PL199201B1

PL199201B1 - Pęcherzyk lipidowy, sposób wytwarzania pęcherzyka lipidowego oraz zastosowanie pęcherzyka lipidowego

Info

Publication number: PL199201B1
Application number: PL329853A
Authority: PL
Inventors: Ernst Rudolf Wälti; Reinhard Glück; Peter Klein
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-04
Publication date: 2008-08-29
Also published as: SK152698A3; KR20000010780A; PA8429201A1; PE65198A1; NO985137D0; SV1997000032A; EA199800992A1; HRP970234A2; CN1225007A; ZA973885B; BR9709224A; US6210708B1; HUP9901790A2; OA10916A; HUP9901790A3; CA2253561A1; KR100536983B1; EP0902682A2; AU710170B2; NO985137L

Abstract

Wynalazek dotyczy dodatnio na ladowanego wirusomu dla skutecznego dostarczania materia lu genetycznego do komórek pozostaj acych w spoczynku lub proliferuj acych in vitro oraz in vivo. B lona wirosomu zawiera lipidy kationowe i/lub polikationowe, co najmniej jeden wirusowy peptyd fuzyjny, ewentualnie co najmniej jeden komórkospecyficzny marker, korzystnie wybrany z grupy obejmuj acej przeciwcia lo monoklonalne, przeciwcia la F(ab ') 2 i Fab ', cytokiny i czynniki wzrostu, dla selektywnej detekcji i wi azania komórek docelowych. Wynalazek ponadto dotyczy wytwarzania nowych wiroso- mów i ich zastosowania, szczególnie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia nowo- tworu, leukemii lub infekcji wirusowych. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest pęcherzyk lipidowy, sposób wytwarzania pęcherzyka lipidowego oraz zastosowanie pęcherzyka lipidowego. Wynalazek należy do dziedziny biotechnologii genów oraz terapii genowej, a nowe pęcherzyki lipidowe stanowią wirosomy, tzn. dodatnio naładowane pęcherzyki liposomowe zawierające wirusowe glikoproteiny w błonie, przeznaczone do skutecznego przenoszenia materiału genetycznego do miejsc docelowych, zwłaszcza do specyficznego i niespecyficznego, nieinfekcyjnego dostarczania genów do komórek docelowych in vitro oraz in vivo.

Stan techniki

Liposomy są szeroko stosowane jako nośniki dla dostarczania leków i jako ochronne osłony substancji farmaceutycznych o krótkim okresie trwania lub jako osłony przed (bio)chemicznemu atakowi płynów fizjologicznych w organizmie. Liposomy zawierające rekonstytuowane proteiny z otoczek wirusów lub części tych protein są zwykle nazywane wirosomami (Sizer i in., Biochemistry 26:5106-5113, 1987). Używano ich do niespecyficznego dostarczania różnych leków i cząsteczek DNA (Vainstein i in., Methods Enzymol. 101:492-512, 1983). Okazało się, że główną ich wadą jest to, że wirosomy ulegały fuzji z błoną komórkową komórek docelowych, co prowadziło do niekontrolowanego uwalniania transportowanego materiału do cytoplazmy komórek docelowych, gdzie niezabezpieczony materiał był łatwo atakowany przez degradacyjne procesy wewnątrzkomórkowe.

W publikacji WO 92/13525, której całą zawartość przywoł uje się tu na zasadzie odnoś nika, podano, że wirosomy utworzone z dwuwarstwowych błon fosfolipidowych, do których przyłączone są proteiny z kolców wirusa grypy i komórkospecyficzne markery takie jak, przykładowo, przeciwciała monoklonalne, bardzo skutecznie łączą się z błonami modelowymi i komórkami zwierzęcymi wskutek wirusopodobnego mechanizmu przenikania na drodze endocytozy za pośrednictwem receptora. Podczas gdy, te wirosomy pomyślnie stosuje się dla dostarczania substancji chemicznych i żądanych leków do miejsc docelowych, mają one pewne wady z punktu widzenia trwałego włączenia i przenoszenia naładowanych cząsteczek, takich jak przykładowo ujemnie naładowane kwasy nukleinowe.

W ostatnich kilku latach dostarczaniu, zwłaszcza dostarczaniu komórkospecyficznemu, materiału genetycznego włączonego w liposomy poświęcano coraz więcej uwagi i zyskało ono na znaczeniu, szczególnie w związku z zastosowaniami w terapii przeciwnowotworowej i genowej. Obecnie dostępnych jest kilka metod dostarczania DNA lub RNA do komórek: metody za pośrednictwem wirusów, metody za pośrednictwem lipidów i inne metody takie jak mikroinjekcja i elektroporacja. Zalety i wady obecnych technik przenoszenia genów można podsumować następująco:

a) Przenoszenie genów za pośrednictwem wirusa.

Geny można wprowadzać trwale i skutecznie do komórek ssaków za pomocą wektora retrowirusowego. Jednak skuteczność przenoszenia genu do komórek nie ulegających replikacji jest bardzo niska, ponieważ retrowirusy infekują tylko komórki ulegające podziałowi. Ponadto z użyciem wektorów retrowirusowych związane są ogólne problemy bezpieczeństwa dotyczące przykładowo możliwości aktywacji onkogenów. Wadliwy pod względem replikacji adenowirus stał się wektorem przenoszenia genów z wyboru dla większości badaczy. Dostarczanie genów za pośrednictwem wektora adenowirusowego obejmuje insercję żądanego genu w cząstki deletowanego adenowirusa lub tworzenie kompleksu między przewidzianym do insercji DNA a wirusową powłoką adenowirusa przez mostek transferyna-polilizyna. Wadą tego bardzo skutecznego układu in vivo jest nieokreślone ryzyko infekcji lub zapalenia: Pomimo delecji genu E1 powodującej, że wirus jest wadliwy z punktu widzenia replikacji, pozostały genom wirusowy zawiera liczne otwarte ramki odczytu kodujące proteiny wirusowe (Yang i in. 1994; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4407- 4411). Ekspresja protein wirusowych przez transdukowane komórki wyzwala zarówno humoralne, jak i komórkowe reakcje immunologiczne w organizmie zwierzęcym i ludzkim, a zatem może prowokować stany zapalne i proliferację.

W metodzie z pośrednictwem HVJ (wirus Sendai) obcy DNA jest kompleksowany liposomami. Następnie liposomy są załadowywane inaktywowanym wirusem Sendai (japoński wirus hemaglutynujący; HVJ). Metodę tę już zastosowano do przenoszenia genów in vivo do różnych tkanek. Ponadto, doniesiono o komórkowym wychwycie antysensownych oligonukleotydów przez HVJ-liposomy (Morishita i in. 1993; J. Cell. Biochem. 17E, 239). Jednak szczególną wadą jest to, że HVJ-liposomy wykazują tendencję do niespecyficznego wiązania z czerwonymi ciałkami krwi.

b) Przenoszenie genów za pośrednictwem lipidów:

Dodatnio naładowane liposomy wykonane z lipidów kationowych okazują się bezpieczne, łatwe do stosowania i skuteczne w przenoszeniu DNA i antysensownych oligonukleotydów in vitro. Wysoce

PL 199 201 B1 ujemnie naładowane kwasy nukleinowe oddziałują spontanicznie z liposomami kationowymi. Już przez proste zmieszanie polinukleotydów z uprzednio utworzonymi liposomami kationowymi osiąga się pełne utworzenie kompleksów DNA-liposom. Jednakże wskutek braku peptydów fuzyjnych i komórkospecyficznych markerów na błonie liposomowej skuteczność transfekcji in vivo jest bardzo niska, a czasy inkubacji są długie i z tego względu należy podawać duże dawki, aby osiągnąć żądany efekt. W konsekwencji mogą wystąpić niepożądane efekty uboczne, ponieważ stwierdzono, że duże ilości lipidów kationowych mogą wykazywać efekty toksyczne in vivo.

Małe oligonukleotydy są obecnie testowane jako środki terapeutyczne w leczeniu raka i jako środki przeciwwirusowe. Tylko jedna z dwóch nici DNA jest transkrybowana, by zsyntetyzować matrycowy (przekazujący informację) RNA (mRNA). Nić DNA transkrybowana do RNA jest nazywana nicią kodującą lub nicią sensowną. Komplementarna, niekodująca lub anty sensowna nić ma tę samą sekwencję co mRNA. Gdy transkrybowana jest nić niekodująca, wytwarza ona cząsteczki antysensownego RNA zdolne do wiązania do docelowego (sensownego) mRNA. Gdy antysensowny RNA zwiąże sensowny RNA, uzyskane dupleksowe cząsteczki RNA nie mogą być translowane i wytwarzanie proteiny jest zablokowane. Zwykle, krótkie syntetyczne oligonukleotydy antysensowne o 18 do 22 zasadach skutecznie wiążą się z mRNA i inhibitują translację mRNA. Dzięki temu mechanizmowi antysensowne oligonukleotydy mogą zatrzymać proliferację ludzkich komórek nowotworowych. Geny związane z nowotworem przejawiają swoje działanie poprzez nadekspresję ich normalnych protein strukturalnych. Geny takie jak c-fos, c-myc, L-myc, N-myc, c-myb, abl, bcr-abl, c-raf, c-erb-2, K-ras mogą być potencjalnymi celami antysensownej terapii nowotworowej. Antysensowne oligonukleotydy są także atrakcyjną potencjalną alternatywą dla leków konwencjonalnych takich, jak przykładowo środki przeciwwirusowe, takie jak antysensowne oligonukleotydy genu tat i gag ludzkiego wirusa upośledzonej odporności (HIV).

Błony liposomowe obejmujące rekonstytuowane otoczki wirusowe jakie opisano w literaturze (Stegmann i in.; EMBO J. 6:2651-2659, 1987) mogą być nazywane wirosomami. Zwykle obejmują one dwuwarstwę fosfolipidową zawierającą fosfatydylocholinę (PC) i fosfatydyloetanolaminę (PE) wraz z otoczką wirusową , przykł adowo proteiny kolczaste, osadzone w bł onie. Konwencjonalne metody włączania materiału genetycznego w PC,PE-wirosomy mają wadę polegającą na dość niskiej skuteczności włączenia kwasu nukleinowego.

Istota wynalazku

Pęcherzyk lipidowy mający dodatnio naładowaną dwuwarstwową błonę lipidową, zawierającą lipidy kationowe i/lub polikationowe, obejmującą ponadto co najmniej jeden naturalny lub syntetyczny wirusowy peptyd fuzyjny, wbudowany w błonę lub z nią kowalencyjnie związany, wybrany z grupy obejmującej: trimer hemaglutyniny lub monomer hemaglutyniny, jej jedną lub obie odszczepione podjed-nostki, glikopeptydy HA 1 i HA2, wirusowy peptyd fuzyjny wyodrębniony ze źródeł naturalnych oraz syntetyczny wirusowy peptyd fuzyjny, obejmującą - w przeliczeniu na całość lipidów: 90 do 95% wag. lipidów kationowych i/lub polikationowych oraz 5 do 10% wag. fosfatydyloetanolaminy; bądź 45 do 90% wag. lipidów kationowych i/lub polikationowych, 5 do 10% wag. fosfatydyloetanolaminy oraz 5 do 50% wag. fosfatydylocholiny, według wynalazku cechuje się tym, że błona dodatkowo zawiera co najmniej jeden komórkospecyficzny marker oraz co najmniej jeden bifunkcyjny środek sieciujący, przy czym ów komórkospecyficzny marker jest połączony z błoną poprzez wskazany środek sieciujący tak, że marker jest związany poprzez grupę tiolową z sieciującą częścią cząsteczki utworzonej przez kowalencyjne związanie środka sieciującego z fosfatydyloetanolaminą.

W pęcherzyku według wynalazku, wskazany komórkospecyficzny marker jest wybrany z grupy obejmującej: monoklonalne przeciwciało, fragment F(ab')₂ przeciwciała oraz fragment Fab' przeciwciała, cytokinę oraz czynnik wzrostu.

W pęcherzyku według wynalazku środek sieciujący jest heterobifunkcyjną pochodną sukcynimidylu, korzystnie wybraną z grupy obejmującej pochodne bis-N-sukcynimidylu i fotoaktywowalne heterobifunkcyjne środki sieciujące.

W pęcherzyku według wynalazku:

(i) lipidy kationowe obejmują co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej chlorek N-[1,2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTMA); metylosiarczan N-[1,2,3-dioleoiloksy)-propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTAP); N-t-butylo-N'-tetradecylo-3-tetradecyloaminopropionamidyn ę ; a (ii) lipidy polikationowe obejmują co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej 1,3-dipalmitoilo-2-fosfatydyloetanolamidosperminę (DPPES); dioktadecyloamidoglicylosperminę (DOGS);

PL 199 201 B1 trifluorooctan 2,3-dioleoiloksy-N-[2(sperminokarboksamido)etylo)-N,N-dimetylo-1-propanoaminiowy (DOSPA); 1,3-dioleoiloksy-2-(6-karboksyspermylo)-propyloamid (DOSPER) i jodek N,N,N',N'-tetrametylo-N,N' bis(2-hydroksyetylo)-2,3-dioleoiloksylo-1,4-butanodiamoniowy (THDOB).

Pęcherzyk według wynalazku zawiera ponadto żądany materiał genetyczny uwięziony w tym pęcherzyku, korzystnie wybrany z grupy obejmującej krótkołańcuchowe DNA lub RNA, deoksyrybonukleotydy, oligodeoksyrybonukleotydy, seleniany oligodeoksyrybonukleotydów, tiofosforany oligodeoksyrybonukleotydów, fosforamidany oligodeoksyrybonukleotydów, metylofosfoniany oligodeoksyrybonukleotydów, peptydowe kwasy nukleinowe, rybonukleotydy, oligorybonukleotydy, tiofosforany oligorybonukleotydów, fosforany 2'-OMe-oligory-bonukleotydów, tiofosforany 2'-OMe-oligorybonukleotydów, rybozymy, geny, plazmidy i wektory.

Pęcherzyk według wynalazku ma średnicę w zakresie 120 - 180 nm.

Pęcherzyk według wynalazku może być korzystnie otrzymany niżej zdefiniowanym sposobem i jest przeznaczony do specyficznego lub niespecyficznego dostarczenia materiału genetycznego do docelowych komórek lub tkanek, zwłaszcza do nie-infekcyjnego przenoszenia materiału genetycznego do rezydentnych (pozostających w spoczynku) lub ulegających proliferacji komórek ssaczych.

Pęcherzyk według wynalazku jest stosowany jako środek leczniczy do profilaktyki lub leczenia ludzi lub zwierząt, bądź do wykorzystania w diagnostyce.

Sposób wytwarzania pęcherzyka o wyżej podanych cechach według wynalazku polega na tym, że w kolejnych etapach:

a) w odpowiednim buforze zawierającym niejonowy detergent rozpuszcza się co najmniej jeden naturalny lub syntetyczny wirusowy peptyd fuzyjny, wybrany z grupy obejmującej: trimer hemaglutyniny lub monomer hemaglutyniny, jej jedną lub obie odszczepione podjednostki, glikopeptydy HA1 i HA2, wirusowy peptyd fuzyjny wyodrębniony ze źródeł naturalnych oraz syntetyczny wirusowy peptyd fuzyjny,

b) do wytworzonego roztworu dodaje się i rozpuszcza w nim fosfatydyloetanolaminę oraz lipidy kationowe i/lub polikationowe oraz ewentualnie fosfatydylocholinę,

c) do roztworu otrzymanego w etapie b) dodaje się co najmniej jeden komórko-specyficzny marker oraz bifunkcyjny środek sieciujący w formie wcześniej wytworzonego kompleksu cząsteczkowego, którym jest oczyszczony sprzężony marker wyodrębniony z mieszaniny reakcyjnej przez oddzielenie niesprzężonych cząsteczek: środek sieciujący-fosfatydyloetanolamina od sprzężonych markerów, a ów wskazany kompleks cząsteczkowy składa się z fosfatydyloetanolaminy, bifunkcyjnego środka sieciującego oraz komórkospecyficznego markera, przy czym marker jest związany poprzez grupę tiolową z sieciującą częścią cząsteczki utworzonej przez kowalencyjne związanie środka sieciującego z fosfatydyloetanolaminą,

d) usuwa się detergent przez działanie na uzyskany roztwór kulkami mikronośnika, korzystnie Biobeads SM-2, bądź ewentualnie przez dializę - gdy jako detergent stosowany jest n-oktylooligooksyetylen (oktylo-POE), z wytworzeniem zawiesiny zawierającej dodatnio naładowane dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe.

W sposobie według wynalazku stosuje się:

(i) lipidy kationowe obejmujące co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej chlorek N-[1,2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTMA); metylosiarczan N-[1,2,3-dioleoiloksy)-propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTAP); N-t-butylo-N'-tetradecylo-3-tetradecyloaminopropionamidynę; i/lub (ii) lipidy polikationowe obejmujące co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej 1,3-di-palmitoilo-2-fosfatydyloetanolo-amidosperminę (DPPES); dioktadecyloamidoglicylosperminę (DOGS); trifluorooctan 2,3-dioleiloksy-N-[2(sperminokarboksamido)etylo]-N,N-dimetylo-1-propanoamoniowy (DOSPA); 1,3-dioleoil-oksy-2-(6-karboksyspermylo)-propyloamid (DOSPER) i jodek N,N,N',N'-tetrametylo-N,N'-bis(2-hydroksyetylo)-2,3-dioleoiloksy-1,4-butanodiamoniowy (THDOB).

W sposobie według wynalazku jako wskazany bufor stosuje się bufor HEPES, który dodatkowo zawiera detergent niejonowy w stężeniu 10 do 250 μmol na ml, a ów niejonowy detergent jest korzystnie wybrany z grupy, którą stanowi monododecylowy eter glikolu oktaetylenowego oraz n-okrylooligooksyetylen.

W sposobie według wynalazku, w przeliczeniu na całość lipidów dodaje się:

- 90 do 95% wag. lipidów kationowych i/lub polikationowych oraz 5 do 10% wag. fosfatydyloetanolaminy; bądź 45 do 90% wag. lipidów kationowych i/lub polikationowych, 5 do 10% wag. fosfatydyloetanolaminy oraz 5 do 50% wag. fosfatydylocholiny,

PL 199 201 B1

W sposobie wedł ug wynalazku żądany materiał genetyczny dodaje się do roztworu z etapu b).

Alternatywnie, w sposobie według wynalazku żądany materiał genetyczny dodaje się do zawiesiny pęcherzyków z etapu d), a następnie uzyskaną mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków w celu wprowadzenia żądanego materiału genetycznego do wnętrza tych pęcherzyków, po czym niewprowadzony materiał oddziela się od pęcherzyków, korzystnie na drodze filtracji żelowej.

W sposobie według wynalazku jako wskazany komórkospecyficzny marker stosuje się marker wybrany z grupy obejmującej monoklonalne przeciwciało, fragment F(ab')₂ przeciwciała, fragment Fab' przeciwciała, cytokinę i czynnik wzrostu.

W sposobie według wynalazku jako środek sieciujący stosuje się heterobifunkcyjną pochodną sukcynimidylu, korzystnie wybraną z grupy, którą tworzą pochodne bis-N-sukcynimidylu i fotoaktywowalne heterobifunkcyjne środki sieciujące.

W sposobie według wynalazku stosuje się związaną kowalencyjnie cząsteczkę środek sieciujący-fosfatydyloetanolamina wybraną z grupy, którą stanowią N-[4-(p-maleimidofenylo)-butyryl]-fosfatydyloetanolamina (MPB.PE) oraz 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan-fosfatydyloetanolamina (MCC.PE).

W sposobie według wynalazku niesprzężone cząsteczki środek sieciujący-fosfatydyloetanolamina, zwłaszcza niesprzężone cząsteczki MPB.PE MCC.PE, usuwa się z mieszaniny reakcyjnej metodą chromatografii żelowej, korzystnie za pomocą chromatografii powinowactwa z matrycą agarozową, najkorzystniej stosując zredukowaną Thiopropylosepharose 6B.

W sposobie według wynalazku stosuje się żądany materiał genetyczny wybrany z grupy obejmującej krótkołańcuchowe DNA lub RNA, deoksyrybonukleotydy, oligodeoksyrybonukleotydy, seleniany oligodeoksyrybonukleotydów, tiofosforany oligodeoksyrybonukleotydów, fosforamidany oligodeoksyrybonukleotydów, metylofosfoniany oligodeoksyrybonukleotydów, peptydowe kwasy nukleinowe, rybonukleotydy, oligorybonukleotydy, tiofosforany oligorybonukleotydów, fosforany 2'-OMe-oligorybonukleotydów, tiofosforany 2'-OMe-oligorybo-nukleotydów, rybozymy, geny, plazmidy i wektory.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie pęcherzyka lipidowego według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka, białaczek i infekcji wirusowych.

Korzystnie, w zastosowaniu według wynalazku pęcherzyk zawiera co najmniej jeden antysensowny oligonukleotyd odpowiedni dla terapii antysensownej, a antysensowny oligonukleotyd jest korzystnie nakierowany na protoonkogen lub na mRNA kodowany przez onkogen.

Niniejszy wynalazek dotyczy więc nowego wirosomu kationowego, który wskutek jego szczególnego składu błony może bardzo skutecznie być załadowany dowolnym żądanym materiałem genetycznym obejmującym długo- i krótkołańcuchowe DNA lub RNA, oligodeoksynukleotydy, rybonukleotydy, peptydowe kwasy nukleinowe (PNĄ), rybozymy (cząsteczki RNA o aktywności enzymatycznej), geny, plazmidy i wektory, a zatem wyraźnie i przekonująco przezwycięża wady stanu techniki.

Wynalazek w zakresie sposobu wytwarzania wyżej opisanego nowego wirosomu kationowego zapewnia skuteczną rekonstytucję hemaglutyniny wirusa grypy A, szczególnie szczepu A/Singapore, do kationowych pęcherzyków lipidowych z wytworzeniem wirosomów kationowych o średnicy około 120 - 180 nm i o ciągłej dwuwarstwie lipidowej, zasadniczo pozbawionych wady wycieków występującej w wielu konwencjonalnych preparatach wirosomowych. Struktura kationowej błony dwuwarstwowej jest taka, że hydrofilowe, dodatnio naładowane czoła lipidów są zorientowane w kierunku fazy wodnej (faz wodnych), a hydrofobowe ogony kwasów tłuszczowych są zorientowane w kierunku środka dwuwarstwowego pęcherzyka. Można wykazać za pomocą mikroskopu elektronowego, że rekonstytuowane wirusowe proteiny „kolczaste” (hemaglutynina) są wintegrowane w lipidową dwuwarstwę i wystają ponad powierzchnię pęcherzyków kationowych (fig. 1).

Obecny wynalazek opiera się na nieodwracalnym wiązaniu kowalencyjnym komórkospecyficznych markerów do kationowych wirosomów, w tym (lecz nie ograniczając się do) przeciwciał monoklonalnych, fragmentów przeciwciał, takich jak fragmenty F(ab')2 i Fab', cytokin, i/lub czynników wzrostu, przydatnych do selektywnej detekcji i wiązania komórek docelowych. Są one związane z błoną pęcherzyka tak, że rozciągają się na zewnątrz i wykazują zasadniczo pełną aktywność funkcyjną względem detekcji receptora i wiązania.

Sprzęganie komórkospecyficznych markerów, takich jak fragmenty przeciwciał z uprzednio utworzonymi pęcherzykami, jak opisano przykładowo przez Martin i in. (J. Biol. Chem. 257: 286-288, 1982) nierzadko prowadzi do niskich i często niepowtarzalnych wydajności sprzęgania, co stanowi komplikację powodującą znaczne ograniczenie strategii ukierunkowywania wirosomów. Zatem, według korzystnego przykładu wykonania niniejszego wynalazku markery sprzęga się z uprzednio

PL 199 201 B1 uformowanymi układami fosfatydyloetanolamina-cząsteczka środka sieciującego, takimi jak przykładowo N-[4-(p-maleimido-fenylobutyrylo]-fosfatydyloetanolaminy (MPB.PE) w obecności detergenta.

Aby osiągnąć najlepsze możliwe wyniki okazało się wskazane staranne wyodrębnienie i oczyszczenie glikoprotein wirusowych przed rekonstytucją, aby uniknąć inaktywacji przez proteolityczne wytrawianie lub redukcję wewnątrzcząsteczkowych wiązań S-S. Zgodnie z powyższym, korzystnie sprzężone markery, przykładowo marker-MPB.PE, oddziela się od niesprzężonych układów fosfatydyloetanolamina-cząsteczka środka sieciującego (przykładowo MPB.PE) za pomocą chromatografii powinowactwa z aktywowaną matrycą agarozową, korzystnie za pomocą zredukowanej Thiopropyl-Sepharose 6B. Próbki oczyszczonych sprzężonych markerów (kompleksów fosfatydyloetanolamina-czynnik sieciujący-marker) dodaje się następnie do roztworu detergenta zawierającego mieszaninę rozpuszczonych lipidów membranowych, peptydów fuzyjnych i innych żądanych składników, przed utworzeniem z nich wirosomów kationowych.

Okazało się korzystne prowadzenie sprzęgania bifunkcyjnego czynnika sieciującego z fosfolipidem i komórkospecyficznym markerem jako oddzielnego etapu poprzedzającego wytwarzanie wirosomów. Takie postępowanie pozwala na lepszą kontrolę i optymalizację powierzchniowej gęstości błon wirosomów, szczególnie pod względem liczby przyłączonych do nich komórkospecyficznych markerów. Lepsza kontrola stężenia cząsteczek proteinowych znajdujących się w błonie lub związanych z błoną jest ważna, ponieważ niezrównoważony stosunek peptydów fuzyjnych (przykładowo hemaglurynina) i komórkospecyficznych markerów (przykładowo fragmenty przeciwciała Fab') na błonie wirosomu może zmniejszyć lub nawet zniszczyć ich selektywne właściwości i - w skrajnym przypadku - może spowodować powstawanie skrzepu i wytrącanie pęcherzyków.

Stosowanie fragmentów przeciwciał F(ab')2 i Fab' zamiast całych cząsteczek przeciwciał jako komórkospecyficznych markerów jest szczególnie korzystne, ponieważ są one znacznie mniej immunogenne niż całe przeciwciała. Ponadto, brak domeny Fc eliminuje szereg niepożądanych aktywności biologicznych i immunologicznych, zachodzących za pośrednictwem Fc, takich jak przykładowo aktywacja komplementu drogą klasyczną i ostre reakcje humoralne powodujące ewentualnie -między innymi - usuwanie z powierzchni komórki docelowej przyłączonych wirosomów poprzez oddziaływanie między przeciwciałem i jego Fc-receptorem na komórce docelowej.

W przeciwieństwie do znanych kompozycji liposomowych dla dostarczania kwasów nukleinowych, obecne wirosomy kationowe zwykle nie muszą ulegać fuzji lub destabilizować błony komórkowej plazmy, aby wniknąć do cytoplazmy. Są one zdolne do wchodzenia do komórek gospodarza zgodnie z mechanizmem dwuetapowym: 1. dołączenie i 2. przenikanie. W pierwszym etapie wiążą się one poprzez peptydy fuzyjne (przykładowo hemaglutyninę) i/lub komórkospecyficzne markery z receptorami komórki, szczególnie z membranowymi glikoproteinami lub glikolipidami z końcowym kwasem sialowym, a następnie są bardzo skutecznie włączane przez endocytozę za pośrednictwem receptora. W przypadku wirosomów zawierających markery komórkospecyficzne, przykładowo fragmenty przeciwciał, markery te będą dodatkowo rozpoznawać struktury antygenowe na powierzchni komórki docelowej, co prowadzi do przyłączenia poprzez dwa różne mechanizmy wiązania. Zatem obecne komórkospecyficzne wirosomy według wynalazku charakteryzuje selektywność względem różnych typów komórek dzięki ich komórkospecyflcznym markerom na błonie, a równocześnie wysoka zdolność przenikania do komórek poprzez endocytozę dzięki wirusowemu peptydowi fuzyjnemu przykładowo hemaglutyninie. Wirosomy z fragmentami Fab', które rozpoznają antygeny związane z nowotworem, takie jak TAG72, CEA, 17-1A, CA19-9 lub antygeny związane z białaczką, takie jak CD1O (CALLA = Common Acute Lymphocytic Leukaemia Antigen, tj. antygen pospolitej ostrej białaczki limfocytowej) i CD2O będą się wiązać selektywnie z komórkami nowotworowymi lub białaczkowymi, zawierającymi wspomniane antygeny na powierzchni ich komórek.

W drugim etapie, przy wnikaniu do komórek gospodarza dzięki endocytozie za pośrednictwem receptora, wirosomy ulegają uwięzieniu w endosomach. W wyniku tego, pH w endosomach obniża się do około pH 5-6, co aktywuje peptyd fuzyjny hemaglutyninę i wyzwala fuzję błony wirosomowej z błoną endosomową. Reakcja fuzji błon otwiera otoczkę lipidową wirosomów i uwalnia uwięziony materiał genetyczny do cytosolu. Mechanizm ten znacząco zwiększa szansę przenoszonego materiału genetycznego na osiągnięcie jądra zanim nastąpi usunięcie tego materiału przez rozkład trawiący i/lub egzocytozę.

Szczegółowy opis wynalazku

Pierwszym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie dodatnio naładowanych pęcherzyków lipidowych zawierających kationowe lub polikationowe lipidy i wewnętrzną - zwykle wodną - przestrzeń, a ponadto obejmujących co najmniej jeden wirusowy peptyd fuzyjny osadzony lub wbudowany

PL 199 201 B1 w błonę pęcherzyka lub związany kowalencyjnie z błoną pęcherzyka. Pęcherzyk korzystnie zawiera także co najmniej jeden komórkospecyficzny marker na swojej błonie. Ponadto, celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie pęcherzyków mających pełną biologiczną aktywność fuzyjną tzn. mających zasadniczo tę samą aktywność fuzyjną co nienaruszony wirus grypy. Peptyd fuzyjny jest wirusową glikoproteiną taką, jak hemaglutynina lub jej pochodna, albo syntetycznym peptydem fuzyjnym zdolnym do indukowania szybkiej fuzji wspomnianych pęcherzyków z błonami endosomowymi komórek docelowych po endocytozie.

Nowe pęcherzyki lub wirosomy według wynalazku są szczególnie przydatne do przenoszenia dowolnego, żądanego materiału genetycznego do miejsc docelowych, w szczególności do komórek i tkanek zwierzęcych i ludzkich in vitro oraz in vivo. Należy podkreślić, że nowe wirosomy są nie tylko zdolne do przenikania do komórek proliferujących, tzn. ulegających replikacji, lecz także do komórek nie proliferujących, tzn. do komórek pozostających w spoczynku, która to cecha czyni je szeroko stosowalnymi w dziedzinach nauk biologicznych, w farmakologii i medycynie, zarówno jako narzędzie badawcze i/lub diagnostyczne oraz jako środek leczniczy. Przy stosowaniu jako środek leczniczy, obecne wirosomy mogą stanowić część kompozycji farmaceutycznej, która ponadto obejmuje zwykłe dodatki i farmaceutycznie odpowiednie nośniki. Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna ma postać roztworu do iniekcji, lecz także inne postacie galeniczne, jak przykładowo emulsje, kremy, żele, maści, do podawania miejscowego lub układowego, w pewnych zastosowaniach mogą okazać się również korzystne.

Zatem celem niniejszego wynalazku jest także zastosowanie obecnych wirosomów do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej odpowiedniej do profilaktyki i/leczenia osobników zwierzęcych lub ludzkich, które mogą odnieść korzyść z takich zabiegów. Zastosowanie obecnych wirosomów pozwala także na wytwarzanie zestawu diagnostycznego do stosowania in vitro oraz in vivo.

Zgodnie z wynalazkiem, obecne pęcherzyki otrzymuje się w procesie obejmującym skuteczną rekonstytucję hemaglutyniny (HA) wirusa grypy A. A zatem, przedmiotem niniejszego wynalazku jest także zapewnienie sposobu wytwarzania wirosomów kationowych. W korzystnym wykonaniu, sposób ten obejmuje ponadto etapy włączania materiału genetycznego do kationowych pęcherzyków lipidowych. Zasadniczo, sposób wytwarzania według wynalazku obejmuje następujące etapy:

1) w odpowiednim buforze zawierającym niejonowy detergent rozpuszcza się co najmniej jeden naturalny lub syntetyczny wirusowy peptyd fuzyjny, wybrany z grupy obejmującej: trimer hemaglutyniny lub monomer hemaglutyniny, jej jedną lub obie odszczepione podjednostki, glikopeptydy HA1 i HA2, wirusowy peptyd fuzyjny wyodrębniony ze źródeł naturalnych oraz syntetyczny wirusowy peptyd fuzyjny,

2) do wytworzonego roztworu dodaje się i rozpuszcza w nim fosfatydyloetanolaminę oraz lipidy kationowe i/lub polikationowe oraz ewentualnie fosfatydylocholinę,

3) do roztworu otrzymanego w etapie b) dodaje się co najmniej jeden komórko-specyficzny marker oraz bifunkcyjny środek sieciujący w formie wcześniej wytworzonego kompleksu cząsteczkowego, którym jest oczyszczony sprzężony marker wyodrębniony z mieszaniny reakcyjnej przez oddzielenie nie-sprzężonych cząsteczek: środek sieciujący-fosfatydyloetanolamina od sprzężonych markerów, a ów wskazany kompleks cząsteczkowy składa się z fosfatydyloetanolaminy, bifunkcyjnego środka sieciującego oraz komórkospecyficznego markera, przy czym marker jest związany poprzez grupę tiolową z sieciującą częścią cząsteczki utworzonej przez kowalencyjne związanie środka sieciującego z fosfatydyloetanolaminą,

4) usuwa się detergent przez działanie na uzyskany roztwór kulkami mikronośnika, korzystnie Biobeads SM-2, bądź ewentualnie przez dializę - gdy jako detergent stosowany jest n-oktylooligooksyetylen (oktylo-POE), z wytworzeniem zawiesiny zawierającej dodatnio naładowane dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe.

Kulki mikronośnika absorbującego detergent, korzystnie stanowią kulki polistyrenowe typu SM-2 Biobeads o wielkości (na mokro) odpowiadającej korzystnie sitom 20-50 mesh (0,84 - 0,30 mm).

W korzystnym wykonaniu wynalazku, stosuje się odpowiedni bifunkcyjny środek sieciujący, by marker komórkospecyflczny nieodwracalnie związać z błoną pęcherzyka. Komórkospecyflczny marker, który jest ukierunkowany na receptor komórki odpowiedzialny za selektywne związanie wirosomu z komórką, jest związany ze środkiem sieciującym w taki sposób, że zachowuje wciąż pełną aktywność biologiczną. Korzystnie, środek sieciujący stosuje się w formie uprzednio utworzonego kompleksu cząsteczkowego, w którym środek sieciujący jest kowalencyjnie związany z fosfatydyloetanolaminą lub zarówno z fosfatydyloetanolaminą, jak i z komórkospecyficznym markerem.

Dzięki funkcjonalnej aktywności peptydów fuzyjnych obecnych wirosomów, otoczkowany materiał jest uwalniany do cytosolu komórki docelowej, głównie przez obniżenie endosomowego pH (jak

PL 199 201 B1 wskazano powyżej). Takie kontrolowane uwalnianie z jednej strony przedłuża czas przebywania dostarczonego materiału w komórce docelowej, a z drugiej strony eliminuje niepożądanie długie przebywanie wirosomów wewnątrz endosomów i tym samym zmniejsza niebezpieczeństwo niespecyficznej degradacji cennych substancji transportowanych przez wirosomy.

Niniejszy wynalazek, w jeszcze innym przykładzie wykonania, dotyczy pęcherzyków, w których błonowe lipidy dodatkowo obejmują fosfatydylocholinę i fosfatydyloetanolaminę, co dodatkowo zwiększa możliwości projektowania specyficznych wirosomów i/lub ułatwia mocowanie peptydów fuzyjnych i/lub komórkospecyficznych markerów do błony.

Określenie „peptyd fuzyjny” dotyczy peptydów lub protein zdolnych do indukowania i/lub sprzyjania reakcji fuzji między błoną wirosomu i błoną lipidową komórki docelowej. W większości wykonań wynalazku, dotyczy to glikoprotein „kolców” wirusowych, zawierających peptyd fuzyjny, szczególnie pełnego trimeru hemaglutyniny „kolców” z powierzchni wirusów, jej monomeru, albo jednej lub obydwu odszczepionych podjednostek, glikopeptydów HA1 i HA2, zawierających funkcjonalny peptyd fuzyjny. W innym wykonaniu niniejszego wynalazku okreś lenie dotyczy samego czystego peptydu fuzyjnego, wyodrębnionego ze źródeł naturalnych lub wytworzonego syntetycznie. W szczególnie korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, te polipeptydy zawierające peptyd fuzyjny odnoszą się do hemaglutynin grypy, zwłaszcza hemaglutyniny należącej do podtypu A-H1N1. Syntetyczne peptydy fuzyjne są korzystnie wybrane spośród sekwencji aminokwasowych podanych poniżej w tabeli 1, w której aminokwasy są identyfikowane przez ich odpowiednie kody jednoliterowe (patrz także przykład 6 i fig. 2 w publikacji WO 92/13525).

Określenie „środek sieciujący” dotyczy organicznej cząsteczki heterobifunkcyjnej zdolnej do łączenia się z powierzchnią pęcherzyków wytworzonych według obecnego wynalazku i zdolnych do wiązania polipeptydów. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, cząsteczka ta zawiera grupę N-hydroksysukcynimidową do sprzęgania z grupą aminową fosfatydyloetanolaminy i grupę maleimidową do sprzęgania z fragmentami przeciwciał monoklonalnych, tak jak 4-(N-maleimidometylo)-cykloheksano-1-karboksylan sukcynimidylu, ester m-maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynimidu, ester m-maleimidobenzoilo-N-hydroksysulfosukcynimidu, 4(p-maleimidofenylo)-maślan sukcynimidylu, 4(p-maleimidofenylo)maślan sulfosukcynimidylu; lub zawiera grupę N-hydroksysukcynimidową i fotoreaktywną grupę azydkową do sprzęgania z cytokinami, tak jak N-hydroksysukcynimidylosuberan (NHSSA), N-hydroksysukcynimidylo-4-azydobenzoesan (HASAB), N-sukcynimidylo-6-(4'azydo-2'-nitrofenylamino)heksanian (SANPAH), N-sulfosukcynimidylo-6-(4'-azydo-2'-nitrofenylamino)heksanian.

Ta b e l a 1

PL 199 201 B1

Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem, środek sieciujący stosuje się w formie uprzednio utworzonego kompleksu cząsteczkowego środka sieciującego i lipidu, zwłaszcza środka sieciującego i fosfatydyloetanolaminy lub lipidu, środka sieciującego i komórkospecyficznego markera.

Określenie „komórkospecyficzna” proteina lub marker dotyczy proteiny zdolnej do wiązania - odpowiednio, ze środkiem sieciującym lub kompleksem środek sieciujący-lipid, a ponadto zdolnej do wiązania z receptorami komórek docelowych.

W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, określenie to odnosi się do związku specyficznego względem receptora komórki, takiego jak przeciwciało monoklonalne, fragment przeciwciała, cytokina lub czynnik wzrostu. Komórkospecyficzny marker zapewnia selektywną detekcję oraz wiązanie komórek docelowych i tym samym usprawnia działanie peptydu fuzyjnego obecnego jednocześnie w błonie wirosomowej. Korzystne fragmenty przeciwciał obejmują fragmenty F(ab')2 i Fab', podczas gdy komórkospecyficzne markery obejmują ponadto interleukiny i inne cytokiny, szczególnie te podane poniżej w tabeli 2.

T a b e l a 2

Cytokiny (skróty międzynarodowe)

BDNF	IFNa	MlP-1a	PDGF
CNTF	IFNe	MIP-1P	PF-4
EGF	IFNy	MIP-2	RANTES
Epo	IL-1 do IL-15	NGF	SCF
FGF	LIF	NT-3	TGFa
G-CSF	LT (TNFe)	NT-4	TGFe
GM-CSF	MCP-1 do MCP-3	OSM	TNFa
I-309/TCA-3	M-CSF	PBP	Tpo
YIP-10	MIF	PBSF	jVEGF

Określenie „lipid kationowy” stosowane w niniejszym tekście dotyczy cząsteczki organicznej zawierającej składnik kationowy i niepolarny „ogon”, tzw. amfifil o konfiguracji „głowa do ogona”, taki jak chlorek N-((1,2,3-dioleoiloksy)propylo)-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTMA) (Felgner i in.; Proc Natl Acad USA 84:7413-7417, 1987), metylosiarczan N-[1,2,3-dioleoiloksy)-propyl)-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTAP); lub N-t-butylo-N'-tetradecylo-3-tetradecyloaminopropionamidyna (Ruysschaert i in.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 203:1622-25 1628, 1994). O ile wyraźnie nie podano inaczej, określenie to obejmuje także poniżej określone lipidy polikationowe.

Określenie „lipid polikationowy” dotyczy cząsteczki organicznej zawierającej składnik polikationowy i niepolarny ogon, taki jak lipospermina: 1,3-dipalmitoilo-2-fosfatydyloetanolamido-spermina (DPPES) i dioktadecylo-amidoglicylospermina (DOGS) (Behr i in.; Proc. Natl. Acad. USA 86:6982-6986, 1989); trifluorooctan 2,3-dioleoiloksy-N-[2(sperminokarboksamido)etylo]-N,N-dimetylo-1-propanoaminiowy (DOSPA); 1,3-dioleoiloksy-2-(6-karboksy-spermylo)-propyloamid (DOSPER); jodek N,N,N',N'-tetrametylo-N,N'-bis(2-hydroksyetylo)-2,3-dioleoiloksy-1,4-butanodi-amoniowy (THDOB).

Określenia „kwas nukleinowy” lub „materiał genetyczny” stosowane w niniejszym tekście obejmują krótkołańcuchowe DNA lub RNA, deoksyrybonukleotydy, oligodeoksyrybonukleotydy, seleniany oligodeoksyrybonukleotydów, tiofosforany oligodeoksyrybonukleotydów (OPT), fosforamidany oligodeoksyrybonukleotydów, metylofosfoniany oligodeoksyrybonukleotydów, peptydowe kwasy nukleinowe (PNA), rybonukleotydy, oligorybonukleotydy, tiofosforany oligorybonukleotydów, fosforany 2'-OMe-oligorybonukleotydów, tiofosforany 2'-OMe-oligorybonukleotydów, rybozymy (cząsteczki RNA o aktywności enzymatycznej), geny, plazmidy i wektory (vehiculum klonowania).

Określenie „wirosomy” stosowane w niniejszym tekście odnosi się - w swojej najprostszej formie - do pęcherzyków liposomowych o dwuwarstwowej błonie, obejmującej lipidy kationowe oraz o wewnętrznej - korzystnie wodnej - przestrzeni, przy czym błona ponadto zawiera proteiny wirusowe, w szczególności glikoproteiny wirusowe. W korzystnym przykładzie realizacji, proteiny wirusowe obejmują co najmniej jeden fuzjogenny peptyd lub proteinę mające pełną biologiczną aktywność fuzyjną, szczególnie glikoproteinę hemaglutyninę i/lub neuraminydazę z „kolców” wirusa grypy A (przykładowo A/Singapore). Należy rozumieć, że proteiny wirusowe obejmują także syntetycznie

PL 199 201 B1 wytworzone sekwencje aminokwasowe odpowiadające lub równe peptydowi fuzyjnemu wirusa grypy, jak opisane w niniejszym tekście. Lipidy błony obejmują lipidy kationowe określone powyżej, lecz mogą ewentualnie ponadto obejmować inne naturalne i/lub syntetyczne lipidy, korzystnie fosfolipidy takie, jak fosfatydylocholina (PC) i fosfatydyloetanolamina (PE).

Chociaż wirosomy kationowe według niniejszego wynalazku mogą w wielu wypadkach - zwłaszcza w eksperymentach w zakresie hodowli komórkowych in vitro - pomyślnie być użyte bez komórkospecyficznych markerów na błonie, dla zastosowań in vivo, szczególnie korzystne jest, aby miały one na błonie co najmniej jeden komórkospecyficzny marker, jak określony powyżej. Przeciętna średnica pęcherzyków jest w zakresie 120 - 180 nm, według oznaczeń metodą mikroskopii elektronowej i dynamicznego rozpraszania światła.

Określenie „pełna (biologiczna) aktywność fuzyjna” stosowane w niniejszym tekście oznacza, że wirosomy według niniejszego wynalazku obejmujące rekonstytuowane proteiny wirusowe w błonie pęcherzyka mają zasadniczo taką samą aktywność fuzyjna względem komórek docelowych co nienaruszony wirus, z którego są one zwykle rekonstytuowane. Korzystnie, fuzjogenność wirosomów kationowych porównuje się względem nienaruszonego wirusa grypy A. Aktywność fuzyjną mierzy się znanymi metodami, szczególnie jak podano przez Hoekstra i in. (Biochemistry 23:5675-5681,1984), lub Luscher i in. (Arch. Virol. 130:317-326, 1993).

Zanim technikę antysensowną może będzie terapeutycznie lub profilaktycznie zastosować u pacjenta, u którego istnieje taka potrzeba, należy rozwiązać szereg problemów technicznych, szczególnie dotyczących opracowania odpowiedniego układu nośnikowego. Przykładowo, materiał genetyczny taki, jak przykładowo antysensowne oligonukleotydy, może być nietrwały i rozkładać się lub może być w inny sposób w większym lub mniejszym stopniu inaktywowany, zanim osiągnie komórki docelowe, a zatem może być niezbędne użycie dużych ilości takiego materiału uwięzionego w konwencjonalnych liposomach kationowych. W związku z tymi dużymi ilościami powstaje pytanie co do ich potencjalnej toksyczności w organizmie ludzkim lub zwierzęcym.

Przez zastosowanie wirosomów kationowych według niniejszego wynalazku jako nośników materiału genetycznego można te trudności pomyślnie przezwyciężyć i zapobiec niepożądanym efektom ubocznym wynikającym z toksyczności lub co najmniej znacząco je zmniejszyć. Taki korzystny efekt osiąga się, ponieważ obecne wirosomy kationowe mają - w porównaniu z dotychczas znanymi liposomami lub wirosomami - znacznie wyższą (nawet rzędu 1000-20000) aktywność i skuteczność pod względem przenoszenia uwięzionego materiału genetycznego takiego, jak anty sensowne oligonukleotydy - do komórek docelowych. W konsekwencji, praktycznie niemożliwe jest porównanie działania konwencjonalnych wirosomów lub liposomów kationowych z działaniem obecnych wirosomów kationowych.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia fotomikrografię wirosomów DOTAP z proteinami z „kolców” wirusa.

Figura 2 przedstawia indukowaną przez pH aktywność fuzyjną wirosomów DOTAP znaczonych oktadecylorodaminą B z liposomami modelowymi.

Figura 3 przedstawia wirosomy DOTAP stanowiące otoczkę antysensownego FITC-OPT włączone w komórki ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc.

Figury 4 i 5 przedstawiają nadzwyczaj na skuteczność wychwytu i transfekcji antysensownych L-myc-wirosomów DOTAP włączonych w komórki ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc.

Figura 6 przedstawia inkubację różnych komórek ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc antysensownymi L-myc-wirosomami.

Figury 7a, 7b przedstawiają skuteczność transfekcji wirosomów pRSVcat-DOTAP dla komórek Jurkata.

Figura 8: Fuzja wirosomów DOTAP z fosfolipido-liposomami. Fuzję mierzono przy użyciu próby R18 w 37°C.

Figura 9: Włączenie tymidyny w komórki NCI-H209 poddane działaniu wirosomu. 75 μl wirosomów zawierających 200 pikomoli antysensownego, sensownego lub msc FITC-OPT i 625 μl świeżej pożywki zawierającej 0,5 μ Ci ¹⁴C-tymidyny dodano do 5x10⁴ komórek/ml na zagłębienie.

Figura 10: Zależne od dawki inhibitowanie włączenia tymidyny w komórki NCI-H209 po dodaniu wirosomów zawierających antysensowny L-myc-OPT. Komórki NCI-H209 inkubowano przy początkowym stężeniu komórek 1 x 10⁵ na zagłębienie i na ml. Podane wartości to wartości średnie ± odchylenie standardowe z trzech pomiarów.

PL 199 201 B1

Figura 11: Inkubacja różnych linii komórkowych ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc przy użyciu 75 μΐ antysensownych wirosomów L-myc. Ekspresja onkogenu L-myc obniża się w liniach komórkowych następująco: H82 < H510A < H209. Wirosomy z serii 1 zawierały mniejszą ilość antysensownego L-myc niż wirosomy z serii 2.

Figura 12: Transfekcja komórek Sp2 przez dwa różnie wytworzone preparaty wirosomów.

Figura 13: Transfekcja komórek P3/NS1 przez dwa różnie wytworzone preparaty wirosomów.

Figura 14: Transfekcja komórek NIH/3T3 przez dwa różnie wytworzone preparaty wirosomów.

Figury 15, 16, 17: Wzrost komórek KG 1 po działaniu sensownymi i antysensownymi wirosomami c-myb-DOTAP. Dodanie 25, 50 lub 100 μl roztworu wirosomów zawierającego 18, 36, lub 72 pmol OPT, odpowiednio. Podane wartości to wartości średnie ± odchylenie standardowe z trzech pomiarów.

Figura 18: Wzrost komórek CEM-C3 po działaniu wirosomami DOTAP przy dodaniu 50 μl sensownego i antysensownego roztworu wirosomów c-myb. Podane wartości to wartości średnie ± odchylenie standardowe z trzech pomiarów.

Aby wynalazek tu opisany mógł być w pełni zrozumiały, podano poniższe przykłady. Przykłady służą jedynie do celów ilustracji i nie należy ich rozumieć jako ograniczających ten wynalazek pod jakimkolwiek względem.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie pęcherzyków lipidowych z lipidów kationowych z wirusowymi trimerami hemaglutyniny z wirusa grypy o pełnej aktywności fuzyjnej, stanowiących otoczkę antysensownego oligodeoksynukleotydu L-myc-FITC (=znaczonego fluoresceiną).

Wytwarzanie wirosomów DOTAP i wirosomów DOTAP-fosfatydylocholina (PC)

Hemaglutyninę (HA) ze szczepu A/Singapore/6/86 wirusa grypy wyodrębniono jak opisali Skehel i Schild (1971), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:968-972. Ujmując to w skrócie: wirus namnażano w jamie omoczni jaj kurzych i oczyszczono go dwukrotnie przez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy. Oczyszczony wirus stabilizowano w buforze zawierającym 7,9 mg/ml NaCl, 4,4 mg/ml cytrynianu trójsodowego-2H2O, 2,1 mg/ml kwasu 2-morfolinoetanosulfonowego i 1,2 mg/ml kwasu N-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego pH 7,3. Z 53 ml zawiesiny wirusa zawierającej 345 μg HA na ml utworzono grudkę przez ultrawirowanie przy 100000 x g przez 10 min. 7,7 ml buforowanego roztworu detergenta zawierającego 145 mM NaCl, 2,5 mM HEPES i 54 mg/ml niejonowego detergenta - monododecyloeteru oktaetylenoglikolu (OEG = C12E8), pH 7,4, dodano do grudki wirusa grypy. Grudkę całkowicie rozpuszczono przez zastosowanie ultradźwięków przez 2 min w temperaturze pokojowej. Roztwór poddano ultrawirowaniu przy 100 000 x g przez 1 h. Otrzymany supernatant zawierał solubilizowany trimer HA (1,635 mg HA/ml) i śladowe ilości neuraminidazy. Dodano 6 mg DOTAP do 3,7 ml supernatantu (6 mg HA) i rozpuszczono. Roztwór sterylizowano przez przepuszczenie przez filtr 0,2 nm, a następnie przeniesiono do szklanego zbiornika zawierającego 1,15 g sterylnych kulek mikronośnika, korzystnie Biobeads SM-2. Zbiornik wytrząsano przez 1 h stosując wytrząsarkę REAX2 firmy Heidolph (Kelheim, Niemcy). O ile to było niezbędne, procedurę tę powtarzano do trzech razy stosując 0,58 mg Biobeads. Po tych procedurach otrzymano nieco przezroczysty roztwór wirosomów DOTAP.

Dla wytwarzania wirosomów DOTAP-PC, 3 mg DOTAP i 3 mg PC dodano do supernatantu zawierającego 6 mg HA i rozpuszczono. Następne etapy były takie same jak opisano dla wirosomów DOTAP.

Wytwarzanie wirosomów z syntetycznym peptydem fuzyjnym

Jedna z możliwości wytwarzania wirosomów kationowych zawierających syntetyczne peptydy fuzyjne w błonie obejmuje następujące etapy:

1. Aktywacja fosfatydyloetanolaminy (PE) przez środek sieciujący - ester N-fy-maleimidobutyryloksy]sukcynimidu (GMBS) w reakcji:

PE + GMBS -> MBS-PE + N-Hydroksysukcynimid, jak opisano przez Martina i in.: „Irreversible coupling of immunoglobulin fragments to preformed vesicles” (Nieodwracalne sprzęganie fragmentów immunoglobuliny z uprzednio utworzonymi pęcherzykami); J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982).

2. Wytwarzanie pęcherzyków lipidowych z aktywowanym PE (GMB-PE), w którym 20% fosfatydylocholiny, 70% DOTAP i 10% GMB-PE rozpuszczono w buforowanym roztworze detergenta jak opisano powyżej dla wirosomów DOTAP zawierających HA. Następne etapy wytwarzania pęcherzyków lipidowych są takie same jak opisano powyżej dla wirosomów DOTAP.

PL 199 201 B1

3. Sprzęganie syntetycznego peptydu fuzyjnego z pęcherzykami lipidowymi, z użyciem peptydu obejmującego 20 aminokwasów o sekwencji aminokwasowej G-L-F-E-A-I-A-G-F-I-E-N-G-W-E-G-M-ID-C, zawierającego wolną grupę aminową przy końcu N i grupę amidową przy końcu C. Ponieważ aminokwasem przy końcu C jest cysteina, dostępna jest wolna grupa tiolowa dla sprzęgania peptydu z GMP-PE występującego w błonie pęcherzyków lipidowych.

Dla wykonania reakcji sprzęgania:

PE-GMBbłona + HS-Cys-Peptyd --> PE-GMBbłona-S-Cys-Peptyd zmieszano roztwór świeżo wytworzonych pęcherzyków lipidowych w buforze (40 mM kwas cytrynowy, 35 mM fosforan disodowy, 100 mM NaCl, i 2 mM EDTA, pH 5,5) z roztworem peptydu w tym samym buforze. Mieszaninę delikatnie mieszano w atmosferze azotu przez noc w 4°C. Pęcherzyki lipidowe oddzielono od niesprzężonych peptydów przez filtrację żelową na kolumnie High Load Superdex 200.

Alternatywnie, peptydy fuzyjne można także sprzęgać z pęcherzykami lipidowymi stosując uprzednio utworzone kompleksy PE-środek sieciujący-peptyd, jak to opisano poniżej w tym przykładzie w odniesieniu do fragmentów Fab'.

Włączenie tiofosforanów oligodeoksyrybonukleotydów do wirosomów DOTAP

Antysensowne i sensowne tiofosforany oligodeoksyrybonukleotydowe (OPT) genu L-myc użyto przykładowo dla wykazania wysokiej skuteczności wirosomów kationowych w transfekcji. 5'-FITC-OPT zsyntetyzowano przez reakcję chemii fosforamidynów (Microsynth GmbH, Balgach, Szwajcaria). Pentadekamer (5'-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3') i pentadekamer (5'-FITC-GCGGACATGGACTAC-3') użyto odpowiednio jako antysensowny OPT i sensowny OPT. Zsyntetyzowano próbę kontrolną o mieszanej sekwencji (msc) OPT składającą się z nukleotydów tej samej długości jak antysensowny i sensowny OPT.

Po 1 ml wirosomów DOTAP lub wirosomów DOTAP-PC dodano do:

a) 2 mg antysensownego FITC-OPT (1,3 μmol),

b) 3,4 mg sensownego FITC-OPT (1,3 μmol)

c) 3,1 mg msc FITC-OPT (1,3 μmol).

FITC-OPT rozpuszczono, a następnie roztwory poddano działaniu ultradźwięków przez 2 min w 26°C. Nieotoczkowane FITC-OPT oddzielono od wirosomów przez filtrację żelową na kolumnie High Load Superdex 200 (Pharmacia, Szwecja). Kolumnę zrównoważono sterylnym PBS. Frakcje z przestrzeni międzyziarnowej zawierające wirosomy DOTAP stanowiące otoczkę FITC-OPT wymyto PBS i zebrano. Stężenia FITC-OPT uwięzionego w wirosomach oznaczono fluorometrycznie, po całkowitym rozpuszczeniu wirosomów w 0,1 M NaOH zawierającym 0,1% (obj./obj.) Triton X-100. W celu kalibracji skali fluorescencji, fiuorescencję pustych wirosomów DOTAP, które rozpuszczono w powyższym roztworze detergentu przyjęto za zero.

Sprzęganie fragmentów Fab' z wirosomami przy użyciu uprzednio utworzonych kompleksów cząsteczkowych fosfatydyloetanolamina-bifunkcyjny środek sieciujący mg świeżo zredukowanego Fab' z mysiego przeciwciała monoklonalnego anti-CD1O-(AntiCALLA), rozpuszczonego w 2,8 ml roztworu buforu kwasu cytrynowego (100 mM NaCl, 40 mM kwas cytrynowy, 35 mM Na₂HPO₄ -2H₂O, 2 mM EDTA, pH 5,5) dodano do roztworu 0,524 mg N-[4-(p-maleimidofenylo)butyrylo]-fosfatydyloetanolaminy (MPB.PE) w 215 μl buforu kwasu cytrynowego zawierającego 0,5% n-oktylooligooksyetylenu. Następnie mieszaninę inkubowano w atmosferze azotu przez 16 h w 4°C delikatnie mieszając. Po inkubacji usunięto niesprzężony MPB.PE za pomocą porcji 400 μl świeżo zredukowanego mokrego Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia, Szwecja). Mieszaninę inkubowano przez 4 h w temperaturze pokojowej. Thiopropyl-Sepharose 6B usunięto przez odwirowanie i uzyskany roztwór zobojętniono do pH 7,0. Zobojętniony roztwór uzupełniono OEG (54 mg/ml). Roztwory wytworzone jak opisano powyżej dodano do roztworów przygotowanych do wytwarzania wirosomów DOTAP. Cząsteczki Fab'-MPB.PE zostały wstawione w dwuwarstwę lipidową podczas tworzenia wirosomów.

Obserwacje metodą mikroskopii elektronowej

Mikrofotografie wirosomów DOTAP potwierdzają korzystną jednopowłokową strukturę pęcherzyków o średniej średnicy około 120 do 180 nm jak oznaczono przez rozpraszanie światła laserowego. „Kolce” proteiny HA wirusa grypy są wyraźnie widoczne (fig. 1).

Oznaczenie aktywności fuzyjnej wirosomów

Aktywność fuzyjną obecnych wirosomów DOTAP zmierzono w próbie ilościowej opartej na odgaszaniu fluorescencji (%FDQ), opisanej przez Hoekstra i in. (1984), Biochemistry 23:5675-5681

PL 199 201 B1 i Luschera i in. (1993), Arch. Virol. 130: 317-326. Chlorek oktadecylorodaminy B sondy fluorescencyjnej (R18) (otrzymanej z Molecular Probes Inc., Eugene, USA) wstawiono przy dużych gęstościach do błony wirosomów DOTAP przez dodanie buforowanego roztworu OEG (C12E8) zawierającego DOTAP i HA do cienkiej suchej warstewki sondy fluorescencyjnej, a następnie wstrząsając przez 5 do 10 min dla rozpuszczenia sondy i dalej kontynuując jak opisano powyżej w punkcie „Wytwarzanie kationowego pęcherzyka lipidowego”. Rozcieńczenie gaszącej rodaminy obserwowano przez inkubację znaczonych rodaminą wirosomów DOTAP z liposomami modelowymi (stosunek ilościowy DOTAP: fosfolipid liposomowy = 1:20). Fluorescencję zmierzono za pomocą spektrofluorymetru Perkin-Elmer 1000 przy długościach fali wzbudzenia i emisji 560 i 590 nm, odpowiednio. Figura 2 przedstawia indukowaną przez pH reakcję fuzji wirosomów DOTAP wyrażoną jako procent odgaszania fluorescencji (% FDQ).

Wychwyt komórkowy otoczkowanego antysensownego L-myc-FITC-OPT

Znakowanie OPT fluoresceiną okazało się bardzo przydatne, by zbadać mechanizm wychwytu komórkowego wirosomów DOTAP. Komórki ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc (ATCC-NCI-H209), ekspresjonujące znaczne poziomy genu L-myc (Nau i in. 1985; Nature 318, 69-73) hodowano na szkiełkach komory do hodowli tkankowej o 2 zagłębieniach (Nunc, Naperville, IL 60566, USA). Do komórek dodano 50 μl wirosomów FITC-OPT; inkubowano je przez 5, 15 i 30 min w 37°C, dwukrotnie przemyto PBS, a następnie zbadano metodą mikroskopii fluorescencyjnej. Wirosomy DOTAP stanowiące otoczkę antysensownego FITC-OPT szybko ulegały włączeniu do komórek, jak widać na fig. 3.

Badanie efektu biologicznego działania wirosomów z antysensownym L-myc-FITC-OPT-DOTAP zmierzonego metodą włączenia tymidyny

Komórki ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc (ATCC-NCI-H209 American Type Culture Collection, Rockville, USA) hodowano na płytkach Costar o 24 zagłębieniach przy początkowym stężeniu 1 x 10⁵ na zagłębienie i na ml. Po inkubacji przez 24 h, pożywkę usunięto i dodano 625 μl świeżej pożywki zawierającej 0,5 piCi ¹⁴C-tymidyny (wytworzonej z [2-¹⁴C]tymidyny, 52,0 mCi/mmol; Amersham, England) i 75 μl wirosomów DOTAP zawierających 0,2 nmol antysensownego, sensownego bądź msc FITC-OPT. Hodowle delikatnie wytrząsano przy bardzo wolnym mieszaniu przez 1 h w 37°C, a następnie przeniesiono do inkubatora. Po 48 h usunięto zawiesiny komórkowe, przeniesiono do fiolek do wirowania i odwirowano. Otrzymane grudki komórkowe dwukrotnie przemyto. Gdy nie można było wystarczająco zdyspergować komórek z wytworzeniem pojedynczej zawiesiny komórkowej, wystawiano je na krótko na działanie roztworu trypsyna/EDTA. Grudki komórek rozpuszczono w 1,5 ml 0,1 M roztworu NaOH/Triton-X-100(0,1%). Do 1 ml roztworu dodano 3 ml ciekłego „koktajlu scyntylacyjnego” (Ready Protein +, Beckman, Fullerton, CA, USA). Radioaktywność ¹⁴C zliczono stosując cieczowy licznik scyntylacyjny (Beckman, Fullerton, CA, USA).

Figury 4 i 5 wyraźnie pokazują nadzwyczajną skuteczność wychwytu i transfekcji antysensownych wirosomów L-myc DOTAP.

Figura 6 pokazuje, że antysensowne wirosomy L-myc nie wpływają lub nie inhibitują komórek, które nie ekspresjonują L-myc. Także puste wirosomy nie ujawniają jakiegokolwiek wpływu na komórki nowotworowe i normalne komórki. Okazuje się zatem, że terapia przeciwnowotworowa z antysensownym OPT zamkniętych w obecnych wirosomach może mieć znaczny potencjał, szczególnie w wyniku braku wspomnianych wyżej wad konwencjonalnych liposomów kationowych.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie kationowych pęcherzyków lipidowych z trimerami wirusowej hemaglutyniny z wirusa grypy o w pełnej aktywności fuzyjnej, stanowiących otoczkę wektora pcDNA3 z ludzkim genem IL-6 wklonowanym w miejsce polilinkera (= pcDNA3-IL-6)

Wytwarzanie wirosomów DOTAP i włączenie pcDNA 3-IL-6 pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, USA) jest wektorem o 5,4 kb zapewniającym wysoki poziom trwałej i przejściowej ekspresji u gospodarzy eukariotycznych. HA wyodrębniono i oczyszczono jak opisano w przykładzie 1.

mg DOTAP rozpuszczono w 0,5 ml buforowanego roztworu detergenta zawierającego 145 mM NaCl, 2,5 mM HEPES i 54 mg/ml OEG (=C12E8), pH 7,4, i dodano do 2 ml supernatantu zawierającego 4 mg HA. Do uzyskanej mieszaniny dodano 100 μg pcDNA3-IL-6 i rozpuszczono. Roztwór poddano działaniu ultradźwięków przez 30 s. OEG usunięto za pomocą Biobeads jak opisano w przykładzie 1.

Transfekcja wirosomów DOTAP obciążonych pcDNA-IL-6 do mysich komórkach szpiczaka

Otrzymany roztwór zawierający pcDNA-IL-6 załadowany do wirosomów DOTAP rozcieńczono 1:1000 przy użyciu PBS. 20 μl i 50 μl tego roztworu zawierającego 1 ng i 2,5 ng pcDNA-IL-6, odpowiednio, dodano do 2 x 10⁶ komórek szpiczaka (P3/NSI/1-Ag4-1; American Type Culture Collec14

PL 199 201 B1 tion, Rockville, USA). Po 48 h inkubacji supernatanty hodowli komórkowych zbadano na obecność ludzkiej IL-6 za pomocą próby ELISA. Zmierzona zawartość wynosiła 20 to 45 pg IL-6 na ml.

Porównanie skuteczności transfekcji pcDNA-IL-6 załadowanego do wirosomów DOTAP i pcDNA-IL-6 załadowanego do liposomów DOTAP

Nie stwierdzono IL-6 w hodowlach komórkowych szpiczaka transfekowanych konwencjonalnymi liposomami DOTAP (pozbawionymi wirusowych peptydów fuzyjnych) zawierających tę samą ilość pcDNA-IL-6 jak wirosomy DOTAP. Aby uzyskać te same wyniki transfekcji jak w przypadku pcDNA-IL-6 załadowanego do wirosomów DOTAP było niezbędne tysiąckrotne (1000) zwiększenie ilości pcDNA-IL-6 załadowanego do liposomów DOTAP !!

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie kationowych pęcherzyków lipidowych z trimerami wirusowej hemaglutyniny z wirusa grypy o w pełnej aktywności fuzyjnej, stanowiących otoczkę wektora pRSYcat.

Wytwarzanie wirosomów DOTAP i włączenie pRSVcat

Wektor ekspresji pRSVcat (z ATCC, Rockville, USA) zawiera gen CAT kodujący acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT).

Enzym katalizuje przenoszenie grupy acetylowej z acetylo-CoA w pozycję 3'-hydroksy chloramfenikolu. Wektory CAT są przydatne do ogólnego monitorowania skuteczności transfekcji.

pRSVcat otoczkowano wirosomami DOTAP w warunkach opisanych w przykładzie 2.

Transfekcja wirosomów DOTAP załadowanego pRSYcat do komórek Jurkata

Komórki Jurkata (10⁶ komórek/ml) inkubowano z różnymi ilościami wirosomów DOTAP załadowanych pRSVcat (0,0001 μl - 25 μθ. Po 48 h inkubacji w 37°C aktywność CAT w komórkach Jurkata zmierzono za pomocą próby CAT-ELISA (Boehringer Mannheim, Niemcy).

Figury 7a i 7b pokazują, że maksymalną transfekcję osiąga się przez dodanie 0,01 μl wirosomów DOTAP. W przeciwieństwie do tej obserwacji, dodanie do komórek Jurkata 0,01 μl liposomów DOTAP załadowanych wektorem pRSVcat, w tych samych warunkach inkubacji nie prowadziło do żadnej wykrywalnej aktywności CAT.

P r z y k ł a d 4

Wychwyt wirosomów przez komórki

Wnikanie wirosomów do komórek docelowych można podzielić na dwa oddzielne etapy:

1. Przyłączenie.

2. Przenikanie.

Przyłączenie wiąże się z wiązaniem wirosomów poprzez HA do receptorów komórki, które są glikoproteinami lub glikolipidami błony z końcowym kwasem sialowym. W przypadku szczególnych wirosomów fragmenty Fab' będą dodatkowo rozpoznawać antygenowe struktury na powierzchni komórki docelowej, co prowadzi do przyłączenia do komórek docelowych poprzez dwa różne mechanizmy wiązania. Zatem, specyficzne wirosomy zapewniają selektywność dla szczególnych typów komórek. Wirosomy z fragmentami Fab', które rozpoznają antygeny związane z nowotworem, takie jak TAG72, CEA, 17- 1 A, CA19-9 lub antygeny związane z białaczką, takie jak CD 10 (CALLA) i CD20, będą się wiązać selektywnie z komórkami nowotworowymi lub białaczkowymi noszącymi wspomniane antygeny na powierzchni swych komórek. Glikoproteiny hemaglutyninowe starannie wyodrębniono i oczyszczono. Nie stwierdzono inaktywacji ani przez wytrawianie proteolityczne ani przez redukcję ich wewnątrzcząsteczkowych wiązań disiarczkowych (-S-S-).

Przenikanie wiąże się z wejściem wirosomów do komórek przez endocytozę za pośrednictwem receptora. Wirosomy są uwięzione w endosomach. Kwasowe pH (5-6) w endosomach wyzwala fuzję błony wirosomowej z błoną endosomową. Fuzja odbywa się za pośrednictwem wirusowej glikoproteiny „kolczastej” hemaglutyniny (HA). Reakcja fuzji błony w endosomie uwalnia wirosorn z otoczki lipidowej i zapewnia dostęp otoczkowanych leków do cytosolu. Aktywność fuzyjną preparatów wirosomowych zbadano za pomocą fluorescencji odgaszanej. Wirosomy znakowano sondą fluorescencyjną oktadecylorodaminy B (R18) i aktywność fuzyjną HA monitorowano jako fluorescencję odgaszaną wskutek rozcieńczenia sondy z błony wirosomowej do docelowej błony liposomowej. Figura 8 przedstawia fluorescencję zaobserwowaną po dodaniu wirosomów DOTAP, znaczonych R18, do fosfolipidoliposomów. Fluorescencja zaczęła szybko wzrastać, co wskazuje na brak upośledzenia fuzji za pośrednictwem HA.

Wychwyt przez komórki zależny od czasu

Wychwyt wirosomów zmierzono przez inkubację komórek z wirosomami znaczonymi ¹⁴C. Komórki P3/NS1 w stężeniu 1 x 10⁵ /ml inkubowano z 40 μl wirosomów w 37°C przez 5, 10, 15, 20 i 30 min.

PL 199 201 B1

Po przemyciu, komórki poddano lizie i zmierzono ilość wirosomów znaczonych ¹⁴C. Jak widać z tabeli 3, wychwyt przez komórki jest bardzo szybki: Podczas pierwszych pięciu minut włączono 10% wirosomów. Dłuższe czasy inkubacji nie zwiększyły już wychwytu, 1 ml roztworu wirosomów zawierał około 10⁵ - 10¹² wirosomów, zatem wciągu 5 min następował wychwyt 4000 - 40000 wirosomów na komórkę.

T a b e l a 3

Czas inkubacji [min]	dpm
5	6414
10	6832
15	6096
20	6610
30	6626

P r z y k ł a d 5

Antysensowne strategie w leczeniu nowotworów

Tzw. „antysensowne” oligodeoksynukleotydy (ODN) to krótkie sekwencje nukleotydowe DNA zsyntetyzowane jako odwrócone komplementy żądanej sekwencji nukleotydowej docelowego mRNA. Przez tworzenie dupleksu RNA-DNA zapobiega się translacji informacji i sprzyja destrukcji cząsteczki przez RNazę H. Dostarczanie do komórek nowotworowych ODN nakierowanych na mRNA kodowany przez onkogen można wiązać z inhibitowaniem proliferacji komórek, a w pewnych okolicznościach, ze śmiercią komórek.

Antysensowne ODN mają znaczny potencjał jako środki terapeutyczne. Szereg przedklinicznych badań na zwierzętach oraz prób klinicznych faz I-III wykazało, że antysensowne ODN skierowane przeciw onkogenom i genom wirusowym są aktywne terapeutycznie.

Przenoszenie funkcjonalnych cząsteczek DNA do komórek przez załadowane DNA liposomy lub konwencjonalne wirosomy nie jest bardzo skuteczne. Dlatego opracowano wirosomy z dodatnio naładowaną lipidową dwuwarstwą (kationową) do przenoszenia materiału genetycznego. Dodatnio naładowana dwuwarstwa lipidową oddziaływa z kwasami nukleinowymi i powoduje ich koncentrację wewnątrz tworzonych pęcherzyków.

Antysensowne L-mvc-wirosomy

Gen L-myc, odkryty najpierw w linii komórkowej drobnokomórkowego raka płuc (SCLC), jest często amplifikowany i nadekspresjonowany w SCLC. 5'-FITC-tiofosforany oligodeoksyrybonukleotydów (OPT) zsyntetyzowano stosując reakcje chemii fosforoamidynów (Microsynth GmbH, Balgach, Szwajcaria). Pentadekamer (5'-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3') i pentadekamer (5'-FITC-GCGGACATGGACTAC-3') użyto, odpowiednio, jako antysensowny OPT i sensowny OPT. Zsyntetyzowano próbę kontrolną o mieszanej sekwencji (msc) OPT składającą się z nukleotydów tej samej długości co anty sensowny i sensowny OPT. Antysensowny OPT obejmujący translacyjne miejsce inicjacji działa przez inhibitowanie rybosomowej translacji docelowego mRNA. Antysensowne L-myc-tiofosforany oligodeoksyrybonukleotydów otoczkowano wirosomami. Oceniono efekt antyproliferacyjny L-myc antysensownego DNA otoczkowanego przez wirosomy w liniach komórkowych SCLC H209, H510 i H82. Antysensowne wirosomy L-myc dodano do komórek linii komórkowych ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc. Sensowne wirosomy L-myc i wirosomy msc (próby kontrolne o mieszanej sekwencji) użyto w celach kontrolnych (fig. 9)

Antysensowne wirosomy L-myc były 20000 razy bardziej aktywne niż nie otoczkowane antysensowne OPT. Aby wywołać te same efekty jak widać na fig. 10 trzeba było dodać do hodowli komórkowych nieotoczkowane L-myc antysensowne OPT w stężeniach w zakresie mikromoli. Zatem, wirosomy kationowe są znacznie bardziej skuteczne w dostarczaniu ODN niż komórkowy wychwyt nieotoczkowanych ODN i także bardziej skuteczne niż liposomy kationowe.

Efekt inhibitowania wzrostu antysensownych wirosomów L-myc korelował z poziomami ekspresji L-myc w trzech liniach komórkowych SCLC: H209, H510 i H82. Z figury 11 wywnioskowano, że na komórki, które nie ekspresjonują genu L-myc, nie wpływają antysensowne wirosomy L-myc. Puste wirosomy kationowe nie wykazywały żadnej lub wykazywały jedynie nieznaczny wpływ na normalne komórki i komórki nowotworowe. Ponieważ gen L-myc jest często amplifikowany i nadekspresjonowa16

PL 199 201 B1 ny w SCLC i bardzo ograniczony oraz ekspresjonowany na niskim poziomie w tkankach dorosłych człowieka, L-myc mógłby być dobrym celem dla antysensownej terapii wirosomowej.

P r z y k ł a d 6

Nieinfekcyjne przenoszenie opartych na plazmidach wektorów dla terapii genowej:

Transfekcja wektorów do ekspresji u ssaków przez wirosomy kationowe.

Współczesne podejście do terapii genowej nowotworów wykorzystuje oparte na plazmidzie wektory do ekspresji odpowiednich genów docelowych w ludzkich komórkach nowotworowych ex vivo lub in vivo. Oceniono następujące genowe cele terapeutyczne: geny podatności, takie jak geny kinazy tymidynowej wirusa herpes simplex (HSY-TK) (Moolten FL; Cancer Res. 46:5276-5281,1986); geny nakierowane na układ immunologiczny w celu eliminacji komórek nowotworowych, takie jak geny cytokinowe (Tepper RI i in.; Cell 57:503-512, 1989), geny kodujące cząsteczki współstymulujące (Townsend SE i in.; Science 259:368-370, 1993), obce geny histokompatybilności (Plautz GE i in.; Proc Natl Acad Sci USA 90: 4645-4649, 1993) oraz zastępniki genów supresora nowotworu dzikiego typu, takie jak p53 (Chen PL i in.; Science 250:1576-1580, 1990).

Wskutek pewnych ograniczeń dotykających obecnie stosowane wektory terapii genowej oparte na wirusach, takich jak przykładowo brak specyficzności w nakierowywaniu na komórki nowotworowe w celu przenoszenia genów oraz wskutek troski o bezpieczeństwo w zakresie możliwości indukowania wtórnych stanów złośliwych oraz możliwości rekombinacji umożliwiającej wytworzenie wirusa zdolnego do replikacji, należało opracować technikę nieinfekcyjnego przenoszenia genu celem dostarczania in vivo genów przy użyciu opartych na plazmidzie wektorów ekspresji. Zastosowanie ujawnionych tu wirosomów kationowych jest obiecującą alternatywą nieinfekcyjnej, odbywającej się za pośrednictwem receptora, techniki przenoszenia genów.

Typowe wydajności transfekcji przy stosowaniu dostępnych handlowo lipidów wynoszą między 5 a 50%. Obecne wirosomy nie tylko zapewniają wyższą skuteczność transfekcji niż dostępne handlowo liposomy, lecz także zamknięcie DNA w wirosomach prowadzi do trwałej transformacji komórek.

Ludzki gen interleukiny 6 (IL-6) klonowano w miejsce polilinkera pcDNA3, będącego wektorem o 5,4 kb zaprojektowanym dla zapewnienia wysokich poziomów trwałej i przejściowej ekspresji u gospodarzy eukariotycznych. Wektor zawiera marker odporności na neomycynę, ekspresjonowany z wczesnego promotora SV40 pozwalający na dokonywanie selekcji trwałych transformantów w obecności G418.

Otoczkowanie wskazanego wektora wykonano 3 różnymi metodami:

1. Dializa: Plazmidy otoczkowano podczas tworzenia wirosomów.

Detergent - oktylo-POE (z Alexis Corp., Laeufelfingen, Szwajcaria), usuwano przez dializę.

2. Biobeads („bioperełki”): Plazmidy otoczkowano podczas tworzenia wirosomów.

Detergent OEG usuwano za pomocą Biobeads.

3. Działanie ultradźwięków: Plazmidy otoczkowano za pomocą DOTAP i otrzymane liposomy DOTAP poddano fuzji z wirosomami DOTAP przez działanie ultradźwięków.

Wytworzono znaczony ¹⁴C-tymidyną pcDNA3-cIL-6-DNA w celu zmierzenia ilości otoczkowanego plazmidu.

Sposób otoczkowania	Ilość otoczkowanego plazmidu
Dializa (1)	0,02 pg DNA na 1 pl wirosomów
Biobeads (2)	0,009 pg DNA na 1 pl wirosomów
Działanie ultradźwięków (3)	0,04 pg DNA na 1 pl wirosomów

Komórki Sp2/0-Ag14 (hybrydowe, niewydzielające, mysz; numer dostępu: ATCC CRL-1581; tu oznaczane jako Sp2), komórki P3/NSI/l-Ag4-1 (niewydzielające szpiczaka, mysz; numer dostępu: ATCC TIB-18; tu oznaczane jako P3/NS1) i komórki NIH/3T3 (embrion, inhibitowany kontakt, mysz NIH Swiss; numer dostępu: ATCC CRL-1658) przy stężeniu komórek 1 x 10⁵ w 1 ml pożywki transfekowano preparatami wirosomowymi (1)-(3). Dziesięć dni po transfekcji ilości ekspresjonowanego IL-6 zmierzono za pomocą ELISA (fig. 12, fig. 13, fig. 14). Wszystkie linie komórkowe są dostępne w kolekcji ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA.

Transfekowane komórki Sp2 i P3/NS1 poddano dwukrotnej selekcji stosując G418. Po 2 miesiącach hodowli produkcję IL-6 zmierzono ponownie. Uzyskane wartości pomiarów podano w tabeli 4.

PL 199 201 B1

T a b e l a 4

Wytwarzanie IL-6 przez transfekowane komórki po powtórnej selekcji przy użyciu G418.

Linia komórkowa		Sposób wytwarzania	Liczba komórek na ml	Całkowita liczba komórek	IL-6 [pg/ml]	Całkowita ilość IL-6 [Pg]	IL-6 [pg/106 kom.]
P3/NS1	Grudki komórek	Dializa	1,2 x 10⁶	6,0 x 10⁶ 3ml bufora	277	831	138
Biobeads	1,6 x 10⁶	7,8 x 10⁶ 4 ml bufora	32	128	16
Działanie ultradźwiękami	1,54 x 10⁶	8,0 x 10⁶ 4 ml bufora	289	1156	144
P3/NS1	Superna- tant	Dializa		5 ml supernatantu	8	40	6,7
Biobeads		4,9 ml supernatant	4	20	2,5
Działanie ultradźwiękami		5,2 ml supernatant	25	130	16,2
Sp2	Grudki- komórek	Dializa	2,25 x 10⁶	1,13 x 10⁷5,5ml bufora	>1200	>6600	>584
Biobeads	1,6 x 10⁶	9,5 x 10⁶4,5ml bufora	232	1044	110
Działanie ultradźwiękami	1,54 x 10⁶	1,37 x 10⁷ 7ml bufora	680	4760	347
P3/NS1	Super- natant	Dializa		5 ml supernatantu	268	1340	119
Biobeads		4,9 ml supernatant	8	42	4,4
Działanie ultradźwiękami		5,2 ml supernatantu	651	3190	233

Objętość bufora do prowadzenia lizy dodanego do grudek komórkowych dobrano tak, by liczba komórek wynosiła około 2 x10⁶ na ml.

P r z y k ł a d 7

Antysensowne strategie w leczeniu białaczek

Najpowszechniejszą anomalią genetyczną w ludzkich białaczkach jest translokacja chromosomu Philadelphia (Ph¹). Translokacja protoonkogenu abl z chromosomu 9 do obszaru klastra punktu wstrzymania (bcr) na chromosomie 22 prowadzi do tworzenia genów hybrydowych bcr-abl. Protoonkogen abl normalnie koduje proteinę o aktywności kinazy tyrozynowej, która jest zwiększana w komórkach noszących geny hybrydowe bcr-abl. Transkrypty bcr-abl znajdują się u znacznej większości chorych z chronicznymi białaczkami mielogennymi (CML) i u chorych z ostrą białaczką limfocytową Ph¹. Nakierowywanie genów bcr-abl w CML jest wyraźnie najbardziej racjonalną procedurą terapeutyczną. Wykazano, że syntetyczny ODN komplementarny do połączenia transkryptów bcr-abl wytworzonych ze splicingu któregokolwiek z drugiego lub trzeciego egzonu genu bcr z drugim egzonem c-abl powoduje supresję proliferacji komórek białaczki Philadelphia 1 in vitro i pozwala na wzrost normalnych progenitorów szpiku (Szczylik C. i in.; Science 253:562-565, 1991). Jednak antysensowna terapia bcr-abl jest ograniczona do chorych na CML.

Innym celem molekularnym dla terapii antysensownej jest gen myb. Myb, kodowany produkt protoonkogenu c-myb, działa jako specyficzny czynnik transkrypcji wiążący DNA. Jest on korzystnie ekspresjonowany w komórkach hemato-poetycznych i jest wymagany dla ich proliferacji. 18-meryczny, antysensowny ODN ukierunkowany na kodony 2-7 c-myb silnie inhibitował lub całkowicie zniósł klonogenny wzrost linii białaczki komórek T (CCRF-CEM), jak również 78% badanych pierwotnych ostrych przypadków białaczki mielogennej i 4 z 5 badanych pierwotnych przewlekłych przypadków

PL 199 201 B1 białaczki mielogennej (CML) w przełomie blastycznym (Calabretta B i in.; Proc Natl Acd Sci USA 88:2351-2355, 1991).

Oczyszczanie szpiku kostnego jest stosowane jako element leczenia szeregu nowotworów, włączając w to ostre i przewlekłe białaczki. Obecnie, szpik jest oczyszczany z komórek białaczkowych za pomocą szeregu czynników, takich jak odczynniki immunologiczne i leki chemoterapeutyczne. Otoczkowany wirosomem ODN nakierowany na pewien onkogen, który nadaje zdolność namnażania komórkom białaczkowym będzie terapeutycznie przydatny i co najważniejsze bardziej selektywny niż konwencjonalne środki chemoterapeutyczne w eliminowaniu komórek białaczkowych przy równoczesnym oszczędzeniu normalnych komórek progenitorowych.

Antysensowne wirosomy c-myb

Wytworzono sensowne i anty sensowne OPT odpowiadające kodonom c-myb 2-9. Sensowne i antysensowne sekwencje c-myb były następujące: 5'GCCCGAAGACCCCGGCAC-3' i 5'-TGTGCCGGGGTCTTCGGGC-3', odpowiednio. Otoczkowanie OPT wirosomami DOTAP wykonano tym samym sposobem co użyty dla wirosomów L-myc DOTAP. Ludzką linię komórkową białaczki szpikowej KG-1 i ludzką linię komórkową ostrej białaczki limfoblastycznej CEM-C3 wystawiono na działanie sensownych i antysensownych wirosomów c-myb. Proliferacja komórek KG-1 jest zależna od produktu genu myb protoonkogenu, podczas gdy komórki CEM-C3 nie są zależne od produktu genu c-myb. Komórki KG-1 inkubowano stosując 25, 50, i 100 μl sensownych i antysensownych wirosomów c-myb zawierających 18, 36, i 72 pmol sensownego i antysensownego OPT, odpowiednio. Liczbę komórek oznaczono dnia 2, 3 i 4.

Dodanie 25 μl sensownych i antysensownych wirosomów c-myb miało jedynie marginalny wpływ na wzrost komórek (fig. 15), jednak dodanie 50 μl (fig. 16) i 100 μl (fig.17) silnie inhibitowało wzrost komórek. Wyższe dawki sensownych wirosomów c-myb także wykazały działanie inhibitujące. Zakłada się, ze te efekty nie były wywołane przez błonę wirosomową, ponieważ na komórki CEM-C3 nie wpływały te same preparaty wirosomowe (fig.18).

Skróty użyte w opisie

2'-OMe	2'-O-metyl
CALLA	antygen pospolitej ostrej białaczki limfocytowej
CAT	acetylotransferazachloramfenikolowa
DOTAP	metylosiarczan N-[(1,2,3-dioleoiloksy)-propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy
DOTMA	chlorek N-((1,2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy
FITC-OPT	tiofosforan oligodeoksyrybonukleotydu znaczony izotiocyjanianem fluoresceiny
G418	disiarczan Geneticin® (antybiotyk G418)
HA	hemaglutynina
IL-6	interleukina-6
MPB.PE	N-[4-(p-maleimido)fenylobutyrylo]-fosfatydyloetanolamina (=kompleks środek sieciującyfosfolipid)
msc	próba kontrolna o mieszanej sekwencji
NA	neuraminidaza
oktylo-POE	n-oktylooligooksyetylen
ODN	oligodeoksynukleotydy
OEG	eter monododecylowy oktaetylenoglikolu (C12E8)
OPT	tiofosforan(y)oligodeoksyrybonukleotydu(ów)
PC	fosfatydylocholina
PE	fosfatydyloetanoloamina
PNĄ	peptydowy kwas nukleinowy
SCLC	drobnokomórkowy rak płuc
5V40	wirus Simian 40

PL 199 201 B1

Claims

1. Pęcherzyk lipidowy mający dodatnio naładowaną dwuwarstwową błonę lipidową, zawierającą lipidy kationowe i/lub polikationowe, obejmującą ponadto co najmniej jeden naturalny lub syntetyczny wirusowy peptyd fuzyjny, wbudowany w błonę lub z nią kowalencyjnie związany, wybrany z grupy obejmującej: trimer hemaglutyniny lub monomer hemaglutyniny, jej jedną lub obie odszczepione podjednostki, glikopeptydy HA1 i HA2, wirusowy peptyd fuzyjny wyodrębniony ze źródeł naturalnych oraz syntetyczny wirusowy peptyd fuzyjny, obejmującą - w przeliczeniu na całość lipidów: 90 do 95% wag. lipidów kationowych i/lub polikationowych oraz 5 do 10% wag. fosfatydyloetanolaminy; bądź 45 do 90% wag. lipidów kationowych i/lub polikationowych, 5 do 10% wag. fosfatydyloetanolaminy oraz 5 do 50% wag. fosfarydylocholiny, znamienny tym, że błona dodatkowo zawiera co najmniej jeden komórkospecyficzny marker oraz co najmniej jeden bifunkcyjny środek sieciujący, przy czym ów komórkospecyficzny marker jest połączony z błoną poprzez wskazany środek sieciujący tak, że marker jest związany poprzez grupę tiolową z sieciującą częścią cząsteczki utworzonej przez kowalencyjne związanie środka sieciującego z fosfatydyloetanolaminą.

2. Pęcherzyk według zastrz. 1, znamienny tym, że wskazany komórkospecyficzny marker jest wybrany z grupy obejmującej: monoklonalne przeciwciało, fragment F(ab')2 przeciwciała oraz fragment Fab' przeciwciała, cytokinę oraz czynnik wzrostu.

3. Pęcherzyk według zastrz. 1, znamienny tym, że środek sieciujący jest hetero-bifunkcyjną pochodną sukcynimidylu, korzystnie wybraną z grupy obejmującej pochodne bis-N-sukcynimidylu i fotoaktywowalne heterobifunkcyjne środki sieciujące.

4. Pęcherzyk według zastrz. 1, znamienny tym, że:

(i) lipidy kationowe obejmują co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej chlorek N-[1,2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTMA); metylosiarczan N-[1,2,3-dioleoiloksy)-propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTAP); N-t-butylo-N'-tetradecylo-3-tetradecyloaminopropionamidynę; a (ii) lipidy polikationowe obejmują co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej 1,3-dipalmitoilo-2-fosfatydyloetanolamidosperminę (DPPES);

dioktadecyloamidoglicylosperminę (DOGS); trifluorooctan 2,3-dioleoiloksy-N-[2(sperminokarboksamido)etylo)-N,N-dimetylo-1-propanoaminiowy (DOSPA); 1,3-dioleoiloksy-2-(6-karboksyspermylo)propyloamid (DOSPER) i jodek N,N,N',N'-tetrametylo-N,N'-bis(2-hydroksyetylo)-2,3-dioleoiloksylo-1,4-butanodiamoniowy (THDOB).

5. Pęcherzyk według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto zawiera żądany materiał genetyczny uwięziony w tym pęcherzyku, korzystnie wybrany z grupy obejmującej krótkołańcuchowe DNA lub RNA, deoksyrybonukleotydy, oligodeoksyrybonukleotydy, seleniany oligodeoksyrybonukleotydów, tiofosforany oligodeoksyrybonu-kleotydów, fosforamidany oligodeoksyrybonukleotydów, metylofosfoniany oligodeoksyrybonukleotydów, peptydowe kwasy nukleinowe, rybonukleotydy, oligorybonukleotydy, tiofosforany oligorybonukleotydów, fosforany 2'-OMe-oligorybonukleotydów, tiofosforany 2'-OMe-oligorybonukleotydów, rybozymy, geny, plazmidy i wektory.

6. Pęcherzyk według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że ma średnicę w zakresie 120-180 nm.

7. Pęcherzyk według w zastrz. 1, znamienny tym, że jest otrzymywalny sposobem zdefiniowanym jak w zastrz. 9, do specyficznego lub niespecyficznego dostarczenia materiału genetycznego do docelowych komórek lub tkanek, zwłaszcza do nie-infekcyjnego przenoszenia materiału genetycznego do rezydentnych (pozostających w spoczynku) lub ulegających proliferacji komórek ssaczych.

8. Pęcherzyk według zastrz. 1 albo 7, do stosowania jako środek leczniczy do profilaktyki lub leczenia ludzi lub zwierząt, bądź do wykorzystania w diagnostyce.

9. Sposób wytwarzania pęcherzyka zdefiniowanego jak w zastrz. 1, znamienny tym, że w kolejnych etapach:

PL 199 201 B1

c) do roztworu otrzymanego w etapie b) dodaje się co najmniej jeden komórko-specyficzny marker oraz bifunkcyjny środek sieciujący w formie wcześniej wytworzonego kompleksu cząsteczkowego, którym jest oczyszczony sprzężony marker wyodrębniony z mieszaniny reakcyjnej przez oddzielenie nie-sprzężonych cząsteczek środek sieciujący-fosfatydyloetanolamina od sprzężonych markerów, a ów wskazany kompleks cząsteczkowy składa się z fosfatydyloetanolaminy, bifunkcyjnego środka sieciującego oraz komórkospecyficznego markera, przy czym marker jest związany poprzez grupę tiolową z sieciującą częścią cząsteczki utworzonej przez kowalencyjne związanie środka sieciującego z fosfatydyloetanolaminą,

d) usuwa się detergent przez działanie na uzyskany roztwór kulkami mikrono-śnika, korzystnie Biobeads SM-2, bądź ewentualnie przez dializę - gdy jako detergent stosowany jest n-oktylooligooksyetylen (oktylo-POE), z wytworzeniem zawiesiny zawierającej dodatnio naładowane dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się:

(i) lipidy kationowe obejmujące co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej chlorek N-[1,2,3-dioleoiloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTMA); metylosiarczan N-[1,2,3-dioleoiloksy)-propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTAP); N-t-butylo-N'-tetradecylo-3-tetradecyloaminopropionamidyn ę ; i/lub (ii) lipidy polikationowe obejmujące co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej 1,3-dipalmitoilo-2-fosfatydyloetanolo-amidosperminę (DPPES); dioktadecyloamidoglicylosperminę (DOGS); trifluorooctan 2,3-dioleiloksy-N-[2(sperminokarboksamido)etylo]-N,N-dimetylo-1-propanoamoniowy (DOSPA); 1,3-dioleoiloksy-2-(6-karboksyspermylo)-propyloamid (DOSPER) i jodek N,N,N',N'-tetrametylo-N,N-bis(2-hydroksyetylo)-2,3-dioleoiloksy-1,4-butanodiamoniowy (THDOB).

11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako wskazany bufor stosuje się bufor HEPES, który dodatkowo zawiera detergent niejonowy w stężeniu 10 do 250 μ mol na ml, a ów niejonowy detergent jest korzystnie wybrany z grupy, którą stanowi monododecylowy eter glikolu oktaetylenowego oraz n-oktylooligooksyetylen.

12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że w przeliczeniu na całość lipidów dodaje się:

- 90 do 95% wag. lipidów kationowych i/lub polikationowych oraz 5 do 10% wag. fosfatydyloetanolaminy; bądź

- 45 do 90% wag. lipidów kationowych i/lub polikationowych, 5 do 10% wag. fosfatydyloetanolaminy oraz 5 do 50 % wag. fosfatydylocholiny,

13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że żądany materiał genetyczny dodaje się do roztworu z etapu b).

14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że żądany materiał genetyczny dodaje się do zawiesiny pęcherzyków z etapu d), a następnie uzyskaną mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków w celu wprowadzenia żądanego materiału genetycznego do wnętrza tych pęcherzyków, po czym niewprowadzony materiał oddziela się od pęcherzyków, korzystnie na drodze filtracji żelowej.

15. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako wskazany komórkospecyficzny marker stosuje się marker wybrany z grupy obejmującej monoklonalne przeciwciało, fragment F(ab')2 przeciwciała, fragment Fab1 przeciwciała, cytokinę i czynnik wzrostu.

16. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako środek sieciujący stosuje się heterobifunkcyjną pochodną sukcynimidylu, korzystnie wybraną z grupy, którą tworzą pochodne bis-N-sukcynimidylu i fotoaktywowalne heterobifunkcyjne środki sieciujące.

17. Sposób według. 9, znamienny tym, że stosuje się związaną kowalencyjnie cząsteczkę środek sieciujący-fosfatydyloetanolamina wybraną z grupy, którą stanowią N-[4-(p-maleimidofenylo)butyryl]-fosfatydyloetanolamina (MPB.PE) oraz 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanfosfatydyloetanolamina (MCC.PE).

18. Sposób według zastrz. 9 albo 17, znamienny tym, że niesprzężone cząsteczki środek sieciujący-fosfatydyloetanolamina, zwłaszcza niesprzężone cząsteczki MPB.PE MCC.PE, usuwa się z mieszaniny reakcyjnej metodą chromatografii żelowej, korzystnie za pomocą chromatografii powinowactwa z matrycą agarozową, najkorzystniej stosując zredukowaną Thiopropylosepharose 6B.

19. Sposób według zastrz. 9 albo 13, albo 14, znamienny tym, że stosuje się żądany materiał genetyczny wybrany z grupy obejmującej krótkołańcuchowe DNA lub RNA, deoksyrybonukleotydy, oligodeoksyrybonukleotydy, seleniany oligodeoksyrybonukleotydów, tiofosforany oligodeoksyrybonukleotydów, fosforamidany oligodeoksyrybonukleotydów, metylofosfoniany oligodeoksyrybonukleotyPL 199 201 B1 dów, peptydowe kwasy nukleinowe, rybonukleotydy, oligorybonukleotydy, tiofosforany oligorybonukleotydów, fosforany 2'-OMe-oligorybonukleorydów, tiofosforany 2'-OMe-oligorybonukleotydów, rybozymy, geny, plazmidy i wektory.

20. Zastosowanie pęcherzyka lipidowego zdefiniowanego jak w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka, białaczek i infekcji wirusowych.

21. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym pęcherzyk zawiera co najmniej jeden anty sensowny oligonukleotyd odpowiedni dla terapii antysensownej, a antysensowny oligonukleotyd jest korzystnie nakierowany na protoonkogen lub na mR-NA kodowany przez onkogen.