesicle (endosome).
  • lysosomes which contain a complex mixture of enzymes, the substances contained in the endosomes are broken down. Because of the low pH required for this degradation, endosomes have proton pumps that pump protons into the endosomes until a proper pH is achieved. To maintain charge neutrality, chloride ions flow into the endosomes to the same extent.
  • DNA can not enter the cell nucleus, which is called the "nuclear barrier," but it arrives at its site of action during cell division, resulting in the expression of proteins.
  • Other non-viral methods based on chemical methods include systems carrying a DNA-binding moiety and a ligand capable of triggering receptor-mediated endocytosis (for example, transferinfection, Wagner et al., Proc. Natl. Acad. 1990, 87, 3410).
  • RNA and / or RNA-binding domains consist of a DNA and / or RNA-binding domain, as well as a ligand that can trigger membrane transfer; e.g. Penetratin, Derossi et al .; Trends in Cell Biology; 1998; 8th ; 84 or HIV Tat Petid, Gratton et al .; Nature Medicine; 2003; 9 (3); 357.
  • membrane transfer is meant that a molecule can pass from one side of the membrane to the other side.
  • Suitable DNA and / or RNA-binding domains are all structural elements of a compound capable of binding DNA and / or RNA via electrostatic interactions (eg, cations) or hydrogen bonds (eg, peptide nucleic acids, PNAs).
  • Intercalating compounds eg acridine
  • the compounds which can induce receptor-mediated endocytosis or membrane transfer can also be covalently bound to the genetic material, if the biological effect is not or only little affected.
  • the most important example of a non-viral method based on a physical process is electroporation.
  • the cells to be transfected are placed between two electrodes, to which a typical voltage profile is applied.
  • the cells are exposed to an intense electrical impulse (pulse), which leads to a reversible opening (pores) of the cell membrane.
  • pulse ie voltage curve
  • the pulse ie voltage curve as one of the most important success parameters must be optimized for each cell type.
  • electroporators eg, Eppendorf / Multiporator, US 6008038, Biorad / Genpulser, US 4750100, Genetronics Inc., US 5869326, BTX / ECM series
  • electroporators eg, Eppendorf / Multiporator, US 6008038, Biorad / Genpulser, US 4750100, Genetronics Inc., US 5869326, BTX / ECM series
  • the cells are suspended in an electroporation buffer, transferred to an electroporated electroporation cuvette along with the DNA / RNA to be transfected, and exposed to one or more pulses.
  • other important parameters are the nature of the buffer, the temperature, the cell concentration and the DNA concentration. After the cells are exposed to the pulse they are left to regenerate the cell membrane for a short time. Subsequently, the cells are sown in a culture vessel and cultivated as usual.
  • Other physical methods include microinjection, hydrodynamic methods, ballistic methods (Genegun) or methods that use ultrasound or the injection of naked DNA into various organs, which leads to low expression of the corresponding genes.
  • magnetofection which uses DNA-binding molecules on magnetic nanoparticles to enrich DNA on the surface of cells via a magnetic field gradient and to trigger endocytosis
  • the innate immune system of eukaryotes may present a significant barrier to non-viral gene delivery systems.
  • the reason is that the eukaryotic innate immune system is able to recognize foreign genetic material via Toll Like receptors and initiate signal transduction cascades that trigger an antiviral state of cell populations.
  • Such an antiviral state of a cell also provides a barrier to transfection with a non-viral gene delivery system that is difficult or impossible to overcome.
  • genes can be selectively switched off if the mRNA has a sequence homology to the introduced dsRNA.
  • RNA interference Fire et al., Nature, 1998, 391, 806-8111 and usually proceeds as follows. An inserted into the cell dsRNA with homologous RNA interference (Fire et al., Nature, 1998, 391, 806-811) and usually proceeds as follows. An inserted into the cell dsRNA with homologous RNA interference (Fire et al., Nature, 1998, 391, 806-811) and usually proceeds as follows. An inserted into the cell dsRNA with homologous
  • the sequence of a cell-specific mRNA is converted by the enzyme Dicer into many small dsRNA
  • Dicer is an ATP-dependent ribonuclease.
  • the resulting nucleotide fragments have at the 3 'end 2-3 nucleotides, which survive.
  • the small pieces of RNA are called "small interfering RNA” (siRNA) (Elbashir et al., Nature, 2001, 411, 494-498).
  • RNA interference RNA interference
  • RNA interference is found in protozoa, fungi, plants and animals, although the individual mechanisms differ slightly. Archaebacteria and prokaryotes do not have this ability.
  • RNA viruses serve to repel RNA viruses.
  • virus-infected plants can recover, and newly developed leaves weaken the symptoms. Symptom-free leaves can no longer be infected with related viruses.
  • Complementary copies of the invading virus or RNA are used to serve as a template for the synthesis of the original RNA. It forms virus-specific dsRNA, which triggers the PTGS mechanism. Since initially the concentration of dsRNA is too low, the plant can only gradually recover and gain control of the viruses. It is thought that a cell-specific RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) recognizes the single-stranded viral genome, converts it into dsRNA and then starts the RNAi process.
  • RdRP cell-specific RNA-dependent RNA polymerase
  • RNA interference has gained immense importance in recent years because it offers the possibility of eliminating unwanted genes or proteins and thus of combating viral and other diseases. Furthermore, it has also become an indispensable tool in the discovery of gene-function relationships.
  • RNA interference is the transfection of synthetically produced siRNA molecules, ie double-stranded RNA with a 3'-overhang of 2-3 nucleotides.
  • siRNA molecules ie double-stranded RNA with a 3'-overhang of 2-3 nucleotides.
  • more than 30bp of introduced dsRNA causes enzymatic destruction of all mRNAs and stops protein synthesis (Kaufmann, Proc Natl Acad., USA, 1999, 96, 11693-11695).
  • some higher eukaryotes can react with the production of interferons, which can inhibit the expression of viral genes and direct the cell into apoptosis.
  • the length of the siRNA must be below 30 bp for mammalian cells (Tuschl et al., Genes Dev., 2001, 15, 188-200).
  • transfection methods known from the DNA transfection methods are available. The difference to DNA transfection consists only in the site of action of the introduced genetic material. This is the core of DNA transfection. In siRNA transfection it is the cytosol.
  • reagents suitable for siRNA transfection are commercially available. Examples are interferon (Polyplus), X-treme genes siRNA (Roche), siPort (Ambion), Silentfect (Biorad), Dharmafect (Dharmacon) and Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen).
  • siRNA transfection the relative knockdown of a protein or a gene compared to an untreated sample or with a non-specific siRNA (siRNA without target) transfected sample.
  • a problem in siRNA transfection is so-called OFF-target effects. This includes, for example, the unimpaired impairment of the expression of a gene that is not the target of knockdown. This can eg. come in sequence similarities.
  • OFF-target effects This includes, for example, the unimpaired impairment of the expression of a gene that is not the target of knockdown. This can eg. come in sequence similarities.
  • a requirement for potential siRNA transfection systems is to achieve the highest possible knockdown with the lowest possible amount of siRNA used.
  • Another preferred requirement, particularly for in vivo applications is to change the expression profile of the cells as little as possible, apart from the expression of the target protein.
  • the object of the invention is to provide a method which allows a more efficient transfection. This applies both to a simple transfection and to a repeated, ie at least two or more transfections. Furthermore, the task is to influence the physiological status of the cell population as little as possible, ie Ideally, the protein expression profile of the cell population should only change with respect to proteins whose genes have been introduced into the cell or whose expression is reduced or blocked by the introduced genetic material. In the case of transfection of siRNA, however, it may also be advantageous to purposely alter the physiological status of the cell in order to bring the cells into an "antiviral status", since RNA interference is particularly efficient here
  • a kit of parts is provided containing the components for performing more efficient transfection of eukaryotic cells with non-viral gene delivery systems.
  • This object is achieved by a method for improving the transfection of non-viral gene delivery systems, characterized in that
  • the method according to the invention for improving the transfection result can be carried out in vitro and / or in vivo.
  • the transfection result can be improved and / or unwanted changes in the expression profile of a transfected cell can be avoided.
  • the signal transmission through messenger substances between the cells can be interrupted. Since these are all proteins, preferably activity-increasing or activity-reducing effectors such as antibodies, aptamers, antagonists or inhibitors against these proteins are used according to the invention.
  • the corresponding active ingredients can be spent as such or with appropriate auxiliary molecules on or in the cells, depending on cell permeability or destination.
  • drugs can be delivered to the endosomes via liposomal carriers.
  • the target site is the cytosol
  • electroporation or special peptide sequences capable of permeabilizing the cell walls are particularly preferred.
  • the active ingredients are peptides or proteins, then according to the invention they can also be formed intracellularly by transfection of suitable genetic material and, if necessary, be directed with localization sequences to the corresponding cell compartments. If one wishes to shut down siRNA genes which code for crucial proteins of the sign transduction apparatus, the known transfection systems are available according to the invention.
  • the method according to the invention or the use according to the invention can be used or take place both in vitro and in vivo. It may be used to prevent or even prevent the formation of "antiviral status" of cells during transfection, as the cells may also be associated with biological material, such as serum or trypsin, which may contain substances during cultivation If one or more TLRs (eg, DNA, RNA, LPS, etc.) are responsive, then cells may already be in an antiviral state before transfection is started, and considering this background, it becomes clear why The quality of transfection results strongly depends on the initial immunological state of the cells, which in turn depends on the pretreatment (eg subcultivation).
  • TLRs eg, DNA, RNA, LPS, etc.
  • the non-viral gene delivery system may comprise a cationic lipid, a cationic polymer, or a cationic protein; and / or comprise a compound having a DNA and / or RNA-binding domain capable of inducing receptor-mediated endocytosis or membrane transfer; and / or include a compound covalently linked to DNA and / or RNA capable of inducing receptor-mediated endocytosis or membrane transfer; and / or on a physical method such as electroporation, microinjection, magnetofection, ultrasound or a ballistic or hydrodynamic method.
  • transfection may be performed at least twice, i. two or more times (3, 4, 5, 6, etc.).
  • a cationic lipid may preferably be present in the non-viral gene delivery system, in particular a cationic lipid according to formula (I):
  • R 2 and R 3 independently of one another are dodecyl, dodecenyl, tetradecyl, tetradecenyl, hexadecyl, hexadecenyl, octadecyl, octadecenyl or other alkyl radicals which in all possible combinations may be saturated, unsaturated, branched, unbranched, fluorinated or non-fluorinated, and from 5 to 30 carbon atoms can be constructed;
  • R 2 and R 3 independently of one another, are dodecyl, dodecenyl, te
  • the innate intracellular and / or intercellular immune defense can be blocked by at least one antibody, intrabody, aptamer, antagonist, inhibitor and / or an siRNA which blocks the transmission of an intracellular and / or intercellular signal of the innate immune defense (en ), at least partially suppressed.
  • en an intracellular and / or intercellular signal of the innate immune defense
  • Corresponding antibodies, intrabodies, aptamers, antagonists and inhibitors are commercially available.
  • siRNA short hairpin RNA
  • TLRs TLRs
  • kinases transcription factors
  • transcription factors are partially commercially available (Imgenex / Invivogen).
  • TLR 1, TLR 2, TLR 4 and / or TLR 9 TLR 10, TLR 11, TLR 12, TLR 13, CD14, CD38, RIG-I helicase and / or RIG-I-like helicase.
  • antibodies are suitable which are able to block the TL receptors.
  • antibodies against the Toll Like receptors TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 and CD14 are known and commercially available.
  • Antibodies capable of blocking TLR can be channeled into the endosomes to block the receptors. As a rule, however, an addition to the extracellular space is sufficient.
  • the choice of the receptor to be blocked also depends on the nature of the genetic material to be transfected.
  • the transfecting agent can also determine the choice of the receptor to be blocked.
  • the TLRs that detect genetic material i. TLR 3, TLR 7, TLR 8 and TLR 9 are usually located in the endosomes. The remaining TLR sit on the plasma membrane. If one wants to transfect DNA, for example, TLR 9 can preferably be blocked. If the DNA is of bacterial origin, it is preferable to block TLR 9, TLR 4 and / or TLR 5 in addition to TLR.
  • an antibody concentration of 0.01-100 ⁇ g / ml is used by addition to the culture medium.
  • the concentration of the antibody is 0.01-1 ⁇ g / ml of culture medium and in the most preferred embodiment 0.01-5 ⁇ g / ml.
  • the antibody may also be incorporated into the transfection-active complex, e.g. Lipoplex, integrated.
  • the ratio of antibody: genetic material is from 0.01: 1 ( ⁇ g / ⁇ g) to 10: 1 ( ⁇ g / ⁇ g).
  • the amount is 0.01-1 ⁇ g / ⁇ g and in the most preferred embodiment 0.01-0.3 ⁇ g / ⁇ g genetic material.
  • the antibody or antibodies used must / must generally be directed against the target molecule to be blocked, eg. a receptor such as a TLR, cytokine receptor, interferon receptor, etc. of the cells to be transfected.
  • a receptor such as a TLR, cytokine receptor, interferon receptor, etc.
  • the antibody must typically target the human TLR receptor that is to be blocked.
  • the antibodies are because of the high similarity of the target molecules from different species, eg.
  • TLRs also cross-reactive; that is, although an antibody to a target molecule has been developed by one species, it also exhibits its properties against a similar target molecule from another species.
  • antibodies from cells are preferred of the same species to be transfected, since in this case they are little or not immunogenic.
  • the antibodies may also have been produced recombinantly.
  • the antibodies used may be polyclonal or monoclonal, with monoclonal antibodies being preferred, or a modified antibody may be used, for example
  • a modified antibody may lack the Fc fragment because binding to the target molecule / antigen is solely through the Fab fragments
  • a modified antibody may also be modified with hydrophobic groups such as lipids to facilitate its anchoring in membranes and antigens If it is desired to detect the antibody used more easily, it can also be labeled with a fluorescent dye, or several modifications can be made to an antibody forbid such as certain preservatives.
  • the kinase MEK1 and / or MEK2 can be inhibited by a compound which has an IC50 value of less than 100 nM. Furthermore, according to the invention, the kinase MEK1 and / or MEK2 can be blocked by 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (o-amionophenylmercapto) butadiene (U0126). In a preferred embodiment, a concentration of 1-500 ⁇ M is used. In a still more preferred embodiment, the concentration is 1-100 ⁇ M, and in the most preferred embodiment 1-30 ⁇ M.
  • Interferon to be blocked is an interferon of type I, in particular at least one of the interferons, selected from interferon-alpha, interferonbeta, interferon-gamma or interferon-omega.
  • interleukin-1 is considered as the interleukin to be blocked.
  • At least one receptor for cytokines can be blocked, in particular at least one receptor for interferons, in particular of type I, at least one receptor for interleukins, and / or at least one receptor for tumor necrosis factors.
  • the receptor for interleukin-1 may be blocked by an antibody or an antagonist such as IL-ra (Human Interleukin-1 Receptor Antagonist, Biomol, Cat. No .: 54592).
  • IL-ra Human Interleukin-1 Receptor Antagonist, Biomol, Cat. No .: 54592
  • Another preferred target is the interferon-gamma receptor.
  • the antagonist (s) used must generally be active against the target molecule to be blocked, eg. a receptor such as an interleukin receptor, cytokine receptor, interferon receptor, etc. that targets cells to be transfected.
  • a receptor such as an interleukin receptor, cytokine receptor, interferon receptor, etc. that targets cells to be transfected.
  • the antagonist will usually have to target the human receptor that is to be blocked.
  • the antagonists are because of the great similarity of the target molecules from different species, eg. TLRs, also cross-reactive; i.e.
  • an antagonist has been developed against a target molecule from one species, it also exhibits its properties against a similar target molecule from another species.
  • antagonists from cells of the same species to be transfected are preferably used, since they are little or not immunogenic in this case.
  • the antagonists may also have been produced recombinantly or synthetically.
  • the antagonist used binds high affinity to its target molecule.
  • Antagonists used according to the invention may also be modified; analogous to the modified antibodies.
  • a preferred embodiment of the invention several of the aforementioned receptors and / or proteins involved in the signal transduction cascade to induce innate intracellular and / or intercellular immune defense are blocked.
  • several antibodies to TLR receptors can be combined to to use additive effects and / or synergy effects.
  • inhibitors and / or antibodies, and / or intrabodies, and / or aptamers, and / or antagonists, and / or siRNA against TLR-receptors and / or TLR-assisting proteins and / or adapter molecules and / or kinases and / or Transcription factors and / or cytokines and / or cytokine receptors are combined to at least partially interrupt the innate immune signal transduction cascade.
  • the method of the invention can be further used to improve the transfection results of siRNA transfections with non-viral gene delivery systems in a number of ways.
  • the siRNA may be modified or unmodified.
  • an agonist in the method according to the invention, can be used as a means for activating the innate immune defense.
  • the method according to the invention can be used to activate the RNA interference machinery by stimulating the intracellular part of the innate immune system. Activation is achieved by occupying various TLR receptors with appropriate agonists, but especially by occupancy (and thus activation) of the receptors TLR7 and TLR8.
  • the receptors TLR7 and TLR8 are located in the endosomes and detect ssRNA as expected in the case of an infection of an RNA virus. The activation of these receptors leads to a particularly strong "antiviral status" to which an active RNA interference machinery can be assigned. The assumption that RNA interference is a mechanism for the defense against viruses fits easily into the overall picture.
  • Improving the transfection results of siRNA transfections differs from the transfection with other genetic material in that, for good transfection success, an active RNAi machinery that is part of the innate immune system must be available, whereby the active RNAi machinery overcompensates the negative influence of the innate immune system to the uptake of siRNA.
  • the innate intracellular and / or intercellular immune defense can be at least partially activated by at least one agonist for a TL receptor, in particular by at least one agonist for TLR7 and / or TLR8.
  • the at least one agonist for TLR7 and / or TLR8 can be selected from the group comprising bropirimines (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinones), imidazoquinolines, thiazoloquinolines, guanosine analogs and ssRNA.
  • the at least one agonist imiquimod (R837, 1- (2-methylpropyl) -1H-imidazole [4,5-c] quinolin-4-amine), resiquimod (R848, 4-amino-2-) (ethoxymethyl) - ⁇ , ⁇ -dimethyl-1H-imidazo [4,5-c] quinoline-1-ethanol) or gardiquimod (1 - (4-amino-2-ethylamino-methyl-imidazo [4,5-c] quinoline) -1 -yl) -2-methylpropan-2-ol); or CL075 or CL097; or loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosine) or isolibine (7-thia-8-oxoguanosine); or ssRNA with U and / or GU rich sequences, in particular ssRNA with the sequence motifs UGUGU and / or GUCCUUCAA
  • Imiquimod can be used at a concentration of 0.1-100 ⁇ g / ml, preferably at a concentration of 0.1-20 ⁇ g / ml, and most preferably at a concentration of 0.1-10 ⁇ g / ml.
  • the addition preferably occurs at the same time as the transfection and / or later.
  • the ssRNA has a length of at least 15 bases.
  • the ssRNA may have a phosphothioate backbone.
  • an ssRNA of 20 nucleotides in length may be employed at a concentration of 0.1-100 ⁇ g / ml, preferably 0.1-20 ⁇ g / ml, and most preferably 0.1-10 ⁇ g / ml.
  • the addition of the ssRNA preferably takes place at the same time as the transfection and / or after the transfection.
  • the immunostimulatory ssRNA may be included in the transfection-active complex of non-viral gene delivery system and siRNA or plasmid DNA encoding shRNA.
  • the cell-permeable agonists can be added directly to the medium of the cells before, during or after the actual siRNA transfection step.
  • the ssRNA and its analogues must be complexed with suitable transfection reagents, since they are not cell-friendly by nature and thus do not reach the TLRs in the endosomes.
  • the agonists can be covalently bound to cationic polymers.
  • the inventive method can be used to activate the RNA interference machinery by stimulating the intercellular part of the innate immune system. Activation is achieved by occupying receptors of antiviral cytokines with suitable agonists.
  • interferon beta and / or interferon gamma are used in a concentration of 1-10000 U / ml. In a still more preferred embodiment, the concentration is 1-5000 and in the most preferred embodiment 1-2000 U / ml. The addition preferably occurs at the same time as the transfection and / or later.
  • the inventive method can be used to stimulate parts of the adaptive immune system, which are suitable for the activation of the siRNA machinery and at the same time to block other parts, eg. by regulating the level of endocytosis influence the amount of siRNA entered. Synergy effects can be exploited.
  • the cells can be treated for up to 4 days, preferably up to 18 hours, in particular up to 6 hours before transfection with the at least one agent for at least partial activation of the innate intracellular and / or intercellular immune defense.
  • the cells can be treated for up to 2 days, preferably up to 12 hours, in particular up to 6 hours after transfection, with the at least one agent for at least partial activation of the innate intracellular and / or intercellular immune defense.
  • the cells can be treated simultaneously with the at least one means for at least partially suppressing or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense and be brought into contact with the non-viral gene delivery system.
  • the method according to the invention can furthermore be used to prevent an undesired reaction of the innate immune system and thus an altered gene expression of the cell. This is of particular importance in in vivo applications and in the elucidation of protein functions by siRNA transfections in complex signal pathways. Often, different signal transduction pathways of the cell are also coupled with the signal transduction pathways of the innate immune system. In the case of a knockdown of a protein, which at the same time massively influences the physiological status of the cell, the assignment of the function to the protein is difficult. In order to avoid this, the method according to the invention can be used to partially or completely block the response of the innate immune system. The method according to the invention is suitable for the transfection of eukaryotic cells.
  • the cells When the eukaryotic cells are transfected in vitro, the cells may be adherent or suspended in a suitable culture medium. Preferably, at the time of transfection, the cells are in the logarithmic phase of proliferation in the case of transfection with DNA. If RNA is to be transfected, the cells are preferably in the lag or log phase at the time of transfection. If a transfection is to be carried out with the aim of expressing a protein, comes as a genetic material dsDNA with an expressible as RNA or peptide / protein portion or ssRNA with a peptide / protein expressible portion (either modified or unmodified) into consideration.
  • modified or unmodified dsDNA with a portion expressible as a small hairpin RNA (shRNA) or modified or unmodified siRNA can be used; only in this case is an activation of the TLR 7 and / or TLR 8 useful.
  • shRNA small hairpin RNA
  • additional blocking of TLR and / or cytokine receptors and / or interruption of signal transduction by blocking MEK1 and / or MEK2 may be advantageous, particularly so as not to affect the expression profile of the cells as much as possible.
  • a method according to the invention may preferably comprise the following method steps:
  • step (d) incubating the mixture of step (c);
  • the first solution may be an antagonist or antibody to a cytokine receptor or TLR 1, TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7, TLR 8, or TLR 9 as the target molecule; an inhibitor for the target molecule MEK 1 and / or MEK 2; or an agonist for TLR 7 and / or TLR 8; in particular, an above-mentioned same.
  • An antagonist or antibody may preferably be in a buffered saline solution, eg PBS, basal medium, etc., having a physiological pH of 6.8-7.45 and a physiological osmolality of 270-310 mosmol / kgH 2 O, or also in water or in unbuffered saline solution having a pH of 5-9.
  • the inhibitor can also be diluted in solubility problems in a suitable physiologically acceptable solvent, eg ethanol / DMSO.
  • the concentration of the antagonist, antibody or inhibitor in the first solution may be 0.01-1 ⁇ g / ⁇ l.
  • the first solution contains an MEK 1 and / or MEK 2 inhibitor, or an antibody or antagonist directed against TLR 1, TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, or TLR 6 or cytokine receptor.
  • the addition is made by adding an appropriate amount of the first solution to the culture medium of the cells to be transfected.
  • the resulting concentration of the antibody or antagonist in the culture medium of the cells to be transfected may be from 0.01 ⁇ g / ml to 50 ⁇ g / ml, preferably 0.05-12 ⁇ g / ml, in particular 0.1-5 ⁇ g / ml.
  • the resulting concentration of the inhibitor in the culture medium of the cells to be transfected may be 1 nM to 500 ⁇ M, preferably 5-100 ⁇ M, in particular 10-50 ⁇ M.
  • the mixing of the second solution with the non-viral gene delivery system and the third solution with the genetic material to be transfected can be carried out by pipetting.
  • Per transfected cell can be used on genetic material to be transfected 0.1 picogram / cell to 300 picograms / cell, preferably 0.2-50 picograms / cell, in particular 1-10 picograms / cell to be transfected genetic material.
  • the amount of non-viral gene delivery system depends on the amount of genetic material. In the case of an electrostatic binding of the non-viral gene delivery system to the genetic material, the amount is defined by the charge ratio (+/-) between gene delivery system and genetic material.
  • the charge ratio (+/-) Gencastersystem: genetic material can be 0.1: 1 to 100: 1, preferably 1: 1 to 20: 1, in particular 4: 1 to 10: 1. In the event of a non-electrostatic bond defines the amount of non-viral
  • Gene delivery system on the stoichiometric ratio to the genetic material may be from 0.1: 1 to 1000: 1, preferably 1: 1.
  • the mixture of the second solution with the non-viral gene delivery system and the third solution with the genetic material to be transfected may be incubated for a period of 1 minute to 30 minutes, preferably 10-15 minutes.
  • a non-viral gene delivery system comprising a cationic lipid, in particular an abovementioned cationic lipid according to the formula (I), can be used.
  • steps (a) to (e) can be repeated after 24 h in order to transfect the cells once again with genetic material.
  • the culture medium with additives in which the cells to be transfected are to be replaced by fresh culture medium.
  • a first solution with an antagonist or antibody to TLR 3, TLR 7, TLR 8 or TLR 9 can be mixed with a second solution with a non-viral gene delivery system and a third solution with the genetic material to be transfected.
  • the first solution with an antibody / antagonist is added to the second solution with a non-viral gene delivery system and mixed.
  • the amount of antibody used is 0.1% by weight to 50% by weight, based on the amount of the non-viral gene delivery system, preferably 0.1 to 10% by weight.
  • the amount of non-viral gene delivery system depends on the amount of genetic material to be used.
  • the amount is defined by the charge ratio (+/-) between gene delivery system and genetic material.
  • the charge ratio (+/-) Gencastersystem: genetic material can be 0.1: 1 to 100: 1, preferably 1: 1 to 20: 1, in particular 4: 1 to 10: 1.
  • the amount of non-viral gene delivery system is defined by the stoichiometric ratio to the genetic material.
  • the stoichiometric ratio of non-viral gene delivery system: genetic material may be from 0.1: 1 to 1000: 1, preferably 1: 1.
  • the mixture of first and second solution is preferably incubated for at least 5 minutes.
  • the third solution of genetic material to be transfected is added to the incubated mixture of first and second solutions and mixed.
  • Each cell to be transfected can be transfected with genetic material 0.1 Picogram / cell to 300 picograms / cell, preferably 0.2-50 picograms / cell, especially 1-10 picograms / cell of genetic material to be transfected.
  • the antibody / antagonist is incorporated into the transfection-active complex of non-viral gene delivery system and genetic material.
  • antibodies / antagonists are used which are modified with a lipophilic part of the molecule to facilitate the binding of the antibody / antagonist into the lipoplex.
  • TLR 3, TLR 7, TLR 8 or TLR 9 may be covalently linked to the non-viral gene delivery system.
  • cationic immunoliposomes from liposomes comprising cationic lipids or lipoplexes i.
  • Complexes containing DNA and cationic lipids to covalently label with antibodies or antibody fragments are known.
  • the methods were developed to allow targeting of the gene delivery systems towards the target cells in the body.
  • Most methods use so-called cross-linkers.
  • Cross-linkers are bifunctional molecules that create a covalent link between two molecules with corresponding functional groups.
  • Pierce offers a broad range of water-soluble and water-insoluble heterobifunctional (that is, more suitable for linking two different functional groups) and homobifunctional (more suitable for linking two like functional groups) cross-linkers.
  • carboxyl and amino groups can be used; in the case of Fab fragments, the thiol group can also be used for linking.
  • Cationic lipids and polymers contain amino functions for linking.
  • carboxyl and amino groups can be used for linking.
  • Cationic immunoliposomes can be formulated by derivatizing antibodies with lipids and adding them to the cationic lipids (possibly with colipids) prior to formulation.
  • homobifunctional cross-linkers such as. DSP (dithiobis [succinimidyl propionate]
  • amino functions can be used to covalently link a lipid with an amino function with an antibody.
  • a thiol function and the cross-linker N-succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) butyrate (Martin et al., J. Biol.
  • lipoplexes with modified antibodies covalently bound to a lipid are known to those skilled in the art.
  • the lipoplexes then absorb the modified antibodies (Lee et al., J. Biomed., Sei, 2003, 10, 337).
  • methods for cationic polymers such as. PEI or dendrimers or cationic proteins, such as. Polylysine (Chen et al., FEBS Letters; 1994; 338; 167; Suh et al; J. Controlled Release; 2001; 72; 171) covalently link to antibodies or antibody fragments.
  • PEI is eg. reacted with DPS in DMSO and added to an antibody solution in PBS. After dialysis, the antibody-coupled non-viral gene delivery system is available (Chiu et al., J. Controlled Release, 2004); 97; 357).
  • the first solution may contain an agonist for activating the TLR 7 and / or TLR 8, in particular one of the abovementioned.
  • the agonist may be dissolved in a buffered saline solution, eg, PBS, basal medium, etc., having a physiological pH of 6.8-7.45 and a physiological osmolality of 270-310 mosmol / kgH 2 O, in water or in an unbuffered saline solution pH of 5-9 be solved.
  • the concentration of the agonist may be 0.01-1 ⁇ g / ⁇ l.
  • This first solution with a TLR 7 and / or TLR 8 agonist may be added before, during or after transfection to the cells to be transfected in the culture medium.
  • the time of agonist treatment should be chosen so that an innate immune system as active as possible encounters the highest possible number of siRNAs.
  • the addition of the first solution with the agonist is carried out simultaneously with the addition of the transfection complex to the cells to be transfected by adding a corresponding amount of first solution to the culture medium.
  • the amount of agonists depends on the amount of cells. Preference is given to using 0.1 ⁇ g of agonist / cell to 25 ⁇ g of agonist / cell, preferably 1-500 ⁇ g of agonist / cell, in particular 10 to 250 ⁇ g of agonist / cell.
  • the amount of genetic material depends on the type of genetic material, the target compartment, eg blood, extracellular fluid of the tissues, cell tissue, etc., the form of administration and the type of addition, eg infusion, injection, or inhalation, and is 0.01-500 mg / kg body weight.
  • the amount of antibody, antagonist or agonist upon direct administration of a first solution to an individual may be from 0.1 mg / kg to 500 mg / kg of body weight, preferably 1-100 mg / kg, especially 5-10 mg / kg.
  • the amount of inhibitor in a direct administration of a first solution to an individual may be 0.1 mg / kg to 500 mg / kg body weight, preferably 10-300 mg / kg, especially 100-200 mg / kg.
  • the time and duration of the addition of a first solution depends on the target compartment, eg blood, extracellular fluid of the tissue, cell tissue, etc., the form of administration and the mode of administration, eg infusion, injection, inhalation.
  • the time interval between two transfections may be up to 6 weeks.
  • the invention further provides a composition comprising at least two of the following components: a) a non-viral gene delivery system, c) genetic material, and b) a means for at least partially suppressing or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense.
  • kits of parts which comprises at least two of the following components: a) a non-viral gene delivery system, c) genetic material, and b) a means for at least partially suppressing or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense.
  • the non-viral gene delivery system comprises a cationic lipid, a cationic polymer, a cationic protein; and / or a compound having a DNA and / or RNA-binding domain capable of inducing receptor-mediated endocytosis or membrane transfer; and / or a compound which is covalently bound to DNA and / or RNA and can induce receptor-mediated endocytosis or membrane transfer.
  • genetic material for example, genetic material for repairing a gene defect, e.g. genetic material, in particular modified or unmodified ssDNA, modified or unmodified dsDNA, modified or unmodified ssRNA, modified or unmodified dsRNA and / or modified or unmodified siRNA.
  • genetic material for example, genetic material for repairing a gene defect, e.g. genetic material, in particular modified or unmodified ssDNA, modified or unmodified dsDNA, modified or unmodified ssRNA, modified or unmodified dsRNA and / or modified or unmodified siRNA.
  • At least one activity-reducing or activity-enhancing effector can be used as a means for at least partially suppressing and / or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense.
  • an antibody, intrabody, aptamer, antagonist, inhibitor and / or a siRNA can be used according to the invention as a means for at least partially suppressing the innate intracellular and / or intercellular immune defense.
  • the antibody (s), intrabody, aptamer, antagonist, inhibitor and / or siRNA used as a means for at least partially suppressing the innate intracellular and / or intercellular immune defense may preferably block at least one signal transduction cascade of the innate immune system.
  • an agonist can be used as a means for at least partial activation of the innate intracellular and / or intercellular immune defense.
  • the agonist used as a means for at least partially activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense can activate at least one signal transduction cascade of the innate immune system.
  • the agent according to the invention for the at least partial suppression of the innate intracellular and / or intercellular immune defense can also be genetic material which can cause knockdown of a protein of a signal transduction cascade of the innate immune system.
  • the means according to the invention for the at least partial suppression of the innate intracellular and / or intercellular immune defense can comprise genetic material which can lead to the expression of a protein which can block the activity of a protein in a signal transduction cascade of the innate immune system.
  • a transfection composition of the invention may comprise (a) a non-viral gene delivery system and (b) a means for at least partially suppressing and / or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense, wherein the non-viral gene delivery system comprises:
  • (i) may comprise a cationic lipid, a cationic polymer, or a cationic protein; and / or (ii) may comprise a compound containing a DNA and / or RNA-binding
  • Can trigger membrane transfer and / or (iii) may comprise a compound covalently bound to DNA and / or RNA capable of inducing receptor-mediated endocytosis or membrane transfer; and the means for at least partially suppressing and / or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense, may be selected from:
  • TLR 1 an antibody to TLR 1, TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7,
  • TLR 8 TLR 9, TLR 10, TLR 11, TLR 12, or TLR 13;
  • an antibody to a cytokine receptor or a cytokine receptor an antibody to a cytokine receptor or a cytokine receptor
  • an inhibitor of kinase MEK1 and / or MEK2 an inhibitor of kinase MEK1 and / or MEK2;
  • an agonist for TLR7 and / or TLR8 selected from the group comprising bropyrimines (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrirnidinones),
  • Imidazoquinolines thiazoloquinolines, and guanosine analogs; and (v) a combination thereof.
  • a transfection kit of parts according to the invention may preferably comprise (a) a non-viral gene delivery system and (b) a means for at least partial suppression and / or Activation of the innate intracellular and / or intercellular immune defense, wherein the non-viral gene delivery system comprises:
  • (i) may comprise a cationic lipid, a cationic polymer, or a cationic protein; and or
  • (ii) may comprise a compound having a DNA and / or RNA-binding domain capable of inducing receptor-mediated endocytosis or membrane transfer;
  • (iii) may comprise a compound covalently linked to DNA and / or RNA capable of inducing receptor-mediated endocytosis or membrane transfer; and the means for at least partially suppressing and / or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense, may be selected from:
  • TLR 1 an antibody to TLR 1, TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7,
  • TLR 8 TLR 9, TLR 10, TLR 11, TLR 12, or TLR 13;
  • an antibody to a cytokine receptor or a cytokine receptor an antibody to a cytokine receptor or a cytokine receptor
  • an agonist for TLR7 and / or TLR8 selected from the group comprising bropirimines (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinones), imidazoquinolines, thiazoloquinolines, and guanosine analogs; and (v) a combination thereof.
  • composition of the invention or a kit of parts according to the invention comprises a non-viral gene delivery system with a cationic lipid.
  • composition according to the invention or a kit of parts according to the invention may comprise a non-viral gene delivery system with a cationic lipid according to the following formula:
  • R 2 and R 3 are independently dodecyl, dodecenyl, tetradecyl, tetradecenyl, hexadecyl, hexadecenyl, octadecyl, octadecenyl or other alkyl radicals, which in all possible combinations may be saturated, unsaturated, branched, unbranched, fluorinated or non-fluorinated, and from 5 can be built up to 30 carbon atoms;
  • composition or the kit of parts may contain modified or unmodified genetic material, in particular modified or unmodified ssDNA, modified or unmodified dsDNA, modified or unmodified ssRNA, modified or unmodified dsRNA and / or modified or unmodified siRNA.
  • the composition or the kit of parts may be used as a means for at least partially suppressing and / or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense 1, 4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (o-amionophenylmercapto) - butadiene (U0126); Imiquimod (R837, 1- (2-methylpropyl) -1 H -imidazole [4,5-c] quinoline-4-amine); Resiquimod (R848, 4-amino-2- (ethoxymethyl) - ⁇ , ⁇ -dimethyl-1H-imidazo [4,5-c] quinoline-1-ethanol); Gardiquimod (1- (4-amino-2-ethylamino-methyl-imidazo [4,5-c] quinolin-1-yl) -2-methyl-propan-2-ol); CL075; CL097; Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guamino
  • composition or kit of parts as an agent for at least partially suppressing and / or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense may contain an antibody to TLR 3, TLR 7, TLR 8, or TLR 9.
  • composition or the kit of parts according to the invention as an agent for at least partial suppression and / or activation of the innate intracellular and / or intercellular immune defense an antibody or antagonist against interleukin-1 receptor, in particular IL-ra; Interferon type I receptor; Interferon-gamma receptor; or tumor necrosis factor receptor.
  • interleukin-1 receptor in particular IL-ra; Interferon type I receptor; Interferon-gamma receptor; or tumor necrosis factor receptor.
  • several of the above-mentioned means for at least partially suppressing and / or activating the immune defense may be combined with each other, i.
  • Two, three or more components can be used in the agent according to the invention for the at least partial suppression and / or activation of the innate intracellular and / or intercellular immune defense. It is likewise possible to use a plurality of the abovementioned components a) and / or b) and / or c).
  • kit of parts according to the invention can:
  • all components may be completely separate from one another; the components a) and b) are present separately from one another; or components a) and b) are present together.
  • the components may either be separate from one another, for example in glass or plastic containers, which are packaged together, or the components may be provided in pairs or more in corresponding containers.
  • the kit of parts may comprise the non-viral gene delivery system in the form of salts, in particular formulated as liposomes / micelles; as a solution, in particular in the form of an aqueous solution, saline solution, buffered saline solution, eg saline solution with HEPES buffer, or solution in a physiologically acceptable solvent, eg ethanol / DMSO; in lyophilised form; as a solid or as a film.
  • Solutions of the non-viral gene delivery system preferably have a pH of 5 to 9.
  • the final concentration of the non-viral gene delivery system in the culture medium is preferably 0.01-10 mg / ml.
  • the means for at least partially suppressing and / or activating the innate intracellular and / or intercellular immune defense may be lyophilized in a kit of parts according to the invention; dissolved in water, saline, buffered saline, e.g. Saline with PBS buffer, or a suitable organic solvent, e.g. Ethanol, DMSO, etc, be included. Solutions preferably have a pH of from 5 to 9. Optionally, stabilizers may be included.
  • the agent for at least partial suppression and / or activation of the innate intracellular and / or intercellular immune defense is preferably present in a concentration of 0.01 to 10 mg / ml.
  • Genetic material kits can lyophilize this genetic material, dissolved in water, saline or buffered saline, e.g. Saline solution containing TE buffer. Solutions of the genetic material preferably have a pH of 5 to 9. The final concentration of the genetic material in the culture medium is preferably 0.01-10 mg / ml.
  • composition according to the invention and / or the kit of parts according to the invention can be used for carrying out a method according to the invention.
  • composition according to the invention can be present as a pharmaceutical composition and the kit of parts according to the invention as a pharmaceutical kit of parts.
  • a composition or kit of parts according to the invention can be used for the treatment of a disease by gene therapy.
  • the disease may be, for example, cystic fibrosis, muscular dystrophy, phenylketonuria, maple syrup disease, propionic acidemia, methylmalonic acidemia, adenosine deaminase deficiency, hypercholesterolemia, hemophilia, ⁇ -thalassemia, cancer, viral disease, macular degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, and / or inflammatory disease act.
  • the present invention can also be used to perform transfections without altering the expression profile of the cells to an undesired extent. This is of particular interest in in vivo applications because activation of the immune system is often a problem here.
  • FCS Mycoplex PAA, cat. No. E15-773
  • HeIa Luc cells stably transfected with luciferase cells
  • siRNA desalted, 30 pmol / ⁇ l in Universal Buffer (siMAX from MWG) directed against Luciferase GL3 (anti-luciferase siRNA): Sense Sequence: CUUACGCUGAGUACUUCGAtt Antisense Sequence: U CG AAG U AC UC AG CG U AAGtt Non-specific control : Sense Sequence: AGGUAGUGUAAUCGCCUUGtt Antisense Sequence: CAAGGCGAU UACACUACCUtt
  • HeLa cells are seeded in a 24 well plate. A cell count of 2.3 * 10 5 cells is plated in a well in 500 ⁇ l complete medium (10% FCS). The mixture is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
  • the antibody Sheep Polyclonal Antibody against human IFN ⁇
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • the efficiency of the transfection is performed with the ß-galactosidase assay kit according to the manufacturer's instructions.
  • the plates are developed until a yellow color is measured in the microplate reader with an absorption of 1-2 and then immediately stopped. The incubation period is then noted. The values are read out with the microplate reader and the mean value is formed.
  • Lines A and B represent duplicates of the results for a single transfection.
  • Lines C and D are duplicates of the results for a repetitive transfection. The average is therefore formed:
  • FIG. 1 A first figure.
  • the antibody (Mouse monoclonal Antibody Against Human Interferon Alpha / Beta Receptor Chain) is mixed with 400 ⁇ l PBS (Phosphate Buffered Saline) and mixed gently. He now has a concentration of 0.1 ⁇ g / ⁇ l.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • the lipoplex addition takes place after 5 h incubation time with the antibody
  • Lines A and B represent duplicates of the results for a single transfection.
  • Lines C and D are duplicates of the results for a repetitive transfection. The average is therefore formed:
  • HeLa cells are seeded in a 48 well plate. A cell count of 1, 2 * 10 5 cells is plated in a well in 250 ⁇ l complete medium (10% FCS). The mixture is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
  • the antibody is adjusted with PBS to a concentration of 0.05 ⁇ g / ⁇ l. Subsequently, the wells of the 48-well plate are supplied with the following amounts of antibody:
  • the mixture is then incubated in the incubator for 5 or 0.5 h, depending on the antibody. Subsequently, the lipoplexes are produced. For this, 13 ⁇ l of DNA (pCMV-lacZ) are pipetted into 650 ⁇ l of PBS and mixed by gently pipetting up and down. 52 ⁇ l Metafectene Pro are also pipetted into 650 ⁇ l PBS and mixed by gently pipetting up and down. Now both solutions are mixed and incubated for 15 min. At the end, add 50 ⁇ l of the lipoplex solution to each well. The mixture is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
  • Antibody Mouse anti human TLR1 antibody (monoclonal, 0.05% sodium azide, 100 ⁇ g lyophilisate); Invivogen, No. Mab htlr1.
  • the antibody was dialyzed against PBS: dialysis membrane: Spectra / Por Dispo Dialyser (500 ⁇ l, cellulose ester membrane, 25,000 Da Molecular Weight Cut-Off); Spectrum Laboratories; No. 135492, Lot 3224004.
  • the antagonist is adjusted to a concentration of 0.025 ⁇ g / ⁇ l with PBS. Subsequently, the wells of the 48-well plate are supplied with the following amounts of antibody:
  • Taq HeLa cells are seeded in a 48 well plate. A cell count of 0.8 * 10 5 cells is plated in a well in 250 ⁇ l complete medium (10% FCS). The mixture is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
  • inhibitor 1 mg is dissolved in 100 ⁇ l DMSO (stock solution). Then dilute with PBS 1:20 (working solution). Subsequently, the wells of the 48-well plate are supplied with the following amounts of inhibitor:
  • the antibody was dialyzed against PBS: dialysis membrane: Spectra / Por Dispo Dialyser (500 ⁇ l, cellulose ester membrane, 25,000 Da Molecular Weight Cut-Off); Spectrum Laboratories; No. 135492, Lot 3224004.
  • HeLa cells are seeded in a 48 well plate. In this case, a cell count of 1, 0 * 10 5 cells in a well in 250 ul complete medium (10% FCS) plated. The mixture is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
  • the antibody is adjusted with PBS to a concentration of 0.1 ⁇ g / ⁇ l.
  • 15 ⁇ g DNA (pCMV ⁇ Gal) and 60 ⁇ l Metafectene Pro are each dissolved in 300 ⁇ l serum-free DMEM. By gently pipetting up and down, the individual solutions are mixed. Subsequently, lipoplexes of the following composition are prepared.
  • the Metafectene Pro solution is combined with the antibody solution and incubated for five minutes at room temperature (RT). Subsequently, the DNA solution and the serum-free DMEM are added and incubated for a further 15 minutes at RT. In each case 50 .mu.l of the DNA-antibody-lipid complexes are pipetted into the wells. The solution 1 is pipetted into four wells of column 1. Solution 2 in four wells of column 2 and so on. The mixture is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
  • Lanes 1 and 2 are duplicates of results for a single transfection.
  • Cols. 3 and 4 are duplicates of the results for a repetitive transfection. The average is therefore formed:
  • the added amount of antibody corresponds to the following amounts of antibody per well:
  • HeLa-Luc cells are seeded in a 48 well plate. A cell count of 1.5 ⁇ 10 4 cells is plated in a well in 250 ⁇ l of complete medium (10% FCS). The mixture is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
  • the wells of the 48 well plate are supplied with the following amounts of inhibitor:
  • the lipoplexes are prepared.
  • 1 ⁇ l of anti-luciferase siRNA stock solution is pipetted into 300 ⁇ l of PBS and mixed by gently pipetting up and down. Only 240 ⁇ l of this solution will be used.
  • 1 ⁇ l of non-specific-control siRNA is pipetted into 300 ⁇ l PBS and mixed by gently pipetting up and down. Only 40 ⁇ l of this solution will be used.
  • 3 ⁇ l of Metafectene Pro are pipetted into 225 ⁇ l of PBS and mixed by gently pipetting up and down. Now 190 ⁇ l are pipetted to the anti-luciferase siRNA working solution and 35 ⁇ l to the non-specific-control-siRNA working solution. The solutions are mixed and incubated for 15 min. This results in lipoplexes with an siRNA reagent ratio of 1: 5 ⁇ g / ⁇ l At the end, 15 ⁇ l each of the anti-luciferase siRNA lipoplex solution are added to the first 6 rows of the plate. 15 ⁇ l of the non-specific-control-siRNA-lipoplex solution are added to the 7th row of the plate. This results in a siRNA amount of 1 pmol / well. Row 8 remains untransfected. The mixture is then incubated for 24 h in a CO 2 incubator (10%).
  • FIG. 11 Example 9 siRNA transfection in the presence of the TLR7 / 8 agonists:
  • a cell count of 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 should be plated in a well in 250 ⁇ l complete medium.
  • the first 5 wells of the first 3 rows of a 48 well plate are filled with 30 ⁇ l PBS each.
  • the stock solution of anti-luciferase siRNA and non-specific-control siRNA is adjusted to a concentration of 1 pmol / 10 ⁇ l with PBS. Then each 10 .mu.l of the
  • the Metafectene Pro reagent is diluted 1: 300 with PBS. In each case, 20 ⁇ l of this dilution are added to each well with siRNA.
  • the lipoplexes are incubated for 20 minutes at room temperature. Thereafter, 250 ⁇ l of cell suspension are added per well.
  • the two 48-well plates are incubated for 48 hours in CO 2 .
  • the cells of a plate are trypsinized and, using a Neubauer counting chamber, a vitality determination is carried out with trypan blue for each well.
  • Luciferase assay RLU / ⁇ l cell extract / sec
  • TLR 4 detects traces of LPS in the plasmid solution.
  • TLR9 and TLR3 detect genetic Material, in this case plasmids or corresponding impurities.
  • TLR1 and TLR2 detect the transfection reagent.
  • TLRs before and during transfection depends on many factors. Depending on the expression profile of the target cell can eg. a particular sensitivity of the cells to be given to certain PAMPs. Furthermore, different reagents and different genetic material can activate different TLRs. Even different DNA sequences can influence the transfection results depending on the CpG content. Last but not least, contaminants also play a role that should not be underestimated. For example, DNA of bacterial origin may be contaminated with LPS or flagellin or RNA. ssRNA can be contaminated with dsRNA and thus, in addition to TLR7 / 8, also respond to TLR3 and vice versa. Different treatment of the cells by stress signal transduction cascades can lead to different results. In summary, it can be said that different blocking strategies are required for different transfection experiments.
  • the invention can be used for therapeutic purposes.
  • the invention may be useful for gene therapy of, for example, cystic fibrosis, muscular dystrophy, phenylketonuria, maple syrup disease, propionic acidemia,
  • Methylmalonic acidemia adenosine deaminase deficiency
  • hypercholesterolemia hemophilia
  • ß-thalassemia ß-thalassemia
  • Gene therapy methods are also of interest if hormones, growth factors, cytotoxins or immunomodulating proteins are to be synthesized in the organism.
  • DNA fragments can be effectively brought into cells by means of the invention, in which this DNA can develop the desired effect without leading to undesired side effects.
  • the desired effect may be the replacement of missing or defective DNA regions or the inhibition of DNA regions (for example by antisense DNA / RNA or siRNA) which cause the disease in the diseased cell type.
  • tumor-suppressing genes can be used in cancer therapy or by introducing cholesterol-regulating genes, a contribution to the prevention of heart and blood vessel diseases are made.
  • DNA encoding ribozymes, siRNA or shRNA, or ribozymes or siRNA itself can be introduced into diseased cells.
  • the translation of the DNA produces active ribozymes or siRNA, which catalytically cleave m-RNA at specific sites and thus prevent transcription.
  • viral mRNA can be cleaved without affecting another cellular mRNA.
  • the multiplication cycle of viruses HAV, herpes, hepatitis B and C, respiratory syncytial virus
  • siRNA diseases specifically targeted for treatment with siRNA include age-related macular degeneration (eye disease), liver cancer, solid tumors, amyotrophic lateral sclerosis and inflammatory diseases.
  • Eye disease age-related macular degeneration
  • liver cancer solid tumors
  • amyotrophic lateral sclerosis and inflammatory diseases.
  • Transfection also plays a role in cancer therapy, for example an increasingly important role in the production of cancer vaccines. Thus, that is also possible application for the invention.
  • Another application may be found, for example, in vaccination methods which function on the basis of the expression of DNA encoding immunogenic peptides in the human and animal body.
  • DNA encoding immunogenic peptides in the human and animal body.
  • Lipid / DNA complexes used as vaccines.
  • the introduction of DNA into the body cells leads to the expression of the immunogenic peptide and thus triggers the adaptive immune response.
  • Amount of protein expression of a cell population as a result of transfection processes with genetic material encoding, inter alia, this expressed protein or extent of knockdown of protein expression of a cell population as a result of transfection processes with genetic material capable of triggering such knockdown in particular siRNA or Ribozymes or DNA encoding shRNA or ribozymes or proportion of cells of a total population of cells that demonstrates the biological activity of the introduced genetic material as a result of transfection processes.
  • the physiological status of the cell population should be influenced as little as possible, ie the protein expression profile of the cell population should ideally only change with respect to the proteins whose genes have been introduced into the cell or whose expression is reduced or prevented by the introduced genetic material should.
  • Non-viral gene delivery system is a non-viral gene delivery system
  • Non-viral gene delivery systems are not produced by recombination of genetic material from naturally occurring viruses. They are able to infect genetic material into eukaryotic cells.
  • the non-viral gene delivery systems are physical methods and chemical methods. Physical methods locate at least the genetic material in the vicinity of the cell, in particular, use physical methods, however, energy supply especially in shape of thermal, kinetic, electrical or other energy to mediate transport of the genetic material through the cell membrane.
  • Chemical methods are based either on a chemical modification or derivatization of the nucleic acids, which in particular make them cell-permeable, or consist in particular of substances which bind DNA and can mediate transport through the cell membrane. In particular, these use electrostatic forces or hydrogen bonds to bind the nucleic acids.
  • the transport of DNA through the cell membrane occurs through an active transport mechanism of the cell, endocytosis.
  • Substances having these properties contain, in particular, cationic lipids, cationic polymers, cationic peptides or also molecules which have a domain which can bind DNA or RNA and at the same time have a second domain which contains a ligand recognized by a receptor also on the cell surface and causes endocytosis by this recognition process.
  • this ligand is able to initiate a membrane transfer, ie mediate transport to the other side of the membrane.
  • the substances can also be specially formulated, in particular as micelles or liposomes and also consist of several components, in particular with different functions.
  • the innate immune defense sets itself apart from the acquired or adaptive immune defense in that it fends off a pathogen, without ever having to come into contact with the pathogen to train the immune system.
  • the innate immune response is most cell types to n intrinsically and consists of two parts, the intracellular and intercellular fraction.
  • the intracellular portion utilizes the recognition of pathogen-associated molecular structures by receptors.
  • these receptors initiate signal transduction cascades, which in particular result in expression of many cell-owned genes and phosphorylation of important proteins in a changed physiological status (eg, "antiviral status") of the cells directly affected Cytokines are also secreted.
  • affected cells notify unaffected cells via these messenger substances (cytokines) and trigger a changed physiological status (eg "antiviral status"), whereby the cytokines dock onto and release cytokine receptors of the other cells
  • cytokines messenger substances
  • antiviral status eg "antiviral status”
  • the intercellular portion is differentiated from the intracellular portion by the different receptors (cytokine receptors instead of PRRs (pattern recognition receptors) and agonists (cytokines instead of pathogenic patterns).
  • the introduction of genetic material into eukaryotic cells takes place outside of a living organism, especially in vessels suitable for the cultivation of eukaryotic cells.
  • the genetic material is used in the case of DNA for the production of RNA and / or proteins. In the case of ssRNA, it serves to produce proteins. In the case of dsRNA, the genetic material serves to knock down a gene by RNA interference.
  • nucleic acids Natural nucleic acids that have been altered by modification in their properties. These modifications may in particular be chemical changes, which relate in particular to the phosphate skeleton, the sugars or bases, which should in particular increase the stability of the nucleic acids to nucleases and ribonucleases.
  • molecules labels
  • molecules can be covalently or non-covalently attached to the nucleic acids leading to new properties of the nucleic acids, in particular to optical traceability by fluorescence labels or labels directing the nucleic acids to a specific location in the cell (localization elements) or labels which mediate the passage of nucleic acids through membranes and thus make nucleic acids cell-like, for example.
  • a modification is the exchange of oxygen for sulfur in the phosphate backbone, the methylation of 2'-OH groups of the ribose in the case of RNA, or the complete removal of 2'OH groups by fluorine to increase the stability against nucleases.
  • Another example is the attachment of FITC (fluorescein isothiocyanate) as a fluorescent label to follow the path of the genetic material in the cell microscopically, or the attachment of so-called NLS (nuclear localization signal, eg PKKKRKVG) to a transport into the cell nucleus to reach.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • NLS nuclear localization signal
  • siRNA short interfering RNA
  • Short dsRNA (up to 28 bp) that can cause the knock-down of a protein through RNA interference.
  • shRNA short hairpin RNA
  • Short ssRNA that has complementary regions at the 3'-end and the 5'-end and thereby hybridizes via hydrogen bonding and forms a hairpin structure.
  • shRNA can cause the knock-down of a protein by RNA interference.
  • Molecule capable of detecting a substance (agonist) and thus a biological substance
  • receptors are proteins.
  • Suppression Interruption of the communication network of the immune defense, ie of one or more immune response inducing signal transduction cascade (s), in particular the innate intra- and / or intercellular immune system. This interruption weakens the immune system, reducing the immune response.
  • s immune response inducing signal transduction cascade
  • Non-covalent interactions are electrostatic forces and hydrogen bonds.
  • the information on the presence of this substance is converted into a signal and transmitted via a chain of molecules by signal transduction.
  • the signal generated by the receptor is taken up by adapter molecules and, in particular, carried on via kinases, in particular to transcription factors.
  • the transcription factors stimulate the expression of genes that mediate the biological response.
  • Molecules in particular proteins, which are capable of recognizing molecular structures, in particular other proteins, and influencing their biological action by binding.
  • blocking antibody ie in the case of the receptors of the innate immune system signal transmission is reduced or prevented.
  • the antibodies can be polyclonal or monoclonal.
  • the antibodies can be humanized. As a rule, you must be directed against the receptor of a species whose cells are to be transfected. Due to the similarity of the receptors, it can also happen that an antibody is cross-reactive.
  • the antibodies can be modified, ie it can, for example. Parts of the molecule (eg Fc Fragments so that only Fab fragments remain) may be cleaved, provided that the biological effect is not significantly reduced.
  • Residues eg, phospholipids, A. Schnyder et al., J. Am. Soc., For Exp. NeuroTherapeutics;
  • Intracellularly expressed antibodies Intracellularly expressed antibodies.
  • RNA molecules which, by forming a tertiary structure, are able to recognize molecular structures, in particular proteins, similar to an antibody and influence their biological activity by binding.
  • Aptamers may consist of modified or unmodified RNA or DNA.
  • An agonist is able to achieve a biological effect by binding to a receptor.
  • Cytokines that are expressed in an infection of a eukaryotic cell with viruses. Examples are interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, TNF alpha, TFN beta, interleukin 6, 8, 15, 28 and 29. inhibitors
  • Molecules that can inhibit the biological activity of another molecule, in particular of proteins.
  • the inhibitors themselves are proteins, modified or unmodified nucleic acids or small organic molecules.
  • Receptors that are grouped across species according to their function.
  • Groups are grouped according to their function.
  • AP-1 Activated protein-1
  • ERK Extracellular-signal Regulated Kinase
  • IkB inhibitory-binding protein kB
  • IKKi IKK epsilon
  • IRAK1 interleukin 1 receptor-associated kinase 1
  • IRAK4 interleukin-1 receptor-associated kinase 4
  • IRF interferon regulating factor
  • JNK c-Jun N-terminal kinase
  • TIRAP MyD88-adapter-like
  • MAPK mitogen activated protein kinase
  • MEK MAPK / ERK kinase
  • MKK MAP kinase kinase
  • MKK mitogen-activated protein kinase kinase
  • MSK mitogen and stress activated kinase
  • MyD88 myeloid differentiation factor 88
  • NAP 1 Nck-associated protein 1
  • NF-kB nuclear factor kappaB
  • P1 3K phosphoinositol 3-kinase
  • PDK1 phosphoinositide-dependent protein kinase 1
  • PDK2 phosphoinositide-dependent protein kinase 1
  • RIP1 receptor-interacting protein 1
  • TAKI transforming growth factor- ⁇ -activated kinase
  • TRAF3 TNF receptor-associated factor 3
  • TRAF6 TNF receptor-associated factor 6
  • TRAM TRIF-related adapter molecule
  • TRIF Toll / IL-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-b adapter protein

Landscapes

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Abstract

Das angeborene Immunsystem von Eukaryoten ist in der Lage, über Toll Like Rezeptoren fremdes genetisches Material zu erkennen und Signaltransduktionskaskaden anzustoßen, die über eine Interferonantwort einen antiviralen Zustand von Zellpopulationen auslösen. Dieser antivirale Zustand ist auch eine Barriere für nicht-virale Genliefersysteme. Wird die Signaltransduktionskaskade intrazellulär oder interzellulär unterbrochen lassen sich Transfektionseffizienzen von nicht-viralen Genliefersystemen steigern und unerwünschte Änderungen des Expressionsprofils vermeiden. Da die RNA Interferenz zum antiviralen Zustand zuzurechnen ist, ist die RNAi-Maschinerie nach einer Aktivierung des angeborenen Immunsystems ebenfalls aktiviert. Auf diese Weise lassen sich Knock-downeffizienzen bei der Transfektion mit siRNA erhöhen.

Description

Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems
Stand der Technik
Bei Immunantworten des Körpers (Luke A. et al.; Spektrum der Wissenschaft, August 2005, Seiten 68-75) gegen eine infektiöse oder immunologische Herausforderung unterscheidet man zwischen der angeborenen (innate immunity) und der erworbenen Immunantwort (antigen-specific acquired immunity).
Die erworbene Immunabwehr wird erst bei einer Infektion mit Krankheitserregern ausgebildet. Sie besitzt eine Art Gedächtnis, sodass es bei einer zweiten Infektion durch denselben Erreger in der Regel nicht mehr zum Ausbruch der Krankheit kommt. Auf diesem Prinzip beruhen Impfstoffe. Gäbe es nur die erworbene Immunabwehr wäre der Organismus vor der ersten Infektion völlig ungeschützt. Das ist jedoch nicht der Fall, da es noch eine weitere sehr ursprüngliche Immunabwehr gibt, die als angeborene Immunabwehr bezeichnet wird und von der Fliege Drosophila bis zu Säugetieren, ja sogar bei Pflanzen gefunden wird.
Die angeborene Immunabwehr ist die erste Abwehrfront gegen Krankheitserreger und stellt ein evolutionär sehr altes System dar. Bei der angeborenen Immunabwehr werden über so genannte Toll-like Rezeptoren (TLRs) (Heine H. et al.; Int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 130; 180-192 und Uematsu S. et al., J. Biol. Chem. 2007, May 25; 282 (21);15319 -23) und RIG-I- like Helikasen (RLHs) die krankheitsassozierten molekularen Muster, so genannte pathogen- associated molecular patterns (PAMPs), erkannt und entsprechende Entzündungs- sowie Immunreaktionen eingeleitet. Dadurch kann der Organismus zwischen „selbst" und „nicht selbst" unterscheiden. RLHs werden ubiquitär im Zytosol exprimiert, wo sie in der Lage sind, die bei viraler Infektion entstehende dsRNA zu erkennen. TLRs und RLHs gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren, die auch als pattem recognition receptors (PRRs) bezeichnet werden.
Toll-like Rezeptoren (TLRs)
Toll-like Rezeptoren wurden erstmals in der Mitte der 1990er Jahre entdeckt (Zimmer A. et al.; PNAS, 1999; 96(10), 5780-5785). Der Name ist abgeleitet von einem in Drosophila Melanogaster von Christiane Nüsslein-Volhard gefundenem Protein, das Sie „Toll" nannte. TLR-Proteine ähneln diesem Typus und werden damit als „Toll-Iike"-Proteine bezeichnet. Dabei handelt es sich um Transmembranproteine mit einer extrazellulären, „leucin-reichen repeat" Domäne (LRR) wie auch einer zytoplasmatischen Domäne, die derjenigen der IL-1 R Familie homolog ist. Die verschiedenen TLRs reagieren selektiv auf verschiedene molekulare virale und bakterielle Komponenten und steuern über eine Signaltransduktionskaskade eine entsprechende Aktivierung von Genen. Dies geschieht zunächst über so genannte Adaptermoleküle und darauf folgend über Kinasen, die schließlich Transkriptionsfaktoren (z.B. NF-kB und die IRF-Familien) durch Phosphorylierung derselben oder entsprechender intrazellulärer Inhibitoren dieser Transkriptionsfaktoren aktivieren. Letztendlich werden neben einer Vielzahl spezifischer Gene, die eine antimikrobielle Wirkung haben, so genannte Zytokine produziert. Zytokine sind wiederum notwendige Stimulatoren für die erworbene Immunabwehr und damit auch ein Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunabwehr. Die Prinzipien der Ligandenerkennung, Signaltransduktion und Signalweiterleitung sind allerdings erst in Ansätzen verstanden.
Bisher sind 13 verschiedene TLRs bekannt (davon 10 beim Menschen), deren Anzahl ausreichend ist für die Erkennung aller pathogenen Erreger, angefangen von Bakterien über Pilze bis zu den Viren. Die Rezeptoren erkennen dabei allen Erregern gemeinsame Strukturen, des Weiteren mitunter auch mehrere Bestandteile gleichzeitig, ohne dass diese sich strukturell ähneln. Beispielsweise erkennt das TLR4 Lipopolysaccharide, aber auch Taxol. Bisher ist nicht bekannt wie die TLRs das leisten können. Die TLRs unterscheiden sich von Spezies zu Spezies nur wenig.
Bisher sind folgende Gruppen von Molekülen als Liganden der TLRs bekannt, die zu einer Auslösung von Signaltransduktionskaskaden führen:
TLR1: bildet mit TLR2 ein Heterodimer, ist der Rezeptor von triacyliertem Lipoprotein und Zymosan aus Hefen.
TLR2: ist der Rezeptor für bestimmte Peptidoglykane, Lipopeptide, Glykolipide und verschiedener Bakterien.
TLR3: erkennt lange dsRNA, wie Sie bei einer Virusreplikation in infizierten Zellen vorkommt.
TLR4: ist der Rezeptor für Lipopolysaccharide (LPS, auch Endotoxine), verschiedene Hüllglykoproteine (auch von Viren) und Taxol. LPS sind Bestandteile von Bakterienzellwänden. Der TLR4 Rezeptor benötigt für seine Funktion ein zusätzliches membrangebundenes Protein (TLR assistierendes Protein). Dabei bindet CD14 zB. das LPS und führt es dem TLR4 Rezeptor zu. Die Bindung an CD14 alleine löst dabei keine Signaltransduktionskaskade aus.
TLR5: ist der Rezeptor von Flagellin, einem Hauptbestandteil der Geiseln (Flagellae), mit welchen sich Bakterien fortbewegen.
TLR6: bildet mit TLR2 ein Heterodimer, ist der Rezeptor von diacyliertem Lipoprotein und bestimmten Peptidoglykanen. Ein spezielles Lipoprotein (MALP-2 = macrophage-activating lipopeptide) wird mittels Unterstützung durch das membrangebundene Protein CD36 detektiert (TLR assistierendes Protein).
TLR7&TLR8: sind Rezeptoren für Imidazochinolinen und von ssRNA/dsRNA z.B. von RNA-Viren.
TLR9: ist der Rezeptor für bakterielle DNA, bzw. für nicht methylierte CpG Motive, die in bakterieller DNA gehäuft (20 x häufiger als in Säugerzellen) auftritt. Das CpG Motiv ist in Säugerzellen stark methyliert, wodurch es unterschieden werden kann. Ähnliches wie für bakterielle DNA gilt auch für virale DNA, die auch von TLR9 detektiert wird. Über die immunstimulatorische Eigenschaft von bakterieller DNA berichtete schon Anfang der 80er Jahre die Gruppe um Dr. Tokunaga. Als zugehöriger Rezeptor wurde von der Gruppe um Dr. Shizuo Akira der TLR9 Rezeptor identifiziert (Aufklärung der Rollen von Toll-Rezeptoren und ihrer Signaltransduktionskaskaden mittels Gen-Targeting, Robert-Koch-Vorlesung von Dr. Shizuo Akira, Allgemeine Presseinformation 2002; www.robert-koch.stiftung.de).
TLR10:
Ligand noch nicht bekannt
TLR11 :
Ist Rezeptor für das urpathogene Bakterium Escherichia coli und dem Profilin-ähnlichen
Protein des Urtierchens Toxoplasma gondii TLR12:
Funktion und Ligand noch unbekannt
TLR13:
Funktion und Ligand noch unbekannt
Lokalisation der TLR:
TLR2, 4, 5 und 6 sitzen insbesondere in den Plasmamembranen von Monozyten, natürlichen Killerzellen, Mastzellen oder myaloiden dendritischen Zellen., 7, 8, und 9 befinden sich insbesondere in Endosomen von Immunzellen (Siegmund-Schultze N., www.aerzteblatt.de). Die Aktivierung der Immunantwort erfordert daher eine intrazelluläre Aufnahme über Endozytose und eine Reifung der Endosomen. Die Signalweiterleitung beginnt hier in einem endosomalen Kompartiment. Für TLR 3 gibt es Hinweise, dass er sich in den Plasmamembranen befindet, allerdings gibt es auch Darstellungen in der Literatur die von einer endosomalen Lokalisation ausgehen. TLRs agieren häufig paarweise und treten bei unterschiedlichen Zelltypen in unterschiedlichen Kombinationen auf.
Signaltransduktionskaskaden:
Die Signaltransduktionswege der unterschiedlichen TLRs (Perry A.K. et al; Cell Research 2005; 15(6); 407-422 und Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141 ; 137-145) sind teilweise zwar ähnlich, weisen aber durchaus auch größere Unterschiede auf, sodass es am Ende zu einer unterschiedlichen Genexpression und damit unterschiedlichen biologischen Reaktionen kommt. Mit Ausnahme von TLR3 geben alle TLRs ihr Signal an das Adapterprotein MyD88 weiter. MyD88 spielt eine entscheidende Rolle bei der Signalübermittlung über den TLR/lnterleukin-1 Rezeptor. Die zytosolische Domäne der TLRs zeigt hohe Ähnlichkeit zu der des lnterleukin-1 Rezeptors und wird daher auch als Toll/IR-1 Rezeptor Domäne (TIR) bezeichnet. MyD88-defiziente Splenozyten zeigten z.B. keine Reaktionen auf lnterleukin-1, LPS oder CpG-DNA. Außerdem wurde bei MyD88 defizienten Zellen in Reaktion auf TLR2, TLR7, TLR9-Liganden keine Aktivierung von Signalmolekülen, wie NF-kB oder MAP Kinasen beobachtet. Das ist ein deutlicher Hinweis auf die vollständige Abhängigkeit der TLRs (außer TLR3) von MyD88 für deren Signalweiterleitung. Andere Adaptermoleküle sind z.B. TIRAP (Toll-lnterleukin-i-Rezeptor(TIR)-Domäne enthaltendes Adapterprotein (TLR1 , TLR2, TLR4 und TLR6), Mal (MyD88-adapter-like), TRIF (TLR3 und TLR4) und TRAM (TLR4).
Welche Proteine neben den Adaptermolekülen noch mitwirken hängt vom jeweiligen TLR ab. Allgemein und vereinfacht dargestellt beginnt eine Signatransduktionskaskade in der Regel mit einem Rezeptor an der Zelloberfläche mit einer zytosolischen Domäne, der sein Signal bei Belegung mir einem passenden Liganden über zytosolische Adaptermoleküle an Kinasen weiterleitet, die über Kaskaden Transkriptionsfaktoren aktivieren. Die aktivierten Transkriptionsfaktoren lokalisieren im Kern und lösen die Expression von Proteinen, meistens Zytokinen aus.
Signaltransduktionskaskade über TLR1/TLR2, TLR2/TLR2, TLR2/TLR6 Die Rezeptoren, die in entsprechenden Paaren auftreten, lösen bei der Belegung mit passenden Liganden die gleichen Signaltransduktionskaskaden aus. Letztendlich werden unter anderem die Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1 aktiviert, die insbesondere zur Expression von Zytokinen führen. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle RAC-1 , TIRAP, MyD88 und TRAF6 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1 , IRAK4, TAK1 , PI 3K, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
Signaltransduktionskaskade über TLR4
Der Rezeptor benötigt das membrangebundene Protein CD14 für seine volle Funktion. CD14 bindet entsprechende Agonisten und führt Sie dem Rezeptor zu. Dieser löst bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, AP-1 , IRF3 und IRF7 aus und führt wiederum insbesondere zur Expression von Zytokinen. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle TIRAP, MyD88, TRAM, TRIF, TRAF3, TRAF6, NAP1 und RIP1 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1 , IRAK4, TAK1 , IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, IKKepsilon, TBK1 , ERK1 , ERK2, JNK, p38 MAPK, MEK1 , MEK2 und MKKs beteiligt.
Signaltransduktionskaskade über TLR5
Der Rezeptor löst bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1 , die insbesondere zur Expression von Zytokinen führen. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle MyD88 und TRAF6 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1 , IRAK4, TAK1 , IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
Signaltransduktionskaskade über TLR10,11 ,12,13
Die Rezeptoren lösen bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1 , die insbesondere zur Expression von Cytokinen führen. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle MyD88 und TRAF6 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1 , IRAK4, TAK1 , IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma und MKKs beteiligt. Signaltransduktionskaskade über TLR3:
Der Rezeptor löst bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, AP-1 , IRF3 und IRF7 aus, wobei wiederum insbesondere Zytokine verstärkt exprimiert werden. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle TRIF1 TRAF6, TRAF3, NAP1 und RIP1 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1 , IRAK4, TAK1 , IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, IKKepsilon, TBK1 , PKR, PI K3, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
Signaltransduktionskaskaden über TLR7, TLR8 und TLR9
Die Rezeptoren, lösen bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, AP-1 , IRF1 , IRF5 und IRF7 aus, wobei wiederum insbesondere Zytokine verstärkt exprimiert werden.. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle MyD88, TRAF6 und TRAF3 beteiligt. Als Kinasen sind IRAK1 , IRAK4, TAK1 , IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
TLRs sind von großem therapeutischem Interesse. TLR Agonisten werden z.B. als Adjuvanten in Impfstrategien oder in der Krebstherapie eingesetzt. Beispiele sind die Behandlung von Basalzellkarzinom durch die TLR7/8 Agonisten Imiquimod/Resiquimod oder von Blasenkrebs durch einen TLR2 Agonisten. Der TLR9 Rezeptor wird durch ein synthetisches CpG-haltiges Oligonukleotid (CpG 7909 und CpG 10101) für die Therapie von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten angesteuert. Kommerzialisiert werden TLR9 basierende Therapiestrategien von der Firma Coley Pharmaceuticals.
TLR7 und TLR8 Agonisten
Bekannte kommerzielle erhältliche Agonisten für den TLR7 und TLR8 Rezeptor sind allgemein Immidazochinoline (Schön et al., Oncogene, 2008, 27, 190-199), wie Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1 H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine), Resiquimod (R848, 4-amino- 2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1 H-imidazo[4,5-c]quinoline-1-ethanol) und Gardiquimod (1-(4- amino-2-ethylamino methylimidazo-[4,5-c]quinolin-1-yl)-2-methylpropan-2-ol),
Guanosinanaloga, wie zB. Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin) und andere wie zB. Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone). Weitere Immidazochinoline wurden in der Literatur beschrieben (Miller et al. Drug News & Perspectives, 2008, 21(2), 69-87; Gorden et al., J. Immunol., 2005, 174, 1259-1268; Jurk et al., Eur. J. Immunol., 36, 1815-1826; 2006; Gorden et al., J. Immunol., 2006, 177, 8164-8170) und sollen durch Referenz mitaufgenommen sein. Weitere teilweise ebenfalls kommerziell erhältliche Agonisten sind Thiazolochinoline wie CL075 (Gordon KB et al., J. Immunol., 2005, 174(3), 1259-68) und CL097 (Schindler U. et al., Mol. Cell Biol., 1994, 14(9), 5820-5831) und das Guanosinanalogon lsatoribine (7-Thia-8-oxoguanosin) (Horsmans Y. et al., Hepatology, 42(3), 724-731).
Bekannte Agonisten für den TLR8 sind ganz allgemein ssRNA, insbesonders einzelsträngiges polyUridin und ssRNA mit U oder GU reichen Sequenzen (Diebold et al, Science, 2004, 303, 1529-1531 ; Heil et al., Science, 2004, 303, 1526-1529; Lund et al; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2004, 101 , 5598-5603). Dabei kann die ssRNA auch als Phosphothioat vorliegen. Besonders zu nennen sind die Sequenzmotive UGUGU und GUCCUUCAA (Hornung et al., Nat. Med., 2005, 1 1 , 263-270; Judge et al., Nat. Biotechnol., 2005, 23, 457- 462) die besonders in ssRNA ab einer Länge von 16bp stimulierend sind. Die ssRNAs müssen natürlich in die Endosomen transportiert werden, um den TLR8 zu erreichen. In der Regel geschieht dies mit den üblichen Transfektionsreagentien. Die Firma InvivoGen bietet eine ssRNA40 komplexiert mit einem kationischen Lipid (Lyovec) als TLR8 Agonisten käuflich an.
Aber auch durch eine Überreaktion der angeborenen Immunabwehr können zahlreiche Krankheiten ausgelöst werden, beispielsweise Autoimmunerkrankungen wie rheumatische Arthritis und systemischer Lupus erythematodes. Hier reagieren TLRs mit Zerfallsprodukten körpereigener Zellen und leiten damit die Immunabwehr fehl.
Die TLRs stehen sogar im Verdacht, ursächlich mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen im Zusammenhang zu stehen. Entzündungsreaktionen am Herz können zur Bildung von arteriosklerotischen Plaques beitragen, die letztendlich durch Gefäßverschluss zum Infarkt führen können.
Zytokine/Cytokines:
Zytokine sind multifunktionale Signalstoffe. Es handelt sich dabei um zuckerhaltige Proteine, die eine regulierende Funktion für das Wachstum und die Differerenzierung von Körperzellen haben. Einige von ihnen werden daher auch als Wachstumsfaktoren bezeichnet. Viele Zytokine spielen zudem eine wichtige Rolle bei immunologischen Reaktionen und werden daher auch Mediatoren genannt. Zytokine werden von den Zellen durch Sekretion in das umgebende Medium abgegeben und stimulieren andere Zellen, wenn diese einen passenden Rezeptor besitzen. Man unterscheidet 5 Hauptgruppen von Zytokinen:
1. lnterferone (IFN) Interferone weisen Zellen an, Proteine zu bilden, die eine virale Infektion erschweren oder unterbinden. Auch können Interferone antitumorale Wirkung haben.
2. Interleukine (IL)
Interleukine dienen insbesondere der Kommunikation von Immunabwehrzellen untereinander und erhöhen dadurch die Koordination bei der Abwehr von Krankheitserregern und der Tumorbekämpfung
3. Koloniestimulierende Faktoren
Koloniestimulierende Faktoren werden in der Niere gebildet. Es handelt sich um Wachstumsfaktoren für Blutkörperchen
4. Tumornekrosefaktoren (TNF)
Die wichtigste Funktion von TNFs ist, die Aktivität verschiedener Immunzellen zu regeln. Sie werden hauptsächlich von Makrophagen ausgeschüttet. TNFs können den Zelltod (Apoptose), Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Ausschüttung anderer Zytokine anregen.
5. Chemokine
Chemokine sind Chemoattraktoren, die Zellen mit passenden Rezeptoren veranlassen durch Chemotaxis zur Quelle der Chemokine zu wandern
Von besonderer Bedeutung als Mediatoren für immunologische Prozesse sind die Interferone (IFN), insbesondere die Interferone vom Typ I. Das erste Interferon dieser Art wurde 1957 von Isaacs und Lindemann gefunden (Isaacs, A. et al.; J. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 147, 258-267). Der Name rührt daher, dass dieses Protein mit der Replikation von Viren interferiert. Typ I Interferone sind Schlüsselzytokine, die eine antivirale Antwort von Zellen auslösen, einen „antiviralen Status" etablieren und Zellen des Immunsystems zu einer antiviralen Antwort stimulieren. Diese Gruppe bindet an einen Rezeptor, den so genannten IFN-alpha Rezeptor (IFNAR), der aus zwei Proteinketten (IFNAR1 und IFNAR2) besteht. Man unterscheidet verschiedene Untertypen. Diese werden als IFN-alpha, IFN-beta, IFN- kappa, IFN-delta, IFN-epsilon, IFN-tau, IFN-omega und IFN-zeta bezeichnet. Wiederum von besonderer Bedeutung sind hier die Interferone des Typs alpha und beta, die von vielen Zellen sekregiert werden, z.B. von Lymphozyten, Makrophagen, Fibroblasten Endothelzellen, Osteoplasten und anderen. Die IFN-alpha Proteine kommen in 13 Subtypen vor, die als IFNAX (x = 1 ,2,4,5,6,7,8,10,13,14,16,17 und 21) bezeichnet werden. Alle ihre Gene liegen clusterartig auf dem Chromosom 9.
Von den IFN-beta Proteinen sind zwei beschrieben. Es handelt sich um IFNB1 und IFNB3. Ein als IFNB2 beschriebenes Protein konnte später als ein bekanntes Interleukin identifiziert werden.
Über eine Signaltransduktionskaskade, den sogenannten JAK/STAT Pathway wird nach der Bindung an den in der äußeren Zellmembran liegenden Interferon-Typ-1 -Rezeptor der Transkriptionsfaktor „interferone stimulated gene factor 3" (ISGF3), ein Heterotrimer der Transkriptionsfaktoren STAT1 , STAT2 und „IFN regulatory factor 9 (IRF9), welche in den Zellkern wandern und dort die Transkription von Hunderten von Effektormolekülen (über so genannte IFN induzierbare Gene) induziert. Diese Effektormoleküle beeinflussen direkt die Proteinsynthese, das Zellwachstum und das Überleben im Prozess der Etablierung des so genannten „antiviralen Status" (antiviral State). In diesem Status wird die Infektiosität der Viren z.B. durch verringerte Replikationsraten abgewehrt oder zumindest verringert.
Zusätzlich wird das adaptive Immunsystem aktiviert, indem die Reifung von dendritischen Zellen ausgelöst, die Antikörperantwort der B Zellen und die T Zellantwort aktiviert wird. Es werden Lymphozyten und Monozyten durch induzierte Chemokine zum Ort der Infektion rekrutiert.
Auch Stress kann Signaltransduktionswege anstossen, die in einen antiviralen Status münden. Diese Signaltransduktionkaskaden kreuzen die Signaltransduktionkaskaden der TLR.
Stress-Signaltransduktionswege:
Zellulärer Stress kann ausgelöst werden, durch:
-Hitze/Kälte
-UV
-mechanische Beanspruchung /Scherkräfte
-Sauerstoffmangel
-Nährstoffmangel
-Osmotischer Stress
-Oxidativer Stress/Freie Radikale
-Entzündungen -biologische und chemische Agentien (zB. TNFalpha, Chemotherapeutika)
Die Zellen reagieren auf Stress mit komplexen Veränderungen in der Aktivität von Signalketten, an welchen spezifische MEK, MSK und MAP Kinasen und verschiedene Transkriptionsfaktoren (zB. NF-kB), Apoptoseregulatoren und Zellzyklus-regulatoren beteiligt sind. GTP-bindende Proteine (Ras/Rho-Familie) die an der Membran gebunden sind spielen bei der Reaktion der Zellen auf zellulären Stress eine besondere Rolle.
Die angeborene Immunantwort erfolgt sowohl intrazellulär als auch interzellulär. Bei der intrazellulären Antwort löst eine durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffene Zelle über PRRs, wie beispielsweise TLRs und RLHs, Signaltransduktionskaskaden aus, wodurch sich der physiologische Status und das Expressionsprofil der Zelle ändern. Daneben gibt es eine interzelluläre Antwort, bei der die durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffene Zelle andere Zellen, die keinem direkten Kontakt mit dem entsprechenden Pathogen ausgesetzt waren, von der "Infektion" mit dem Pathogen „informiert". Dabei werden von der durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffenen Zelle Zytokine freigesetzt, die von Zytokinrezeptoren, welche sich auf den anderen nicht mit dem Pathogen in Kontakt gekommen Zellen befinden, detektiert werden. Durch die Bindung der Zytokine an die Zytokinrezeptoren wird eine Signaltransduktionskaskade in den Zellen, die keinem direkten Kontakt mit dem Pathogen ausgesetzt waren, ausgelöst, mit der Folge, dass sich auch deren physiologischer Status und Expressionsprofil ändert, obwohl sie mit dem Pathogen nicht direkt in Berührung gekommen sind. Die Änderung des physiologischen Status und des Expressionsprofils der Zellen soll dabei den pathogenen Angriff abwehren und das Überleben der Zellen sichern.
Die interzelluläre Antwort grenzt sich von der intrazellulären Antwort durch die unterschiedlichen Rezeptoren und Agonisten ab. Als Rezeptoren fungieren bei der interzellulären Antwort Zytokinrezeptoren und bei der intrazellulären Antwort PRRs. Die Agonisten der interzellulären Antwort sind Zytokine und bei der intrazellulären Antwort sind die Agonisten pathogene Muster.
Genliefermethoden
Die Transfektion, d.h. das Einbringen von genetischem Material in eukariotische Zellen, insbesondere Säugerzellen, ist heute eine Methode, die aus der modernen Forschung nicht mehr wegzudenken ist (Domb A. J.; Review in Molecules; 2005; 10; 34 und Xiang G; Keun- Sik K.; Dexi L.; Review in The AAPS Journal; 2007; 9(1) Article 9; http://www.aapsj.org). Ohne diese Methode wäre eine Aufklärung der Funktion verschiedener Gene wesentlich erschwert. Nicht zu vergessen ist die Möglichkeit, auf diesem Wege Proteine eukariotischen Ursprungs originalgetreu herzustellen, da die korrekte posttranslationale Modifikation durch die eukariotischen Zellen, im Gegensatz zu früher häufig verwendeten prokariotischen Zellen, sichergestellt wird. Des Weiteren wird für die nahe Zukunft erwartet, dass insbesondere das Einbringen von genetischem Material in humane Zellen, also die Gentherapie, Einzug in die moderne Medizin in Form klinisch getesteter Verfahren und Therapien halten wird. Das Einbringen von genetischem Material ermöglicht es z.B. in eukariotischen Zellen zerstörte DNA Bereiche zu ersetzen und somit Fehlfunktionen zu beheben. Des Weiteren können Suizidgene eingeschleust werden, die beispielsweise Krebszellen zum „Selbstmord" zwingen. Aber auch das Stilllegen (Knock-down) von Genen kann erreicht werden, indem beispielsweise siRNA (small interfering RNA), Ribozyme oder Antisense Moleküle zum Einsatz kommen. Mit der Möglichkeit, auf den genetischen Steuerungsapparat der Zelle zugreifen zu können, steht dem Menschen daher ein wertvolles Mittel zur Verfügung, sein Verständnis aber auch seinen Einfluss auf die natürlich ablaufenden Prozesse in einer Zelle zu vermehren.
In den vergangenen Jahren erlangte die Erforschung so genannter Genliefermethoden (Gene Delivery Systems), die sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden können, enorme Bedeutung, da jenen große Chancen eingeräumt werden, der Gentherapie zum Durchbruch zu verhelfen. Ein Schwerpunkt der Gentherapieforschung besteht darin, Viren als Carriersysteme zu nutzen. Da das Einbringen von DNA oder RNA in Fremdzellen ein integraler Bestandteil des Vermehrungszyklus der Viren ist, wurde diese Fähigkeit durch einen natürlichen, evolutiven Prozess in der Entwicklungsgeschichte der Viren soweit verfeinert, dass es bis heute keine effektiveren Gen-Carrier gibt. Die natürlich vorkommenden Viren werden gentechnisch so manipuliert, dass sie Ihre Fähigkeit zur Reproduktion und ihre Pathogenität verlieren, jedoch eine Zelle mit rekombinant eingebrachtem genetischem Material infizieren können. Da Viren außer aus genetischem Material im Wesentlichen aus Proteinen bestehen, bieten Sie dem Immunsystem allerdings eine große Angriffsfläche. Dabei hat das Immunsystem in einem ebenso evolutionären Anpassungsprozess Strategien entwickelt, sich diesen Eindringlingen zur Wehr zu setzen. Daher wird die Immunantwort des Körpers als ein besonders bedeutender Faktor bezüglich gescheiterter Gentherapiestudien genannt.
Die gegenwärtig zur Verfügung stehenden Genliefermethoden können in die zwei Hauptgruppen virale Systeme und nicht-virale Systeme unterteilt werden. Die nicht-viralen Systeme können wiederum in chemische und physikalische Methoden unterschieden werden. Von den nicht-viralen Systemen, die auf chemischen Methoden beruhen, sind insbesondere solche erwähnenswert, die auf kationischen Lipiden (sog. Lipofektion) oder kationischen Polymeren (sog. Polyfektion) beruhen. Deren Effizienz liegt in der Regel weit hinter den viralen Systemen.
Allseits bekannte kationische Polymere sind beispielsweise Poly-L-Lysin (PLL), (EP 388758) Polyethylenimin (PEI), (J. P. Behr et al.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA; 1995;92; 7297; WO 9602655), Diethylaminoethyldextran (DEAE), (S. C. De Smedt et al.; Phar. Res.; 2000; 17; 113), Starburst Dendrimere (PAMAM), (F. C. Szoka et al.; Bioconjug. Chem.; 1996; 7; 703; WO 9502397), Chitosanderivate (W. Guang Liu et al.; J. Control. Release; 2002; 83; 1) oder auch Polydimethylaminoethylmethacrylate (P. van de Wetering et al.; J. Gene Med.; 1999; 1 ; 156; WO 9715680). Auch die weit verbreitete Ca-Phosphat-Präzipitationsmethode nutzt in weiterem Sinne ein „kationisches Polymer" und kann daher zu dieser Gruppe gezählt werden.
Kommerziell erhältliche Produkte solcher kationischer Polymere sind z.B. Superfect, Polyfect (Qiagen), ExGenδOO (Biomol) und jetPEI (Qbiogene).
Ebenso bekannte kationische Lipide (J. P. Behr; Bioconjugate Chem.; 1994; 5; 382) sind beispielsweise DOTMA (US 4946787), DOTAP (Leventis et al.; Biochim. Biophys. Acta; 1990; 1023; 124), DOGS (EP 394111), DOSPA (WO 9405624), DOSPER (WO 97002419), DMRIE (US 5264618) oder DC-Chol (Huang et al; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1991 ; 179; 280; WO 9640067). Solche oder ähnliche Lipide werden als solche oder in Kombination mit so genannten Colipiden (z.B. DOPE) in der Regel in ethanolischen, wässrigen Pufferlösungen als Micellen oder Liposomen formuliert. Als solche, oder auch als Öl oder Festsubstanz zur Eigenformulierung sind sie als kommerziell erhältliche Reagenzien, wie Lipofectin, Lipofectamin, Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Fugene (Roche), Effectene (Qiagen), Transfectam (Promega), Metafectene (Biontex) etc. erhältlich.
Kationische Lipide und kationische Polymere bilden in Anwesenheit von DNA oder RNA aufgrund der gegenläufigen Ladungsverhältnisse spontan so genannte Lipoplexe oder Polyplexe. Die DNA wird dabei durch die Kompensation der negativen Ladung am Phosphatrest kondensiert, also in ihrer Größe minimiert. Im Allgemeinen hängt die Transfektionseffizienz von Lipoplexen oder Polyplexen von einer Vielzahl von Parametern ab. Die wichtigsten sind das Mengenverhältnis von genetischem Material zu kationischer Komponente bei der Herstellung der Lipo/Polyplexe, lonenstärke während der Herstellung der Lipo/Polyplexe, Absolutmenge von Lipo/Polyplexen pro Zelle, Zelltyp, Proliferationszustand der Zellen, physiologischer Status der Zellen, Zellteilungsrate, Inkubationszeit etc. Diese Einflussparameter sind Ausdruck eines komplizierten Transfektionsgeschehens, bei der die Lipo/Polyplexe bzw. die enthaltenen genetischen Materialien eine Vielzahl von zellulären Barrieren überwinden müssen.
Die erste Barriere stellt die äußere negativ geladene Zellmembran dar. Es wird angenommen, dass transfektionsaktive Lipoplexe, die eine positive Nettoladung haben müssen, durch adsorptive Endocytose oder Flüssigphasenendocytose in das Innere der Zelle gelangen. Durch die Endocytose, die einen aktiven Transportprozess der Zelle darstellt, wird Material auf der Zelloberfläche mit Zellmembran ummantelt und als Vesikel (Endosom) intemalisiert. Durch Verschmelzung mit so genannten Lysosomen, die ein komplexes Gemisch von Enzymen beinhalten, werden die in den Endosomen enthaltenen Stoffe abgebaut. Da zu diesem Abbau ein niedriger pH-Wert nötig ist, besitzen Endosomen Protonenpumpen, die solange Protonen in die Endosomen pumpen, bis ein entsprechender pH-Wert erreicht wird. Um Ladungsneutralität zu wahren, strömen im gleichen Ausmaß Chloridionen in die Endosomen.
Viele moderne kationische Lipide oder Polymere besitzen aus diesem Grund Puffereigenschaften. Auf diese Weise wird der niedrige pH-Wert nicht erreicht und es kommt zu einem Eintrag an Ionen in die Endosomen, der die Endosomen durch den entstehenden osmotischen Druck zum Platzen bringt. Auf diese Weise gelangen diese Lipo/Polyplexe in das Cytosol. Da auch eine Reihe transfektionsaktiver Lipide und Polymere ohne Puffereigenschaften bekannt sind, muss ein weiterer Mechanismus existieren, der die Lipo/Polyplexe in das Cytosol gelangen lässt. Man vermutet zumindest im Falle der Lipide eine Fusion der beteiligten Membranen und damit einhergehend eine Destabilisierung. Ob dabei vorwiegend der Lipoplex oder die enthaltende DNA/RNA als solches in das Cytosol gelangt ist unklar. Es wird jedoch vermutet, dass die DNA im Cytosol aus dem Lipoplex freigesetzt wird, da Versuche scheiterten, durch Mikroinjektion von Lipoplexen direkt in den Zellkern eine Proteinexpression zu erreichen. Es scheint, als ob die in den Lipoplexen gebundene DNA dem Transkriptionsapparat nicht zugänglich ist.
Handelt es sich um gegen mRNA gerichtete Antisense Moleküle oder siRNA, ist der biologische Wirkort erreicht und die Dauer der Wirkung hängt im wesentlichen von der Konzentration cytosolischer RNasen und der Rate der Freisetzung aus den Lipo/Polyplexen ab. DNA kann als solche nicht in den Zellkern eindringen, was als „Nuclear Barrier" bezeichnet wird. Sie gelangt allerdings während der Zellteilung an ihren Wirkort und führt so zur Expression von Proteinen. Als weitere nicht-virale Methoden, die auf chemischen Methoden basieren, seien Systeme genannt, die ein DNA-bindenden Molekülteil sowie einen Liganden tragen, der rezeptorvermittelte Endozytose auszulösen vermag (Beispiel Transferinfektion; Wagner et al.; Proc. Natl. Acad. Sei.; 1990; 87; 3410).
Andere Verbindungen bestehen aus einer DNA und/oder RNA-bindenden Domäne, sowie einem Liganden, der einen Membrantransfer auslösen kann; z.B. Penetratin, Derossi et al.; Trends in Cell Biology; 1998; 8 ; 84 oder HIV Tat Petid, Gratton et al.; Nature Medicine; 2003; 9(3); 357. Unter Membrantransfer versteht man, daß ein Molekül von einer Seite der Membran auf die andere Seite gelangen kann. Als DNA und/oder RNA-bindende Domäne kommen alle Strukturelemente einer Verbindung in Frage, die DNA und/oder RNA über elektrostatische Wechselwirkungen (zB. Kationen) oder Wasserstoffbrückenbindungen (zB. Peptid Nucleic Acids, PNAs) binden können. Auch interkalierende Verbindungen (zB. Acridin) können zur Bindung von RNA/DNA verwendet werden. Die Verbindungen, die rezeptorvermittelte Endozytose oder Membrantransfer auslösen können, können aber auch kovalent an das genetische Material gebunden werden, wenn dadurch die biologische Wirkung nicht oder nur wenig beeinträchtigt wird.
Das bedeutendste Beispiel einer nicht-viralen Methode, die auf einem physikalischen Verfahren beruht, stellt die Elektroporation dar. Dabei werden die zu transfizierenden Zellen zwischen zwei Elektroden verbracht, an die ein typischer Spannungsverlauf angelegt wird. Auf diese Weise werden die Zellen einem intensiven elektrischen Stromstoß (Puls) ausgesetzt, der zur einer reversiblen Öffnung (Poren) der Zellmembran führt. Durch diese Poren können Substanzen, wie z.B. genetisches Material, die sich in unmittelbarer Umgebung der Poren befinden in die Zelle eindringen. Der Puls (also Spannungsverlauf) als einer der wichtigsten Erfolgsparameter muss für jeden Zelltyp optimiert werden. Es gibt inzwischen einige kommerzielle Anbieter für Elektroporatoren (z.B. Eppendorf/Multiporator, US 6008038, Biorad/Genpulser, US 4750100, Genetronics Inc., US 5869326, BTX/ECM Serie), die speziell für eukariotische Zellen entwickelt wurden und eine Anpassung der Pulsparameter an den jeweiligen Zelltyp erlauben. Tatsächlich gibt es inzwischen auch Vorrichtungen die eine in vivo Applikation möglich machen. Bei der in vitro Anwendung werden die Zellen in einem Elektroporationspuffer suspendiert, zusammen mit der zu transfizierenden DNA/RNA in eine mit Elektroden versehene Elektroporationsküvette verbracht und einem oder mehreren Pulsen ausgesetzt. Neben dem Spannungsverlauf sind weitere wichtige Parameter die Beschaffenheit des Puffers, die Temperatur, die Zellkonzentration und die DNA-Konzentration. Nach dem die Zellen dem Puls ausgesetzt wurden, lässt man ihnen eine kurze Zeit zur Regeneration der Zellmembran. Anschließend werden die Zellen in ein Kulturgefäß ausgesäht und wie üblich kultiviert.
Als weitere physikalische Methoden seien Mikroinjektion, Hydrodynamische Methoden, ballistische Methoden (Genegun) oder Methoden, die Ultraschall benutzen genannt oder auch die Injektion nackter DNA in verschiedene Organe, die zu geringer Expression der entsprechenden Gene führt.
Zu den Verfahren die physikalische Methoden als auch chemische Methoden vereinen, zählt insbesondere auch die Magnetofektion, die DNA-bindende Moleküle auf magnetischen Nanoteilchen nutzt um über eine magnetischen Feldgradienten DNA auch der Oberfläche von Zellen anzureichern und Endozytose auszulösen
Den enormen Möglichkeiten, die das Einbringen von genetischem Material in eukariotische Zellen mit sich bringt, steht ein Arsenal von Methoden gegenüber, die nur unbefriedigende Leistungsfähigkeit aufweisen. Die jeweils spezifisch auftretenden Mängel bis dato vorhandener Methoden betreffen im Wesentlichen die wichtigen Parameter Effizienz, Toxizität, Immunogenität, Targeting, Restriktion bzgl. der Größe des genetischen Materials, Möglichkeiten der in vivo/in vitro Anwendung, Möglichkeit von High-Throughput- Anwendungen, Gefahrenpotential, Einfachheit der Methode und Kosten der Methode. Kein Verfahren ist in der Lage, alle diese Parameter ausreichend zu erfüllen. Dem Fehlen eines geeigneten Gen-Carriersystems wird zugeschrieben, dass sich bis heute trotz erheblicher Forschungsaufwendungen keine auf Gentherapie beruhende medizinische Therapie etablieren konnte.
Insbesondere kann das angeborene Immunsystem von Eukaryoten eine erhebliche Barriere für nicht-virale Genliefersysteme darstellen. Der Grund dafür ist, dass das angeborene Immunsystem von Eukaryoten in der Lage ist, über Toll Like Rezeptoren fremdes genetisches Material zu erkennen und Signaltransduktionskaskaden anzustoßen, die einen antiviralen Zustand von Zellpopulationen auslösen. Ein derartiger antiviraler Zustand einer Zelle stellt auch eine Barriere für die Transfektion mit einem nicht-viralen Genliefersystem dar, die kaum bzw. nicht überwunden werden kann.
So zeigten beispielsweise repetitive Lipofektionsversuche, bei denen zunächst eine Transfektion mit einer spezifisch gegen ein bestimmtes Protein gerichteten siRNA durchgeführt wurde und anschließend eine Plasmidtransfektion mit einem Reportergen folgte, dass der Transfektionserfolg der Plasmidtransfektion ausblieb, obwohl die Zellen einen gesunden Eindruck machten. Nur bei sehr geringen siRNA Mengen konnte eine geringe Menge des Reporterproteins detektiert werden.
Um auszuschließen, dass es sich um einen OFF-Target-Effekt der spezifischen siRNA handelt, wurde der Versuch mit einer unspezifischen siRNA wiederholt, die gegen das humane Erbgut „geblastet" wurde. Das Ergebnis blieb jedoch dasselbe.
Da bekannt ist, dass auch die Proliferation der Zellen einen Einfluss bei der Lipofektion hat, wurde untersucht, ob die Zellen in Ihrem Proliferationsverhalten durch die Vortransfektion mit siRNA beeinträchtigt wurden. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Proliferationsraten bei höheren siRNA Mengen sinken, jedoch eine ausreichende Proliferation bei den Experimenten gegeben, war, als die der Vortransfektion folgende Plasmidtransfektion fehlschlug. Es schien, als ob die Zellen sich überraschenderweise gegen die zweite Transfektion wehren können.
Mit repetitiven Transfektionsversuchen, bei denen zwei Plasmidtransfektionen hintereinander geschaltet wurden, konnte ein ähnliches Ergebnis erhalten werden, wenn auch nicht mit der oben genannten Deutlichkeit. Der zweite Transfektionschritt war häufig entweder sehr ineffizient oder kontraproduktiv. Auch hier wurden ähnliche Untersuchungen, wie oben genannt, durchgeführt, um sicherzustellen, dass es sich nicht um toxische Effekte handelt. Weitere Untersuchungen zeigten, dass es zur Aussschüttung von Interferonen kam.
Transfektion von siRNA zum Auslösen von RNA-I nterferenz
Durch das Einbringen von dsRNA in Zellen können Gene gezielt ausgeschaltet werden, wenn die mRNA eine Sequenzhomologie zu der eingeführten dsRNA aufweist.
Der Prozeß wird als RNA-I nterferenz bezeichnet (Fire et al., Nature, 1998, 391 , 806-811) und läuft meist folgendermaßen ab. Eine in die Zelle eingeschleuste dsRNA mit homologer
Sequenz einer zelleigenen mRNA wird durch das Enzym Dicer in viele kleine dsRNA-
Fragmente von 21-25 Nukleotiden zerschnitten (Bernstein et al., Nature, 2001 , 409, 363-
366).
Dicer ist eine ATP- abhängige Ribonuclease. Die entstehenden Nukleotidfragmente besitzen am 3'-Ende 2-3 Nukleotide, welche überstehen. Die kleinen RNA-Stücke werden „small interfering RNA" (siRNA) genannt (Elbashir et al., Nature, 2001 , 411 , 494-498).
Die doppelsträngigen siRNAs werden unter ATP-Verbrauch vermutlich mit Hilfe einer Helicase (Dalmay et al., EMBO, 2001 , J20, 2069-2078) entwunden. Danach wird ein Einzelstrang in den Proteinkomplex RISC (RNA induced silencing complex) überführt (Kuhlmann et al., Biol. unserer Zeit, 2004, 3, 142-150). Der am RISC verbleibende Strang kann mit einer komplementären RNA (target RNA) hybridisieren. Anschließend wird die target-RNA von einer integralen Endoribonuklease zerschnitten. Da Gene nur über den Umweg von einsträngiger mRNA wirken können, wird dieses Gen dadurch faktisch ausgeschaltet. Es wird zwar noch transkribiert, aber die RNA-I nterferenz (RNAi) baut diese mRNA genau so schnell wieder ab. Aus diesem Grund wird die RNA-I nterferenz auch als „Posttranscriptional Gene Silencing" (PTGS) bezeichnet.
Die RNA-I nterferenz findet man bei Protozoen, Pilzen, Pflanzen und Tieren wenn sich auch die einzelnen Mechnismen leicht unterscheiden. Archaebakterien und Prokaryonten verfügen nicht über diese Fähigkeit.
Die Frage nach der Funktion ist noch nicht genau geklärt. Man vermutet, dass es zur Abwehr von RNA-Viren dient. Mit Viren infizierte Pflanzen können sich beispielsweise erholen und bei neu entwickelten Blättern schwächen sich die Symptome ab. Symptomfreie Blätter können nicht mehr mit artverwandten Viren infiziert werden. Von den eingedrungenen Viren bzw. von derer RNA werden komplementäre Kopien erstellt, die als Matrize für die Synthese der ursprünglichen RNA dienen. Es bildet sich virusspezifische dsRNA, welche den PTGS Mechanismus auslöst. Da am Anfang die Konzentration an dsRNA zu gering ist, kann sich die Pflanze erst allmählich erholen und die Herrschaft über die Viren erlangen. Es wird vermutet, dass eine zelleigene RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP) das einsträngige Viren-Genom erkennt, in dsRNA umwandelt und dann den RNAi- Vorgang startet. Die These des PTGS zur Abwehr der Viren wurde unterstützt durch den Fund von Inhibitoren gegen das PTGS in Viren. Wie genau diese wirken und ob Pflanzen wiederum Mechanismen gegen diese Inhibitoren entwickelt haben, ist noch nicht bekannt.
Die RNA-I nterferenz hat in den letzten Jahren eine immense Bedeutung erlangt, da sie die Möglichkeit bietet unerwünschte Gene bzw. Proteine auszuschalten und damit Virus- und andere Krankheiten zu bekämpfen. Desweiteren ist sie auch in der Forschung zur Aufdeckung von Gen-Funktionsbeziehungen zu einem unverzichtbaren Hilfmittel geworden.
Die am häufigsten verwendete Variante RNA-I nterferenz zu nutzen, besteht in der Transfektion von synthetisch hergestellten siRNA-Molekülen, also doppelsträngiger RNA mit einem 3'-Überhang von 2-3 Nukleotiden. In Säugerzellen bewirkt eine eingeschleuste dsRNA mit mehr als 30bp eine enzymatische Zerstörung aller mRNAs und den Stopp der Proteinsynthese (Kaufmann, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1999, 96, 11693-11695). Nach der Injektion von längerer dsRNA können einige höhere Eukaryonten mit der Produktion von Interferonen reagieren, welches die Expression viraler Gene hemmen und die Zelle in Apoptose lenken können. Will man dies verhindern, so muss für Säugerzellen die Länge der siRNA unter 30 bp liegen (Tuschl et al., Genes Dev., 2001 , 15, 188-200). Als Transfektionsmethoden stehen die aus der DNA-Transfektion bekannten Methoden zur Verfügung. Der Unterschied zur DNA Transfektion besteht lediglich im Wirkort des eingeschleusten genetischen Materials. Bei der DNA Transfektion ist dies der Kern. Bei der siRNA Transfektion ist es das Cytosol.
Die am häufigsten verwendeten Methoden sind die Elektroporation, die Transfektion durch kationische Polymere und insbesonders die Transfektion durch kationische Lipide. Dabei sind nicht unbedingt die besten Reagentien bei der Plasmidtransfektion auch die besten Reagentien bei der siRNA Transfektion und umgekehrt. Daher werden spezielle für die siRNA Transfektion geeignete Reagentien kommerziell angeboten. Beispiele sind Interferrin (Polyplus), X-treme Gene siRNA (Roche), siPort (Ambion), Silentfect (Biorad), Dharmafect (Dharmacon) und Lipofectamin RNAiMax (Invitrogen).
Als Maß für den Transfektionserfolg wird bei der siRNA-Transfektion der relative Knockdown eines Proteins bzw. eines Gens im Vergleich zu einer unbehandelten Probe oder einer mit unspezifischer siRNA (siRNA ohne Target) transfizierten Probe verstanden. Ein Problem bei der siRNA-Transfektion stellen sogenannte OFF-Target-Effekte dar. Darunter versteht man beispielsweise die unbeachsichtigte Beeinträchtigung der Expression eines Gens, das nicht Ziel des Knockdowns ist. Dazu kann es zB. bei Sequenzähnlichkeiten kommen. Um diese OFF-Target-Effekte möglichst gering zu halten und aus Gründen der Toxizität, besteht eine Anforderung an potentielle siRNA-Transfektionsysteme darin, einen möglichst hohen Knockdown bei einer möglichst geringen Menge eingesetzter siRNA zu erreichen. Eine weitere bevorzugte Anforderung insbesondere für in vivo Anwendungen besteht darin, das Expressionsprofil der Zellen, abgesehen von der Expression des Targetproteins, so wenig wie möglich zu ändern.
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das eine effizientere Transfektion ermöglicht. Dies gilt sowohl für eine einfache Transfektion als auch für eine wiederholte, d.h. mindestens zwei- oder mehrmalige Transfektion. Weiter stellt sich die Aufgabe den physiologischen Status der Zellpopulation so wenig wie möglich zu beeinflussen, d.h. das Protein-Expressionsprofil der Zellpopulation sollte sich idealerweise nur bezüglich der Proteine ändern, deren Gene in die Zelle eingeschleust wurden oder deren Expression durch das eingeschleuste genetische Material herabgesetzt oder blockiert werden. Im Falle der Transfektion von siRNA kann es jedoch auch vorteilhaft sein den physiologischen Status der Zelle absichtlich zu Verändern, um die Zellen in einen „antiviralen Status" zu bringen, da hier die RNA-I nterferenz besonders effizient verläuft. Weiterhin wird eine Zusammensetzung und ein Kit of parts bereitgestellt, die die Komponenten zur Durchführung einer effizienteren Transfektion von eukariotischen Zellen mit nicht-viralen Genliefersystemen enthalten.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Verbesserung des Transfektionsergebnisses von nicht-viralen Genliefersystemen, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) die Zellen vor und/oder bei der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt und bei der Transfektion genetisches Material, insbesondere modifizierte und/oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsRNA und/oder modifizierte und/oder unmodifizierte siRNA, in die Zellen einbringt; oder
b) die Zellen vor und/oder bei und/oder nach der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt und bei der Transfektion modifizierte und/oder unmodifizierte siRNA in die Zellen einbringt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung des Transfektionsergebnisses kann in vitro und/oder in vivo durchgeführt werden.
Durch die zumindest teilweise Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr, d.h. eine der intra- und/oder interzellulären Signaltransduktionskaskaden der angeborenen Immunabwehr wird unterbrochen, lässt sich das Transfektionsergebnis verbessern und/oder unerwünschte Änderungen des Expressionsprofils einer transfizierten Zelle vermeiden.
Das heißt, dass insbesondere die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade ausgehend von den TLRs, über die Adaptermoleküle, über die entsprechenden Kinasen, welche wiederum über die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren Zytokine, insbesondere die Interferone induzieren und Membrantransportvorgänge herunterregulieren, unterbrochen oder geschwächt werden kann. Weiter kann die Signalübertragung durch Botenstoffe zwischen den Zellen unterbrochen werden. Da es sich dabei allesamt um Proteine handelt, werden erfindungsgemäß vorzugsweise aktivitätssteigernde oder aktivitätsmindemde Effektoren wie Antikörper, Aptamere, Antagonisten oder Inhibitoren gegen diese Proteine eingesetzt. Dabei können die entsprechenden Wirkstoffe als solches oder mit entsprechenden Hilfsmolekülen an oder in die Zellen verbracht werden, je nach Zellgängigkeit oder Zielort. So können z.B. Wirkstoffe über liposomale Carrier in die Endosomen verbracht werden. Ist der Zielort das Zytosol, bieten sich insbesondere Elektroporation oder spezielle Peptidsequenzen an, die in der Lage sind, die Zellwände zu permeabilisieren. Handelt es sich bei den Wirkstoffen um Peptide oder Proteine, so können diese erfindungsgemäß auch durch Transfektion geeigneten genetischen Materials intrazellulär gebildet werden und falls nötig mit Lokalisationssequenzen zu den entsprechenden Zellkompartimenten dirigiert werden. Will man über siRNA Gene stilllegen, die für entscheidende Proteine des Signatransduktionapparates kodieren, stehen erfindungsgemäß die bekannten Transfektionssysteme zur Verfügung.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Verwendung kann sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden bzw. erfolgen. Es kann dazu angewendet werden die Ausbildung des „antiviralen Status" von Zellen während der Transfektion zu verhindern oder auch schon vorher. Da die Zellen bei der Kultivierung auch mit biologischem Material zB. Serum oder Trypsin in Verbindung kommen können, das Stoffe beinhalten kann, auf die ein oder mehrere TLR ansprechen (zB. DNA, RNA, LPS etc.), kann es dazu kommen, dass sich Zellen schon in einem antiviralen Status befinden, bevor mit der Transfektion begonnen wurde. Unter Beachtung dieses Hintergrundes wird auch verständlich, warum es als schwierig gilt, Transfektionsergebnisse zu repoduzieren. Die Qualität von Transfektionsergebnissen hängt stark vom immunologischen Ausgangszustand der Zellen ab, der wiederum von der Vorbehandlung (zB. Subkultivierung) abhängt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das nicht-virale Genliefersystem ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfassen; und/oder eine Verbindung umfassen, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder eine Verbindung umfassen, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion, Magnetofektion, Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruhen.
Ferner kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Transfektion mindestens zweimal, d.h. zwei- oder mehrfach (3, 4, 5, 6, etc.), ausgeführt werden.
Weiterhin kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt ein kationisches Lipid in dem nicht-viralen Genliefersystem enthalten sein, insbesondere ein kationisches Lipid gemäß Formel (I):
H— (-?— f CH' ).)
(I) wobei sein kann, wobei
R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl oder andere Alkylreste, die in allen möglichen Kombinationen gesättigt, ungesättigt, verzweigt, unverzweigt, fluoriert oder nicht fluoriert sein können, und aus 5 bis 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sein können;
\ Il X = CH-C -NH-
sein kann; und wobei m = 0 und n = 0; oder m = 0 und n = 1; oder m = 0 und n = 2; oder m = 1 und n = 1 ; oder m = 1 und n = 2; oder m = 2 und n = 2 sein kann; und g = 1,2,3,4,5,6,7 oder 8 sein kann; a = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; b = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; c = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; d = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; e = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann, und f = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann.
Noch mehr bevorzugt kann bei dem erfindunsgemäßen Verfahren ein nicht-virales Genliefersystem, umfassend ein kationisches Lipid gemäß der Formel (I) eingesetzt werden, wobei R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl sein können; m = 1 und n = 1 sein kann; und g = 1 ,2,3,4,5,6,7 oder 8 sein kann; a = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; b = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; c = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; d = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; e = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; und f = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonisten, Inhibitor und/oder eine siRNA, der/die die Weiterleitung eines intra- und/oder interzellulären Signals der angeborenen Immunabwehr blockiert(en), zumindest teilweise unterdrückt werden. Entsprechende Antikörper, Intrabodies, Aptamere, Antagonisten und Inhibitoren sind kommerziell erhältlich.
Weiterhin kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Knock-down mit siRNA zumindest ein Gen ausgeschaltet werden, das für ein zur Signaltransduktion notwendiges Protein codiert. Entsprechende siRNA oder Plasmide, die shRNA (short hairpin RNA) z.B. gerichtet gegen TLRs, Kinasen und Transkriptionsfaktoren sind teilweise kommerziell erhältlich (Imgenex/Invivogen).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr mindestens einer aus der Gruppe TLR 1 , TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7, TLR 8, TLR 9, TLR 10, TLR 11,TLR 12, TLR 13, CD14, CD38, RIG-I Helikase und/oder RIG-l-like Helikase blockiert werden. Insbesondere ist es bevorzugt, TLR 1 , TLR 2, TLR 4 und/oder TLR 9 zu blockieren. Weiterhin ist es bevorzugt, mehrere der vorstehend genannten Rezeptoren bzw. Proteine zu blockieren. Erfindungsgemäß sind Antikörper geeignet, die in der Lage sind, die TL- Rezeptoren zu blockieren. So sind Antikörper gegen die Toll Like Rezeptoren TLR1 , TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 und CD14 bekannt und kommerziell erhältlich. Beipiele für Antikörper, die in der Lage sind, humane TLR zu blockieren sind: Mouse Anti- human-CD282 Antibody (= anti TLR2), monoclonal, AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2484EL, Mouse Anti-humanTLR3 Antibody, monoclonal, Lifespan Biosciences Kat-nr.: LS-C18685, Mouse Anti-human-CD284 Antibody (= anti TLR4), monoclonal, AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2061 EL, Antikörper: Mouse Anti human TLR1 Antibody (monoclonal, 0.05% Natriumazid, 100 μg Lyophilisat); Invivogen, No. Mab-htlr1 , Rabbit Anti-human-TLR9 Antibody (= anti TLR9), polyclonal, 0,5 μg/μl in PBS, 0,2% Gelatine, 0,05% Natriumazid, Lifespan Biosciences, Kat-nr.: MCA2484EL. Sind unerwünschte Stoffe wie Natriumazid in den kommerziell erhältlichen Antikörpern enthalten, so müssen diese unerwünschten Stoffe vor dem Einsatz des Antikörpers in dem erfindungsgemäßen Verfahren abgetrennt werden, zB. durch Dialyse.
Antikörper, die in der Lage sind, TLR zu blockieren können zusammen mit Endozytose auslösenden Lipo- oder Polyplexen als solche oder verpackt in Liposomen in die Endosomen geschleust werden und so die Rezeptoren blockieren. In der Regel reicht aber auch eine Zugabe zum extrazellulären Raum. Die Wahl des zu blockierenden Rezeptors hängt erfindungsgemäß natürlich auch von der Art des zu transfizierenden genetischen Materials ab. Desweiteren kann auch das transfizierende Agens die Wahl des zu blockierenden Rezeptors bestimmen. Die TLR, die genetisches Material detektieren, d.h. TLR 3, TLR 7, TLR 8 und TLR 9, sitzen in der Regel in den Endosomen. Die übrigen TLR sitzen auf der Plasmamembran. Will man beispielsweise DNA transfizieren, kann bevorzugt TLR 9 blockiert werden. Ist die DNA bakteriellen Ursprungs, ist es bevorzugt, zusätzlich zu TLR 9, TLR 4 und/oder TLR 5 zu blockieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Antikörperkonzentration von 0,01- 100μg/ml durch Zugabe zum Kulturmedium zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration des Antikörpers 0,01-1 Oμg/ml Kulturmedium und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 0,01-5μg/ml.
Der Antikörper kann auch in den transfektionsaktiven Komplex, z.B. Lipoplex, integriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis Antikörper : genetisches Material von 0,01 : 1 (μg/μg) bis 10 : 1 (μg/μg). In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Menge 0,01-1 μg/μg und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 0,01-0,3μg/μg genetischem Material.
Für alle Antikörper, die erfindungsgemäß als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr eingesetzt werden können, gilt: Der oder die eingesetzten Antikörper muss/müssen in der Regel gegen das zu blockierende Zielmolekül, zB. einen Rezeptor wie einen TLR, Zytokinrezeptor, Interferonrezeptor, usw. der Zellen gerichtet sein, die transfiziert werden sollen. Handelt es sich beispielsweise um einen TLR einer humanen Zelle, so muss der Antikörper sich in der Regel gegen den humanen TLR Rezeptor richten, der blockiert werden soll. In manchen Fällen sind die Antikörper wegen der großen Ähnlichkeit der Zielmoleküle aus verschiedenen Spezies, zB. TLRs, auch kreuzreaktiv; d.h. obwohl ein Antikörper gegen ein Zielmolekül von einer Spezies entwickelt wurde, zeigt er seine Eigenschaften auch gegen ein ähnliches Zielmolekül aus einer anderen Spezies. Weiterhin werden bevorzugt Antikörper aus Zellen derselben Spezies, die transfiziert werden soll, eingesetzt, da sie in diesem Falle wenig oder nicht immunogen sind. Die Antikörper können auch rekombinant hergestellt worden sein. Sollen sie an menschlichen Zellen eingesetzt werden, können sie „humanisiert" sein. Vorzugsweise bindet der eingesetzte Antikörper hochaffin an sein Zielmolekül. Der verwendete Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein, wobei monoklonale Antikörper bevorzugt sind. Es kann auch ein modifizierter Antikörper eingesetzt werden. beispielsweise kann bei einem modifizierten Antikörper das Fc-Fragment fehlen, da die Bindung an das Zielmolekül/Antigen ausschliesslich durch die Fab-Fragmente zustande kommt. Ein modifizierter Antikörper kann auch mit hydrophoben Gruppen, wie z.B. Lipiden, modifiziert sein, um seine Verankerung in Membranen und/oder Liposomen zu erleichtern. Will man den eingesetzten Antikörper leichter detektieren, kann er auch mit einem Fluoreszenzfarbstoff gelabelt sein. Es können auch mehrere Modifikationen an einem Antikörper vorgenommen werden. Weiter muss der eingesetzte Antikörper frei von Zusatzstoffen sein, die eine Anwendung an lebenden Zellen verbieten, wie zB. bestimmte Konservierungstoffe.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ferner zumindest eine der Kinasen IRF-Kinase TBK1 , MAP Kinase, MAPK Kinase, MAPK Kinase, MAPKK Kinase, MAPKKK Kinase, MEK1 , MEK2, MEK5, MKK4/SEK, MKK5, MKK6, MKK7, ERK1 , ERK2, ERK3, ERK4, ERK5, ERK6, ERK7, ERK8, JAK, JNK1 , JNK2, p38 MAP Kinase, RK, p38/RK MAP Kinase, p30/RK MAP Kinase, Phosphatidylinositol 3-Kinase, IRAK-1 , IRAK-4, IKK-alpha, IKK-beta, IKKgamma, IKK delta, IKK epsilon, TAK1 , PKB Kinase, PKD1 , PKD2, MSK1 oder PKR blockiert werden. Bevorzugt wird mindestens eine Kinase, ausgewählt aus MEK1 und MEK2, blockiert. Weiterhin ist es bevorzugt, mehrere der vorstehend genannten Kinasen zu blockieren.
Weiterhin kann erfindungsgemäß die Kinase MEK1 und/oder MEK2 durch eine Verbindung inhibiert werden, die einen IC50 Wert kleiner 100 nM aufweist. Weiterhin kann erfindungsgemäß die Kinase MEK1 und/oder MEK2 durch 1 ,4-Diamino-2,3-dicyano-1 ,4- bis(o-amionophenylmercapto)butadien (U0126) blockiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kommt dabei eine Konzentration von 1-500 μM zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 1-100μM und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 1-30μM.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch zumindest ein Zytokin, zumindest ein Tumornekrosefaktor (TNF), zumindest ein Interleukin und/oder zumindest ein Interferon blockiert werden, die bei der angeborenen interzellulären Immunabwehr beteiligt sind. Als zu blockierendes Interferon kommt beispielsweise ein Interferon des Typs I, insbesondere zumindest eines der Interferone, ausgewählt aus Interferon-alpha, Interferonbeta, Interferon-gamma oder Interferon-omega in Betracht. Als zu blockierendes Interleukin kommt insbesondere lnterleukin-1 in Betracht.
Auch kann zumindest ein Rezeptor für Zytokine blockiert werden, insbesondere zumindest ein Rezeptor für Interferone, insbesondere des Typs I, zumindest ein Rezeptor für Interleukine, und/oder zumindest ein Rezeptor für Tumornekrosefaktoren. Ein Beispiel für einen geeigneten Antikörper der gegen den Interferon-Typ-1 -Rezeptor gerichtet ist, ist der Mouse monoclonal Antibody against Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain 2 (CD118), ebne MMHAR-2, Isotype Ig2a, C= 0,5 mg/ml in PBS (Phosphat buffered saline) containing 0,1% bovine serum albumin (BSA), PBL Biomedical Laboratories, Product-No: 21385. Insbesondere kann der Rezeptor für lnterleukin-1 durch einen Antikörper oder einen Antagonisten wie IL-ra (Human lnterleukin-1 Receptor Antagonist, Biomol, Kat.-Nr.: 54592) blockiert werden. Ein weiteres bevorzugtes Ziel ist der Interferon-gamma-Rezeptor.
Für alle Antagonisten, die erfindungsgemäß als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr eingesetzt werden können, gilt: Der oder die eingesetzten Antagonist(en) muss/müssen in der Regel gegen das zu blockierende Zielmolekül, zB. einen Rezeptor wie einen Interleukinrezeptor, Zytokinrezeptor, Interferonrezeptor, usw., der Zellen gerichtet sein, die transfiziert werden sollen. Handelt es sich beispielsweise um einen Rezeptor einer humanen Zelle, so muss der Antagonist sich in der Regel gegen den humanen Rezeptor richten, der blockiert werden soll. In manchen Fällen sind die Antagonisten wegen der großen Ähnlichkeit der Zielmoleküle aus verschiedenen Spezies, zB. TLRs, auch kreuzreaktiv; d.h. obwohl ein Antagonist gegen ein Zielmolekül von einer Spezies entwickelt wurde, zeigt er seine Eigenschaften auch gegen ein ähnliches Zielmolekül aus einer anderen Spezies. Weiterhin werden bevorzugt Antagonisten aus Zellen derselben Spezies, die transfiziert werden soll, eingesetzt, da sie in diesem Falle wenig oder nicht immunogen sind. Die Antagonisten können auch rekombinant oder synthetisch hergestellt worden sein. Vorzugsweise bindet der eingesetzte Antagonist hochaffin an sein Zielmolekül. Erfindungsgemäß eingesetzte Antagonisten können auch modifiziert sein; analog zu den modifizierten Antikörpern.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden mehrere der vorstehend erwähnten Rezeptoren und/oder Proteine, die an der Signaltransduktionskaskade zur Auslösung der angeborenen intra- und/oder interzellulären Immunabwehr beteiligt sind, blockiert. So können beispielsweise mehrere Antikörper gegen TLR-Rezeptoren kombiniert werden, um additive Effekte und/oder Synergieeffekte zu nutzen. Ebenso können beispielsweise auch Inhibitoren und/oder Antikörper, und/oder Intrabodys, und/oder Aptamere, und/oder Antagonisten, und/oder siRNA gegen TLR-Rezeptoren und/oder TLR assistierende Proteine und/oder Adaptermoleküle und/oder Kinasen und/oder Transkriptionsfaktoren und/oder Zytokine und/oder Zytokinrezeptoren kombiniert werden, um die Signaltransduktionskaskade der angeborenen Immunabwehr zumindest teilweise zu unterbrechen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner dazu benutzt werden, die Transfektionsergebnisse von siRNA Transfektionen mit nicht-viralen Genliefersystemen auf mehrerlei Weise zu verbessern. Dabei kann die siRNA modifiziert oder unmodifiziert sein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann als Mittel zur Aktivierung der angeborenen Immunabwehr ein Agonist eingesetzt werden.
Zum Einen kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu genutzt werden durch eine Anregung des intrazellulären Teils des angeborenen Immunsystems die RNA- Interferenzmaschinerie zu aktivieren. Die Aktivierung gelingt durch die Belegung verschiedener TLR Rezeptoren mit entsprechenden Agonisten, insbesonders aber durch Belegung (und damit Aktivierung) der Rezeptoren TLR7 und TLR8. Die Rezeptoren TLR7 und TLR8 befinden sich in den Endosomen und detektieren ssRNA, wie sie bei einer Infektion eines RNA-Virus zu erwarten ist. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu einem besonders starken „antiviralen Status" zu dem eine aktive RNA-Interferenzmaschinerie zugeordnet werden kann. Die Annahme, dass es sich bei der RNA- Interferenz um einen Mechanismus zur Abwehr von Viren handelt fügt sich zwanglos in das Gesamtbild. Die Verbesserung der Transfektionsergebnisse von siRNA Transfektionen weicht insofern von den Transfektionen mit anderem genetischen Material ab, dass für einen guten Transfektionserfolg eine aktive RNAi-Maschinerie zur Verfügung stehen muss, die Bestandteil des angeborenen Immunsystems ist. Dabei überkompensiert die aktive RNAi- Maschinerie den negativen Einfluss des angeborenen Immunsystems auf die Aufnahme der siRNA.
Bevorzugt kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Agonisten für einen TL- Rezeptor, insbesondere durch mindestens einen Agonisten für TLR7 und/oder TLR8, zumindest teilweise aktiviert werden. Erfindungsgemäß kann der mindestens eine Agonist für TLR7 und/oder TLR8 ausgewählt werden aus der Gruppe, umfassend Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4- pyrimidinone), Imidazochinoline, Thiazolochinoline, Guanosinanaloga und ssRNA.
Bevorzugt kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der mindestens eine Agonist Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1 H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine), Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1 H-imidazo[4,5-c]quinoline-1-ethanol) oder Gardiquimod (1 -(4-amino-2-ethylamino methylimidazo-[4,5-c]quinolin-1 -yl)-2-methylpropan- 2-ol); oder CL075 oder CL097; oder Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin) oder lsatoribine (7-Thia-8-oxoguanosin); oder ssRNA mit U und/oder GU reichen Sequenzen, insbesondere ssRNA mit den Sequenzmotiven UGUGU und/oder GUCCUUCAA, sein. Imiquimod kann in einer Konzentration von 0,1-100 μg/ml, bevorzugt in einer Konzentration von 0,1-20 μg/ml, und am meisten bevorzugt in einer Konzentration von 0,1-10 μg/ml eingesetzt werden. Die Zugabe findet bevorzugt zur gleichen Zeit wie die Transfektion und/oder später statt. Vorzugsweise hat die ssRNA eine Länge von mindestens 15 Basen. Ferner kann die ssRNA ein Phosphothioatrückgrat haben. Beispielsweise kann eine ssRNA mit 20 Nukleotiden Länge in einer Konzentration von 0,1-100 μg/ml, bevorzugt 0,1-20 μg/ml, und am meisten bevorzugt 0,1-10 μg/ml eingesetzt werden. Die Zugabe der ssRNA findet bevorzugt zur gleichen Zeit wie die Transfektion und/oder nach der Transfektion statt. Bevorzugt kann die immunstimulierende ssRNA in dem transfektionsaktiven Komplex aus nicht-viralem Genliefersystem und siRNA oder Plasmid-DNA, auf der shRNA codiert ist, enthalten sein.
Die zellgängigen Agonisten können vor, während oder nach dem eigentlichen siRNA- Transfektionsschritt direkt zum Medium der Zellen gegeben werden. Die ssRNA und deren Analoga müssen dabei mit geeigneten Transfektionsreagentien komplexiert werden, da sie von Haus aus nicht zellgängig sind und damit die in den Endosomen liegenden TLRs nicht erreichen. Es ist auch möglich die Agonisten in Lipo- oder Polyplexe mitsamt der siRNA miteinzubauen oder durch Derivatisierung mit Alkylketten die Agonisten in die Lipidmembranen der Liposomen bzw. Lipoplexe miteinzubauen, die aus den eigentlichen transfektionsaktiven kationischen Lipiden und möglicher Colipide wie zB. DOPE bestehen. Auch können die Agonisten kovalent an kationische Polymere gebunden werden.
Zum Zweiten kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu genutzt werden durch eine Anregung des interzellulären Teils des angeborenen Immunsystems die RNA- Interferenzmaschinerie zu aktivieren. Die Aktivierung gelingt über die Belegung von Rezeptoren von antiviralen Zytokinen mit geeigneten Agonisten. In einer bevorzugten Ausführung kommt dabei Interferon beta und/oder Interferon gamma in einer Konzentration von 1-10000 U/ml zur Anwendung. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration 1-5000 und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform 1-2000 U/ml. Die Zugabe findet bevorzugt zur gleichen Zeit wie die Transfektion und/oder später statt.
Zum Anderen kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu genutzt werden, Teile des adaptiven Immunsystems zu stimulieren, die für die Aktivierung der siRNA-Maschinerie geeignet sind und gleichzeitig andere Teile zu blockieren, die zB. durch eine Herunterregelung der Endozytose Einfluss auf die Menge der eingetragenen siRNA haben. Dabei können Synergieffekte genutzt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Zellen bis zu 4 Tage, vorzugsweise bis zu 18 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden vor der Transfektion mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
Ferner können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen bis zu 2 Tage, vorzugsweise bis zu 12 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden nach der Transfektion mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
Weiterhin können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen gleichzeitig mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden und mit dem nicht-viralen Genliefersystem in Kontakt gebracht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiters dazu genutzt werden eine unerwünschte Reaktion des angeborenen Immunsystems zu verhindern und damit eine veränderte Genexpression der Zelle. Dies ist insbesondere bei in vivo Anwendungen und bei der Aufklärung von Proteinfunktionen durch siRNA Transfektionen in komplexen Signal- Pathways von besonderer Bedeutung. Häufig sind verschiedene Signaltransduktionswege der Zelle auch mit den Signaltransduktionswegen des angeborenen Immunsystems gekoppelt. Bei einem Knockdown eines Proteins, der gleichzeitig den physiologischen Status der Zelle massiv beeinflusst, ist die Zuordung der Funktion zum Protein erschwert. Um dies zu vermeiden kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu genutzt werden, die Antwort des angeborenen Immunsystems teilweise oder vollständig zu blockieren. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Transfektion von eukariotischen Zellen. Werden die eukariotischen Zellen in vitro transfiziert, können die Zellen adhärent oder in Suspension in einem geeigneten Kulturmedium vorliegen. Bevorzugt befinden sich die Zellen zum Zeitpunkt der Transfektion in der logarithmischen Phase der Proliferation, falls es sich um eine Transfektion mit DNA handelt. Soll RNA transfiziert werden, befinden sich die Zellen zum Zeitpunkt der Transfektion bevorzugt in der lag oder log-Phase. Soll eine Transfektion mit dem Ziel durchgeführt werden, ein Protein zu exprimieren, kommt als genetisches Material dsDNA mit einem als RNA oder Peptid/Protein exprimierbaren Anteil oder ssRNA mit einem als Peptid/Protein exprimierbaren Anteil (jeweils modifiziert oder unmodifiziert) in Betracht.
Soll eine Transfektion mit dem Ziel durchgeführt werden, durch RNA-I nterferenz einen Knock-down eines Gens zu erreichen, kann modifizierte oder unmodifizierte dsDNA mit einem als small hairpin-RNA (shRNA) exprimierbaren Anteil oder modifizierte oder unmodifizierte siRNA eingesetzt werden; nur in diesem Falle ist eine Aktivierung der TLR 7 und/oder TLR 8 sinnvoll. Jedoch kann eine zusätzliche Blockierung von TLR und/oder Zytokinrezeptoren und/oder die Unterbrechung einer Signaltransduktion durch Blockierung von MEK1 und/oder MEK2 vorteilhaft sein, insbesondere um das Expressionsprofil der Zellen möglichst nicht zu beeinflussen.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann bevorzugt folgende Verfahrensschritte aufweisen:
(a) Bereitstellen einer ersten Lösung mit einem Antikörper, Antagonisten, Inhibitor oder Agonisten gegen ein Zielmolekül; bereitstellen einer zweiten Lösung mit einem nicht-viralen Genliefersystem; und bereitstellen einer dritten Lösung mit dem zu transfizierenden genetischen Material;
(b) Zugabe der ersten Lösung, enthaltend einen Antikörper, Antagonisten oder Inhibitor gegen das Zielmolekül, zu den zu transfizierenden Zellen im Kulturmedium;
(c) Mischen der zweiten Lösung mit dem nicht-viralen Genliefersystem und der dritten Lösung mit dem zu transfizierenden genetischen Material
(d) Inkubation des Gemisches aus Schritt (c);
(e) Zugabe des inkubierten Gemisches aus Schritt (d) zu den mit der ersten Lösung vorbehandelten zu transfizierenden Zellen aus Schritt (b); Erfindungsgemäß kann die erste Lösung einen Antagonisten oder Antikörper gegen einen Zytokinrezeptor oder TLR 1 , TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7, TLR 8, oder TLR 9 als Zielmolekül; einen Inhibitor für das Zielmolekül MEK 1 und/oder MEK 2; oder einen Agonisten für TLR 7 und/oder TLR 8 enthalten; insbesondere einen oben genannten derselben. Ein Antagonist oder Antikörper kann bevorzugt in einer gepufferten Salzlösung, z.B. PBS, Basalmedium, etc., mit einem physiologischen pH-Wert 6,8-7,45 und einer physiologischen Osmolalität 270-310 mosmol/kgH20, oder auch in Wasser oder in ungepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 5-9 gelöst werden. Der Inhibitor kann bei Löslichkeitsproblemen auch in einem geeigneten physiologisch unbedenklichen Solvent, z.B. Ethanol/DMSO verdünnt werden. Die Konzentration des Antagonisten, Antikörpers oder Inhibitors in der ersten Lösung kann 0,01-1 μg/μl betragen.
Erfindungsgemäß kann die Zugabe der ersten Lösung zu den zu transfizierenden Zellen im Kulturmedium im Schritt (b) im Zeitraum 24 h bis 1 s vor der Behandlung der Zellen mit dem Transfektionskomplex (Schritt (e)) erfolgen, bevorzugt im Zeitraum 0,5-5 h. Dies gilt insbesondere, wenn die erste Lösung einen MEK 1- und/oder MEK 2-lnhibitor, oder einen gegen TLR 1 , TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, oder TLR 6 oder Zytokinrezeptor gerichteten Antikörper oder Antagonisten enthält. Die Zugabe erfolgt, indem eine entsprechende Menge der ersten Lösung zum Kulturmedium der zu transfizierenden Zellen hinzugegeben wird. Die resultierende Konzentration des Antikörpers oder Antagonisten im Kulturmedium der zu transfizierenden Zellen kann von 0,01 μg/ml bis 50 μg/ml, bevorzugt 0,05-12 μg/ml, insbesondere 0,1-5 μg/ml betragen. Die resultierende Konzentration des Inhibitors im Kulturmedium der zu transfizierenden Zellen kann 1 nM bis 500 μM, bevorzugt 5-100 μM, insbesondere 10-50 μM betragen.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Mischen der zweiten Lösung mit dem nicht-viralen Genliefersystem und der dritten Lösung mit dem zu transfizierenden genetischen Material (Schritt (c)) durch pipettieren erfolgen. Pro zu transfizierende Zelle kann an zu transfizierendem genetischen Material 0,1 Picogramm/Zelle bis 300 Picogramm/Zelle, bevorzugt 0,2-50 Picogramm/Zelle, insbesondere 1-10 Picogramm/Zelle zu transfizierendes genetisches Material eingesetzt werden. Die Menge des nicht-viralen Genliefersystems richtet sich nach der Menge des genetischen Materials. Im Falle einer elektrostatischen Bindung des nicht-viralen Genliefersystems an das genetische Material definiert sich die Menge durch das Ladungsverhältnis (+/-) zwischen Genliefersystem und genetischem Material. Das Ladungsverhältnis (+/-) Genliefersystem : genetisches Material kann 0,1 :1 bis 100:1 , bevorzugt 1 :1 bis 20:1 , insebsondere 4:1 bis 10:1 betragen. Im Falle einer nicht-elektrostatischen Bindung definiert sich die Menge des nicht-viralen
Genliefersystems über das stöchiometrische Verhältnis zum genetischen Material. Das stöchiometrische Verhältnis nicht-virales Genliefersystem : genetisches Material kann von 0,1 :1 bis 1000:1 , bevorzugt 1 :1 betragen.
Die Mischung der zweiten Lösung mit dem nicht-viralen Genliefersystem und der dritten Lösung mit dem zu transfizierenden genetischen Material kann für einen Zeitraum von 1 min bis 30 min, bevorzugt 10-15 min inkubiert werden.
Vorzugsweise kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein nicht-virales Genliefersystem eingesetzt werden, das ein kationisches Lipid umfasst, insbesondere ein vorstehend erwähntes kationisches Lipid gemäß der Formel (I).
Erfindungsgemäß können nach 24 h die Schritte (a) bis (e) wiederholt werden, um die Zellen ein weiteres Mal mit genetischem Material zu transfizieren. Vorzugsweise sollte vor einer zweiten oder weiteren Transfektion das Kulturmedium mit Additiven, in dem sich die zu transfizierenden Zellen befinden, durch frisches Kulturmedium ersetzt werden.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine erste Lösung mit einem Antagonisten oder Antikörper gegen TLR 3, TLR 7, TLR 8 oder TLR 9 mit einer zweiten Lösung mit einem nicht-viralen Genliefersystem und einer dritten Lösung mit dem zu transfizierenden genetischen Material gemischt werden. Vorzugsweise wird die erste Lösung mit einem Antikörper/Antagonisten zur zweiten Lösung mit einem nicht-viralen Genliefersystem gegeben und gemischt. Die eingesetzte Antikörpermenge beträgt 0,1 Gewichts-% bis 50 Gewichts-% bezogen auf die Menge des nicht-viralen Genliefersystems, bevorzugt 0,1 bis 10 Gewichts-%. Die Menge des nicht-viralen Genliefersystems richtet sich nach der Menge des genetischen Materials das verwendet werden soll. Im Falle einer elektrostatischen Bindung des nicht-viralen Genliefersystems an das genetische Material definiert sich die Menge durch das Ladungsverhältnis (+/-) zwischen Genliefersystem und genetischem Material. Das Ladungsverhältnis (+/-) Genliefersystem : genetisches Material kann 0,1 :1 bis 100:1 , bevorzugt 1 :1 bis 20:1 , insebsondere 4:1 bis 10:1 betragen. Im Falle einer nichtelektrostatischen Bindung definiert sich die Menge des nicht-viralen Genliefersystems über das stöchiometrische Verhältnis zum genetischen Material. Das stöchiometrische Verhältnis nicht-virales Genliefersystem : genetisches Material kann von 0,1 :1 bis 1000:1 , bevorzugt 1 :1 betragen. Die Mischung aus erster und zweiter Lösung wird bevorzugt mindestens 5 min inkubiert. Anschließend wird die dritte Lösung mit zu transfizierendem genetischen Material zu der inkubierten Mischung aus erster und zweiter Lösung zugegeben und es wird gemischt. Pro zu transfizierende Zelle kann an zu transfizierendem genetischen Material 0,1 Picogramm/Zelle bis 300 Picogramm/Zelle, bevorzugt 0,2-50 Picogramm/Zelle, insbesondere 1-10 Picogramm/Zelle zu transfizierendes genetisches Material eingesetzt werden. Dabei wird der Antikörper/Antagonist in den transfektionsaktiven Komplex aus nicht-viralem Genliefersystem und genetischem Material eingebaut. Bevorzugt werden Antikörper/Antagonisten eingesetzt, die mit einem lipophilen Molekülteil modifiziert sind, um die Bindung des Antikörpers/Antagonisten in den Lipoplex zu erleichtern. Es können auch Antikörper eingesetzt werden, die mit dem nicht-viralen Genliefersystem über Avidin/Streptavidin und Biotin verknüpft sind. In diesem Fall müssen das Genliefersystem und der Antikörper entsprechend vorher verändert werden. Auch kann ein gegen TLR 3, TLR 7, TLR 8 oder TLR 9 gerichteter Antikörper kovalent mit dem nicht-viralen Genliefersystem verknüpft sein.
Methoden, kationische Immunoliposomen aus Liposomen, die kationische Lipide umfassen oder Lipoplexe, d.h. DNA und kationische Lipide enthaltende Komplexe, kovalent mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten zu versehen, sind bekannt. Die Verfahren wurden entwickelt, um ein Targeting der Genliefersysteme in Richtung der Zielzellen im Körper zu ermöglichen. Die meisten Methoden nutzen sogenannte Cross-Linker. Cross-Linker sind bifunktionale Moleküle, die eine kovalente Verknüpfung zwischen zwei Molekülen mit entsprechenden funtionellen Gruppen erstellen. Beispielsweise bietet die Firma Pierce eine breite Auswahl von wasserlöslichen und wasserunlöslichen heterobifunktionalen (also für die Verknüpfung zweier unterschiedllicher funktioneller Gruppen geeigneter) und homobifunktionalen (für die Verknüpfung zweier gleicher funktioneller Gruppen geeigneter) Cross-Linker an. Für die Verknüpfung der Antikörper können Carboxyl- und Aminogruppen genutzt werden; bei Fab-Fragmenten kann auch die Thiolgruppe für eine Verknüpfung genutzt werden. Kationische Lipide und Polymere enthalten Aminofunktionen zur Verknüpfung. Bei kationischen Peptiden können Carboxyl- und Aminogruppen für die Verknüpfung genutzt werden.
Kationische Immunoliposomen können wie herkömmliche Liposomen formuliert werden, indem man Antikörper mit Lipiden derivatisiert und zu den kationischen Lipiden (ev. mit Colipiden) vor der Formulierung zugibt. Für die kovalente Verknüpfung durch homobifunktionale Cross-Iinker, wie zB. DSP (dithiobis[succinimidylpropionat]), können Aminofunktionen genutzt werden, um ein Lipid mit einer Aminofunktion mit einem Antikörper kovalent zu verknüpfen. Zur kovalenten Verknüpfung eines Fab-Fragments mit einem Lipid kann auch eine Thiolfunktion und der Cross-Iinker N-succinimidyl-4-(p- maleimidophenyl)butyrat (Martin et al.; J. Biol. Chem.; 1982 257(1), 286) oder SPDP (N - Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionat) genutzt werdendar. Sofern die Crosslinker in Wasser nicht löslich sind, müssen diese Kupplungsreaktionen zwischen Antikörper und Lipid in organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden und vor einer Transfektion eine Reinigung, d.h. Entfernung des organischen Lösungsmittels erfolgen. Zur Reinigung kann Dialyse eingesetzt werden. Ist der Crosslinker in Wasser löslich, z.B. DSP, kann eine kovalente Verknüpfung zwischen dem Lipid und dem Antikörper, z.B. Verknüpfung über Aminofunktionen, in wässriger Lösung erfolgen und eine Reinigung vor der Transfektion ist nicht zwingend nötig.
Verfahren zur Darstellung solcher Lipoplexe mit modifizierten Antikörpern, die kovalent an ein Lipid gebunden sind, sind dem Fachmann bekannt. Die Lipoplexe nehmen dann die modifizierten Antikörper auf (Lee et al.; J. Biomed. Sei.; 2003; 10; 337). Ebenso bekannt sind Methoden um kationische Polymere, wie zB. PEI oder Dendrimere oder kationische Proteine, wie zB. Polylysin (Chen et al.; FEBS Letters; 1994; 338; 167; Suh et al.; J. Controlled Release; 2001; 72; 171 ) kovalent mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten zu verknüpfen. PEI wird dabei zB. mit DPS in DMSO zur Reaktion gebracht und zu einer Antikörperlösung in PBS zugegeben. Nach einer Dialyse steht das mit Antikörper gekuppelte nicht-virale Genliefersystem zur Verfügung (Chiu et al.; J. Controlled Release; 2004); 97; 357).
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren kann die erste Lösung einen Agonisten zur Aktivierung des TLR 7 und/oder TLR 8 enthalten, insbesondere einen der vorstehend angeführten. Der Agonist kann in einer gepufferten Salzlösung, z.B. PBS, Basalmedium, etc, mit einem physiologischen pH-Wert 6,8-7,45 und einer physiologischen Osmolalität 270-310 mosmol/kgH2O, in Wasser oder in einer ungepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 5- 9 gelöst sein. Die Konzentration des Agonisten kann 0,01-1 μg/μl betragen. Diese erste Lösung mit einem TLR 7 und/oder TLR 8 Agonisten kann vor, während oder nach der Transfektion zu den zu transfizierenden Zellen im Kulturmedium zugegeben werden. Der Zeitpunkt der Agonistenbehandlung sollte in Abhängigkeit der Natur des Agonisten so gewählt werden, daß ein möglichst aktives angeborenes Immunsystem auf eine möglichst hohe Anzahl an siRNA trifft. Bevorzugt erfolgt die Zugabe der ersten Lösung mit dem Agonisten gleichzeitig mit der Zugabe des Transfektionskomplexes zu den zu transfizierenden Zellen, indem eine entsprechende Menge an erster Lösung zum Kulturmedium hinzugegeben wird. Die Agonistenmenge richtet sich nach der Zellmenge. Bevorzugt werden 0,1 pg Agonist /Zelle bis 25 ng Agonist/Zelle, bevorzugt 1-500 pg Agonist/Zelle, insbesondere 10 bis 250 pg Agonist/Zelle eingesetzt.
Erfindungsgemäß kann ein erfindunsgsgemäßes Verfahren, d.h. eine Transfektion, auch in vivo erfolgen, wobei die Verfahrensschritte den jeweiligen Verfahrensschritten einer in vitro Transfektion entsprechen, mit der Ausnahme, dass die Zugabe der jeweiligen Lösungen oder Mischungen peroral (p.o.), percutan, sublingual (sl), nasal, intravenös (i.V.), intraartikulär, intraarteriell (i.a.), intralymphatisch, intramuskulär (i.m.), intraossär (i.o.), subkutan (s.c), intrakutan (i.e.), transdermal, rektal, vaginal, inhalativ (p.i. = per inhalation), intrapulmonal, endobronchial (e.b.), intraperitoneal (i.p.), intrakardial, intraneural, perineural, peridural, intrathekal, intrapleural, intravitreal, parenteral, enteral oder buccal erfolgt. Die Menge des genetischen Materials richtet sich nach der Art des genetischem Materials, nach dem Zielkompartiment, z.B. Blut, extrazelluläre Flüssigkeit der Gewebe, Zellgewebe, etc., der Applikationsform und der Art der Zugabe, z.B. Infusion, Injektion, oder Inhalation, und sie beträgt 0,01-500 mg/kg Körpergewicht. Die Menge an Antikörper, Antagonist oder Agonist bei einer direkten Verabreichung einer ersten Lösung an ein Individuum kann 0,1 mg/kg bis 500 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 1-100 mg/kg, insbesondere 5-10 mg/kg betragen. Die Menge an Inhibitor bei einer direkten Verabreichung einer ersten Lösung an ein Individuum kann 0,1 mg/kg bis 500 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 10-300 mg/kg, insbesondere 100- 200 mg/kg betragen. Der Zeitpunkt und die Dauer der Zugabe einer ersten Lösung richtet sich nach dem Zielkompartiment, z.B. Blut, extrazelluläre Flüssigkeit der Gewebe, Zellgewebe, etc., der Applikationsform und der Verabreichungsart, z.B. Infusion, Injektion, Inhalation.
Bei in vivo Anwednungen kann das Zeitintervall zwischen zwei Transfektionen bis zu 6 Wochen betragen.
Erfindungsgemäß wird ferner eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst: a) ein nicht-virales Genliefersystem, c) genetisches Material, und b) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr.
Auch wird erfindungsgemäß ein Kit of parts vorgesehen, der zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst: a) ein nicht-virales Genliefersystem, c) genetisches Material, und b) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr. Erfindungsgemäß umfasst das nicht-virale Genliefersystem insbesondere ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, ein kationisches Protein; und/oder eine Verbindung, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder eine Verbindung, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann.
Erfindungsgemäß kann als genetisches Material beispielsweise genetisches Material zur Reparatur eines Gendefekts, z.B. genetisches Material, insbesondere modifizierte oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNA und/oder modifizierte oder unmodifizierte siRNA eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß kann als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr zumindest ein aktivitätsmindernder oder aktivitätssteigemder Effektor eingesetzt werden.
Weiterhin kann erfindungsgemäß als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr ein Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonist, Inhibitor und/oder eine siRNA eingesetzt werden.
Bevorzugt kann der/die als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr verwendete Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonisten, Inhibitor und/oder siRNA zumindest eine Signaltransduktions- kaskade des angeborenen Immunsystems blockieren.
Weiterhin kann erfindungsgemäß als Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr ein Agonist eingesetzt werden.
Bevorzugt kann der/die als Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr verwendete Agonist zumindest eine Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems aktivieren.
Auch kann das erfindungsgemäße Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr genetisches Material umfassen, das einen Knock-down eines Proteins einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems bewirken kann.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr genetisches Material umfassen, das zur Expression eines Proteins führen kann, welches die Aktivität eines Proteins in einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems blockieren kann.
Bevorzugt kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung für eine Transfektion (a) ein nicht-virales Genliefersystem und (b) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr umfassen, wobei das nicht-virale Genliefersystem:
(i) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfassen kann; und/oder (ii) eine Verbindung umfassen kann, die eine DNA und/oder RNA-bindende
Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen
Membrantransfer auslösen kann; und/oder (iii) eine Verbindung umfassen kann, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr, ausgewählt sein kann aus:
(i) einem Antikörper gegen TLR 1 , TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7,
TLR 8, TLR 9, TLR 10, TLR 11 ,TLR 12, oder TLR 13; (ii) einem Antikörper gegen einen Zytokinrezeptor oder einem Zytokinrezeptor-
Antagonisten;
(iii) einem Inhibitor der Kinase MEK1 und/oder MEK2; (iv) einem Agonisten für TLR7 und/oder TLR8, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrirnidinone),
Imidazochinoline, Thiazolochinoline, und Guanosinanaloga; und (v) einer Kombination derselben.
Ein erfindungsgemäßer Kit of parts zur Transfektion kann bevorzugt (a) ein nicht-virales Genliefersystem und (b) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr umfassen, wobei das nicht-virale Genliefersystem:
(i) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfassen kann; und/oder
(ii) eine Verbindung umfassen kann, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder
(iii) eine Verbindung umfassen kann, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr, ausgewählt sein kann aus:
(i) einem Antikörper gegen TLR 1 , TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7,
TLR 8, TLR 9, TLR 10, TLR 11 ,TLR 12, oder TLR 13; (ii) einem Antikörper gegen einen Zytokinrezeptor oder einem Zytokinrezeptor-
Antagonisten;
(iii) einem Inhibitor der Kinase MEK1 und/oder MEK2;
(iv) einem Agonisten für TLR7 und/oder TLR8, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone), Imidazochinoline, Thiazolochinoline, und Guanosinanaloga; und (v) einer Kombination derselben.
Weiterhin bevorzugt umfasst eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder ein erfindungsgemäßer Kit of parts ein nicht-virales Genliefersystem mit einem kationischen Lipid.
Ferner kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder ein erfindungsgemäßer Kit of parts ein nicht-virales Genliefersystem mit einem kationischen Lipid gemäß folgender Formel umfassen:
wobei sein kann, wobei
R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl oder andere Alkylreste sind, die in allen möglichen Kombinationen gesättigt, ungesättigt, verzweigt, unverzweigt, fluoriert oder nicht fluoriert sein können, und aus 5 bis 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sein können;
O
N Il X = CH-C- NH
/ sein kann; und wobei m = 0 und n = 0; oder m = 0 und n = 1 ; oder m = 0 und n = 2; oder m = 1 und n = 1 ; oder m = 1 und n = 2; oder m = 2 und n = 2 sein können; und g = 1 ,2,3,4,5,6,7 oder 8 sein kann; a = 0,1,2,3,4,5 oder 6 sein kann; b = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; c = 0,1,2,3,4,5 oder 6 sein kann; d = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; e = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann; und f = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein kann.
Bevorzugt können in dem kationischen Lipid R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl sein; m und n = 1 sein; g = 1 ,2,3,4,5,6,7 oder 8 sein; a = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein; b = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein; c = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein; d = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein; e = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein; und f = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 sein.
Erfindungsgemäß kann die Zusammensetzung oder der Kit of parts modifiziertes oder unmodifiziertes genetisches Material enthalten, insbesondere modifizierte oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNS und/oder modifizierte oder unmodifizierte siRNA.
Bevorzugt kann die Zusammensetzung oder der Kit of parts als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr 1 ,4-Diamino-2,3-dicyano-1 ,4-bis(o-amionophenylmercapto)- butadien (U0126); Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1 H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine); Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1 H-imidazo[4,5-c]quinoline-1- ethanol); Gardiquimod (1-(4-amino-2-ethylamino methylimidazo-[4,5-c]quinolin-1-yl)-2- methylpropan-2-ol); CL075; CL097; Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin); lsatoribine (7-Thia-8-oxoguanosin); Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone); oder irgendeine Kombination derselben enthalten.
Ferner kann die Zusammensetzung oder der Kit of parts als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr einen Antikörper gegen TLR 3, TLR 7, TLR 8, oder TLR 9 enthalten.
Weiterhin kann die Zusammensetzung oder der Kit of parts erfindungsgemäß als Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr einen Antikörper oder Antagonisten gegen lnterleukin-1 -Rezeptor, insbesondere IL-ra; Interferon-Typ-I-Rezeptor; Interferon-gamma- Rezeptor; oder Tumornekrosefaktor-Rezeptor enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform können mehrere der vorstehend genannten Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der Immunabwehr miteinander kombiniert werden, d.h. es können zwei, drei oder mehrere Komponenten in dem erfindungsgemäßen Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr eingesetzt werden. Ebenso ist es möglich mehrere der vorstehend genannten Komponenten a) und/oder b) und/oder c) einzusetzen.
Bei dem erfindungsgemäßen Kit of parts können:
- alle Komponenten getrennt voneinander vorliegen, oder
- die Komponenten a) und b) gemeinsam, oder
- die Komponenten a) und c) gemeinsam, oder
- die Komponenten b) und c) gemeinsam vorliegen.
Bevorzugt können in einem Kit of parts: alle Komponenten vollständig getrennt voneinander vorliegen; die Komponenten a) und b) getrennt voneinander vorliegen; oder die Komponenten a) und b) gemeinsam vorliegen.
So können die Komponenten entweder getrennt voneinander z.B. in Glas- oder Plastikbehälter vorliegen, die gemeinsam verpackt sind, oder die Komponenten können zu zweit oder zu mehreren in entsprechenden Behältern bereitgestellt werden. Erfindungsgemäß kann der Kit of parts das nicht-virale Genliefersystem in Form von Salzen, insbesondere formuliert als Liposomen/Micellen; als Lösung, insbesondere in Form einer wässrigen Lösung, Salzlösung, gepufferten Salzlösung, z.B. Salzlösung mit HEPES Puffer, oder Lösung in einem physiologisch unbedenklichen Solvent, z.B. Ethanol/DMSO; in lyophilisierter Form; als Feststoff oder als Film enthalten. Lösungen des nicht-viralen Genliefersystems haben vorzugsweise einen pH Wert von 5 bis 9. Die Endkonzentration des nicht-viralen Genliefersystems im Kulturmedium beträgt vorzugsweise 0,01-10 mg/ml.
Das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr, wie beispielsweise ein Antikörper, Antagonist oder Inhibitor, kann in einem erfindungsgemäßen Kit of parts lyophilisiert; gelöst in Wasser, Salzlösung, gepufferter Salzlösung, z.B. Salzlösung mit PBS Puffer, oder einem geeigneten organischen Solvent, z.B. Ethanol, DMSO, etc, enthalten sein. Lösungen haben vorzugsweise einen pH Wert von 5 bis 9. Optional können Stabilisatoren enthalten sein. Das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr hat liegt vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 10 mg/ml vor.
Kits mit genetischem Material können dieses genetische Material lyophilisiert, gelöst in Wasser, Salzlösung oder gepufferter Salzlösung, z.B. Salzlösung mit TE Puffer enthalten. Lösungen des genetischen Materials haben vorzugsweise einen pH Wert von 5 bis 9. Die Endkonzentration des genetischen Materials im Kulturmedium beträgt vorzugsweise 0,01-10 mg/ml.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder der erfindungsgemäße Kit of parts können zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden.
Ferner kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung als pharmazeutische Zusammensetzung und der erfindungsgemäße Kit of parts als pharmazeutischer Kit of parts vorliegen.
Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder Kit of parts zur Behandlung einer Krankheit durch Gentherapie verwendet werden. Bei der Krankheit kann es sich beispielsweise um cystische Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie, ß-Thalassämie, Krebs, eine Viruserkrankung, eine Degeneration der Macula, Amyotropische Lateral-Sklerose und/oder eine Entzündungserkrankung handeln.
Die vorliegende Erfindung kann auch dazu genutzt werden Transfektionen durchzuführen, ohne das Expressionprofil der Zellen in einem ungewünschten Ausmaß zu verändern. Von besonderem Interesse ist dies bei in vivo Anwendungen, da hier die Aktivierung des Immunsystems häufig ein Problem darstellt.
Besonders auch bei der Untersuchung von Signaltransduktionswegen durch den Knockdown eines beteiligten Proteins durch siRNA ist es unerwünscht, dass übrige Expressionsprofil der Zelle unnötig zu verändern, insbesondere da bekannt ist, dass die Signaltransduktionskaskaden sich gegenseitig häufig beeinflussen.
Beispiele
Allgemeines Material:
1. HeIa Zellen
2. Metafectene Pro, T040-1.0, Biontex Laboratories
3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 92024
4. 48-Well-Platten, Corning Inc., Costar, Produktnummer 3548
5. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-883
6. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-773
7. pCMV-lacZ, Produktnr.: PF462-060207, Plasmidfactory, c= 1 mg/ml in WFI
8. ß-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene
9. HeIa Luc-Zellen (stabil mit Luciferase transfizierte Zellen)
10. Luciferase Assay Kit, Promega
11. BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, Prod-Nr.: 23227
12. Dimethylsulfoxid (DMSO für die Molekularbiologie), Fluka; No. 41639
13. siRNA, entsalzt, 30pMol/μl in Universal Buffer (siMAX von MWG) gerichtet gegen Luciferase GL3 (anti-Luciferase-siRNA): Sense Sequence: CUUACGCUGAGUACUUCGAtt Antisense Sequence: U CG AAG U AC U C AG CG U AAGtt Non-specific control: Sense Sequence: AGGUAGUGUAAUCGCCUUGtt Antisense Sequence: CAAGGCGAU UACACUACCUtt
Beispiel 1
Material:
1. Sheep Polyclonal Antibody against human IFNß, PBL Biomedical Laboratories, Product Number 31400-1 , 0,25 mg/ml (estimate), 2 x 104 Units/ml.
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
1. Tag: Es werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 2,3 * 105 Zellen in ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
2Tag:
Zunächst wird der Antikörper (Sheep Polyclonal Antibody against human IFNß) aufgetaut. Anschließend wird er mit 400μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt und sanft gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,05μg/μl. Anschließend werden die Wells der 24 Well Platte mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
Anschließend wird im Inkubator für 0,5 h inkubiert. Derweilen werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 26 μl DNA (pCMV-lacZ) in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 104 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
Am Ende werden jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
Am dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
4. Tag
Reporterqenassav :
Die Effizienz der Transfektion wird mit dem ß-Galaktosidase Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Platten werden so lange entwickelt bis im Mikroplate-Reader eine Gelbfärbung mit einer Absorption von 1-2 gemessen wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader ausgelesen, und der Mittelwert gebildet.
Ergebnis: Inkubationszeit 9,5 min
Mittelwert von 3 Messungen:
Die Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Figur 1
Beispiel 2
Material:
1. Mouse monoclonal Antibody against Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain 2 (CD118), clone MMHAR-2, Isotype Ig2a, C= 0,5 mg/ml in PBS (Phosphat buffered saline) containing 0,1% bovine serum albumin (BSA), PBL Biomedical Laboratories, Product-No: 21385
Detaillierte Versuchsbeschreibung: Analog Beispiel 1 Abweichungen:
Zunächst wird der Antikörper (Mouse monoclonal Antibody against Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain) mit 400μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt und sanft gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,1 μg/μl. Die Wells der 24 Well Platte werden mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
Die Lipoplexzugabe erfolgt nach 5 h Inkubationszeit mit dem Antikörper
Ergebnis: Inkubationszeit: 4min Mittelwert von 3 Messungen:
Die Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Figur 2
Beispiel 3
Weitere Versuche mit Antikörpern gegen Rezeptoren & Zytokine
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
1. Tag: Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 1 ,2 * 105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
2.Tag:
Der Antikörper wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,05μg/μl eingestellt. Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
Anschließend wird im Inkubator je nach Antikörper für 5 oder 0,5 h inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl DNA (pCMV-IacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert. Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
Am dritten Tag wird das Medium der Spalten 3 und 4 erneuert. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
4. Tag
Reportergenassav :
Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
Ergebnisse: Antikörper:
Mouse Anti-human-CD282 Antibody (= anti TLR2), monoclonal, AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2484EL
Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5h Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5 Mittelwert von 3 Messungen:
Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Figur 3
Antikörper:
Mouse Anti-human TLR3 Antibody, monoclonal, Lifespan Biosciences Kat-nr.: LS- C18685
Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5 h Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5,5 Mittelwert von 3 Messungen:
Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Figur 4
Antikörper:
Mouse Anti-human-CD284 Antibody (= anti TLR4), monoclonal, AbD Serotec, Kat-nr. MCA2061 EL
Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5 h Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5,5 Mittelwert von 3 Messungen:
Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Figur 5
Antikörper:
Antikörper: Mouse Anti human TLR1 Antibody (monoclonal, 0.05% Natriumazid, 100 μg Lyophilisat); Invivogen, No. Mab-htlr1.
Zur Entfernung des Natriumazides wurde der Antikörper gegen PBS dialysiert: Dialysemembran: Spectra/Por DispoDialyser (500μl, Celluloseestermembran, 25000 Da Molecular Weight Cut-Off); Spectrum Laboratories; No. 135492, Lot 3224004.
Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5 h Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 4 Mittelwert von 3 Messungen:
Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Figur 6
Beispiel 4
Weitere Versuche mit Antagonisten
Detaillierte Versuchsbeschreibung: 1. Tag: Analog Beispiel 3
2.Tag:
Der Antagonist wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,025μg/μl eingestellt. Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
Anschließend wird im Inkubator für 7 inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl DNA (pCMV-lacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert. Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
3. Tag:
Analog Beispiel 3
4. Tag
Reporterqenassav :
Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
Ergebnisse:
Antagonist:
Human lnterleukin-1 Receptor Antagonist (IL1-ra Human), Biomol, Kat.-Nr.: 54592
Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 7h
Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 10 Mittelwert von 3 Messungen:
1 2 3 4
A 0,436 0,433 0,932 0,820
B 0,427 0,448 0,791 1 ,021
C 0,415 0,435 0,856 1 ,185
D 0,393 0,439 1 ,035 1 ,026
E 0,392 0,460 1,076 1 ,081
F 0,443 0,455 1,161 1 ,207
Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Figur 7
Beispiel 5
Weiterer Versuch mit einem Kinase-Inhibitor: MEK1 und MEK2 Inhibitor:
U0126, i ^-Diamino^.S-dicyano-i ^-bisCo-amionophenylmercaptoJbutadiene, MW = 380,5, Invivogen, Kat.-Nr.: tlr-uO126.
Detaillierte Versuchsbeschreibung: I. Taq: Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 0,8 * 105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
2.Tag:
1 mg Inhibitor wird in 100 μl DMSO gelöst (Stocklösung). Anschließend wird mit PBS 1 :20 verdünnt (Arbeitslösung). Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt:
Anschließend wird im Inkubator für 2 h inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 5 μl DNA (pCMV-lacZ) in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 20 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
Am Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in jedes Well gegeben. Anschließend wird 48 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
Am dritten Tag wird das Medium erneuert und die in der Tabelle angegebenen Inhibitormengen ersetzt. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden ohne Inkubationszeit wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
4. Tag
Reporterqenassay :
Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
Ergebnisse:
Vorinkubationszeit mit dem Inhibitor vor der Transfektion: 2h
Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 10 Mittelwert von 3 Messungen:
F E D C B A
1 0,63 0,72 0 ,92 0 ,79 0 ,90 0, 97
Figur 8
Beispiel 6
Weiterer Versuch mit HepG2 Zellen
Durchführung anlalog Beispiel 3
Abweichungen: HepG2 Zellen, Antikörperkonzentration 0,1 μg/μl statt 0,05 μg/μl in PBS1
Lipoplexbildung in serumfreien DMEM statt in PBS
Antikörper:
Mouse Anti-human-CD282 Antibody (= anti TLR2), monoclonal, AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2484EL
Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion: 5h Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 4
Mittelwert von 3 Messungen:
Die Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Figur 9
Beispiel 7
Weiterer Versuch mit einem Antikörper gegen TLR9 mit Einbau in einen Lipoplex
Antikörper:
Rabbit Anti-human-TLR9 Antibody (= anti TLR9), polyclonal, 0,5 μg/μl in PBS, 0,2%
Gelatine, 0,05% Natriumazid, Lifespan Biosciences, Kat-nr.: MCA2484EL.
Zur Entfernung des Natriumazides wurde der Antikörper gegen PBS dialysiert: Dialysemembran: Spectra/Por DispoDialyser (500μl, Celluloseestermembran, 25000 Da Molecular Weight Cut-Off); Spectrum Laboratories; No. 135492, Lot 3224004.
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
I. Tag: Es werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 1 ,0 * 105 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
2.Tag:
Der Antikörper wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,1 μg/μl eingestellt. 15 μg DNA (pCMVßGal) und 60 μl Metafectene Pro werden jeweils in 300 μl serumfreien DMEM gelöst. Durch sanftes Auf- und Abpipettieren werden die einzelnen Lösungen gemischt. Anschließend werden Lipoplexe folgender Zusammensetzung hergestellt.
Dabei wird zunächst die Metafectene Pro-Lösung mit der Antikörperlösung vereint und für fünf Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wird die DNA-Lösung und das serumfreie DMEM hinzugegeben und weitere 15 Minuten bei RT inkubiert. Jeweils 50 μl der DNA-Antikörper-Lipidkomplexe werden in die Wells pipettiert. Dabei wird die Lösung 1 in vier Wells der Spalte 1 pipettiert. Lösung 2 in vier Wells der Spalte 2 und so weiter. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
3. Tag
Das Medium aller Zeilen wird erneuert. Für die Zeilen C und D wird eine zweite Transfektion analog der Transfektion am ersten Tag durchgeführt.
4. Tag
Reportergenassav :
Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
Ergebnisse:
Mittelwert von 3 Messungen:
Die Zeien 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es wird daher der Mittelwert gebildet:
Die zugegebene Antikörpermenge enspricht folgenden Mengen Antikörper pro Well:
Figur 10
Beispiel 8 siRNA Transfektion in Anwesenheit der Kinase Inhibitoren: p38/RK MAPK-Inhibitor: SB203580, Invivogen; No. tlrl-sb20 MEK-Inhibitor: U0126, Invivogen, No. tlr-uO126
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
j. Taq: Es werden HeLa-Luc Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wird eine Zellzahl von 1 ,5 x 104 Zellen in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
2.Taq: Zuerst werden die Inhibitoren vorbereitet:
SB203580 (M = 377,43 g/mol): 1 mg wird in 20 μl DMSO gelöst. Die Stocklösung wird mit
PBS 1 :105 verdünnt.
U0126 (M = 380,49 g/mol): 1 mg des Inhibitors wird in 100 μl DMSO gelöst. Die Stocklösung wird mit PBS 1 :20 verdünnt.
Die Wells der 48 Well Platte werden mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt:
Anschließend wird im Inkubator für 2 h inkubiert. Danach werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu wird 1 μl anti-Luciferase-siRNA Stocklösung in 300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. Von dieser Lösung werden nur 240 μl weiterverwendet. 1 μl non-specific-control-siRNA wird in 300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. Von dieser Lösung werden nur 40 μl weiterverwendet.
3 μl Metafectene Pro werden in 225 μl PBS einpipettiert und ebenfalls durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden 190μl zur anti-Luciferase-siRNA Arbeitslösung und 35μl zur non-specific-control-siRNA Arbeitslösung pipettiert. Die Lösungen werden gemischt und 15 min inkubiert. Es resultieren Lipoplexe mit einem siRNA-Reagenzverhältnis von 1 :5 μg/μl- Am Ende werden jeweils 15 μl der anti-Luciferase-siRNA-Lipoplexlösung in die ersten 6 Reihen der Platte gegeben. 15 μl der non-specific-control-siRNA- Lipoplexlösung werden in die 7. Reihe der Platte gegeben. Es resultiert eine siRNA Menge von 1 pMol/Well. Die Reihe 8 bleibt untransfiziert. Anschließend wird 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
3. Tag:
Am dritten Tag wird das Medium aller Wells erneuert und die in der Tabelle angegebenen Inhibitormengen ersetzt. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion werden nach der Inhibitorzugabe für die Spalten E und C wiederholt. Anschließend wird weitere 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.
4. Tag
Luciferase-Assay und BCA Protein Assay:
Beide Assays werden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt.
Auswertung:
Von der 48 Well Platte wir das Medium entfernt und die Zellen mit 100 μl PBS gewaschen. Anschließend werden 120 μl Luciferase-Lysispuffer hinzugegeben. Die Platte wird auf Eis ca. 30 Minuten inkubiert und 20-30 Sekunden durch vorsichtiges Schütteln (Klopfen) gemischt. Nun werden von dieser 48 Well Platte pro Well 25 μl entfernt und mit analoger Belegung in eine zweite 48 Well Platte gegeben. Mit der ersten Platte wird der Luciferase Assay mit der zweiten Platte der BCA Test durchgeführt.
Luciferase Assay:
Parametereinstellungen des Luminometers: Messzeit: 15 sec
Zeitintervall zwischen Lösungsinjektionen: 0,5 sec Intervall zwischen Lösungsinjektion und Messung: 0,1 sec
BCA Protein Assay:
Auswertung bei Wellenlänge 562 nm
Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt. Im Fall des Luciferase Assays dreimal mit drei neuen Zellextrakten. Die erhaltenen Werte des Luciferase-Assays (RLU) wurden auf 1 μl Zellextrakt und 1 sec Messzeit normiert. Die erhaltenen Werte des BCA Protein Assays wurden ebenfalls auf 1 μl Zellextrakt normiert. Luciferase Assay: RLU/μl Zellextrakt/sec Mittelwert von 3x3 Messungen:
BCA Assay: ABS/μl Zellextrakt
Mittelwert von 3 Messungen:
Figur 11 Beispiel 9 siRNA Transfektion in Anwesenheit der TLR7/8 Agonisten:
Imiquimod, InvivoGen, Kat.-Nr.: tlrl-imq ssRNA40/LyoVec, InvivoGen, Kat.-Nr.: tlrl-lrna-40
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
Vorbereiten der Zellen:
Es soll eine Zellzahl von 2 x 104 Zellen/cm2 in ein Well in 250 μl komplettem Medium ausplattiert werden.
Herstellung der Lipoplexe:
Zunächst werden die ersten 5 Wells der ersten 3 Reihen einer 48 Well Platte mit jeweils 30 μl PBS gefüllt.
Die Stocklösung der anti-Luciferase-siRNA und der non-specific-control-siRNA wird mit PBS auf eine Konzentration von 1 pmol/10 μl eingestellt. Anschließend werden jeweils 10 μl der
Arbeitslösung der anti-Luciferase-siRNA in die ersten 3 Wells der der ersten drei Reihen der
48 Well Platte pipettiert. In die jeweils vierten Wells werden jeweils 10 μl der Arbeitslösung der non-specific-control-siRNA pipettiert.
Das Metafectene Pro Reagenz wird mit PBS 1 :300 verdünnt. Von dieser Verdünnung werden jeweils 20 μl in jedes Well mit siRNA gegeben.
Anschließend werden die Lipoplexe für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden pro Well 250 μl Zellsuspension zugegeben.
Analog wird eine zweite Platte bestückt.
Zugabe der Agonisten :
In die ersten 2 Spalten der beiden 48 Well Platte werden 2 verschiedene Agonisten hinzugegeben. Dabei werden 3 verschiedene Arbeitskonzentrationen der Agonisten verwendet. Die Agonisten liegen lyophilisiert vor. Sie werden mit endotoxin-freiem Wasser zu Stocklösungen mit der Konzentration 100μg/ml gelöst. Die Stocklösungen werden jeweils 1 :10 mit Wasser zu Arbeitslösungen verdünnt. Von der Imiquimod-Arbeitslösung werden in A1 0,78 μl (=0,25 μg/ml Endkonzentration), in
A2 15,5 μl (=5μg/ml) und in A3 31 μl (=10μg/ml) pipettiert.
Von der ssRNA40/LyoVec-Arbeitslösung werden in B1 0,78 μl (=0,5 μg/ml Endkonzentration ssRNA40), in B2 15,5 μl (=5μg/ml) und in B3 31 μl (=10μg/ml) pipettiert.
Nach der Zugabe der Agonisten werden die beiden 48 Well Platten für 48 Stunden im CO2-
Inkubator inkubiert.
Vitalitätsbestimmunq:
Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden werden die Zellen einer Platte trypsiniert und mittels einer Neubauer-Zählkammer eine Vitalitätbestimmung mit Trypanblau für jedes Well durchgeführt.
Luciferase-Assav und BCA Protein Assay: Analog Beispiel 13
Ergebnisse
Trypanblaufärbung:
Es wurden zwischen 40 und 70 Zellen ausgewertet.
Luciferase Assay: RLU/μl Zellextrakt/sec
Mittelwert von 3x3
Messungen:
BCA Assay ABS/μl Zellextrakt Mittelwert von 3x3 Messungen:
Figur 12
Die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Beispiele lassen auch den Schluss zu, dass nicht nur das genetische Material, sondern auch die chemischen Agentien wie zb. kationische Lipide und kationische Polymere von den TLRs detektiert werden. Nach den vorliegenden Ergebnissen muss man davon ausgehen, dass im Fall von HeIa Zellen, Metafectene Pro als Transfektionsreagenz und DNA (Plasmid) hoher Qualität folgende TLRs involviert sind. TLR 4 detektiert Spuren von LPS in der Plasmidlösung. TLR9 und TLR3 detektieren genetisches Material, also in diesem Fall Plasmide oder entsprechende Verunreinigungen. TLR1 und TLR2 detektieren das Transfektionsreagenz.
Zwanglos lässt sich damit möglicherweise auch erklären, dass unterschiedliche Zellen bei unterschiedlichen Verhältnissen von genetischem Material und Transfektionsreagenz optimale Ergebnisse zeigen. Zellen die zB. sehr viele TLR9 und wenige TLRs für die Reagentien exprimieren, sollten demnach bei einem Verhältniss optimale Ergebnisse zeigen, bei dem wenig DNA auf viel Reagenz trifft.
Es ist einleuchtend, das die Aktivierung der TLRs vor und während der Transfektion von vielen Faktoren abhängt. Je nach Expressionsprofil der Zielzelle kann dabei zB. eine besondere Empfindlichkeit der Zellen gegenüber bestimmten PAMPs gegeben sein. Weiter können unterschiedliche Reagentien und unterschiedliches genetisches Material unterschiedliche TLRs aktivieren. Selbst unterschiedliche DNA Sequenzen können je nach CpG Gehalt Einfluss auf die Transfektionsergebnisse nehmen. Nicht zuletzt spielen auch Verunreinigungen eine nicht zu unterschätzende Rolle. So kann DNA bakteriellen Ursprungs beispielsweise mit LPS oder Flagellin oder RNA verunreinigt sein. ssRNA kann mit dsRNA verunreinigt sein und damit ausser TLR7/8 auch TLR3 ansprechen und umgekehrt. Unterschiedliche Behandlung der Zellen kann durch Stress-Signaltransduktionkaskaden zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass für unterschiedliche Transfektionsexperimente unterschiedliche Blockierungsstrategien erforderlich sind.
Die unterschiedlichen Transfektioneergebnisse zur Blockierung des angeborenen Immunsystems bezüglich einfacher und repetitiver Transfektion lassen sich ebenfalls deuten. Es ist bekannt, dass die Endozytose, also der äußere Membrantransport, stark durch Kinasen reguliert ist. Über den schnellen Weg der Phosphorylierung kann die die Zelle bei der Detektion pathogen assoziierter Muster die Endozytose herunterregulieren und damit ein Enfallstor für Pathogene schliessen. Da die Signaltransdukionskaskaden auch über Kinasen das Signal weiterleiten, ist hier ein Zusammenhang zu vermuten. Deutliche Zuwächse der Transfektionseffizienz schon bei der ersten Transfektion deuten darauf hin, dass schnelle Abwehrprozesse unterbunden wurden, also vermutlich auch der Memrantransport. Abwehrprozesse, die über die Expression spezielle Proteine oder Zytokine laufen, dauern erheblich länger und sind dabei in einem Zeitschema erst bei einer Doppeltransfektion wirksam. Eine Steigerung der Transfektionseffizienz nach einem Tag durch eine repetitive Transfektion deutet auf eine reduzierte Expression eines oder mehrerer für den Abwehrprozess wichtigen Proteine hin.
Nur im Falle der Transfektion von siRNA lässt sich mit einer Aktivierung von TLRs eine Verbesserung des Transfektionesergebnisses erzielen, da hier die benötigte RNAi- Maschinerie Bestandteil des angeborenen Immunsystems ist. In diesem Fall kann allerdings auch eine Blockierung verschiedener Signaltransduktionswege (Beispiel U0126) vorteilhaft sein.
Wie bereits ausgeführt, kann die Erfindung zu Therapiezwecken eingesetzt werden. Insbesondere kann die Erfindung für die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie,
Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie, ß- Thalassämie und Krebs genutzt werden. Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant, wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels der Erfindung effektiv in Zellen gebracht werden, in denen diese DNA die gewünschte Wirkung entfalten kann ohne dabei zu unerwünschten Nebenwirkungen zu führen. Die gewünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel durch Antisense-DNA / RNA oder siRNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten Zelltyp sein. Auf diese Weise können z.B. tumorunterdrückende Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung cholesterolregulierender Gene ein Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und Blutgefäßkrankheiten geleistet werden. Weiters kann DNA, welche Ribozyme, siRNA oder shRNA kodiert, oder Ribozyme oder siRNA selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation der DNA erzeugt aktive Ribozyme oder siRNA, die an spezifischen Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel virale m-RNA gespalten werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehrungszyklus von Viren (HIV, Herpes, Hepatitis B und C, respiratorisches Syncytial Virus) kann auf diesem Wege unterbrochen werden. Weitere Erkrankungen, die speziell über die Behandlung mit siRNA geheilt werden sollen sind die altersbedingte Degeneration der Macula (Augenerkrankung), Leberkrebs, solide Tumoren, Amyotropische Lateral-Sklerose und Entzündungserkrankungen. Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion beispielsweise zur Herstellung von Krebsvakzinen eine immer größer werdende Rolle. Damit ist jene auch mögliches Anwendungsgebiet für die Erfindung.
Eine weitere Anwendung kann die Erfindung zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogene Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden z.B. Lipid / DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt. Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expression des immunogenen Peptids und löst somit die adaptive Immunantwort aus.
Im folgenden werden erfindungsgemäß beispielhafte, aber keinesfalls beschränkende Definitionen aufgeführt:
Transfektion:
Einschleusen von genetischem Material in eine eukariotische Zelle.
Transfektionsergebnis/Transfektionseffizienz
Menge einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches unter anderem dieses exprimierte Protein codiert oder Ausmaß eines Knock-downs einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches einen solchen Knock-Down auslösen kann, insbesondere siRNA oder Ribozyme oder DNA, die für shRNA oder Ribozyme codiert oder Anteil der Zellen einer Gesamtpopulation von Zellen, die die biologische Wirksamkeit des eingeschleusten genetischen Materials in Folge von Transfektionsprozessen zeigt. Gleichzeitig soll der physiologische Status der Zellpopulation so wenig wie möglich beeinflusst werden, das heisst das Protein-Expressionsprofil der Zellpopulation soll sich idealerweise nur bezüglich der Proteine ändern, deren Gene in die Zelle eingeschleust wurden oder deren Expression durch das eingeschleuste genetisches Material herabgesetzt oder verhindert werden soll.
Nicht-virales Genliefersystem:
Nicht-virale Genliefersysteme werden nicht durch Rekombination genetischen Materials von natürlich vorkommenden Viren erzeugt. Sie sind in der Lage genetisches Material in eukariotische Zellen einzuschleusen. Insbesondere handelt es sich bei den nicht-viralen Genliefersystemen um physikalische Methoden und chemische Methoden. Physikalische Methoden lokalisieren mindestens das genetische Material in der Nähe der Zelle, insbesondere nutzen physikalische Verfahren jedoch Energiezufuhr insbesondere in Form von thermischer, kinetischer, elektrischer oder sonstiger Energie um einen Transport des genetischen Materials durch die Zellmembran zu vermitteln. Chemische Methoden beruhen entweder auf einer chemischen Veränderung oder Derivatisierung der Nukleinsäuren, die sie insbesondere zellgängig machen oder bestehen insbesondere aus Stoffen, die DNA binden und einen Transport durch die Zellmembran vermitteln können. Insbesondere nutzen diese zur Bindung der Nukleinsäuren elektrostatische Kräfte oder Wasserstoffbrückenbindungen. Wiederum insbesondere geschieht der Transport der DNA durch die Zellmembran durch einen aktiven Transportmechanismus der Zelle, der Endozytose. Stoffe, die diese Eigenschaften aufweisen enthalten insbesondere kationische Lipide, kationische Polymere, kationische Peptide oder auch Moleküle die eine Domäne haben, die DNA oder RNA binden kann und zugleich eine zweite Domäne haben, die eine Liganden enthält, der von einem Rezeptor auch der Zelloberfläche erkannt wird und durch diesen Erkennungsprozess Endozytose auslöst. Eine zweite Möglichkeit besteht darin, daß dieser Ligand in der Lage ist einen Membrantransfer auszulösen, d.h. einen Transport auf die andere Seite der Membran vermitteln. Die Stoffe können auch besonders formuliert sein, insbesondere als Micellen oder Liposomen und auch aus mehreren Komponenten insbesondere mit unterschiedlicher Funktion bestehen.
Gentherapie
Therapie zur Heilung oder Linderung von Krankheiten bei der als Wirkstoff modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren eingesetzt werden.
Angeborene Immunabwehr
Die angeborene Immunabwehr grenzt sich von der erworbenen oder adaptiven Immunabwehr dahingehen ab, dass sie einen Erreger abwehrt, ohne dass es vorher jemals zu einem Kontakt mit dem Erreger gekommen sein muss, um das Immunsystem zu schulen. Die angeborene Immunabwehr ist den meisten Zelltypen zuneigen und besteht aus zwei Teilen, dem intrazellulären und dem interzellulären Anteil. Der intrazelluläre Anteil nutzt die Erkennung von Pathogenen zuzuordnenden molekularen Strukturen durch Rezeptoren. Diese Rezeptoren stoßen insbesondere Signaltransduktionskaskaden an, die insbesondere durch Expression vieler zelleigener Gene und Phosphorylierung wichtiger Proteine in einem geänderten physiologischen Status (zB. „antiviralen Status") der direkt betroffenen Zellen münden. Zusätzlich werden Zytokine ausgeschüttet. Über den interzellulären Anteil des angeborenen Immunsystems benachrichtigen betroffene Zellen über diese Botenstoffe (Zytokine) nichtbetroffene Zellen und lösen auch dort einen geänderten physiologischen Status (zB. „Antiviralen Status") aus. Dabei docken die Zytokine an Zytokin-Rezeptoren der anderen Zellen an und lösen wiederum eine Signaltransduktionskaskade aus. Der interzelluläre Anteil grenzt sich also vom intrazellulären Anteil durch die unterschiedlichen Rezeptoren (Zytokinrezeptoren statt PRRs (pattern recognition receptors) und Agonisten (Zytokine statt pathogene Muster) ab.
Antiviraler Status
Status von Zellen, der sich dadurch auszeichnet, dass die Zelle versucht die mögliche biologische Wirksamkeit von fremdem genetischen Material durch Gegenmaßnahmen zu unterbinden.
Transfektion in vivo
Das Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet in einem lebenden
Organismus statt.
Transfektion in vitro
Das Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet außerhalb eines lebenden Organismus statt, insbesondere in Gefäßen, die sich zur Kultivierung von eukariotischen Zellen eignen.
Genetisches Material
Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren, die insbesondere aus zwei wenigstens teilweise komplementären Strängen (doppelsträngig = ds) bestehen z.B. dsDNA und dsRNA, oder die insbesondere aus einem Strang (einzelsträngig = ss) besteht, z.B. ssDNA und ssRNA, der teilweise komplentäre Bereiche aufweisen kann, die über Wasserstoffbrückenbindung miteinander verbunden sein können. Das genetische Material dient im Falle von DNA zur Erzeugung von RNA und/oder Proteinen. Im Falle von ssRNA dient es zur Erzeugung von Proteinen. Im Falle von dsRNA dient das genetische Material dazu einen Knockdown eines Gens durch RNA-Interferrenz zu erreichen.
Modifiziertes genetisches Material Natürliche Nukleinsäuren, die durch Modifikation in ihren Eigenschaften verändert wurden. Dabei können diese Modifikationen insbesondere chemische Veränderungen sein, die insbesondere das Phosphatgerüst, die Zucker oder Basen betreffen, was insbesondere die Stabilität der Nukleinsäuren gegen Nukleasen und Ribonukleasen erhöhen soll. Weiters können Moleküle (Labels) an die Nukleinsäuren kovalent oder nicht-kovalent angeheftet werden, die zu neuen Eigenschaften der Nukleinsäuren führen, insbesondere zu optischer Verfolgbarkeit durch Fluoreszenzlabels oder Labels, die die Nukleinsäuren zu einen bestimmen Ort in der Zelle dirigieren (Lokalisationselemente) oder Labels, die den Durchtritt von Nukleinsäuren durch Membranen vermitteln und so Nukleinsäuren beispielsweise zellgängig machen.
Ein Beispiel für eine Modifikation ist der Austausch von Sauerstoff gegen Schwefel im Phosphatgerüst, die Methylierung von 2'-OH Gruppen der Ribose im Falle von RNA, oder die vollständige Subtitition von 2'OH Gruppen durch Fluor, um die Stabilität gegen Nukleasen zu erhöhen. Ein weiteres Beipiel ist das Anheften von FITC (fluorescein isothiocyanate) als Fluoreszenzlabel, um den Weg des genetischen Materials in der Zelle mikroskopisch verfolgen zu können oder das Anheften von sogenannten NLS (Nuclear localisation Signals, zB. PKKKRKVG) um einen Transport in den Zellkern zu erreichen.
siRNA (short interfering RNA):
Kurze dsRNA (bis 28 bp) die durch RNA-I nterferenz den Knock-Down eines Proteins bewirken kann.
shRNA (short hairpin RNA):
Kurze ssRNA, die am 3'-Ende und am 5'-Ende komplementäre Bereiche besitzt und dadurch über Wasserstoffbrückenbindung hybridisieren und eine Haarnadelstruktur ausbilden kann. shRNA kann durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines Proteins bewirken.
Rezeptor:
Molekül, das in der Lage ist einen Stoff (Agonist) zu detektieren und damit eine biologische
Reaktion auslöst, Insbesondere handelt es sich bei Rezeptoren um Proteine.
Blockierung:
Verhinderung der biologischen Funktion, insbesondere von Proteinen.
Unterdrückung: Unterbrechung des Kommunikationsnetzes der Immunabwehr, d.h. von einer oder mehreren eine Immunantwort auslösenden Signaltransduktionskaskade(n), insbesondere der angeborenen intra- und/oder interzellulären Immunabwehr. Durch diese Unterbrechung wird die Immunabwehr geschwächt, wodurch sich die Immunantwort verringert.
DNA/RNA-bindende Domäne:
Bereich in einem Molekül das DNA kovalent oder über nicht kovalente Wechselwirkungen gebunden trägt, insbesondere sind die nicht kovalenten Wechselwirkungen elektrostatische Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen.
Signaltransduktionskaskade
Ausgehend von einem Rezeptor, der die Anwesenheit eines Stoffes durch Anlagerung dieses Stoffes an den Rezeptor detektiert, wird die Information über die Anwesenheit dieses Stoffes in ein Signal umgewandelt und über eine Kette von Molekülen durch Signaltransduktion weitergetragen. Am Ende steht eine biologische Reaktion. Insbesondere wird das durch den Rezeptor erzeugte Signal von Adaptermolekülen aufgenommen und insbesondere über Kinasen insbesondere an Transkriptionsfaktoren weitergetragen. Die Transkriptionsfaktoren stimulieren die Expression von Genen, die die biologische Reaktion vermitteln.
Knock-down
Abschwächung oder Ausschaltung der Translation einer mRNA zu einem Protein bei der
Proteinbiosynthese.
Antikörper
Moleküle, insbesondere Proteine, die in der Lage sind molekulare Strukturen, insbesondere andere Proteine, zu erkennen und durch Bindung dessen biologische Wirkung beeinflussen. Im erfindungsgemäßen Zusammenhang handelt es sich um blockierende Antikörper, d.h. im Falle der Rezeptoren des angeborenen Immunsystems wird die Signalweiterleitung verringert oder unterbunden. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Die Antikörper können humanisiert sein. In der Regel müssen Sie gegen den Rezeptor einer Spezies gerichtet sein, dessen Zellen transfioziert werden sollen. Aufgrund der Ähnlichkeit der der Rezeptoren, kann es aber auch vorkommen, daß ein Antikörper kreuzreaktiv ist. Weiters können die Antikörper modifiziert sein, d.h. es können zb. Molekülteile (zB. Fc- Fragmente, sodaß nur noch Fab Fragmente verbleiben) abgespalten sein, sofern damit die biologische Wirkung nicht wesentlich verringert wird.
Weiters können zusätzlich Molekülteile an dem Antikörper angebracht werden, die dem
Antikörper zusätzliche Eigenschaften verleihen, sofern damit die biologische Wirkung nicht wesentlich verringert wird.
Ein Beispiel ist das Anbringen von Fluoreszenzlabels oder das Anbringen von hydrophoben
Resten (zB. Phospholipide, A. Schnyder et al.; J. Am. Soc. for Exp. NeuroTherapeutics;
2005; 2; 99-107) um eine Verankerung in Membranen und/oder Liposomen zu erleichtern.
Intrabodies
Intrazellular exprimierte Antikörper.
Aptamere
RNA-Moleküle, die durch Ausbildung einer Tertiärstruktur in der Lage sind molekulare Strukturen, insbesondere Proteine, ähnlich einem Antikörper zu erkennen und durch Bindung dessen biologische Wirkung beeinflussen. Aptamere können aus modifizierter oder unmodifizierter RNA oder DNA bestehen.
Antagonist
Substanz, die einen Agonisten durch Blockierung eines entsprechenden Rezeptors in seiner
Wirkung hemmt, ohne selbst einen Effekt auszulösen.
Agonist
Ein Agonist ist in der Lage durch Bindung an einen Rezeptor eine biologische Wirkung zu erzielen.
Antivirale Zytokine
Zytokine, die bei einer Infektion einer eukariotischen Zelle mit Viren exprimiert werden. Beispiele sind Interferon alpha, Interferon beta, Interferon gamma, TNF alpha, TFN beta, lnterleukin 6,8,15,28 und 29. Inhibitoren
Moleküle, die die biologische Wirkung eines anderen Moleküls, insbesondere von Proteinen inhibieren können. Insbesondere sind die Inhibitoren selbst Proteine, modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren oder kleine organische Moleküle.
TLRs, RIG-I-Helikase, RIG-l-like Helikase
Rezeptoren die speziesübergreifend in Gruppen nach ihrer Funktion zusammengefasst werden.
Adaptermoleküle
Moleküle die ein Signal von Rezeptoren übernehmen und die speziesübergreifend in
Gruppen nach ihrer Funktion zusammengefasst werden.
Abkürzungen
AP-1 = Activated protein-1
ERK = Extracellular-signal Regulated Kinase
IkB = Inhibitory-binding protein kB
IKK = IkappaBKinase = inhibitory-binding protein KB kinase
IKKa = lkkalpha= I Kappa Kalpha = IKK1
IKKb = IKKbeta = I Kappa Kbeta = IKK2
IKKd = IKKdelta = I Kappa Kdelta
IKKe = IKKepsilon = I Kappa Kepsilon
IKKg = IKK gamma = I Kappa Kgamma= IKK3
IKKi = IKK epsilon
IRAK1 = Interleukin 1 Receptor-Associated Kinase 1
IRAK4 = interleukin-1 receptor-associated kinase 4
IRF = Interferon regulating Factor
JNK = c-Jun N-terminal Kinase
JAK = Janus activated Kinaste
Mal = TIRAP= MyD88-adapter-like
MAPK = Mitogen activated Protein Kinase
MEK = MAPK/ERK kinase
MKK = MAP Kinase Kinase
MKK = Mitogen-activated protein kinase kinase
MSK = Mitogen and stress activated kinase
MyD88 = Myeloid differentiation factor 88
NAP 1 = Nck-associated protein 1
NEMO = IKK gamma
NF-kB = Nuclear Factor kappaB
P1 3K = Phosphoinositol-3-Kinase
PKR = Protein Kinase R = Protein Kinase RNA-activated
PKB = Protein Kinase B
PDK1 = Phosphoinositide-dependend Protein Kinase 1
PDK2 = Phosphoinositide-dependend Protein Kinase 1
Rad = Ras-related C3 botulinum toxin Substrate 1
RIP1 = Receptor-interacting protein 1
STAT = Signal Transducers and Activators of Transcription
TAKI= Transforming growth factor-ß-activated kinase
TBK1 = IKKd= TANK-binding Kinase
TIRAP = Mal =Toll-interleukin 1 receptor (TIR) domain-containing adapter protein
TRAF3 = TNF receptor-associated factor 3
TRAF6 = TNF receptor-associated factor 6
TRAM = TRIF-related adaptor molecule
TRIF = Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing interferon-b adaptor protein

Claims

Ansprüche
1. Zusammensetzung für eine Transfektion, umfassend: a) ein nicht-virales Genliefersystem, wobei das nicht-virale Genliefersystem
(i) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfasst; und/oder (ii) eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder (iii) eine Verbindung umfasst, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und
b) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr, ausgewählt aus:
(i) einem Antikörper gegen TLR 1 , TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7,
TLR 8, TLR 9, TLR 10, TLR 11 ,TLR 12, oder TLR 13; (ii) einem Antikörper gegen einen Zytokinrezeptor oder einem Zytokinrezeptor-
Antagonisten;
(iii) einem Inhibitor der Kinase MEK1 und/oder MEK2; (iv) einem Agonisten für TLR7 und/oder TLR8, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone),
Imidazochinoline, Thiazolochinoline, und Guanosinanaloga; und (v) einer Kombination derselben.
2. Kit of parts zur Transfektion, umfassend: a) ein nicht-virales Genliefersystem, wobei das nicht-virale Genliefersystem
(i) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfasst; und/oder (ii) eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder (iii) eine Verbindung umfasst, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und
b) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr, ausgewählt aus: (i) einem Antikörper gegen TLR 1 , TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7,
TLR 8, TLR 9, TLR 10, TLR 11 ,TLR 12, oder TLR 13; (ii) einem Antikörper gegen einen Zytokinrezeptor oder einem Zytokinrezeptor-
Antagonisten;
(iii) einem Inhibitor der Kinase MEK1 und/oder MEK2; (iv) einem Agonisten für TLR7 und/oder TLR8, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone),
Imidazochinoline, Thiazolochinoline, und Guanosinanaloga; und (v) einer Kombination derselben.
3. Zusammensetzung oder Kit of parts nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-virale Genliefersystem ein kationisches Lipid umfasst.
4. Zusammensetzung oder Kit of parts nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das in a) definierte nicht-virale Genliefersystem ein kationisches Lipid mit folgender Formel umfasst:
wobei ist, wobei
R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl oder andere Alkylreste sind, die in allen möglichen Kombinationen gesättigt, ungesättigt, verzweigt, unverzweigt, fluoriert oder nicht fluoriert sind, und aus 5 bis 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind; \ Il
X = CH-C- NH
/ ist; und wobei m = 0 und n = 0 ist; oder m = 0 und n = 1 ist; oder m = 0 und n = 2 ist; oder m = 1 und n = 1 ist; oder m = 1 und n = 2 ist; oder m = 2 und n = 2 ist; und g = 1 ,2,3,4,5,6,7 oder 8 ist; a = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; b = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; c = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; d = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; e = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; und f = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist.
5. Zusammensetzung oder Kit of parts nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl sind; m und n = 1 sind; g = 1 ,2,3,4,5,6,7 oder 8 ist; a = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; b = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; C = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; d = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; e = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist; und f = 0,1 ,2,3,4,5 oder 6 ist.
6. Zusammensetzung oder Kit of parts nach einem der Ansprüche 1 bis 5, enthaltend modifiziertes oder unmodifiziertes genetisches Material, insbesondere modifizierte oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNS und/oder modifizierte oder unmodifizierte siRNA.
7. Zusammensetzung oder Kit of parts nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr 1 ,4-Diamino-2,3-dicyano-1 ,4-bis(o-amionophenylmercapto)butadien (U0126); Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1 H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine); Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dirnethyl-1 H-imidazo[4,5-c]quinoline-1- ethanol); Gardiquimod (1-(4-amino-2-ethylamino methylimidazo-[4,5-c]quinolin-1-yl)-2- methylpropan-2-ol); CL075; CL097; Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin); lsatoribine (7-Thia-8-oxoguanosin); Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4- pyrimidinone); oder irgendeine Kombination derselben ist.
8. Zusammensetzung oder Kit of parts nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr ein Antikörper gegen TLR 3, TLR 7, TLR 8, oder TLR 9 ist.
9. Zusammensetzung oder Kit of parts nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung und/oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr ein Antikörper oder Antagonist gegen lnterleukin-1 -Rezeptor, insbesondere IL-ra; Interferon-Typ-I-Rezeptor; Interferon-gamma-Rezeptor; oder Tumornekrosefaktor-Rezeptor ist.
10. Kit of parts nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei
(i) alle Komponenten vollständig getrennt voneinander vorliegen; (ii) die Komponenten a) und b) getrennt voneinander vorliegen; oder (iii) die Komponenten a) und b) gemeinsam vorliegen.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
12. Pharmazeutischer Kit of parts, der einen Kit of parts nach einem der Ansprüche 2 bis 10 umfasst.
13. Verwendung einer Zusammensetzung oder eines Kit of parts nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung einer Krankheit durch Gentherapie.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei es sich bei der Krankheit um cystische Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie, ß-Thalassämie, Krebs, eine Viruserkrankung, eine Degeneration der Macula, Amyotropische Lateral-Sklerose und/oder eine Entzündungserkrankung handelt.
15. Verfahren zur Verbesserung des Transfektionsergebnisses von nicht-viralen Genliefersystemen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Zellen vor und/oder bei der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt und bei der Transfektion genetisches Material, insbesondere modifizierte und/oder unmodifizierte ssDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsRNA und/oder modifizierte und/oder unmodifizierte siRNA, in die Zellen einbringt; oder
b) die Zellen vor und/oder bei und/oder nach der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt und bei der Transfektion modifizierte und/oder unmodifizierte siRNA in die Zellen einbringt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-virale Genliefersystem
(i) ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfasst; und/oder (ii) eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder (iii) eine Verbindung umfasst, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann; und/oder (iv) auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion, Magnetofektion,
Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruht.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen bis zu 4 Tage, vorzugsweise bis zu 18 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden vor der Transfektion mit mindestens einem Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen gleichzeitig mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung oder Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden und mit dem nicht-viralen Genliefersystem in Kontakt gebracht werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr einen Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonisten, Inhibitor und/oder eine siRNA umfasst.
20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass durch Knock-down mit siRNA zumindest ein Gen ausgeschaltet wird, das für ein zur Signaltransduktion über TLR notwendiges Protein codiert.
21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem aus der Gruppe TLR 1 , TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 7, TLR 8, TLR 9, TLR 10, TLR 11 ,TLR 12, TLR 13, CD14, CD38, RIG-I Helikase und RIG-!-like Helikase, insbesondere durch die Blockierung von mindestens einem aus der Gruppe TLR 1 , TLR 2, TLR 4 und TLR 9, zumindest teilweise unterdrückt wird.
22. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einer Kinase aus der Gruppe MEK1 und MEK2 zumindest teilweise unterdrückt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Kinase(n) MEK1 und/oder MEK2 durch 1 ,4-Diamino-2,3-dicyano-1 ,4-bis(o- amionophenylmercapto)butadien (U0126) blockiert wird/werden.
24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Zytokin, einem Tumornekrosefaktor, einem Interleukin, oder einem Interferon zumindest teilweise unterdrückt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass ein Interferon des Typs I1 insbesondere ein Interferon aus der Gruppe Interferon-alpha, Interferon-beta, Interferon- gamma und Interferon-omega, blockiert wird.
26. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene interzelluläre Immunabwehr durch die Blockierung von mindestens einem Rezeptor aus der Gruppe der Zytokinrezeptoren, Interferonrezeptoren, insbesondere Rezeptoren für Interferone des Typs I, Interleukinrezeptoren und Tumomekrosefaktorrezeptoren zumindest teilweise unterdrückt wird.
27. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Aktivierung der angeborenen Immunabwehr ein Agonist ist.
28. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18 und 27, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene intrazelluläre und/oder interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Agonisten für einen TL-Rezeptor, insbesondere durch mindestens einen Agonisten für TLR7 und/oder TLR8, zumindest teilweise aktiviert wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Agonist für TLR7 und/oder TLR8 ausgewählt wird aus der Gruppe, umfassend Bropirimine (2-amino-5-bromo-6-phenyl-4-pyrimidinone), Imidazochinoline, Thiazolochinoline, Guanosinanaloga und ssRNA.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Agonist (i) Imiquimod (R837, 1-(2-methylpropyl)-1 H-imidazol[4,5-c]quinolin-4-amine),
Resiquimod (R848, 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1 H-imidazo[4,5- c]quinoline-1-ethanol) oder Gardiquimod (1-(4-amino-2-ethylamino methylimidazo- [4,5-c]quinolin-1-yl)-2-methylpropan-2-ol) ist; oder
(ii) CL075 oder CL097 ist; oder
(iii) Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin) oder lsatoribine (7-Thia-8- oxoguanosin) ist; oder
(iv) ssRNA mit U und/oder GU reichen Sequenzen ist, insbesondere ssRNA mit den Sequenzmotiven UGUGU und/oder GUCCUUCAA.
31. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18 sowie 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene interzelluläre Immunabwehr durch mindestens einen Agonisten für Rezeptoren von antiviralen Zytokinen, insbesondere durch Interferon-beta oder Interferon gamma, zumindest teilweise aktiviert wird.
32. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15, 16 sowie 27 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen bis zu 2 Tage, vorzugsweise bis zu 12 Stunden, insbesondere bis zu 6 Stunden nach der Transfektion mit dem mindestens einen Mittel zur zumindest teilweisen Aktivierung der angeborenen intrazellulären und/oder interzellulären Immunabwehr behandelt werden.
33. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-virale Genliefersystem ein kationisches Lipid gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5 umfasst.
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