CZ299809B6 - Lipidový vácek mající kladne nabitou membránu z lipidové dvojvrstvy pro prenos genetického materiálu a zpusob jeho prípravy - Google Patents

Abstract

Lipidový vácek mající kladne nabitou membránu z lipidové dvojvrstvy, která obsahuje kationtové a/nebo polykationtové lipidy, je charakterizován tím, že dále obsahuje alespon jeden prirozený nebo syntetický virový fúzní peptid integrovaný do membránynebo na ni kovalentne vázaný, a membrána je dále charakterizována specifickým obsahem kationtových a/nebo polykationtových lipidu fosfatidyletanolaminu, nebo kationtových a/nebo polykationtových lipidu, fosfatidyletanolaminu a fosfatidylcholinu, pricemž lipidový vácek je ješte dále charakterizován tím, že membrána dále obsahuje alespon jeden bunecne specifický marker ve forme predem vytvoreného molekulového komplexu sestávajícího z fosfatidyletanolaminu, dvojfunkcního zesítujícího cinidla a bunecne specifického markeru.

Description

Lipidový váček mající kladně nabitou membránu z lipidové dvojvrstvy pro přenos genetického materiálu a způsob jeho přípravy

Oblast vynálezu

Předkládaný vynález je z oblasti genové biotechnologie a genové terapie a týká se nových virozomů, tj. pozitivně nabitých lipozomových váčků (vezikul) obsahujících v membráně virové glykoproteiny, vhodných pro účinný přenos genetického materiálu na cílová místa a způsobu jejich přípravy. Kationtové virozomy podle vynálezu jsou zejména vhodné pro specifický i nespecifický neinfekční přenos genů do cílových buněk in vitro a in vivo.

Dosavadní stav techniky

Lipozomy jsou široce užívány jako nosiče pro podávání léků a jako ochranné schránky pro farmaceutické látky s krátkou životností nebo jako ochrana proti (bio)chemickému útoku tělesných tekutin. Lipozomy obsahující rekonstituované membránové proteiny z virových obalů nebo jejich části jsou obvykle nazývány „virozomy“ (Sizer et al., Bíochemistry, 26, 5106-5113, 1987). Byly použity pro nespecifické podání různých léků a molekul DNA (Vainstein et al., Methods Enzymol., 101, 492-512, 1983). Ukázalo se, že hlavní nedostatek těchto virozomů je, že jejich fúze s buněčnou membránou cílových buněk má za následek nekontrolované uvolňování přenášeného materiálu do cytoplazmy cílových buněk, kde byl nechráněný materiál snadno napadán degradativními intracelulárními procesy.

²⁵

Přihláška WO 92/13 525, na jejíž plné znění se zde odkazujeme, uvádí, že virozomy tvořené fosfolipidovými dvojvrstevnými membránami, které jsou zacílené tím, že obsahují povrchové membránové „hřebíkovité“ proteiny („spike“ proteiny) viru chřipky a buněčně specifické markéry, jako jsou např. monoklonální protilátky, velmi účinně fúzují s modelovými membránami a živo30 čišnými buňkami díky mechanismu podobnému penetračnímu mechanismu virů, a sice endocytózou zprostředkovanou receptorem. Ačkoli jsou tyto virozomy úspěšně aplikovány pro přenos chemických látek a požadovaných léčiv na cílová místa, trpí určitými nevýhodami vzhledem k stabilní inkorporaci a přenosu nabitých molekul, jako jsou například negativně nabité nukleové kyseliny.

V průběhu posledních několika let přenos, zejména buněčně specifický přenos, genetického materiálu inkorporovaného do lipozomů získal více a více pozornosti a důležitosti, zejména pokud se týče aplikací v protirakov inňé a geňóvé terapii. V současné době je dostupných několik metod pro přenos DNA nebo RNA do buněk: metody zprostředkované viry, metody zprostředko40 . vaně lipidy, a další metody, jako jsou mikro injekce a elektroporace. Výhody a nevýhody současných technik přenosu genů mohou být shrnuty následovně:

a) Přenos genů zprostředkovaný viry: geny mohou být zavedeny trvale a účinně do savčích buněk prostřednictvím retrovirových vektorů. Avšak účinnost přenosu genů do nereplikujících se buněk je velmi nízká, protože retroviry infikují pouze dělící se buňky. Dále použití retrovirových vektorů souvisí s obecnými požadavky bezpečnosti, které se týkají například možné aktivace onkogenů. Pro většinu vědců se replikaěně defektní adenoviry staly vektory vhodnými pro přenos genů. Přenos genů zprostředkovaný adenovirovým vektorem zahrnuje buď inzerci požadovaného genu do adenovirových částic upravených delecí, nebo tvorbu komplexu mezi DNA, která má být vlo50 žena, a virovým obalem adenovirů pomocí transferin-polylyzinového můstku. Nedostatkem tohoto systému velmi účinného in vivo je nedefinovatelné riziko infekce nebo zánětu: navzdory deleci genu El, která poskytuje virus s vadnou replikací, zbývající virový genom obsahuje četné otevřené čtecí rámce kódující virové proteiny (Yang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91, 44074411, 1994). Exprese virových proteinů trans dukovanými buňkami vyvolává jak humorální, tak buněčnou imunitní odpověď ve zvířecím a lidském těle, a tedy může podnítit zánět a proliferaci.

-1 CZ 299809 B6

V metodě zprostředkované HVJ (virus Sendai, japonský hemaglutinační virus) je cizí DNA spojena v komplexu s lipozomy. Lipozomy jsou poté naplněny inaktivovaným virem Sendai (HVJ). Tato metoda již byla použita pro přenos genů in vivo do různých tkání. Kromě toho bylo publi5 kován buněčný příjem „antisense“ (tj. s orientací proti směru transkripce) oligonukleotidu HVJlipozomy (Morishita et al., J. Cell. Biochem., 17E, 239, 1993). Avšak je určitou nevýhodou, že HVJ-I i pozorný mají tendenci se nespecificky vázat na červené krvinky.

b) Přenos genů zprostředkovaný lipidy: pro in vitro přenos DNA a „antisense“ oligonukleotidů se ío zdají být bezpečné, snadno použitelné a účinné pozitivně nabité lipozomy tvořené kationtovými lipidy. Vysoce negativně nabité nukleové kyseliny spontánně reagují s kationtovými lipozomy.

Kompletní tvorby komplexů DNA-lipozom je dosaženo již prostým smísením polýnukleotidů s předem vytvořenými kationtovými lipozomy. Avšak kvůli nepřítomnosti ťuzních peptidů a buněčně specifických markérů na lipozomové membráně je účinnost transfekce in vivo velmi nízká a inkubační doba je dlouhá, proto musí být podávány vysoké dávky, aby se dosáhlo požadovaného efektu. Následkem toho mohou nastat nežádoucí vedlejší účinky, protože je dokázáno, že velká množství kationtových lipidů mohou mít in vivo toxický účinek.

Malé oligonukleotidy jsou v současnosti testovány jako léčebné přípravky pro léčení rakoviny a jako protivirové přípravky. Aby se syntetizovala „messenger“ RNA (rnRNA), přepisuje se pouze jedno ze dvou DNA vláken. Vlákno DNA přepsané na RNA se nazývá kódující vlákno neboli „sense“ vlákno. Komplementární, nekódující neboli „antisense“ vlákno má tutéž sekvenci jako rnRNA. Když se přepíše nekódující vlákno,,vytvoří se „antisense“ RNA molekuly, které jsou schopné vázat se k cílové („sense“) rnRNA. Jak je jednou „antisense“ RNA navázána k „sense“

RNA, výsledné duplexové molekuly RNA nemohou být translatovány a blokuje se tvorba proteinu. Obvykle se účinně vážou na rnRNA a i nh i buj i translaci rnRNA krátké syntetické „antisense“ oligonukleotidy o 18 až 22 bázích. Tímto mechanismem mohou „antisense“ oligonukleotidy zastavit proliferací lidských rakovinných buněk. Geny, které jsou zapojeny v rakovině, uplatňují svůj účinek nadměrnou expresí svých normálních strukturních proteinů. Geny, jako jsou c-fos, c-myc, L-myc, N-myc, c-myb, abl, bcr-abl, c-raf, c-crb-2, K-ras, mohou být potenciálním cílem pro „antisense“ rakovinnou terapii. „Antisense“ oligonukleotidy jsou také přitažlivou potenciální alternativou ke konvenčním léčivům jako jsou protivirové přípravky, např. „antisense“ oligonukleotidy genů tat a gag viru lidské imunodeficience (HIV).

Lipozomové membrány obsahující rekonstituované virové obaly, jak je popsáno v literatuře (Stegmann et al., EMBO J., 6, 2651-2659, 1987), se nazývají virozomy. Obvykle se skládají z fosfolipidové dvoj vrstvy obsahující fosfatidylcholin (PC) a fosfatidyletanolamin (PE) spolu s . virovým obalem, např. povrchovými „spike“ proteiný zakotvenými v membráně. Obvyklé meto-. dy začleňování genetického materiálu do PC,PE-virozomů trpí nevýhodou poněkud nízké účin40 nosti inkorporace nukleových kyselin.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se proto týká nového kationtového virozomu, který, může být díky specifickému složení své membrány velmi účinně naplněn jakýmkoliv požadovaným genetickým materiálem obsahujícím dlouhé a krátké řetězce DNA nebo RNA, oligodeoxynukleotidy, ribonukleotidy, peptidové nukleové kyseliny (PNA), ribozymy (molekuly RNA s enzymovými aktivitami), geny, plazmidy a vektory, a tedy přesvědčivě překonává nedostatky dosavadního stavu techniky.

⁵⁰

Vynález se týká také způsobu pro účinnou rekonstituci hemaglutininu viru chřipky A, zejména kmene A/Singapúr, do v podstatě monolamelámích kationtových lipidových váčků (vezikul), což má za následek tvorbu kationtových virozomů se středním průměrem přibližně 120 až 180 nm, a souvislé lipidové dvoj vrstvy, která je v podstatě zbavena nevýhody prosakování (netěsnosti) pozorované u mnoha konvenčních virozomových přípravků. Struktura - výhodně monolamelámí

-2CZ 299809 B6

- kationtové dvojvrstevné membrány je taková, že hydrofílní, pozitivně nabité části („hlavičky“) molekul lipidů jsou orientovány směrem k vodné fázi (fázím) a hydrofobní úseky („ocásky“) mastných kyselin jsou orientovány směrem ke středu dvojvrstvy. Elektronovou mikroskopií je možné ukázat, že rekonstituované virové membránové „spike“ proteiny (jako je např, hemagluti5 nin) jsou integrovány do lipidové dvojvrstvy a vyčnívají z povrchu kationtových váčků (obr, 1).

Lipídové složení membrány váčků je takové, že váček obsahuje kationtové a/nebo polykationtové lipidy a volitelně fosfolipidy, jako je fosfatidyletanolamin a fosfatidylcholin. Pro většinu případů se ukázalo výhodné vybrat lipidové složení membrány obsahující (vyjádřeno jako podíl z celkoio vých lipidů) buď

I) 90 až 95 % (hmotnostních) kationtových a/nebo polykationtových lipidů a 5 až 10 % (hmotnostních) fosfatidyletanolaminu, nebo

Π) 45 až 90% (hmotnostních) kationtových a/nebo polykationtových lipidů, 5 až 10 % (hmotnostních) fosfatidyletanolaminu a 5 až 50 % (hmotnostních) fosfatidylcholinu.

Vynález se také týká ireverzibi lni kovalentní vazby buněčně specifických markérů ke kationtovým virozomům, jako jsou např. (ale bez omezení) monoklonální protilátky, protilátkové frag20 menty jako fragmenty F(ab')₂ a Fab', cytokiny a/nebo růstové faktory, použitelné pro selektivní detekci a vazbu cílových buněk. Jsou spojeny s membránou váčků tak, že vyčnívají na vnější povrch a projevují v podstatě plnou funkční aktivitu co se týče vyhledání (detekce) receptorů a vazby.

Navázání buněčně specifických markérů, jako jsou protilátkové fragmenty, k předem vytvořeným váčkům, jak popsal např. Martin et al. (J. Biol. Chem., 257, 286-288, 1982), vede k nízkým výtěžkům a často nereprodukovatelným výsledkům vazby, což jsou komplikace, které významně omezují strategie cílení do buněk. Proto jsou podle předkládaného vynálezu markéry vázány na předem vytvořené komplexy „fosfatidyletanolamin - vazebná molekula“, jako je například

N-[4-(p-maleimÍd-fenylbutyryl]fosfatidytetanolamin (ΜΡΒ.ΡΕ) v přítomnosti detergentu.

Za účelem dosažení nej lepších možných výsledků se ukázalo výhodné před rekonstitucí pečlivě izolovat a purifikovat virové glykoproteiny, aby se zabránilo inaktivaci buď proteolytickým štěpením, nebo redukcí intramolekulárních vazeb S-S. Proto je výhodné, když jsou konjugované markéry, např. marker-MPB.PE, separovány od nekonjugovaných molekul (např. ΜΡΒ.ΡΕ) afinitní chromatografií s aktivovanou agarózovou matricí, výhodně např. redukovanou sefarózou „Thiopropyl Sepharose 6B“. Alikvoty purifikovaných konjugovaných markérů (komplexů fosfa. 2..... . tidyletanolamín - vazebná molekula - markér) jsou poté. přidány k roztoku detergentu obsahujícím směs rozpuštěných membránových lipidů, fúzních peptidů a dalších požadovaných složek před tím, než se vytvářejí kationtové virozomy.

Ukázalo se výhodné provádět navázání dvojfunkční vazebné (zesíťující) molekuly s fosfolipidem a buněčně specifickým markérem v oddělených procesech před přípravou virozomů. Tento postup umožňuje lepší kontrolu a optimalizuje povrchovou hustotu virozomových membrán, zejmé45 na co se týče počtu buněčně specifických markérů k ní připojených. Zlepšená kontrola koncentrace proteinových molekul zakotvených v membráně nebo s ní spojených je důležitá, nevyrovnaný poměr fúzních peptidů (např. hemaglutinin) a buněčně specifických markérů (např. protilátkové fragmenty Fab') na membráně virozomů· může snížit nebo dokonce zničit jejich selektivní vlastnosti a v krajním případě může mít za následek srážení a precipitaci váčků.

Použití proti látkových fragmentů F(ab')₂ a Fab' místo celých proti látkových molekul jako buněčně specifických markérů je obzvláště výhodné, protože jsou daleko méně imunogenní než celá protilátka. Také nepřítomnost domén Fc eliminuje celou řadu nežádoucích biologických a imunologických aktivit zprostředkovaných Fc, jako jé například aktivace komplementu prostřednic55 tvím klasické dráhy a akutní humorální odpovědi, které maj í nakonec za následek - kromě j iného

-3CZ 299809 B6

- odklizení připojených virozomů z povrchu cílové buňky prostřednictvím interakce mezi protilátkou a jejím receptorem Fc na cílové buňce.

Na rozdíl od známých lipozomových přípravků pro přenos nukleových kyselin, předkládané kati5 ontové virozomy obvykle nepotřebují fúzovat s buněčnou membránou, nebojí destabilizovat, aby vstoupily do cytoplazmy. Jsou schopné vstupu do hostitelské buňky prostřednictvím dvoukrokového mechanismu: 1) připojení a 2) penetrace. V prvním kroku se váží prostřednictvím fúzních peptidů (např. hemaglutinin) a/nebo buněčně specifických markérů na buněčné receptory, zejména na membránové glykoproteiny nebo glykolipidy, koncovou kyselinou sialovou, a jsou poté io velmi účinně inkorporovány endocytózou receptorem zprostředkovanou. V případě virozomů nesoucích buněčně specifické markéry, např. protilátkové fragmenty, tyto markéry navíc rozpoznávají antigen ní struktury na povrchu cílových buněk, z čehož plyne připojení dvěma různými vazebnými mechanismy. Předkládané buněčně specifické virozomy tedy projevují selektivitu pro různé buněčné typy díky svým buněčně specifickým markérům na membráně a současně vyso15 kou schopnost buněčné penetrace endocytózou díky virovému fúznímu peptidů, např. hemaglutininu. Virozomy s fragmenty Fab', které rozpoznávají antigeny spojené s nádory, jako jsou TEG72, CEA, 17-1 A, CA 19-9 nebo antigeny spojené s leukémií, jako je CD 10 (CALLA = Common Acute Lymphocytic Leukaemia Antigen) a CD20, se budou vázat selektivně na nádorové nebo leukemické buňky nesoucí zmíněné antigeny na svých buněčných površích.

²⁰

Ve druhém kroku, když vstupují do hostitelské buňky prostřednictvím endocytózy zprostředkované receptorem, jsou virozomy zachyceny v endozomech. Následně se pH v endozomech snižuje na hodnotu přibližně pH 5 až 6, při které se aktivuje hemaglutininový fúzní peptid a spouští fúzi membrány virozomů s membránou endozomu. Fúzní reakce membrány otevírá lípidový obal virozomů a uvolňuje zachycený genetický materiál do cytosolu. Tento mechanismus podstatně zvyšuje šance přenášeného genetického materiálu dosáhnout jádra předtím, než je odstraněn digestívní degradací a/nebo exocytózou.

Primárním cílem předkládaného vynálezu je poskytnout pozitivně nabité lipidové váčky obsahu30 jící kationtové nebo polykationtové lipidy a vnitřní prostor - obvykle s vodným prostředím, a dále obsahující alespoň jeden virový fúzní peptid zakotvený nebo integrovaný do membrány nebo kovalentně navázaný na membránu váčku. Váček také obsahuje na membráně alespoň jeden buněčně specifický markér. Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout váčky mající plnou biologicky fúzní aktivitu, tj. mající v podstatě tutéž fúzní aktivitu jako má intaktní virus chřipky. Fúzní peptid je virový glykoprotein, jako je hemaglutinin nebo jeho derivát, nebo syntetický fúzní peptid schopný vyvolat rychlou fúzi uvedených váčků s endozomálními membránami cílových buněk po endocytóze.

Nové váčky nebo virozomy jsou obzvláště užitečné pro přenos jakéhokoliv požadovaného gene40 tického materiálu na cílová místa, zejména do živočišných a lidských buněk a tkání in vitro a in vivo. Je nutné zdůraznit, že nové virozomy jsou nejen schopné proniknout do proliferujících, tj. replikujících se buněk, ale také do neproliferuj ících, tj. klidových buněk, přičemž tato vlastnost je činí široce upotřebitelnými v biologických vědách, farmakologii a medicíně, jak pro výzkum a/nebo pro diagnostiku a jako léčivo. Pro použití jako léčivo mohou být virozomy podle předklá45 daného vynálezu částí farmaceutického přípravku, který dále obsahuje obvyklá aditiva a farmaceuticky vhodné nosiče. Výhodně je farmaceutický přípravek ve formě roztoku pro injekce, ale pro některé aplikace pro topické nebo systémové podávání mohou být výhodné jiné formy přípravy, např. emulze, krémy, gely, masti.

Proto je také cílem předkládaného vynálezu použít virozomy podle předkládaného vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku vhodného pro profylaktické a/nebo léčebné ošetřování zvířecích nebo lidských jedinců, kteří mohou mít z takového ošetření prospěch. Dalším cílem předkládaného vynálezu je použití virozomů podle vynálezu pro výrobu diagnostické soupravy (kitu) pro aplikace in vitro a in vivo.

-4CZ 299809 B6

V jednom provedení předkládaného vynálezu jsou váčky získány postupem zahrnujícím účinnou rekonstituci hemaglutininu (HA) viru chřipky A (influenzy A). Podle toho je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout způsob přípravy kationtových virozomů. Ve výhodném provedení vynálezu způsob dále zahrnuje kroky inkorporace genetického materiálu do kationtových lipido5 vých váčků. Způsob přípravy v základě zahrnuje následující kroky:

1) Rozpuštění kationtových lipidů v neionogenním detergentu, výhodně oktaetylenglykolmonon-dodecyléteru (OEG, Ci₂E₈), spolu s virovými membránovými „spike“ glykoproteiny (nejlépe purifi kovanými), genetickým materiálem požadovaným pro přenos a s předem vytvořenými io molekulovými komplexy tvořenými fosfatidyletanolaminem, vazebnou molekulou a buněčně specifickým markérem, a

2) tvorbu váčku prostřednictvím (nejlépe opakovaného) odstranění detergentu mikronosiěovými kuličkami absorbujícími detergent, výhodně polystyrénovými kuličkami typu SM-2 Biobeads s výhodnou zrnitostí (za vlhka) 20 až 50 (0,84 až 0,30 mm).

Podle vynálezu je použita vhodná dvoj funkční vazebná molekula. Buněčně specifický markér, který je namířen na buněčný receptor odpovědný za selektivní vazbu virozomů k buňce, je navázán na vazebnou molekulu tak, že je stále plně biologicky aktivní. Vazebná molekula, která má být použita, je ve formě předem vytvořeného molekulového komplexu, kde vazebná, molekula je kovalentně navázána k oběma molekulám, tj. fosfatidyletanolaminu i buněčně specifickému markéru.

Díky funkčně aktivním fúzním peptidům virozomů podle předkládaného vynálezu je opouzdřený materiál uvolněn do cytosolu cílové buňky převážně při snížení endozomálního pH (jak naznačeno výše). Takové kontrolované uvolnění na jedné straně prodlužuje dobu pobytu přenášeného materiálu v cílové buňce a na druhé straně zabraňuje nežádoucímu dlouhému pobytu virozomů uvnitř endozomů, a tím snižuje nebezpečí nespecifické degradace cenných látek přenášených virozomy.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká váčků, kde membránové lipidy navíc zahrnují fosfatidylcholin a fosfatidyletanolamin, které dále zlepšují možnosti specifického návrhu virozomů a/nebo usnadňují zakotvení fúzních peptidů a/nebo buněčně specifických markérů v membráně.

Termín „fúzní peptid“, případně fuzogenní peptid označuje takové peptidy nebo proteiny, které jsou schopné navodit a/nebo podpořit fúzní reakci mezi membránou virozomů a íipidovou mem„ .bránou cílové buňky. V.e; většině_provedení se^Ttýká. virových.povrchových membránových ... „spike“ glykoproteinů obsahujících fúzní peptid, zejména kompletního povrchového hemagluti40 ninového trimeru z virového obalu, jeho monomeru, nebo jedné či obou naštěpených podjednotek, glykopeptidů HA1 a HA2, obsahujících funkční fúzní peptid. V dalším provedení předkládaného vynálezu se tentýž termín týká samotného čistého fúzntho peptidu, buď izolovaného z přírodních zdrojů, nebo tvořeného synteticky. V obzvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu se tyto polypeptidy obsahující fúzní peptid vztahují k hemaglutininům chřipky, zejména hemaglutininu subtypu A-HiNj. Syntetické fúzní peptidy jsou výhodně vybrány ze sekvencí aminokyselin uvedených v seznamu v tabulce 1 níže, kde jsou aminokyseliny označeny svými odpovídajícími jednopísmennými kódy (viz také příklad 6 a obr, 2 z WO 92/13525).

Termín „vazebná molekula“ případně vazebné (zesíťující) agens označuje organickou hetero50 bifunkční molekulu, která je schopná navázání na povrch váčků připravených podle tohoto vynálezu a současně schopnou navázání polypeptidů. V provedení předkládaného vynálezu tato molekula obsahuje N-hydroxysukcinimidovou skupinu pro vazbu k aminokyselinové skupině fosfatidyletanolaminu a maleimidovou skupinu pro konjugaci fragmentů monoklonální protilátky, jako jsou sukcinimidyM-(N-iTialeirnid-metyl)cyk]ohexan-l-karboxylát, m-maleimido55 benzoyl-N-hydroxysukcinimid ester, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosukcin-imid ester,

-5 CZ 299809 B6 sukcinimidyM-(p-inaleimidofenyl)but\'rát, sulfo-sukcinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrát, nebo obsahuje N-hydroxysukcinimidovou skupinu a fotoreaktivní azidovou skupinu pro vazbu na cytokiny, jako je N-hydroxy-sukcinimidylsuberát (NHS-SA), N-hydroxysukcinimidyMazido-benzoát (HASAB), N-sukcinimi-dyl-6-(4'-azido-2’-nitro-fenylamÍno)hexanoát (SANPAH),N-sulfo-sukcinimidyl-6-(4^,-azido-2'-nÍtrofenylamino)hexanoát

Tabulka 1

C CGLFG-	AI A G F I E NG W E G Μ I D G	W Y G
	G L F G	AIAGFIENGWEGMIDG	W Y G C C C .
C CGLFG	A I A G F I E N G W E G Μ I 3 G ·
	G L F G	A I A G F Γ E N G W E G Μ I D G	C C: C
C C G L F E	A I A G F I E N G W’ E G Μ I D G
	G L F E	AIAGFIENGWEGMIDG	CCC
.C C E L F G	A I A G F I E N G W E G. Μ I D :G
	E L F G	AIAGFIENGWEGMIDG	CCC
CC C L F :G	A I A G F I E N G· W E GM I DG
	L F G	AIAGFIENGWEGMI DG	ccc
C C. C	PPG .A. V I G T I A L G V A T A	A G I T
		? P G A V Ϊ G TIALGVA.TA	A 'G I T-	c c c
	CCC	P A G V V I G L A A L G V A T A	A G V T
		PAGVVIGLAAL-GVATA	A G^V T	C C c
	CCC	? I G A I I G G V A L G V A T .A	A ,G I T
		pigaiiggv.algvat A	A G I T	C C, c

Vazebná molekula, která je použita, je ve formě předem vytvořeného molekulového komplexu lipidu, vazebné molekuly a buněčně specifického markéru, ......

Termín „buněčně specifický protein nebo markér se vztahuje k proteinu schopnému vazby k vazebné molekule nebo komplexu vazebné molekuly s lipidem, a dále schopnému vazby k receptoru cílových buněk. V provedení předkládaného vynálezu je tato molekula sloučenina specifická pro buněčný receptor, jako je monoklonální protilátka, protilátkový fragment, cytokin nebo růstový faktor. Buněčně specifický markér poskytuje selektivní detekci a vazbu cílových buněk, a tedy zlepšuje akci fúzního peptidu, který je současně přítomný na membráně virozomů. Výhodné protilátkové fragmenty zahrnují F(ab')₂ a Fab', zatímco buněčně specifické markéry dále zahrnují interleukiny a jiné cytokiny, zejména ty, které jsou uvedeny v seznamu v následující tabulce 2.

-6CZ 299809 B6

Tabulka 2 _; Cytokiny (mezinárodní z.kratky)

BDNF	IFNa	MIP-la	PDGF
CNTF	ΙΕΝβ	ΜΪΡ-1β	PF-4.
EGF	IFNy	MIP-2	RANTES
Epo	IL-l áž IL-15,	NGF	SCF
FGF	LIF	NT-3	TG-Fa
G-CSF	L.T (TNFp)	NT-4	TGFP’
GM-CSF	MCP-1 až MCP-3.	OSM	TNFa
I^309/TCA-3	M-CSF	PBP	Tpó
γΙΡ-l.C	. .MXF.......	PBSF	VEGF

Termín „kationtový lipid“ používaný zde se týká organické molekuly, která obsahuje kationtovou složku a nepolární část („ocásek“) a takzvanou amfifilní část („head-to-tail“), jako je např. N[(l,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniumchlorid .(DOTMA) (Felgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7414, 1987), N-[(l,2,3-dí-oleoyloxy)propyí]-N,N,N-trimetylamoniummetylsulfát (DOTAP), nebo N-T-butyl-N'tetradecyl-3-tetradeeylaminopropíon10 amidin (Ruysschaert et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 203, 1622-1628, 1994). Pokud není výslovně uvedeno jinak, termín také zahrnuje dále definované polykationtové lipidy.

Termín „polykationtový lipid“ se týká organické molekuly, která obsahuje polykationtovou složku a nepolární úsek („ocásek“), jako je např. lipospermin: l,3-dipalmiltoyl-2-fosfatidyletanol15 amidospermin (DPPES) a dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS) (Behr et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986, 1989), 2,3“dioleoyloxy-N-[2(sperminkarboxamído)etyl]-N,Ndimetyl-l-propanamonium-trifluoroacetát (DOSPA), 1,3-dioleoyloxy-2-(6-karboxy-speřmyl)propylamid (DOSPER), N,N,N’,N'-tetrametyl-N,N’-bis (2-hydroxyetyl)~2,3-dioleoyloxy-l,4butandiamoniumjodid (THDOB).

Termín „nukleová kyselina“ nebo „genetický materiál“ používaný zde zahrnuje krátký řetězec DNA nebo RNA, deoxýribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidselenoáty, oligodeoxyríbonukleotidfosforothioáty (OPT), oligodeoxyribonukleotidfosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidmetylfosfonáty, peptidové nukleové kyseliny (PNA), ribonukleotidy, oli 25 goribpnukleotidy, oligoribonukleotidfosforothioáty, . 2'-OMe-oligoribonukíeotidfosfáty, 2'- — OMe-oligoribonukleotidfosforothíoáty, ribozymy (molekuly RNA s enzymatickými aktivitami), geny, plazmidy a vektory (klonovací nosiče).

Termín „vírozomy“ používaný zde se vztahuje - ve své nejjednodušší formě - k lípozomovým váčkům s dvojvrstevnou membránou obsahující kationtové lipidy a vnitřní - nejtépe vodný prostor, a kde membrána dále obsahuje virové proteiny, zejména virové glykoproteiny. Ve výhodném provedení virové proteiny zahrnují alespoň jeden peptid schopný fúze nebo. protein, který má plnou biologickou fúzní aktivitu, zejména „spike“ glykoprotein hemaglutinin a/nebo neuraminidáza viru chřipky A (např. virus A/Singapur), Rozumí se, že virové proteiny také zahr35 nují synteticky tvořené aminokyselinové sekvence odpovídající anebo shodné s fúzním peptidem viru chřipky, jak je zde popsáno. Membránové lipidy zahrnují kationtové lipidy definované výše, ale mohou volitelně dále zahrnout další přirozené a/nebo syntetické lipidy, výhodně fosfol ipidy, jako je fosfatidyleholin (PC) a fosfatidyletanol amin (PE).

Ačkoliv kationtové vírozomy předkládaného vynálezu mohou být v mnoha případech - zvláště v pokusech s in vitro tkáňovými kulturami - úspěšně aplikovány bez buněčně specifických markérů na membráně, zejména pro aplikace in vivo je výhodné, že dále obsahují alespoň jeden buněě-7CZ 299809 B6 ně specifický markér na membráně, jak zde výše definována. Střední průměr váčků je v rozmezí 120 až 180 nm, jak bylo určeno elektronovou mikroskopií a měřením dynamického rozptylu světla.

Termín „plná (biologická) fúzní aktivita“ používaný zde vyjadřuje, že virozomy podle předkládaného vynálezu obsahující rekonstituované virové proteiny v membráně váčku mají v podstatě tutéž fúzní aktivitu pro cílové buňky jako intaktní virus, z kterého jsou obvykle virové proteiny rekonstituovány. Srovnání schopnosti fúzovat kationtových virozomů je výhodně srovnáváno s intaktním virem chřipky A. Fúzní aktivita se měří známými postupy, zejména jak bylo publikoío váno autory Hoekstra et al. (Bíochemistry, 23, 5675- 5681, 1984) nebo Luscher et al. (Arch.

Virol., 130,317-326- 1993).

Ještě než může být „antisense“ technologie použita léčebně nebo profylakticky u pacienta, který ji potřebuje, je.nutné napřed vyřešit velký počet technických problémů, týkajících se zejména vývoje vhodného nosičového systému. Například genetický materiál, jako jsou např. „antisense“ oligonukleotidy, může být nestabilní a rozkládat se, nebo být jinak více ěi méně inaktivován před tím, než dosáhne cílové buňky a bylo by tedy nutné používat velká množství tohoto materiálu zachyceného v konvenčních kationtových lípozomech. Díky těmto velkým množstvím pak vyvstává otázka potenciální toxicity v lidském nebo zvířecím těle.

Použitím kationtových virozomů podle předkládaného vynálezu jako nosiče pro genetický materiál mohou být tyto problémy úspěšně překonány a mohou se předejít nebo alespoň významně snížit nežádoucí vedlejší účinky způsobené toxicitou. Tento prospěšný účinek je dosažen tím, že předkládané kationtové virozomy mají - ve srovnání s lipozomy nebo virozomy doposud zná25 mými - mnohem vyšší aktivitu a účinnost vyjádřenou faktorem až 1000-20 000 pro přenos uzavřeného genetického materiálu, jako jsou např. „antisense“ oligonukleotidy, do cílových buněk. Je tedy prakticky nemožné srovnat výkonnost konvenčních virozomů nebo kationtových lipozomů s výkonností kationtových virozomů podle předkládaného vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje mikrofotografii virozomů DOTAP s virovými „spike“ proteiny.

Obrázek 2 ukazuje fúzní aktivitu indukovanou pH virozomů DOTAP značenými oktadecylrhodamidem B s modelovými lipozomy.

Obrázek 3-ukazuje virozomy DOTAP s opouzdřenými „antisense“ FITC-OPT inkorporovanými^! clo buněk lidského malobuněčného plicního karcinomu.

Obrázek 4 a obrázek 5 ukazují vynikající příjem „antisense“ virozomů L-myc-DOTAP do buněk lidského malobuněčného plicního karcinomu transfekční účinnost a vynikající účinnost transfekce.

Obrázek 6 ukazuje inkubaci různých buněk lidského malobuněčného plicního karcinomu s „antisense“ virozomy L-myc.

Obrázky 7a, 7b ukazují transfekční účinnost virozomů pRSVcat-DOTAP pro buňky Jurkat.

Obrázek 8: fúze virozomů DOTAP s fosfolipidovými lipozomy. Fúze se měřila testem R18 ve ’ 37 °C.

Obrázek 9: inkorporace thymidinu do buněk NCI-H209 ošetřenými virozomy. 75 μΐ virozomů obsahujících 200 pmol buď „antisense“, „sense“, nebo msc FITC-OPT a 625 μΐ čerstvého média obsahujícího 0,5 pCi ¹⁴C-thymidinu se přidalo k 5x10⁴ buněk/ml na jamku.

-8CZ 299809 B6

Obrázek 10: inhibice inkorporace thymidinu závislá na dávce do buněk NCI-H209 při přidání virozomů obsahujících „antisense“ L-myc-OPT. Buňky NC1-H209 se inkubovaly při počáteční koncentraci buněk lxl0⁵/ml na jamku. Hodnoty jsou průměry ± směrodatné odchylky ze tří pokusů.

Obrázek 11: inkubace různých buněčných linií lidského malobuněčného plicního karcinomu se 75 μί „antisense“ virozomů L-myc. Exprese onkogenu L-myc se snižuje v buněčných liniích, jak uvedeno: H82 < H510A < H209. Virozomy série 1 obsahovaly menší množství „antisense“ L10 myc než virozomy série 2.

Obrázek 12 : transfekce buněk Sp2 dvěma odlišně připravenými virozomovými preparáty.

Obrázek 13: transfekce buněk P3/NS1 dvěma odlišně připravenými virozomovými preparáty.

Obrázek 14: transfekce buněk NIH/3T3 dvěma odlišně připravenými virozomovými preparáty.

Obrázky 15, 16, 17: růst buněk KG1 při ošetření se „sense“ a „antisense“ virozomy c-mybDOTAP. Přidáno 25, 50 nebo 100 μί roztoku virozomu obsahujícího 18,36 nebo 72 pmol OPT, v uvedeném pořadí. Hodnoty jsou průměry ± směrodatné odchylky ze tří pokusů.

Obrázek 18: růst buněk CEM-C3 při ošetření s virozomy DOTAP při přidání 50 μί roztoku „sense“ a „antisense“ virozomů c-myb. Hodnoty jsou průměry ± směrodatné odchylky ze tří pokusů.

²⁵

Aby byl vynález zde popisovaný plněji pochopen, jsou uvedeny následující příklady. Příklady slouží pouze pro účely ilustrace a nemají být chápány jako omezující v jakémkoliv aspektu tohoto vynálezu.

³⁰

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava kationtového lipidového váčku s virovými hemaglutinlnovými trimery s plnou fúzní aktivitou z viru chřipky obsahujícími opouzdřené „antisense“ oligodeoxynukleotidy L-mycFITC (= značené fluoresceinem) , .

Příprava virozomů DOTAP a virozomů DOTAP-fosfatidylcholin (PC)

Hemaglutinin (HA) z kmene chřipky A/Singapur/6/86 byl izolován, jak popsali Skehel a Schild (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 968,972, 1971). Ve stručnosti, virus se pěstoval v alantoinové dutině slepicích vajec a byl dvakrát purifikován ultracentrifugací na sacharózovém gradientu.

Purifikovaný virus byl stabilizován v pufru obsahujícím 7,9 mg/ml NaCl, 4,4 mg/ml troj sodného citrátu.H₂O, 2,1 mg/ml 2-morfolinoetansulfonové kyseliny, a 1,2 mg/ml N-hydroxy-etyl-piperazin-N-2-etansulfonové kyseliny pH 7,3. Z 53 ml virové suspenze obsahující 345 pg HA v 1 ml byla vytvořena peleta ultracentrifugací při 100 000 x g po dobu 10 minut. K peletě viru chřipky se přidalo 7,7 ml pufrovaného roztoku detergentu obsahujícího 145 mM NaCl, 2,5 mM

HEPES a 54 mg/ml neionogenního detergentu oktaetylenglykolmonododecyléteru (OEG=Ci2E₈), pH 7,4. Peleta se kompletně rozpustila použitím ultrasonikace po 2 minuty při teplotě místnosti, Roztok se odstředil v ultracentrifuze při 100 000 x g po dobu 1 hodiny. Získaný supematant obsahoval solubilizovaný trimer HA (1,635 mg HA/ml) a stopové množství neuraminidázy. Ke 3,7 ml supematantu (6 mg HA) se přidalo 6.mg DOTAP a rozpustilo. Roztok se sterilizoval prů55 tokem přes 0,2 μτη filtr, a poté se přenesl do skleněné nádobky obsahující 1,15 g sterilních mik-9CZ 299809 B6 ronosičových kuliček, nejlépe „Biobeads SM-2“. Nádobka se třepala 1 hodinu při použití třepačky REAX2 z Heidolphu (Kelheim, Německo). Bylo—li nutné, tento postup se opakoval až třikrát s 0,58 mg Biobeads. Tímto postupem se získal slabě transparentní roztok virozomů DOTAP.

Pro tvorbu virozomů DOTAP-PC se k supematantu obsahujícímu 6 mg HA přidaly 3 mg DOTAP a 3 mg PC a rozpustily. Následné kroky byly tytéž, jak byly popsány v předchozím textu pro virozomy DOTAP.

Příprava virozomů se syntetickým fúzním peptidem ¹⁰

Jedna možnost přípravy kationtových virozomů nesoucích syntetické fúzní peptidy v membráně zahrnuje následující kroky:

1. Aktivace fosfatidyletanolaminu (PE) vazebnou molekulou N-[y-maleimidobutyryloxy]15 sukcimid esterem (GMBS) v reakci

PE + GMBS —* MBS-PE + N-hydroxysukcinimid, jak popsáno autory Martin et al. (írreversible coupling of immunoglobulin fragments to preformed vesicles, J. Biol. Chem., 257, 286-288, 1982).

2. Příprava lipidových váčků s aktivovaným PE (GMB-PE), kdy se rozpustí 20% fosfatidylcholin, 70% DOTAP a 10% GMB-PE v pufrovaném roztoku detergentu, jak popsáno výše pro HA obsahující virozomy DOTAP. Následné kroky přípravy lipidových váčků jsou tytéž, jak byly popsány v předchozím textu pro virozomy DOTAP.

3. Vazba syntetického fúzního peptidu na liptdové váčky, kdy se používá peptíd obsahující 20 aminokyselin mající aminokyselinovou sekvenci G-L-F-E^;-A-I-A-G-F-l-E-N-G-W-E-GM-I-D-C, a který obsahuje volnou aminovou skupinu na N-koncové části a amidovou skupinu na C-koncové Části. Protože aminokyselina na C-koncové části je cystein, je zde dostupná volná thiolová skupina pro vazbu peptidu k GMP-PE v membráně lipidových váčků.

Pro provedení vazebné reakce:

PE-GMBmembráiia ⁺ HS-cys-peptid —> PE-GMB_mcmbrana-S-cys-peptid se smísí roztok čerstvě připravených lipidových váčků v pufru (40mM kyselina citrónová, 35mM fosforečnan sodný, lOOmM NaCl, a 2mM EDTA, pH 5,5) s roztokem peptidu v tomtéž pufru. Směs se jemně míchá v dusíkové atmosféře přes noc při 4 °C. Lipidové váčky se oddělí od nekonjugováných peptidu gelovou filtrací na-koloně High Load Superdex 200:

V další části je ukázán postup přípravy virozomů podle vynálezu využívající předem vytvořené komplexy „PE-dvojvazebné činidlo—peptid“

Inkorporace fosforothioátových oligodeoxyribonukleotidů do virozomů DOTAP „Antisense“ a „sense“ oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty (OPT) genu L-myc byly použity jako příklad pro demonstraci vysoké účinnosti kationtových virozomů v transfekci. Prostřednictvím chemického postupu s fosforamidity (Microsynth GmbH, Balgach, Švýcarsko) se syntetizovaly 5-FITC-OPT. Jako „antisense“ OPT a „sense“ OPT se použily v uvedeném pořadí pentadekamer (5’-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3') a pentadekamer (5-FITC-GCGGACATGGACTAC-3'). Syntetizovaly se kontrolní OPT se smíšenou sekvencí (mixed sequence control so msc) skládající se z nukleotidů téže délky jako „antisense“ a „sense“ OPT.

ml virozomů DOTAP nebo DOTAP-PC se přidal ke každému z následujících:

a) 2 mg „antisense“ FITC-OPT (1,3 pmol), .

b) 3,4 mg „sense“ FITC-OPT (1,3 pmol) a

-10CZ 299809 B6

c) 3,1 mg msc FITC-OPT (1,3 pmol),

FITC-OPT se rozpustily a roztoky se poté sonikovaly 2 minuty při 26 °C. Neopouzdřené FITCOPT se oddělily od virozomů gelovou filtrací na koloně Hígh Load Superdex 200 (Pharmacia,

Švédsko). Kolona se ekvilibrovala sterilním PBS. Frakce obsahující virozomy DOTAP s opouzdřenými FITC-OPT se eluovaly PBS a sbíraly. Koncentrace virozomy opouzdřeného FITC-OPT se určovaly fluorometricky poté, co se virozomy plně rozpustily v 0,IM NaOH obsahujícím 0,1% Triton X-100. Pro účely kalibrace fluorescenční stupnice byla fluorescence prázdných virozomů DOTAP, které byly rozpuštěny ve výše zmíněném roztoku detergentu, stanovena jako nulová.

Vazba fragmentů Fab' na virozomy prostřednictvím předem vytvořených molekulových komplexů fosfatidyletano lam i n-dvoj funkční vazebná molekula-peptid mg čerstvě redukovaných Fab' z myší monoklonální protilátky anti-CDlO (anti-CALLA), roz15 puštěné ve 2,8 ml pufrovaného roztoku kyseliny citrónové (lOOmM NaCI, 40mM kyselina citrónová, 35mM Na₂HPO4.2H₂O, 2mM EDTA, pH 5,5), se přidaly k roztoku 0,524 mg N-[4-(pmaleimidfenylbutyrylj-fosfatidyletanolaminu (ΜΡΒ.ΡΕ) ve 215 μΙ pufru kyseliny citrónové obsahujícím 0,5% n-oktyloligooxyetylen. Směs se poté inkubovala pod dusíkem 16 hodin ve °C za jemného míchání. Po inkubaci byl odstraněn nenavázaný MPE.PE dávkou 400 μΐ čerstvě redukované vlhké sefarózy „Thiopropyl Seharose 6B“ (Pharmacia, Švédsko). Směs se inkubovala hodiny při teplotě místnosti. „Thiopropyl Seharose 6B“ se odstranila centrifugací a výsledný roztok se neutralizoval na pH 7,0. Neutralizovaný roztok se doplnil OEG (54 mg/ml).

Roztoky připravené výše popsaným způsobem se přidaly k roztokům pro přípravu virozomů

DOTAP. Molekuly Fab-ΜΡΒ.ΡΕ jsou vloženy do lipidové dvojvrstvy během tvorby virozomů. Pozorování elektronovým mikroskopem

Mikrofotografie virozomů DOTAP potvrdily výhodnou monolamelámí strukturu váčků se střed30 ním průměrem přibližně 120 až 180 nm, jak bylo určeno měřením rozptylu laserového paprsku. „Spike“ proteiny HA viru chřipky jsou jasně viditelné (obr. 1).

Určení fúzní aktivity virozomů DOTAP

Fúzní aktivita předkládaných virozomů DOTAP se hodnotila kvantitativním testem založeným na měření snižování zhášení fluorescence popsaném autory Hoekstra et al.(Biochemistiy, 23, 5675— 5681, 1984) a Luscher et al. (Arch. Virol, 130, 317-3263 1993). Fluorescenční sonda chlorid .oktadecylrhodamidu B (R18) (získaná od Molecular Probes lne'.,. Eúgeňe,.USA).še vkládala vé vysoké hustotě do membrány virozomů DOTAP přidáním pufrovaného roztoku OEG (C^Es), . 40 který obsahoval DOTAP a HA, k tenkému suchému filmu fluorescentní sondy, což bylo následováno třepením 5 až 10 minut pro rozpuštění sondy, a poté se pokračovalo, jak popsáno výše v „Příprava kationtových lipidových váčků...“. Diluce rhodamidu zhášejícího fluorescenci se pozorovala inkubací virozomů DOTAP značených rhodamidem s modelovými lípozomy (poměr DOTAP : lipozomální fosfolipid = 1:20). Fluorescence se měřila spektrofluorometrem Perkin45 Elmer 1000 v excitačních a emisních vlnových délkách 560 a 590 nm. Obrázek 2 ukazuje fúzní reakci navozenou pH virozomů DOTAP vyjádřenou jako procento snížení zhášení fluorescence (% FDQ).

-11 CZ 299809 B6

Buněčný příjem opouzdřených antisense-L-myc-FITC-OPT

Pro studium mechanismu buněčného příjmu virozomů DOTAP se ukázalo velmi užitečným značit OPT fluoresceinem.

Buňky lidského malobuněčného plicního karcinomu (ATCC-NCI-H209), které exprimuj í vysoké hladiny genu L-myc (Nau et al.. Nátuře, 318, 69-73, 1985) se pěstovaly sklíčkách s dvěma jamkami pro tkáňové kultury (Nunc, Naperville, IL 60566, USA). K buňkám se přidalo 50 μΐ virozomů FITC-OPT. Inkubovaly se 5, 15 a 30 minut ve 37 °C, dvakrát se promyly PBS, a poté io se vyšetřily fluorescenční mikroskopií. Jak lze vidět na obrázku 3, byly virozomy DOTAP s opouzdřenými antisense FITC-OPT rychle inkorporovány do buněk.

Zkoumání biologického účinku virozomů antisense-L-myc-FlTC-OPT-DOTAP měřeného metodou inkorporace thymidinu

Buňky lidského malobuněčného plicního karcinomu (ATCC-NCI-H209, American Type Culture

Collection, Rockville, USA) se pěstovaly na 24-jamkových destičkách Costar v počáteční koncentraci 1 x 10⁵ na jamku a na 1 ml. Po inkubaci 24 hodin se odstranilo živné médium a přidalo se 625 μΐ čerstvého živného média obsahujícího 0,5 pCi ¹⁴C-thymidinu (připraveno z [2- ¹⁴C] thymidinu, 52,0 mCi/mmol, Amersham, Anglie) a 75 μΐ virozomů DOTAP obsahujících

0,2 nmol buď „antisense“, „sense“, nebo msc FITC-OPT. Tkáňové kultury se jemně třepaly velmi pomalým natřásáním l hodinu ve 37 °C, a poté se přenesly do inkubátoru. Po 48 hodinách byly buněčné suspenze odebrány, přeneseny do centrifugačních kyvet a odstředěny. Získané buněčné pelety se dvakrát promyly. Pokud nebylo možné buňky dostatečně rozptýlit do suspenze jednotlivých, byly buňky krátce vystaveny působení roztoku trypsin/EDTA. Buněčné pelety se rozpustily v 1,5 ml roztoku 0,lM NaOH/Triton-X-100 (0,1%). K 1 ml roztoku se přidaly 3 ml kapalné scintilační směsi (Ready Protein +, Beckman, Fullerton, CA, USA). Radioaktivita ¹⁴C se měřila na scintilačním počítači (Beckman, Fullerton, CA, USA),

Obrázky 4 a 5 jasně ukazují nadprůměrný příjem a transfekční účinnost virozomů antisense-Lmyc-DOTAP.

Obrázek 6 ukazuje, že buňky, které neexprimují L-myc, nejsou ovlivněny nebo inhibovány virozomy antisense-L-myc. Také prázdné virozomy nevykazují žádné účinky na rakovinné a nor35 mální buňky. Proto se zdá, že protinádorová léčba s „antisense“ OPT opouzdřenými ve virozomech podle předkládaného vynálezu může mít velké možnosti, zejména kvůli odstranění výše zmíněných nevýhod konvenčních kationtových lipozomů.

Příklad 2

Příprava kationtového lipidového váčku s virovými hemaglutininovými trimery s plnou fúzní aktivitou z viru chřipky obsahujícího opouzdřený vektor pcDNA3 s lidským genem IL—6 klonovaným do mnohočetného klonovacího místa (polylinkeru) (= pcDNA3-IL-6)

Příprava virozomů DOTÁP s inkorporace pcDNA3-IL-6 pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, USA) je vektor o velikosti 5,4 kb navržený pro vysoce stabilní i přechodnou expresi v eukaryotických hostitelích. HA byl izolován a purifíkoso ván, jak bylo popsáno v příkladu 1.

mg DOTAP se rozpustily v 0,5 ml pufrovaného roztoku detergentu obsahujícího 145mM NaCl, 2,5mM HEPES a 54 mg/ml OEG (=Ci2Eg), pH 7,4, a přidaly k2 ml supematantu obsahujícího 4 mg HA. K výsledné směsi se přidalo a rozpustilo 100 pg pcDNA3-IL-6. Roztok se podrobil

30s ultrasonikaci. OEG se odstranil pomocí Biobeads, jak bylo popsáno v příkladu 1.

-12CZ 299809 B6

Transfekce virozomů DOTAP naplněných pcDNA-IL-6 do buněk myšího myelomu

Získaný roztok obsahující virozomy DOTAP naplněné pcDNA-IL-ó byl naředěn 1:1000 PBS.

20 μί a 50 μί tohoto roztoku o obsahu 1 ng a 2,5 ng pcDNA-IL-6, v uvedeném pořadí, se přidalo k 2 x 10⁶ myelomových buněk (P3/NSI/l-Ag4-l,.American Type Culture Collection, Rockville, USA). Po 48 hodinách inkubace se supematant z tkáňových kultur testoval na lidský IL—6 testem ELISA. Naměřil se obsah 20 až 45 pg 1L-6 na 1 ml.

io Srovnání transfekční účinnosti virozomů DOTAP naplněných pcDNA-IL-6 s lipozomy DOTAP naplněnými pcDNA-IL-6

V myelomových tkáňových kulturách transfekovaných konvenčními lipozomy DOTAP (které postrádají virové fúzní peptidy), které obsahovaly totéž množství pcDNA-IL-ó jako virozomy

DOTAP, nebyl nalezen žádný IL~6. Aby se získaly stejné výsledky transfekce jako u virozomů DOTAP naplněných pcDNA-IL-6, bylo nutné zvýšit množství lipozomů DOTAP naplněných pcDNA-IL-6 faktorem jeden tisíc (1000)!

. Příklad 3

Příprava kationtového lipidového váčku s virovými hemaglutininovými trimery z viru chřipky s plnou fúzní aktivitou obsahujícího opouzdřený vektor pRSVcat

Příprava virozomů DOTAP a inkorporace pRSVcat

Expresní vektor pRSVcat (od ATCC, Rockville, USA) obsahuje gen CÁT, který kóduje choramfenikolacetyltransferázu (CAT). Enzym katalýzu je přenos acetylové skupiny z acetylkoenzymuA (acetyl-KoA) na 3'-hydroxylovou skupinu chloramfenikolu. Vektory CAT jsou obecně pou30 žitelné pro monitorování transfekční účinnosti.

PRSVcat byl opouzdřen virozomy DOTAP za podmínek popsaných v příkladu 2.

Transfekce virozomů DOTAP naplněných pRSVcat do buněk Jurkat

Buňky Jurkat (10⁶ buněk/ml) se inkubovaly s různým množstvím virozomů DOTAP naplněných pRSVcat (0,0001 μί až 25 μί). Po 48 hodinách inkubace ve 37 °C se měřila CAT aktivita testem

.. ? CAT-ELIS A. (Boehringer. Mannheim, Německo).. . .. ...... . _{r r}. ...... .

Obrázky 7a a 7b ukazují, že maximum transfekce. se dosáhne přidáním 0,01 μί virozomů DOTAP. Na rozdíl od výše zmíněného, přidání 0,01 μί lipozomů DOTAP naplněných pRSVcat k buňkám Jurkat za stejných inkubačních podmínek nemělo za následek žádnou detekovatelnou aktivitu CAT.

Příklad 4

Příjem virozomů buňkami

Vstup virozomů do cílových buněk může být rozdělen do dvou oddělených kroků:

L Navázání

2. Penetrace.

-13CZ 299809 Bó

Navázání zahrnuje vazbu virozomů prostřednictvím HA k buněčným receptorum, kterými jsou membránové glykoproteiny nebo glykolipidy s koncovou kyselinou sialovou. V případě specifických virozomů fragmenty Fab’ budou navíc rozpoznávat antigenní struktury na povrchu cílové buňky, což má za následek navázání k cílovým buňkám dvěma různými vazebnými mechanismy.

Specifické virozomy projevují tedy selektivitu pro speciální buněčné typy. Virozomy s fragmenty Fab', které rozpoznávají antigeny spojené s nádory, jako jsou TAG-72, CEA, 17-1 A, CA 19-9, nebo antigeny spojené s leukémií, jako jsou CD 10 (CALLA) a CD20, se budou selektivně vázat na nádorové nebo leukemické buňky nesoucí uvedené antigeny na svém buněčném povrchu. Hemaglutininové glykoproteiny jsou pečlivě izolovány a purifíkovány. Nedochází zde k žádné ío inaktivaci buď proteolytickým štěpením, nebo redukcí intramolekulární disulfídových (—S—S—) vazeb.

Penetrace zahrnuje vstup virozomů do buněk endocytózou zprostředkovanou receptorem. Virozomy jsou zachyceny v endozomech. Kyselé pH (5-6) v endozomech spouští fúzi virozomové . membrány s membránou endozomu. Fúze je zprostředkována virovým „spike“ glykoproteinem hemaglutininem (HA). Membránová fúzní reakce v endozomu uvolňuje virozom od lipidového obalu a poskytuje přístup opouzdřeným léčivům do cytosolu. Fúzní aktivita těchto virozomových přípravků se testovala měřením snížení zhášení fluorescence. Virozomy byly značeny fluorescenční sondou chloridem oktadecylrhodamidu B (R18) a fúzní aktivita HA se monitorovala jako snížení zhášení fluorescence způsobené naředěním sondy z virozomové na lipozomovou cílovou membránu. Obrázek 8 ukazuje fluorescenci pozorovanou po přidání virozomů DOTAP, značených R18, k fosfolipidovým lipozomům. Fluorescence se začala rychle zvyšovat, což naznačuje intaktní fúzi zprostředkovanou HA.

Příjem buňkami závislý na čase

Příjem virozomů se měřil tak, že se buňky inkubovaly s virozomy značenými ^l4C. Buňky P3/NS1 v koncentraci lx.l0⁵/ml se inkubovaly se 40 μΐ virozomů ve 37 °C po dobu 5, 10, 15, 20 a 30 minut. Po promytí se buňky lyžovaly a měřilo se množství virozomů značených ¹⁴C. Jak lze vidět v tabulce 3, buněčný příjem je velmi rychlý: během prvních pěti minut bylo inkorporováno 10 % virozomů. Delší inkubační časy již příjem dále nezvýšily, 1 ml virozomového roztoku obsahoval přibližně 10¹¹ až 10¹² virozomů, tudíž během 5 minut se inkorporovalo 4000 až 40 000 virozomů dojedné buňky,

Tabulka 3

J i

’ Doba 'irikubace (min) τ	' ďpm
5.	6414
,10	683Z
15	6096'
20	6610
30	6626

- 14CZ 299809 Bó

Příklad 5 „Antisense“ strategie v léčení rakoviny

Takzvané „antisense“ oligodeoxynukleotidy (ODN) jsou krátké nukleotidové sekvence DNA syntetizované jako opačné komplementární sekvence k požadované mRNA cílové nukleotidové sekvenci, Tvorbou duplexu RNA-DNA se tak zabrání translaci informační RNA (mRNA) a podpoří se zničení molekuly RNA RNázou H. Přenos ODN, cílených proti mRNA kódované onkogenem, do rakovinných buněk může být spojen s inhibicí buněčné proliferace a, za určitých podio mínek, s buněčnou smrtí.

„Antisense“ ODN mají velké možnosti jak léčebné přípravky. Mnoho preklinických studií na zvířatech i klinických zkoušek ve fázi I—III ukázalo, že „antisense“ ODN namířené proti onkogenům a virovým genům jsou terapeuticky aktivní.

¹⁵

Přenos funkčních molekul DNA do buněk prostřednictvím lipozomů naplněných DNA nebo konvenčních virozomů není velmi účinný. Proto byly pro přenos genetického materiálu vyvinuty virozomy s pozitivně nabitou (kationtovou) lipídovou dvojvrstvou. Pozitivně nabitá lipidová dvojvrstva interaguje s nukleovými kyselinami a způsobí, že se koncentrují uvnitř tvořených váčků. .

Virozomy obsahující „antisense“ L-myc

Gen L-myc, poprvé objeven v buněčné linii malobuněěného plicního karcinomu (smáli cell lung cancer-SCLC), je často amplifikován a zvýšeně exprimován v SCLC. 5'-FITC-oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty (OPT) se syntetizovaly fosforamiditovým postupem (Microsynth GmbH, Balgach, Švýcarsko). Pentadekamer (5-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3') a pentadekamer (5'-FITC-GCGGACATGGACTAC-3') byly použity jako „antisense“ OPT a „sense“ OPT, v uvedeném pořadí. Syntetizovaly se kontrolní OPT se smíšenou sekvencí (mixed sequence control - msc) skládající se z nukleotidů téže délky jako „antisense“ a „sense“ OPT. „Antisense“ OPT pokrývající počáteční místo translace působí inhibicí ribozomální translace na cílové mRNA. „Antisense“ L-myc oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty byly opouzdřeny virozomy. Byl hodnocen anti pro liferační účinek „antisense“ L-myc DNA opouzdřené virozomem v buněčných liniích H209, H510 a H82 SCLC. „Antisense“ virozomy L-myc se přidaly k buňkám buněčných linií lidského malobuněěného plicního karcinomu. Jako kontroly se použily virozomy „sense“ L-myc a msc (kontroly se smíšenou sekvencí) (obr. 9) „Antisense virozomy L-myc bylý 20 000 krát aktivnější riež neopouzdřené antisense OPT. Aby se vyvolal stejný úěinekjaký je vidět na obr. 10, musely být ke tkáňovým kulturám přidány řádo40 vě mikromolové koncentrace neopouzdřených OPT antisense L-myc. Proto jsou kationtové virozomy daleko účinnější pro přenos ODN ve srovnání s buněčným příjmem neopouzdřených OPT, a také účinnější než kationtové lipozomy.

Růstově inhibiění účinek antisense virozomů L-myc koreloval s hladinami exprese L-myc ve třech buněčných liniích SCLC, H209, H510 a H82. Z obrázku 11 lze vyvodit, že ty buňky, které neexprimují gen L-myc, nejsou ovlivněny „antisense“ virozomy L-myc. Prázdné kationtové virozomy nevykazovaly žádné nebo pouze malé účinky na normální a rakovinné buňky. Protože gen L-myc je často amplifikován a zvýšeně exprimován v SCLC a velmi potlačen a exprimován s nízkou hladinou v tkáních dospělého člověka, L-myc může být dobrým cílem pro léčbu pomocí „antisense“ virozomů.

- is CZ 2998U9 B6

Příklad 6

Neinfekční přenos vektorů založených na plazmidech pro genovou terapii: transfekce vektorů pro savčí expresi pomocí kationtových virozomů

Současné přístupy ke genové terapii rakoviny užívají vektory založené na plazmidech pro expresi vhodných cílových genů v lidských rakovinných buňkách buď ex vivo, nebo in vivo. Zvažují se následující terapeutické genové cíle:

geny vnímavosti, jako jsou geny thymidinkinázy viru Herpes simplex (HSV-TK) (Moolten, F.L., io Cancer Res., 46,5276-5281,1986), geny, které směrují imunitní systém k eliminaci rakovinných buněk, jako jsou geny pro cytokiny (Tepper, R.I., et al. Cell, 57, 503-512, 1989), geny kódující kostimulující molekuly (Townsend, S.E., et al., Science, 259, 368-370, 1993), cizorodé geny pro histokompatibilitu (Plautz, G.E., et al., Proč. Nati. Ácad. Sci. USA, 90, 4645-4649, 1993), a nasazení nádorově supresorových genů divokého typu, jako je p53 (Chen, P.L., et al., Science,

250, 1576-1580, 1990).

Kvůli určitým omezením současně používaných vektorů založených na virech pro genovou terapii, jako je například nedostatek specifity v zacílení nádorových buněk pro přenos genů, a z hlediska požadavků bezpečností vzhledem k možné indukci sekundárních malignit a možnosti vzniku replikačně kompetentního viru rekombinací, bylo zapotřebí vyvinout neinfekční technologii genového přenosu pro in vivo přenos genů expresními vektory založenými na plazmidech. Použití zde popsaných kationtových virozomů je slibná alternativa neinfekční technologie pro přenos genů zprostředkovaný receptorem.

Typická účinnost transfekce při použití komerčně dostupných lipidů je mezi 5 až 50 %. Virozomy poskytují nejen vyšší účinnost transfekce než komerčně dostupné li pozorný, ale zachycení DNA do virozomů má za následek také stabilní transformaci buněk.

Gen pro lidský interleukin 6 (IL·—6) byl klonován do místa polylinkeru pcDNA3, vektoru o veli30 kosti 5,4 kb navrženého pro vysoce stabilní i přechodnou expresi v eukaryotických hostitelích. Vektor obsahuje markér pro rezistenci na neomycin, exprimovaný z časného promotoru SV40 pro selekci stabilních transformant v přítomnosti G418,

Opouzdření vektoru se provádělo 3 různými metodami:

1. Dialýza: plazmidy byly opouzdřený v průběhu tvorby virozomů. Detergent Oktyl-POE (od

Alexis, Corp., Laeufelfíngen, Švýcarsko) byl odstraněn dialýzou.

2. „Biobeads“: plazmidy byly opouzdřený v průběhu tvorby virozomů. Detergent OEG byl odstraněn pomocí „Biobeads“.

3. Ultrasonikace: plazmidy byly opouzdřený DOTAP a získané lipozomy DOTAP se fúzovaly s virozomy DOTAP prostřednictvím ultrasonikace.

Pro měření množství opouzdřeného plazmidu se vytvořila pcDNA3-cIL-6-DNA značená ¹⁴Cthymidinem.

Opouzdřovací metoda	Množství opouzdřeného plazmidu
; Dialýza (l)	0,02 μσ DNA na μΐ virozomů
•^Biobeads (2)	0,009 ug DNA na μ! virozomů
Ultrasonikace (3)	0,04 μ^ DNA ha μΐ virozomů

- 16CZ 299809 B6

Buňky Sp2/O-Ag 14 (hybridní, nesecemující, myší buňky ě. ATCC CRL-1581, zde nazývané Sp2), buňky P3/NSI/1—Ag4—1 (nesecemující myelomové myší buňky č. ATCC TIB-18, zde nazývané P3/NS1) a buňky NIH/3T3 (embryonální buňky kontaktně inhibované ze Švýcarské NIH myši č. ATCC CRL-1658) v buněčné koncentraci 1 x 10⁵ v 1 ml média byly transfekovány virozomovými přípravky (1) - (3). Deset dní po transfekci se měřila množství exprimovaného IL-6 pomocí testu ELISA (obr, 12, obr. 13, obr. 14). Všechny buněčné linie jsou dostupné od ATCC, 12301, Parklawn Drive, Rockvílle, Maryland, USA

Transfekované buňky Sp2 a P3/NS1 byly selektovány dvakrát prostřednictvím G418. Po 2 měsíío cích kultivace se opět měřila tvorba IL-6. Hodnoty jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Tvorba IL-6 transfokovanými buňkami po opakované selekci G418.

Buněč- ná linie		Způsob přípravy	Počet buněk na ml	Celkový' počet· buněk-	IL-6 [pg/ml]	Celkové množství IL-6 [pg·]·	IL-6 [pg/ios> buněk]
P3/NS1	Pelety .buněk	Di.alýza	1,2x10°	6,0x10° 3 ml pufru,	277	831	138:
Biobeads	.1, 6x10°	7,8x10° 4- ml. pufru.	32	12.8	16
Ultraso- nikace	1,54x10*	8,0x10b 4 ml pufru·;.	289	1156 '	144
P3/NS1	Super-1 nátant	Dialýza		5 ml superrí.	6	40 .	6,7
Biobeads		4,9 ml. supern..	4	2Ό	2,5
Vl.traso• nikace		5,2 ml supern...	25	130	16,2
,Sp2	Pelety buněk	:Dialýza	2.,25x10°	1,13xlOJ 5,5 ml . pufru	>1200	>66:00'	>584
Biobeads.	.1,8x10°	9/5x10° • 4,5 ml : pufru	232-	1044	110
Ultráso- . nikace	2,8x10°	1,37x10*’ 7 m-1 pufru	680	476 0	347
Sp2	: Supernatant	Dialýza		5 mí supern.	268	1340	119
Biobeads1		5,2 ml supern.	8	' 42	' 4,4
:U1trasonikace		4,9 ml, supern.	651	3190	233

Objem lyzačního pufru přidaného k buněčným peletám byl nastaven tak, aby se získal počet 20 buněk přibližně 2xl0⁶ na ml.

-17CZ 299809 B6

Příklad 7 „Antisense“ strategie v léčení leukémií

Nejběžnější genetická abnormalita u lidských leukémií je translokace filadelfského chromozomu (Ph¹). Translokace protoonkogenu abl z chromozomu 9 na zlomový úsek (ber) na chromozomu 22 má za následek tvorbu hybridních genů bcr-abl. Protoonkogen abl normálně kóduje protein s tyrozinkinázovou aktivitou, která je v buňkách nesoucích hybridní geny bcr-abl zesílena. Transkripty bcr-abl se nalézají u převážné většiny pacientů s chronickou myelogenní leukémií (CML) ío au pacientů s Ph¹ akutní lymfocytámí leukémií. Zaměření na geny bcr-abl u CML je jasně nejracionálnější léčebný postup. Ukázalo se, že syntetické ODN komplementární ke spojení transkriptů bcr-abl tvořené sestřižením buď druhého, nebo třetího exonu genu ber na druhý exon cabl potlačují proliferaci leukemických buněk Philadelphia 1 in vitro a přitom šetří růst normálních prekurzorů v kostní dřeni (Szczylik, C„ et al., Science, 253, 562-565, 1991), Avšak „anti15 sense“ léčba bcr-abl je omezena na pacienty s CML.

Další molekulový cíl pro „antisense“ léčbu je gen myb. Myb, produkt kódovaný protoonkogenem c-myb, působí jako specifický transkripční faktor vázající DNA. Je přednostně exprimován v hematopoetických buňkách a je vyžadován pro proliferaci hematopoetické buňky. „Antisense“

ODN jako 18-mer cílený na kodony 2-7 z c-myb silně inhiboval nebo kompletně zrušil růst klonu T-buněčné leukemické linie (CCRF-CEM), a také 78 % z vyšetřených případů primární akutní myeloidní leukemie, a 4 z 5 případů primární chronické myeloidní leukemie (CML) v blastické krizi (Calabretta, B., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2351-2355, 1991.

Přečišťování kostní dřeně se používá jako součást léčby několika neoplazmat, včetně akutních a chronických leukémií. V současnosti se dřeň čistí od leukemických buněk celou řadou přípravků, jako jsou imunologické reagencie a chemoterapeutika. ODN opouzdřené virozomem zacílené proti jednomu onkogenu, který propůjčuje leukemickým buňkám růstovou výhodu, se ukazují jako terapeuticky užitečné a, což je nejdůležitější, selektivnější než konvenční chemoterapeutické přípravky v eliminaci leukemických buněk při ušetření normálních prekurzorových buněk. „Antisense“ virozomy c-myb

Byly připraveny „sense a „antisense“ OPT odpovídající kodonům 2-9 c-myb. „Sense“ a „anti35 sense“ sekvence c-myb byly 5'-GCCCGAAGACCCCGGCAC-3' a 5-TGTGCCGGGGTCTTCGGGC-3', v uvedeném pořadí. Opouzdření OPT ve virozomech DOTAP se provádělo stejnou metodou, jaká byla použita pro virozomy DOTAP L-myc. Buněčná linie lidské myeloidní leukémie KG-1 á buněčná linie lidské akutní lymfoblastické leukemie CEM-C3 byly vystaveny „sense“ a „antisense“ virozomům c-myb. Proliferace buněk KG-l je závislá na produktu proto40 onkogenu genu myb, zatímco buňky CEM-C3 nejsou závislé na produktu genu c-myb. Buňky KG-1 se inkubovaly s 25, 50 a 100 μΐ „sense“ a „antisense“ virozomů c-myb obsahujících 18, 36 a 72 pmol „sense“ a „antisense“ OPT, v uvedeném pořadí. Počet buněk se určoval ve dnech 2, 3 a

4.

Přidání 25 μΙ „sense“ a „antisense“ virozomů c-myb mělo pouze malé účinky na buněčný růst (obr. 15). Avšak přidání 50 μΐ (obr, 16) a 100 μΐ (obr. 17) buněčný růst silně inhibovalo. Vyšší dávky „sense“ virozomů c-myb také vykazovaly inhibiční účinky. Předpokládá se, že tyto účinky nebyly vyvolány membránou virozomů, protože buňky CEM-C3 nebyly ovlivněny stejnými virozomovými přípravky (obr. 18).

Zkratky používané v popise 2'-OMe 2'-0 metyl

CALLA Common Acute Lymphocytic Leukaemia Antigen - společný lymfocy55 támí antigen

-18CZ 299809 B6

CAT	choramfenikolacetyltransferáza
DOTAP	N-[(l,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetyl-amoniummetylsulfát
DOTMA	N-[(l,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N“trimetyl-amoniumchlorid
FITC-OPT	oligodeoxyribonukleotidfosforothioát značený fluoresceinizothiokyanátem
G418	Genefcicin® disulfát (antibiotikum G418)
HA	hemaglutinin
IL-6	interleukin 6
MPB.PE	N-[4-(p-maleimid) fenylbutyryl-fosfatidyletanolamin (=komplex vazebná molekula-fosfolipid)
Msc	kontrola se smíšenou sekvencí („mixed sequence kontrol“)
NA	neuraminidáza
Oktyl-POE	n-okty 1—ol igo-oxyety len
ODN	oligodeoxynukleotidy
OEG	oktaetylenglykolmonododecyléter (C)2E8)
OPT	oligodeoxyríbonukleotidfosforothioát (γ)
PC	fosfatidylcholin
PE	fosfatidyletanolamin
PNA	peptidová nukleová kyselina
SCLC	malobuněčný plicní karcinom
SV40	opičí virus 40 (Simian virus) PATENTOVÉ NÁROKY

1. Lipidový váček mající kladně nabitou membránu z lipidové dvojvrstvy, která obsahuje kati-

Claims (19)

1. Lipidový váček mající kladně nabitou membránu z lipidové dvojvrstvy, která obsahuje kati30 on tové a/nebo polykat iontové lipidy, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jeden přirozený nebo syntetický virový fúzní peptid integrovaný do membrány nebo na ni kovalentně vázaný, přičemž fúzní peptid je vybrán ze skupiny sestávající z trimeru nebo monomeru hemaglutininu, jedné nebo obou jeho rozštěpených podjednotek, glykopeptidů HA1 a HA2, fúzního peptidu izolovaného z přírodních zdrojů, syntetického fúzního peptidu, a membrána obsa35 huje, vzhledem k celkovým lipidům, 90 až 95 % hmotn. kationtových a/nebo polykationtových lipidů a 5 až 10 % hmotn. fosfatidyletanolaminu, nebo 45 až 90 % hmotn. kationtových a/nebo polykationtových lipidů, 5 až 10 % hmotn. fosfatidyletanolaminu a 5 až 50 % hmotn. fosfatidylčholinu, přičemž lipidový váček je charakterizován tím, že membrána dále obsahuje alespoň jeden buněčně specifický markér a alespoň jedno dvojfunkční zesíťující činidlo, přičemž buněčně

40 specifický markér a dvojfunkční zesíťující činidlo jsou ve formě předem vytvořeného molekulového komplexu sestávajícího z fosfatidyletanolaminu, dvojfunkčňího zesíťujícího činidla a buněčně specifického markéru, a buněčně specifický markér je připojen k membráně prostřednictvím zesíťujícího činidla a dvojfunkční zesíťující činidlo je jedním vazebným místem navázáno na aminoskupinu fosfatidyletanolaminu a druhým vazebným místem je navázáno na thiolovou

45 skupinu buněčně specifického markéru.

2. Váček podle nároku 1,vyznačující se tím, že buněčně specifický markér je vybrán ze skupiny sestávající z monoklonální protilátky, fragmentu F(ab')₂, fragmentu Fab', cytokinu a růstového faktoru.

3. Váček podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zesíťující činidlo je heterobifunkční sukcinimidylový derivát obsahující N-hydroxysukcinímidovou skupinu a buďto máleimidovou skupinu nebo fotoreaktivní azidoskupinu.

55

4. Váček podle kteréhokoliv z nároků 1,2 nebo 3, vyznačuj ící se tím, že

-19’

CZ Z998U9 B6

I) kationtové lipidy obsahují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny sestávající z:

N-[( 1,2,3-dÍoleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniumchlorid (DOTMA),

N-[( l,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniummetylsulfát (DOTAP), nebo

5 N-t-butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidin, a

II) polykationtové lipidy obsahují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny sestávající z;

1.3- dipalmiltoyl-2-fosfatidyletanolamidospennin (DPPES), dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS), ío 2,3-dioIeoyloxy-N-[2(sperminkarboxamido)etyl]-N,N-dimetyl-l-propanaminiumtrifluoracetát (DOSPA),

1.3- dioleoyloxy-2-(6-karboxyspermyl)-propylamid (DOSPER), a

N,N,N',N'-tetrametyl-N,N'-bis(2-hydroxyetyl)-2,3-dioleoyloxy-l,4-butandiamoniumjodid (THDOB).

5. Váček podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznač uj ící se t í m , že dále obsahuje uvnitř váčku požadovaný genetický materiál, vybraný ze skupiny sestávající z krátkého řetězce DNA nebo RNA, deoxyribonukleotidů, olígodeoxyribonukleotidů, oligodeoxyribonukleotidselenoátů, oligodeoxyribonukleotidfosforothioátů, oligodeoxyribonukleotidfosforami20 dátů, oligodeoxyribonukleotidmetylfosfonátů, peptidových nukleových kyselin (PNA), ribonukleotídů, olígoribonukleotidů, oligoribonukleotidfosforothioátů, 2'-OMe-oligoribonukleotidfosfátů, 2’-OMe-oligorÍbonukleotidfosforothioátů, ríbozymů, genů, plazmidů a vektorů.

6* Váček podle jednoho nebo několika z předchozích nároků, vyznačující se t í m , že

25 jeho průměr je v rozmezí 120 až 180 nm.

7. Způsob přípravy váčků podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že zahrnuje následující kroky, kdy

30 a) alespoň jeden přírodní nebo syntetický virový fúzní peptid se rozpustí ve vhodném pufru obsahuj ícím neiontový detergent, přičemž virový fúzní peptid je vybrán ze skupiny sestávající z trimeru nebo monomeru hemaglutininu, jedné nebo obou jeho rozštěpených podjednotek, glykopeptidů HA1 a HA2, fúzního peptidu izolovaného z přírodních zdrojů a syntetického fúzního peptidu,

35'

b) k roztoku z kroku a) se přidají buďto fosfatidylethanolamin a kationtové a/nebo polykationtové lipidy nebo fosfatidylethanolamin a fosfatidylcholin a kationtové a/nebo polykationtové lipidy, a rozpustí, -

40 c) alespoň jeden buněčně specifický markér a dvojfunkění zesíťující činidlo se přidají k roztoku z kroku b) ve formě předem vytvořeného molekulového komplexu, kterým je purifikovaný konjugovaný markér získaný z reakční směsi, kde nekonjugované molekuly zesíťovadlo-fosfatidylethanolamin jsou odděleny od konjugovaných markérů, přičemž molekulový komplex sestává z fosfatidylathanolaminu, dvoj funkčního zesíťuj ícího činidla a buněčně specifického markéru a

45 dvojfunkění zesíťující činidlo je jedním vazebným místem navázáno na aminoskupinu fosfatidyletanolaminu a druhým vazebným místem je navázáno na thiolovou skupinu buněčně specifického markéru,

d) detergent se odstraní ošetřením roztoku mikronosičovými perličkami, nebo případně dialýzou,

50 kdy se jako detergent užije n-oktyl-oligo-oxyethylen, což vede k vytvoření suspenze obsahující váčky s kladně nabitou lipidovou dvojvrstvou.

-208. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že

I) kationtové lipidy obsahují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny obsahující

5 N—[(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimety lamoniumchlorid (DOTMA),

N-[( 1,2,3-dioIeoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniummetylsuIfát (DOTAP), nebo N-t-butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidin, a

II) polykationtové lipidy obsahují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny obsahující io l,3-dipalmiltoyl-2-fosfatidyletanolamidospermin (DPPES), dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS),

2.3- dioleoyloxy-N-[2(sperminkarboxamÍdo)etyl]-N,N-dimetyl-l-propanaminÍumtrifluoracetát (DOSPA),

1.3- dioIeoyloxy-2-(6-karboxyspermyl)propylamid (DOSPER), a

15 N,N,N',N'-tetrametyl-N,N'-bis(2-hydroxyetyl)-2,3-dioleoyloxy-l,4-butandiamoniumjodid (THDOB).

9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, v y z n a č u j í c í se t í m , že pufr je HEPES pufr a dále obsahuje 10 až 250 pmol/ml neionogenního detergentu, výhodně vybraného ze skupiny sestáva20 jící z oktaetylenglykolmonododecyléteru a n-oktyloligooxyetylenu.

10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9, vyznačující se t í m , že zahrnuje přidání 90 až 95 % hmotn., vzhledem k celkovým lipidům, kationtových a/nebo polykationtových lipidů a 5 až 10 % hmotn. fosfatidyletanolaminu, nebo 45 až 90 % hmotn. kationtových a/nebo

25 polykationtových lipidů, 5 až 10 % hmotn. fosfatidyletanolaminu a 5 až 50 % hmotn. fosfatidylcholinu.

11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 10, vyznačující se tím, že se k suspenzi váčků podle kroku d) z nároku 7 přidají pozitivně nabité liposomy obsahující požadovaný gene30 tický materiál, a poté se vzniklá směs vystaví působení ultrazvuku, čímž se fúzují liposomy s váčky a genetický materiál se integruje do váčků.

12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 10, v y znač uj íc í se t í m, že se k suspenzi váčků podle kroku d) z nároku 7 přidá požadovaný genetický materiál a poté se vzniklá směs

35 vystaví působení ultrazvuku, čímž se inkorporuje požadovaný genetický materiál do váčků, načež se neinkorporovaný materiál oddělí od váčků, výhodně gelovou filtrací.

13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7až 12, vyznač u j ící se tí m , že buněčně specifický markér je vybrán ze skupiny sestávající z monoklonální protilátky, fragmentu F(ab')₂,

40 fragmentu Fab', cytokinů a růstového faktoru.

14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7ažl3, vyznačující se tím, že zesíťující činidlo je heterobifunkční sukcinimídylový derivát obsahující N-hydroxysukcinimidovou skupinu a buďto maleimidovou skupinu, nebo fotoreaktivní azidokupinu.

15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 14, vy zn a č uj íc í se t í m , že molekula „zesíťující činidlo-fosfatidylethanolamin“ je vybrána ze skupiny sestávající z N-[4-(p-maleímidfenyl-butyryl]“fosfatidyletanolaminu (MPB.PE) a 4-(N-maleimíd-metyl)cyklohexan-l-karboxylatfosfatidyletanolaminu (MCC.PE).

16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7ažl5, vyznačující se tí m, že nekonjugované molekuly zesíťující činidlo-fosfatidylethanolamin, zejména nekonjugované MPB.PE nebo MCC.PE, se odstraní z reakční směsi gelovou chromatografíí, výhodně afinitní chromatografíí s náplní agarózové hmoty, nej výhodněji s redukovanou thiopropylsefarózou.

-21

17. Způsob podle jednoho nebo více předchozích nároků, vyznačující se tím, že požadovaný genetický materiál je vybraný ze skupiny sestávající z krátkých řetězců DNA nebo RNA, deoxyribonukleotidů, oligodeoxyribonukleotidů, oligodeoxyribonukleotidselenoátů, oligodeoxyribonukleotidfosforothioátů (OPT), oligodeoxyribonukíeotidfosforamÍdátů, oligodeoxy5 ribonukleotidmetylfosfonátů, peptidových nukleových kyselin (PNA), ribonukleotidů, oligoríbonukleotidů, olígoribonukleotidfosforothioátů, 2'-OMe-oligoribonukleotidfosfátů, 2'-OMe-oligoribonukleotidfosforothioátů, ribozymů, genů, plazmidů a vektorů.

18. Kladně nabitý lipidový váček podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a/nebo připravitelný způsoio bem podle kteréhokoliv z nároků 7 až 17 pro specifický a nespecifický přenos genetického materiálu do cílových buněk nebo tkání, zejména neinfekční přenos genetického materiálu do klidových nebo proliferujících savčích buněk.

19. Kladně nabitý lipidový váček podle nároku 18 pro použití jako léčivo, výhodně pro profy15 laktické a/nebo terapeutické ošetřování lidí nebo zvířat, nebo pro diagnostické použití.

20. Použití lipidového váčku podle nároku 18 nebo 19 pro výrobu farmaceutické kompozice k léčení rakoviny, leukémií a virových infekcí.

20 21. Použití podle nároku 20, kdy váček obsahuje alespoň jeden „antisense“ oligonukleotid vhodný pro „antisense“ terapii, přičemž „antisense“ oligonukleotid je výhodně namířen proti protoonkogenem nebo onkogenem kódované mRNA.