CZ361498A3

CZ361498A3 - Kladně nabité lipidové váčky (virozomy) pro přenos genetického materiálu a způsob jejich přípravy

Info

Publication number: CZ361498A3
Application number: CZ983614A
Authority: CZ
Inventors: Ernst Rudolf Wälti; Reinhard Glück; Peter Klein
Original assignee: Nika Health Products Limited
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-04
Publication date: 1999-03-17
Also published as: AU2776697A; KR20000010780A; EA199800992A1; NO985137D0; NO327726B1; PE65198A1; BG102880A; PL199201B1; EP0902682A2; KR100536983B1; JP2000509404A; GT199700058A; HUP9901790A2; HUP9901790A3; BR9709224A; OA10916A; NZ332666A; TNSN97080A1; AU710170B2; ZA973885B

Description

Oblast vynálezu

Předkládaný vynález je z oblastí genové biotechnologie a genové terapie a týká se nových virozomú, tj . pozitivně nabitých lipozomových váčku (vezikul) obsahujících v membráně virové glykoproteíny, vhodných pro účinný přenos genetického materiálu na cílová místa, způsobu jejich výroby a použitelných aplikací. Předkládané kationtové virozomy jsou zejména vhodné pro specifický i nespecifický neinfekční přenos genů do cílových buněk in vitro a in vivo.

Dosavadní stav techniky

Lipozomy jsou široce užívány jako nosiče pro podávání léků a jako ochranné schránky pro farmaceutické látky s krátkou životností nebo jako ochrana proti (bio)chemickému útoku tělesných tekutin. Lipozomy obsahující rekonstituované membránové proteiny z virových obalů nebo jejich části jsou obvykle nazývány „virozomy” (Sizer et al. , Bíochemistry, 26, 5106-5113, 1987). Byly použity pro nespecifické podání různých léků a molekul DNA (Vainstein et al., Methods Enzymol., 101, 492-512, 1983). Ukázalo se, že hlavní nedostatek těchto virozomú je, že jejich fúze s buněčnou membránou cílových buněk má za následek nekontrolované uvolňování přenášeného materiálu do cytoplazmy cílových buněk, kde byl nechráněný materiál snadno napadán degradativními intracelulárními procesy.

Přihláška WO 92/13525, na jejíž plné znění se zde odkazujeme, uvádí, že virozomy tvořené fosfolipidovými b * 4 4 «4 4 4 dvojvrstevnými membránami, které jsou zacílené tím, že obsahuj í povrchové („spike proteiny) membránové víru chřipky „hřebíkovité a buněčně keizv markéry, jako jsou např. monoklonální protilátky, velmi účinně fúzují s modelovými membránami a živočišnými buňkami díky mechanismu podobnému penetračnímu mechanisme viru, a sice endocytózou zprostředkovanou receptorem. Ačkoli jsou tyto virozomy úspěšně aplikovány pro přenos chemických látek a požadovaných léčiv na cílová místa, trpí určicými nevýhodami vzhledem nosu : stabilní inkorporaci a nabitých molekul, jako jsou například negativně nabit nuklecvé kyseliny.

V průběhu posledních několika let přenos buněčně specifický přenos, genetického zeo měna materiálu inkorporovaného do lipozomů získal více a více pozornost:

a důležitosti, zejména apliKaci tyče pokud v protirakovínné a genové terapii. V současné době je dostupných několik metod pro přenos DNA. nebo RNA. do buněk: metody zprostředkované viry, metody zprostředkované lipidy, a další metody, jako jsou mikroinjekce a elektroporace. Výhody a nevýhody současných technik přenosu genů mohou být shrnuty následovně:

a) Přenos genů zprostředkovaný viry: geny mohou být zavedeny trvale a účinně do savčích buněk prostřednictvím retrovirových vektorů. Avšak účinnost přenosu genů do nereplikujících se buněk je velmi nízká, protože retroviry infikují pouze dělící se buňky. Dále použiti retrovirových vektorů souvisí s obecnými požadavky bezpečnosti, které se týkají například možné aktivace onkogenů. Pro většinu vědců se replikačně defektní adenoviry staly vektory vhodnými pro přenos genů. Přenos genů zprostředkovaný adenovirovým vektorem zahrnuje buď inzercí požadovaného genu do se

φ Φ·Φ • i ·* adencvircvých částic upravených delecí nebo tvorbu komplexu mezi DMA, která má být vložena, a virovým obalem adenoviru oomccí transferin-pólylyžinového můstku. Nedostatkem tohoto systému velmi účinného in vivo je nedefinovatelné riziko infekce nebo zánětu: navzdory deleci genu El, která poskytuje virus s vadnou replikací, zbývající virový genom obsahuje četné otevřené Čtecí rámce kódující virové proteiny (Yang et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91, 4407-4411, 1394; . Exprese virových proteinů transdukovanými buňkami vyvolává jak humorální, tak buněčnou imunitní odpověď ve zvířecím a lidském těle, a tedy múze podnítit zánět a proliferaci.

V metodě zprostředkované HVJ (virus Sendai, japonský hemaglutinační virus) je cizí DNA spojena v komplexu s lipczcmy. Lipozomy jsou poté naplněny inaktivovaným virem Sendai (HVJ) . Tato metoda již byla použita pro přenos genů m vivo dc různých tkání. Kromě toho bylo publikován buněčný příjem „antisense (tj. s orientací proti směru transkripce) oligcnukleotidů HVJ-lipozomy (Morishita et al. , J. Cell. Ěiochem., 17Ξ, 239, 1993), Avšak je určitou nevýhodou, že HVJ-lipozomy mají tendenci se nespecificky vázat na červené krvinky.

b) Přenos genů zprostředkovaný lipidy: pro in vitro přenos DNA a „antisense olígonukleotidů se zdají být bezpečné, snadno použitelné a účinné pozitivně nabité lipozomy tvořené kationtovými lipidy. Vysoce negativně nabité nukleové kyseliny spontánně reagují s kationtovými lipozomy. Kompletní tvorby komplexů DNA-lipozom je dosaženo již prostým smísením polynukleotidů s předem vytvořenými kationtovými lipozomy. Avšak kvůli nepřítomností fúzních peptidú a buněčně specifických markérů na lipozomové membráně je účinnost transfekce in vivo velmi nízká « 4 · « » * v · * ·· * · « t · · « ·· ** a inkubační doba je dlouhá, proto musí být podávány vysoké dávky, aby se dosáhle požadovaného efektu. Následkem toho mohou nastat nežádoucí vedlejší účinky, protože je dokázáno, že velká množství kationtových lipidů mohou mít in vivo toxický účinek.

Malé oligonukleotidy jsou v současnosti testovány jako léčebné přípravky pro léčení rakoviny a jako protivirové přípravky. Aby se syntetizovala „messenger RNA (mRNA), přepisuje se pouze jedno ze dvou DNA vláken. Vlákno DNA přepsané na RNA se nazývá kódující vlákno neboli „sense vlákno. Komplementární, nekódující neboli „antisense vlákno má tutéž sekvenci jako mRNA. Když se přepíše nekódující vlákno, vytvoří se „antisense RNA molekuly, které jsou schopné vázat se k cílové („sense) mRNA. Jak je jednou „antisense RNA navázána k „sense RNA, výsledné duplexové molekuly RNA nemohou být translatovány a blokuje se tvorba orotsinu ví

Obvyk se ucinne vázou ne mRNA inhibuj í translaci mRNA krátké syntetické „antisense oligonukleotidy o 13 až 22 bazích. Tímto mechanismem mohou „antisense oligonukleocidy zastavit proliferaci lidských rakovinných buněk. Geny, které jsou zapojeny v rakovině, uplatňují svůj účinek nadměrnou expresí svých normálních strukturních proteinů. Geny, jako jsou c-fos, c-myc, L-myc, N-myc, c-myb, abl, bcr-abl, c-raf, c-erb-2, K-ras, mohou být potenciálním cílem pro „antisense rakovinnou terapii.

oligonukleotidy jsou také přitažlivou alternativou ke konvenčním léčivům jako jsou protivirové přípravky, např. „antisense oligonukleotidy genů tat a gag viru lidské imunodeficience (HIV).

Lípozomové membrány obsahující rekonstituované virové obaly, jak je popsáno v literatuře (Stegmann et al., EMBO

J. , 6, 2551-2659, 1387), se nazývají virozomy. Obvykle se „Antisense potenciální • · * skládají z fosfolipídové dvojvrstvy obsahující fosfatidylcholin (PC) a fosfatidyietanolamin (ΡΞ) spolu s virovým zakotvenými obalem, např. v membráně ;ovrchcvými „spike proteiny Obvyklé metcdv začleňování

Genetického materiálu do PC,ΡΞ-virozomu tmí poněkud nízké účinnosti ir.kcrporace nuklecvých kyselin.

Podstata vvnález;

Předkládaný vynález se proto týká nového kationtového virozomu, který může být díky specifickému membrány velmi účinně naplněn jakýmkoliv genetickým materiálem obsahujícím dlouhé a krátké řetězce DNA nebo RNA, oligodeoxynukleotidy, ribonuklectidy, peptidové nukleové kyseliny (PNA), ribozymy (molekuly RNA s enzymovými aktivitami), geny, plazmidy a vektory, a tedy přesvědčivě překonává nedostatky dosavadního stavu techniky. Vynález se dále týká způsobu pro účinnou rekonstituci hemaglutininu viru chřipky A, zejména kmene A/Singapur, do v podstatě monolamelárních katicntových lipidových váčků (vezikul), což má za následek tvorbu kationtových virozomu se středním průměrem přibližně 120-130 ran, a souvislé lipidové dvoj vrstvy, která je v podstatě zbavena nevýhody prosakování (netěsnosti) pozorované u mnoha konvenčních virozcmových přípravků. Struktura - výhodně monolamelární kat iontové dvouvrstevné membrány je taková, že hydrofilní, pozitivně nabité Části („hlavičky) molekul lipidů jsou orientovány směrem k vodné fázi (fázím) a hydrofobní úseky („ocásky) mastných kyselin jsou orientovány směrem ke středu dvojvrstvy. Elektronovou mikroskopií je možné ukázat, že rekonstituované virové membránové „spike proteiny (jako je např. hemaglutinin) jsou integrovány do lipidové složeni sve požadovaným:

« a 4 «

«fc dvoj vrstvy a vyčnívají z povrchu kationtových váčků (obr. 1).

Lipidové složení membrány váčků je takové, že obsahuje kationtové a/nebo polykat iontové lipidy a volitelně fosfolipídy, jako je řosřacidyiecanolamin a fosfatidylcholin. Pro většinu případů se ukázalo výhodné vybrat lipidové složení membrány obsahující (vyjádřeno jako podíl z celkových lipidů) buč'

I) 100 % (hmotnostních) kationtových a/nebo polykat iontových lipidů, nebo

II) 90 až 95 % (hmotnostních) kationtových a/nebo polykationtových lipidů a 5 až 10 % (hmotnostních) fosfatidyletanolaminu, nebo

III) 45 až 90 % (hmotnostních) kationtových a/nebo

polykationtových lipidů,	5 až 10	%	! hmo t no smích)
fosfatidyletanolaminu a	5 až 50	%	(hmotnostních)
fosfatidylcholinu. Ve výhodném provedení	se předkládaný	vynález také týká

ireverzibilní kovalentní vazby buněčně specifických markérů ke kationtovým virozomům, jako jsou např. (ale bez omezení) monoklonální protilátky, protílátkové fragmenty jako· fragmenty F(ab')₂ a Fab', cytokiny a/nebo růstové faktory, použitelné pro selektivní detekci a vazbu cílových buněk. Jsou spojeny s membránou váčků tak, že vyčnívají na vnější povrch a projevují v podstatě plnou funkční aktivitu co se týče vyhledání (detekce) receptoru a vazby.

Navázání buněčně specifických markérů, jako jsou protílátkové fragmenty, k předem vytvořeným váčkům, jak popsal např. Martin et al. (J. Biol. Chem., 257, 23S-233, 1982), vede k nízkým výtěžkům a často nereprodukovatelným výsledkům vazby, což jsou komplikace, které významně omezují strategie cílení do buněk. Proto podle výhodného provedení « · · * <

« · ‘ ·* ·· předkládaného vynálezu jsou markéry vázány na předem vytvořené molekulové komplexy „fosfatidyletanolamin vazebná molekula, jako je například N-[4 -(p-maleimidfenylbutyryl]fosfatidyletanolamin (MPB.PE) v přítomnosti detergentu.

Za účelem dosažení nej lepších možných výsledků se ukázalo výhodné před rekonstitucí pečlivě izolovat a purifikovat virové glykoproteiny, aby se zabránilo inaktivaci bud' proteolytickým štěpením nebo redukcí intramolekulárních vazeb S-S. konjugované markéry, např. nekonjugovaných molekul

Proto je výhodné, když jsou marker-MPB.PE, separovány od (např. MPB.PE) afinitní chromatografií s aktivovanou agarózovou matricí, výhodně redukovanou sefarózou „Thiopropyl Sepharose

6B'

Alikvoty purífikovaných konjugovaných markérů (komplexů fosfatidyletanolamin - vazebná molekula - markér) jsou poté přidány k roztoku detergentu obsahujícím směs rozpuštěných membránových lipidů, fúzních peptidů a dalších požadovaných složek před tím, než se vytvářejí kationtové virozomy.

Ukázalo se výhodné provádět navázání dvoj funkční vazebné (zesíčující) molekuly s fosfolípidem a buněčně specifickým markérem v oddělených procesech před přípravou virozomů. Tento postup umožňuje lepší kontrolu a optimalizuje povrchovou hustotu virozomovýcn membrán, zejména co se týče počtu buněčně specifických markérů k ní připoj envcn.

Zlepšená kontrola koncentrace proteinových molekul zakotvených v membráně nebo s ní spojených je poměr hemaglutinin) a buněčně specifických protilátkové fragmenty Fab') na membráně virozomu může snížit nebo dokonce zničit jejich selektivní vlastnosti a v krajním případě může mít za následek srážení a precípitaci váčků.

důležitá, nevyrovnaný fúzních peptidů markérů (napr. (např.

*ϊ • · * 4 * • * 4 4 · * · • · 4 4 • ··» <« ··

Použití proti látkových fragmentů F{ab')₂ a Fab' místo celých protilátkových molekul jako buněčně specifických markérů je obzvláště výhodné, protože jsou daleko méně imuncgenní než celá protilátka. Také nepřítomnost domén Fc eliminuje celou řadu nežádoucích biologických a imunologických aktivit zprostředkovaných Fc, jako je například aktivace komplementu prostřednictvím klasické dráhy a akutní humorální odpovědi, které mají nakonec za následek - kromě jiného - odklizení připojených virozomů z povrchu cílové buňky prostřednictvím interakce mezi protilátkou a jejím receptorem Fc na cílové buňce.

Na rozdíl od známých lipozomových přípravků pro přenos nukleových kyselin, předkládané kationtové virozomy obvykle nepotřebují fúzovat s buněčnou membránou, nebo ji destabilizovat, aby vstoupily do cytoplazmy. Jsou schopné vstupu do hostitelské buňky prostřednictvím dvoukrokového mechanismu: 1) připojení a 2) penetrace. V prvním kroku se váží prostřednictvím fúzních peptidů (např. hemaglutimn? a/nebo buněčně specifických markérů na buněčné receptory, zejména na membránové glykoproteíny nebo glykolipidy, koncovou kyselinou sialovou, a jsou poté velmi účinně inkorpcrcvány endccytózou receptorem zprostředkovanou. V případě virozomů nesoucích buněčně specifické markéry, např. protilátkové fragmenty, tyto markéry navíc rozpoznávají antigenni struktury na povrchu cílových buněk, z čehož plyne připojení dvěma různými vazebnými mechanismy. Předkládané buněčně specifické virozomy tedy projevují selektivitu pro různé buněčné typy díky svým buněčně specifickým markérům na membráně a současně schopnost buněčné penetrace endocytózou díky fuznímu peptidu, např. hemaglutininu. Virozomy s fragmenty Fab', které rozpoznávají antigeny spojené s nádory, jako jsou vysokou virovému

9 · 9 · « * * · • · * 9 9 · · · • 9 9 9 9

99« · 9 9*

TEG72, CEA, 17-1A, CA19-9 nebo antigeny spojené s leukémií, jako je CD10 (CALLA = Common Acute Lympnccytic Leukaemia Antigen) a CD2 0, se budou vázat selektivně na nádorové nebo leukemické buňky nesoucí zmíněné antigeny na svých buněčných r n¹; r c bi .

Ve druhém kroku, když vstupují do hostitelské buňky prostřednictvím endocytozy zprostředkované receptorem, jsou virozomy zachyceny v endozomech. Následně se pH v endozomech snižuje na hodnotu přibližně pH 5-5, při které se aktivuje hemaglutinínový fúzní peptíd a spouští fúzí membrány virozomu s membránou endozomu. Fúzní reakce membrány otevírá lipidcvý obal virozomu a uvolňuje zachycený genetický materiál do cytosolu. Tento mechanismus podstatně zvyšuje šance přenášeného genetického materiálu dosáhnout jádra předtím, než je odstraněn digestivní degradací a/nebo exocytózou.

peptíd zakotvený kovalentně navázaný do membrány nebo Váček výhodně také

Primárním cílem předkládaného vynálezu je pozitivně nabité lipidové váčky obsahující kationtové nebo pclykationtové lipidy a vnitřní prostor * obvykle s vodným prostředím, a dále obsahující alespoň jeden virový fúzní nebo integrovaný na membránu váčku.

obsahuje na membráně alespoň jeden buněčně specifický markér. Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout váčky mající plnou biologicky fúzní aktivitu, tj. mající v podstatě tutéž fúzní aktivitu jako má intaktní virus chřipky. Fúzní peptíd je virový glykoprotein, jako je hemaglutinin nebo jeho derivát, nebo syntetický fúzní peptid schopný vyvolat rychlou fúzi uvedených váčků s endozomálnímí membránami cílových buněk po endocytóze.

Nové váčky nebo virozomy jsou obzvláště užitečné pro přenos jakéhokoliv požadovaného genetického materiálu na • » • v * · · · cílová místa, zejména do živočišných a lidských buněk a tkání in vitro a in vivo. Je nutné zdůraznit, že nové virozomy jsou nejen schopné proniknout do proliferujících, tj . replikujících se buněk, ale také do neproliferujících, tj. klidových buněk, kterážto vlastnost je činí široce upotřebitelnými v biologických vědách, farmakologii a medicíně, jak pro výzkum a/nebo pro diagnostiku a jako léčivo. Pro použití jako léčivo mohou být virozomy podle předkládaného vynálezu částí farmaceutického přípravku, který dále obsahuje obvyklá aditiva a farmaceuticky vhodné nosiče. Výhodně je farmaceutický přípravek ve formě rozteku pro injekce, ale pro některé aplikace pro topícké nebe systémové podávání mohou být výhodné jiné formy přípravy, např. emulze, krémy, gely, masti.

Proto je také cílem předkládaného vynálezu použít virozomy podle předkládaného vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku vhodného pro profylaktické a/nebo léčebné ošetřování zvířecích nebo lidských mohou mít z takového ošetření prospěch, předkládaného vynálezu je použití virozemů podle vynálezu pro výrobu diagnostické soupravy (kitu) pro aplikace in vitro a in vivo.

V jednom provedení předkládaného vynálezu jsou váčky získány postupem zahrnujícím účinnou rekonstituci hemaglutininu (HA) viru chřipky A (influenzy A) . Podle toho je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout způsob přípravy kationtových vírozomú. Ve výhodném provedení vynálezu způsob dále zahrnuje kroky inkorporace genetického materiálu do kationtových lipidových váčků. Způsob přípravy v základě zahrnuje následující kroky:

1) Rozpuštění kationtových lipidů v neionogenním detergentu, výhodně oktaetylenglykolmono-n-dodecyléteru (OEG, Ο_:2Ε_Β) , jedinců, kP

Dalším

I • » · » · * • · · Ί · • · * · ·» ·

- 11 spolu s virovými membránovými „spike glykoproteiny (nejlépe purifikovanými), genetickým materiálem požadovaným pro přenos a volitelně s předem vytvořenými moelkulovými komplexy tvořenými fosfatidyletanolaminem, vazebnou molekulou a buněčně specifickým markérem, a

2} Tvorbu váčku prostřednictvím (nejlépe opakovaného) odstranění detergentu mikronosičovými kuličkami absorbujícími detergent, výhodně polystyrénovými kuličkami typu SM-2 Biobeads s výhodnou zrnitostí(za vlhka) 20-50 (0,84-0,30 mm).

Ve výhodném provedení vynálezu je použita vhodná dvoj funkční vazebná molekula pro navázání buněčně specifického markéru ireverzibilně k membráně váčku. Buněčně specifický markér, který je namířen na buněčný receptor odpovědný za selektivní vazbu virozomu k buňce, je navázán na vazebnou molekulu tak, že je stále plně biologicky aktivní. Výhodné je, když vazebná molekula, která má být použita, je ve formě předem vytvořeného molekulového komplexu, kde vazebná molekula je kovalentně navázána buď k fosfatidyletanolaminu nebo k oběma molekulám, tj. fosfatidyletanolamínu i buněčně specifickému markéru.

Díky funkčně aktivním fúzním peptidům virozomú podle předkládaného vynálezu je opouzdřený materiál uvolněn do cytosolu cílové buňky převážně při snížení endozomálního pH (jak naznačeno výše). Takové kontrolované uvolnění na jedné straně prodlužuje dobu pobytu přenášeného materiálu v cílové buňce a na druhé straně zabraňuje nežádoucímu dlouhému pobytu virozomú uvnitř endozomu, a tím snižuje nebezpečí nespecifické degradace cenných látek přenášených virozomy.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká váčků, kde membránové lipidy navíc zahrnují fosfatidylcholin a fosfatidyletanolamin, které dále zlepšují možnosti « · 1 · * * * » · * · · · * * · · * * »··· · * · * • » « ·· ·** · · *·

- 12 specifického návrhu virozomu a/nebo usnadňují zakotvení fúzních pepcidů a/nebo buněčně specifických markéru v membráně.

Termín „fúzní peptid případně fuzogenní peptid cznačuie takové peptidy nebo proteiny, které jsou schopné navodit a/nebo podpořit fúzní reakci mezi membránou virozomu a iípidovou membránou cílové buňky. Ve většině provedení se týká virových povrchových membránových „spike glykoproteinů obsahujících fúzní peptid, zejména kompletního povrchového hemaglut imnovéno trimeru z virového obalu, jeho monomeru, nebo jedné či obou naštěpených podjednotek, glykopeptidú KA1 a ΗΆ2, obsahujících funkční fúzní peptid. V dalším provedení předkládaného vynálezu se tentýž termín týká samotného Čistého fúzního peptidu, bud' izolovaného z přírodních zdrojů nebo tvořeného synteticky. V obzvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu se tyto polvpeptidy obsahující fúzní peptid vztahují k hemaglutinínům chřipky, zejména hemaglutinmu subtypu A-Hýb. Syntetické fúzní peptidy jsou výhodně vybrány ze sekvencí aminokyselin uvedených v seznamu v tabulce 1 níže, kde jsou aminokyseliny označeny svými odpovídajícími jednopísmennými kódy (viz také příklad 6 a obr. 2 z WO 92/13525) .

Termín „vazebná molekula” případně vazebné (zesífující) agens označuje organickou heterobiřunkční molekulu, která je schopná navázání na povrch váčků připravených podle tohoto vynálezu současně schopnou navázání polypeptidů.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu tato molekula pro obsahuje N-hydroxysukcinímidovou skupinu k aminokyselinové skupině a maleímidovou skupinu pro konjugaci fragmentů monoklonalni protilátky, jako jsou sukcinimidyl-4 -(N-maleimidmetyl)cyklohexan-1-karboxylát, m-maleimido-benzoyl-N-hydrovazbu fosfatidyletánolaminu • ·*· »« » · • « • · a benzoát (HASAB), fenylamino)hexancát xysukcinimid ester, m-maleimidocenzoyl·-N-hydrcxysulfosukcinimid ester, sukcínimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrát, sulfosukcinimidyl-4 -(p-maleimidofenyi' butyrát, nebe obsahuje

N-hydroxysukcínimidovcu skupinu a fotoreaktivní azidovou skupinu pro vazbu na cytokxnv, jako je N-hydroxysukcinimidylsuberát (NHS-SA), N-hydroxysukcinimidyl-4-azidoN-sukeinimi-dyl - 6- (4'-azido-2'-nitro(SANFAH), N-suifo-sukcinimidyl-6-(4'a z ido-2'-nitro feny lamino) hexanoát.

Tabulka 1

C C C G L F G

A I A G F I E N G W E G Μ I D G Μ Y G

GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGCCC

c c c	G L F G	AIAGFIENGWEGMIDG

	G L F G	aiagfiengwegmidg	c c c
c c c	G L F E	AIAGFIENGWEGMIDG

	G L F E	AIAGFIENGWEGMIDG	c c c
c c c	E L F G	AIAGFIENGWEGMIDG
	E L F G	AIAGFIENGWEGMIDG	c c c

cc	C L E G	AIAGFIENGWEGMIDG

L F G

C G C

AIAGFIENGWEGMIDG

v · »»« « 1 « Φ 4 • * « · »»«

Výhodné je, když vazebná molekula, která má být použita, je ve formě předem vytvořeného molekulového komplexu vazebné molekuly a lipidu, zejména vazebné molekuly a fosfatidyletanolaminu, nebo lipidu a vazebné molekuly a bunecne specifického markem.

Termín „buněčně specifický protein nebo markér se vztahuje k proteinu schopnému vazby k vazebné molekule nebo komplexu vazebné molekuly s lipidem, a dále schopnému vazby buněk. Ve výhodném provedení molekula sloučenina jako je monoklonáiní cytokin nebo růstový seiext ivm k receptoru cílových předkládaného vynálezu je tato specifická pro buněčný receptor, protilátka, protilátkový fragment, faktor. Buněčně specifický markér poskytuje detekci a vazbu cílových buněk, a tedy zlepšuje akci fúzníbc peptidu, který je současně přítomný na membráně virozcmu. Výhodné protilátkové fragmenty zahrnují F(ab'}₂ a Fať, zatímco buněčně specifické markéry dále zahrnuli interleukiny a jiné cytokiny, zejména ty, které jsou uvedeny v seznamu v následující tabulce 2.

Tabulka 2

Cytokiny (mezinárodní zkratky)
BDNF	IFNa	MiP-ία	PDGF
CNTF	IFNP	ΜΙΡ-ΐβ	PF-4
EGF	IFNy	MIP-2	RANTES
Epo	IL-1 až IL-15	NGF	SCF
FGF	LIF	NT-3	TGFa
G-CSF	LT (TNFP)	NT-4	TGFp
GM-CSF	MCP-1 až MCP-3	OSM	TNFa
I-309/TCA-3	M-CSF	PBP	Tpo
γΙΡ-10	MIF	PBSF	VEGF

« ·♦· v ·

- 15 Termín „katíontový lipid používaný zde se týká organické molekuly, která obsahuje kationtovou složku a nepolární část („ocásek) a takzvanou amfifilní část („headtc-tail), jako je např. N-[(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]N,N,N-trimetylamoniumchlorid (DOTMA) (Felaner et al . , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7414, 1987), N-[(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniummetylsulfát (DOTAP), nebo N-t-butyl -N'tetradecyl - 3 - tetradecylaminopropionamidin (Ruysschaert et al,, Biochem. Bíophvs. Res. Commun., 203, 1522-1628, 1994) . Pokud není výslovně uvedeno jinak, termín také zahrnuje dále definované polykationtové lipidy.

Termín „polykationtový lipid se týká organické molekuly, která obsahuje polykationtovou složku a nepolární úsek („ocásek), jako je např. lipospermin: 1,3-dipalmiltoyl-2 fosfatidyletanolamidospermin (DPPES) a dioktadecylamidoglycyl-spermin (DOGS) (Behr et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986, 1989), 2,3-dioleoyloxyN-[2(sperminkarboxamido)etyl]-N,N-dimetyl-l-propanamoniumtrifluoroacetát (DOSPA), 1,3-dioleoyloxy-2-(6-karboxyspermyl) prcpylamid (DOSPER) , N, N, Ν', Ν'-tetrametyl-N, N'-bis (2hydroxyetyl)-2,3-dioleoyloxy-1,4-butandiamoniumjodid(THDOB).

Termín „nukleová kyselina nebo „genetický materiál používaný zde zahrnuje krátký řetězec DNA nebo RNA, deoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleot idselenoáty, oligodeoxyribonukleot idfosforothioáty(OPT), oligodeoxyribonukleotidfosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidmetylfosfonáty, peptidové nukleové kyseliny (PNA), ribonukleotidy, oligoribonukleotídy, oligoribonukleotidfosforothioáty, 2' -OMe-oligoribonukleotidfosfáty, 2'-OMe-oligoribonukleotidfosforothioáty, ribozymy (molekuly RNA s enzymatickými aktivitami), geny, plazmídy a vektory (klonovací nosiče).

• ·· • · ·

Termín „virozomy používaný zde se vztahuje - ve své nej jednodušší formě - k lipozomovým váčkům s dvojvrstevnou membránou obsahující kationtové lipidy a vnitřní - nejlépe membrána dále obsahuje virové prostor, zejména virové glykoproteiny. Ve výhodném provedení virové proteiny zahrnují alespoň jeden peptid vodný proteiny, kdí schopný fúze nebo protein, který má plnou biologickou fúzní aktivitu, zejména „spike glykoprotein hemaglutinin a/nebo neuraminidáza víru chřipky A (např virus A/Singapur). Rozumí se, že virové proteiny také zahrnují synteticky tvořené aminokyselinové sekvence odpovídající anebo shodné s fúzním peptidem viru chřipky, jak je zde popsáno. Membránové lipidy zahrnují kationtové lipidy definované '/ýše, ale mohou volitelně dále zahrnout další přirozené a/nebo syntetické lipidy, výhodně fosfolipidy, jako je fosfátidylcholin (PC) a fosfatídyletanolamin (PE) .

Ačkoliv kationtové virozomy předkládaného vynálezu mohou být v mnoha případech - zvláště v pokusech s in vitro tkáňovým,! kulturami - úspěšně aplikovány specifických markérů na membráně, zejména in vivc je výhodné, že dále obsahují alespoň jeden buněčně specifický markér na membráně, jak zde výše definována. Střední průměr váčků je v rozmezí 120 - 180 nm, jak bylo určeno elektronovou mikroskopií a měřením dynamického rozptylu světla.

Termín „ plná (biologická) fúzní aktivita používaný zde vyjadřuje, že virozomy podle předkládaného vynálezu obsahující rekonstituované virové proteiny v membráně váčku mají v podstatě tutéž fúzní aktivitu pro cílové buňky jako intaktní virus, z kterého jsou obvykle virové proteiny rekonstituovány. Srovnání schopnosti fúzovat kationtových virozomů je výhodně srovnáváno s intaktním virem chřipky A.

bez buněčně pro aplikace * ·

Fúzní aktivita se měří známými postupy, zejména jak bylo publikováno autory Hoekstra et al. (Biochemístry, 23, 56755681, 1984) nebo Lůscher et al. (Arch. Virol., 130, 317-3261993).

Ještě než muže být „antisense technologie použita léčebně nebo profylakticky u pacienta, který ji potřebuje, je nutné napřed vyřešit velký počet technických problémů, týkajících se zejména vývoje vhodného nosičového systému. Například genetický materiál, jako jsou např „antisense oligonukleotidy, může být nestabilní a rozkládat se, nebo být jinak více či méně inaktivován před tím, než dosáhne cílové buňky a bylo by tedy nutné používat velká množství tohoto materiálu zachyceného v konvenčních kationtových lipozomech. Diky těmto velkým množstvím pak vyvstává otázka potenciální toxicity v lidském nebo zvířecím těle.

Použitím kationtových virozomú podle předkládaného vynálezu jako nosiče pro genetický materiál mohou být tyto problémy úspěšně překonány a mohou se předejít nebo alespoň významné sni z:

nežádoT.

vedlejší účinky způsobené toxicitou. Tento prospěšný účinek je dosažen tím, že předkládané kationtové virozomy mají - ve srovnání s lípozcmy nebo virozomy doposud známými - mnohem vyšší aktivitu a účinnost vyjádřenou faktorem až 1000-20 000 pro přenos uzavřeného genetického materiálu, jako jsou např,„antisense oligonukleotidy, do cílových buněk. Je tedy prakticky nemožné srovnat výkonnost konvenčních virozomú nebo kationtových lipozomů s výkonností kationtových virozomú podle předkládaného vynálezu.

- 18 Popis obrázku

Obrázek 1 ukazuje mikrofotografi i virozomú DOTAP s virovými „spike proteiny.

Obrázek 2 ukazuje fúzní aktivitu indukovanou pK virozomú DOTAP značenými oktadecylrhodamidem B s modelovými lipozomy.

Obrázek 3 ukazuje virozomy DOTAP s opouzdřenými „antisense FITC-OPT inkorporovanými do buněk lidského malobuněčného plicního karcinomu.

Obrázek 4 a obrázek 5 ukazují vynikající příjem „antisense virozomú L-myc-DOTAP do buněk lidského malobuněčného plicního karcinomu transfekční účinnost a vynikající účinnost transfek.ce.

Obrázek 6 ukazuje inkubací různých buněk lidského malobuněčného plicního karcinomu s „antisense virozomy L-mvc.

Obrázky	7a,	7b ukazují transfekční	úč	innost virozomú
pFSVcat-DOTAP	pro	buňky Jurkat.
Obrázek	8 :	fúze virozomú DOTAP	s	fos folipidovými
lipozomy. Fúze se	měřila testem R18 ve 37	°C.
Obrázek	9 :	inkorporace thymidinu	do	buněk NCI-H209

ošetřenými virozomy. 75 μΐ virozomú obsahujících 200 pmol buď „antisense, „sense nebo msc FITC-OPT a 625 μΐ čerstvého média obsahujícího 0,5 μθί ¹⁴C-thymidinu se přidalo k 5x1O⁴ buněk/ml na jamku.

Obrázek 10: inhibice inkorporace thymidinu závislá na dávce do buněk NC1-H209 při přidání virozomú obsahujících „antisense L-myc-OPT. Buňky NC1-H209 se inkubovaly při počáteční koncentraci buněk lxlO⁵ /ml na jamku. Hodnoty jsou průměry ± směrodatné odchylky ze tří pokusů.

Obrázek 11: inkubace různých buněčných linií lidského maiobuněčného plicního karcinomu se 75 μΐ „antisense virozomů L-myc. Exprese onkogenu Lri.yc se snižuje v buněčných liniích, jak uvedeno: H82 < H510A < H209.

Virczcmy série 1 obsahovaly menší množství „antisense L-myc než virczcmy série 2.

Obrázek 12: transfekce buněk Sp2 dvěma odlišně připravenými virozcmovými preparáty.

Obrázek 13: transfekce buněk P3/NS1 dvěma odlišně připravenými virozomcvými preparáty.

Obrázek 14: transfekce buněk NIH/3T3 dvěma odlišně připravenými virozomcvými preparáty.

Obrázky 15,15,17: růst buněk KG1 při ošetření se „sense a „antisense virozomy c-myb-DOTAP. Přidáno 25, 50 nebo 100 μΐ roztoku virozomu obsahujícího 18, 36 nebo pmoi OPT, v uvedeném pořadí. Hodnoty jsou průměry ± směrodatné odchylky ze tří pokusů.

Obrázek 18: růst buněk CEM-C3 při ošetření s vírozomy DOTA? při přidání 50 μΐ roztoku „sense a „antisense virozomů c-myb. Hodnoty jsou průměry ± směrodatné odchylky ze tří pokusů.

Aby byl vynález zde popisovaný plněji pochopen, jsou uvedeny následující příklady. Příklady slouží pouze pro i nemají být chápány jako omezující účely ilustrace jakémkoliv aspektu tohoto vynálezu.

Příklad’/ provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava katicntového lípidového váčku s virovými hemaglut ininovými trimery s plnou fúzní aktivitou z viru chřipky obsahujícími cpouzdřené „antisense oligodeoxynukieotidy L-myc-?ITC(= značené fluoresceinem)

Příprava virozemů DOTAP a virozomů DOTAP-fosfát idylchol in (PC)

Kemaglutmin (LHA) z kmene chřipky A/Singapur/6/85 byl izolován, jak popsali Skenei a Schild (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 963,972, 1971) . Ve stručností, virus se pěstoval v alantoinové dutině slepicích vajec a byl dvakrát purifikován ultracentrifugací na sacharózovém gradientu. Purifikovaný virus byl stabilizován v pufru obsahujícím 7,9 mg/ml NaCl, 4,4 mg/ml troj sodného citrátu.H₌O, 2,1 mg/ml

2-morfolinoetansulfořové kyseliny, a 1,2 etyl-piperazín-N'-2-etansulfonové kyseliny pH 7,3 virové suspenze obsahující 34 5 pg HA v I ml byla vytvořena peleta ultracentrifugací při 100 000 x g po dobu 10 minut. K peletě viru chřipky se přidalo 7,7 ml pufrovaného roztoku detergentu obsahujícího 145 mM NaCl, 2,5 mM HEPSS a 54 mg/ml neionogenního detergentu oktaetylenglykolmonododecyléteru mg /ml N-hydroxyZ 5 3 ml (OEG-C

12^3 , pK 7,4. Peleta se kompletně rozpustila použitím ultrasonikace po 2 minuty při teplotě místnosti. Roztok se odstředil 1 hodiny.

v ultracentrifuzí pr;

100 000 po dobu

Získaný supernatant obsahoval solubilizovaný trimer HA (1,535 mg HA./mi) a stopové množství neuraminidázy. Ke 3,7 ml supernatantu (6 mg HA) se přidalo 6 mg DOTAP a rozpustilo. Roztok se sterilizoval průtokem přes 0,2 μπι filtr, a poté se přenesl do skleněné nádobky obsahující

-21 1,15 g sterilních mikronosičcvých kuliček, nejlépe „Siobeaas SM-2. Nádobka se třepala 1 hodinu při použití třepačky REAX2 z Heidolphu (Kelheim, Německo). Byio-li nutné, tento postup se opakoval až třikrát s 0,53 mg Eiobeads. Tímto ____ __ 2 £ s 1 s 1 ξ b ě

DOTAP.

Pro tvorbu virozomů DOTAP-PC obsahuj ícímu • i r-n 7ΩΤΠ; i supernatantu a 3 mc PC mg HA přidaly 3 mg DOTAP a rozpustily. Následné kroky byly tytéž, jak byly popsány v předchozím textu pro virozomy DOTAP.

Příprava virozomů se syntetickými fúzním peptidem

Jedna možnost přípravy kationtových virozomů nesoucích syntetické fúzní peptidy v membráně zahrnuje následující kroky:

1. Aktivace fosfatidyletanolaminu (PE) vazebnou molekulou N-[γ-maleimidobutyryloxy]sukcimid esterem (GMBS) v reakci

PE + GMSS -> MBS-PE e N-hydrcxysukcinimid, jak popsáno autory Martin et al. (Irreversible coupling of immuncglobulin fragments to preformed vesicles, J. Biol. Chem., 257, 2SS-238, 1932).

2. Příprava lipidových váčků s aktivovaným PE (GM3-PE), kdy se rozpustí 20% fosfatidylchclin, 70% DOTAP a 10% GMB-PE v pufrovaném roztoku detergentu, jak popsáno výše pro HA obsahující virozomy DOTAP. Následné kroky přípravy lipidových váčk jsou tytéž, jak byly popsány v předchozím textu pro virozomy DOTAP.

3. Vazba syntetického fúzního peptidu na lipidové váčky, kdy se používá peptid obsahující 20 aminokyselin mající aminokyselinovou sekvenci G-L-F-E-A-1-A-G-F-1-E-N-GW-E-G-M-I-D-C, a který obsahuje volnou aminovou skupinu na * *4 · 4 O 4 4 44 · 4 4

44*4 · 4 444 · 44 444 4 4 4 44 44

- 22 N-koncové části a amidovou skupinu na C-koncové části. Protože aminokyselina na C-koncové části je cystein, je zde dostupná volná thiolová skupina pro vazbu peptidu k GMP-PE v membráně lipidových váčku.

Pro provedení vazebné reakce:

PE-GMB_rae:nbrána + HS-cys-peptid —> PE-GMB^^-S - cys - peptid se smísí roztok čerstvě připravených lipidových váčků v pufru (40mM kyselina citrónová, 35mM fosforečnan sodný, lOOmM NaCl, a 2mM EDTA, pH 5,5) s roztokem peptidu v tomtéž pufru. Směs se jemně míchá v dusíkové atmosféře přes noc při 4 ^cC. Lipidové váčky se oddělí od nekonjugovaných peptidu gelovou filtrací na koloně High Load Superdex 200.

Jako alternativa mohou být fúzní peptidy také navázány na lipidové váčky prostřednictvím předem tvořených komplexů PE-vazebná molekula-peptid, jak je popsáno dále v tomto příkladě pro fragmenty Fab'.

Inkorporace fosforothioátových oligodeoxyribonukleotidů do virozomů DOTAP „Antisense a „sense” oligodeoxyribonukieotidfosforothioáty (OPT) genu L-myc byly použity jako příklad pro demonstrací vysoké účinnosti kationtových. virozomů v transfekci. Prostřednictvím chemického postupu s fosřoramidity (Microsynth GmbH, Balgach, Švýcarsko) se syntetizovaly 5'-FITC-OPT. Jako „antisense” OPT a „sense” OPT se použily v uvedeném pořadí pentadekamer (5’-FITCGTAGTCCATGTCCGC-3') a pentadekamer (5'-FITC-GCGGACATGGACTAC3') . Syntetizovaly se kontrolní OPT se smíšenou sekvencí (mixed sequence control - msc) skládající se z nukleotidů téže délky jako „antisense a „sense OPT.

ml virozomů DOTAP nebo DOTAP-PC se přidal ke každému z následujících:

* « se poté sonikovaly -OPT se oddělily od

- 23 a) 2 mg „antisense FITCOPT (1,3 pmol),

b) 3,4 mg „sense FITC-OPT (1,3 pmol) a

c) 3,1 mg msc FITC-OPT (1,3 μπιοί) .

FITC-OPT se rozpustily a roztoky 2 minuty při 26 °C, Necpou z dře né FITC virozomů gelovou filtrací na koloně High Load Superdex 200 (Pharmacia, Švédsko) . Kolona se ekvilibrovala sterilním PBS. Frakce obsahující virozomy DOTAP s opouzdřenými FITC-OPT se eluovaly PBS a sbíraly. Koncentrace virozomy opouzdřeného FITC-OPT se určovaly fluorometrícky poté, co se virozomy plně rozpustily v O,1M NaOH obsahujícím 0,1% Triton X-100, Pro účely kalibrace fluorescenční stupnice byla fluorescence prázdných virozomů DOTAP, které byly rozpuštěny ve výše zmíněném roztoku detergentu, stanovena jako nulová.

Vazba fragmentů Fab' na virozomy prostřednictvím předem vytvořených molekulových komplexů fosfatidyletanolamindvojfunkční vazebná molekula mg čerstvě redukovaných Fab' z myší monoklonální protilátky anti-CDlO (anti-CALLA), rozpuštěné ve 2,8 ml pufrovanénc roztoku kyseliny citrónové (lOOmM NaCl, 40mM kyselina citrónová, 35mM Na₂HPO₄.2H₂O, 2mM EDTA, pH 5,5), se přidaly k roztoku 0,524 mg N-[4-(p-maleimidfenylbutyryl]fosfatidyletanolaminu (ΜΡΒ.ΡΞ) ve 215 μΐ pufru kyseliny citrónové obsahujícím 0,5% n-oktyloligooxyetylen. Směs se poté ínkubovala pod dusíkem 16 hodin ve 4 °C za jemného míchání. Po inkubaci byl odstraněn nenavázaný MPE.PE dávkou 400 μΐ čerstvě redukované vlhké sefarózy „Thiopropyl Seharose 6B {Pharmacia, Švédsko). Směs se ínkubovala 4 hodiny při teplotě místností. „Thiopropyl Seharose 6B se odstranila centrifugací a výsledný roztok se neutralizoval na pH 7,0. Neutralizovaný roztok se doplnil OEG (54 mg/ml).

- 24 « 4 4 4 4

4 4 4 4

44 444

4 *

4

4 4

Roztoky připravené výše popsaným způsobem se přidaly k roztokům pro přípravu virozomů DOTAP. Molekuly Fab'-MPB.PE jsou vloženy do lipidové dvoj vrstvy během tvorby virozomů.

Pozorování elektronovým. míkroskocem

Mikrofotografíe virozomů DOTAP potvrdily výhodnou mcnoiameiární strukturu váčků se středním průměrem přibližně 12Q až 130 nm, jak bylo určeno měřením rozptylu laserového paprsku. „Spike proteiny HA viru chřipky viditelné (obr. I) .

jsou jasné

DOTAP se na měření

Určení fúzní aktivity virozomů DOTAP

Fúzní aktivita předkládaných virozomů hodnotila kvantitativním testem založeným snižováni zhášení fluorescence popsaném autory Hoekstra et al.(Bíochemístry, 23, 5675-5681, 1934) a Lúscher et al.

(Arch. Víro!., 130, 317-3263 1993). Fluorescenční sonda chlorid oktadecylrhodamidu B (R13) (získaná od Molecular Proces lne., Eugene, USA) se vkládala ve vysoké hustotě do membrány virozomů DOTAP přidáním pufrovaného roztoku OEG (C_:-,E₃) , který obsahoval DOTAP a HA, k tenkému suchému filmu fluorescenční sondy, což bylo následováno třepáním 5 až 10 minut pro rozpuštění sondy, a poté se pokračovalo, jak popsáno výše v „Příprava kationtových lipidových váčků..., Diluce rhodamidu zhášejícího fluorescenci se pozorovala inkubací virozomů DOTAP značených rhodamidem s modelovými lipezomy (poměr DOTAP : lipozomální fosfolipid = 1:20) .

Fluorescence se měřila spektrofluorometrem Perkin-Elmer 1000 v excitačních a emisních vlnových délkách 560 a 590 nm. Obrázek 2 ukazuje fúzní reakci navozenou pH virozomů DOTAP vyjádřenou jako procento snížení zhášení fluorescence (% FDQ).

-r τ « « V >

• · » · 4 · * « 4 « * 4 4 4 4 4 4 4 4 * ·

44 ··4 44« *4 ·«

- 25 Buněčný příjem opouzdřených antisense-L-myc-FITC-OPT

Pro studium mechanismu buněčného příjmu virozomú DOTA? se ukázalo velmi užitečným značit OPT řluoresceinem.

Buňky lidského malobuněčného plicního karcinomu (ATCCNCI-H209), které exprimují vysoké hladiny genu L-myc (Nau et al., Nátuře, 318, 69-73, 1985) se pěstovaly sklíčkách s dvěma jamkami pro tkáňové kultury (Nunc, Naperville, IL 60566, USA) . K buňkám se přidalo 50 μΐ virozomú FITC-OPT. Inkubovaly se 5, 15 a 30 minut ve 37 °C, dvakrát se promyly PBS, a poté se vyšetřily fluorescenční mikroskopií. Jak lze vidět na obrázku 3, byly virozomy DOTA? s opouzdřenými antisense FITC-OPT rychle inkorporovány do buněk.

Zkoumání biologického účinku virozomú antisense-L-mvc-FITCOPT-DOTAP měřeného metodou inkorporace thymidinu

Buňky lidského malobuněčného plicního karcinomu (ATCCNCI-H209, American Type Culture Collection, Rockvilie, USA) se pěstovaly na 24-jamkových destičkách Costar v počáteční koncentraci 1 x 10’ na jamku a na 1 ml. Po inkubaci 24 hodin se odstranilo živné médium a přidalo se 625 μΐ čerstvého živného média obsahujícího 0,5 μθί ¹⁴C-thymidinu (připraveno z [2-¹⁴C]thymidinu, 52,0 mCi/mmol, Amersham, Anglie) a 75 μΐ virozomú DOTAP obsahujících 0,2 nmol bud' „antisense, „sense nebo msc FITC-OPT. Tkáňové kultury se jemně třepaly velmi pomalým natřásáním 1 hodinu ve 37 °C, a poté se přenesly do inkubátoru. Po 48 hodinách byly buněčné suspenze odebrány, přeneseny do centrifugačních kyvet a odstředěny. Získané buněčné pelety se dvakrát promyly. Pokud nebylo možné buňky dostatečně rozptýlit do suspenze jednotlivých, byly buňky krátce vystaveny působení roztoku trypsin/EDTA. Buněčné pelety se rozpustily v 1,5 ml roztoku 0, 1M

4 · · 4 · • · a 4 4 4 »4 44 ··4 «44 ·· ♦ 4 *

4 4

4· 44

NaOH/Triton-X-100 (0,1%) K 1 ml roztoku se přidaly 3 ml kapalné scintilační směsi (Ready Protein +, Eeckman,

Fullerton, CA, USA) . Radioaktivita ¹⁴C se měřila na scintilačním počítači (Beckman, Fullerton, CA, USA) .

Obrázky 4 a 5 jasně ukazuj í a transfekční účinnost virozomú antisense-L-myc-DOTAP.

Obrázek 6 ukazuje, že buňky, které neexprimují L-myc, nejsou ovlivněny nebo inhibovánv virozomy antisense-L-myc. Také prázdné virozomy nevykazují žádné účinky na rakovinné a normální buňky. Proto se zdá, že s „antisense OPT opouzdřenými ve protinádorová léčba virozomech podle předkládaného vynálezu múze mít velké možnosti, zejména kvůli odstranění výše kat iontových lipozomú.

zmíněných nevýhod konvenčních

Příklad 2

Příprava kat iontového lipidového váčku s virovými hemaglutininovými trimery s plnou fúzní aktivitou z viru chřipky obsahujícího opouzdřený vektor pcDMA3 s lidským genem IL-6 klonovaným do mnohočetného klonovacího místa (polylinkeru) (= pcDNA3-IL-6)

Příprava virozomú DOTAP s inkorporace pcDNA3-IL-6 pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, USA) je vektor o velikosti 5,4 kb navržený pro vysoce stabilní i přechodnou expresi v eukaryotických hostitelích. HA byl izolován a purifikován, jak bylo popsáno v příkladu 1.

mg DOTAP se rozpustily v 0,5 ml pufrovaného roztoku detergentu obsahujícího 145mM NaCl, 2,5mM ΚΞΡΕΞ a 54mg/ml OEG (=C₁₂E₈) , pH 7,4, a přidaly k 2 ml supernatantu obsahujícího 4 mg HA. K výsledné směsi se přidalo a rozpustilo 100 pg pcDNA3-IL-6. Roztok se podrobil 30s

- 27 • · ··· • · · · · • · « · ·« ·· • ♦ »· uitrascnikaci. OEG se odstranil pomocí Biobeads, jak bylo popsáno v příkladu 1.

Transfekce virozomů DOTAP naplněných pcDNA-IL-6 do buněk

Pj-i ' qi -f ó. ΓΠΤ _r -j I Qýpi i

Získaný roztok obsahující virozomy DOTAP naplněné pcDMA-IL-6 byl naředěn 1:1000 PBS. 20 μΐ a 50 μΐ tohoto roztoku o obsahu 1 ng a 2,5 ng pcDNA-IL-6, v uvedeném pořadí, se přidalo k 2 x 10^s myelomových buněk (P3/NSI/1-Ag41, American Type Culture Collection, Rockville, USA). Po 43 hodinách inkubace se supernatant z tkáňových kultur testoval na lidský IL-6 testem ELISA. Naměřil se obsah 20 až 45 pg Ιο-6 na 1 mi.

Srovnání transfekční účinnosti virozomu DOTAP naplněných pcDNA-IL-6 s lipozomy DOTAP naplněnými pcDNA-IL-6

V myelomových tkáňových kulturách transfekovaných konvenčními lipozomy DOTAP (které postrádají virové fúzní peptidy), které obsahovaly totéž množství pcDNA-IL-6 jako virozomy DOTAP, nebyl nalezen žádný IL-6. Aby se získaly stejné výsledky transfekce jako u virozomů DOTAP naplněných pcDNA-IL-5, bylo nutné zvýšit množství lipozomú DOTAP naplněných pcDNA-IL-6 faktorem jeden tisíc (1000) !l

Příklad 3

Příprava kationtcvého lipidového váčku s virovými hemaglutininovými trimery z viru chřipky s plnou fúzní aktivitou obsahujícího opouzdřený vektor pRSVcat • 4

- 28 Příprava virozomu DOTAP a inkorporace pRSVcat

Expresní vektor pRSVcat (od ATCC, Rockville, USA) obsahuje gen CAT, který kóduje choramfenikolacetyl transferem (CAT). Enzym kataiyzuje přenos acetylové skupiny z acetylkoenzymu-A (acetyl-KoA) na 3'-hydroxylovou skupinu chioramfenikolu. Vektory CAT jsou obecně použitelné pro monitorování transfekční účinnosti.

PRSVcat bvl opouzdřen virozomy DOTAP za podmínek popsaných v příkladu 2.

Transfekce virozomu DOTAP naplněných pRSVcat do buněk Jurkat

Buňky Jurkat (10’ buněk/ml) se inkubovaly s různým množstvím virczomů DOTAP naplněných pRSVcat (0,0001 μΐ až 25 μΐ). Po 4 8 hodinách inkubace ve 3 7 °C se měřila CAT aktivita testem CAT-ELISA (Boehringer Mannheim, Německo).

Obrázky 7a a 7b ukazují, že maximum transfekce se dosáhne přidáním 0,01 μΐ virozomu DOTAP. Na rozdíl od výše zmíněného, přidání 0,01 μΐ lipozomů DOTAP naplněných pRSVcat k buňkám Jurkat za stejných inkubačních podmínek nemělo za následek žádnou detekovatelnou aktivitu CAT.

Příklad 4

Příjem virozomu buňkami

Vstup vírozomů do cílových buněk může být rozdělen do dvou oddělených kroků:

1, Navázání

2. Penetrace.

Navázání zahrnuje vazbu virozomu prostřednictvím HA k buněčným receptorům, kterými jsou membránové glykoproteiny nebo glykolipidy s koncovou kyselinou sialovou. V případě specifických virozomů fragmenty Fab’ budou navíc rozpoznávat antigenní struktury na povrchu cílové buňky, což má za následek navázání k cílovým buňkám dvěma různými vazebnými mechanismy. Specifické virozomy projevují tedy selektivitu pro speciální buněčné typy. Virozomy s fragmenty Fab', které rozpoznávají antigeny spojené s nádory, jako jsou TAG-72, CEA, 17-1A, CA19-9, nebe antigeny spojené s leukémii, jako jsou CD10 (CALLA) a CD20, se budou selektivně vázat na nádorové nebo leukemické buňky nesoucí uvedené antigeny na svém buněčném povrchu. Hemaglutininové glykoproteiny jsou pečlivě izolovány a purifikovány. Nedochází zde k žádné inaktivaci bud' proteolytickým štěpením nebo redukcí intramolekulární disuifidových (-S-S-) vazeb.

Penetrace zahrnuje vstup virozomů do buněk endocytózou zprostředkovanou receptorem. Virozomy jsou zachyceny v endozomech. Kyselé pH (5-6) v endozomech spouští fúzi virozomové membrány s membránou endezomu. Fúze je rošt i o. kovana virowz .spike giyKoprcternem hemaglutminem (HA) . Membránová fúzní reakce v endozomu uvolňuje virozom cd lipídového obalu a poskytuje přístup opouzdřeným léčivům do cytosolu. Fúzní aktivita těchto virozomových přípravků se testovala měřením snížení zhášení fluorescence. Virozomy byly značeny fluorescenční sondou chloridem oktadecylrhodamidu B (R18) a fúzní aktivita HA se monitorovala jako naředěním sondy snížení zhášení fluorescence způsobené z virozomové na lipozomevou cílovou membránu. Obrázek 8 ukazuje fluorescenci pozorovanou po přidání virozomů DOTAP, značených R13, k fosfolipidovým lipozomům. Fluorescence se začala rychle zvyšovat, což naznačuje intaktní fúzi zprostředkovanou HA.

Φ •

Φ

Φ Φ »

Φ Φ • Φ *>

s virozomy značenými

	- 3 0

Lý na	čase
se	měřil	tak, ž	e se buňky
¹⁴c.	Buňky	Ρ3/ΝΞ1	v koncentra
μΐ v;	.rozomů	ve 3 7	°C po· dobu
nr orný ti se	buňkv	1 v z c v 3 y

množství virozomů značených ' C. Jak lze vidět v tabulce 3, buněčný příjem je velmi rychlý: během prvních pěti minut bylo inkorporováno 10 % vírczomú. Delší inkubacní časy již příjem dále nezvýšily. 1 ml virczomcvého roztoku obsahoval přibližně 10’* - 10^1ώ vírozomú, tudíž během 5 minut se inkorporovalo 4000 - 40 000 virozomů do jedné buňky.

Tabulka

Doba inkubace (min)	dpm
O	64 14
10	6832
15	6096
20	6610
30	6626

Příklad 5 „Antisense strategie v léčení rakoviny

Takzvané „antisense oligcdeoxynukleotidy (ODN) jsou krátké nukleotidové sekvence DNA syntetizované jako opačné komplementární sekvence k požadované mRNA cílové nukleotidové sekvenci. Tvorbou duplexu RNA-DNA se tak zabrání translaci informační RNA (mRNA) a podpoří se zničení molekuly RNA RNázou H. Přenos ODN, cílených proti mRNA kódované onkogenem, do rakovinných buněk může být spojen >99 9 * · za urcitýcn pccmí možnosti studí í jak léčebné na zvířatech . -,ČO..C^F s inhibici buněčné proliferace a, s buněčnou smrtí.

„Antisense ODN mají velké přípravky. Mnoho prekliníckých i klinických zkoušek ve fázi T-m ukázalo, ze ODN namířené proti onkogenům a virovým genům jsou terapeuticky aktivní.

Přenos funkčních molekul DNA do buněk prostřednictvím lipozomů naplněných DNA nebo konvenčních virozomu není velmi účinný. Proto byly pro přenos genetického materiálu vyvinuty virozomy s pozitivně nabitou (katicntovou) lípidcvou dvoj vrstvou. Pozitivně nabitá lipidová dvoj vrstva interaguje s nukleovými kyselinami a způsobí, že se koncentrují uvnitř tvořených váčků.

Virozomy obsahující „antisense L-myc

Gen L-myc, poprvé objeven v buněčné linii malobuněčného uličního karcinomu (smáli cell iung cancer-SCLC,', je často am.plif ikován a zvýšeně exprimcván v SCLC. 5'-FlTColigodeoxyribonukleotidfosforothioáty (OPT) se syntetizovaly fosforamiditovým postupem (Microsynth GmbH, Balgach, Švýcarsko) . Pentadekamer (5'-rZTC-GTAGTCCATGTCCGC-3') a pentadekamer (5'-FITC-GCGGACATGGACTAC-3') byly použity jako „antisense” OPT a „sense” OPT, v uvedeném pořadí. Syntetizovaly se kontrolní OPT se smíšenou sekvencí (rnixed sequence control - msc) skládající se z nukleotidů téže délky jako „antisense a „sense” OPT pokrývající počáteční místo translace ribozomální translace na cílové mRNA. oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty virozomy. Byl hodnocen antiproliferační účinek „antisense” L-myc DNA opouzdřené virozomem v buněčných liniích H209, „Antisense” OPT působí inhibici „Ant i sense L-myc byly opouzdřeny • * · • * * • · · <♦ *·

H510 a H82 SCLC. „Antisense virozomy L-myc se přidaly k buňkám buněčných linií lidského malobuněčného plícnihc karcinomu. Jako kontroly se použily virozomy „sense L-myc a msc (kontroly se smíšenou sekvencí) (obr. 9).

„Antisense virozomy L-myc byly 20 000 krát aktivnější než neopouzdřené antisense OPT. Aby se vyvolal stejný účinek jaký je vidět na obr. 10, musely být ke tkáňovým kulturám přidány řádově mikromolové koncentrace neopouzdřených OPT antisense L-myc. Proto jsou kationtové virozomy daleko účinnější pro přenos ODN ve srovnání s buněčným příjmem neopouzdřených OPT, a také lipozomy.

Růstově inhibíční účinek antisense koreloval s hladinami exprese L-myc ve třech buněčných liniích SCLC, H209, H510 a H82 . Z obrázku 11 lze vyvodit, že ty buňky, které neexprimují gen L-myc, nejsou ovlivněny „antisense virozomy L-myc. Prázdné kationtové virozomy nevykazovaly žádné nebo pouze malé účinky na normální a rakovinné buňky. Protože gen L-myc je často amplifíkcván a zvýšeně exprimován v SCLC a velmi potlačen a exprimován s nízkou hladinou v tkáních dospělého člověka, L-myc může být dobrým cílem pro léčbu pomocí „antisense virozomú.

ucmnej si nez kat iontové virozomú

-myc

Příklad 6

Neinfekční přenos vektorů založených na plazmidech pro genovou terapii: transfekce vektorů pro savčí expresi pomocí kationtových virozomú

Současné přístupy ke genové terapii rakoviny užívají vektory založené na plazmidech pro expresi vhodných cílových genů v lidských rakovinných buňkách buď ex vivo nebo ín vivo. Zvažují se následující terapeutické genové cíle:

* • fc * , * a a • · · « ¹ • · i • · · »

- 33 (Plautz, G. 4649, geny vnímavostí, jako jsou geny thymidinkinázy viru Herpes simplex (HSV-TK) (Moolten, F.L., Cancer Res., 46, 5276-5281, 1936), geny, které směrují imunitní systém k eliminaci rakovinných buněk, jako jsou geny pro cytokiny (Tepper, R.I., et al . , Cell, 57, 503-512, 1939), geny kódující, kestimulující molekuly (Townsend, S.E., et al., Science, 259, 363-370, 1993), cizorodé geny pro histokompatíbilitu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 4645.993), a nasazení nádorově supresorových genů divokého typu, jako je p53 (Chen, P.L., et al. , Science, 250, 15761530, 1990) .

Kvůli určitým omezením současně používaných vektorů založených na virech pro genovou terapii, jako je například nedostatek specifity v zacílení nádorových buněk pro přenos genů, a z hlediska požadavků bezpečností vzhledem k možné indukci sekundárních malignit a možnosti vzniku replikačne kompetentního viru rekombinací, bylo zapotřebí vyvinout neinfekční technologii genového přenosu pro ín vivo přenes genů expresními vektory založenými na piazmidech. Použití zde popsaných kationtových virozomů je slibná alternativa neinfekční technologie pro přenos genů zprostředkovaný receptorem.

Typická účinnost transfekce při použití komerčně dostupných lipidů je mezi 5-50 %. Virozomy poskytují nejen vyšší účinnost transfekce než komerčně dostupné lipozomy, ale zachycení DNA do virozomů má za následek také stabilní transformaci buněk.

Gen pro lidský interleukin 6 (IL-S) byl klonován do místa polylinkeru pcDNA3, vektoru o velikosti 5,4 kb navrženého pro vysoce stabilní i přechodnou expresi v eukaryotických hostitelích. Vektor obsahuje markér pro « · ft«« • » · * * • · · · • · · · • * * ·· • » ·· · « * • · · * ft« * * ·*

- 34 rezistenci na necmycin, exprimovaný z časného promotoru SV40 pro selekci stabilních transformant v přítomnosti G418.

Opouzdřsní vektoru se provádělo 3 různými metodami:

1. Dialýza: plazmidy byly opouzdřeny v průběhu tvorby virozomu. Detergent Oktyl-POE (od Alexis Corp., Laeufelfingen, Švýcarsko) byl odstraněn dialýzou.

2. „Biobeads: plazmidy byly opouzdřeny v průběhu tvorby virozomu. Detergent OEG byl odstraněn „Biobeads.

3. Ultrasonikace: plazmidy byly opouzdřeny a získané lipozomy DOTAP se fúzovaly prostřednictvím ultrasonikace.

Pro měření množství opouzdřeného piazmidu se vytvořila pcDNA3-cIL-6-DNA značená ⁱ⁴C-thymidinem.

pomoci

DOTAP virozomy DOTAP

Opouzdřovací metoda	Množství opouzdřeného piazmidu
Dialýza (1)	0,02 μια DNA na Lil virozomu
„Biobeads (2)	0,009 Lig DNA na ul virozomu
Ultrasonikace (3)	0,04 Lig DNA na Lil virozomu

Buňky Sp2/O-A.g 14 (hybridní, nesecernující, myší buňky o. ATCC CRL-1531, zde nazývané Sp2), buňky P3/NSl/l-Ag4-1 (nesecernující myelomové myší buňky č. ATCC TIB-18, zde nazývané P3/NS1) a buňky NIH/3T3 (embryonální buňky kontaktně inhibované ze švýcarské NIH myši č. ATCC CRL-1658) v buněčné koncentraci 1 x 10⁵ v 1 ml média byly transfekovány virozomovými přípravky (1) - (3) . Deset dní po transfekci se měřila množství exprimovaného IL-6 pomocí testu ELISA (obr. 12, obr. 13, obr. 14). Všechny buněčné linie jsou dostupné od ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA.

	a * ··# 4 · « * * • * * · · ·	• » · · · * , · · ···· * » · « · · •·· ··« ·· · *
	- 35	-
Transfekované buňky	Sp2	a P3/NS1	byly selektovány
dvakrát prostřednictvím	G418 .	Po 2 měsí	cích kultivace se

opět měřila tvorba IL-6. Hodnoty jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Tvorba IL-6 transfekovanými buňkami po opakované selekci G418 .

Buněč- ná linie		Způsob přípravy	Počet buněk na ml	Celkový počet buněk	IL-6 [pg/mlj	Celkové množství IL-6 ípg]	IL- 6 ípg/10’ buněk)
P3/NS1	Ps1β tv buněk	Dialýza	1,2x10’	6,0x10’ 3 ml pufru	277	831	138
Siobeads	1,6x10’	7,3x10° 4 ml pufru	32	12 3	16
Ultraso- nikace	1,54X10’	8,0x10° 4 ml pufru	239	1156	14 4
P3/NS1	Super- natant	Dialýza		5 ml supem.	8	40	6,7
Bicbeads		4, 9 ml supern.	4	2 0	2, 5
Ul rrasonikace		5,2 ml supem.	25	130	j_ 6 _t 2
Spí	Pelety buněk	Dialýza	2,25x10’	1,13x10' 5,5 ml puf ru	>1200	>6600	>5 3 4
Biobeads	1,3x10°	S,5x10° 4,5 ml pufru	232	1044	110
Ultraso- nikace	2,8x10°	1,37x10° 7 ml pufru	680	4760	347
Sp2	Super- natant	Dialýza		5 ml supern.	268	1340	119
Biobeads		5,2 ml supern.	8	42	4,4
Ultraso- nikace		4,9 ml supern.	651	3190	233

* · β * « • fc « • * ·« · *·«

Objem lyzačního pufru přidaného k buněčným peletám byl nastaven tak, aby se získal počet buněk přibližně 2xlG⁶ na ml .

Příklad 7 „Antisense strategie v léčení leukémií

Nejběžnější genetická abnormalita u lidských leukémií je translokace filadelfského chromozomu (Ph‘) . Translokace protoonkogenu abl z chromozomu 9 na zlomový úsek (ber' na chromozomu 22 má za následek tvorbu hybridních genů bcr-abl·. Protoonkogen abl normálně kóduje protein s tyrozinkinázovou aktivitou, která je v buňkách nesoucích hybridní geny berabl zesílena. Transkripty bcr-abl se nalézají u převážné většiny pacientů s chronickou myelogenní leukémií (CML) a u pacientů s Ph¹ akutní lymfocytární leukémií. Zaměření na geny bcr-abl u CML je jasně nejracionálnější léčebný postup. Ukázalo se, že syntetické ODN komplementární ke spojení transkriptů bcr-abl tvořené sestřižením buď druhého nebo třetího exonu genu ber na druhý exon c-abi potlačují proliferaci leukemických buněk Philadelphia 1 in vitro a přitom Šetří růst normálních prekurzorů v kostní dřeni (Szczylik, C., et al., Science, 253, 562-565, 1991). Avšak „antisense léčba bcr-abl je omezena na paciency s CML.

Další molekulový cíl pro „antisense léčbu je gen myb. Myb, produkt kódovaný protoonkogenem c-myb, působí jako specifický transkripční faktor vázající DNA. Je přednostně exprimován v hematopoetických buňkách a je vyžadován pro proliferaci hematopoetické buňky. „Antisense ODN jako 18-mer cílený na kodony 2-7 z c-myb silně ínhiboval nebo kompletně zrušil růst klonu T-buněčné leukemické linie (CCRF-CEM), a také 78 % z vyšetřených případů primární • 44 akutní myeloidní leukemie, a 4 z chronické myeloidní leukemie (CML) (Caiabretta, B., et al., Proč. Nati. 2351-2355, 1991.

Přečisiování kostní dřeně se případu primární v blastické krizi Acad. Sci. USA, 88, „ i v a r ϋ¹

J ďKO SOíiCaSu xtdCíjy několika r.eoplazmat, včetně akutních a chronických leukémií. V současnosti je dřeň čistí od leukemických buněk celou řadou přípravků, jako jsou imunologické reagencie a chemoterapeutika. ODN opouzdřené virozomem zacílené proti jednomu onkogenu, který propůjčuje leukemickým buňkám růstovou výhodu, se ukazují jako terapeuticky užitečné a, což je nej důležitější, selektivnější než konvenční chemoterapeutícké přípravky v eliminaci leukemických buněk při ušetření normálních prekurzorových buněk.

„Antisense virozomy c-myb

Byly připraveny „sense a „antisense OPT odpovídající kodonům 2-9 c-myb. „Sense a „antisense sekvence c-myb byly 5'-GCCCGAAGACCCCGGCAC-3' a 5'-TGTGCCGGGGTCTTCGGGC-3', v uvedeném pořadí. Opouzdření OPT ve virozomech DOTAP se provádělo stejnou metodou, jaká byla použita pro virozomy DOTAP L-myc. Buněčná linie lidské myeloidní leukemie KG-1 a buněčná linie lidské akutní lymfoblastické leukemie CEM-C3 byly vystaveny „sense a „antisense virozomům c-myb. Proliferace buněk KG-1 je závislá na produktu protoonkogenu genu myb, zatímco buňky CEM-C3 nejsou závislé na produktu genu c-myb. Buňky KG-1 se inkubovaly s 25, 5 0 a 10 0 μΐ „sense a „antisense virozomů c-myb obsahujících 18, 36 a 72 pmol „sense a „antisense OPT, v uvedeném pořadí.

Počet buněk se určoval ve dnech 2, 3 a 4.

Přidání 25 μΐ „sense a „antisense virozomů c-myb mělo pouze malé účinky na buněčný růst (obr. 15) . Avšak přidání

~ ^J μ..	r. 16)	a 100 úl	(obr. 17) buněčný	růst	silně
inhibovalo.	Vyš	ší dávky	„sense virozomů	c -myb	také
vykazovaly	inhib:	Lení účinky.	Předpokládá se, že	tyto	účinky
nebyly νγ^	-elány	membránou	virozomů, protože buňky	CEM-C3
nebyly cv’	í vřeny	stejnými virozomovými přípravky	(obr.	18) .

Zkratky používané v popise

2'-0Me 2'-0 metyl

CALLA Common Acute Lymphocytic Leukaemia Antigen společný lymfocytární antigen

CAT choramfenikolacetyltransferáza

LOTA? N-[(1,2,3-diolecyloxy)propyl]-N,N,N-trimetyl amomummetylsul f át

DOTMA N-[(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniumcnlorid

FITC-OPT oligodeoxyribcnukleotidfosforothioát značený f líioresceínizothiokyanátem

G418 Geneticin- disulfát (antibiotikum G418)

HA hemag1ut ini n

1L-6 interleukin 6

ΜΡΒ.ΡΞ N-[4 -(p-maleimid)íenylbutyryl-fosťatidyletanolamin msc

NA

Oktvl-ΡΟΞ (=komplex vazebná molekula-fosfolipid) kontrola se smíšenou sekvencí („mixed sequence centrol) neuraminidáza n-oktyl-oligo-oxyetylen

GDN oligodeoxynukleotidy

OEG oktaetylenglykolmonododecyléter (C₁₂E_a)

OPT oligodeoxyribonukleotidfosforothioát (y)

PC fosfatidylcholin

ΡΞ fosťatidyletanolamin ·*· <··

- 39 PNA peptidcvá nukleová kyselina

SCLC malobunečný plicní karcinom

SV10 odičí virus 40 (Simian virus

Claims

PATE Ν TOV

NÁROKY

4 4« > 4 4 • »

1. Způsob přípravy váčků majících kladně nabitou membránu z lipidové dvojvrstvy, která obsahuje kationtové a/nebo polykationtové lipidy společně s alespoň jedním funkčně aktivním fuzogenním peptidem integrovaným do membrány nebo na ni kovalentně navázaným, který je schopen indukovat a/nebo podporovat fúzní reakci mezi membránou váčku a lipidovou membránou cílové buňky, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje krcky, kde

a) rozpustí se purifikovaný virus chřipky (inluenzy) v roztoku neioncgenního detergentu a z tohoto roztoku se oak separuje frakce obsahující nemagiut minový trimer,

b) připraví se konjugcvané molekulové komplexy obsahující fosfatidyletanolamín (PE), bifunkční vazebnou (zesífující) molekulu a buněčně specifický markér, a to tak, že bifunkční vazebná molekula se jedním vazebným místem váze na aminovou skupinu PE a druhým na thiolovou skupinu buněčně specifického markéru, a odstraní se nekonjugovaný materiál,

c) připraví se roztok obsahující: pufrovaný neionogenní detergent, hemaglutinin viru chřipky získaný v kroku a), kationtové a/nebo

30Ivkat iontové lioidy, volitelně ^:osfatidylcholin, a alespoň jeden buněčně specifický markem ve formě předem oripraveneno molekulového komplexu „PE/vazebná molekula/marker, a koncentrace lioidů, vzhledem k celkovým lipidům, se nastaví tak, az

S5^; (hmotnostních) jsou kationtové a/nebo polykationtové lipidy a 5 až 10 %(hmotnotních) je fosfatidyletanolamín, nebo 45 až 90 % (hmotnostních) jsou kationtové a/nebo polykationtové lipidy a 5 až 50 % (hmotnostních) je fosfatidylcholin a 5 až 10 % (hmotnostních) je fosfatidyletanolamín,

4 ·*«

41 d) detergent se odstraní ošetřením roztoku mikronosičovými kuličkám, výhodně polystyrénovými „Biobeads SM-2, což vede k vytvoření váčků (vezikul) s kladně nabitou lipidovou dvoj vrstvou, a

e) k váčkům se přidá množství požadovaného genetického materiálu, který má být přenesen do cílové buňky, sonikuje, aby se materiál integroval ío a neintegrovaný materiál se odstraní, výhodně

STtGS «Ξ váčk’.

gelovc
2. Způsob podle nároku Ivyznačující se tím, že váhový poměr hemaglutininu k celkovým membránovým lipidům je nastaven na hodnotu přibližně 1 (mg/mg) nebe menší.
3. Způsob podle nároků 1 nebo 2 vyznačující se tím, že buněčně specifický markér je schopen specificky rozpoznat cílovou buňku a navázat se na ni, a je vybrán ze skupiny obsahující protilátku, výhodně monoklonáiní protilátku, protilátkový fragment, výhodně fragment F(ab')₂ nebo Fab', cytokin a růstový faktor.
4 . Způsob podle vyznačuj ící markér je fragmen kteréhokoliv z předchozích nároků se tím, že buněčně specifický Fab' a je použit v hmotnostním poměru hemaglutininu k fragmentu Fab' asi 2:1.
5. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že

I) kationtové lipidy obsahují alespoň jeden člen vybraný se skupiny obsahující

N- [(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniumchlorid (DOTMA), » · **

N- [(1,2,3-dioleoyloxy)propyl] -N,N,N-trímetylamoniummetylsulfát (DOTAP), nebo

N-1 -butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidin, a II) polykationtové lipidy obsahují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny obsahující

1.3- dipalmiltoyl-2-fosfatidyletanolamidospermin (DPPES) , dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS),

2.3- dioleoyloxy-N-[2(sperminkarboxamido)etyl]-N,N-dimetyl- 1propanaminiumtrifluoroacetát (DOSPA),

1.3- dioieoyloxy-2-(
6-karboxyspermvl)propylamid (DOSPER), a N, N,N', N' -tetrametyl-N, N'-bis (2 -hydroxyetyl) 2,3 -dioleoyloxyl·,4-butandiamoniumjodid (THDOB).

o. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že roztok neionogenního detergentu obsahuje C₁₂E_a (oktaetylenglykolmonododecyléter) nebo n-oktyloligooxyetylen v koncentraci 10 až 250 pmol/mi v pufru HEPES.
7. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že mikronosíčové kuličky mají zrnitost velikosti 20 až 50 (0,34 až 0,30 mm) a že roztok je těmito mikronosičovými kuličkami ošetřen až čtyřikrát.

Způsob podle předchozích nároků že vazebné aaens kteréhokoliv z vyznačující se tím, (zesíčovací agens) je heterobifunkční organická molekula, která má alespoň jednu maleimídovou skupinu a alespoň jednu karboxylovou skupinu a výhodně je vybráno ze skupiny obsahující bis-N-sukcinimidylové deriváty a fotoaktivovatelné sukcinimidylové deriváty.

, · · * • 4 · 4 ’ • · ⁴

99 ·· • « ··« • · ·

9 · ·

5. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároku vyznačující se tím, že neúplně konjugovaný materiál, zvláště nezreagované komplexy „PE/vazebná molekula jako např. N-[4 -(p-maleimidfenylbutyrylj-fostatidyletanolamin (MPB.PE) nebo 4 -(N-maleimidmetyljcyklohexan1 -karboxylac-fosfatidyletanolamin (MCC.PE), se separuje od reakčních produktů gelovou chromatografií, výhodně afinitní chromatografií s agarózovou matrix, nejvýhodněji s redukovanou thiopropylsefarózou „Thiopropylsepharose 63.
10. Způsob v y z n a č u materiál pro přenos je materiál vybraný ze skupiny obsahující krátký řetězec DNA nebo RNA, deoxyribonukleotidy, oligcdeoxyribcnukleotidy, oligodeoxyribonukleotidselenoáty, oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty (OPT) , oligodeoxyribcnukleotidfosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidmetvl fosfonáty, peptidové nukleové kyseliny (PNA), ribonukleotidy, olígoribonukleotidy, oligoribonukieot ídfosforothioáty, 2' - OMe-oligoribonukleotidfos fáty, 2'-0Me-cligoribonukleotídfosforothioáty, ribozymy (molekuly RNA s enzymatickými aktivitami), geny, plazmidy a vektory.

podle kteréhokoliv z předchozích nároku, lící se t í m, že požadovaný genetický
11. Lípidovy váček mající kladně nabitou membránu z lipidové dvojvrstvy, která obsahuje kationtové a/nebo polykationtové lipidy společně s alespoň jedním funkčně aktivním hemaglutininem viru chřipky (ínfluenzy) integrovaným do membrány nebo na ní kovalentně navázaným, který je schopen indukovat a/nebo podporovat fúzovací reakci mezi membránou váčku a lipidovou membránou cílové buňky, vyznačující se tím, že

a) membrána obsahuje, vzhledem k celkovým lipidům, 90 až 95% (hmotnostních) kationtových a/nebo polykationtovových lipidů a 5 až 10 % (hmotnostních) je fosfatidyletanolaminu, nebo 45 až 50 % (hmotnostních) kationtových a/nebo polykationtových lipidů, 5 až 50 % (hmotnostních) fosfatidylcholinu a 5 až 10 % (hmotnostních) fosfatidyletanolaminu,

b) membrána dále obsahuje alespoň jedno bifunkční vazebné

agens (zesilovací agens) navázané na membránu kovalentní vazbou k fosfatidyletanolaminu, c) vac ek dále obsahuje alespoň jeden buněčně specifický markér schopný selektivně rozpoznat cílovou buňku a navázat ss ns. ni, přičemž markér se vybere ze skupiny obsahuj ící

protilátku, protiiátkový fragment, cytokin a růstový faktor, a je připojen k membráně prostřednictvím vazebného (zesilovacího) agens vázajícího volnou thiclovou skupinu buněčné specifického markéru, a

d) váček obsahuje požadovaný genetický materiál, který má být přenesen do cílové buňky.
12. Váček podle nároku 11 vyznačující se tím, že

I) kationtové lipidy obsahují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny obsahující

N-[(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimetylamoniumchloríd (DOTMA),

N-[(1,2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniummetylsulfát (DOTAP), nebo

N-1 - butyl-N'-tetradecyl-3 -tetradecylaminopropionamidin, a LI) polykationtové lipidy obsahují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny obsahující

1,3-dipalmiltoyl-2-fosfatidyletanolamidospermin (DPPES), díoktadecylamidoglycylspermín (DOGS),

I ··

- 45 2,3-dicleoyioxy-N-[2(sperminkarboxamiao)etyl]-N,N-dimetyl-1 propanaminium trifluoroacetát (DOSPA),

1,3-diolecyloxy-2-(β-karboxyspermyi)-propylamid (DOSPER) , a N, N,N', N'-tetrametyl-N, N'-bis (2 -bydroxyetyl) -2,3 -dioleoyloxy1,4 -buzandiamcniumjcdíd (THDOB) .

Váček ” ΐ podle nároků 11 nebo ., že membrána obsahuje

12 vyznačující

1,3-dioleoyloxy-2-(6-karbcxyspermyl}prcpylamid (DOSPER) 1ioid.

jakožto polykationotvý
14. Váček podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13 vyznačující se tím, že požadovaný genetický materiál obsažený ve váčku je vybrán ze skupiny obsahující krátký řetězec DNA nebo RNA, deoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidy, oligodeoxyribonukleotidselenoátv, oligcdecxyribonukleotidfosforothioáty (OPT), oligodeoxyribcnukleocidfosforamidáty, oligodeoxyribonukleotidme tyl řosfonáty, peptidové nuklecvé kyseliny (PNA), ribonukleotidy, oligoribonukleotídy, oligoríbonuklectídřosforothioáty, 2' -OMe-oligoribonukleotidfosfáty, 2’-QMe-oligcríbcnukleotidfosforothioáty, ribozymv, geny, plazmidy a vektory.
15. Váček podle jednoho nebo několika z předchozích nároků vyznačující se tím, že jeho průměr je v rozmezí 120 až 180 nm.
16. Lipidový váček podle kteréhokoliv z nároků 11 až 15 vyznačující se tím, že ho lze získat způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.

·· · • · · • * ·«
17. Kladně naditý lioidový váček pcdie kteréhokoliv z nároků 11 až 16 pro použití v diagnostice nebo léčení, výhodně pro profylaxi a/nebo léčení lidí nebo zvířat.
18. Kladně nabitý lioidový váček podle nároku 17 pro použití jako nosičovy systém pro specifický a neinfekční přenos požadovaného genetického materiálu do cílové buňky nebo tkáně, zejména dc klidových nebo proliferujících savčích
19. Kladně nabitý lioidový váček oodle nároku 17 nebo lí

m.

vyznačující se t alespoň jeden „antisense oiigonukleotid vhodný pro „antisense terapii, pro léčení nemoci vybrané ze skupiny obsahující rakovinu, leukémii a virovou infekci.

ze výhodné cosahuje
20 . Kladně nabitý lioidový váček podle nároku 19 vyznačující se tím, že „antisense oligonukleotid je namířený proti mRNA kódující protoonkcgen nebo onkoaen.
21. Způsob přípravy molekulového komplexu obsahujícího fostatidyletanolamin (ΡΞ), heterobifunkční vazebné (zesilující) agens a buněčně specifický markér vybraný ze skupiny obsahující protilátku, protilátkový fragment, cytokin a růstový faktor, vyznačující se tím, že

a) buněčně specifický markér, výhodně redukovaný Fab' z monoklcnální protilátky, se rozpustí v roztoku pufru, přičemž roztok pufru výhodně obsahuje IQOmM NaCl, 40mM kyselinu citrónovou, 35mM Na₂HP0₄,2H₂O, 2mM EDTA a má pH 5,5, * / • * ·· * · « • · ··

b) výsledný roztok se kombinuje s roztokem detergentu, který obsahuje 0,5 % neionogennihc detergentu, výhodně N-[4-(pmaleimidfenylbutyryl] -fcsf aúidyietanolamm ÍMPB.PE) nebo

4 -(N-maleimidmetyl)cyklohexan-1-karboxylat-fosfatidyletanclamin (MCC.PE) nebo N-y-ual e iiuidcbutyryioxyfostat idyi etanolamin (GM3.PE),

c) směs se inkubuje, výhodně ve 4°C po °6 hodin pod dusíkem za jemného míchání, a

d) po inkubaci se nenavázané molekuly „vazebná moiekula/PE odstraní afinitní chomatograf ií užitím agarózové niatrix, výhodně se směs inkubuje 4 hodiny při teplotě místnosti s čerstvě redukovanou vlhkou thicpropylsefarózou (Thioprpopylsepharose 63, Pharmacia, Švédsko'¹ .
22. Způsob podle nároku 21 v y z n a č u j í o i s e tím, že po ukončení afinitní chromatografie se agarózová matrix odstraní, výhodně odstředěním, zbývá jící roztok obsahující molekulový komplex „ΡΞ/vazebná molekula/markér se neutralizuje na hodnotu pH 7,0 a volitelně oktaetylenglykolmono-n-dodecyléter (OEG, C₁₂S₃) .
23. Způsob podle nároků 21 nebo 22 vyzná se tím, že vazebné agens (zesífující heterobifunkční sukcinimidylový derivát, který má alespoň jednu maleimidovou skupinu a alespoň jednu karboxylovou skupinu a výhodně je vybráno ze skupiny obsahující bis-Nsukcinimidylové deriváty a fotoaktívovatelné sukcinimidylové deriváty.

: u j ιοί agens) je
24. Molekulový komplex, který obsahuje heterobifunkční vazebnou molekulu v kombínac:

fosfatidyletanolaminem navázaným svou aminovou skupinou k jednomu vazebnému místu, • · lil • * « • · * ·· ·· ··· • · « » · · · ··« ··♦ ·· ··

- 48 a buněčně specifickým markérem, navázaným svou thiolovcu skupinou k druhému vazebnému místu vazebné molekuly, přičemž tato heterobifunkční vazebná molekula je sukcinimidyiový derivát, který má alespoň jednu maleimidovou skupinu a alespoň jednu karboxylovou skupinu a výhodně je vybrán ze skupiny obsahující bís-N-sukcinimidylcvé deriváty a fotoaktivovatelné sukcinimidylové deriváty, a že buněčně specifický markér je schopen specificky rozpoznat cílovou buňku a navázat se na ni, a je vybrán ze skupiny obsahující protilátku, výhodně monoklonální protilátku, protiiátkový fragment, výhodně fragment F(ab')₂ nebo Fab', cytokin a růstový faktor.
25. Molekulový komplex podle nároku 24, kte způsobem podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23.
26. Molekulový komplex podle nároku 24 nebo 25 pro ukotven buněčně specifického markéru k membráně virozomu.