ES2211882T3 - Sistema de cesion de polinucleotido, automontable que comprende policationes de dendrimeros. - Google Patents
Sistema de cesion de polinucleotido, automontable que comprende policationes de dendrimeros.Info
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Abstract
UN SISTEMA DE SUMINISTRO DE POLINUCLEOTIDOS DE AUTOACOPLAMIENTO QUE CONTIENE UN POLICATION DE UN DENDRIMERO QUE AYUDA AL SUMINISTRO DEL POLINUCLEOTIDO A UNA DIRECCION DESEADA, Y OPCIONALMENTE OTROS AGENTES TALES COMO AGENTES DE ENMASCARAMIENTO DEL ADN, AGENTES DE RECONOCIMIENTO DE CELULAS, AGENTES DE NEUTRALIZACION DE CARGAS, AGENTES DE PERMEABILIZACION DE MEMBRANAS, Y AGENTES DE LOCALIZACION SUBCELULAR.
Description
Sistema de cesión de polinucleótido, automontable
que comprende policationes de dendrímeros.
Esta invención se refiere al campo de sistemas de
cesión de oligonucleótidos y terapia génica. En particular, esta
invención se dirige a un sistema de cesión de polinucleótido
automontable que comprende un polinucleótido y un policatión de
dendrímero, y opcionalmente otros agentes, que facilita la cesión
del polinucleótido a unas posición subcelular deseada. El
polinucleótido y los otros agentes están asociados en general con
el polinucleótido mediante interacciones no covalentes. Los agentes
adecuados para su uso aquí incluyen componentes de enmascaramiento
de ADN, agentes de reconocimiento de células, agentes
neutralizantes de carga, agentes de permeabilización de membrana y
agentes de localización subcelular, entre otros.
El gobierno tiene derechos en esta invención de
acuerdo con Grant Nº GM-30163 otorgado por los
National Institutes of Health.
Los biólogos moleculares han identificado los
defectos cromosómicos en un gran número de enfermedades
hereditarias humanas, elevando las probabilidades de curas usando
terapia génica. Esta rama emergente de la medicina pretende
corregir defectos genéticos transfiriendo genes clonados y activos
funcionalmente a las células afectadas. La fibrosis cística (CF) es
una enfermedad genética recesiva fatal caracterizada por
anormalidades en el transporte de cloruro. Se ha recorrido el lugar
de la enfermedad hasta mutaciones en el gen que codifica el
regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis cística
(CFTR). La corrección del defecto genético subyacente por
complementación o sustitución del CFTR defectuoso es la cura
esencial para la CF.
La terapia génica o la cesión in vivo y
expresión de genes es una ciencia de rápido desarrollo que puede
usarse para sustituir genes defectuosos. Se conocen en la técnica
varios sistemas y polímeros adecuados para la cesión de
polinucleótidos. Entre ellos, se han usado vectores víricos tales
como vectores adenovíricos para transferir CFTR al pulmón de la
rata del algodón in vivo. Aunque se ha informado de altos
niveles de transfección in vivo con los vectores
adenovíricos, los sistemas de cesión no víricos tienen un cierto
número de ventajas para la cesión de polinucleótidos.
Durante la década pasada, se ha desarrollado un
cierto número de métodos para introducir genes funcionales en
células de mamífero in vitro. Estas técnicas son aplicables
a terapia génica, siempre que las células objetivo puedan separarse
del cuerpo, transfectarse y multiplicarse las células transfectadas
y devolverse después al paciente. Esto no es posible, sin embargo,
para pacientes con CF.
Actualmente, las mejores eficacias de
transfección in vivo se obtienen con retrovirus. Sin embargo,
la eficacia de la transfección es variable y los sistemas de cesión
de genes basados en virus tienen el riesgo de causar infección
vírica o cáncer. Claramente, aunque no se han observado
complicaciones agudas procedentes del uso de vectores retrovíricos
en seres humanos, la posibilidad de complicaciones a largo plazo
obligan a una vigilancia del paciente cuidadosa.
Los riesgos potenciales de usar vectores basados
en virus y las ventajas conceptuales de usar en su lugar
construcciones de ADN plásmido para terapia génica han conducido al
desarrollo de diversos métodos físicos y químicos para facilitar la
transferencia génica en ausencia de vectores víricos. Los sistemas
estudiados más intensamente implican el tratamiento de células con
fosfato cálcico o un facilitador catiónico. Otros métodos implican
la inyección del ADN durante el pinchado físico de la membrana o la
absorción pasiva del ADN durante la permeabilización o abrasión de
la membrana celular. Cada uno de estos métodos es intrínsicamente
agresivo y no se prefiere para uso in vivo.
El uso de un sistema de cesión de genes directo
que no implique el uso de vehículos víricos puede evitar los
riesgos planteados por los sistemas víricos. Un vehículo no vírico
adecuado para cesión de genes debe ser capaz de superar muchas
barreras. Debe subsistir en la circulación y ser capaz de alcanzar
el objetivo de la célula de elección, introducir ADN en el
citoplasma de la célula y transportar el ADN al núcleo.
Actualmente, los virus son los vectores más
eficaces para transferencia de genes, pero los riesgos potenciales
asociados con su uso han catalizado una investigación sobre
sistemas de cesión de ADN sintéticos. Un primer trabajo mostró que
policationes tales como polilisina y DEAE-dextrano
promueven la absorción de proteínas y polinucleótidos de cadena
sencilla y de doble cadena en células de animales, y, desde
entonces, se han ensayado extensamente vectores basados en
polilisina para transferencia de genes. Sin embargo, estos
policationes son relativamente citotóxicos y no son por sí mismos
muy eficaces, lo que limita su utilidad para transfectar células en
cultivo.
A pesar de estos inconvenientes, las polilisinas
tienen un cierto número de ventajas tales como ayudar a
- 1)
- montar ADN en una estructura compacta,
- 2)
- desestabilizar membranas celulares, y
- 3)
- proporcionar una palanca para la incorporación de otros efectores al ácido nucleico.
La neutralización y condensación de ADN por
polilisinas en estructuras de tipo toroide pequeñas (aprox. 100 nm)
promueve la endocitosis del ácido nucleico en células in
vitro. El proceso endocítico puede estimularse adicionalmente
por la incorporación covalente al policatión de ligandos
específicos como transferrina, asialoorosomucoide o insulina.
Cuando los procedimientos de transfección del policatión se basan
en endocitosis mediada por el receptor o en fase fluida, una gran
fracción del ADN endocitosado resulta atrapado en vesículas
intracelulares y se degrada finalmente en los lisosomas. La
degradación lisosómica puede evitarse parcialmente por adición de
agentes lisosomotróficos tales como cloroquina durante la
transfección, o por incorporación a la polilisina de agentes que
rompan endosoma, tales como virus inactivados o péptidos
fusogénicos víricos. La capacidad de complejos de
polilisina-ADN para transfectar células depende
fuertemente de la presencia de estos efectores.
Una forma de proteger el polinucleótido en la
circulación, de manera que subsista lo suficiente para llegar al
destino celular deseado es el "enmascaramiento" o protección
del polinucleótido.
Se han usado en parte como protección en
transferencia de genes micropartículas, tales como espectros de
eritrocitos, envolturas víricas reconstituidas y liposomas. Un
sistema liposómica de éxito utiliza el lípido catiónico cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA), mezclado con fosfatidiletanolamina (PE) para formar el
reactivo Lipofectin®. Lipofectin® es un liposoma catiónico que
puede mezclarse con el ADN, y añadirse la mezcla a una célula sin
necesidad de encapsulación del ADN dentro del liposoma con reactivos
catiónicos. Se ha usado Lipofectin® para transfectar genes
informadores en células epiteliales de pulmón humano en cultivo,
para introducir el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) en
células de ratas por vía intratraqueal, y para introducir el gen de
CAT en células de ratones por vías intratraqueal e intravenosa. En
el caso del gen de CAT, aproximadamente el 50% de las células de
ratas epiteliales de las vías respiratorias expresaron
transitoriamente el gen informador de
\beta-galactosidasa, aunque no se cuantificó el
nivel de expresión. Cuando el gen de CAT se incorporó a un
activador sensible a esteroides y se transfectó en pulmón de rata,
se mostró que su expresión era regulada positivamente por
dexametasona. No obstante, la citotoxicidad es un problema definido
cuando se usan altas concentraciones de Lipofectin®.
Se han usado sustitutos de DOTMA que incluyen
lipopoliamina, polilisinas lipófilas y un colesterol catiónico,
para mediar en la transferencia de genes en cultivo. Aunque algunos
de éstos muestran una mejora de aproximadamente tres veces sobre
las proporciones de transfección observadas con Lipofectin®, su
toxicidad sigue siendo un problema. No se ha explorado a fondo el
mecanismo responsable de la transfección usando lípidos catiónicos.
El método pasado ha sido sintetizar diferentes lípidos catiónicos y
probarlos en ensayos de transfección, en lugar de estudiar
sintemáticamente cómo los sistemas de cesión introducen ADN en una
célula. El hallazgo de que liposomas de DOTMA/PE pueden experimentar
fusión de bicapa con liposomas aniónicos sugiere que DOTMA puede
facilitar la entrada directa del ADN a través de la membrana del
plasma. Por otra parte, para transfección de alta eficacia, los
sistemas de lípidos catiónicos requieren PE, posiblemente porque PE
puede formar compuestos intermedios de lípidos intramembrana que
facilitan la fusión de membrana.
Una transferencia de genes eficaz requiere
también fijar el objetivo del ADN a la célula de elección. Se han
descrito recientemente para transferencia génica diversos
procedimientos basados en endocitosis mediada por el receptor. Se
unió un conjugado de ligando específico para la
célula-poililisina a ácidos nucleicos a través de
interacciones de carga, y el complejo resultante se absorbió
eficazmente por las células objetivo, tal como en el caso del linaje
celular de hepatoma humano HepG2 y hepatocitos de rata in
vivo usando este sistema de cesión con asialoorosomucoide como
ligando. Se ha informado de la expresión estable de una actividad
enzimática en células HepG2 tras la fijación de objetivo dirigida
por insulina así como la cesión mediada por
transferrina-policatión de un plásmido en el linaje
celular leucémico humano K-562 y la expresión
subsiguiente del gen de luciferasa codificado. Sin embargo, los
sistemas de cesión descritos requieren el enlace de las proteínas de
fijación de objetivo de alto peso molecular a ADN a través de un
enlazador de polilisina. Estos conjugados grandes de
ligando-policatión son de tamaño y composición
heterogéneos, químicamente mal definidos y difíciles de preparar de
manera reproducible. Además, en muchos de los sistemas mediados por
receptores, se requieren cloroquina u otros rompedores del
tránsito intracelular para conseguir altos niveles de transfección.
En un estudio, se usó un adenovirus para aumentar la cesión de
genes de un sistema mediado por receptor.
Así, pueden cederse genes al interior de células
de mamífero por endocitosis mediada por receptores, escapando de la
degradación una fracción del ADN exógeno, entrando en el núcleo y
expresándose. No obstante, el nivel de expresión es bajo, debido
probablemente a la entrada limitada del ADN extraño en el
citoplasma.
La cesión directa de genes también es facilitada
por neutralización de la gran carga negativa en el polinucleótido,
y la capacidad (a menudo concomitante) para permeabilizar la
membrana de la célula fijada como objetivo. El uso de policationes
para neutralizar la carga del polinucleótido facilita la
permeabilización de la membrana y la translocalización del
polinucleótido. Se han usado con este fin lípidos catiónicos.
También se conocen ciertos lípidos catiónicos denominados
lipopoliaminas y lipointercaladores.
Una vez que el polinucleótido ha entrado en la
célula fijada como objetivo, la cesión directa de genes puede
facilitarse dirigiendo los genes a la posición subcelular
apropiada. Un objetivo obvio para la cesión de
desoxirribonucleótidos es el núcleo. Son ligandos conocidos para
facilitar en este proceso péptidos o proteínas de localización
nuclear que contienen secuencias de localización nuclear.
Se demostró que la eficacia de transfección
obtenida con envolturas víricas reconstituidas aumentaba cuando el
gen extraño se co-cede a las células objetivo con
proteínas nucleares. Se mostró que ADN mezclado con proteínas
nucleares presentaba un aumento modesto de transfección sobre ADN
mezclado con albúmina usada como testigo. Así, el ADN parece
incorporarse al núcleo más fácilmente cuando proteínas que
contienen la secuencia de localización nuclear (NLS)
pro-lys-lys-lys-arg-lys-val
(SEC. ID NO:1) están asociadas con el plásmido porque la presencia
de la NLS en una proteína la señala para transporte a través del
poro nuclear. Se han incorporado las secuencias de localización
nuclear de 14 aminoácidos a una variedad de macromoléculas e
incluso a partículas de oro (diámetro 150 \ring{A}) y, cuando se
introdujeron en el citoplasma, se incorporaron rápidamente al
núcleo. La entrada nuclear parece ser la etapa limitante de
intensidad para una transfección estable con éxito. Esto es
respaldado por el hallazgo de que cuando se microinyecta ADN
plásmido en el citoplasma, es incapaz de lograr la transfección de
la célula. No tuvo lugar transfección en 1.000 inyecciones
citoplásmicas, mientras que la microinyección de plásmidos
directamente en el núcleo produjo transfección en más del 50% de
las células microinyectadas.
Se mostró también aumentar la eficacia de
transfección cuando se condensa el ADN usando diversas proteínas
catiónicas. Aunque no es fácilmente evidente la razón por la que la
condensación de ADN aumenta la transfección, puede ser debido a un
aumento en la absorción celular de ADN o a una disminución en la
susceptibilidad del ADN a nucleasas, que puede producir cantidades
más altas de ADN intacto en la célula.
La cesión directa de genes asociados con una de
las clases de agentes comentadas antes es facilitada adicionalmente
por la capacidad de esos agentes para permanecer asociados con el
ADN. Son ejemplos de esto la asociación de un ligando receptor con
un polinucleótido por incorporación covalente del ligando a la
polilisina policatión, y opcionalmente incorporando covalentemente
el ligando a un intercalador de ADN, por ejemplo, homodímero de
etidio (dihidrocloruro de dicloruro de
5,5'-diazadecametilenbis-(3,8-diamino-6-fenilfenantridio))
y la asociación de marcas de fotoafinidad a ADN por incorporación
covalente a 9-aminoacridina y ciertas
bis-acridinas.
Los dendrímeros son polímeros tridimensionales
voluminosos construidos por secuencias de reacción reiterativas
alrededor de una molécula de núcleo que pueden prepararse en pesos
moleculares y tamaños variados (Tomalia, D.A. et al.,
"Starburst Cascade Polymers: Molecular-Level
Control of Size, Shape, Surface Chemistry, Topology, and
Flexibility from Atoms to Macroscopic Matter", Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 29:138 (1990)).
Sin embargo, en la búsqueda para alcanzar mejores
resultados en el campo de la terapia génica, hay necesidad aún de
sistemas de cesión de polinucleótidos mejorados de alta eficacia de
transfección sin los inconvenientes de sistemas anteriores.
El documento WO 93/19768 se refiere a un sistema
de cesión de polinucleótido automontable que comprende componentes
que facilitan la cesión del polinucleótido a las direcciones
deseadas que están asociadas mediante interacciones no covalentes
con el polinucleótido. Los componentes de este sistema incluyen
ADN, componentes de enmascaramiento, componentes de reconocimiento
de células, componentes de neutralización de carga y de
permeabilización de membrana y componentes de localización
subcelular.
Esta invención se refiere a un sistema de cesión
de polinucleótido automontable que utiliza un policatión de
dendrímero que tiene grupos catiónicos terminales, acoplado no
covalentemente a un polinucleótido a ceder, en el que la proporción
de grupos catiónicos terminales del policatión de dendrímero al
contenido de nucleótidos del polinucleótido es de 1:1 a 223,3:1,
pero excluyendo composiciones obtenibles diluyendo 12 \mug de
plásmido PCLuc4 en 660 \mul de HBS (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH
7,4) para formar una solución de ADN y disolviendo 1 nmol de
micropartículas de dendrímero Starburst de macromolécula de
policatión ramificada hidrófila de quinta generación en 340 \mul
de HBS y añadiendo esto gota a gota a la solución de ADN.
Opcionalmente, puede contener uno o más, preferiblemente dos o más
de los siguientes agentes.
- 1)
- Agentes de enmascaramiento de ADN.
- 2)
- Agentes de reconocimiento de células.
- 3)
- Agentes de neutralización de carga y de permeabilización de membrana.
- 4)
- Agentes de localización subcelular.
El policatión de dendrímero es capaz por sí mismo
de ceder el polinucleótido con alta eficacia de transfección. Cada
componente opcional de este sistema es capaz de realizar su función
indicada y también es capaz de montarse o desmontarse con el
polinucleótido según se requiera. Por ejemplo, un cierto componente
puede tener que disociarse él mismo del polinucleótido con el fin
de realizar su función deseada.
Esta invención proporciona una composición para
ceder un polinucleótido a un componente subcelular de una célula
eucariota que comprende un polinucleótido y un policatión de
dendrímero que tiene grupos catiónicos terminales acoplados no
covalentemente al polinucleótido, en el que la proporción de grupo
catiónico terminal del policatión de dendrímero al contenido de
nucleótidos del polinucleótido es de 1:1 a 223,3:1.
En una realización de la presente composición, el
polinucleótido comprende un vector híbrido que tiene un gen
estructural acoplado operativamente a él.
La composición de la invención puede ponerse en
contacto con una célula eucariota objetivo en condiciones eficaces
para conseguir una transfección altamente eficaz.
En otro aspecto, la invención abarca también la
administración de la presente composición a un organismo para ceder
a células objetivo específicamente un polinucleótido tal como un gen
estructural en condiciones de transfección altamente eficaces e
inducir la expresión en las células del producto génico.
Una apreciación más completa de la invención y
muchas de las ventajas concomitantes de la misma se percibirán
fácilmente cuando se entiendan mejor con referencia a las
siguientes figuras.
La Figura 1 muestra el efecto de pLys115, SD68,
SD54 y GALA-SD54 en la movilidad electroforética de
ADN plásmido. Se prepararon complejos de
policatión-pCMV-\beta-Gal
con cada uno de los anteriores y se pasaron como sigue en el gel.
Pista 1: pCMV-\betaGal solo: pista 2: 2 \mug de
pLys115; pista 3: 4 \mug de pLys115; pista 4: \mug de SD68;
pista 5: 6 \mug de SD68; pista 6: 4 \mug de SD54 proporcionado
por el conjugado GALA-SD54; pista 7: 160 \mug de
SD54 proporcionado por el conjugado GALA-SD54; y
pista 8: 4 \mug de SD54 proporcionado por una mezcla equimolar de
SD54 y GALA-SD54.
La Figura 2 muestra el efecto de diámetro y
cantidad de dendrímero para mediar la transfección en células
CV-1 (datos obtenidos de la Tabla 2).
La Figura 3 muestra la
dosis-respuesta de actividad de luciferasa en
función de la cantidad de plásmido pCLuc4 usado para la
transfección.
La Figura 4 muestra la transfección mediada por
polímero en cascada PAMAM de células de mamífero. Figura 4A: las
células se transfectaron en duplicados con 6 \mug de plásmido
acomplejado a SD68. Se comparó la eficacia de transfección del
complejo optimizado (25 \mug de SD68/6 \mug de plásmido;
\otimes) con la obtenida con complejos formados con 4 \mug de
SD68/6 \mug de plásmido ([aminas terminales] = [nucleótidos];
\Box). La actividad de luciferasa en las células transfectadas
con pCLuc4 se midió 48 h post-transfección como se
describe en la Tabla 2 o 24 h post-transfección en
el caso de hepatocitos primarios. Cada valor es la media \pm
intervalo de determinaciones duplicadas. Se estimó el porcentaje de
células transfectadas en las condiciones optimizadas con el
plásmido pCMV-\betaGal. Se detectaron las células
transfectadas por coloración histoquímica usando
X-Gal, 24 h post-transfección (Lim,
K. Y Chae, C-B, "A Simple Assay for DNA
Transfection by Incubation of the Cells in Culture Dishes with
Substrate for \beta-Glactosydase", Biotech.
7:576 (1989)). Se muestran los resultados como porcentajes en el
histograma. Figura 4B: Se transfectaron las células como antes con
6 \mug de pCLuc4 acomplejado a 4 \mug de dendrímero
proporcionado por SD54 no modificado (\Box) o por una mezcla
equimolar de SD54 no modificado y GALA-SD54
(
\sqt).
La Figura 5 muestra una comparación de la
toxicidad de pLys115 y SD68 en células CV-1. Se
trataron durante 5 h células CV-1 en una placa de 96
pocillos en DME H-21 exento de suero con cantidades
crecientes de policatión (pLys115 \bullet, o SD68 \circ)
acomplejado (- - -) o no (-) a ADN plásmido y cultivaron durante un
período de 48 h más en DME H-21 que contenía 10% de
FCS. Después de este período, se estimó la toxicidad de los
tratamientos por el ensayo de reducción de colorante MTT. Se
cuantificó formazano después de lisis de las células por su
absorbancia a 570 nm. La observancia de fondo se obtuvo pasando el
ensayo en células tratadas con hidrocloruro de guanidinio 6 M. % de
reducción en la viabilidad de células =
{1-[OD_{570}(células tratadas-fondo]/[
OD_{570}(células no tratadas-fondo]} x
100. Cada valor es la media \pm DT de determinaciones
triplicadas.
La Figura 6 muestra un gráfico que indica el
desplazamiento competitivo de bromuro de etidio de ADN de timo de
becerro por los derivados de bis-acridina del
Ejemplo 20. (\bullet): trihidrocloruro de
espermidina-bis-acridina, Kd = 4,3 x
10^{-8} M; (\circ): WTcisMPB-bA, Kd = 2,1 x
10^{-7} M; (\Box): cTcysMPB-bA, Kd = 7,9 x
10^{-7} M; (\Delta): MPB-bA, Kd = 1,0 x
10^{-6} M.
La Figura 7 muestra el efecto dependiente de la
dosis del policatión de dendrímero SD68 sobre la cesión de
oligonucleótidos al núcleo de la célula.
La Figura 8 muestra la dependencia del tiempo con
la que el policatión de dendrímero SD68 facilita la acumulación de
oligonucleótidos en el núcleo de una célula (sustitución de tampón
de 25% de glucosa).
La Figura 9 muestra el efecto de la generación
del policatión de dendrímero en la absorción nuclear de
oligonucleótidos de 16 meros marcado con Fitc.
La Figura 10 muestra la fluorescencia nuclear
observada en función de la dilución de la composición de cesión con
soluciones de carbohidrato.
La Figura 11 muestra el efecto sobre la
transfección de la incorporación de un ligando de fijación de
objetivo y un desestabilizador de membrana al ADN mediante
bis-acridina.
La Figura 12 muestra el efecto sobre la
transfección de la incorporación de un ligando de fijación de
objetivo y un desestabilizador de membrana al policatión de
dendrímero.
Otros objetos, ventajas y aspectos de la presente
invención se evidenciarán para los expertos en la técnica a partir
de la siguiente discusión.
"Polinucleótido" según se usa aquí incluye
secuencias de ARN o ADN de más de un nucleótido en forma de cadena
sencilla, doble o múltiple. El polinucleótido abarca
polidesoxirribonucleótidos que contienen
2'-desoxi-D-ribosa o
formas modificadas del mismo, es decir, ADN, polirribonucleótidos
que contienen D-ribosa o formas modificadas del
mismo, ARN, y cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un
N-glicósido o C-glicósido de una
base de purina o pirimidina, o una base de purina o pirimidina
modificada o un nucleótido básico. El polinucleótido puede
codificar regiones activadoras, regiones operadoras, regiones
estructurales, regiones de terminación, combinaciones de ellas o
cualquier otro material relevante genéticamente.
Enlaces "sustitutos" se definen aquí como
enlaces alternativos convencionales tales como fósforotioato o
fósforoamidato, que se sintetizan como se describe en la
bibliografía disponible generalmente. No todos los enlaces en un
polinucleótido necesitan ser idénticos. Los polinucleótidos de la
invención pueden contener uno o más enlaces "sustitutos" como
se entiende generalmente en la técnica. Algunos de estos enlaces
sustitutos son no polares y contribuyen a la capacidad deseada del
polinucleótido para difundirse a través de una membrana. Otros
enlaces sustitutos contribuyen a la biodegradabilidad aumentada o
disminuida del polinucleótido. La biodegradabilidad es afectada, por
ejemplo, por una sensibilidad a nucleasa aumentada o
disminuida.
"Purinas análogas" y "pirimidinas
análogas" son las conocidas generalmente en la técnica, muchas de
las cuales se usan como agentes quimioterapéuticos, que contienen
modificaciones en el resto azúcar del polinucleótido. Son ejemplos
de purinas y pirimidinas análogas aquellas en las que uno o más de
los grupos hidroxilo están sustituidos con grupos halógeno o
alifáticos, o están funcionalizadas como éteres, aminas y
similares, o en las que la ribosa o desoxirribosa está sustituida
con otras estructuras equivalentes funcionalmente. Las
modificaciones en el resto de base incluyen purinas o pirimidinas
alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros heterociclos. En
particular, la cadena principal de azúcar-fosfato
del polinucleótido puede sustituirse con una cadena principal no
carbohidrato tal como un péptido u otro tipo de cadena principal de
polímero (Nielsen, P.E. et al., Science 254: 1497
(1991)).
El peso molecular calculado para un dendrímero
ideal que no contenga productos de reacción incompletos o productos
de reacción secundarios es el peso molecular. Sin embargo, en el
transcurso de una síntesis se presentan usualmente algunos
productos incompletos o productos secundarios. "Peso molecular
medio" según se usa aquí se refiere a un peso molecular
hipotético de un dendrímero ideal pero debe señalarse que, en la
práctica, pueden tener lugar desviaciones de este peso molecular
medio, y están presentes en alguna proporción moléculas de diversos
pesos moleculares menores y mayores que este valor. "Radio
hidrodinámico" según se usa aquí se refiere al radio aparente de
un dendrímero simple en soluciones acuosas. Puede estimarse por los
expertos en la técnica usando cromatografía de permeación de gel o
fotodispersión laser.
"Componente funcional" según se usa aquí
incluye componentes de enmascaramiento de ADN, componentes de
reconocimiento de células, componentes de neutralización de carga y
permeabilización de membrana, y componentes de localización
subcelular.
"Componente de enmascaramiento de ADN" según
se usa aquí se refiere a una molécula capaz de enmascarar todo o
parte de un polinucleótido para aumentar su vida media circulatoria
inhibiendo el ataque por reactivos degradantes tales como nucleasas
presentes en la circulación y/o que interfieren con la absorción
por el sistema retículoendotelial.
"Componente permeabilizante de membrana"
según se usa aquí se refiere a cualquier componente que facilita el
paso de un polinucleótido a través de una membrana. Así, este
término abarca en parte componentes neutralizantes de carga,
habitualmente policationes, que neutralizan la gran carga negativa
en polinucleótidos, y permiten al polinucleótido atravesar el
interior hidrófobo de una membrana. Muchos componentes
neutralizantes de carga pueden actuar como permeabilizadores de
membrana. La permeabilización de membrana puede proceder también de
moléculas anfipáticas. Un permeabilizador de membrana es una
molécula que puede ayudar a una molécula normalmente impermeable a
atravesar membranas celulares y conseguir la entrada al citoplasma
de la célula. Un permeabilizador de membrana puede ser un péptido,
una sal biliar, un glicolípido, un fosfolípido o una molécula de
detergente. Los permeabilizadores de membrana tienen a menudo
propiedades anfipáticas tales que una porción es hidrófoba y otra es
hidrófila, permitiéndoles interactuar con la membrana.
"Péptido fusogénico" según se usa aquí se
refiere a un péptido que, cuando se añade a dos membranas bicapa
separadas, puede realizar su fusión en una membrana simple.
"Liposoma" según se usa aquí se refiere a
pequeñas vesículas compuestas de líquidos anfipáticos dispuestos en
bicapas esféricas. Los liposomas se clasifican habitualmente como
pequeñas vesículas unilaminares (SUV), grandes vesículas
unilaminares (LUV) o vesículas multilaminares (MLV). Las SUVs y LUVs
tienen, por definición, sólo una bicapa, mientras que las MLVs
contienen muchas bicapas concéntricas. Los liposomas pueden usarse
para encapsular diversos materiales, atrapando moléculas hidrófilas
en el interior acuoso o entre bicapas, o atrapando moléculas
hidrófobas dentro de la bicapa. Los liposomas presentan una amplia
variedad de características, dependiendo de su tamaño, composición
y carga. Por ejemplo, los liposomas que tienen un pequeño porcentaje
de lípidos insaturados tienden a ser ligeramente más permeables,
mientras que los liposomas que incorporan colesterol u otros
esteroles tienden a ser más rígidos y menos permeables. Los
liposomas pueden ser de carga positiva, negativa o neutra,
dependiendo del grupo hidrófilo. Por ejemplo, los lípidos basados
en colina imparten una carga total neutra, los lípidos basados en
fosfato y sulfato aportan una carga negativa, los lípidos basados en
glicerol están cargados negativamente generalmente y los esteroles
son generalmente neutros en solución pero tienen grupos
cargados.
"Componente de reconocimiento de célula"
según se usa aquí se refiere a una molécula capaz de reconocer un
componente en la superficie de una célula fijada como objetivo. Los
componentes de reconocimiento de célula incluyen anticuerpos para
antígenos de la superficie celular, ligandos para receptores de la
superficie celular incluyendo los implicados en endocitosis mediada
por receptor, hormonas de péptidos y similares.
"Resto que se asocia a ADN" se refiere a una
molécula o porciones de la misma que interactúan de manera no
covalente con ácidos nucleicos. Los restos que se asocian a ADN
incluyen aglomerantes de ranura principal y pequeña, intercaladores
de ADN y policatión, entre otros. Los aglomerantes de ranura
principal y pequeña son moléculas de las que se piensa que
interactúan con ADN asociando con la ranura principal o pequeña de
ADN de doble cadena. Los intercaladores de ADN son moléculas planas
o porciones planas de moléculas que se piensa que se intercalan en
ADN insertándose ellas mismas entre, y paralelas a, pares de bases
de mucleótidos. Se piensa que los policationes se asocian con las
cargas negativas en la cadena principal de ADN. Además, cuando un
ADN o ARN de cadena sencilla se usa como cadena terapéutica, la
"cadena enlazadora" complementaria como se describe aquí puede
actuar funcionalmente como un "resto que se asocia a ADN".
Los restos que se asocian a ADN pueden enlazarse
covalentemente a través de un "grupo reactivo" a un componente
funcional de esta invención. Estos grupos reactivos se hacen
reaccionar fácilmente con un nucleófilo en el componente funcional.
Tales grupos reactivos (con sus nucleófilos reactivos
correspondientes) incluyen, aunque sin limitarse a ellos,
N-hidroxisuccinimida (por ejemplo, amina),
maleimida y maleimidofenilo (por ejemplo, sulfhidrilo), disulfuro
de piridilo (por ejemplo, sulfhidrilo), hidrazida (por ejemplo,
carbohidrato) y fenilglioxal (por ejemplo, arginina).
"Componente de localización subcelular"
según se usa aquí se refiere a una molécula capaz de reconocer un
componente subcelular en una célula fijada como objetivo. Los
componentes subcelulares reconocidos incluyen el núcleo, ribosomas,
mitocondrias y cloroplastos. Componentes de localización subcelular
particulares incluyen los "componentes de localización nuclear"
que ayudan a llevar moléculas al núcleo y se sabe que incluyen los
péptidos de localización nuclear y secuencias de aminoácidos.
"Policatión de dendrímero" según se usa aquí
se refiere a un compuesto oligómero y/o polímero altamente ordenado,
tridimensional, formado por secuencias de reacción reiterativas
partiendo de una molécula más pequeña o iniciador diseñado tal como
amoníaco o pentaeritritol, entre otros, que tienen una superficie
cargada positivamente como se describe, por ejemplo, por Tomalia
et al. (1990), supra.
La composición de esta invención es un sistema de
casión de polinucleótido automontable que comprende
un polinucleótido; y
un policatión de dendrímero acoplado
operativamente al polinucleótido, como se define en la
reivindicación 1ª.
El polinucleótido puede ser un ADN o ARN de
cadena sencilla, o un ADN de cadena doble o híbrido de
ADN-ARN. También se consideran dentro del alcance de
esta invención polinucleótidos de triple o cuádruple cadena con
valor terapéutico. Los ejemplos de ADN de doble cadena incluyen
genes estructurales, genes que incluyen regiones de control de
operador y de terminación, y sistemas de autorreplicación tales
como ADN plásmido, entre otros.
Los polinucleótidos de cadena sencilla o
"cadenas terapéuticas" incluyen polinucleótidos antisentido
(ADN y ARN), ribozimas y oligonucleótidos de formación de triple.
Con el fin de tener actividad prolongada, la cadena terapéutica
tiene preferiblemente algunos o todos sus enlaces nucleótidos
estabilizados como enlaces no fosfodiéster. Tales enlaces incluyen,
por ejemplo, enlaces fósforotioato, fósforoditioato,
fóaforoselenato u O-alquilfosforotriéster en los
que el grupo alquilo es metilo o etilo, entre otros.
Para estos polinucleótidos de cadena sencilla,
puede ser preferible preparar la complementaria o "cadena
enlazadora" a la cadena terapéutica como parte de la composición
administrada. La cadena enlazadora se sintetiza habitualmente con un
enlace fosfodiéster de manera que se degrade después de entrar en
la célula. La "cadena enlazadora" puede ser una cadena
separada, o puede estar incorporada covalentemente a o ser una mera
extensión de la cadena terapéutica, de modo que la cadena
terapéutica se vuelve atrás esencialmente y se hibrida a sí
misma.
La cadena enlazadora puede tener también
funcionalidades en el extremo 3' o 5' o en el carbohidrato o cadena
principal que sirven como componentes funcionales para aumentar la
actividad de la cadena terapéutica. Por ejemplo, la cadena
enlazadora fosfodiéster puede contener un ligando de fijación de
objetivo tal como un derivado folato que permite el reconocimiento
y la internalización en las células objetivo. Si la enlazadora está
incorporada a su cadena terapéutica complementaria que está
compuesta de enlaces resistentes a la degradación, se
internalizaría el dúplex. Una vez dentro de la célula, se degradará
la enlazadora, liberando por ello la cadena terapéutica. De esta
manera, la cadena terapéutica no tendrá funcionalidades adicionales
incorporadas y no se verá impedida su función por restos no
esenciales. Esta estrategia puede aplicarse a cualquier
polinucleótido antisentido, ribozima o de formación de triple y se
usa para ceder polinucleótidos antivíricos, antibacterianos,
antineoplásticos, antiinflamatorios, antiproliferativos,
anti-bloqueo de receptor o
anti-transporte, y similares.
Puede sintetizarse una cadena enlazadora separada
para tener la secuencia complementaria directa de la cadena
terapéutica e hibridarla con ella de manera una en una.
Alternativamente, la cadena enlazadora puede construirse de manera
que la región 5' de la cadena enlazadora se hibride con la región 5'
de la cadena terapéutica, y la región 3' de la cadena enlazadora se
hibride con la región 3' de la cadena terapéutica para formar un
concatenado de la siguiente estructura.
5' ------ ------ ------
- 3' ------ ------ ------
Este concatenado tiene la ventaja de que se
aumenta el peso molecular aparente de los ácidos nucleicos
terapéuticos y pueden ajustarse sus propiedades farmacocinéticas y
la relación ligando de fijación de objetivo:oligonucleótido
terapéutico para conseguir el efecto terapéutico óptimo.
El policatión de dendrímero es un compuesto
oligómero y/o polímero altamente ordenado, tridimensional, formado
sobre una molécula de núcleo o iniciador diseñado por secuencias de
reacción reiterativas que añaden los oligómeros y/o polímeros y que
proporcionan una superficie exterior que está cargada
positivamente. Estos dendrímeros pueden prepararse como se describe
en el documento PCT/US83/02052 de la Dow Chemical Company, y en las
Patentes de los EE.UU. Nº 4.507.466, 4.558.120, 4.568.737,
4.587.329, 4.631.337, 4.694.064, 4.713.975, 4.737.550, 4.871.779 y
4.857.599 de Tomalia, D.A. et al., o como se describe en la
descripción de ejemplo proporcionada después. Típicamente, los
policationes de dendrímero comprenden una molécula de núcleo sobre
la que se añaden polímeros. Los polímeros pueden ser oligómeros o
polímeros que comprenden grupos terminales capaces de adquirir una
carga positiva. Las moléculas de núcleo adecuadas conprenden al
menos dos residuos reactivos que pueden utilizarse para la unión de
la molécula de núcleo a los oligómeros y/o polímeros. Son ejemplos
de los residuos reactivos hidroxilo, éter, amino, imino, amido,
imido, amonio, haluro, carboxilo, carboxihaluro y sulfhidrilo, entre
otros. Las moléculas de núcleo preferidas son amoníaco,
tris-(2-aminoetil)amina, lisina, ornitina,
pentaeritritol y etilendiamina, entre otras. También son adecuadas
combinaciones de estos residuos como lo son otros residuos
reactivos.
Los oligómeros y polímeros adecuados para la
preparación de los policationes de dendrímero de la invención son
oligómeros y/o polímeros aceptables farmacéuticamente que son bien
aceptados en el cuerpo. Son ejemplos de éstos poliamidoaminas
derivadas de la reacción de un éster de alquilo de un ácido
carboxílico \alpha,\beta-insaturado etilénicamente o una
amida \alpha,\beta-insaturada etilénicamente y una
alquilenpoliamina o una polialquilenpoliamina, entre otros. Se
prefieren acrilato de metilo y etilendiamina. El polímero está
preferiblemente unido covalentemente a la molécula de núcleo.
Los grupos terminales que pueden incorporarse a
los oligómeros y/o polímeros deben ser capaces de adquirir una carga
positiva. Son ejemplos de éstos azoles y aminas alifáticas y
aromáticas primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias, que
pueden estar sustituidos con S u O, guanidinio y combinaciones de
ellos. Los grupos catiónicos terminales se incorporan
preferiblemente de manera covalente a los oligómeros y/o polímeros.
Los grupos catiónicos terminales preferidos son aminas y
guanidinio. Sin embargo, pueden utilizarse también otros. Los
grupos catiónicos terminales pueden estar presentes en una
proporción de aproximadamente 10 a 100% de todos los grupos
terminales del oligómero y/o polímero, y más preferiblemente
alrededor del 50 al 100%. El policatión de dendrímero puede
comprender también de 0 a aproximadamente 90% de residuos reactivos
terminales distintos de los grupos catiónicos. Son residuos
reactivos terminales adecuados distintos de los grupos catiónicos
terminales hidroxilo, ciano, carboxilo, sulfhidrilo, amida y
tioéter, entre otros, y combinaciones de ellos. No obstante,
también pueden utilizarse otros.
El policatión de dendrímero está asociado no
covalentemente con el polinucleótido. Esto permite una
desasociación o desmontaje fácil de la composición una vez que se
cede a la célula. Los policationes de dendrímero típicos adecuados
para su uso aquí tienen un peso molecular medio de aproximadamente
2.000 a 1.000.000, y más preferiblemente un peso molecular medio de
aproximadamente 5.000 a 500.000. No obstante, también son adecuados
otros pesos de molécula. Los policationes de dendrímero preferidos
tienen un radio hidrodinámico de aproximadamente 11 a 60
\ring{A}, y más preferiblemente de aproximadamente 15 a 55
\ring{A}. No obstante, también son adecuados otros tamaños.
Se obtienen buenos resultados con la presente
composición cuando la proporción de grupos catiónicos terminales del
policatión de dendrímero al polinucleótido es de aproximadamente
1:1 a 25:1, y más preferiblemente de aproximadamente 1:1 a 10:1. No
obstante, también pueden utilizarse otras proporciones.
La composición puede comprender además un agente
seleccionado del grupo constituido por
- 1)
- componentes de enmascaramiento de ADN;
- 2)
- componentes de reconocimiento de células;
- 3)
- componentes de neutralización de carga y de permeabilización de membrana; y
- 4)
- componentes de localización subcelular.
Cada elemento en este sistema, incluyendo el
policatión de dendrímero, es preferiblemente capaz de realizar su
función indicada y capaz también de montarse o desmontarse con el
polinucleótido según se requiera. La composición puede comprender
además uno o más de los agentes anteriores, y más preferiblemente
dos o más de los agentes. Una realización del sistema se muestra en
el siguiente Esquema 1.
Esquema
1
En esta realización del sistema de cesión de
polinucleótido de la invención, NLS es unas secuencia de
localización nuclear, MD es un componente de permeabilización de
membrana y Ligando es un componente de reconocimiento de
célula.
Cuando la composición de la invención comprende
también un agente de permeabilización de membrana, la proporción de
este agente a grupos catiónicos terminales del policatión de
dendrímero es preferiblemente de alrededor de 1:100 a 1:4, y más
preferiblemente de 1:50 a 1:8 aproximadamente. No obstante, también
son adecuadas otras proporciones. El agente de permeabilización de
membrana puede acoplarse al policatión de dendrímero mediante
fuerzas covalentes o electrostáticas. La composición de la
invención puede contener adicionalmente un fosfolípido que puede
estar en forma de un liposoma, un policatión tal como una poliamina
y similares.
Cuando el agente de localización subcelular es un
agente de localización nuclear, puede contener también un resto que
se asocia a ADN tal como un enlazador polinucleótido de cadena
sencilla, un policatión de dendrímero o un aglomerante de ranura
principal o pequeña, que está acoplado operativamente al agente de
localización nuclear, en cuyo caso la incorporación a ADN es
preferiblemente no covalente. El resto que se asocia a ADN puede ser
un agente intercalador tal como se conocen en la técnica. Se
describen después ejemplos de éstos. El agente intercalador puede
estar acoplado a uno o más ligandos dirigidos como objetivo a un
receptor situado en la superficie de la célula eucariota. En este
caso, el ligando y el policatión de dendrímero forman un agente de
reconocimiento de célula capaz de reconocer la célula eucariota, y
el ligando de fijación de objetivo también está acoplado al
policatión de dendrímero. El agente intercalador está acoplado no
covalentemente al polinucleótido, y el ligando está preferiblemente
acoplado covalentemente al agente intercalador. También puede estar
presente un agente de permeabilización de membrana que esté
acoplado operativamente al agente intercalador o al ligando.
Adicionalmente, la composición puede comprender también un
polipéptido fusogénico que esté acoplado operativamente al
policatión de dendrímero. Este acoplamiento puede ser covalente o no
covalente. La composición puede contener también un resto que se
asocia a ADN tal como los descritos después.
Cuando está presente en la composición un ligando
con objetivo fijado a un receptor situado en la superficie de la
célula eucariota, la proporción de ligando con objetivo fijado a la
célula a grupos catiónicos terminales del policatión de dendrímero
es preferiblemente de alrededor de 1:100 a 1:10, y más
preferiblemente de 1:80 a 1:25 aproximadamente. No obstante, también
son adecuadas otras proporciones. Los ejemplos de ligandos con
objetivo fijado a la célula preferidos son vitaminas, carbohidratos
y polipéptidos. No obstante, otros también son adecuados. El
polipéptido puede comprender anticuerpos o fragmentos de ellos que
tengan una especificidad predeterminada.
Cuando un polipéptido fusogénico está acoplado al
policatión de dendrímero, la proporción de polipéptido fusogénico a
grupos catiónicos terminales del policatión de dendrímero es
preferiblemente de alrededor de 1:100 a 1:4, y más preferiblemente
de 1:80 a 1:10. No obstante, también son adecuadas otras
proporciones.
La composición puede contener también un agente
de enmascaramiento de ADN que sea capaz de aumentar la vida media
circulatoria del polinucleótido. El agente de enmascaramiento de
ADN está acoplado operativamente al policatión de dendrímero por
fuerzas covalentes o no covalentes. No obstante, el agente de
enmascaramiento de ADN está preferiblemente acoplado no
covalentemente al polinucleótido. Cuando el agente de
enmascaramiento de ADN está presente en la composición, la
proporción del agente de enmascaramiento de ADN a los grupos
catiónicos terminales del policatión de dendrímero es
preferiblemente de alrededor de 1:33 a 1:3, y más preferiblemente
de 1:25 a 1:8 aproximadamente. No obstante, también son adecuadas
otras proporciones.
Se describen después otras formas particulares de
todos estos agentes que pueden añadirse a la composición.
El elemento de enmascaramiento de ADN de este
sistema es una molécula capaz de enmascarar la totalidad o parte del
polinucleótido, aumentando por ello su vida media circulatoria
inhibiendo el ataque por reactivos degradantes presentes en la
circulación o bloqueando la absorción por el sistema
retículoendotelial.
En esta invención, puede enlazarse covalentemente
polietilenglicol (PEG) con un resto que se asocia a ADN por métodos
convencionales como se describe después, y usarse como componente
de enmascaramiento de ADN. El PEG puede tener un peso molecular de
aproximadamente 700 a 20.000 Daltons, preferiblemente de 1.800 a
6.000 Daltons aproximadamente, y está presente preferiblemente en
una relación (moléculas de PEG:pb de ADN) de aproximadamente 1:4 a
1:100, y más preferiblemente de alrededor de 1:20.
Alternativamente, el ADN puede enmascararse por
asociación con lípidos. En una realización, el ADN está encerrado en
liposomas estándares como se ha descrito, por ejemplo, en la
Patente de los EE.UU. Nº 4.394.448 de Szoka et al. En otra
realización, el ADN se incuba con un lípido catiónico sintético
similar a los descritos en la Patente de los EE.UU. Nº 4.897.355 de
Epstein et al. Estos lípidos catiónicos tienen la fórmula
química
en la
que
n es un número entero de 1 a 8;
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son
alquilo(C_{6}-C_{24}) o alquenilo;
R^{3} es hidrógeno o
alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alquil(C_{1}-C_{10})amina; y
R^{4} es un
alquilo(C_{1}-C_{30}) lineal o ramificado
cargado positivamente o
alquil(C_{1}-C_{30})amina, en el
que uno o más de los átomos de carbono puede estar sustituido con
NR', en el que R' es hidrógeno o
alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alqui(C_{1}-C_{10})lamina.
Los grupos preferidos que pueden funcionar como
resto -N-R' son tris(aminoetil)amina
(NH_{2}CH_{2}CH_{2})_{3}N, agmatina
(descarboxiarginina)
H_{2}N(CH_{2})_{4}C(=NH)NH_{2},
3-aminoetil-1,3-propanodiamina
H_{2}N(CH_{2})_{3}NH(CH_{2})_{2}NH_{2},
3-dimetilaminopropilamina
(CH_{3})_{2}NH(CH_{2})_{3}NH_{2},
iminobis(N,N')dimetilpropilamina
NH((CH_{2})_{3}N(CH_{3})_{2})_{2},
iminobis(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina,
1,4-bis(3-aminopropil)piperazina,
bis(propilamina)
(NH_{2}(CH_{2})_{3})_{2}NH, espermidina
y espermina, entre otros. Estos grupos están incorporados
preferiblemente a la molécula de lípido a través de uno de sus
átomos de nitrógeno.
En una realización preferida específicamente, el
lípido catiónico sintético es un lípido de cola catiónico sintético
que tiene la fórmula química
en la
que
n es un número entero de 6 a 24;
Y se selecciona del grupo constituido por
hidrógeno, etanolamina, colina, glicerol, serina,
monometoxipolietilenglicol, ácido siálico e inositol;
R^{1} es
alquilo(C_{6}-C_{24}) o
alquenilo(C_{6}-C_{24});
R^{3} es hidrógeno o
alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alquil(C_{1}-C_{10})amina; y
R^{4} es un
alquilo(C_{1}-C_{30}) lineal o ramificado
cargado positivamente o
alquil(C_{1}-C_{30})amina, en el
que uno o más de los átomos de carbono puede estar sustituido con
NR', en el que R' es hidrógeno o
alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alquil(C_{1}-C_{10})amina.
Los grupos preferidos que pueden funcionar como
resto -N-R' son tris(aminoetil)amina
(NH_{2}CH_{2}CH_{2})_{3}N, agmatina
(descarboxiarginina)
H_{2}N(CH_{2})_{4}C(=NH)NH_{2},
3-aminoetil-1,3-propanodiamina
H_{2}N(CH_{2})_{3}NH(CH_{2})_{2}NH_{2},
3-dimetilaminopropilamina
(CH_{3})_{2}NH(CH_{2})_{3}NH_{2},
iminobis(N,N')dimetilpropilamina
NH((CH_{2})_{3}N(CH_{3})_{2})_{2},
iminobis(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina,
1,4-bis(3-aminopropil)piperazina,
bis(propilamina)
(NH_{2}(CH_{2})_{3})_{2}NH, espermidina
y espermina, entre otros. Estos grupos están incorporados
preferiblemente a la molécula de lípido a través de uno de sus
átomos de nitrógeno.
Los lípidos catiónicos sintéticos descritos antes
enmascaran eficazmente al ADN cuando se asocian con él. Sin intentar
limitar la invención en modo alguno, se cree que los lípidos pueden
formar una estructura monocapa que encapsula de alguna manera al
ADN.
El elemento de reconocimiento de célula de este
sistema es una molécula capaz de reconocer un componente en la
superficie de una célula fijada como objetivo que está enlazado
covalentemente con un resto que se asocia a ADN por métodos
convencionales como se describe después. Los componentes de
reconocimiento de célula incluyen anticuerpos para antígenos de la
superficie celular, ligandos para receptores de la superficie
celular incluyendo los implicados en endocitosis mediada por
receptor, hormonas péptidas, etc. Los ligandos específicos
considerados por esta invención incluyen ligandos carbohidratos
tales como galactosa, manosa, 5-fosfato de manosilo,
fucosa, grupos siálicos, N-acetilglucosamina o
combinaciones de estos grupos como carbohidratos complejos tales
como los encontrados en glicolípidos de los grupos sanguíneos o en
diversas proteínas segregadas. Otros ligandos incluyen folato,
biotina, diversos péptidos que pueden interactuar con receptores de
la superficie celular o intracelulares tales como el péptido
quimioatrayente
N-formil-met-leu-phe
(SEC ID NO:2), péptidos que contienen la secuencia
arg-asp-glicina o péptidos de
cys-ser-gly-arg-glu-asp-val-trp
(SEC ID NO:3), péptidos que contienen un residuo de cistina o que
interactúan con proteína de la superficie celular tal como el virus
de la inmunodeficiencia humana GP-120, y péptidos
que interactúan con CD-4. Otros ligandos incluyen
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tales como los descritos
por Hertler y Frankel (Hertler, A. y Frankel, A., J. Clin. Oncol.
7: 1932 (1989)). La especificidad de los anticuerpos puede dirigirse
contra una variedad de epítopes que pueden expresarse en
superficies celulares incluyendo macromoléculas de
histocompatibilidad, antígenos autoinmunes, proteínas víricas,
parásitas o bacterianas. Otros ligandos proteínas incluyen hormonas
tales como la hormona del crecimiento e insulina o factores de
crecimiento de proteínas tales como GM-CSF,
G-CSF, eritropoyetina, factor de crecimiento
epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico y ácido y
similares. Otros ligandos proteínas incluyen diversas citoquinas que
funcionan a través de receptores de la superficie celular tales
como interleuquina-2,
interleuquina-1, factor de necrosis de tumores y
fragmentos de péptidos adecuados de tales macromoléculas.
El elemento permeabilizador de la membrana de
este sistema es una molécula que facilita el paso de un
polinucleótido a través de una membrana. Los liposomas y lípidos
catiónicos sintéticos descritos antes como componentes de
enmascaramiento de ADN también pueden funcionar también como
componentes de permeabilización de la membrana.
Los componentes permeabilizadores de la membrana
de esta invención incluyen también policationes que neutralizan la
gran carga negativa en polinucleótidos. Los policationes de esta
invención incluyen polilisina, poliarginina,
poli(lisina-arginina) y polipéptidos
similares, y los dendrímeros de poliaminas y policatiónicos tales
como los descritos antes y utilizados en los ejemplos, y descritos
por Tomalia et al. (Tomalia, D.A. et al., (1990),
supra). Estos dendrímeros son una realización
particularmente preferida de esta invención, porque, por sí mismos,
en asociación con el polinucleótido, pueden mejorar sustancialmente
la eficacia de transfección de nucleótido como se ha descrito
antes.
Estos polímeros en cascada policatiónicos no
lineales combinan las propiedades de unión a ADN y cesión de la
polilisina y los efectos lisomotrópicos de las bases débiles. Los
polímeros en cascada de poliamidoamina (PAMAM), una clase bien
definida de polímeros dendríticos sintetizados a partir de acrilato
de metilo y etilendiamina como se describe por Tomalia et
al., supra, han mostrado en la descripción de ejemplo
ser bien tolerados por células y, cuando se acomplejan a plásmidos
que codifican genes informadores, mediar en una transfección
altamente eficaz de una amplia variedad de células en cultivo.
En una realización aún más preferida, un péptido
anfipático tal como GALA puede incorporarse covalentemente al
polímero en cascada (Subbarao, N.K. et al.,
"pH-Dependent Bilayer Destabilization by an
Amphipathic Peptide", J. Biol. Chem. 26: 2964 (1987)). Esta
composición es también una realización más preferida de esta
invención, porque se muestra en la descripción de ejemplo que mejora
significativamente la eficacia de transfección de polinucleótido en
células primarias y linajes celulares.
Otra clase de policationes son las sales biliares
catiónicas que tienen la fórmula química
en la
que
X e Y son independientemente H u OH;
R^{3} es hidrógeno o
alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alquil(C_{1}-C_{10})amina; y
R^{4} es un
alquilo(C_{1}-C_{30}) lineal o ramificado
cargado positivamente o
alquil(C_{1}-C_{30})amina, en el
que uno o más de los átomos de carbono puede estar sustituido con
NR', en el que R' es hidrógeno o
alquilo(C_{1}-C_{10}) o alquilamina.
Los grupos preferidos que pueden funcionar como
resto -N-R' son tris(aminoetil)amina
(NH_{2}CH_{2}CH_{2})_{3}N, agmatina
(descarboxiarginina)
H_{2}N(CH_{2})_{4}C(=NH)NH_{2},
3-aminoetil-1,3-propanodiamina
H_{2}N(CH_{2})_{3}NH(CH_{2})_{2}NH_{2},
3-dimetilaminopropilamina
(CH_{3})_{2}NH(CH_{2})_{3}NH_{2},
iminobis(N,N')dimetilpropilamina
NH((CH_{2})_{3}N(CH_{3})_{2})_{2},
iminobis(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina,
1,4-bis(3-aminopropil)piperazina,
bis(propilamina)
(NH_{2}(CH_{2})_{3})_{2}NH, espermidina
y espermina, entre otros. Estos grupos están incorporados
preferiblemente a la sal biliar a través de uno de sus átomos de
nitrógeno.
En una realización diferente, el componente
permeabilizador de membrana de la invención es un péptido catiónico
anfipático. Los péptidos catiónicos anfipáticos son péptidos cuya
configuración nativa es tal que se considera que el péptido tiene
una cara catiónica y una cara hidrófoba neutra. En una realización
preferida, el péptido es un péptido cíclico. Son ejemplos de los
péptidos cíclicos catiónicos anfipáticos de esta invención
gramicidina S, y las tirocidinas. El péptido puede contener también
algunos o todos los aminoácidos en configuración D, en oposición a
la configuración L que tiene lugar naturalmente. La estructura
química de la gramicidina S se muestra a continuación.
En una realización particularmente preferida, el
elemento permeabilizador de membrana incluye, además de los péptidos
cíclicos catiónicos anfipáticos, (1) un lípido o (2) una poliamina
simple, o ambos.
El lípido de la invención es una molécula
anfipática que es capaz de formación de liposoma, y es
sustancialmente no tóxica cuando se administra en las
concentraciones necesarias en forma nativa o como liposomas. Los
lípidos adecuados tienen generalmente un extremo polar o hidrófilo
y un extremo no polar o hidrófobo. Los lípidos adecuados incluyen
sin limitación fosfatidilcolina de huevo (EPC),
fosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC),
colesterol (Chol), colesterilfosforilcolina,
3,6,9-trioxaoctan-1-ol-colesteril-3-ol,
dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y otros derivados de
hidroxicolesterol o aminocolesterol (véase, por ejemplo, Patel,
K.R. et al., Biochim. Biophys. Acta 814: 256 (1985)). El
lípido se añade preferiblemente en forma de liposomas y la
poliamina añadida es preferiblemente espermina o espermidina.
Los elementos permeabilizadores de membrana, el
péptido cíclico y el fosfolípido y la poliamina opcionales pueden
añadirse a la composición simultánea o consecutivamente.
Preferiblemente, el péptido cíclico se añade primero, y el
fosfolípido o la poliamina después. La relación en moles de pétido
cíclico a poliamina añadidos es preferiblemente de alrededor de 1:1
a aproximadamente 1:3. La relación en moles de péptido cíclico a
fosfolípido añadidos es preferiblemente de alrededor de 1:1 a
aproximadamente 1:20.
El elemento de localización subcelular de este
sistema es una molécula capaz de reconocer un componente subcelular
en una célula fijada como objetivo, enlazada covalentemente con un
resto que se asocia a ADN por métodos convencionales como se
describe después. Los componentes subcelulares particulares incluyen
el núcleo, ribosomas, mitocondrias y cloroplastos.
En una realización preferida de esta invención,
el componente de localización subcelular es un componente de
localización nuclear. Los componentes de localización nuclear
incluyen péptidos conocidos de secuencias de aminoácidos definidas,
y secuencias más largas que contienen estos péptidos. Una secuencia
de péptido conocida es el heptapéptido antígeno T grande de SV40
pro-lys-lys-lys-arg-lys-val
(SEC ID NO:1). Otros péptidos incluyen el decapéptido de
nucleoproteína del virus de la gripe
ala-ala-phe-glu-asp-leu-arg-val-leu-ser
(SEC ID NO:4), y el segmento de proteína de adenovirus E1a
lys-arg-pro-arg-pro
(SEC ID NO:5). Otras secuencias pueden percibirse de Dingwall et
al. (Dingwall, C. et al., TIBS 16: 478 (1991)).
En otra realización, el componente de
localización subcelular es un componente de localización
lisosómica. Un componente conocido para fijar como objetivo al
lisosoma es un péptido que contiene el segmento
lys-phe-glu-arg-gln
(SEC ID NO:6).
En otra realización todavía, el componente de
localización subcelular es un componente de localización
mitocondrial. Un componente conocido para fijar como objetivo
mitocondrias es un péptido que contiene la secuencia
met-leu-ser-leu-arg-gln-ser-ile-arg-phe-phe-lys-pro-ala-thr-arg
(SEC ID NO:7). No obstante, también son adecuados otros componentes
o agentes de localización subcelular.
El resto que se asocia a ADN de este sistema se
refiere a una porción de un componente funcional que interactúa de
manera no covalente con ácidos nucleicos. El resto está enlazado
covalentemente al excedente del componente funcional por medios
convencionales o como se describe después. Los restos que se asocian
a ADN son preferiblemente aglomerantes de ranura principal y
pequeña, intercaladores de ADN o aglomerantes de ADN generales. En
el caso de polinucleótidos de cadena sencilla, el resto que se
asocia a ADN puede ser incluso la cadena enlazadora como se ha
descrito antes. En tal caso, el resto funcional, tal como el
componente de reconocimiento de célula o localización subcelular,
está enlazado covalentemente a la cadena enlazadora.
En una realización preferida, el resto que se
asocia a ADN es un aglomerante de ranura principal o pequeña. Los
aglomerantes de ranura principal y pequeña son restos conocidos por
asociarse o "meterse dentro de" la ranura principal o pequeña
de ADN. Estos aglomerantes incluyen distamicina A y el colorante de
Hoechst 33258.
En otra realización, el resto que se asocia a ADN
es un aglomerante de ADN no específico tal como un policatión. Los
policationes de esta invención incluyen polilisina, poliarginina,
poli(lisina-arginina) y polipéptidos
similares, y las poliaminas y los dendrímeros policatiónicos.
En otra realización preferida, el resto que se
asocia a ADN es un intercalador de ADN. Los intercaladores de ADN
son moléculas policíclicas planas tales como bromuro de etidio,
acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y
N-metil-2,7-diazapirenio,
y derivados de ellos. En una realización particular preferida, el
intercalador es un dímero consistente en dos moléculas policíclicas
planas enlazadas covalentemente. Un resto dímero policíclico plano
de esta invención tiene la fórmula química
en la
que
Z es un enlace;
n y m son independientemente un número entero de
1 a 20;
p es un número entero de 0 a 20; y
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan
independientemente del grupo constituido por bromuro de etidio,
acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y
N-metil-2,7-diazapirenio,
y derivados de ellos, entre otros.
Los valores de n y m son importantes porque
determinan el espaciamiento de los monómeros de acridina
intercalados en el ADN. Los valores más preferidos de n y m son 3 y
4, respectivamente. Se prefieren dímeros de
bis-acridina en los que Ar_{1} y Ar_{2} son
ambos acridina.
Este resto que se asocia a ADN preferido puede
estar incorporado covalentemente a un resto funcional, tal como un
resto de reconocimiento de célula, un resto de localización
subcelular o un resto permeabilizador de membrana como se ha
descrito antes. El valor de p determina la separación del
intercalador del resto funcional. Los valores preferidos de p son
de 0 a 8.
El resto que se asocia a ADN puede incorporarse
covalentemente a copias múltiples de un, o más de un, resto
funcional. Por ejemplo, puede incorporarse un dímero de
bis-acridina a tres residuos de galactosa que se
unen al receptor de asialoglicoproteína de hepatocito.
Un método preferido para incorporar el dímero que
se asocia a ADN al resto funcional implica un precursor que tiene la
fórmula química
en la
que
n y m son independientemente un número entero de
1 a 20;
p es un número entero de 0 a 20; y
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan
independientemente del grupo constituido por bromuro de etidio,
acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y
N-metil-2,7-diazapirenio,
y derivados de ellos; y
X es un grupo reactivo seleccionado del grupo
constituido por N-hidroxisuccinimida, maleimida,
maleimidofenilo, disulfuro de piridilo, hidrazida y
fenilglioxal.
En una realización preferida, Ar_{1} y Ar_{2}
son acridina, p es 3 y X es p-maleimidofenilo. Este resto
intercalador se acopla después al resto funcional a través de un
grupo sulfhidrilo en el resto funcional, por ejemplo, para obtener
un componente bifuncional que tiene la fórmula química
en la
que
Y es un componente funcional;
n y m son independientemente un número entero de
1 a 20;
p es un número entero de 0 a 20;
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan
independientemente del grupo constituido por bromuro de etidio,
acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y
N-metil-2,7-diazapirenio,
y derivados de ellos; y
X es un grupo reactivo seleccionado del grupo
constituido por N-hidroxisuccinimida, maleimida,
maleimidofenilo, disulfuro de piridilo, hidrazida y
fenilglioxal.
También pueden usarse enlazadores biodegradables
tales como péptidos que tienen el segmento de aminoácidos
-lys-lys- para incorporar el componente funcional al
intercalador.
En otra realización todavía de esta invención, el
dímero policíclico plano tiene la fórmula química en la que
en la
que
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan
independientemente del grupo constituido por bromuro de etidio,
acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina y
N-metil-2,7-diazapirenio,
y derivados de ellos;
cada aa es independientemente un aminoácido;
x y z son números enteros seleccionados
independientemente de 1 a 100;
y es un número entero de 0 a 5;
aa_{1} y aa_{2} son residuos de lisina; y
N^{1} y N^{2} son nitrógenos de los grupos
\varepsilon-amino de los residuos de lisina
aa_{1} y aa_{2}.
La composición de la invención se utiliza
convenientemente para introducir un polinucleótido en una célula
eucariota poniéndolo en contacto con la célula. La introducción del
polincleótido en la célula eucariota puede conseguirse in
vitro e in vivo. In vivo, la composición puede
administrarse en una cantidad que comprende aproximadamente 0,5
\mug a 20 mg del polinucleótido, y más preferiblemente alrededor
de 2,5 \mug a 10 mg del polinucleótido. No obstante, pueden
administrarse también otras cantidades. El presente método es
adecuado para introducir polinucleótidos en células de plantas o
animales, incluyendo células humanas, in vitro e in
vivo.
El sistema de cesión de polinucleótido de la
invención es útil en un contexto terapéutico. En aplicaciones
terapéuticas, la composición de la invención puede formularse para
una variedad de modos de administración, incluyendo administración
sistémica y tópica o localizada. Pueden encontrarse en general
técnicas y formulaciones en Remington's Pharmaceutical Sciences,
Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
La composición de la invención se administra
típicamente por vías oral, transdérmica, sistémica o de
inhalación.
Para administración sistémica, se prefiere la
administración parenteral tal como inyección, incluyendo
intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para
tratar trastornos del pulmón, la administración del sistema de
cesión de polinucleótido puede hacerse por inhalación o por
instalación del sistema directamente en el pulmón.
Para inyección, la composición de la invención
puede formularse en forma de una solución líquida, preferiblemente
en tampones compatibles fisiológicamente tales como solución de
Hank o solución de Ringer, entre otros. Además, la composición
puede formularse también en forma sólida y venderse y transportarse
en esta forma, y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de
usar. También se incluyen dentro de los confines de la invención
formas liofilizadas. La forma sólida puede administrarse también
directamente mediante un polvo seco en los pulmones, piel, tracto
gastrointestinal o músculo.
La administración sistémica de la presente
composición también puede hacerse por medios transmucósicos o
transdérmicos, o los sistemas pueden administrarse oralmente, o a
través de aerosoles intranasales o inhalados. Para administración
transmucósica o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes
apropiados para la barrera a permear. Tales penetrantes son
conocidos generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para
administración transmucósica sales biliares y derivados de ácido
fusídico. Además, pueden usarse también detergentes para facilitar
la permeación. Pueden usarse también medios físicos tales como
impacción a alta velocidad para facilitar la penetración de la capa
exterior de la piel para posicionar el complejo en la epidermis. La
administración transmucósica puede conseguirse a través de
pulverizaciones nasales, por ejemplo, o por medio de
supositorios.
Para administración oral, la composición de la
invención puede formularse en formas de asdministración oral
convencionales tales como cápsulas, pastillas y tónicos.
Para administración tópica, los sistemas de la
invención se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como
se conoce generalmente en la técnica. La administración tópica o
transdérmica puede realizarse mediante administración por impacción
a alta velocidad a la superficie de la piel. No obstante, también
son adecuados otros medios de administración transdérmica o
tópica.
Habiendo descrito ahora en general esta
invención, se entenderá mejor la misma mediante referencia a ciertos
ejemplos específicos, que se incluyen aquí sólo con fines de
ilustración y no pretenden ser limitativos de la invención o
cualquier realización de ella, salvo que así se especifique.
(no
reivindicado)
Para encontrar mejores alternativas definidas
químicamente a los polímeros poliaminas tales como polilisina, se
emplearon las macromoléculas de policatión ramificado hidrófilo
también conocidas como micropartículas de dendrímero Starbust®
(Tomalia et al., supra) para formar un complejo con
ADN o con ADN y el péptido anfipático permeabilizador GALA
(Parente, R. et al., Biochemistry 29: 8720 (1990)). El
complejo se preparó diluyendo 12 \mug de plásmido pCLuc4 en 660
\mul de HBS (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) en un tubo de
poliestireno. Se disolvió polilisina (Sigma Chemical Co.) o
micropartículas de dendrímero Starbust® de la quinta generación (1
nmol) (Polysciences, Inc.) en 340 \mul de HBS y se añadió
lentamente (gota a gota) a la solución de ADN. En estas
condiciones, las cargas positivas de los grupos amino epsilon de
las polilisinas o de las aminas periféricas de los dendrímeros
están en un exceso de 1,3 veces sobre las cargas negativas de los
plásmidos. Cuando se añadió el péptido GALA, se añadió de tal
manera que las cargas negativas en GALA neutralizaban las cargas en
exceso en el dendrímero. La mezcla se dejó reposar durante 30
minutos tras la última adición a temperatura ambiente y se
añadieron después 500 \mul de la mezcla a células
CV-1. El método de transfección se realizó como se
ha descrito antes. En este experimento, el mejor método de
transfección se logró con el complejo
GALA-dendrímero-ADN, seguido por el
dendrímero-ADN y después por
polilisina-ADN. Los resultados se muestran en la
siguiente tabla.
Se obtuvieron polímeros en cascada PAMAM
sintetizados a partir de un núcleo iniciador de amoníaco (generación
2 a 10) de Polysciences, Inc. (Warrington, PA) y se designan como
dendrímeros Starbust®. Cuando se necesitaron, se concentraron
soluciones de dendrímero usando un sistema Savant SC110 Speed Vac.
Se obtienen resultados similares a los indicados aquí cuando el
polímero en cascada se sintetizó en el laboratorio de los
inventores usando el método de Tomalia et al. (Tomalia et
al., supra) pero partiendo de
tris(2-aminoetil)amina. Los
dendrímeros disponibles comercialmente deben analizarse en una
columna de permeación de gel calibrada para asegurarse de que el
material se ajusta al diámetro especificado, porque algunos lotes no
se ajustan a las especificaciones. Se obtuvo hidrobromuro de
poli(L-lisina) con una longitud de cadena
media de 115 residuos de lisina (pLys 115) de Sigma. Chemical Co.
(St. Louis, MO).
3-(2-Piridil)ditiopropionato de
N-succinimidilo (SPDP) se obtuvo de Pierce
(Rockford, IL).
GALAcystrp-glu-ala-ala-leu-ala-glu-ala-leu-ala-glu-ala-leu-ala-glu-his-leu-ala-
glu-ala-leu-ala-glu-ala-leu-glu-
ala-cys-ala-ala (SEC ID NO:8), un análogo que contiene cisteína del péptido anfipático GALA, se sintetizó en el UCSF Bioresources Center, se purificó y se analizó esencialmente como se ha descrito previamente para GALA (Subbarao et al., supra).
ala-cys-ala-ala (SEC ID NO:8), un análogo que contiene cisteína del péptido anfipático GALA, se sintetizó en el UCSF Bioresources Center, se purificó y se analizó esencialmente como se ha descrito previamente para GALA (Subbarao et al., supra).
DME: medio de Eagle modificado por Dulbecco.
EDTA: ácido etilendiaminatetraacético.
HBS: solución salinada tamponada con Hepes (Hepes
10 mM; NaCl 150 mM; pH 7,3).
HEPES:
N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido
2-etanosulfónico).
MEM: medio de Eagle esencial mínimo.
MTT: bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio.
TRIS:
tris(hidroximetil)aminometano.
PAMAM SD54 y SD68: dendrímero poliamidoamina
Starbust® de 54 \ring{A} y 68 \ring{A} de diámetro.
PLys115: poli(L-lisina),
longitud media de cadena 115 monómeros.
El dendrímero PAMAM de la 5ª generación (54
\ring{A} de diámetro, SD54) se modificó según el siguiente Esquema
2.
Esquema
2
El dendrímero (66 \mumoles de aminas
terminales, 15 mg) en 0,5 ml de agua se diluyó con 0,75 ml de tampón
fosfato 0,1 M (pH 8,0) y se añadieron gota a gota 0,75 ml de una
solución 15 mM de SPDP en etanol. La mezcla de reacción se agitó
durante 1 h bajo argón y se fraccionó en una columna Biogel P2 (2,8
x 20 cm) eluida con tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Las fracciones
que contenían dendrímeros modificados con
3-(2-piridiltio)propionato
(PDP-SD54 con una media de 16 grupos ditiopiridina
por partícula) se agruparon entre sí y se concentraron hasta un
volumen final de 3 ml.
Un mililitro de una solución 10 mM de GALAcys
(SEC ID NO:8) en un tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2) se añadió gota a
gota a 1 ml de la solución concentrada de PDP-SD54.
La mezcla se agitó durante la noche bajo argón y el conjugado de
GALA se purificó fraccionando la mezcla de reacción en una columna
Sephadex® G75-120 (2 x 90 cm) calibrada (juego de
calibración Sigma MW-GF-70 que
contiene aprotinina (66.000) y azul dextrano (2.000.000)), y se
eluyó la columna con tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Las fracciones
que contenían el conjugado, que eluyeron con un peso molecular
aparente de aproximadamente 50.000, se agruparon, concentraron y
dializaron frente a HBS (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3). El
material dializado se diluyó con HBS hasta 1 mg de dendrímero/ml y
se sometió a filtración estéril a través de una membrana Millipore
de 0,45 \mum.
Los plásmidos pCLuc4 que codifican luciferasa de
luciérnaga y pCMV-\betaGal que codifica
\beta-galactosidasa fueron obsequios generosos del
Dr. Cotten, M. (Institute of Molecular Pathology, Viena, Austria) y
el Dr. Mc Gregor, G. (Howard Hughes Medical Institute, Houston, TX)
respectivamente (De Wet, J.R. et al., "Firefly Luciferase
Gene: Structure and Expression in Mammalian Cells", Mol. Cell
Biol. 7:725 (1987); Mc Gregor, G.R. y Caskey, C.T., "Construction
of Plasmids that Express E. Coli
\beta-galactosidase in Mammalian Cell Lines",
Biotech. 7:1116 (1989)). Los plásmidos se desarrollaron en
Escherichia coli, se extrajeron por la técnica de lisis alcalina y
se purificaron por centrifugación en gradientes de CsCl de
equilibrio. La pureza de los plásmidos se comprobó por
electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y se determinó la
concentración de ADN a partir de la absorbancia a 260 nm.
Se hizo un complejo típico diluyendo 6 \mug de
ADN plásmido en 330 \mul de HBS en un tubo de poliestireno. El
policatión y/o su derivado GALA-funcionalizado
(2-160 \mug) se diluyeron en 170 \mul de HBS y
se añadieron gota a gota al ADN. Cuando se completó la adición, la
solución se mezcló suavemente. Se mostró la formación del complejo
policatión-ADN por un ensayo de retardo de gel; se
sometieron a electroforesis muestras (30 \mul) a través de un gel
de agarosa al 0,8% usando un sistema de tampón
Tris-acetato-EDTA (pH 8,0) y se
visualizó ADN usando coloración con bromuro de etidio.
Los linajes celulares adherentes
CV-1 (fibroblasto de mono), HeLa (carcinoma humano)
y HepG2 (hepatoma humano) se proporcionaron por la instalación de
cultivos de células UCSF. Las células se pusieron en placa con una
densidad de aproximadamente 5 x 10^{5} células por placa de
cultivos de 60 mm (Falcon) en 3 ml de DME-H21 que
contenía 10% de FCS y antibióticos (penicilina 100 unidades/ml y
estreptomicina 100 \mug/ml). Se desarrollaron las células hasta
semiconfluencia a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 5%
de CO_{2}. En un experimento típico, se transfectaron las células
en 1,5 ml de medio sin suero por adición de 0,5 ml de HBS que
contenía 6 \mug de plásmido acomplejado con la cantidad indicada
de policatión. El medio se separó 5 h más tarde y se sustituyó por
medio reciente que contenía 10% de FCS. Las células se cultivaron
durante períodos de 24 o 48 h adicionales, y se ensayó en ellas la
expresión de gen informador.
Los linajes celulares en suspensión
K-562 (eritroleucemia humana), EL-4
(linfoma de ratón) y Jurkat (células T humanas) se obtuvieron de la
instalación de cultivos de células UCSF y se desarrollaron en RPMI
1640 que contenía 10% de FCS y antibióticos. Para el experimento de
transfección, se introdujeron 1,2 x 10^{6} células en 1,5 ml de
RPMI 1640 que contenía 7,5% de FCS en cada pocillo de una placa de
6 pocillos o se hicieron girar en tubos de polipropileno y se
transfectaron con 6 \mug de ADN como se ha descrito antes. Se
transfirieron las células 5 h más tarde a medio reciente que
contenía 10% de FCS. Esto se consiguió después de centrifugar la
placa o los tubos (1.200 rpm durante 5 min) y separando el 90% del
medio de transfección y sustituyéndolo por medio precalentado
reciente. Las células se cultivaron durante períodos de 24 ó 48 h
adicionales, y se ensayó en ellas la expresión de gen
informador.
Se obtuvieron hepatocitos de rata recién aislados
del Dr. Bissel, M. (Liver Center, UCSF) y se pusieron en placa con
una densidad de 2 x 10^{6} células por placa de cultivo de 60 mm
en 3 ml de un medio de hepatocitos compuesto por 75% de MEM y 25%
de medio de Waymouth que contenía 10% de FCS, insulina (10
\mug/ml), transferrina (10 \mug/ml), dexametasona (1 \muM) y
antibióticos (penicilina: 100 unidades/ml; estreptomicina: 100
\mug/ml y gentamicina: 25 \mug/ml). Se desarrollaron las
células a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 5% de
CO_{2}, y se transfectaron 5 a 6 h más tarde como se ha descrito
antes con 6 \mug de plásmido en 2 ml de medio de hepatocitos que
contenía 2% de FCS. Tras un período de incubación durante la noche,
se retiró el medio de transfección y se sustituyó por 3 ml de medio
de hepatocitos reciente que contenía 2% de FCS. Las células se
cultivaron adicionalmente durante 24 h y se ensayó en ellas la
expresión de gen informador.
La expresión del gen de
\beta-galactosidasa se detectó 24 h después de la
transfección por coloración histoquímica de las células usando
X-Gal (Lim, K. Y Chase, C.-B., supra). La
expresión del gen informador de luciferasa se cuantificó 48 h
después de la transfección en lisados de células midiendo la
emisión de luz con un bioluminómetro (Analytical bioluminiscence,
San Diego, CA) en presencia de luciferina y ATP (Brasier, A.R.
et al., "Optimized use of the Firefly Luciferase Assay as
a Reporter Gene in Mammalian Cell Lines", Biotech. 7:1116
(1989)).
Los efectos de los polímeros en cascada sobre el
crecimiento de células se valoraron midiendo el contenido de
proteína total después de la transfección así como usando un ensayo
de reducción de colorante colorimétrico (Mosmann, T.R., "Rapid
Colorimetric Assay for cellular Growth and Survival: Application to
Proliferation and Cytotoxycity Assays", J. Immunol. Methods 65:55
(1983)). Se comparó el efecto del dendrímero de 6ª generación (68
\ring{A} de diámetro, SD68) con el efecto de polilisina
(pLys115). Los policationes se añadieron a las células con o sin
ADN plásmido en una relación de 10 aminas terminales del policatión
por nucleótido. Se pusieron las células en placa con una densidad de
aproximadamente 5 x 10^{4} células por pocillo en 300 \mul de
DME H-21 en bandejas de 96 pocillos. Después de un
cultivo durante la noche a 37ºC en una atmósfera humidificada del
5% de CO_{2}, se icubaron las células en triplicados con 200
\mul de medio exento de suero que contenía de 0 a 60 \mug de
pLys 115 o SD68. Después de 5 h, se sustituyó el medio por 200
\mul de DME H-21 reciente que contenía 10% de FCS
y se cultivaron las células durante 48 h más. Después, se añadieron
por pocillo 10 \mul de bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT, 5 mg/ml) y se dejó reaccionar durante 2 h a 37ºC. Se añadió
solución solubilizante (HCl 0,4 N en isopropanol, 200 \mul) y se
incubó la placa durante 30 min a temperatura ambiente. Se midió la
absorbancia a 570 nm usando un lector de placas automático ELISA
(MR 700, Dynatech Laboratories, Inc.) y se corrigió por la
absorbancia de fondo obtenida en células tratadas con hidrocloruro
de guanidio 6 M (100% muerte). Los resultados se expresaron como %
de reducción en la viabilidad de células =
{{1-[OD_{570}(células
tratadas)-fondo]/[OD_{570} (células no
tratadas)-fondo]} x 100.
Se usó el dendrímero para incorporar grupos
funcionales a polinucleótidos tales como ADN para crear vehículos de
cesión de genes. El dendrímero PAMAM de 5ª generación se enlazó a
GALAcys (SEC ID NO:8), un análogo que contiene cisteína del péptido
anfipático GALA, usando química de acoplamiento SPDP estándar
(Carlsson, J. et al., "Protein Thiolation and Reversible
Protein-Protein Conjugation.
N-Succinimidyl
3-(2-pyridylthio)Propionate, a New
Heterobi-functional Reagent", Biochem. J. 173:723
(1978)) como se muestra en la siguiente Tabla 1.
Modificado de la referencia de Tomalia et
al.
El dendrímero se funcionalizó sucesivamente con
el reactivo heterobifuncional SPDP y se hizo reaccionar con un
exceso de GALAcys (SEC ID NO:8). El conjugado resultante se eluyó de
una columna Sephadex® G75-120 calibrada con un peso
molecular aparente de aproximadamente 50.000 Daltons. Esto sugiere
la presencia de aproximadamente 10 residuos de GALA por dendrímero.
Se cuantificó una media de 13 residuos de GALA por dendrímero
usando un coeficiente de extinción molar para triptófano de
\varepsilon_{280 nm} = 5570 M^{-1} cm^{-1} (pH 7,5). Puesto
que GALA contiene 8 cargas negativas por péptido, muchas de las
aminas no modificadas en los conjugados se neutralizan
probablemente a pH 7,4. Esto está justificado por la unión débil
del conjugado GALA-dendrímero a ADN (véase
después).
Se incubaron muestras (30 \mul) de complejos de
policatión-pCMV-\betaGal durante
20 minutos y se sometieron a electroforesis a través de un gel de
agarosa al 0,8% usando un sistema de tampón de
Tris-acetato-EDTA (pH 8,0). Los
complejos se formaron mezclando 6 \mug de plásmido
pCMV-\betaGal diluido en 330 \mul de HBS con
los siguientes agentes en 170 \mul de HBS.
pista 1: pCMV-\betaGal
solo;
pista 2: 2 \mug de pLys115;
pista 3: 4 \mug de pLys115;
pista 4: 4 \mug de SD68;
pista 5: 6 \mug de SD68;
pista 6: 4 \mug de SD54 proporcionado por el
conjugado GALA-SD54;
pista 7: 160 \mug de SD54 proporcionado por el
conjugado GALA-SD54;
pista 8: 4 \mug de SD54 proporcionado por una
mezcla equimolar de SD54 y GALA- SD54.
Tras completarse la electroforesis, se coloreó el
gel con bromuro de etidio para visualizar ADN.
Los dendrímeros PAMAM se unen a ADN como se
demuestra por la retención del complejo en el punto de aplicación en
un gel de electroforesis de agarosa como se muestra en la Figura 1.
La polilisina (pistas 2 y 3) y el polímero en cascada (pistas 4 y
5) son capaces de retardar e inmovilizar el ADN en el gel. El
retardo del gel es un resultado de efectos electrostáticos y
estéricos y sugiere la formación de un complejo de carga entre los
dendrímeros cargados positivamente y el ADN aniónico. Puesto que
las aminas terminales del dendrímero tienen menor pK_{a} que
\varepsilonNH_{2} de lisina (véase discusión), el dendrímero
era ligeramente menos eficaz para inducir retardo de gel que la
polilisina como se muestra en la Figura 1. Con polilisina, se
observó la retención total del plásmido en una relación de
\varepsilonNH_{2} a nucleótido de 1:1 (pista 3), mientras que
con el dendrímero, la retención total tuvo lugar con una relación
de NH_{2} terminal a nucleótido de aproximadamente 1,5:1 (pista
5). La relación exacta de retención total varió por un factor de
dilución entre experimentos. El conjugado
GALA-dendrímero no inmovilizó el ADN y afectó sólo
ligeramente a la migración del plásmido incluso cuando se usó en
gran exceso sobre el ADN (pistas 6 y 7). Una combinación de
conjugado GALA-dendrímero y dendrímero sin
modificar (relación 1:1, como se usó en los ensayos de
transfección) retuvo parcialmente al plásmido (pista 8).
Se transfectaron por duplicado células
CV-1 (500.000 células por placa de 60 mm) con
cantidades crecientes de pCLuc4 (0,1 a 6 \mug) acomplejado a SD68.
En la Figura 3, los complejos se formaron añadiendo el dendrímero
disuelto en 170 \mul de HBS al ADN en 330 \mul de HBS;
(\Box), se formaron primero complejos añadiendo 25 \mug de SD68
en 6 \mug de pCLuc4 y se diluyeron después en HBS hasta la
cantidad indicada de ADN; (\circ), el plásmido se diluyó primero
en HBS y se añadieron 25 \mug de SD68; (\Delta), se añadió un
plásmido que no contenía luciferasa al plásmido pCLuc4 diluido para
mantener la cantidad total de ADN constante en 6 \mug/330 \mul y
se añadieron después 25 \mug de SD68. La expresión de luciferasa
se midió 48 h después de la transfección como se describe en la
siguiente Tabla 2. Cada valor es la media \pm intervalo de
determinaciones duplicadas.
Un hallazgo inesperado de este trabajo es que los
polímeros en cascada PAMAM pueden por sí mismos transfectar ADN (por
ejemplo, plásmidos que codifican genes informadores) en células en
cultivo. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 2 y en
las Figuras 2 a 4.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}{145mm}a: Recuperación de proteína celular en
comparación con células no tratadas (sin indicación = 100% de
recuperación).\end{minipage} \cr \begin{minipage}{145mm}Se
muestra actividad de luciferasa en las células transfectadas
(unidades de luz por mg de proteína celular) como media \pm
intervalo de duplicados.\end{minipage} \cr
\begin{minipage}{145mm}Cuando la transfección fue tóxica, la
recuperación porcentual de proteína celular en células
transfectadas en comparación con células no transfectadas se indica
entre
corchetes.\end{minipage} \cr}
La actividad de transfección fue particularmente
alta cuando se usó un exceso de aminas terminales a nucleótido. Para
definir los parámetros que controlan la cesión de genes y la
expresión por los dendrímeros, se transfectaron células
CV-1 con complejos de
pCLuc4-dendrímero y se midió la expresión de
luciferasa en función del diámetro y la cantidad de dendrímero en
el complejo (véase anterior Tabla 2). La transfección fue sensible
a ambos factores. Una alta expresión de luciferasa requirió un
exceso de policatión. Con una baja entrada de dendrímero ([aminas
primarias de dendrímero]=[nucleótidos]) sólo se transfectaron
escasamente las células por los complejos.
En el intervalo de concentración ensayado, los
dendrímeros de diámetro grande (\diameter = 40 nm) mediaron
mejores eficacias de transfección que los más pequeños. La
expresión de luciferasa aumentó 2 ó 3 órdenes de magnitud cuando se
incrementó el diámetro del dendrímero formador de complejo de 40
\ring{A} (generación 4) a 54 \ring{A} (generación 5). Esto
puede apreciarse mejor examinando los datos en un gráfico
tridimensional (véase Figura 2). Se obtuvieron niveles máximos de
transfección (= 10^{10} LU/mg de proteína celular) con el
dendrímero de la 6ª generación (SD68, diámetro 68 \ring{A}) con
una relación de 6 aminas primarias por nucleótido. Con estas
condiciones, la expresión de luciferasa en células
CV-1 fue aproximadamente 1.000 veces mayor que la
obtenida con una cantidad equivalente de polilisina 115 (véase
anterior Tabla 2) y 100 veces mayor que la obtenida con el lípido
catiónico DOTMA (Legendre, J.Y. y Szoka, F.C., "Delivery of
Plasmid DNA into Mammalian Cell Lines using
pH-Sensitive Liposomes: Comparison with Cationic
Liposomes", Pharm. Res. 9:1235 (1992)).
Las condiciones optimizadas se ensayaron en 10
experimentos separados en células CV-1, y se
obtuvieron actividades de luciferasa entre 2 x 10^{9} y 3 x
10^{10} LU/mg de proteínas celulares. Cuando se transfectan
células CV-1 con dendrímero en medio que contiene
10% de FCS, disminuyó la expresión de luciferasa en aproximadamente
dos veces, mientras que la expresión disminuyó 50 veces en el caso
de DOTMA (Legendre et al., supra).
Se construyó una respuesta a la dosis de la
actividad de luciferasa frente a entrada de ADN con una relación
constante de aminas terminales/nucleótido de 6:1 usando el
dendrímero de diámetro 68 \ring{A} (SD68), y se muestra en la
Figura 3. Cuando se formó primero el complejo y se diluyó después
hasta la cantidad indicada de plásmido pCLuc4, se observó una
disminución lineal de la expresión de luciferasa (véase Figura 3).
Si se usó plásmido que no contiene luciferasa para diluir el
plásmido de luciferasa y el dendrímero añadido, también disminuyó
la actividad de transfección de manera lineal. Cuando se diluyó
primero el plásmido y se añadió una cantidad constante de
dendrímero, la relación dendrímero/plásmido aumenta en este caso con
la dilución del plásmido pCLuc4 y disminuyó la actividad de
transfección en mayor medida (véase Figura 3).
Cada tipo de célula examinado en este estudio
podría transfectarse con dendrímero PAMAM-plásmido
en condiciones de aminas terminales en exceso sobre nucleótidos,
incluyendo células adherentes y en suspensión así como cultivos
primarios y linajes establecidos (Figura 4A). Se estudió también la
eficacia de transfección del complejo optimizado usando el plásmido
pCMV-\betaGal. Se detectó la actividad de
\beta-galactosidasa por una coloración histoquímica 24 h
después de la transfección y se enumeraron las células
transfectadas. Estos datos se indican como el porcentaje al final de
la barra en el gráfico (véase Figura 4A). Los diferentes tipos de
células estudiados diferían en su capacidad para experimentar
transfección (hasta el 80% de transfección en CV-1,
menos del 1% de transfección en EL-4 y Jurkat). Esta
variabilidad es una propiedad general compartida por todos los
sistemas de cesión de genes; no se entiende todavía la razón para
tal transfección variable entre diferentes tipos de células.
Con la entrada de dendrímero más baja, la
eficacia de transfección de los complejos de
dendrímero-ADN se redujo drásticamente (véase
Figuras 4A y 4B). Una actividad de transfección reducida con
relaciones aminas terminales/nucleótido más bajas es similar a los
resultados observados con polilisinas. Así, se examinó la
posibilidad de que tratamientos que pueden aumentar la transfección
mediada por policationes lineales puedan aumentar la transfección
mediada por dendrímero. La transfección fue esencialmente
insensible a cloroquina (datos no mostrados), pero aumentó
significativamente cuando se incorporó al dendrímero péptido
fusogénico GALA (véase Figura 4B).
Se han explotado los efectos rompedores de
endosoma de partículas víricas inactivadas y de péptidos fusogénicos
víricos para iniciar o aumentar la transferencia de genes mediada
por polilisina (Wagner, E. et al., "Coupling of Adenovirus
to Transferrin-polylysine/DNA Complexes Greatly
Enhances Receptor-Mediated Gene Delivery and
expression of Transfected Genes", PNAS (EE.UU.) 89:6099 (1992);
Wagner, E. et al., "Influenza Virus Hemagglutinin
HA-2N-terminal Fusogenic Peptides
Augment Gene Transfer by Transferrin-polylysine/DNA
Complexes: Toward a Synthetic Virus-Like
Gene-Transfer Vehicle", PNAS (EE.UU.) 89:7934
(1992)). Se diseñó el péptido GALA de 30 aminoácidos para
desestabilizar bicapas de lípidos de manera sensible al pH hasta
propiedades miméticas de proteínas fusogénicas víricas (Subbarao,
N.K. et al., supra). Se incorporó aquí GALA al
dendrímero para ensayar si aumentaría la transfección como lo hacen
las partículas víricas o los péptidos fusogénicos víricos. Con una
relación aminas terminales:nucleótido baja, la eficacia de
transfección de los complejos de dendrímero-ADN fue
baja. Sin embargo, la transfección mejoró significativamente cuando
se sustituyó el 50% del dendrímero en el complejo por su
GALA-conjugado (véase Figura 4B). En estas
condiciones, el conjugado puede funcionar con una baja relación
dendrímero/plásmido (aproximadamente 50:1 en estos experimentos). En
el caso de algunos tipos de células, tales como K562, el
GALA-conjugado era tan eficaz como cuando se empleó
un exceso de dendrímero para transfección (véanse Figuras 4A y 4B).
Estos resultados indican que GALA aumenta la transfección,
probablemente catalizando la infiltración del endosoma. Con una
entrada de dendrímero en la que la transfección fue máxima, no se
aumentó adicionalmente la expresión por GALA. Esto puede ser debido
a que los dendrímeros presentan efectos lisosomotróficos.
Un índice de la toxicidad del procedimiento de
transfección es la cantidad de proteína celular obtenida de los
cultivos tras la transfección. Los tratamientos que produjeron una
disminución del rendimiento de proteína celular cuando se comparó
con células no tratadas, se indican entre corchetes en la anterior
Tabla 2. En general, la citotoxicidad inducida por
dendrímero-ADN parecía estar controlada por los
tres siguientes parámetros principales.
- 1)
- El diámetro del dendrímero.
- 2)
- La cantidad añadida.
- 3)
- Si estaba presente o no ADN.
El último factor puede apreciarse mejor
comparando la toxicidad del dendrímero SD68 con la de polilisina
115 en células CV-1 en presencia y ausencia de ADN
plásmido (véase Figura 12). La citotoxicidad total de SD68 era baja
comparada con la de pLys115. En ausencia de ADN, la LD_{50} de
pLys 115 en células CV-1 era 25 \mug/ml mientras
que la LD_{50} de SD68 era mayor de 300 \mug/ml. En presencia
de ADN plásmido (relación de aminas primarias de
policatión:nucleótido 10:1), la citotoxicidad de pLys115 no fue
afectada, mientras que la de SD68 aumentó (LD_{50} de
SD68-ADN = 100 \mug/ml) pero era aún
significativamente más baja que la de pLys115.
Cuando se utilizaron condiciones de transfección
optimizadas, la concentración de SD68 fue 12,5 \mug/ml, un nivel
de dendrímero que indujo una disminución de aproximadamente el 35%
en la reducción de colorante (véase Figura 5), así como en la
recuperación de proteína celular (véase anterior Tabla 2). Según la
proteína celular recuperada al final del ensayo, la transfección con
complejos de SD68-ADN era razonablemente bien
tolerada por todos los diferentes tipos de células ensayados
(recuperación de proteína = 60%).
Los polímeros policatiónicos tales como
polilisinas se han usado extensamente para transferencia de genes a
células de animales (Felgner, P.L., Adv. Drug Delivery Rev. 5:163
(1990)). Los vectores basados en polilisina tienen una alta
capacidad de cesión, pero una transfección eficaz de las células
objetivo sólo tiene lugar en presencia de agentes rompedores de
endosoma o lisosomotróficos (Cotten, M. et al.,
"Transferrin-Polycation-Mediated
Introduction of DNA into Human Leukemic Cells: Stimulation by
Agents that Affect the Survival od Transfected DNA or Modulate
Transferrin Receptor Levels", PNAS (EE.UU.) 87:4033 (1990);
Cotten, M. et al., "High Efficiency Receptor- Mediated
Delivery of Small and Large (48kb) Gene Constructs Using the
Endosome Disruption Activity of Defective or
Chemically-Inactivated Adenovirus Particles",
PNAS (EE-UU.) 86:6094 (1992)). Los polímeros
policatiónicos de los Ejemplos 1 a 16 presentan la capacidad de
cesión combinada de las polilisinas y la capacidad de transfección
de un virus.
Los polímeros en cascada PAMAM usados aquí se
derivan de un núcleo de amoníaco y unidades
-CH_{2}CH_{2}CONH
CH_{2}CH_{2}N resultantes de adiciones sucesivas de acrilato de metilo y etilendiamina como se muestra en la anterior Tabla 2. La propagación de crecimiento por etapas controlado de esta estructura produce generaciones de polímeros crecientemente mayores con superficies precisas dimensionalmente y con un número definido de grupos superficiales (Tomalia, D.A. et al., supra). El diámetro de los dendrímeros de generación más alta es similar al diámetro del núcleo histona de cromatina (aproximadamente 70 \ring{A}) y puede actuar como un estrado para condensar el ADN (Richmond, T.J. et al., "Structure of the Nucleosome Core Particle at a 7 \ring{A} Resolution", Nature 311:532 (1984)). Así, los dendrímeros PAMAM difieren de las polilisinas en su bien caracterizada fórmula y estructura, su ramificación y la baja pK_{a} de sus aminas terminales (pK_{a} = 6,9) y aminas internas (pK_{a} = 3,9) (Tomalia, D.A. et al., supra).
CH_{2}CH_{2}N resultantes de adiciones sucesivas de acrilato de metilo y etilendiamina como se muestra en la anterior Tabla 2. La propagación de crecimiento por etapas controlado de esta estructura produce generaciones de polímeros crecientemente mayores con superficies precisas dimensionalmente y con un número definido de grupos superficiales (Tomalia, D.A. et al., supra). El diámetro de los dendrímeros de generación más alta es similar al diámetro del núcleo histona de cromatina (aproximadamente 70 \ring{A}) y puede actuar como un estrado para condensar el ADN (Richmond, T.J. et al., "Structure of the Nucleosome Core Particle at a 7 \ring{A} Resolution", Nature 311:532 (1984)). Así, los dendrímeros PAMAM difieren de las polilisinas en su bien caracterizada fórmula y estructura, su ramificación y la baja pK_{a} de sus aminas terminales (pK_{a} = 6,9) y aminas internas (pK_{a} = 3,9) (Tomalia, D.A. et al., supra).
La internalización de célula eficaz de ADN cuando
se asocia con policationes puede ser debida a una asociación tipo
cremallera de las cargas positivas en exceso del complejo de
policatión-ADN con grupos de la superficie celular
cargados negativamente. La interacción puede producir endocitosis
adsortiva y desestabilización de membrana, tal como se ha propuesto
por Behr para complejos de liposomas catiónicos-ADN
(Behr, J.P., "Synthetic Gene-Transfer Vectors",
Acc. Chem. Res. 26:274 (1993)). Realmente, las capacidades de unión
a ADN de polilisina y el dendrímero, estudiadas por retardo de gel,
son algo similares (véase Figura 1). Para aumentar la
desestabilización de membrana tras endocitosis, se incorporó al
dendrímero el péptido GALA desestabilizador de membrana.
Cuando se ensaya la cesión de plásmido y la
transfección, los dendrímeros PAMAM no modificados presentaron
características excelentes. Se vió que la eficacia de transfección
dependía del tamaño y cantidad del dendrímero en el complejo de
ADN-dendrímero. Más notablemente, se observó un
aumento drástico de transfección cuando se incrementó el diámetro
del dendrímero de 40 \ring{A} (generación 4) a 54 \ring{A}
(generación 5). La razón para este efecto de umbral no está todavía
clara pero puede estar relacionada con el diámetro y la estructura
del polímero. Aunque los dendrímeros PAMAM de generación 3 parecen
una estrella de mar, en la generación 5 tienen una forma esferoidal
de aproximadamente 54 \ring{A} de diámetro (Tomalia, D.A. et
al., supra). Esta forma esférica podría servir como
núcleo altamente estructurado para estrechar favorablemente al ADN,
tal como tiene lugar en la cromatina (Richmond, T.J. et al.,
supra). Alternativamente, la forma esférica puede ser más
eficaz para desestabilizar membranas que los dendrímeros de
generación más baja o los policationes lineales.
Los polímeros en cascada PAMAM difieren también
de las polilisinas en la pK_{a} de sus grupos amino primarios e
interiores (pK_{a} = 6,9, 3,9). Esta propiedad puede ser también
importante para la transfección. A pH fisiológico, los dendrímeros
PAMAM están sólo parcialmente protonados y deben presentar efectos
lisosomotróficos similares a las bases débiles (Stenseth, K y
Thyberg, J., "Monensin and Chloroquine Inhibit Transfer to
lysosomes of Endocytosed Macromolecules in cultured Mouse
Peritoneal Macrophages", Eur. J. Cell. Biol. 49:326 (1989)).
Además, los grupos amino terciario interiores, que constituyen la
ramificación del dendrímero, tienen una pK_{a} de 3,9 y podrían
contribuir también al efecto lisosomotrófico. Así, el dendrímero
sería capaz de tamponar la acidificación endosómica después de la
absorción celular del complejo. Las propiedades lisosomotróficas
putativas de los dendrímeros PAMAM puede explicar por qué se
requiere un exceso de dendrímeros para una alta transfección
mientras que un exceso de polilisinas no aumenta la transfección
(véase anterior Tabla 2). Los grupos amino de la cadena secundaria
(pK_{a} = 9 a 10) de la polilisina están fuertemente cargados a
pH neutro y no pueden tamponar la acidificación del endosoma. Esto
es apoyado por la observación de que la eficacia de transfección
del complejo de dendrímero-ADN no se aumenta por
cloroquina (datos no mostrados). La eficacia de transfección de los
complejos de polilisina-ADN, por otra parte, se
mejora drásticamente en presencia de cloroquina (Cotten, M. et
al. (1990), supra).
El complejo compuesto por ADN plásmido y SD68 en
una relación de 6 aminas terminales de SD68 por nucleótido presentó
la mejor actividad de transfección. En estas condiciones óptimas,
hay aproximadamente 320 partículas de SD68 por plásmido pCLuc4,
aunque todas las partículas de dendrímero pueden no estar
implicadas en complejos con ADN. Como se ha sugerido antes, el
dendrímero en exceso puede actuar como un agente lisosomotrófico.
Por encima de esta relación óptima, el sistema se hace menos
eficaz. El aumento de la cantidad de SD68 puede disminuir la
eficacia de transfección debido a la toxicidad asociada con el
complejo. Alternativamente, un aumento en la cantidad de complejo de
dendrímero no acomplejado puede competir con el
ADN-dendrímero por los lugares de unión putativos
en la superficie celular. Esto disminuiría el nivel de ADN asociado
a célula y de esta manera disminuir la eficacia de transfección.
Un aumento del diámetro del dendrímero, aún
manteniendo la relación 6:1, no aumentó la toxicidad, pero disminuyó
la eficacia de transfección. Cuando se observaron bajo el
microscopio óptico células expuestas a complejos de
dendrímero-ADN formados de dendrímero mayor que el
de la 6ª generación, presentaban grandes vacuolas
intracitoplásmicas. Estas vacuolas de tamaño no se observan en
células tratadas con complejos formados de dendrímeros de la 6ª o
generaciones inferiores. No está claro si las vacuolas están
relacionadas con las proporciones de transfección reducida
observadas.
Se examinó adicionalmente la toxicidad usando el
ensayo de reducción de colorante MTT. El dendrímero SD68 es muy
bien tolerado por las células, mucho mejor que cantidades
equivalentes de pLys115. La marcada diferencia de toxicidad entre
pLys115 y SD68 puede ser debida a una diferencia del estado de
ionización de las partículas. A pH fisiológico, la polilisina
soporta más cargas positivas que los dendrímeros, y debe tener una
interacción más fuerte con las membranas celulares. La toxicidad
del dendrímero aumentó significativamente en presencia de ADN
plásmido pero permaneció inferior que la de los complejos
correspondientes de polilisina-ADN.
El péptido GALA, un desestabilizador de membrana,
era capaz de aumentar significativamente la actividad de
transfección del complejo cuando estaba incorporado covalentemente
al dendrímero (véase Figura 4B). GALA es un desestabilizador de
membrana soluble en agua y su interacción dependiente del pH con
membranas ha sido bien estudiada (Subbarao, N.K. et al.,
supra); Parente, R.A. et al., "Association of a
pH-Sensitive Peptide with Membrane Vesicles: Role
of Amino Acid Sequence", Biochem. 29:8713 (1990) y referencias en
él). Se ha incorporado por otros péptidos con el motivo GALA a
anticuerpos para aumentar su retención e internalización de células
de tumores (Anderson, D.C. et al., "Enhanced in
Vitro Tumor Cell Retention and Internalization of Antibody
Derivatized with Synthetic Peptides", Bioconjugate Chem. 4:10
(1993)). El hecho de que los conjugados de
dendrímero-GALA mezclados con dendrímeros no
modificados en una relación 1:1 aumente la transfección muestra que
los dendrímeros son excelentes constituyentes de sistemas de
transfección altamente eficaces.
Los procedimientos de transfección basados en
dendrímeros Starbust® PAMAM constituyen métodos simples y eficaces
para transferencia de genes a células de animales. Los resultados
superiores obtenidos en una amplia variedad de células (véase
Figura 4) muestran que los dendrímeros PAMAM, por sí mismos, están
bien adaptados para la cesión directa de genes a animales.
Se sintetizó una molécula bifuncional consistente
en una maleimida reactiva con sulfhidrilo incorporada a una
bis-acridina-espermidina
(N-4-[p-(maleimidofenil)butiril]-N_{1},N_{8}-(bis-9-acridinil)espermidina
(MPB-bA). Los péptidos que contienen sulfhidrilo se
incorporaron al intercalador mediante un enlace tioéter y el
péptido-intercalador resultante se asoció con ds
ADN por bis-intercalación de las acridinas. La
incorporación de una secuencia de péptido de localización nuclear a
ADN usando este reactivo aumenta la transfección en células
cultivadas.
La síntesis de MPB-bA se basa en
una trifuncionalización de espermidina como se muestra en el
siguiente Esquema 3.
Esquema
3
N_{1},N_{8}-bis(t-butoxicarbonil)espermidina
1, el material de partida, es un sustrato adecuado para
N_{4}-acilación de espermidina (Bergeron, R.J.
et al., Synthesis 689-692 (1989)). El
compuesto 1 se N_{4}-aciló sucesivamente con
4-[p-(maleimidofenil)butirato] de
N-succinimidilo (SMPB) como se describe por
Kitogawa y Aikawa, se desprotegió, y se hicieron reaccionar las
aminas N_{1},N_{8} regeneradas con
9-fenoxicaridina como se describe por Nielsen et
al. para formar una bis-acridina que lleva una
maleimida reactiva (MPB-bA) (Kitawa, T. y Aikawa,
T., J. Biochem. 79:233 (1976); Nielsen, P.E. et al.,
Bioconjugate Chem. 2:57 (1991)).
Se precipitó MPB-bA en dietiléter
y se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice y se
eluyó con
n-butanol/ácido acético/agua
(5:4:1 v/v).
Rf = 0,28.
LSIMS: m/z = 741,8 (M^{+}H).
Se forma un enlace tioéter estable cuando se hace
reaccionar un péptido que contiene sulfhidrilo con el intercalador
que lleva maleimida como se muestra en el Esquema 3 anterior; puede
incorporarse un grupo sulfhidrilo al N-terminal del
péptido con el reactivo
3-(2-piridiltio)propionato de succinimidilo
(Carlsson, J. et al., Biochem. 173:723 (1978)).
Alternativamente, puede sintetizarse el péptido con un residuo de
cisteína en la posición apropiada. La síntesis es sólida y
proporciona un rendimiento global de aproximadamente 15%.
Para demostrar que el MPB-bA
podía mediar en la incorpooración de péptido a ADN, se sintetizaron
dos péptidos de 13 residuos con una cisteína
N-terminal. El primero,
cys-gly-tyr-gly-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val-gly-gly
(SEC ID NO: 9) (Wtcys), contenía la secuencia de localización
nuclear de antígeno T grande de SV40. El segundo,
cys-gly-tyr-gly-pro-lys-asp-lys-val-gly-gly
(SEC ID NO: 10) (cTcys), era un péptido testigo que mimetiza la
mutación presente en el mutante (cT)-3 de SV40, que
es deficitario en el transporte de antígeno T al núcleo. Estos
péptidos se sintetizaron como se describe por Landford et al.
(Landford, R.E. et al., Cell. 46:576 (1986)).
Los péptidos del Ejemplo 19 se hicieron
reaccionar con MPB-bA como se muestra en el anterior
Esquema 3. Un mg de péptido puro por HPLC disuelto en 360 \mul de
un tampón fosfato 0,2 M y EDTA 1 mM, pH 7,2, se hicieron reaccionar
con 1 mg de MPB-bA disuelto en 40 \mul de metanol
durante 45 min con agitación bajo argón. Se purificaron
WTcysMPB-bA y cTcysMPB-bA por
filtración de gel en una columna Biogel P2 seguida por HPLC de fase
inversa C-18 como se describe para los péptidos
libres por Landford et al. (1996), supra, y se
liofilizaron.
LSIMS: WTcysMPB-bA.
m/z = 2118,9 (M^{+}H).
m/z = 2140,7 (M^{+}Na).
CTcysMPB-bA.
m/z = 2106,2 (M^{+}H).
m/z = 218,4 (M^{+}Na).
La interacción de los
bis-acridinil péptidos resultantes con ADN plásmido,
en una relación que permitía la neutralización de la carga, condujo
a una inhibición total de la movilidad electroforética del plásmido
mientras que cantidades iguales de los péptidos no conjugados sólo
retenían parcialmente el ADN (resultados no mostrados).
La intercalación de los
bis-acridinil péptidos en ds ADN condujo al
desplazamiento de bromuro de etidio de ADN de timo de becerro como
se muestra en la Figura 6.
Se computaron las constantes de unión de las
diversas bis-acridinas a partir del desplazamiento
competitivo de bromuro de etidio, una constante de disociación
intrínseca de 6,7 x 10^{-6} M para bromuro de etidio y el
algoritmo de Wolfe y Meehan (Reinhardt, C.G. y Krugh, T.R.,
Biochem. 17:4845 (1978); Wolfe, A.R. y Meehan, T., Mol. Biol.
223:1063 (1992)). Estas constantes de unión se compararon con las
de espermidina bis-acridina sola. Como resultado de
la pérdida de una de sus cargas positivas, se observó una
disminución de afinidad ligera pero significativa cuando el grupo
amino N_{4} de la espermidina bis-acridina se
aciló como en MPB-bA. Se encontró que los conjugados
formados por los péptidos que contienen cisteína y
MPB-bA se unen a ADN con constantes de afinidad
compatibles con un mecanismo de bis-intercalación.
La incorporación de los péptidos cargados positivamente a
MPB-bA restauró parcialmente la afinidad como se
indica en la Figura 6.
Se mezcló bromuro de etidio (19 \muM) con ADN
de timo de becerro (5,7 \muM como equivalentes de nucleótido) en
un tampón Tris-HCl 10 nM, NaCl 0,2 M, pH 7,4, y se
añadieron cantidades crecientes de un derivado de
bis-acridina. Se midió la fluorescencia obtenida
por el desplazamiento de bromuro de etidio en las siguientes
condiciones.
Excitación = 540 nm; Emisión = 610 nm.
Fo: Fluorescencia de bromuro de etidio libre (19
\muM).
Fmax: Fluorescencia del complejo de
etidio-ADN solo (etidio 19 \muM, nucleótido 5,7
\muM).
F: Fluorescencia del complejo de
etidio-ADN en presencia del derivado de bis-
acridina.
- i)
- La fluorescencia intrínseca de la acridina tiene lugar a 450 nm y no interfiere en este ensayo.
- ii)
- La concentración de las soluciones madre de bis-acridina se determinó a partir de la absorbancia a 412 nm usando un patrón de espermidina bis-acridina.
Se determinaron las eficacias de transfección de
plásmidos no modificados o plásmidos mezclados con WTcys
MPB-bA o el mutante cTcysMPB-bA. Este ensayo funcional se basa en las siguientes observaciones.
MPB-bA o el mutante cTcysMPB-bA. Este ensayo funcional se basa en las siguientes observaciones.
- i)
- La eficacia de transfección obtenida con envolturas víricas reconstituidas aumenta cuando los genes encapsulados se co-ceden a las células objetivo con proteínas nucleares sintéticas compuestas por BSA enlazado a la secuencia de localización nuclear de antígeno T grande de SV40 (Kaneda, Y. et al., Science 243-375 (1989).
- ii)
- Las partículas de virión de SV40 microinyectadas en el citoplasma de células cultivadas se transportan a través de complejos de los poros nucleares. La importancia nuclear de las partículas de virión se induce por señales de transporte nuclear específicas contenidas en las proteínas estructurales del virión (Clever, J. et al. PNAS (EE.UU.) 88:7333 (1991)).
Un plásmido que codifica el gen de luciferasa
bacteriana, el plásmido pCLuc4, acomplejado a los péptidos de
MPB-bA podía encapsularse dentro de liposomas
sensibles al pH, sin afectar a la eficacia de encapsulación ni al
tamaño de las vesículas en comparación con liposomas que contienen
el plásmido solo (Legendre, J.Y. y Szoka, F.C., Pharm. Res. 9:1235
(1992)). En una serie de experimentos, el WTcys
MPB-bA aumentaba significativamente (P < 0,025)
la eficacia de transfección aproximadamente 3 veces sobre el
plásmido acomplejado con el cTcysMPB-bA. Estos
datos se muestran en la siguiente Tabla 3.
| \begin{minipage}{145mm}a La eficacia de transfección se midió en células CV-1 en cultivo (Legendre y Szoka, supra).\end{minipage} |
| \begin{minipage}{145mm}Las células CV-1 se transfectaron por triplicado con 4 \mu g de pCLuc4 encapsulado en liposoma, libre o acomplejado a WTcysMPB-bA en una relación de 300 péptidos/plásmido.\end{minipage} |
| \begin{minipage}{145mm}Las actividades de transfección medias obtenidas con liposomas que contienen complejos de WTcys-pCLuc4 o cTcys-pCLuc4 se dividieron por las de liposomas que contienen pCLuc4.\end{minipage} |
| \begin{minipage}{145mm}Las relaciones obtenidas de 4 experimentos diferentes se promediaron (aumento de veces en Tabla) y se compararon usando un ensayo de la t de Student [Ho rechazado; p 0,025].\end{minipage} |
| \begin{minipage}{145mm}No hay diferencias significativas en el diámetro de liposoma o las eficacias de encapsulación de los diversos plásmidos usados en los experimentos de transfección anteriores.\end{minipage} |
Este aumento es similar al observado cuando se
combinan proteínas nucleares sintéticas con ADN y se ceden con
virosomas reconstituidos (Kaneda, Y. et al.,
supra).
En conclusión, la bis-acridina
reactiva con sulfhidrilo proporciona un reactivo excelente para la
incorporación no covalente de moléculas que contienen sulfhidrilo a
ds ADN. Empleando una combinación de diferentes péptidos efectores
que mimetizan los atributos de diversos virus biológicos, se han
producido inesperadamente nuevos complejos de cesión de genes
sintéticos superiores.
Se pusieron 1,2 \mug de oligonucleótidos
marcados con fluoresceína en 330 \mul de solución salina de
tampón Hepes (HBS: Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) en un tubo de
poliestireno y se añadieron gota a gota con mezclado muy ligero 170
\mul de HBS que contenía 100 \mug de un dendrímero de
poliamidoamina de sexta generación (SD68). Después de 30 minutos a
temperatura ambiente, se añadieron 1,5 ml de medio DME H21 exento
de suero, y se aplicó la mezcla a células en cultivo. Típicamente,
se añadieron 100 \mul del complejo a cada cubreobjetos de 22 mm
que contenía células CV-1 80% confluentes puestas en
placa 24 h antes. Después de 2 a 4 h, se lavaron los cubreobjetos
con DME H21-10% de FCS y se montaron sin fijar en
platinas de depresión. Estas platinas pueden acomodar 200 \mul de
medio por debajo del cubreobjetos y se cerraron en los bordes
con parafina caliente.
Para análisis, se visualizaron los cubreobjetos
por microscopía confocal de exploración laser. Se emplearon un
sistema confocal BioRad MRC-600 que emplea un laser
de cripton-argón (excitación: 488 nm) y un
microscopio invertido Nikon. Una regulación típica para análisis
utilizado para los ensayos fue como sigue.
Alta regulación de laser
Densidad neutra = 1
Ganancia = 7
Abertura = 10
Auto black conectado
Promedio de Kalman = 3
Objetivo = 63X
Las células se anotaron como positivas en base a
la presencia de fluorescencia nuclear inequívoca y la existencia de
un borde visual entre el núcleo y el citoplasma. La fracción de
núcleos fluorescentes observada se calculó contando el número de
núcleos fluorescentes observados y dividiendo por el número total
de células en campos sanos aleatorios.
En la Figura 7 se muestra el efecto del
policatión de dendrímero SD68 utilizado en el Ejemplo 23 que media
en la acumulación nuclear de oligonucleótido de manera dependiente
de la dosis. Se prepararon como se ha descrito antes cantidades
variables de policatión de dendrímero (3-200
\mug/prep) con una cantidad fija de oligonucleótido (1,2
\mug/prep). Estos se añadieron a las células CV-1
mediante procedimientos estándares y se ensayó la fluorescencia
nuclear. Se observó que se requería una relación umbral de
policatión de dendrímero a oligonucleótido para acumulación
nuclear. Más allá de ésta, se observó coloración nuclear hasta
aproximadamente el 25%. La Tabla 4 muestra la carga y las
relaciones de oligonucleótido a dendrímero para cada ensayo, y la
acumulación nuclear resultante de fluorescencia (nucleótido).
La dependencia del tiempo con la que el
policatión de dendrímero SD68 facilitó la acumulación nuclear de
los oligonucleótidos se muestra en la Figura 8. Se añadió una
preparación estándar de policatión de
dendrímero-oligonucleótido a células
CV-1 que se lavaron, montaron y visualizaron a los
5, 30, 60, 90, 120 y 180 minutos. Las células se anotaron como
positivas o negativas en base a la presencia o ausencia de
fluorescencia nuclear como se ha descrito antes. La acumulación
nuclear se vio tan pronto como 30 min después del tiempo de contacto
y alcanzó casi el 80% en 3 h.
La generación del dendrímero, correspondiente al
tamaño, afecta a su capacidad para facilitar la acumulación nuclear
de oligonucleótidos. Se prepararon preparaciones estándares de
dendrímero-oligonucleótido con tamaños variables de
dendrímero (SD22, SD68, SD124). Cada una se aplicó a células
CV-1 durante 4 h, y se ensayó la acumulación
nuclear de manera usual. El experimento se realizó en DME H21 o un
medio optimizado de fuerza iónica reducida. El SD68 podía mediar en
casi el 80% de acumulación nuclear, mientras que el SD22 y el SD124
eran algo menos eficaces como mediadores de la acumulación nuclear
en condiciones iónicas reducidas. Los resultados de este ensayo se
muestran en la Figura 9.
Los complejos de policatión de
dendrímero-oligonucleótido se prepararon como se ha
descrito antes. Estos se diluyeron con DME H21 o DME H21 diluido 30%
con una solución no iónica equimolar de un sacárido incluyendo
glucosa, lactosa, manitol, sorbitol y sacarosa. Los complejos se
aplicaron a células CV-1 durante 2 h, y se analizó
como se ha descrito antes. Independientemente del tipo de
carbohidrato usado, una fuerza iónica reducida aumentó la
acumulación nuclear mediada por dendrímero. Las condiciones y
resultados del ensayo se muestran en la Figura 10.
El péptido GALA cys se incorporó a la
bis-acridina maleimida como se ha descrito en el
Ejemplo 21 para preparar un desestablizador de membrana que se
asocia a ADN. El aminoácido cisteína se incorporó a las
bis-acridina maleimida como se ha descrito en el
Ejemplo 21 como testigo. Se diluyeron seis microgramos de plásmido
que contenía el gen de luciferasa en 330 \mul de HBS en un tubo de
poliestireno. GALA
cysMPB-bis-acridina (1 nmol) o
cysMPB-bis-acridina y/o dendrímero
PAMAM SD68 de 6ª generación (4 \mug) se diluyeron en 170 \mul de
HBS y se añadieron gota a gota al ADN. El tubo se mezcló suavemente
y, después de 20 min, se ensayo en los complejos resultantes la
transfección en hepatocitos recién aislados.
De manera similar, la
(galactosa-6)3Lys2-bis-acridina
(Haensler, J. y Szoka, F., Bioconjugate Chemistry 4:85 (1993)) se
incorporó a ADN y se formó un complejo con el dendrímero SD68.
Además, la GALA
cysMPB-bis-acridina y la
(galactosa-6)3Lys2-bis-acridina
se mezclaron a 0,5 nmoles cada una y se añadieron a ADN junto con el
dendrímero. La composición que contenía los tres componentes se
añadió después a los hepatocitos como se ha descrito antes. Los
resultados se presentan en la Figura 11. Las cantidades de
componentes en cada transfección se dan debajo de la actividad de
luciferasa. La adición del desestabilizador de membrana GALA
cysMPB-bis-acridina o el ligando de
fijación de objetivo (galactosa-6)3Lys2bis-
acridina al dendrímero aumenta la transfección en aproximadamente
dos órdenes de magnitud. La adición de los dos efectores juntos al
dendrímero pero en una cantidad reducida también era capaz de
aumentar la transfección. Sin embargo, la adición del testigo
cysMPB-bA al dendrímero no aumentó la
transfección.
Se incorporó tio-galactosa al
dendrímero modificado con SPDP de 40 \ring{A} de diámetro (SD40)
como se describe en el Ejemplo 4 y se mezcló con dendrímero SD40
sin modificar y dendrímero GALA cys. Las mezclas de los dendrímeros
se usaron para transfectar hepatocitos con el plásmido de
luciferasa. Los resultados se dan en la Figura 12. Se observaron
los mayores niveles de transfección cuando la relación de
dendrímero/gal-dendrímero/GALA-dendrímero
fue 24/141/42 en base a peso.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: SZOKA; FRANCIS C:
\hskip3.35cmHENSLER, JEAN
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMA DE CESIÓN DE POLINUCLEOTIDOS AUTOMONTABLE QUE COMPRENDE POLICATIONES DE DENDRIMERO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: ROBBINS, BERLINER & CARSON
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 201 Nth FIGUEROA STREET
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LOS ANGELES
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE:UU:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 90012
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Floppy disk
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect 5.1 / ASCII
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACION: 14 de Julio de 1994
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BERLINER, ROBERT
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 20.121
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5555-242
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACION DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (213) 977-1001
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELEFAX: (213) 977-1003
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEX:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:1
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:2
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- T IPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CONFIGURACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/GUIA: Lugar modificado
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACION: /nota = "Esta posición es n-formil-".
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Met Leu Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:3
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ser Gly Arg Glu Asp Val Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:4
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:5
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Pro Arg Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:6
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Phe Glu Arg Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe
Lys Pro Ala Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu
Ala Leu Ala Glu}
\sac{His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu
Ala Cys Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Tyr Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÍN PARA SEC ID NO: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Tyr Gly Pro Lys Asp Lys Arg Lys Val
Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (65)
1. Una composición para presentar un
polinucleótido a un componente subcelular de una célula eucariota,
que comprende
un polinucleótido; y
un policatión de dendrímero que tiene grupos
catiónicos terminales acoplados no covalentemente al polinucleótido,
en la que la proporción de grupos catiónicos terminales del
policatión de dendrímero al contenido de nucleótido del
polinucleótido es de 1:1 a 223,3:1 pero excluyendo composiciones
obtenibles
diluyendo 12 \mug de plásmido pCLuc4 en 660
\mul de HBS (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) para formar una
solución de ADN; y
disolviendo 1 nmol de micropartículas de
dendrímero Starburst de macromolécula de policatión ramificada
hidrófila de quinta generación en 340 \mul de HBS y añadiendo
esto gota a gota a la solución de ADN.
2. La composición de la reivindicación 1ª, que
comprende además un excipiente aceptable farmacéuticamente.
3. La composición de la reivindicación 1ª, en la
que el policatión de dendrímero comprende una molécula de núcleo que
comprende al menos dos residuos reactivos seleccionados del grupo
constituido por hidroxilo, éter, amino, imino, amido, imido,
amonio, haluro, carboxilo, carboxihaluro y sulfhidrilo, y
combinaciones de ellos.
4. La composición de la reivindicación 3ª, en la
que el policatión de dendrímero comprende además un polímero
aceptable farmacéuticamente seleccionado del grupo constituido por
poliamidoaminas derivadas de la reacción de un éster de alquilo de
un ácido carboxílico \alpha,\beta-insaturado
etilénicamente o una amida \alpha,\beta-insaturada
etilénicamente y una alquilenpoliamina o una polialquilenpoliamina,
estando el polímero acoplado operativamente a la molécula de
núcleo.
5. La composición de la reivindicación 1ª, en la
que el policatión de dendrímero comprende una poliamidoamina.
6. La composición de la reivindicación 1ª, en la
que el policatión de dendrímero comprende grupos terminales capaces
de adquirir una carga positiva.
7. La composición de la reivindicación 6ª, en la
que los grupos catiónicos terminales se seleccionan del grupo
constituido por azoles y aminas alifáticas y aromáticas primarias,
secundarias, terciarias y cuaternarias, que pueden estar sustituidos
con S u O, guanidinio y combinaciones de ellos, estando los grupos
catiónicos terminales acoplados operativamente al polímero.
8. La composición de la reivindicación 6ª, en la
que los grupos catiónicos terminales comprenden del 10 al 100% de
todos los grupos terminales del polímero.
9. La composición de la reivindicación 8ª, en la
que el policatión de dendrímero comprende además del 0 al 90% de
residuos reactivos terminales de todos los grupos terminales del
policatión de dendrímero.
10. La composición de la reivindicación 9ª, en la
que los residuos reactivos terminales se seleccionan del grupo
constituido por hidroxilo, ciano, carboxilo, sulfhidrilo, maleimida
y ditiopiridilo, y combinaciones de ellos.
11. La composición de la reivindicación 1ª, en la
que el policatión de dendrímero tiene un peso molecular medio de
2.000 a 1.000.000.
12. La composición de la reivindicación 1ª, en la
que el policatión de dendrímero tiene un radio hidrodinámico de 11 a
60 \ring{A}.
13. La composición de la reivindicación 1ª, en la
que la proporción de grupos catiónicos terminales del policatión de
dendrímero al contenido de nucleótidos es de 1:1 a 25:1.
14. La composición de la reivindicación 1ª, que
comprende además un agente permeabilizador de membrana capaz de
transportar el polinucleótido a través de las membranas
citoplásmica o endosómica de la célula eucariota, estando el agente
permeabilizador de membrana acoplado operativamente al policatión de
dendrímero.
15. La composición de la reivindicación 14ª, en
la que la proporción del agente permeabilizador de membrana a grupos
catiónicos terminales del policatión de dendrímero es de 1:100 a
1:4.
16. La composición de la reivindicación 14ª, en
la que el agente permeabilzador de membrana comprende un péptido
anfipático.
17. La composición de la reivindicación 16ª, en
la que el péptido anfipático comprende GALA.
18. La composición de la reivindicación 16ª, en
la que el péptido comprende un péptido cíclico.
19. La composición de la reivindicación 16ª, en
la que el péptido cíclico se selecciona del grupo constituido por
gramicidina S y tirocidinas.
20. La composición de la reivindicación 19ª, en
la que el péptido cíclico comprende gramicidina S.
21. La composición de la reivindicación 14ª, que
comprende además un fosfolípido.
22. La composición de la reivindicación 21ª, en
la que el fosfolípido comprende fosfatidiletanolamina.
23. La composición de la reivindicación 22ª, en
la que la fosfatidiletanolamina comprende
dioleilfosfatidiletanolamina.
24. La composición de la reivindicación 21ª, en
la que el fosfolípido está presente en forma de liposomas.
25. La composición de la reivindicación 14ª, que
comprende además un policatión.
26. La composición de la reivindicación 25ª, en
la que el policatión comprende una poliamina.
27. La composición de la reivindicación 26ª, en
la que la poliamina se selecciona del grupo constituido por
polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina,
3,3'-diaminobispropilamina,
iminobis(N,N)-dimetilpropilamina,
iminobis(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina
y dendrímeros catiónicos.
28. La composición de la reivindicación 15ª, en
la que el agente permeabilizador de membrana comprende una sal
biliar catiónica de fórmula química
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
X e Y son independientemente H u OH;
R^{3} es H,
alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alquil(C_{1}-C_{10})amina; y
R^{4} es un
alquilo(C_{1}-C_{30}) lineal o ramificado
cargado positivamente o
alquil(C_{1}-C_{30})amina, en el
que uno o más de los átomos de carbono puede estar sustituido con
NR', en el que R' es H,
alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alquil(C_{1}-C_{10})amina.
29. La composición de la reivindicación 1ª, que
comprende además un agente de localización subcelular capaz de ceder
el polinucleótido desde el citoplasma de la célula eucariota a un
componente subcelular de la célula eucariota, estando el agente de
localización subcelular acoplado operativamente al policatión de
dendrímero.
30. La composición de la reivindicación 29ª, en
la que la proporción del agente de localización subcelular a grupos
catiónicos terminales del policatión de dendrímero es de 1:100 a
1:5.
31. La composición de la reivindicación 30ª, en
la que el agente de localización subcelular comprende un agente de
localización nuclear capaz de ceder el polinucleótido al núcleo de
la célula eucariota.
32. La composición de la reivindicación 31ª, en
la que el agente de localización nuclear está acoplado
operativamente a un resto que se asocia a ADN.
33. La composición de la reivindicación 32ª, en
la que el resto que se asocia a ADN comprende un agente
intercalador.
34. La composición de la reivindicación 33ª, en
la que el agente intercalador tiene la fórmula química
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
Z comprende un enlace, un grupo reactivo
seleccionado del grupo constituido por
N-hidroxisuccinimida, maleimida, maleimidofenilo,
disulfuro de piridilo, hidrazida y fenilglioxal, o ZY, en el que Y
se selecciona de los grupos constituidos por ligandos receptores de
la superficie celular, secuencias de localización nuclear y
componentes permeabilizadores de membrana;
n y m son independientemente un número entero de
1 a 20;
p es un número entero de 0 a 20; y
Ar_{1} y Ar_{2} se seleccionan
independientemente del grupo constituido por bromuro de etidio,
acridina, mitoxantrona, oxazolopiridocarbazol, elipticina,
N-metil-2,7-diazapirenio
y derivados de ellos.
35. La composición de la reivindicación 34ª, en
la que Ar_{1} y Ar_{2} comprenden acridina.
36. La composición de la reivindicación 35ª, en
la que Z comprende maleimidofenilo o ditiopiridilo.
37. La composición de la reivindicación 34ª, en
la que Z comprende el grupo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
38. La composición de la reivindicación 33ª, en
la que el agente intercalador está acoplado a al menos un ligando
que tiene como objetivo un receptor situado en la superficie de la
célula eucariota, en la que el ligando y el policatión de
dendrímero están comprendidos en un agente de reconocimiento de
célula capaz de reconocer la célula eucariota, estando el ligando
con objetivo fijado acoplado operativamente al policatón de
dendrímero.
39. La composición de la reivindicación 33ª, que
comprende además un agente permeabilizador de membrana acoplado
operativamente al agente intercalador o al ligando.
40. La composición de la reivindicación 33ª, en
la que el agente intercalador tiene la fórmula química
41. La composición de la reivindicación 32ª, en
la que el resto que se asocia a ADN comprende un enlazador de
polinucleótido de cadena sencilla.
42. La composición de la reivindicación 32ª, en
la que el resto que se asocia a ADN comprende un policatión de
dendrímero.
43. La composición de la reivindicación 32ª, en
la que el resto que se asocia a ADN comprende un aglomerante de
ranura principal o pequeña.
44. La composición de la reivindicación 1ª, que
comprende además un ligando que tiene como objetivo un receptor
situado en la superficie de la célula eucariota, en la que el
ligando y el policatión de dendrímero están comprendidos en un
agente de reconocimiento de célula capaz de reconocer la célula
eucariota, estando el ligando con objetivo fijado acoplado
operativamente al policatón de dendrímero.
45. La composición de la reivindicación 44ª, en
la que la proporción de ligando con objetivo fijado en la célula a
grupos catiónicos terminales del policatión de dendrímero es de
1:100 a 1:10.
46. La composición de la reivindicación 45ª, en
la que el ligando con objetivo fijado en la célula se selecciona del
grupo constituido por vitaminas, carbohidratos y polipéptidos.
47. La composición de la reivindicación 46ª, en
la que el polipéptido comprende un anticuerpo o fragmento del
mismo.
48. La composición de la reivindicación 44ª, que
comprende además un agente permeabilizador de membrana acoplado
operativamente al agente intercalador o al ligando.
49. La composición de la reivindicación 1ª, que
comprende además un polipéptido fusogénico, estando el polipéptido
fusogénico acoplado operativamente al policatión de dendrímero.
50. La composición de la reivindicación 49ª, en
la que la proporción de polipéptido fusogénico a grupos catiónicos
terminales del policatión de dendrímero es de 1:100 a 1:4.
51. La composición de la reivindicación 1ª, que
comprende además un agente de enmascaramiento de ADN capaz de
aumentar la vida media circulatoria del polinucleótido, estando el
agente de enmascaramiento de ADN acoplado operativamente al
policatión de dendrímero.
52. La composición de la reivindicación 51ª, en
la que la proporción de agente de enmascaramiento de ADN a grupos
catiónicos terminales del policatión de dendrímero es de 1:33 a
1:3.
53. La composición de la reivindicación 51ª, en
la que el agente de enmascaramiento de ADN está acoplado
operativamente a un resto que se asocia a ADN.
54. La composición de la reivindicación 51ª, en
la que el agente de enmascaramiento de ADN tiene la fórmula
química
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
n es un número entero de 6 a 24;
Y se selecciona del grupo constituido por
hidroxi, sialilo, etanolamina, colina, glicerol, serina,
monometoxipolietilenglicol e inositol;
R^{1} es
alquilo(C_{6}-C_{24}) o
alquenilo(C_{6}-C_{24});
R^{3} es H, o
alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alquil(C_{1}-C_{10})amina;
R^{4} es un
alquilo(C_{1}-C_{30}) lineal o ramificado
cargado positivamente o alquilamina, en el que uno o más de los
átomos de carbono puede estar sustituido con NR', en el que R' es
H, alquilo(C_{1}-C_{10}) o
alquil(C_{1}-C_{10})amina.
55. La composición de la reivindicación 51ª, en
la que el agente de enmascaramiento comprende polietilenglicol
(PEG).
56. La composición de la reivindicación 1ª, en la
que el polinucleótido comprende un vector híbrido que comprende un
gen estructural acoplado operativamente a él.
57. La composición de la reivindicación 1ª, en
forma sólida, líquida o de aerosol.
58. Un método para introducir un polinucleótido
en una célula eucariota, que comprende poner en contacto la célula
con la composición de la reivindicación 1ª in vitro.
59. El método de la reivindicavión 58ª, en el que
la célula eucariota es una célula de mamífero.
60. Un método para introducir un polinucleótido
en una célula de planta, que comprende poner en contacto la célula
con la composición de la reivindicación 1ª.
61. El uso de la composición de la reivindicación
1ª, en la fabricación de un medicamento para la introducción de un
polinucleótido en una célula eucariota presente en un animal vivo,
en el que la composición se administra al animal en una cantidad
eficaz para alcanzar y entrar en las células del animal.
62. El uso de la reivindicación 61ª, en el que el
medicamento es para la introducción de un polinucleótido en una
célula eucariota presente en un ser humano vivo.
63. El uso de la reivindicación 61ª, en el que el
medicamento comprende aproximadamente 0,5 \mug a 20 mg de
polinucleótido.
64. El uso de la reivindicación 61ª, en el que el
medicamento está adaptado para administración por vía oral,
transdérmica, sistémica o de inhalación.
\newpage
65. El uso de la reivindicación 64ª, en el que el
medicamento está adaptado para administración transdérmicamente
mediante administración por impacción a alta velocidad a la
superficie de la piel.
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