JP3785187B2 - 樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系 - Google Patents
樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3785187B2 JP3785187B2 JP50471995A JP50471995A JP3785187B2 JP 3785187 B2 JP3785187 B2 JP 3785187B2 JP 50471995 A JP50471995 A JP 50471995A JP 50471995 A JP50471995 A JP 50471995A JP 3785187 B2 JP3785187 B2 JP 3785187B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- composition
- polycation
- dendritic
- group
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- VHPKGHVTZBCPAV-UHFFFAOYSA-N O=C(CCCc(cc1)ccc1N(C(C=C1)=O)C1=O)N(CCCCNc1c(cccc2)c2nc2c1cccc2)CCCNc1c(cccc2)c2nc2c1cccc2 Chemical compound O=C(CCCc(cc1)ccc1N(C(C=C1)=O)C1=O)N(CCCCNc1c(cccc2)c2nc2c1cccc2)CCCNc1c(cccc2)c2nc2c1cccc2 VHPKGHVTZBCPAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
- C08G83/002—Dendritic macromolecules
- C08G83/003—Dendrimers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
Description
発明の分野
この発明は、オリゴヌクレオチド配送系、および遺伝子治療の分野に関する。更に詳しくは、この発明は、ポリヌクレオチドと、樹枝状体ポリ陽イオンと、必要に応じて所望の亜細胞(subcellular)位置へのポリヌクレオチドの配送(デリバリ)を助成する他の薬剤とを含む自己集合性(self-assembling)ポリヌクレオチド配送系に関する。ポリヌクレオチドおよび他の薬剤は、一般に非共有結合的な相互作用を介してポリヌクレオチドと会合する。ここで使用するのに適切な薬剤には、就中、DNAマスク成分、細胞認識剤、電荷中和剤、膜透過剤、および亜細胞局在化剤が含まれる。
政府支援に対する謝辞
国立衛生研究所により与えられた授与番号GM-30163に準じたこの発明において、政治は権利を有する。
背景の説明
分子生物学者は、多数のヒトの遺伝病において染色体の欠陥を既に同定しており、遺伝子治療を使用する治癒のための見通しが提起されている。出現しつつある医学のこの領域は、クローン化した機能的に活性な遺伝子を罹患した細胞へと移送することにより、遺伝的な欠陥を矯正することを目的としている。膵嚢胞性繊維症(cystic fibrosis,CF)は、塩化物輸送の異常を特徴とする致命的な劣性の遺伝的疾患である。この疾患の遺伝子座は、膵嚢胞性繊維症膜横断コンダクタンスレギュレーター(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)をコードする遺伝における変異であることが明らかにされている。欠陥のあるCFTRの相補または置換によって原因となる遺伝子の欠陥を矯正することが、CFに対する究極的な治癒となる。
遺伝子治療または生体内における遺伝子の配送と発現は、欠陥のある遺伝子を置換するのに使用することのできる急速に発展しつつある科学である。幾つかの系、およびポリヌクレオチドの配送に適切なポリマーが当業界で公知である。これらの中で、アデノウイルスベクターのようなウイルスベクターが、CFTRをコットンラットの肺に生体内で移送するのに使用されている。アデノウイルスベクターを用いて、高レベルの生体内トランスフェクション(transfection)が報告されているが、非ウイルス性の配送系は、ポリヌクレオチドの配送について多数の利点を有している。
過去10年の間に、機能性の遺伝子を試験管内で哺乳動物細胞に導入するための多数の方法が開発された。これらの技術は、標的細胞を体から取り出してトランスフェクションを行い、トランスフェクションした細胞を増幅した後に患者に戻すことができる限り、遺伝子治療に適用可能である。しかしながら、これはCF患者については可能ではない。
現在、最高の生体内トランスフェクションの効率は、レトロウイルスを用いて得られている。しかしながら、トランスフェクションの効率は変動し得るものであり、ウイルスに基づく遺伝子配送系は、ウイルス感染またはガンを引き起こす危険性を有している。明らかに、ヒトにおいてレトロウイルスベクターの使用に由来して急性の合併症が観察されたことはないが、長期間の合併症の可能性により、注意深く患者をモニターする必要がある。
ウイルスに基づいたベクターを使用することの潜在的な危険性、およびこれに代えて遺伝子治療のためにプラスミドDNA構成体を使用することの概念的な利点より、ウイルスベクターの非存在下での遺伝子の移送を助成する種々の物理的および化学的な方法の開発が導かれた。最も熱心に研究された系は、リン酸カルシウムまたは陽イオン性促進剤を用いて細胞を処理することを伴うものである。他の方法には、膜に物理的に穴を開けてDNAを注入したり、細胞膜の透過または剥離の際にDNAを受動的に取り込ませたりすることを伴うものがある。これらの方法のそれぞれは、本質的に攻撃的なものであり、生体内での使用には好ましくない。
ウイルス運搬体の使用を伴わない直接的な遺伝子配送系を使用すると、ウイルスの系によっては難関である危険性が回避されると考えられる。遺伝子の配送に適切な非ウイルス性のキャリヤーは、多くの障害を乗り越えることのできるものでなければならない。これは、循環系において消滅することなく、選択した細胞を標的として、細胞の細胞質にDNAを導入し、DNAを核に輸送することのできるものでなければならない。
現在のところ、ウイルスが遺伝子の移送のための最も効率的なベクターであるが、その使用に随伴する潜在的な危険性により、合成DNA配送系の研究が促進された。初期の研究により、ポリリジンやDEAE−デキストランのようなポリ陽イオンが、蛋白質並びに一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの動物細胞への取り込みを促進することが示され、それ以来、ポリリジンを基材とするベクターが、遺伝子の移送のために広範に試験された。しかしながら、これらのポリ陽イオンは相対的に細胞毒性を有するものであり、それ自体あまり効率的なものではなく、これによりその有用性は、培養細胞をトランスフェクションすることに限定されている。
このような欠点にも拘わらず、ポリリジンは、
1)DNAをコンパクトな構造に集合させ、
2)細胞膜を不安定化させ、
3)核酸に対する他のエフェクターの付着のためのハンドルを提供する
ことを助成するといった多数の利点を有している。
ポリリジンによってDNAを小さな(約100nm)トロイド様構造に中和して凝縮することにより、試験管内における細胞への核酸のエンドサイトーシスが促進される。エンドサイトーシスの過程は、トランスフェリン、アシアロオロソムコイド、またはインシュリンのような特異的なリガンドのポリ陽イオンに対する共有結合による付着によって更に刺激され得る。ポリ陽イオントランスフェクションの手順が、受容体媒介または流体相エンドサイトーシスに基づく場合は、エンドサイトーシスに供されたDNAの大部分が細胞内小胞に捕捉され、最終的にはリソゾーム中で分解される。リソゾームによる分解は、ポリリジンに対して、トランスフェクションの際にクロロキンのようなリソゾーム型(lysosomotrophic)薬剤を添加することにより、または不活性化したウイルスまたはウイルス融合性(fusogenic)ペプチドのようなエンドソーム破壊剤を付着させることにより、部分的に迂回することができる。ポリリジン−DNA複合体の細胞をトランスフェクションする能力は、このようなエフェクターの存在に強く依存する。
所望の細胞の目的地に到達するのに十分に長い間残存するよう、循環系においてポリヌクレオチドを保護する1つの形態は、ポリヌクレオチドを「マスク」または保護することである。
赤血球ゴースト、再構成されたウイルスエンベロープおよびリポソームのようなミクロ粒子が、遺伝子の移送の際に保護するものとして一部で使用されている。成功を収めたリポソームの系は、ホスファチジルエタノールアミン(PE)と混合した陽イオン性脂質であるN-[1(-2,3-ジオレオイロキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を使用し、薬剤リポフェクチン(Lipofectin、商標名)を形成するものである。リポフェクチン(商標名)は、DNAと混合することのできる陽イオン性リポソームであり、陽イオン性薬剤を用いてリポソームの内部にDNAをカプセル封入する必要なく、混合物を細胞に添加することができる。リポフェクチン(商標名)は、ヒト肺培養上皮細胞にレポーター遺伝子をトランスフェクションするのに使用され、気管内の経路によってラット細胞にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を導入するのに使用され、また気管内および静脈内の経路によってマウス細胞にCAT遺伝子を導入するのに使用されている。CAT遺伝子の場合、発現のレベルは定量されていないが、約50%の気道上皮ラット細胞により、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子が一時的に発現された。CAT遺伝子をステロイド感受性のプロモーターに結合させてラット肺へとトランスフェクションすると、その発現は、デキサメタゾンにより正に制御されることが示された。しかしながら、高濃度のリポフェクチン(商標名)を使用した場合は、細胞毒性が明確な問題である。
リポポリアミン、好脂質性ポリリジン、および陽イオン性コレステロールを含むDOTMAを置き換える物質が、培養系において遺伝子の移入を媒介するのに使用されている。これらの幾つかは、リポフェクチン(商標名)で観察されたトランスフェクション率の約3倍の改善を示すが、その毒性が問題として残っている。トランスフェクションに寄与する陽イオン性脂質を使用する機構は、完全に探求されていない。過去の手法は、異なる陽イオン性脂質を合成し、トランスフェクションの検定でこれらを試すというものであり、配送系がDNAをどのようにして細胞に導入するかを体系的に研究するものではなかった。DOTMA/PEリポソームを、陰イオン性リポソームと共に二重層の融合に供することができるという発見は、DOTMAが、原形質膜を介するDNAの直接的な侵入を促進し得ることを示唆する。一方、高い効率のトランスフェクションのためには、陽イオン性脂質の系はPEを必要とするが、この理由は恐らく、PEが、膜の融合を促進する膜内の脂質中間体を形成し得るためである。
効率的な遺伝子の移入には、選択された細胞に対するDNAのターゲティング(標的指向化)が必要とされている。最近では、受容体に媒介されたエンドサイトーシスに基づく種々の手順が、遺伝子の移送に関して記載されている。細胞特異的なリガンド−ポリリジン接合体が、電荷相互作用を介して核酸に結合され、この結果得られた複合体は、アシアロオロソムコイドをリガンドとして用いて、この配送系を使用して試験管内において、ヒト肝ガンセルラインHepG2およびラット肝細胞の場合のように、標的細胞によって効率的に取り込まれた。インシュリンに指向するターゲティング後のHepG2細胞における酵素活性の安定な発現、並びにヒト白血病セルラインK-562へのトランスフェリン−ポリ陽イオンに媒介されたプラスミドの配送とその後のコードされたルシフェラーゼ遺伝子の発現が報告されている。しかしながら、記載された配送系では、ポリリジンリンカーを介して高分子量のターゲティング蛋白質をDNAに連結させることが必要である。このような大きなリガンド−ポリ陽イオン接合体は、大きさおよび組成において不均一であり、化学的には特定が不十分で、再現性のある様式で調製するのは困難である。更に、受容体に媒介される系の多くにおいては、高レベルのトランスフェクションのためには、クロロキンまたは他の細胞内伝播破壊物質が必要である。1つの研究では、受容体に媒介される系の遺伝子の配送を増強するためにアデノウイルスが使用された。
このようにして、受容体媒介エンドサイトーシスによって遺伝子を哺乳動物細胞の内部に配送することができ、この際に外来DNAの一部は、分解を免れて核に侵入して発現される。しかしながら、恐らく外来DNAの細胞質への侵入が制限されているために、発現のレベルは低い。
遺伝子の直接配送は、ポリヌクレオチド上の大きな負の電荷を中和すること、および(しばしば随伴する)標的細胞の膜を透過する能力によっても助成される。ポリヌクレオチドの電荷を中和するためにポリ陽イオンを使用すると、膜の透過およびポリヌクレオチドの移動が助成される。この目的のためには、陽イオン性の脂質も使用されている。リポポリアミンおよびポリ挿入体(lipointercalant)と呼ばれるある種の陽イオン性脂質も知られている。
ポリヌクレオチドが標的細胞に一旦侵入すると、遺伝子の直接配送は、適切な亜細胞位置に遺伝子を指向させることによって助成され得る。デオキシリボヌクレオチドの配送の1つの明確な標的は核である。この過程を助成することが知られているリガンドには、核局在化ペプチドまたは核局在化配列を含む蛋白質がある。
再構成されたウイルスエンベロープを用いて得られるトランスフェクション効率は、外来遺伝子が核蛋白質と共に、同時に標的細胞に配送される場合に増加することが示されている。核蛋白質と混合したDNAは、対照として使用したアルブミンと混合したDNAに対して、トランスフェクションのある程度の増加を示した。このようにして、核局在化配列(nuclear localization sequence,NLS)pro-lys-lys-lys-arg-lys-val(配列番号:1)を含む蛋白質をプラスミドに会合させると、DNAが核により容易に組み込まれることが認められる。蛋白質上にNLSが存在することにより、これが核孔を介して輸送されるように選定されるためである。14アミノ酸の核局在化配列を、種々の高分子、更に金粒子(150Å直径)に結合させたものがあり、これは細胞質に導入されると、容易に核に取り込まれた。核への侵入は、成功を収める安定なトランスフェクションのための律速段階であると認められる。このことは、プラスミドDNAを細胞質にマイクロインジェクションした場合は、トランスフェクションをもたらすことができないという知見によって裏付けられる。1000の細胞質注入によってはトランスフェクションが生起しなかったのに対し、核へのプラスミドの直接マイクロインジェクションは、50%を越えるマイクロインジェクションした細胞でトランスフェクションをもたらす。
トランスフェクション効率は、種々の陽イオン性蛋白質を使用してDNAを凝縮させた場合にも増加することが示されている。DNAの凝縮(condensation)によりトランスフェクションが増加する理由は容易に明らかではないが、DNAの細胞の取り込みの増加、または核に対するDNAの感受性の減少によるものと考えられ、この結果細胞内の無傷のDNAの量が増加するものと考えられる。
前記論じた種類の薬剤の1つと会合した遺伝子の直接配送は、これらの薬剤がDNAと会合したまま留まる能力によって更に助成される。この例には、ポリ陽イオンポリリジンに対するリガンドの共有結合による付着による、および必要に応じてDNA挿入体(intercalator)、例えばエチジウムホモダイマー(5,5'-ジアザデカメチレンビス(3,8-ジアミノ-6-フェニルフェナンスリジウム)ジクロリドジヒドロクロリド)を共有結合により付着させることによる、受容体リガンドとポリヌクレオチドとの会合、並びに9-アミノアクリジンおよびある種のビス−アクリジンに対する共有結合での付着によるDNAに対する光アフィニティ標識の会合がある。
樹枝状体は、種々の分子量および大きさで調製され得るコア分子の周りに繰り返し反応手順によって構築された嵩高い三次元ポリマーである(Tomalia,D.A.ら、「星状に展開したカスケードポリマー(Starburst Cascade Polymers):原子から巨視的事項までの、大きさ、形状、表面、化学、トポロジーおよび順応性の分子レベルの制御」、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29:138(1990))。
しかしながら、遺伝子治療の分野でより良い結果を達成するための探求においては、従来の系の欠点を伴うことなく、高い形質転換効率の改良されたポリヌクレオチド配送系に対する必要性がなお存する。
発明の要旨
この発明は、好ましくは配送されるポリヌクレオチドに非共有結合により結合した樹枝状体ポリ陽イオン、および必要に応じて1以上の、好ましくは2以上の以下の薬剤を利用する自己集合性ポリヌクレオチド配送系に関する。
1)DNAマスク剤、
2)細胞認識剤、
3)電荷中和剤および膜透過剤、
4)亜細胞局在化剤。
樹枝状体ポリ陽イオン(dendrimer polycation)は、それ自体で高いトランスフェクション効率でポリヌクレオチドを配送することができる。この系におけるそれぞれの任意の成分は、その示された機能を行うことができ、必要に応じてポリヌクレオチドと集合または離散することもできる。例えば、ある種の成分は、その所望の機能を行うために、それ自体ポリヌクレオチドから解離すべきものとし得る。
この発明によれば、ポリヌクレオチドと、これに機能的に連結した樹枝状体ポリ陽イオンとを含む、真核細胞の亜細胞成分にポリヌクレオチドを配送するための組成物が提供される。
本組成物の1つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、機能的に結合した構造遺伝子を有するハイブリッドベクターを含む。
この発明の組成物は、高い効率のトランスフェクションを達成するのに有効な条件下で標的真核細胞と接触させることができる。
他の態様では、この発明は、高い効率のトランスフェクションの条件下で、構造遺伝子のようなポリヌクレオチドを標的細胞に特異的に配送するために、生物に対して本発明の組成物を投与すること、および遺伝子産物の細胞内での発現を誘導することも含む。
この発明のより完全な理解、およびこれに付随する多くの利点は、以下の図面を参照してこれをより良く理解すると共に容易に認められよう。
【図面の簡単な説明】
図1は、プラスミドDNAの電気泳動移動度に対するpLys115、SD68、SD54およびGALA-SD54の効果を示す。前記したもののそれぞれを用いてポリ陽イオン−pCMV−β−Gal複合体を調製し、次のようにゲル中で流した。レーン1:pCMV−βGal単独;レーン2:2μgのpLys115;レーン3:4μgのpLys115;レーン4:4μgのSD68;レーン5:6μgのSD68;レーン6:GALA-SD54接合体を用いた4μgのSD54;レーン7:GALA-SD54接合体を用いた160μgのSD54;およびレーン8:SD54およびGALA-SD54の等モル混合物を用いた4μgのSD54。
図2は、CV-1細胞におけるトランスフェクションを媒介する際の樹枝状体の直径および量の効果を示す(データは表2から得た)。
図3は、トランスフェクションのために使用したpCLuc4プラスミドの量の関数としてルシフェラーゼ活性の投与量応答性を示す。
図4は、哺乳動物細胞のPAMAMカスケードポリマー媒介トランスフェクションを示す。図4A:SD68と複合化した6μgのプラスミドを用いて二連で細胞をトランスフェクションした。最適化した複合体のトランスフェクション効率(25μgのSD68/6μgのプラスミド;斜線のバー)を、4μgのSD68/6μgのプラスミドを用いて形成した複合体により得られたもの([末端アミン]=[ヌクレオチド];白抜きのバー)と比較した。pCLuc4トランスフェクション細胞におけるルシフェラーゼ活性は、表2に記載したようにトランスフェクションの48時間後に、または初代肝細胞の場合はトランスフェクションの24時間後に測定した。それぞれの値は、平均±二連測定の範囲である。最適化した条件におけるトランスフェクションした細胞の百分率は、pCMV-βGalプラスミドを用いて見積もった。トランスフェクションした細胞は、トランスフェクションの24時間後にX-Galを使用する組織学的染色によって検出した(Lim.K.とChae,C-B、「β−ガラクトシダーゼの基質を用いた培養皿での細胞のインキュベートによるDNAトランスフェクションの簡単な検定」、Biotech.7:576(1986))。ヒストグラム上の百分率として結果を示す。図4B:未修飾のSD54を用いて(白抜きのバー)、または未修飾のSD54およびGALA-SD54の等モル混合物を用いて(斜線のバー)4μgの樹枝状体に対して複合化した6μgのpCLuc4により前記したように細胞にトランスフェクションした。
図5は、CV-1細胞に対するpLys115およびSD68の毒性の比較を示す。プラスミドDNAと複合させた(点線)または複合させていない(実線)増加する量のポリ陽イオン(pLys115●またはSD68○)を用いて、血清を含有しないDME H-21中でCV-1細胞を96穴プレートにて5時間処理し、10%FCSを含有するDME H-21中で更に48時間培養した。この期間の後に、MTT色素低減検定により処理物の毒性を見積もった。570nmでの吸光度により、細胞の溶解後にホルマザンを定量した。バックグラウンドの吸光度は、6Mグアニジン塩酸塩で処理した細胞に対して検定を行うことにより得た。細胞生存の%低下={1−[OD570(処理細胞のバックグラウンド]/[OD570(未処理細胞のバックグラウンド]}×100。それぞれの値は、平均±二連測定のSDである。
図6は、実施例20のビス−アクリジン誘導体による、ウシ胸腺DNAからのエチジウムブロマイドの競合置換を示すプロットを示す。(●):スペルミジン−ビス−アクリジントリヒドロクロリド、Kd=4.3×10-8M;(○):WTcysMBT−bA、Kd=2.1×10-7M;(□):cTcysMBT-bA、Kd=7.9×10-7M;(△):MBT-bA、Kd=1.0×10-6M。
図7は、細胞核へのオリゴヌクレオチドの配送に対するSD68樹枝状体ポリ陽イオンの投与量依存性効果を示す。
図8は、SD68樹枝状体ポリ陽イオンが、細胞の核においてオリゴヌクレオチドの蓄積を促進する時間依存性を示す(25%グルコース緩衝液置換)。
図9は、Fitc標識した16マーオリゴヌクレオチドの核取り込みに対する樹枝状体ポリ陽イオンの世代の効果を示す。
図10は、炭水化物溶液を用いた配送組成物の希釈の関数として観察された核蛍光を示す。
図11は、ターゲティングリガンドおよび膜脱安定化剤のビス−アクリジンを介するDNAへの結合のトランスフェクションに対する効果を示す。
図12は、ターゲティングリガンドおよび膜脱安定化剤の樹枝状体ポリ陽イオンへの結合のトランスフェクションに対する効果を示す。
本発明の他の目的、利点および特徴は、以下の説明から当業者に明らかとなろう。
好適な実施形態の説明
用語の説明
ここで使用するように「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二重鎖、または多重鎖の形態の1以上のヌクレオチドのRNAまたはDNA配列を含む。ポリヌクレオチドは、2'-デオキシ-D-リボースまたはその修飾形態を含むポリデオキシリボヌクレオチド、すなわちDNA、D-リボースまたはその修飾形態を含むポリリボヌクレオチド、RNA、およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾プリンもしくはピリミジン塩基または塩基性ヌクレオチドのN-グリコシドまたはC-グリコシドである他のいずれかの種類のポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドは、プロモーター領域、オペレーター領域、構造領域、終止領域、これらの組合せ、または他の何らかの遺伝的に関連する物質をコードすることができる。
「置換」結合は、ここでは一般的に入手可能な文献に記載されたように合成される、ホスホロチオエートまたはホスホルアミデートのような従来の代替的な結合として定義する。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同じである必要はない。この発明のポリヌクレオチドは、当業界で一般的に理解されているような1以上の「置換」結合を含むことができる。このような置換結合の幾つかは非極性であり、ポリヌクレオチドの望まれている膜を横切って拡散する能力に寄与する。他の置換結合は、ポリペプチドの増加または減少された生分解性に寄与する。生分解性は、例えば、増加または減少されたヌクレアーゼ感受性によって影響され得る。
「アナログプリン」および「アナログピリミジン」は、当業界で一般的に知られ、その多くは、化学治療剤として使用されており、ポリヌクレオチドの糖部分の修飾部を含んでいる。アナログプリンおよびピリミジンの例は、1以上の水酸基が水素または脂肪族基により置換されるか、エステル、アミン等として官能化されたものであり、またはリボースまたはデオキシリボースが他の官能的に等価な構造により置換されたものである。塩基部分の修飾には、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他の複素環が含まれる。特に、ポリヌクレオチドの糖−リン酸骨格は、ペプチドまたは他の種類のポリマー骨格のような非炭水化物骨格により置換することができる(Nielsen,P.E.ら、Science 254:1497(1991))。
分子量は、不完全な反応生成物または副反応生成物を含有しない理想的な樹枝状体について計算された分子量とする。ただし、合成の過程で、幾らかの不完全な生成物または副反応生成物が通常は生ずる。ここで使用するように「平均分子量」は、理想的な樹枝状体の仮説的な分子量を指すが、実際はこの平均分子量から偏差が生ずることがあり、この値より小さいか大きい種々の分子量の分子が幾らかの割合で存在することを銘記すべきである。
ここで使用するように、「流体力学的半径」は、水溶液中の単一の樹枝状体の見かけの半径を指す。これは、当業者であれば、ゲル浸透クロマトグラフィまたはレーザー光散乱を使用して見積もることができる。
ここで使用するように、「機能性成分」は、DNAマスク成分、細胞認識成分、電荷中和および膜透過成分、並びに亜細胞局在化成分を含む。
ここで使用するように、「DNAマスク成分」は、ポリヌクレオチドの全部または一部をマスクして、循環系に存在するヌクレアーゼのような分解剤による攻撃を阻害し、かつ/または細網内皮細胞系による取り込みを妨害することにより、循環系におけるその半減期を増加させ得る分子を指す。
ここで使用するように、「膜透過成分」は、膜を横切るポリヌクレオチドの通過を助成するあらゆる成分を指す。よって、この用語は、ポリヌクレオチド上の大きな負の電荷を中和し、ポリヌクレオチドが膜の疎水性の内部を横断するのを可能とする、通常はポリ陽イオンとする電荷中和成分を一部包含する。多くの電荷中和成分が、膜透過剤として作用することができる。膜の透過は、両親媒性分子によっても生じ得る。膜透過剤は、通常は不透過性の分子が細胞膜を横断して細胞の細胞質への侵入を行うのを補助し得る分子である。膜透過剤は、ペプチド、胆汁酸塩、糖脂質、リン脂質または界面活性剤分子とすることができる。膜透過剤は、1つの部分が疎水性であり他の部分が親水性であって、これらが膜と相互作用するのが可能となるような両親媒性の性質をしばしば有する。
ここで使用するように、「融合性ペプチド」は、2つの別々の二重層膜に添加された場合に、1つの膜へのこれらの融合をもたらすことのできるペプチドを指す。
ここで使用するように、「リポソーム」は、球状の二重層内に配置された両親媒性の脂質により構成される小さい小胞を指す。リポソームは、通常は、小型単ラメラ小胞(small unilamellar vesicle,SUV)、大型単ラメラ小胞(large unilamellar vesicle,LUV)、または多重ラメラ小胞(multi-lamellar vesicle,MLV)として分類される。SUVsおよびLUVsが、定義により、1のみの二重層を有するのに対し、MLVsは多くの同心円状の二重層を含む。リポソームは、水性の内部または二重層の間に親水性の分子を捕捉することにより、または二重層の中に疎水性の分子を捕捉することにより、種々の物質をカプセル封入するのに使用することができる。リポソームは、その大きさ、組成および電荷に応じて広範な種類の特性を示す。例えば、不飽和脂質の割合が小さいリポソームは、僅かではあるが透過性がより良好な傾向があるのに対し、コレステロールまたは他のステロールを組み込んだリポソームは、より剛性で透過性が低い傾向がある。リポソームは、親水性基に応じて正、負、または中性に荷電させることができる。例えば、コリンを基材とする脂質は全体として中性の電荷を与え、リン酸および硫酸を基材とする脂質は負の電荷に寄与し、グリセリンを基材とする脂質は一般に負に荷電し、ステロールは一般に溶液中では中性であるが荷電した基を有する。
ここで使用するように、「細胞認識成分」は、標的細胞の表面上の成分を認識し得る分子を指す。細胞認識成分は、細胞表面抗原に対する抗体、受容体媒介エンドサイトーシスに関与するものを含む細胞表面受容体のためのリガンド、ペプチドホルモン等を含む。
「DNA会合部分」は、非共有結合的な様式で核酸と相互作用する分子またはその一部を指す。DNA会合部分は、就中、主溝および小溝バインダー(groove binders)、DNA挿入体およびポリ陽イオンを含む。主溝および小溝バインダーは、二本鎖DNAの主溝および小溝と会合することにより、DNAと相互作用すると考えられている分子である。DNA挿入体(intercalator)は、間にそれ自身を挿入してヌクレオチド塩基対と平行となることにより、DNAに差し込まれると考えられている平板状の分子または分子の平板状の部分である。ポリ陽イオンは、DNA骨格上の負の電荷と会合すると考えられている。加えて、一本鎖DNAまたはRNAを治療鎖として使用する場合は、ここに記載するような相補的な「リンカー鎖」が、「DNA会合部分」として機能的に作用し得る。
DNA会合部分は、「反応性の基」を介して、この発明の機能性の成分と共有結合により連結することができる。このような反応性の基は、機能性の成分上の求核体と容易に反応する。この種の反応性の基(その対応する反応性の求核体を備える)には、限定されるものではないが、N-ヒドロキシスクシンイミド(例えばアミン)、マレイミドおよびマレイミドフェニル(例えばスルフヒドリル)、ピリジルジスルフィド(例えばスルフヒドリル)、ヒドラジド(例えば炭水化物)、およびフェニルグリオキサール(例えばアルギニン)が含まれる。
ここで使用するように、「亜細胞局在化成分」は、標的細胞中で亜細胞成分を認識し得る分子を指す。認識される亜細胞成分には、核、リボソーム、ミトコンドリア、および葉緑体が含まれる。特定の亜細胞局在化成分には、分子を核へと運搬するのを助成すると共に核局在化ペプチドおよびアミノ酸配列を含むことが知られている「核局在化成分」が含まれる。
ここで使用するように、「樹枝状体ポリ陽イオン」は、就中、例えばTomaliaら(1990)、前記により記載されたように、正に荷電した表面を有する、小分子または選定された開始剤、例えばアンモニアまたはペンタエリスリトール等から出発する繰り返し反応手順により形成される三次元の高度に秩序化されたオリゴマーおよび/またはポリマー化合物を指す。
組成物
この発明の組成物は、
ポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドに機能的に結合した樹枝状体ポリ陽イオンと
を含む自己集合性のポリヌクレオチド配送系である。
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、一本鎖DNAもしくはRNA、または二本鎖DNAもしくはDNA−RNAハイブリッドとすることができる。治療的価値を有する3本鎖もしくは4本鎖ポリヌクレオチドも、この発明の範囲内であることが企図される。二本鎖DNAの例には、就中、構造遺伝子、オペレーター調節領域および終止領域を含む遺伝子、並びにプラスミドDNAのような自己複製系が含まれる。一本鎖ポリヌクレオチドまたは「治療鎖」には、アンチセンスポリヌクレオチド(DNAおよびRNA)、リボザイム(ribozyme)および3本鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。長期間の活性をもたらすためには、治療鎖は、好ましくは非ホスホジエステル結合として安定化されたその幾つかまたは全部のヌクレオチド結合を有するものとする。この種の結合には、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-アルキルホスホロトリエステル結合が含まれ、就中この場合、アルキル基はメチルまたはエチルとする。
このような一本鎖ポリヌクレオチドについて、投与組成物の一部として、治療鎖に対する相補体または「リンカー鎖」を調製するのが好適である。リンカー鎖は、通常は細胞に侵入した後に分解されるようホスホジエステル結合を用いて合成する。「リンカー鎖」は、別個の鎖とすることができ、または共有結合により結合させるか、または治療鎖の単なる延長部分とし、これにより治療鎖が主として二本鎖に戻り、それ自体にハイブリダイズするようにする。
リンカー鎖は、治療鎖の活性を増強するために、機能性の成分として働く3'もしくは5'末端に、または炭水化物部分もしくは骨格に官能基を有することもできる。例えば、ホスホジエステルリンカー鎖は、標的細胞に対する認識および内在化(internalization)を可能とする葉酸誘導体のようなターゲティングリガンドを含むことができる。分解抵抗性結合により構成された相補的な治療鎖にリンカーが結合している場合は、二重鎖を内在化させ得る。一旦細胞の内部に入れば、リンカーは分解されることとなり、これにより治療鎖が放出される。このようにして、治療鎖は結合した追加的な官能基を有さなくてもよく、その作用は必須でない部分によって妨げられ得ない。この戦略は、あらゆるアンチセンス、リボザイム、または3本鎖形成ポリヌクレオチドに適用することができ、これを使用して抗ウイルス性、抗細菌性、抗腫瘍性、抗炎症性、抗増殖性、抗受容体ブロック性、または抗輸送性ポリヌクレオチド等を配送することができる。
別個のリンカー鎖は、治療鎖に隊する直接的な相補配列を有し、1対1の様式でこれにハイブリダイズするよう合成することができる。あるいは、リンカー鎖は、リンカー鎖の5'領域が治療鎖の5'領域とハイブリダイズし、リンカー鎖の3'領域が治療鎖の3'領域とハイブリダイズして、次のような構造の連鎖状体(concatenate)を形成するよう構成することができる。
この連鎖状体は、治療核酸の見かけの分子量が増加し、最適の治療効果を達成するために、その薬物動力学的性質およびターゲティングリガンド:治療オリゴヌクレオチド比率を調整することができるという利点を有する。
樹枝状体ポリ陽イオン
樹枝状体ポリ陽イオンは、オリゴマーおよび/またはポリマーを付加し、正に荷電した外側表面を与える繰り返し反応手順により、コア分子または指定された内部上に形成された三次元の高度に秩序化されたオリゴマーおよび/またはポリマー化合物である。このような樹枝状体は、ダウ・ケミカル・カンパニーに対するPCT/US83/02052、およびTomalia,D.A.らに対する米国特許第4,507,466号、4,558,120号、4,568,737号、4,587,329号、4,631,337号、4,694,064号、4,713,975号、4,737,550号、4,871,779号および4,857,599号に開示されるようにして、または以下に示す例示的な開示に記載されるようにして調製することができる。典型的には、樹枝状体陽イオンは、その上にポリマーを付加したコア分子を含む。ポリマーは、正の電荷を獲得し得る末端基を含むオリゴマーまたはポリマーとすることができる。適切なコア分子は、オリゴマーまたはポリマーに対するコア分子の結合のために利用することのできる少なくとも2つの反応性の残基を含む。反応性の残基の例には、就中、ヒドロキシル、エーテル、アミノ、イミノ、アミド、イミド、アンモニウム、ハライド、カルボキシル、カルボキシハライドおよびスルフヒドリルがある。好適なコア分子は、就中、アンモニア、トリス-(2-アミノメチル)アミン、リジン、オルニチン、ペンタエリスリトールおよびエチレンジアミンである。これらの残基の組合せも、他の反応性の残基として適切である。
この発明の樹枝状体ポリ陽イオンの調製に適切なオリゴマーおよびポリマーは、体に良好に受容される薬学的に受容し得るオリゴマーおよび/またはポリマーとする。これらの例には、就中、α,β−エチレン系不飽和カルボン酸のアルキルエステルまたはα,β−エチレン系不飽和アミドと、アルキレンポリアミンまたはポリアルキレンポリアミンとの反応から誘導されるポリアミドアミンがある。好適なのは、メチルアクリレートおよびエチレンジアミンである。ポリマーは、好ましくは共有結合によりコア分子に結合させる。
オリゴマーおよび/またはポリマーに結合させ得る末端基は、正の電荷を獲得し得るものとすべきである。これらの例には、アゾールおよび第1、第2、第3および第4級の脂肪族および芳香族アミンおよびアゾール、これらはSまたはOにより置換されていてもよい、グアニジウムおよびこれらの組合せがある。末端陽イオン基は、好ましくはオリゴマーおよび/またはポリマーに対して共有結合の様式で結合させるものとする。好適な末端陽イオン基は、アミンおよびグアニジウムである。ただし、他のものを利用することもできる。末端陽イオン基は、オリゴマーおよび/またはポリマーの全ての末端基の約10〜100%、更に好ましくは約50〜100%の割合で存在させることができる。樹枝状体陽イオンは、陽イオン基以外に、0〜約90%の末端反応性残基も含むことができる。末端陽イオン性基以外の適切な末端反応性残基は、就中、ヒドロキシル、シアノ、カルボキシル、スルフヒドリル、アミドおよびチオエーテル、並びにこれらの組合せである。ただし、他のものを利用することもできる。
樹枝状体ポリ陽イオンは、一般に好ましくはポリヌクレオチドと非共有結合により会合するものとする。これにより、一旦細胞に配送された際に、組成物の容易な解離または離散が可能となる。ここで使用するのに適切な典型的な樹枝状体ポリ陽イオンは、約2,000〜1,000,000の平均MW(MWave)、更に好ましくは約5,000〜500,000の平均MWを有する。ただし、他の分子量も適切である。好適な樹枝状体ポリ陽イオンは、約11〜60Å、好ましくは約15〜55Åの流体力学的半径を有する。ただし、他の大きさも適用することができる。
樹枝状体陽イオンの末端陽イオン基対ポリヌクレオチドの割合を約1:4〜25:1、更に好ましくは約1:1〜10:1とする場合に、本発明により良好な結果が得られる。ただし、他の割合も利用することができる。
組成物は、
1)DNAマスク成分、
2)細胞認識成分、
3)電荷中和および膜透過成分、および
4)亜細胞局在化成分
よりなる群から選択される薬剤を更に含むことができる。
樹枝状体陽イオンを含むこの系におけるそれぞれの要素は、好ましくはその示された機能を果たすことができ、必要に応じてポリヌクレオチドと集合または離散することもできる。組成物は、1以上の前記薬剤、更に好ましくは2以上の薬剤を更に含むことができる。この系の1つの実施形態を以下のスキーム1に示す。
この発明のポリヌクレオチド配送系のこの実施形態では、NLSを核局在化配列とし、MDを膜透過成分とし、リガンドを細胞認識成分とする。
この発明の組成物が膜透過剤をも含む場合は、この薬剤対樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基の割合は、好ましくは約1:100〜1:4、更に好ましくは約1:50〜1:8とする。ただし、他の割合も適切である。共有結合力または静電的力によって、膜透過剤を樹枝状体ポリ陽イオンに結合させることができる。この発明の組成物は、リポソーム、ポリアミンのようなポリ陽イオン等の形態とすることのできるリン脂質を更に含むことができる。
組成物が亜細胞局在化剤を含む場合は、亜細胞局在化剤対樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基の割合は、約1:100〜1:5、更に好ましくは約1:80〜1:20とすることができる。ただし、他の割合も適切である。共有結合力または静電的力によって、亜細胞局在化剤を樹枝状体ポリ陽イオンに結合させることができる。
亜細胞局在化剤が核局在化剤である場合には、これは一本鎖ポリヌクレオチドリンカーのようなDNA会合部分、樹枝状体ポリ陽イオン、または主溝もしくは小溝バインダーをも含むことができ、これを核局在化剤に機能的に連結させるものとし、この場合はDNAに対する結合は好ましくは非共有結合によるものとする。DNA会合部分は、当業界で公知のもののような挿入剤とすることができる。これらの例については後述する。挿入剤は、真核細胞表面上に位置した受容体を標的とする1以上のリガンドに結合させることができる。この場合、リガンドおよび樹枝状体ポリ陽イオンは、真核細胞を認識し得る細胞認識剤を形成し、標的化リガンドも樹枝状体ポリ陽イオンに結合させる。挿入剤はポリヌクレオチドに非共有結合により結合させ、リガンドは好ましくは共有結合により挿入剤に結合させる。挿入剤またはリガンドに機能的に結合した膜透過剤も存在させることができる。更に、組成物は、樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した融合性ポリペプチドも含むことができる。この結合は、共有結合または非共有結合とすることができる。組成物は、以下に記載するようなDNA会合部分を含むこともできる。
真核細胞表面上に局在化する受容体を標的とするリガンドが組成物中に存在する場合は、細胞標的化リガンド対樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基の割合は、好ましくは約1:100〜1:10、更に好ましくは約1:80〜1:25とする。ただし、他の割合も適切である。好適な細胞標的化リガンドは、ビタミン、炭水化物およびポリペプチドである。ただし、他のものも適切である。ポリペプチドは、所定の特異性を有する抗体またはその断片を含むことができる。
融合性のポリペプチドを樹枝状体ポリ陽イオンに結合させる場合は、融合性ポリペプチド対樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基の割合は、好ましくは約1:100〜1:4、更に好ましくは1:80〜1:10とする。ただし、他の割合も適切である。
組成物は、ポリヌクレオチドの循環系における半減期を増加させ得るDNAマスク剤を含むこともできる。DNAマスク剤は、共有結合または非共有結合によって樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合させる。ただし、DNAマスク剤は、好ましくは非共有結合によってポリヌクレオチドに結合させる。DNAマスク剤が組成物中に存在する場合は、DNAマスク剤対樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基の割合は、好ましくは約1:33〜1:3、より好ましくは約1:25〜1:8とする。ただし、他の割合も適切である。
組成物に添加できるこれらの全ての薬剤の他の特定の形態を以下に記載する。
機能性成分
(1)DNAマスク成分
この系のDNAマスク要素は、ポリペプチドの全部または一部をマスクすることができる分子であり、これにより循環系に存在する反応物を分解することにより攻撃を阻害するか、または細網内皮細胞系による取り込みをブロックすることにより、その循環系における半減期を増加させるものである。
この発明では、以下に記載する従来の方法により、ポリエチレングリコール(PEG)をDNA会合部分に共有結合により連結し、DNAマスク成分として使用することができる。PEGは、約700〜20,000ダルトン、好ましくは約1800〜6000ダルトンの分子量を有することができ、好ましくは約1:4〜1:100、更に好ましくは約1:20の比率(分子PEG:bpDAN)で存在させる。
あるいは、脂質との会合によってDNAをマスクすることができる。1つの態様では、例えば、Szokaらに対する米国特許第4,394,448号(この相応する部分を参考によりここに援用する)に記載されたように、標準的なリポソームにDNAを封入する。他の態様では、Epsteinらに対する米国特許第4,897,355号に記載されたものに類似する合成陽イオン性脂質を用いてDNAをインキュベートする。このような陽イオン性脂質は、次の化学式を有する。
式中、
nは1〜8の整数であり、
R1およびR2は同一または異なり、(C6〜C24)アルキルまたはアルケニルであり、
R3は水素、または(C1〜C10)アルキルまたはアルキルアミンであり、
R4は正に荷電した直鎖または分岐(C1〜C30)アルキルまたはアルキルアミンであり、1以上の炭素原子がNR’により置換されていてもよく、R’は水素、または(C1〜C10)アルキルまたはアルキルアミンである。
-N-R'部分として機能し得る好適な基は、就中、トリス(アミノエチル)アミン(NH2CH2CH2)3N、アグマチン(デカルボキシ−アルギニン)H2N(CH2)4C(=NH)NH2、3-アミノエチル-1,3-プロパンジアミンH2N(CH2)3NH(CH2)2NH2、3-ジメチルアミンプロピルアミン(CH3)2NH(CH2)3NH2、イミノビス(N,N')ジメチルプロピルアミンNH((CH2)3N(CH3)2)2、イミノビス(3-アミノプロピル)-1,3-プロパンジアミン、1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン、ビス(プロピルアミン)(NH2(CH2)3)2NH、スペルミジン、およびスペルミンである。これらの基は、好ましくはその窒素原子の1つを介して脂質分子に結合される。
特に好適な実施形態では、合成陽イオン性脂質は、次の化学式を有する合成陽イオン性尾部脂質とする。
式中、
nは6〜24の整数であり、
Yは、水素、エタノールアミン、コリン、グリセロール、セリン、モノメトキシポリエチレングリコール、シアル酸、およびイノシトールよりなる群から選択され、
R1は(C6〜C24)アルキルまたはアルケニルであり、
R3は水素、または(C1〜C10)アルキルまたはアルキルアミンであり、
R4は正に荷電した直鎖または分岐(C1〜C30)アルキルまたはアルキルアミンであり、1以上の炭素原子がNR’により置換されていてもよく、R’は水素、または(C1〜C10)アルキルまたはアルキルアミンである。
-N-R'部分として機能し得る好適な基は、就中、トリス(アミノエチル)アミン(NH2CH2CH2)3N、アグマチン(デカルボキシ−アルギニン)H2N(CH2)4C(=NH)NH2、3-アミノエチル-1,3-プロパンジアミンH2N(CH2)3NH(CH2)2NH2、3-ジメチルアミンプロピルアミン(CH3)2NH(CH2)3NH2、イミノビス(N,N')ジメチルプロピルアミンNH((CH2)3N(CH3)2)2、イミノビス(3-アミノプロピル)-1,3-プロパンジアミン、1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン、ビス(プロピルアミン)(NH2(CH2)3)2NH、スペルミジン、およびスペルミンである。これらの基は、好ましくはその窒素原子の1つを介して脂質分子に結合させる。
前記した合成陽イオン性脂質は、会合した場合にDNAを有効にマスクする。この発明を如何なる様式においても限定することを意図するものではないが、脂質は、DNAをある種の様式でカプセル封入する単層構造を形成し得ると考えられる。
(2)細胞認識成分
この系の細胞認識要素は、後記するように従来の方法によりDNA会合部分に共有結合で連結した、標的細胞の表面上の成分を認識し得る分子である。細胞認識成分は、細胞表面抗原に対する抗体、受容体媒介エンドサイトーシスに関与するものを含む細胞表面受容体のためのリガンド、ペプチドホルモン等を含む。この発明により企図する特異的なリガンドには、炭水化物リガンド、例えばガラクトース、マンノース、マンノシル5-リン酸、フコース、シアル酸基、N-アセチルグルコサミン、または複合体炭水化物のようなこれらの基の組合せ、例えば血液型の糖脂質上に、または種々の分泌蛋白質上に認められるものが含まれる。他のリガンドには、葉酸、ビオチン、細胞表面または細胞内受容体と相互作用し得る種々のペプチド、例えば化学誘因性ペプチドN-ホルミル-met-leu-phe(配列番号:2)、arg-asp-グリシン配列を含むペプチドまたはcys-ser-gly-arg-glu-asp-val-trp(配列番号:3)ペプチド、シスチン残基を含むか、細胞表面蛋白質、例えばヒト免疫不全ウイルスGP-120と相互作用するペプチド、およびCD-4と相互作用するペプチドが含まれる。他のリガンドには、抗体または抗体断片、例えばHertlerとFrankelにより記載されたものが含まれる(Hertler,A.とFrankel,A.,J.Clin.Oncol.7:1932(1989))。抗体の特異性は、組織適合性高分子、自己免疫抗原、ウイルス、寄生性または細菌性蛋白質を含む細胞表面上で発現し得る種々のエピトープに対して向けることができる。他の蛋白質リガンドには、ホルモン、例えば成長ホルモンおよびインシュリンまたは蛋白質成長因子、例えば、GM-CSF、G-CSF、エリスロポイエチン、上皮成長因子、塩基性または酸性繊維芽細胞成長因子等が含まれる。他の蛋白質リガンドには、細胞表面受容体を介して作用する種々のサイトカイン、例えばインターロイキン2、インターロイキン1、腫瘍壊死因子、およびこの種の高分子由来の適切なペプチド断片が含まれる。
(3)膜透過成分
この系の膜透過要素は、膜を横切るポリヌクレオチドの通過を助成する分子である。DNAマスク成分として前記したリポソームおよび合成陽イオン性脂質も、膜透過成分として機能することができる。
この発明の膜透過成分は、ポリヌクレオチド上の大きな負の電荷を中和するポリ陽イオンも含む。この発明のポリ陽イオンには、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ(リジン−アルギニン)および類似するポリペプチド、並びにポリアミンおよびポリ陽イオン性樹枝状体、例えば前記し、実施例で利用し、Tomaliaら(Tomalia,D.A.ら(1990)前記)により開示されたものが含まれる。このような樹枝状体は、この発明の特に好適な態様である。これらはそれ自体で、ポリヌクレオチドと会合して、前記したようにポリヌクレオチドのトランスフェクション効率を実質的に増強させ得るためである。
これらの非直鎖状ポリ陽イオン性カスケードポリマーは、ポリリジンのDNA結合および配送特性と弱塩基のリソゾーム型(lysomotropic)効果とを組み合わせるものである。ポリアミドアミン(PAMAM)カスケードポリマーは、Tomaliaら、前記により記載されたようにメチルアクリレートとエチレンジアミンとから合成された十分に特定された種類の樹枝状ポリマーであり、レポーター遺伝子をコードするプラスミドと複合化した場合、例示的な開示において細胞により十分に許容され、広範な種類の培養細胞の高い効率のトランスフェクションを媒介することが示されている。
更に好適な態様では、GALAのような両親媒性ペプチドをカスケードポリマーに共有結合により結合させる(Subbarao,N.K.ら、「両親媒性ペプチドによるpH依存性二重層脱安定化」、J.Biol.Chem.26:2964(1987))。この組成物も、この発明の最も好適な態様である。例示的な開示において、これは初代細胞およびセルラインの両者で、ポリヌクレオチドのトランスフェクション効率を有意に増加させることが示されているためである。
ポリ陽イオンの他の種類は、次の化学式を有する陽イオン性胆汁酸塩である。
式中、
XおよびYは、独立してHまたはOHであり、
R3は水素、または(C1〜C10)アルキルまたはアルキルアミンであり、
R4は正に荷電した直鎖または分岐(C1〜C30)アルキルまたはアルキルアミンであり、1以上の炭素原子がNR’により置換されていてもよく、R’は水素、または(C1〜C10)アルキルまたはアルキルアミンである。
-N-R'部分として機能し得る好適な基は、就中、トリス(アミノエチル)アミン(NH2CH2CH2)3N、アグマチン(デカルボキシ−アルギニン)H2N(CH2)4C(=NH)NH2、3-アミノエチル-1,3-プロパンジアミンH2N(CH2)3NH(CH2)2NH2、3-ジメチルアミンプロピルアミン(CH3)2NH(CH2)3NH2、イミノビス(N,N')ジメチルプロピルアミンNH((CH2)3N(CH3)2)2、イミノビス(3-アミノプロピル)-1,3-プロパンジアミン、1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン、ビス(プロピルアミン)(NH2(CH2)3)2NH、スペルミジン、およびスペルミンである。これらの基は、好ましくはその窒素原子の1つを介して胆汁酸塩に結合させる。
異なる実施形態では、この発明の膜透過成分は、両親媒性陽イオン性ペプチドとする。両親媒性陽イオン性ペプチドは、その本来の形状が、ペプチドが陽イオン性の面と中性で疎水性の面とを有すると考えられるようなペプチドである。好適な実施形態では、ペプチドは環状ペプチドとする。この発明の両親媒性陽イオン性ペプチドの例は、グラミシジンSおよびチロシジン(tyrocidine)である。ペプチドは、天然に存在するL型の形状に対して、D型の形状の幾つかまたは全部のアミノ酸を含むこともできる。グラミシジンSの化学構造を以下に示す。
特に好適な態様では、膜透過要素には、両親媒性陽イオン性環状ペプチドに加えて、(1)脂質または(2)単純ポリアミンまたは両者が含まれる。
この発明の脂質は、リポソーム形成を行うことができ、元々の形態またはリポソームとして必要な濃度で投与した場合に実質的に毒性のない両親媒性分子である。適切な脂質は、一般に極性または親水性の末端と、非極性または疎水性の末端とを有する。適切な脂質には、限定されるものではないが、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、コレステロール(Chol)、コレステリルホスホリルコリン、3,6,9-トリオキサオクタン-1-オール−コレステリル-3e-オール、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、および他のヒドロキシ−コレステロールまたはアミノコレステロール誘導体(Patel,K.R.ら、Biochem.Biophys.Acta 814:156(1985)を参照することができる)が含まれる。脂質は、好ましくはリポソームの形態で添加し、添加するポリアミンは、好ましくはスペルミンまたはスペルミジンとする。
膜透過要素、環状ペプチドおよび必要に応じてリン脂質およびポリアミンは、同時にまたは連続的に組成物に添加することができる。好ましくは、環状ペプチドを最初に添加し、その後にリン脂質またはポリアミンを添加する。添加する環状ペプチド対ポリアミンのモル比は、好ましくは約1:1〜約1:3とする。添加する環状ペプチド対リン脂質のモル比は、好ましくは約1:1〜約1:20とする。
(4)亜細胞局在化成分
この系の亜細胞局在化要素は、後記するような従来の方法によってDNA会合部分と共有結合により連結された、標的化細胞の亜細胞成分を認識し得る分子である。特定の亜細胞成分には、核、リボソーム、ミトコンドリア、および葉緑体が含まれる。
この発明の好適な態様では、亜細胞局在化成分は、核局在化成分とする。核局在化成分には、特定されたアミノ酸配列の公知のペプチド、およびこのようなペプチドを含むより長い配列が含まれる。1つの公知のペプチド配列は、SV40ラージT抗原ヘプタペプチドpro-lys-lys-lys-arg-lys-val(配列番号:1)である。他のペプチドには、インフルエンザウイルス核蛋白質デカペプチドala-ala-phe-glu-asp-leu-arg-val-leu-ser(配列番号:4)、およびアデノウイルスEla蛋白質セグメントlys-arg-pro-arg-pro(配列番号:5)が含まれる。他の配列は、Dingwallら(Dingwall,C.ら、TIBS 16:478(1991))から認めることができる。
他の実施形態では、亜細胞局在化成分はリソゾーム局在化成分とする。リソゾームを標的とする公知の成分は、lys-phe-glu-arg-gln(配列番号:6)断片を含むペプチドである。
更に他の実施形態では、亜細胞局在化成分はミトコンドリア局在化成分とする。ミトコンドリアを標的とする公知の成分は、配列met-leu-ser-leu-arg-gln-ser-ile-arg-phe-phe-lys-pro-ala-thr-arg(配列番号:7)を含むペプチドである。ただし、他の亜細胞局在化成分または薬剤も適切である。
DNA会合部分
この系のDNA会合部分は、非共有結合的な様式で核酸と相互作用する機能性の成分の部分を指す。この部分は、従来の手段により、または後記するようにして機能性の成分の残余部分に共有結合により連結する。DNA会合部分は、好ましくは主溝および小溝バインダー、DNA挿入体、または一般的なDNAバインダーとする。一本鎖ポリヌクレオチドの場合は、DNA会合部分は、前記したようなリンカー鎖でもよい。このような場合は、機能性の部分、例えば細胞認識または亜細胞局在化成分は、リンカー鎖に共有結合により連結するものとする。
1つの好適な態様では、DNA会合部分は、主溝または小溝バインダーとする。主溝または小溝バインダーは、DNAの主溝または小溝部に会合または「入り込んでいる(lay in)」ことが知られている部分である。これらのバインダーには、ジスタマイシンAおよびヘキスト(Hoechst)色素33258が含まれる。
他の実施形態では、DNA会合部分は、ポリ陽イオンのような非特異的なDNAバインダーとする。この発明のポリ陽イオンには、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ(リジン−アルギニン)および類似するポリペプチド、並びにポリアミンおよびポリ陽イオン性樹枝状体が含まれる。
他の好適な実施形態では、DNA会合部分は、DNA挿入体とする。DNA挿入体は、平板状の多環式分子、例えばエチジウムブロマイド、アクリジン、ミトキサントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシンおよびN-メチル-2,7-ジアザピレニウム、およびその誘導体とする。特に好適な実施形態では、挿入体は、2つの共有結合により連結された平板状の多環式分子により構成されるダイマーとする。この発明の平板状の多環式ダイマー部分は、次の化学式を有する。
式中、
Zは結合であり、
nおよびmは独立して1〜20の整数であり、
pは0〜20の整数であり、
Ar1およびAr2は、就中、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトキサントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシンおよびN-メチル-2,7-ジアザピレニウム、およびその誘導体よりなる群から独立に選択される。
nおよびmの値は、DNAにおける挿入されたアクリジンモノマーの間隔を決定するものであるために重要である。nおよびmのより好適な値は、それぞれ3および4である。Ar1およびAr2が両者ともアクリジンであるビス−アクリジンダイマーが好適である。
好適なDNA会合部分は、前記したように機能性の部分、例えば細胞認識部分、亜細胞局在化部分、または膜透過部分に共有結合により結合させることができる。pの値は、機能性の部分からの挿入体の分離を決定する。pの好適な値は0〜8である。
DNA会合部分は、多コピーの1以上の機能性の部分に共有結合により結合させることができる。例えば、ビス−アクリジンダイマーは、肝細胞アジアロ糖蛋白質受容体に結合した3つのグルコース残基に結合させることができる。
DNA会合ダイマーを機能性の部分に結合させる好適な方法は、次の化学式を有する前駆体を伴うものである。
式中、
nおよびmは独立して1〜20の整数であり、
pは0〜20の整数であり、
Ar1およびAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトキサントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシンおよびN-メチル-2,7-ジアザピレニウム、並びにその誘導体よりなる群から独立に選択され、
Xは、N-ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジスルフィド、ヒドラジドおよびフェニルグリオキサールよりなる群から選択される反応性の基である。
1つの好適な実施形態では、Ar1およびAr2はアクリジンとし、pは3とし、Xはp-マレイミドフェニルとする。その後、挿入部分を、例えば機能性の部分のスルフヒドリル基を介して機能性の部分に結合させ、次の化学式を有する二機能性成分を得る。
式中、
Yは機能性成分であり、
nおよびmは独立して1〜20の整数であり、
pは0〜20の整数であり、
Ar1およびAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトキサントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシンおよびN-メチル-2,7-ジアザピレニウム、およびその誘導体よりなる群から独立に選択され、
Xは、N-ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジスルフィド、ヒドラジドおよびフェニルグリオキサールよりなる群から選択される反応性の基である。
機能性の成分を挿入体に結合させる際に、アミノ酸セグメント-lys-lys-を有するペプチドのような生分解性のリンカーを使用することもできる。
この発明の更に他の実施形態では、平板状の多環式ダイマーは次の化学式を有する。
式中、
Ar1およびAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトキサントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシンおよびN-メチル-2,7-ジアザピレニウム、およびその誘導体よりなる群から独立に選択され、
各aaは、独立にアミノ酸であり、
xおよびzは、独立に選択される1〜100の整数であり、
yは、0〜5の整数であり、
aa1およびaa2は、リジン残基であり、
N1およびN2は、リジン残基aa1およびaa2のε−アミノ基である。
この発明の組成物は、細胞と接触させることにより、ポリヌクレオチドを真核細胞に導入するために適切に利用される。ポリヌクレオチドの真核細胞への導入は、試験管内および生体内の両者で行うことができる。生体内では、約0.5μg〜20mgのポリヌクレオチド、更に好ましくは約2.5μg〜10mgのポリヌクレオチドを含む量で、組成物を投与することができる。ただし、他の量で投与することもできる。本方法は、試験管内および生体内の両者において、ヒト細胞を含む植物または動物細胞にポリヌクレオチドを導入するのに適切である。
この発明のポリヌクレオチド配送系は、治療的な意味合いにおいても有用である。治療的な応用においては、この発明の組成物は、全身および局所または局在化投与を含む種々の様式の投与のために処方することができる。技術および処方は、一般にRemington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Co.,Easton,PA(最新版)に見出すことができる。
この発明の組成物は、典型的には経口、経皮、全身投与、または吸入経路により投与する。
全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下を含む注射のような非経口投与が好適である。肺の疾患を処置するためには、ポリヌクレオチド配送系の投与は、肺への直接的な系の吸入または投薬により行うことができる。
注射のためには、この発明の組成物は、就中、好ましくは生理的に和合性の緩衝液、例えばハンクス溶液またはリンゲル液中で、液体溶液の形態で処方することができる。更に、組成物を固体の形態で処方し、この形態で販売し輸送することができ、使用の直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態もこの発明の範囲内に含まれる。固体形態は、肺、皮膚、胃腸管または筋肉へ乾燥粉末を介して直接投与することもできる。
本組成物の全身投与は、粘膜経由または皮膚経由手段により行うこともでき、または経口的、または鼻腔内もしくは吸入エーロゾルを介してこの系を投与することができる。粘膜経由または皮膚経由の投与のためには、透過するバリアーに対して適切な浸透剤を処方物中で使用する。この種の浸透剤は一般に当業界で公知であり、例えば、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体の粘膜経由投与を含む。更に、透過を促進するために界面活性剤を使用することもできる。高速衝撃(high velocity impaction)のような物理的な手段を使用し、皮膚の外側層の透過を促進し、複合体を表皮に配置することもできる。粘膜経由の投与は、例えば鼻スプレーにより、または座薬の手段により行うことができる。
経口投与のためには、この発明の組成物は、従来の経口投与形態、例えばカプセル、錠剤および強壮剤(tonics)に処方することができる。
局所投与のためには、この発明の系は、当業界で一般的に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに処方することができる。局所または皮膚経口の投与は、皮膚表面に対する高速衝撃による投与によって行うことができる。ただし、皮膚経由または局所投与の他の手段も適切である。
この発明をここに一般的に説明したが、特に示さない限り、説明の目的のみにためにここに含め、この発明およびそのあらゆる実施形態を限定することを意図しない所定の特定の実施例を参照することにより、これをより良く理解することができよう。
実施例
実施例1:DNA−樹枝状体複合体およびDNA−ポリリジン複合体により媒介されるトランスフェクションの比較
ポリリジンのようなポリアミン重合体に対するより良好な化学的に特定された代替物を見出すために、スターバースト(Starburst)(商標名)樹枝状体微粒子(Tomaliaら、前記)としても知られている親水性の分岐ポリ陽イオン高分子を用いて、DNAと、またはDNAおよび透過性両親媒性ペプチドGALA(Parente,R.ら、Biochemistry 29:8720(1990))との複合体を形成した。ポリスチレンチューブ内で、660μ1のHBS(20mM Hepes,150mM NaCl,pH7.4)中で12μgのpCLuc4プラスミドを希釈することにより複合体を調製した。ポリリジン(Sigma Chemical Co.)または第5世代(generation)のStarburst樹枝状体微粒子(1nmol)(Polysciences,Inc)を340μ1のHBSに溶解させ、DNA溶液に徐々に(滴下)添加した。このような条件下で、ポリリジンのε−アミノ基由来の、または樹枝状体の末梢アミン由来の正電荷は、プラスミドの負電荷に対して1.3倍過剰である。ペプチドGALAを添加する場合、GALA上の負電荷が樹枝状体の過剰の電荷を中和するようこれを添加するものとした。最後の添加の後に室温で30分間混合物を放置した後、500μ1の混合物をCV-1細胞に添加した。前記したようにトランスフェクションの手順を実施した。この実験では、GALA−樹枝状体−DNA複合体を用いた場合に最良のトランスフェクションの手順が達成され、次いで樹枝状体−DNA、その次にポリリジン−DNAであった。結果を以下の表に示す。
実施例2:材料
アンモニア開始剤コアから合成されたPAMAMカスケードポリマー(世代2〜10)を、Polysciences,Inc.(Warrington,PA)から取得し、Starburst(商標名)樹枝状体とした。必要に応じて、Savant SC110スピードバック装置を使用して樹枝状体溶液を濃縮した。トリス(2-アミノエチル)アミンから出発する以外は、Tomaliaら(Tomaliaら、前記)の方法を使用して当実験室でカスケードポリマーを合成した場合も、ここに報告したのと類似する結果が得られる。市販の樹枝状体は、較正したゲル浸透カラム上で分析し、その材料が特定の直径に適合していることを確認すべきである。ロットによっては規格に適合していないためである。115リジン残基の平均鎖長さを有するポリ(L-リジン)ヒドロブロミド(pLys115)は、Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)から取得した。N-スクシニミジル3-(2-ピリジル)ジチオ)プロピオネート(SPDP)は、Pierce(Rockford,IL)から取得した。
両親媒性ペプチドGALAのシステイン含有アナログであるGALA-cys-trp-glu-ala-ala-leu-ala-glu-ala-leu-ala-glu-ala-leu-ala-glu-his-lue-ala-glu-ala-leu-ala-glu-ala-leu-glu-ala-cys-ala-ala(配列番号:8)は、主としてGALAについて先に記載されたように(Subbaraoら、前記)、UCSF Bioresources Centerで合成され、精製され、分析されたものである。
実施例3:省略形
DME:ダルベッコの改変イーグル培地
EDTA:エチレンジアミンテトラ酢酸
HBS:Hepes緩衝塩類溶液(10mM Hepes;150mM NaCl,pH7.3)
HEPES:N-(2ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)
MEM:最小必須イーグル培地
MTT:3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド
TRIS:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
PAMAM SD54およびSD68:ポリアミドアミンスターバースト(商標名)樹枝状体、直径54Åおよび68Å。
pLys115:ポリ(L-リジン)、115モノマー平均鎖長。
実施例4:GALAcys(配列番号:8)を用いたSD54の修飾
第5世代のPAMAM樹枝状体(54Å直径、SD54)を以下のスキーム2に従って修飾した。
実施例5:SPDPによるSD54の官能化
0.5mlの水中の樹枝状体(66μmol末端アミン、15mg)を0.75mlの0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)を用いて希釈し、0.75mlのエタノール中のSPDPの15mM溶液を滴下添加した。反応混合物をアルゴン下に1時間撹拌し、Biogel P2カラム(2.8×20cm)上で分画し、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)を用いて溶出させた。3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート修飾樹枝状体(粒子当たり平均16のジチオピリジン基を有するPDP-SD54)を含有する画分を共にプールし、3mlの最終容量に濃縮した。
実施例6:GALAcys(配列番号:8)とPDP-SD54の反応
0.1Mリン酸緩衝液(pH7.2)中のGALAcys(配列番号:8)の10mM溶液(1ml)を1mlの濃縮したPDP-SD54溶液に滴下添加した。混合物をアルゴン下で一夜撹拌し、較正したセファデックス(商標名)G75-120カラム(2×90cm)(アプロチニン(66,000)およびブルーデキストラン(2,000,000))を含有するキャリブレーションキットSigma MW-GF-70)上で反応混合物を分画することによりGALA接合体を精製し、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)を用いてカラムを溶出させた。約50,000の見かけの分子量で溶出される接合体を含有する画分をプールし、濃縮し、HBS(10mM Hepes;150mM NaCl,pH7.3)に対して透析した。透析物質をHBSを用いて希釈して1mgの樹枝状体/mlとし、0.45μmのミリポアメンブレンを介して滅菌ろ過した。
実施例7:発現ベクター
ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドpCLuc4、およびβ−ガラクトシダーゼをコードするpCMV−βGalは、それぞれCotten,M.博士(Institute of Molecular Pathology、Vienna、オーストリア)およびMc Gregor,G.博士(Howard Hughes Medical Institute,Houston,TX)からそれぞれ快く贈られたものである(De Wet,J.R.ら、「ホタルルシフェラーゼ遺伝子:構造および哺乳動物細胞における発現」、Mol.Cell Biol.7:725(1987);Mc Gregor,G.R.とCaskey,C.T.、「哺乳動物セルラインでイー・コリβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドの構築」、Biotech.7:1116(1989))。E.coli中でプラスミドを生育させ、アルカリ溶解技術により抽出し、平衡CsCl勾配での遠心分離により精製した。プラスミドの純度は、0.8%アガロースゲル上の電気泳動によりチェックし、DNA濃度は、260nmの吸光度から測定した。
実施例8:複合体の調製
典型的な複合体は、ポリスチレンチューブ中で、6μgのプラスミドDNAを330μ1のHBS中に希釈することにより作製した。ポリ陽イオンおよび/またはそのGALA官能化誘導体(2〜160μg)を170μ1のHBS中で希釈し、DNAに滴下添加した。添加を完了したときに、溶液を穏やかに混合した。ポリ陽イオン−DNA複合体の形成は、ゲル遅延検定により示された。すなわち、トリス−酢酸−EDTA緩衝液系(pH8.0)を使用し、0.8%アガロースゲルを介してサンプル(30μ1)を電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を使用してDNAを明視化した。
実施例9:細胞およびトランスフェクション手順
付着性セルラインCV-1(サル繊維芽細胞)、HeLa(ヒトカルチノーマ)、HepG2(ヒトヘパトーマ)は、UCSF細胞培養研究所より得た。10%FCSおよび抗生物質(ペニシリン、100単位/mlおよびストレプトマイシン、100μg/ml)を含有する3mlのDME-H21中で、60mm培養皿(Falcon)当たり約5×105の濃度で細胞をプレート処理した。5%CO2を含有する湿潤雰囲気中で37℃で細胞を半コンフレント(集密化)状態まで生育させた。典型的な実験では、示した量のポリ陽イオンと複合化した6μgのプラスミドを含有する0.5mlのHBSの添加により、血清を含有しない1.5mlの培地中で細胞をトランスフェクションした。5時間後に培地を除去し、10%FCSを含有する新鮮な培地で置き換えた。更に24時間または48時間、細胞を培養し、レポーター遺伝子の発現について試験した。
浮遊セルラインK-562(ヒト赤白血病)、EL-4(マウスリンホーマ)、およびJurkat(ヒトT細胞)は、UCSF細胞培養研究所から取得し、10%FCSおよび抗生物質を含有するRPMI1640中で生育させた。トランスフェクションの実験のために、7.5%FCSを含有する1.5mlのRPMI1640中の1.2×106の細胞を、6穴プレートの各穴に導入するか、またはポリエチレンチューブ中で回転させ、前記したように6μgのDNAを用いてトランスフェクションした。5時間後に、10%FCSを含有する新鮮な培地に細胞を移した。これはプレートまたはチューブの遠心分離(1200rpm、5分)後に行い、トランスフェクション培地を90%除去し、これを予め加温した新鮮な培地で置き換えることによった。更に24時間または48時間、細胞を培養し、レポーター遺伝子の発現について試験した。
新たに単離されたラット肝細胞を、Bissel,M.博士(肝臓センター、UCSF)から取得し、75%のMAMと、10%FCS、インシュリン(10μg/ml)、トランスフェリン(10μg/ml)、デキサメタゾン(1μM)および抗生物質(ペニシリン:100単位/ml;ストレプトマイシン:100μg/ml、およびゲンタマイシン:25μg/ml)を含有する25%のWaymouth's培地とにより構成される3mlの肝細胞培地中で、60mmの培養皿当たり2×106の密度でプレート処理した。5%CO2を含有する湿潤雰囲気中で37℃で細胞を生育させ、2%FCSを含有する2mlの肝細胞培地中で6μgのプラスミドを用いて前記したように5〜6時間後にトランスフェクションした。一夜のインキュベート期間の後に、トランスフェクション培地を除去し、2%FCSを含有する3mlの新鮮な肝細胞培地で置き換えた。細胞を更に24時間培養し、レポーター遺伝子の発現について試験した。
X-Galを使用する細胞の組織学的染色により(Lim,K.とChase,C.B.、前記)、トランスフェクションの24時間後にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を検出した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現は、ルシフェリンおよびATPの存在下にバイオルミノメーター(Analytical bioluminescence,San Diego,CA)を用いて発光を測定することにより、細胞溶解物上でトランスフェクションの48時間後に定量した(Brasier,A.R.ら、「哺乳動物セルラインにおけるレポーター遺伝子としてのホタルルシフェラーゼ検定の最適化した使用」、Biotech.7:1116(1989))。
実施例10:毒性検定
トランスフェクション後の全蛋白質含有量を測定すると共に、比色色素低減検定を使用することにより、細胞生育に対するカスケードポリマーの効果を評価した(Mosmann,T.R.、「細胞の生育および生存についての迅速な比色検定:増殖および細胞毒性検定への応用」、J.Immunol.Methods 65:55(1983))。第6世代の樹枝状体(直径68Å、SD68)の効果と、ポリリジン(pLys115)の効果とを比較した。ポリ陽イオンの末端アミンがヌクレオチド当たり10となる比率で、プラスミドDNAを用いるか、または用いることなく、ポリ陽イオンを細胞に添加した。96穴トレー中で300μ1のDME H-21中で、穴当たり約5×104細胞の密度で細胞をプレート処理した。5%CO2湿潤雰囲気中で37℃で一夜培養した後、0〜60μgのpLys115またはSD68を含有する200μ1の血清非含有培地を用いて三連で細胞をインキュベートした。5時間後に、10%FCSを含有する200μ1の新鮮なDME H-21を用いて培地を置き換え、更に48時間細胞を培養した。その後、穴当たり10μ1の3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT、5mg/ml)を添加し、37℃で2時間反応させた。可溶化溶液(イソプロパノール中の0.4N HCl、200μ1)を添加し、室温で30分間プレートをインキュベートした。自動ELISAプレート読取器(MR700,Dynatech Laboratories Inc.)を使用して570nmの吸光度を測定し、6Mグアニジニウム塩酸塩を用いて処理した細胞(100%死亡)で得られたバックグラウンドの吸光度について補正した。結果は、細胞生存の%低下={1−[OD570(処理細胞)−バックグラウンド]/[[OD570(未処理細胞)−バックグラウンド]}×100として表した。
実施例11:修飾カスケードポリマーの合成および性状解析
樹枝状体を使用してDNAのようなポリヌクレオチドに官能基を結合させ、遺伝子配送運搬体を造成した。以下の表1に示すように、標準的なSPDP結合化学手法を使用することにより(Carlsson,J.ら、「蛋白質のチオール化と可逆的な蛋白質−蛋白質接合。N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート、新規なヘテロ二機能性試薬」、Biochem.J.173:723(1978))、両親媒性ペプチドGALAのシステイン含有アナログであるGALAcys(配列番号:8)に第5世代のPAMAM樹枝状体を連結した。
ヘテロ二官能性試薬SPDPを用いて樹枝状体は首尾よく官能化され、過剰のGALAcys(配列番号:8)と反応させた。この結果得られた接合体は、較正したセファデックス(商標名)G75-120カラムから溶出させ、約50,000ダルトンの見かけの分子量を有していた。このことは、樹枝状体当たり約10のGALA残基が存在することを示唆する。ε=5570M-1cm-1(pH7.5)のトリプトファンのモル消光計数を使用し、樹枝状体あたり平均13のGALA残基が定量された。GALAは、ペプチド当たり8の負の電荷を含むため、接合体上の未修飾アミンの大半は、恐らくpH7.4で中和される。これは、GALA−樹枝状体接合体のDNAに対する結合が弱いことにより裏付けられる(下記参照)。
実施例12:DNAに対するカスケードポリマーの結合
ポリ陽イオン−pCMV−βGal複合体のサンプル(30μ1)を20分間インキュベートし、トリス−酢酸−EDTA緩衝液系(pH8.0)を使用し、0.8%アガロースゲルを介して電気泳動した。6μgのpCMV−βGalプラスミドを混合することにより複合体を形成した(170μ1HBS中の次の薬剤を用いて330μ1のHBS中で希釈)。
レーン1:pCMV−βGal単独
レーン2:2μgのpLys115
レーン3:4μgのpLys115
レーン4:4μgのSD68
レーン5:6μgのSD68
レーン6:GALA-SD54接合体を用いた4μgのSD54
レーン7:GALA-SD54接合体を用いた160μgのSD54
レーン8:SD54およびGALA-SD54の等モル混合物を用いた4μgのSD54
電気泳動が完了した後、エチジウムブロマイドを用いてゲルを染色し、DNAを明視化した。
図1に示すように、アガロース電気泳動ゲルに対して施した地点における複合体の遅延によって示されるように、PAMAM樹枝状体はDNAに結合する。ポリリジン(レーン2および3)およびカスケードポリマー(レーン4および5)の両者は、ゲル上でDNAを遅延させ固定化させることができた。ゲルにおける遅延は、静電効果および立体効果の結果であり、正に荷電した樹枝状体と陰イオン性DNAとの間の電荷複合体の形成を示唆する。樹枝状体の末端アミンは、リジンεNH2より低いpKaを有するため(考察参照)、図1に示すように、樹枝状体は、ポリリジンよりゲルにおける遅延を誘導する点では僅かに有効性が低い。ポリリジンの場合は、プラスミドの全体的な遅延は、1:1のεNH2対ヌクレオチド比率(レーン3)で観察されたのに対し、樹枝状体の場合は、全体的な遅延は、1.5:1の末端εNH2対ヌクレオチド比率で生じた(レーン5)。全体的な遅延の正確な比率は、実験の中の1つの希釈因子により変動した。GALA−樹枝状体接合体は、DNAを固定化せず、DNAに対して大過剰で使用した場合でも、プラスミドの移動に僅かに影響を与えたのみであった(レーン6および7)。GALA−樹枝状体接合体と未修飾の樹枝状体との組合せ(1:1比率、トランスフェクション検定で使用されるのと同様)は、プラスミドを部分的に遅延させた(レーン8)。
実施例13:トランスフェクションのための複合体の最適化
SD68と複合化した増加する量のpCLuc4(0.1〜6μg)を用いて、CV-1細胞(60mm皿当たり500,000細胞)を二連でトランスフェクションした。図3において、330μ1HBSに対して170μ1HBSに溶解した樹枝状体を添加することにより複合体を形成した。(□)、最初に6μgのpCLuc4上の25μgのSD68を添加することにより複合体を形成した後、記載した量のDNAにHBS中で希釈した。(○)、最初にHBS中でプラスミドを希釈し、25μgのSD68を添加した。(△)、希釈したpCLuc4プラスミドにルシフェラーゼを含有しないプラスミドを添加し、DNAの合計量を6μg/330μ1で一定に保持した後、25μgのSD68を添加した。以下の表2に記載するように、ルシフェラーゼの発現は、トランスフェクションの48時間後に測定した。各値は、二連の実験の平均±範囲である。
この検討により予期しないことに、PAMAMカスケードポリマーは、それ自体でDNA(例えば、レポーター遺伝子をコードするプラスミド)を培養細胞にトランスフェクションすることができることが見出された。結果を以下の表2、および図2〜4に示す。
トランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性(mgの細胞蛋白質当たりの光単位)は、二連の平均±範囲として示す。
トランスフェクションが毒性である場合は、未トランスフェクション細胞に対するトランスフェクション細胞中の細胞蛋白質の%回収を括弧内に示す。
トランスフェクション活性は、ヌクレオチドに対して過剰の末端アミンを使用した場合に特に高かった。樹枝状体による遺伝子配送および発現を調節するパラメーターを特定するために、pCLuc4−樹枝状体複合体を用いてCV-1細胞をトランスフェクションし、複合体における樹枝状体の直径および量の関数としてルシフェラーゼの発現を測定した(前記表2参照)。トランスフェクションは、両者の因子に対して感受性であった。高いルシフェラーゼの発現には、過剰のポリ陽イオンを必要とした。低い樹枝状体の投与では([樹枝状体第1アミン]≦[ヌクレオチド])、細胞は複合体によって僅かにトランスフェクションされるのみであった。
試験した濃度範囲では、大きな直径の樹枝状体(φ≧40mm)は、小さなものより良好なトランスフェクションの効率を示した。複合体形成樹枝状体の直径を40Å(世代4)から54Å(世代5)に増加させると、ルシフェラーゼの発現は、2〜3オーダーの大きさで増加した。このことは、三次元プロット(図2参照)のデータを検討することから最も良く理解することができる。最高レベルのトランスフェクション(≧1010LU/mg細胞蛋白質)は、ヌクレオチド当たり6の第1アミンの比率で、第6世代の樹枝状体(SD68、68Å直径)を用いた場合に得られた。このような条件の場合、CV-1細胞におけるルシフェラーゼの発現は、等量のポリリジン115(前記表2参照)を用いた場合に得られるものより約1000倍大きく、陽イオン性脂質DOTMAを用いて得られるものより100倍大きかった(Legendre,J.Y.とSzoka,F.C.、「pH感受性リポソームを使用する哺乳動物セルラインへのプラスミドDNAの配送:陽イオン性リポソームとの比較」、Pharm.Res.9:1235(1992))。
CV-1細胞における10の別々の実験により、最適化した条件を試験し、2×109〜3×1010LU/mg細胞蛋白質のルシフェラーゼ活性が得られた。10%FCSを含有する培地中でCV-1細胞を樹枝状体を用いてトランスフェクションした場合は、ルシフェラーゼの発現は約2倍だけ減少したのに対し、DOTMA(Legendreら、前記)の場合は、50倍だけ発現が減少した。
6:1の一定の末端アミン/ヌクレオチド比率におけるルシフェラーゼ活性対DNA投入の投与量応答を、68Å直径の樹枝状体(SD68)を使用して構成した(図3に示す)。最初に複合体を形成した後、記載した量のpCLuc4プラスミドに希釈した場合、ルシフェラーゼの発現の直線的な減少が観察された(図3参照)。ルシフェラーゼを含有しないプラスミドを使用してルシフェラーゼプラスミドを希釈し、樹枝状体を添加した場合は、トランスフェクション活性は直線的な様式で同様に減少した。プラスミドを最初に希釈し、一定量の樹枝状体を添加した場合について検討した。この場合は、pCLuc4プラスミドの希釈により樹枝状体/プラスミド比率が増加し、トランスフェクション活性は、極度に減少した(図3参照)。
実施例14:低い末端アミン/ヌクレオチド比率でのSD-68-DNA複合体を用いた哺乳動物細胞のトランスフェクション
付着性および浮遊細胞、並びに一次培養および確立されたラインを含むこの検討で試験したあらゆる細胞型は、ヌクレオチドに対して過剰な末端アミンの条件下で、PAMAM樹枝状体−プラスミド和用いてトランスフェクションすることができた(図4A)。pCMV−βGalプラスミドを使用し、最適化した複合体のトランスフェクション効率も検討した。β−ガラクトシダーゼ活性は、トランスフェクションの24時間後に組織学的染色により検出し、トランスフェクション細胞を計数した。これらのデータは、グラフのバーの末尾の%として示す(図4A参照)。検討した異なる細胞型は、トランスフェクションを受ける能力が異なっていた(CV-1細胞での80%までのトランスフェクション、EL-4およびJurkatでの1%未満のトランスフェクション)。この変動は、全ての遺伝子配送系が共有する一般的な性質であり、異なる細胞型の間でのこのような可変のトランスフェクションの理由は、未だ解明されていない。
樹枝状体の投入が低い場合は、樹枝状体−DNA複合体のトランスフェクション効率は、劇的に低下した(図4Aおよび4B参照)。低い末端アミン/ヌクレオチド比率を用いた場合の低減したトランスフェクション活性は、ポリリジンで認められた結果に類似する。よって、直鎖ポリ陽イオンにより媒介されるトランスフェクションを増加させ得る処理が樹枝状体媒介トランスフェクションを増加させ得る可能性を検討した。トランスフェクションは、クロロキンに対して主として感受性がなかったが(データは示さない)、融合性ペプチドGALAを樹枝状体に結合させた場合に有意に増加した(図4B参照)。
実施例15:カスケードポリマーに対する両親媒性ペプチドGALAcys(配列番号:8)の共有結合接触によるトランスフェクションの増強
不活性化したウイルス粒子およびウイルス融合性ペプチドのエンドソーム破壊効果は、ポリリジン媒介遺伝子移送を起動または増強するために活用されている(Wagner,E.ら、「アデノウイルスとトランスフェリン−ポリリジン/DNA複合体との結合により、レポーター媒介遺伝子配送およびトランスフェクション遺伝子の発現が大きく増強される」、PNAS(USA)89:6099(1992);Wagner,E.ら。「トランスフェリン−ポリリジン/DNA複合体によるインフルエンザウイルスヘムアグルチニンHA-2 N-末端融合性ペプチド増加遺伝子移送:合成ウイルス様遺伝子移送運搬体へ向けて」、PNAS(USA)89:7934(1992))。ウイルス融合性蛋白質の性質を模倣するために、pH感受性の様式で脂質二重層を脱安定化させるよう30アミノ酸のペプチドGALAが設計た(Subbarao,N.K.ら、前記)。ここではGALAを樹枝状体に連結し、ウイルス粒子またはウイルス融合性ペプチドのように、これがトランスフェクションを増加させるか否かを試験した。低い末端アミン:ヌクレオチド比率では、樹枝状体−DNA複合体のトランスフェクション効率は低かった。しかしながら、複合体中の樹枝状体の50%をそのGALA接合体で置き換えると、トランスフェクションは有意に向上した(図4B参照)。このような条件下で、接合体は、低い樹枝状体/プラスミド比率(これらの実験では約50:1)で機能することができる。K562のような幾つかの細胞型の場合、トランスフェクションのために過剰の樹枝状体を用いた場合に、GALA接合体は有効であった(図4Aおよび4B参照)。これらの結果は、恐らくエンドソームの漏れを触媒することにより、GALAがトランスフェクションを増強することを示す。トランスフェクションが最大となる樹枝状体の投入においては、GALAによって発現は更に増強されることはなかった。これは恐らく樹枝状体がリソゾーム型の効果を示すためと考えられる。
実施例16:PAMAMカスケードポリマーおよびpLys115細胞毒性の比較
トランスフェクション手順の毒性の1つの指標は、トランスフェクションの後に培養物から得られる細胞蛋白質の量である。未処理細胞と比較した場合に細胞蛋白質の収量の減少をもたらす処理を、前記表2の括弧に示す。一般に、樹枝状体−DNAにより誘導される細胞毒性は、次の3つの主要なパラメーターにより調節されるものと認められる。
1)樹枝状体の直径、
2)添加量、
3)DNAが存在するか否か。
最後の因子は、プラスミドDNAの存在下または非存在下で、樹枝状体SD-68の毒性をポリリジン115の場合とCV-1細胞上で比較することによって、より十分に理解することができる(図12参照)。pLys115と比較した場合、SD68の全体的な細胞毒性は低いものであった。DNAの非存在下では、CV-1細胞に対するpLys115のLD50は25μg/mlであったのに対し、SD68のLD50は300μg/mlを越えていた。プラスミドDNAの存在下では(10:1のポリ陽イオンの第1アミン:ヌクレオチドの比率)、pLys115の細胞毒性は影響を受けないのに対し、SD68の場合は増加するが(SD68−DNAのLD50=100μg/ml)、pLys115の場合よりはなお有意に低いものであった。
最適化したトランスフェクションの条件を利用する場合は、SD68の濃度は12.5μg/mlであり、これは色素低減の約35%の減少(図5参照)並びに細胞蛋白質の回収の減少(前記表2参照)を誘導する樹枝状体のレベルである。検定の終了の際に回収された細胞蛋白質によれば、SD68−DNA複合体によるトランスフェクションは、試験した異なる細胞型の全てによって妥当に十分に耐えられるものであった(蛋白質回収≧60%)。
実施例17:結果の考察
ポリリジンのようなポリ陽イオン性ポリマーは、動物細胞への遺伝子の移送のために広範に使用されている(Felgner,P.L.,Adv.Drug Delivery Rev.5:163(1990))。ポリリジンを基材とするベクターは、高い配送能力を有するが、標的細胞の効率的なトランスフェクションは、エンドソーム破壊剤またはリソゾーム型薬剤の存在下でのみ生起する(Cotten,M.ら、「ヒト白血病細胞へのDNAのトランスフェリン−ポリ陽イオン媒介導入:トランスフェクションされたDNAの残存に影響を与えるか、トランスフェリン受容体レベルを変調する薬剤による刺激」、PNAS(USA)87:4033(1990);Cotten,M.ら、「欠陥があるか化学的に不活性化したアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を使用する小および大(48Kb)遺伝子構成体の高い効率の受容体媒介配送」、PNAS(USA)89:6094(1992))。実施例1〜16のポリ陽イオン性ポリマーは、組み合わされたポリリジンの配送能力およびウイルスのトランスフェクション能力を示す。
ここで使用するPAMAMカスケードポリマーは、前記表2に示すように、メチルアクリレートおよびエチレンジアミンの連続的な付加から得られるアンモニアコアと-CH2CH2CONHCH2CH2N単位から誘導されるものである。この構造の制御された段階的な成長増殖により、寸法的に正確な表面を備え特定の数の表面基を備えた増加する高次世代のポリマーが生成される(Tomalia,D.A.ら、前記)。高次世代の樹枝状体の直径は、クロマチンのヒストンコアの直径に類似しており(約70Å)、DNAを凝縮する足場として作用すると考えられる(Richmond,T.J.ら、「7Å分解能でのヌクレオソームコア粒子の構造」、Nature 311:532(1984))。よって、PAMAM樹枝状体は、その十分に特徴付けられた形状および構造、その分岐状態、並びにその末端アミン(pKa=6.9)および内部アミン(pKa=3.9)の低いpKaの点で、ポリリジンとは異なる(Tomalia,D.A.ら、前記)。
ポリ陽イオンと会合させた場合のDNAの効率的な細胞内在化は、ポリ陽イオン−DNA複合体の過剰な正の電荷と負に荷電した細胞表面基とのジッパーのような会合によるものと考えられる。この相互作用の結果、例えば陽イオン性リポソーム−DNA複合体についてBehrにより提案されたような、吸着性のエンドサイトーシスおよび膜の脱安定化に至ると考えられる(Behr,J.P.、「合成遺伝子移送ベクター」、Acc.Chem.Res.26:274(1993))。実際、ゲルにおける遅延により検討されたポリリジンおよび樹枝状体のDNA結合能力は、幾分類似している(図1参照)。エンドサイトーシスの後の膜の脱安定化を増加させるために、膜脱安定化ペプチドGALAを樹枝状体に結合させた。
プラスミドの配送およびトランスフェクションについて試験した場合、未修飾のPAMAM樹枝状体は、優れた特性を示した。トランスフェクション効率は、DNA−樹枝状体複合体における樹枝状体の大きさおよび量に依存すると認められた。最も注目すべきことに、樹枝状体の直径を40Å(世代4)から54Å(世代5)に増加させた場合に、トランスフェクションの劇的な増加が観察された。この閾値効果の理由はなお不明確であるが、ポリマーの直径および構造に関連すると考えられる。世代3のPAMAM樹枝状体はヒトデに似ているが、世代5によって、これらは直径約54Åの球状の形態を有する(Tomalia,D.Aら、前記)。この球状の形状は、クロマチンで生起するような、DNAを良好に束縛する高度な構造を有するコアとして働くと考えられる(Richmond,T.J.ら、前記)。あるいは、球状の形態は、低次世代の樹枝状体または直鎖状ポリ陽イオンよりも、膜を脱安定化するのにより効率的であると考えられる。
PAMAMカスケードポリマーは、その第1および内部アミノ基のpKaの点でもポリリジンとは異なる(pKa 's=6.9,3.9)。この性質もトランスフェクションのために重要であると考えられる。生理的なpHでは、PAMAM樹枝状体は、部分的にプロトン化されているのみであり、弱塩基と類似するリソゾーム型の効果を示す筈である(Stenseth,K.とThyberg,J.、「モネンシンとクロロキンは、培養マウス腹腔マクロファージにおいてエンドサイトーシスされた高分子のリソゾームへの移送を阻害する」、Eur.J.Cell.Biol.49:326(1989))。加えて、樹枝状体の分岐構造を構成する内部第3アミノ基は、3.9のpKaを有し、リソゾーム型の効果にも寄与すると考えられる。よって、樹枝状体は、複合体の細胞取り込みの後に、エンドソームの酸性化を緩衝し得る筈である。PAMAM樹枝状体の推定されるリソゾーム型の性質は、過剰のポリリジンがトランスフェクションを増加させないのに対し、高いトランスフェクションのためには過剰の樹枝状体がなぜ必要であるかを説明し得るものである(前記表2参照)。ポリリジンの側鎖アミノ基(pKa=9〜10)は、中性のpHでは強く荷電しており、エンドソームの酸性化を緩衝化することはできない。このことは、樹枝状体−DNA複合体のトランスフェクション効率は、クロロキンによっては増強されないという観察によって支持される(データは示さない)。一方、ポリリジン−DNA複合体のトランスフェクションの効率は、通常はクロロキンの存在下で劇的に増強される(Cotten,M.ら、前記)。
ヌクレオチド当たりSD68の6末端アミンの比率でプラスミドDNAおよびSD68より構成される複合体は、最高のトランスフェクション活性を示した。このような最適の条件下で、pCLuc4プラスミド当たり約320のSD68が存在するが、全ての樹枝状体粒子がDNAとの複合体に関与し得るわけではない。前記示唆されたように、過剰の樹枝状体は、リソゾーム型薬剤として作用すると考えられる。この最適の比率を越えると系の効率は下がる。複合体に随伴する毒性のために、SD68の量が増加すると、トランスフェクションの効率は減少し得る。あるいは、複合化していない樹枝状体複合体の量の増加は、細胞表面上の推定される結合部位においてDNA−樹枝状体と競合すると考えられる。これにより細胞に会合したDNAのレベルが減少し、この様式でトランスフェクションの効率が減少し得る。
6:1の比率を維持しながら樹枝状体の直径が増加しても毒性は増加しないが、トランスフェクションの効率は減少した。光学顕微鏡下で観察すると、第6世代を越える樹枝状体から形成された樹枝状体−DNA複合体に露呈した細胞では、大きい細胞質内液胞が認められた。このような大きさの液胞は、第6世代以下の樹枝状体から形成された複合体を用いて処理した細胞では観察されなかった。液胞が、観察された低下したトランスフェクション率と関連するか否かは明らかではない。
MTT色素低減検定を使用することにより、毒性を更に検討した。SD68樹枝状体は、等量のpLys115と比較して、細胞によって極めて良好に許容された。pLys115とSD68との間の毒性の顕著な差は、粒子のイオン化状態の差によると考えられる。生理的なpHでは、ポリリジンは、樹枝状体より多くの正電荷を担持し、細胞膜とより強い相互作用を行う筈である。樹枝状体の毒性は、プラスミドDNAの存在下で僅かに増加したが、対応するポリリジン−DNA複合体の場合よりは低いままであった。
膜の脱安定化剤であるGALAペプチドは、樹枝状体に共有結合により結合させると、複合体のトランスフェクション活性を有意に増加させることができた(図4B参照)。GALAは水溶性の膜脱安定化剤であり、その膜とのpH依存性相互作用は十分に検討されている(Subbarao,N.K.ら、前記;Parente,R.A.ら、「pH感受性ペプチドの膜小胞との会合:アミノ酸配列の役割」、Biochem.29:8713(1990)およびその中の参考文献)。GALA構成を有するペプチドは、他の研究者によって、その腫瘍細胞の保持および内在化を増加させるために抗体と結合されている(Anderson,D.C.ら、「合成ペプチドを用いて誘導された抗体の試験管内における腫瘍細胞保持および内在化の増強」、Bioconjugate Chem.4:10(1993))。1:1の比率で未修飾の樹枝状体と混合した樹枝状体−GALA接合体がトランスフェクションを増強するという事実は、樹枝状体が、高い効率のトランスフェクション系の優れた構成成分であることを示す。
スターバースト(商標名)PAMAM樹枝状体を基材とするトランスフェクションの手順は、動物細胞への遺伝子の移送のための単純で効率的な方法を構成する。広範な種類の細胞について得られた優れた結果(図4参照)は、PAMAM樹枝状体が、それ自体で、動物の遺伝子の直接配送に良好に適合していることを示す。
実施例18:MPB-bAの合成
ビス−アクリジン−スペルミジンに結合したスルフヒドリル反応性マレイミドより構成される二官能性分子(N4[p-(マレイミドフェニル)ブチリル]N1,N8(ビス-9-アクリジニル)スペルミジン(MPB-bA)を合成した。スルフヒドリル含有ペプチドをチオエステル結合を介して挿入体に結合させ、アクリジンのビス挿入を介してdsDNAに会合したペプチド−挿入体を得た。この試薬を使用する核局在化ペプチド配列のDNAへの結合により、培養細胞におけるトランスフェクションが増強される。
MPB-bAの合成は、以下のスキーム3に示すように、スペルミジンの三官能化に基づくものである。
出発材料であるN1,N8-ビス(t-ブトキシカルボニル)スペルミジンは、スペルミジンの選択的なN4アシル化のために適切な基質である(Bergeron,R.J.ら、Synthesis 689-692(1989))。KitogawaとAikawaにより記載されたようにして、N-スクシニミジル4[p-(マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)を用いて、化合物1を連続的にN4アシル化し、脱プロトン化し、Nielsenらに記載されたようにして、N1,N8再生アミンを9-フェノキシカリジンと反応させ、反応性のマレイミドを担持するビス−アクリジン(MPB-bA)を形成した(Kitawa,T.とAikawa,T.,J.Biochem.79:233(1976);Nielsen,P.E.ら、Bioconjugate Chem.2:57(1991))。
ジエチルエーテル中でMPB-bAを沈殿させ、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィにより精製し、次のように溶出させた:
n-ブタノール/酢酸/水(5:4:1v/v)、
Rf=0.28、
LSIMS:m/z=741.8(M+H)。
前記スキーム3に示すように、スルフヒドリル含有ペプチドと挿入体を担持するマレイミドとを反応させると、安定なチオエステル結合が生成し、試薬スクシンイミジル3(2-ピリジルジチオ)プロピオネートにより、スルフヒドリル基は、ペプチドのN-末端に結合していると考えられる(Carlsson,J.ら、Biochem.173:723(1978))。あるいは、このペプチドは、適切な位置でシステイン残基を用いて合成することができる。合成は洗練されておらず、全体的な収率は約15%である。
実施例19:末端Cysを有する13アミノ酸ペプチドの合成
MPB−bAがDNAに対するペプチドの結合を媒介し得ることを示すために、N-末端システインを用いて2つの13残基ペプチドを合成した。第1のものは、cys-gly-tyr-gly-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val-gly-gly(配列番号:9)(WTcys)であり、SV40ラージT抗原核局在化配列を含む。第2のものは、cys-gly-tyr-gly-pro-lys-asp-lys-val-gly-gly(配列番号:10)(cTcys)であり、T抗原の核への移送を欠損するSV40(cT)-3変異体に存在する変異を模倣する対照ペプチドである。これらのペプチドは、Landfordらにより記載されたようにして合成した(Landford,R.E.ら、Cell.46:576(1986))。
実施例20:MPB-bAに対する13アミノ酸ペプチドの結合
前記スキーム3に示すように、実施例19のペプチドとMPB-bAとを反応させた。360μ1の0.2Mリン酸緩衝液および1mMEDTA、pH7.2に溶解した1mgのHPLC級に純粋なペプチドと、40μ1のメタノールに溶解した1mgのMPB-bAとを、アルゴン下に撹拌しながら45分間反応させた。Landfordら(1986)、前記により遊離のペプチドについて記載されたようにして、Biogel P2カラムによるゲルろ過の後にC-18逆相HPLCを用いて、WTcysMPB-bAおよびcTcysMPT-bAを精製し、凍結乾燥した。
LSIMS:WTcysMPB-bA
m/z=2118.9(M+H)
m/z=2140.7(M+Na)
cTcysMPB-bA
m/z=2106.2(M+H)
m/z=218.4(M+Na)
電荷の中和を可能とする比率での、結果的に得られたビス−アクリジニルペプチドとプラスミドDNAとの相互作用により、プラスミドの電気泳動移動度の全体的な阻害が導かれたのに対し、等量の接合していないペプチドでは、DNAを部分的に保持したのみであった(結果は示していない)。
ビス−アクリジニルペプチドのdsDNAへの挿入により、図6に示すように、ウシ胸腺DNAからエチジウムブロマイドの置換が導かれた。
エチジウムブロマイドの競合置換、エチジウムブロマイドについての6.7×10-6Mの固有の解離定数、およびWolfeとMeehanのアルゴリズム(Reinhardt,C.G.とKrugh,T.R.,Biochem.17:4845(1978);Wolfe,A.R.とMeehan,T.,Mol.Biol.223:1063(1992))から、種々のビス−アクリジンの結合定数を計算した。これらの結合定数を、スペルミジンビス−アクリジン単独の場合と比較した。その正の電荷の1つの喪失の結果、MPB-bAと同様にスペルミジンビス−アクリジンのN4基をアシル化すると、僅かではあるが有意な親和力の減少が観察された。システイン含有ペプチドおよびMPB-bAにより形成された接合体は、ビス挿入機構(bis-intercalation mechanism)と対比し得る親和力定数でDNAと結合することが見出された。MPB-bAに対する正に荷電したペプチドの結合は、図6に示すように、親和力を部分的に復帰させた。
10nMトリスHCl緩衝液、0.2MNaCl、pH7.4中で、エチジウムブロマイド(19μM)とウシ胸腺DNA(ヌクレオチド等量として5.7μM)とを混合し、増加する量のビス−アクリジン誘導体を添加した。エチジウムブロマイドの置換により放射される蛍光を次の条件下で測定した。
励起=540nm、発光=610nm
Fo:遊離のエチジウムブロマイドの蛍光(19μM)
Fmax:エチジウム−DNA複合体単独の蛍光(19μMエチジウム、5.7μMヌクレオチド)
F:ビス−アクリジン誘導体存在下でのエチジウム−DNA複合体の蛍光
i)アクリジンの固有の蛍光は450nmで生じ、この検定を妨害しない。
ii)ビス−アクリジン保存溶液の濃度は、スペルミジンビス−アクリジン標準品を使用して412nmでの吸光度から決定した。
実施例21:WTcysMPB-bAおよびcTcysMPB-bAのトランスフェクション効率
未修飾のプラスミド、またはWTcysMPB-bAもしくは変異体cTcysMPB-bAと混合したプラスミドのトランスフェクション効率を測定した。この機能的な検定は、次の観察に基づくものである。
i) SV40ラージT抗原核局在化配列に連結したBSAにより構成される合成核蛋白質と共に、カプセル封入した遺伝子を標的細胞に同時に配送すると、再構成されたウイルスエンベロープにより得られるトランスフェクション効率が増加する(Kaneda,Y.ら、Science 243:375(1989))。
ii)培養細胞の細胞質にマイクロインジェクションしたSV40ウイルス粒子は、核孔複合体を介して輸送される。ウイルス粒子の核移入は、ウイルス粒子の構造蛋白質に含まれる特異的な核輸送シグナルにより誘導される(Clever,J.ら、PNAS(USA)88:7333(1991))。
MPB-bAペプチドと複合化した、細菌ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド、pCLuc4プラスミドは、プラスミド単独を含むリポソームと比較した場合、カプセル封入効率および小胞の大きさに影響されることなく、pH感受性リポソーム内でカプセル封入され得る(Legendre,J.Y.とSzoka,F.C.,Pharm Res.9:1235(1992))。一連の実験では、WTcysMPB-bAは、cTcysMPB-bAと複合化したプラスミドに対して、トランスフェクション効率を約3倍有意に(P<0.025)増強させた。以下の表3にこれらのデータを示す。
遊離、または300ペプチド/プラスミドの比率で、WTcysMPB-bAまたはcTcysMPB-bAと複合化した4μgのリポソームカプセル封入pCLuc4を用いて、CV-1細胞に対して三連でトランスフェクションした。
WTcys-pCLuc4またはcTcys-pCLuc4複合体を含むリポソームを用いて得られた平均トランスフェクション活性を、pCLuc4を含むリポソームのもので割った。
4つの異なる実験から得られた比率を平均し(表中の増加倍率)、スチューデントtテスト[Ho無効;p≦0.025]を使用して比較した。
前記トランスフェクション実験で使用した種々のプラスミドのリポソーム直径またはカプセル封入効率には有意な差はなかった。
この増強は、合成蛋白質をDNAと組み合わせて、再構成したウイロソーム(virosome)を用いて配送した場合に観察されるものと類似している(Kaneda,Y.ら、前記)。
実施例22:結果と考察
結論として、スルフヒドリル反応性ビス−アクリジンは、スルフヒドリル含有分子のdsDNAに対する非共有結合による結合のための優れた試薬を提供する。種々の生物ウイルスの特質を模倣する異なるエフェクターペプチドの組合せを用いることにより、新規な優れた合成遺伝子配送複合体が、予期しないことに造成された。
実施例23:樹枝状体による培養細胞へのオリゴヌクレオチドの配送
330μ1のHepes緩衝塩類溶液(HBS:10mM Hepes,150mM NaCl pH7.4)中の1.2μgのフルオレセイン標識化オリゴヌクレオチドをポリスチレンチューブに入れ、100μgの第6世代ポリアミドアミン樹枝状体(SD68)を含有する170μ1のHBSを、極めて僅かに混合しながら滴下添加した。室温で30分後に1.5mlの血清を含有しないDME H21培地を添加し、混合物を培養細胞に施した。典型的には、24時間前にプレート処理した80%コンフレントCV-1細胞を含む22mmのカバーグラスに、それぞれ100μgの複合体を添加した。2〜4時間後、DME H21-10%FCSを用いてカバーグラスを洗浄し、凹スライド上に固定せずに埋設した。スライドは、カバーグラスの下部に200μ1の培地を収容することができ、温めたパラフィンで縁部を封止した。
分析のために、レーザー走査共焦点顕微鏡によりカバーグラスを明視化した。クリプトンアルゴンレーザー(励起:488nm)およびニコン倒立顕微鏡を用いたBioRad MRC-600共焦点装置を使用した。試験のために利用した分析のための典型的な設定は次の通りとした。
高レーザー設定
中性密度=1
ゲイン=7
開口=10
オートブラックオン
Kalman平均=3
対物=63×
明白な核の蛍光の存在、および核と細胞質との間の目視可能な境界の存在に基づいて、細胞を陽性として評価した。観察された蛍光核の画分は、観察された蛍光核の数を計数し、無作為の健全な視野中での細胞の合計数で割ることにより計算した。
実施例24:オリゴヌクレオチドの核蓄積のための樹枝状体対オリゴヌクレオチドの比率
オリゴヌクレオチドの核蓄積を投与量依存性の様式で媒介する実施例23で利用したSD68樹枝状体ポリ陽イオンの効果を図7に示す。固定した量のオリゴヌクレオチド(1.2μg/調製物)を用いて、前記したように、変動する量の樹枝状体ポリ陽イオン(3〜200μg/調製物)を調製した。標準的な手順に従ってこれらをCV-1細胞に添加し、核蛍光について検定した。樹枝状体陽イオン対オリゴヌクレオチドの所定の閾値比率が、核蓄積のために必要であることが観察された。これを越えて、核染色は、約25%まで観察された。以下の表4は、それぞれの試験についての電荷およびオリゴヌクレオチド対樹枝状体比率、並びに結果的に得られた蛍光の核蓄積(ヌクレオチド)を示す。
実施例25:オリゴヌクレオチドの樹枝状体媒介核蓄積の時間依存性
SD68樹枝状体ポリ陽イオンがオリゴヌクレオチドの核蓄積を促進する時間依存性を図8に示す。樹枝状体ポリ陽イオン−オリゴヌクレオチドの標準的な調製物をCV-1細胞に添加し、これを洗浄し、埋設し、5、30、60、90、120および180分で明視化した。前記したように、核蛍光の存在または不存在に基づいて、細胞を陽性または陰性として評価した。接触の時点から早くも30分後に核蓄積が認められ、3時間でほぼ80%に達した。
実施例26:核蓄積を媒介する能力に対する樹枝状体の大きさの効果
大きさに対応する樹枝状体の世代は、オリゴヌクレオチドの核蓄積を促進するその能力に影響を与える。変動する大きさの樹枝状体(SD22、SD68、SD124)を用いて、樹枝状体−オリゴヌクレオチドの標準的な調製物を調製した。それぞれをCV-1細胞に対して4時間施し、通常と同様にして核蓄積を検定した。この実験は、DME H21または低減したイオン強度の最適化した培地中で行った。SD68は、80%近い核蓄積を媒介することができた。これに対して、SD22およびSD124は、低減したイオン条件下では、核蓄積の媒介体としては幾分効率が低かった。この試験の結果を図9に示す。
実施例27:低減したイオン強度によるオリゴヌクレオチドの核蓄積の増加
前記したように、樹枝状体ポリ陽イオン−オリゴヌクレオチド複合体を調製した。DME H21、またはグルコース、ラクトース、マンニトール、ソルビトールおよびショ糖を含む糖類の等浸透圧で非イオン性の溶液を用いて30%希釈したDME H21を用いてこれらを希釈した。複合体をCV-1細胞に対して2時間施し、前記したようにして分析した。使用した炭水化物の種類に拘わらず、低減したイオン強度により、樹枝状体媒介核蓄積が増加した。試験の条件および結果を図10に示す。
実施例28:ビス−アクリジンを介するターゲティングリガンドおよび膜脱安定化剤のDNAへの結合および樹枝状体との組合せ
実施例21に記載したように、ペプチドGALAcysをビス−アクリジンマレイミドに結合させ、DNA会合膜脱安定化剤を調製した。対照として、実施例21に記載したように、アミノ酸システインをビス−アクリジンマレイミドに結合させた。ルシフェラーゼ遺伝子を含む6μgのプラスミドを、ポリスチレンチューブ中で330μ1のHBSへと希釈した。GALAcysMPB−ビス−アクリジン(1nmol)またはcysMPB−ビス−アクリジンおよび/または第6世代のSD68PAMAM樹枝状体(4μg)を170μ1のHBS中で希釈し、DNAに滴下添加した。チューブを穏やかに混合し、20分後に、新たに単離した肝細胞上でのトランスフェクションについて、得られた複合体を試験した。
同様の様式で、(ガラクトース-6)3Lys2ビス−アクリジン(Haensler,J.とSzoka,F.,Bioconjugate Chemistry 4:85(1993))をDNA、およびSD68樹枝状体を用いて形成した複合体に結合させた。
更に、GALAcysMPB−ビス−アクリジンおよび(ガラクトース-6)3Lys2ビス−アクリジンの両者をそれぞれ0.5nmolで混合し、樹枝状体と共にDNAに添加した。その後、3つの成分を含む組成物を、前記したように肝細胞に添加した。結果を図11に示す。それぞれのトランスフェクションにおける成分の量は、ルシフェラーゼ活性の下に示す。膜脱安定化剤GALAcysMPB−ビス−アクリジン、またはターゲティングリガンド(ガラクトース-6)3Lys2ビス−アクリジンを樹枝状体に添加することにより、少なくとも2オーダーの大きさだけトランスフェクションが増加する。2つのエフェクターを共に(ただし低減した量で)樹枝状体に添加しても、トランスフェクションを増加させることができた。しかしながら、樹枝状体に対する対照cysMPB−bAの添加は、トランスフェクションを増加させなかった。
実施例29:トランスフェクションを増加させるためのターゲティングリガンドと膜脱安定化剤との樹枝状体への直接結合および種々の割合での混合
実施例4に記載したようにして、直径40ÅのSPDP修飾樹枝状体(SD40)にチオガラクトースを結合させ、未修飾のSD40樹枝状体およびGALAcys樹枝状体と混合した。樹枝状体の混合物を使用し、ルシフェラーゼプラスミドを用いて肝細胞に対してトランスフェクションした。結果を図12に示す。樹枝状体/gal-樹枝状体/GALA−樹枝状態の比率が重量基準で24/141/42の場合に、最高レベルのトランスフェクションが観察された。
ここでこの発明を十分に説明したが、ここに記載した発明の精神または範囲から逸脱することなく、これに対して多くの変更および改変を行い得ることは、当業者に明らかであろう。
配列表
(1)一般情報:
(i) 出願人:スゾカ・フランシス・シー
ヘンスラー・ジーン
(ii) 発明の名称:樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系
(iii)配列の数:10
(iv) 連絡先:
(A)宛名:ロビンス、バーリナー&カーソン
(B)番地:201ノース・フィグエロア・ストリート
(C)市:ロサンジェルス
(D)州:カリホルニア
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:90012
(v) コンピューター読取り可能形式:
(A)媒体の型:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換
(C)操作システム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウエア:WordPerfect 5.1/ASCII
(vi) 現行出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:1994年7月14日
(C)分類:
(viii)弁理士/代理人情報:
(A)名前:バーリナー、ロバート
(B)登録番号:20,121
(C)整理/書類番号:5555-242
(ix) 遠隔通信情報:
(A)電話:(213)977-1001
(B)テレファックス:(213)977-1003
(C)テレックス:
(2)配列番号:1の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:7アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi)配列の記載:配列番号:1:
(2)配列番号:2の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:4アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ix) 特徴:
(A)名前/記号/修飾部位
(B)位置:1
(C)他の情報:/注=「この位置はN-ホルミル-」
(xi) 配列の記載:配列番号:2:
(2)配列番号:3の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:8アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi) 配列の記載:配列番号:3:
(2)配列番号:4の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi) 配列の記載:配列番号:4:
(2)配列番号:5の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:5アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi) 配列の記載:配列番号:5:
(2)配列番号:6の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:5アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi) 配列の記載:配列番号:6:
(2)配列番号:7の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:16アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi) 配列の記載:配列番号:7:
(2)配列番号:8の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:30アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi) 配列の記載:配列番号:8:
(2)配列番号:9の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:13アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi) 配列の記載:配列番号:9:
(2)配列番号:10の情報:
(i) 配列の性質:
(A)長さ:13アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(xi) 配列の記載:配列番号:10:
Claims (63)
- 真核細胞の亜細胞成分に対してポリヌクレオチドを与えるための組成物であって、
ポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドに機能的に結合した第6から第8世代のポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンと、
を含むことを特徴とする組成物。 - ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンがN-スクシニミジル3-(2-ピリジル)ジチオプロピオネート(SPDP)で官能化されたポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンである、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、薬学的に受容し得るキャリヤーを更に含む組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンが、ヒドロキシル、エーテル、アミノ、イミノ、アミド、イミド、アンモニウム、ハライド、カルボキシル、カルボキシハライド、およびスルフヒドリル、並びにこれらの組合せよりなる群から選択される少なくとも2つの反応性残基を含むコア分子を含む組成物。
- 請求項4記載の組成物において、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンが、α,β−エチレン系不飽和カルボン酸のアルキルエステルまたはα,β−エチレン系不飽和アミドと、アルキレンポリアミンまたはポリアルキレンポリアミンとの反応から誘導されるポリアミドアミンよりなる群から選択される薬学的に受容し得るポリマーを更に含み、該ポリマーがコア分子に機能的に結合している組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンが、SまたはOにより置換され得るアゾールおよび第1、第2、第3および第4級の脂肪族および芳香族アミン、グアニジウム並びにこれらの組合せよりなる群から選択される末端陽イオン基を含み、その末端陽イオン基が前記ポリマーに機能的に結合している組成物。
- 請求項6記載の組成物において、前記末端陽イオン基が、ポリマーの全ての末端基の約10〜100%を構成する組成物。
- 請求項7記載の組成物において、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンが末端に、ヒドロキシル、シアノ、カルボキシル、スルフヒドリル、アミド、チオエーテル、並びにこれらの組合せよりなる群から選択される基の0乃至90%を更に含む、組成物。
- 請求項7記載の組成物において、
前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンが末端に、ヒドロキシル、シアノ、カルボキシル、スルフヒドリル、マレイミド、およびジチオピリジル、並びにこれらの組合せよりなる群から選択される基の0乃至90%を更に含む、組成物。 - 請求項1又は2に記載の組成物において、
前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンが、非共有結合によりポリヌクレオチドと会合する組成物。 - 請求項1又は2に記載の組成物において、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンが、約2,000〜1,000,000の平均MWを有する組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンが、約11〜60Åの流体力学的半径を有する組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基対ポリヌクレオチドの割合が、約1:4〜25:1である組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、
真核細胞の細胞質膜またはエンドソーム膜を横切ってポリヌクレオチドを輸送し得る両親媒性ペプチドを更に含み、該両親媒性ペプチドが、ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合している組成物。 - 請求項14記載の組成物において、前記両親媒性ペプチド対前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基の割合が、約1:100〜1:4である組成物。
- 請求項14記載の組成物において、前記両親媒性ペプチドがGALAを含む組成物。
- 請求項14記載の組成物において、前記ペプチドが環状ペプチドを含む組成物。
- 請求項17記載の組成物において、前記環状ペプチドが、グラミシジンSおよびチロシジンよりなる群から選択される組成物。
- 請求項18記載の組成物において、前記環状ペプチドがグラミシジンSを含む組成物。
- 請求項14記載の組成物において、リン脂質を更に含む組成物。
- 請求項20記載の組成物において、前記リン脂質がホスファチジルエタノールアミンを含む組成物。
- 請求項21記載の組成物において、前記ホスファチジルエタノールアミンが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含む組成物。
- 請求項20記載の組成物において、前記リン脂質がリポソームの形態で存在する組成物。
- 請求項14記載の組成物において、ポリ陽イオンを更に含む組成物。
- 請求項24記載の組成物において、前記ポリ陽イオンがポリアミンを含む組成物。
- 請求項25記載の組成物において、前記ポリアミンが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、3,3'-ジアミノ−ビスプロピルアミン、イミノビス(N,N)-ジメチルプロピルアミン、イミノビス(3-アミノプロピル)-1,3-プロパンジアミン、および陽イオン性樹枝状体よりなる群から選択される組成物。
- GALAに結合したビスアクリジンをさらに含む、請求項16記載の組成物。
- ポリアミドアミン樹枝状体陽イオンの末端陽イオン基対ポリヌクレオチドの割合が1:1から1:10の範囲にある、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記両親媒性ペプチドが挿入剤に共有結合している、請求項14の組成物。
- 請求項30記載の組成物において、Ar1およびAr2がアクリジンを含む組成物。
- 請求項31記載の組成物において、Xがマレイミドフェニルまたはジチオピリジルである組成物。
- さらに挿入剤を含む請求項1又は2に記載の組成物において、前記挿入剤が、真核細胞表面に局在する受容体を標的とする少なくとも1つのリガンドに結合し、該ターゲティングリガンドが前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した組成物。
- 請求項35記載の組成物において、Ar1およびAr2がアクリジンを含む組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、
真核細胞表面上に局在した受容体を標的とするリガンドを更に含み、前記ターゲティングリガンドが前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した組成物。 - 請求項38記載の組成物において、前記細胞ターゲティングリガンド対前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基の割合が、約1:100〜1:10である組成物。
- 請求項38記載の組成物において、前記細胞ターゲティングリガンドが、ビタミン、ガラクトース、マンノース、マンノシル5−リン酸、フコース、シアル酸基、N-アセチルグルコサミン、化学誘因性ペプチドN-ホルミル-met-leu-phe(配列番号:2)、arg-asp-グリシン配列を含むペプチド、cys-ser-gly-arg-glu-asp-val-trp(配列番号:3)ペプチド、シスチン残基を含むペプチド、細胞表面蛋白質と相互作用するペプチド、CD-4と相互作用するペプチド、抗体または抗体断片、ホルモン、細胞表面受容体を介して作用するサイトカインよりなる群から選択される組成物。
- 請求項40記載の組成物において、前記細胞ターゲティングリガンドが、抗体またはその断片を含む組成物。
- 前記リガンドがガラクトースである、請求項38に記載の組成物。
- ビスアクリジンがガラクトースに結合している、請求項42に記載の組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、固体、液体またはエーロゾルの形態である組成物。
- ポリヌクレオチドをヒト以外の真核細胞に導入する方法において、該細胞と請求項1又は2に記載の組成物とを接触させることを含むことを特徴とするポリヌクレオチドの導入方法。
- 請求項45記載の方法において、
前記細胞がヒト以外の生きた動物中に存在し、
前記ヒト以外の動物の細胞に到達して侵入するのに有効な量で前記組成物を該動物に投与する方法。 - 請求項45記載の方法において、前記組成物を、約0.5μg〜20mgのポリヌクレオチドを含む量で投与する方法。
- 請求項45記載の方法において、前記真核細胞が植物細胞を含む方法。
- 請求項45記載の方法において、前記真核細胞がヒト以外の哺乳動物を含む方法。
- 請求項46記載の方法において、前記組成物を、経口、皮膚経由、全身および吸入経路よりなる群から選択される経路により投与する方法。
- 請求項50記載の方法において、前記組成物を、皮膚表面に対する高速衝撃投与により皮膚経由で投与する方法。
- 請求項1又は2に記載の組成物において、
前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した、GALA、GALAcys、およびGALAcysMPB−ビス−アクリジンからなる群から選択される化合物を更に含む、組成物。 - 請求項1又は2に記載の組成物において、
前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した、(ガラクトース−6)3Lys2ビスーアクリジンおよびチオガラクトースからなる群から選択される化合物を更に含む、組成物。 - 請求項1又は2に記載の組成物において、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基対ポリヌクレオチドの割合が、6:1〜25:1である組成物。
- 真核細胞の亜細胞成分に対してポリヌクレオチドを与えるための組成物であって、
ポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドに機能的に結合した第5から第8世代のポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンと、
を含み、前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンの末端陽イオン基対ポリヌクレオチドの割合が、6:1〜25:1である、組成物。 - ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンがN-スクシニミジル3-(2-ピリジル)ジチオプロピオネート(SPDP)で官能化されたポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンである、請求項55に記載の組成物。
- 請求項55又は56に記載の組成物において、
真核細胞の細胞質膜またはエンドソーム膜を横切ってポリヌクレオチドを輸送し得る両親媒性ペプチドを更に含み、該両親媒性ペプチドが、ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合している組成物。 - さらに挿入剤を含む請求項55又は56に記載の組成物において、前記挿入剤が、真核細胞表面に局在する受容体を標的とする少なくとも1つのリガンドに結合し、該ターゲティングリガンドが前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した組成物。
- 請求項55又は56に記載の組成物において、
真核細胞表面上に局在した受容体を標的とするリガンドを更に含み、前記ターゲティングリガンドが前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した組成物。 - 請求項55又は56に記載の組成物において、
前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した、GALA、GALAcys、およびGALAcysMPB−ビス−アクリジンからなる群から選択される化合物を更に含む、組成物。 - 請求項55又は56に記載の組成物において、
前記ポリアミドアミン樹枝状体ポリ陽イオンに機能的に結合した、(ガラクトース−6)3Lys2ビスーアクリジンおよびチオガラクトースからなる群から選択される化合物を更に含む、組成物。 - ポリヌクレオチドをヒト以外の真核細胞に導入する方法において、該細胞と請求項55又は56に記載の組成物とを接触させることを含むことを特徴とするポリヌクレオチドの導入方法。
- 請求項62記載の方法において、
前記細胞がヒト以外の生きた動物中に存在し、
前記ヒト以外の動物の細胞に到達して侵入するのに有効な量で前記組成物を該動物に投与する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9220093A | 1993-07-14 | 1993-07-14 | |
US08/092,200 | 1993-07-14 | ||
PCT/US1994/007916 WO1995002397A1 (en) | 1993-07-14 | 1994-07-14 | Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09500136A JPH09500136A (ja) | 1997-01-07 |
JP3785187B2 true JP3785187B2 (ja) | 2006-06-14 |
Family
ID=22232131
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50471995A Expired - Lifetime JP3785187B2 (ja) | 1993-07-14 | 1994-07-14 | 樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0708637B1 (ja) |
JP (1) | JP3785187B2 (ja) |
AT (1) | ATE258434T1 (ja) |
AU (1) | AU681735C (ja) |
CA (1) | CA2163364C (ja) |
DE (1) | DE69433519T2 (ja) |
ES (1) | ES2211882T3 (ja) |
WO (1) | WO1995002397A1 (ja) |
Families Citing this family (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08510761A (ja) * | 1994-03-07 | 1996-11-12 | ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー | 生物活性及び/又はターゲテッドデンドリマー複合体 |
AUPM623994A0 (en) | 1994-06-15 | 1994-07-07 | Biomolecular Research Institute Limited | Antiviral dendrimers |
AU4344696A (en) * | 1994-12-21 | 1996-07-10 | Novartis Ag | Oligonucleotide-dendrimer conjugates |
US5795587A (en) | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
AU5979296A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Life Technologies, Inc. | Peptide-enhanced cationic lipid transfections |
US6051429A (en) * | 1995-06-07 | 2000-04-18 | Life Technologies, Inc. | Peptide-enhanced cationic lipid transfections |
DE69725878T2 (de) | 1996-08-13 | 2004-07-29 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Zusammensetzungen zur polynukleotidabgabe |
FR2754828B1 (fr) * | 1996-10-23 | 1998-12-24 | Univ Toulouse | Structure membranaire artificielle, procede et polymere pour sa preparation, procede de preparation de ce polymere, particule et film comprenant cette structure |
GB9623051D0 (en) * | 1996-11-06 | 1997-01-08 | Schacht Etienne H | Delivery of DNA to target cells in biological systems |
FR2761691B1 (fr) | 1997-04-03 | 1999-05-14 | Oreal | Polymeres a fonction terminale thiol |
US5948878A (en) * | 1997-04-15 | 1999-09-07 | Burgess; Stephen W. | Cationic polymers for nucleic acid transfection and bioactive agent delivery |
DE69841937D1 (de) * | 1997-04-21 | 2010-11-25 | California Inst Of Techn | Multifunctionelle polymer-beschichtung |
US6197332B1 (en) | 1997-08-13 | 2001-03-06 | Chiron Corporation | Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof |
WO1999042091A2 (en) * | 1998-02-19 | 1999-08-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Use of polycations as endosomolytic agents |
WO2000011181A1 (en) | 1998-08-20 | 2000-03-02 | Connaught Laboratories Limited | NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING INCLUSION MEMBRANE PROTEIN C OF $i(CHLAMYDIA) |
US6693087B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-17 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding POMP91A protein of Chlamydia |
US6686339B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-03 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia |
FR2785293B1 (fr) | 1998-10-30 | 2002-07-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Acides nucleiques et polypeptides specifiques des souches pathogenes du genre neisseria |
US7166745B1 (en) | 1998-11-12 | 2007-01-23 | Invitrogen Corporation | Transfection reagents |
US6770740B1 (en) | 1999-07-13 | 2004-08-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods |
WO2001004135A2 (en) * | 1999-07-13 | 2001-01-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Crosslinked dna condensate compositions and gene delivery methods |
AU1013601A (en) | 1999-10-22 | 2001-05-08 | Aventis Pasteur Limited | Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens |
FR2801592B1 (fr) * | 1999-11-25 | 2002-02-22 | Centre Nat Rech Scient | Dendrimeres phosphores et leurs applications comme agents de transfection |
DE19960924C2 (de) * | 1999-12-17 | 2002-08-01 | Therapeutics Gmbh G.O.T. | Amphiphile Polyamine, deren Anwendungen |
AU5697001A (en) | 2000-03-31 | 2001-10-15 | Purdue Research Foundation | Method of treatment using ligand-immunogen conjugates |
DE10016881B4 (de) * | 2000-04-05 | 2006-06-01 | Qiagen Gmbh | Gezielte Transfektion von Zellen mittels biotinyliertem Dendrimer |
EP1792995A3 (en) | 2000-05-08 | 2007-06-13 | Sanofi Pasteur Limited | Chlamydia secretory locus orf and uses thereof |
DK1282702T3 (da) | 2000-05-10 | 2007-04-02 | Sanofi Pasteur Ltd | Immunogene polypeptider, som er kodet af KAGE-minigener, og anvendelser deraf |
US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
FR2820434A1 (fr) * | 2001-02-05 | 2002-08-09 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation d'oligonucleotides pour ameliorer la transfection des plasmides dans les cellules, procede et kit de transfection |
EP1356820A1 (en) | 2002-04-26 | 2003-10-29 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | DNA vaccine combined with an inducer of tumor cell apoptosis |
ATE465255T1 (de) * | 2002-11-26 | 2010-05-15 | Univ Massachusetts | Verabreichung von sirnas |
AU2004211522B2 (en) * | 2003-02-13 | 2010-01-28 | National Center For Scientific Research ''demokritos'' | Multifunctional dendrimers and hyperbranched polymers as drug and gene delivery systems |
WO2005054438A2 (en) | 2003-12-01 | 2005-06-16 | Invitrogen Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
JP5541861B2 (ja) | 2005-04-29 | 2014-07-09 | エージェンシー フォー サイエンス, テクノロジー アンド リサーチ | 超分岐ポリマーおよびそれらの適用 |
DE102008023913A1 (de) | 2008-05-16 | 2009-11-19 | Biontex Laboratories Gmbh | Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems |
EP2363494A1 (de) | 2007-11-22 | 2011-09-07 | Biontex Laboratories Gmbh | Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems |
DE102007056488A1 (de) | 2007-11-22 | 2009-07-23 | Biontex Laboratories Gmbh | Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems |
DE102008016275A1 (de) | 2008-03-28 | 2009-11-19 | Biontex Laboratories Gmbh | Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems |
EP2411519B1 (en) | 2009-03-27 | 2015-07-22 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Kanamycin antisense nucleic acid for the treatment of cancer |
WO2011115555A1 (en) * | 2010-03-16 | 2011-09-22 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | System for improved delivery of gene modulating compounds |
WO2012154879A2 (en) | 2011-05-09 | 2012-11-15 | Van Andel Research Institute | Autophagy inhibitors |
CN106572974B (zh) | 2014-07-15 | 2021-04-23 | 生命技术公司 | 用于将分子有效递送到细胞的具有脂质聚集体的组合物和方法 |
JP2020500020A (ja) | 2016-11-14 | 2020-01-09 | ノバルティス アーゲー | 融合誘導性タンパク質minionに関連する組成物、方法、および治療上の使用 |
IT201900007060A1 (it) | 2019-05-21 | 2020-11-21 | St Superiore Di Sanita | Cellule tumorali ingegnerizzate e loro usi |
IT201900012540A1 (it) | 2019-07-22 | 2021-01-22 | Humanitas Mirasole Spa | Inibitori di CHI3L1 e loro usi |
RU2771605C2 (ru) * | 2020-10-26 | 2022-05-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Пептиды для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот |
CN112807444B (zh) * | 2021-01-18 | 2023-12-12 | 北京大学深圳研究生院 | 一种纳米抗体药物偶联物 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2221920T3 (es) * | 1992-04-03 | 2005-01-16 | The Regents Of The University Of California | Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico. |
US5574142A (en) * | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
-
1994
- 1994-07-14 DE DE69433519T patent/DE69433519T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-14 AU AU12400/95A patent/AU681735C/en not_active Expired
- 1994-07-14 EP EP94922555A patent/EP0708637B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-14 AT AT94922555T patent/ATE258434T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-07-14 ES ES94922555T patent/ES2211882T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-14 WO PCT/US1994/007916 patent/WO1995002397A1/en active IP Right Grant
- 1994-07-14 CA CA002163364A patent/CA2163364C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-14 JP JP50471995A patent/JP3785187B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU681735B2 (en) | 1997-09-04 |
ES2211882T3 (es) | 2004-07-16 |
CA2163364C (en) | 2009-10-27 |
AU681735C (en) | 2002-02-21 |
WO1995002397A1 (en) | 1995-01-26 |
EP0708637B1 (en) | 2004-01-28 |
ATE258434T1 (de) | 2004-02-15 |
JPH09500136A (ja) | 1997-01-07 |
AU1240095A (en) | 1995-02-13 |
DE69433519T2 (de) | 2004-11-11 |
DE69433519D1 (de) | 2004-03-04 |
EP0708637A1 (en) | 1996-05-01 |
EP0708637A4 (en) | 1998-08-12 |
CA2163364A1 (en) | 1995-01-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3785187B2 (ja) | 樹枝状体ポリ陽イオンを含む自己集合性ポリヌクレオチド配送系 | |
US5990089A (en) | Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations | |
US5908777A (en) | Lipidic vector for nucleic acid delivery | |
Pichon et al. | Histidine-rich peptides and polymers for nucleic acids delivery | |
JP3950472B2 (ja) | 自己構築ポリヌクレオチド送達システム | |
Erbacher et al. | Transfection and physical properties of various saccharide, poly (ethylene glycol), and antibody‐derivatized polyethylenimines (PEI) | |
Haensler et al. | Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture | |
Leamon et al. | Folate copolymer-mediated transfection of cultured cells | |
JP2007521247A (ja) | 生体適合性−遺伝子送達剤としての新規カチオン性リポポリマー | |
US20080171025A1 (en) | Highly Branched Hk Peptides as Effective Carriers of Sirna | |
US20030180950A1 (en) | Reversible masking of liposomal complexes for targeted delivery | |
US11911485B2 (en) | Ionizable lipid compounds, lipid nanoparticles comprising same and therapeutic uses thereof | |
Prevette et al. | Polycation-induced cell membrane permeability does not enhance cellular uptake or expression efficiency of delivered DNA | |
US20010048940A1 (en) | Cationic amphiphile micellar complexes | |
KR100723852B1 (ko) | 핵산 및 약물 전달용 중성-양이온성 지질 | |
EP1115428B1 (en) | Cationic dendrimeric compounds and their use as oligonucleotide/polynucleotide carriers | |
CA2358497A1 (en) | Ligand-peg post-coating stabilized lipoplex and polyplex for targeted gene delivery | |
KR20000070914A (ko) | 안정화된 양이온 형질감염제(들)/핵산 입자의 제형 | |
AU4698499A (en) | Cationic amphiphile micellar complexes | |
US20230121879A1 (en) | Methods for preparing nanoparticle compositions containing histidine-lysine copolymers | |
US20230233476A1 (en) | Nanoparticle pharmaceutical compositions with reduced nanoparticle size and improved polydispersity index | |
Kumar | Advances in Gene Delivery Systems | |
Sorgi | Pharmaceutical considerations for cationic liposome-mediated gene delivery systems |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050726 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051024 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060228 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060317 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100324 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100324 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110324 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120324 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130324 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130324 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140324 Year of fee payment: 8 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |