JP2003535832A - ポリヌクレオチドおよび薬物の標的化リポソームへのカプセル化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 内膜二重層と外膜二重層との間で異なる脂質組成を有し、そして動物およびヒトへの静脈内注入後に原発性腫瘍およびその転移物に到達し得るリポソーム中に、プラスミド、オリゴヌクレオチド、または負電荷薬物をカプセル化する方法が、開示されている。この処方法は、カチオン性脂質分子を含むＤＮＡと、約１０〜２０アミノ酸の疎水性鎖から構成され、そして４以上のヒスチジン残基またはＮＬＳもまたそれらの一方の末端に含む、フソジェニック／ＮＬＳペプチド結合体との間の複合体形成を伴う。カプセル化された分子は、種々の固形ヒト腫瘍（乳癌および前立腺癌が挙げられるがこれらに限定されない）を根絶させる際に治療効果を示す。プラスミド、オリゴヌクレオチド、または負電荷薬物と他の抗新生物薬（正に荷電したシスプラチン、ドキソルビシン）との組み合わせをカプセル化したリポソームは、治療的価値を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２０００年６月９日出願の
米国仮出願番号６０／２１０，９２５号の優先権を主張する。この出願の内容は
、これによって本開示に参考として援用される。

【０００２】 （技術分野） 本発明は遺伝子治療の分野に関し、そして被験体へのポリヌクレオチドの送達
にとって適切なペプチド−脂質−ポリヌクレオチド複合体の産生のための方法に
特に向けられる。そのように産生されたペプチド−脂質−ポリヌクレオチド複合
体は、被験体において、新生物疾患の進行を阻害するために有用である。

【０００３】 （発明の背景） 本出願を通して、種々の刊行物、特許および公開された特許明細書は、著者お
よび日付または識別特許番号によって参考とされる。これらの刊行物についての
全ての著書目録の引用は、特許請求の範囲のすぐ前に提供される。これらの刊行
物、特許、公開された特許明細書の開示は、これによって発明に関する当該分野
の状況をより完全に記載するために、本開示に参考として援用される。

【０００４】 遺伝子治療は、急性疾患および慢性疾患の両方の処置に対して重要な見込みの
ある、生物医学的研究の新たに現れた分野であり、分子医学に対して革命的な時
代をもたらす能力を有する。しかし、多くの前臨床研究および臨床研究にもかか
わらず、ヒトの疾患の処置のための遺伝子治療の慣用的な使用は、まだ完全では
ない。被験体において目的の特定細胞を効率的に標的化し、一方有害な副作用を
制御する遺伝子送達システムを作るための遺伝子治療のまだ対処されていない重
要な必要性が存在する。

【０００５】 遺伝子治療は、患者の体細胞中に治療的に重要な遺伝子を導入することが目的
とされる。臨床試験において遺伝子移入を用いる治療を受けやすいことがすでに
示されている疾患としては、癌腫（黒色腫、乳癌、リンパ腫、頭頸部（ｈｅａｄ
ａｎｄ ｎｅｃｋ）癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃ
ａｎｃｅｒ）、慢性骨髄性白血病、非小細胞肺癌、肺腺癌、結腸直腸癌、 神経
芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫など）、エイズ、嚢胞性線維症、アデ
ノシンデアミナーゼ欠損症、心臓血管疾患（再狭窄、家族性高コレステロール血
症、末梢動脈疾患）、ゴーシェ病、α１抗トリプシン欠損症、慢性関節リウマチ
などが挙げられる。臨床試験の対象であると期待されるヒト疾患としては、血友
病Ａおよび血友病Ｂ、パーキンソン病、眼の疾患、色素性乾皮症、高血圧、肥満
症が挙げられる。ＡＤＡ疾患は、最初のヒト「遺伝子移入」によって処置（Ｋｅ
ｎｎｅｔｈ Ｃｕｌｖｅｒによって１９９０年に実施された実験）が成功した疾
患であった。Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．Ｗ．（１９９６）ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ
．，Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．Ｐｕｂｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，ｐｐ．１−１９８を参照のこと。

【０００６】 遺伝子治療の第一の目標は、変異遺伝子の修復または置換、遺伝子発現および
シグナル伝達の調節、免疫系の操作、あるいは悪性細胞および他の細胞の破壊の
ための標的化である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５６：８０８−８１３；Ｌａｓｉｃ，Ｄ．（１９９７）ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏ
ｍｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１−
２９５；Ｂｏｕｌｉｋａｓ，Ｔ．（１９９８） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１：１−１７２；Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．およびＢｏｕｌｉｋａｓ，Ｔ．
（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：１７３−２１４；Ｒ
ｏｓｓ，Ｇ．ら、（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７８１−１
７９０を参照のこと。

【０００７】 ヒト癌は、効果的な遺伝子治療が、特に有用な臨床的利益を提供する特定の疾
患状態を示す。このような疾患の処置についての遺伝子治療の概念は、免疫応答
の刺激および悪性表現型に影響する種々の代替的な細胞機能の操作を含む。多く
のヒト腫瘍は、免疫原性でないかまたは免疫原性が弱いけれども、免疫系は、サ
イトカイン遺伝子ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、
ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αの、エキソビボでの患者の細胞への形質導入、引
き続くＴリンパ球媒介抗腫瘍効果（癌免疫療法）を増強するための患者の細胞ワ
クチン接種（例えば、皮内）後に、癌細胞を除去することを増強および指示され
得る。現在試験されているさらなる開発は、腫瘍抗原をコードする遺伝子を用い
るＤＮＡワクチン接種および合成腫瘍ペプチドワクチンを用いる免疫療法である
。ヒト臨床試験での癌遺伝子治療に使用される遺伝子としては、多くの腫瘍サプ
レッサー遺伝子（ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、ＥｌＡ）、アンチセンスオンコジ
ーン（アンチセンスｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、Ｋ−ｒａｓ）、および自殺遺伝子
（ＨＳＶ−ｔｋ、ガンシクロビルとの併用、５−フルオロシトシンとの併用のシ
トシンデアミナーゼ）が挙げられる。癌遺伝子治療に提案されている他の重要な
遺伝子としては、ｂｃｌ−２、ＭＤＲ−１、ｐ２１、ｐｌ６、ｂａｘ、ｂｃｌ−
ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ−Ｉ、ＶＥＧＦ、アンギオスタチン、ＣＦＴＲ、ＬＤＬ−
Ｒ、ＴＧＦ−βおよびレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）が挙げられる。これらの遺伝子
治療の成功した実行を防げる一つの大きな障害は、腫瘍の部位に対するポリヌク
レオチドの有効用量を効率的に送達することの難しさである。従って、増強した
トランスフェクション能力を伴う遺伝子送達システムは、非常に有益である。

【０００８】 多くの異なるベクター技術および遺伝子送達方法は、インビボで遺伝子を送達
するために提案および試験されており、これらにはウイルスベクターおよび種々
の核酸カプセル化技術が挙げられる。遺伝子の代替的なウイルス送達ビヒクルと
しては、マウスレトロウイルス、組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウ
イルス、ＨＳＶ、ＥＢＶ、ＨＩＶベクターおよびバキュロウイルスが挙げられる
。非ウイルス遺伝子送達方法は、カチオン性または中性のリポソーム、プラスミ
ドＤＮＡの直接的注入、およびポリマーを併用する。遺伝子移入効率を促進する
種々の戦略は、エンドソームからのプラスミドＤＮＡの放出を促進するために、
リポソームまたはポリマーとの併用のフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ペ
プチドなどが試験されている。

【０００９】 種々の遺伝子送達技術のそれぞれは、異なる強さおよび弱さを有することが見
出されている。組換えレトロウイルスは、染色体に安定に組み込まれるが、挿入
に宿主のＤＮＡ合成を必要とする。アデノウイルスは非分裂細胞に感染し得るが
、治療的に形質導入された細胞の除去を誘導する免疫応答を引き起こす。アデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、病原性でなく、免疫応答を誘発しないが、新しい産
生戦略は、臨床前および臨床の研究について高いＡＡＶ力価を得ることを要求さ
れる。野性型ＡＡＶは第１９染色体に組み込まれるのに対して、組換えＡＡＶは
部位特異的組み込みができず、そしてまたエピソーム性を維持し得る。

【００１０】 単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、神経細胞のような非複製細胞に感染
し得、そして外来ＤＮＡに対して高いペイロード能力を有するが、細胞傷害性の
影響を負わせる。各送達システムは、他と独立して開発され、そしてそれぞれは
特定の用途に対して強さおよび弱さを証明するようである。現在、レトロウイル
スは、ヒト臨床試験において最も一般的に使用され引き続いてアデノウイルス、
カチオン性リポソームおよびＡＡＶが併用されている。

【００１１】 遺伝子治療技術を完成させる挑戦が明らかになっているように、種々のさらな
る送達システムは、標準的な技術で観察される困難さを回避するために提案され
ている。例えば、患者の組織に移植されたポリマーカプセル化同系または同種異
系の細胞を使用する細胞ベースの遺伝子送達は、治療タンパク質を分泌するため
に使用され得る。この方法は、毛様体神経組織栄養因子遺伝子を使用する筋萎縮
性側索硬化症についての臨床試験において試験されており、そして血友病に対す
る第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子、インターロイキン遺伝子、パーキンソン病
を処置するためのドーパミン分泌細胞、アルツハイマー病および他の疾患に対す
る神経成長因子に拡張され得る。開発下の他の技術としては、望ましくないウイ
ルスＤＮＡ配列のトランスフェクト細胞を取り除くためのＣｒｅ−ＬｏｘＰレコ
ンビナーゼ系を伴うベクター、特定の細胞型において遺伝子を発現するための組
織特異的プロモーターの使用、または特定の細胞型に対して遺伝子ビヒクルを指
向するための細胞表面分子を認識するリガンドの使用が挙げられる。

【００１２】 遺伝子治療技術の効力を改善するために提案されているさらなる方法としては
、腫瘍細胞中で爆発するように設計したｐ５３“遺伝子爆弾（ｇｅｎｅ ｂｏｍ
ｂｓ）”、遺伝子移入のためのベクターを操作するためのＨＩＶ−１ウイルスの
開発、遺伝子移入を改善するためのポリマーまたはカチオン性脂質とウイルスの
連結、遺伝子を核へ指向するためのオリゴヌクレオチドに対する核局在化シグナ
ルペプチドの付着、および遺伝子が随意に発現され得るかまたは消失され得る分
子スイッチシステムの開発が挙げられる。それにもかかわらず、遺伝子治療が要
求される疾患状態の広い範囲のために、そしてこのような疾患のための処置を開
発する複雑さのために、遺伝子治療を実行する改善された技術の必要性が残存す
る。本発明は、これらの問題に取り組む方法および組成物を提供する。

【００１３】 （本発明の開示） 内膜および外膜の二分子層の間で異なる脂質組成を有するリポソームにＤＮＡ
および負に電荷した薬物を、カプセル化する方法が開示される。このリポソーム
は、動物およびヒトに対する静脈注射後に、原発性腫瘍およびこれらの転移に達
し得る。この方法は、１０−９０％エタノールにおいてほぼ中和比率のモル比で
、カチオン性脂質およびペプチド分子の混合物とＤＮＡとのミセル形成を含み；
このカチオン性ペプチドは核局在性を特定化し、複合体が細胞膜を横切って入る
ことを改善するための膜融合を有する疎水性部分を有する。これらのペプチドは
、これらのカチオン性部分が、濃縮したＤＮＡに向って指向されて挿入し、そし
てミセル単層膜における脂質の疎水性鎖と一緒にこれらの疎水性鎖が埋まってい
る。このＤＮＡ／脂質／ペプチドミセルは、予め作製されたリポソームまたは脂
質との混合、引き続く水溶液への希釈およびエタノールを取り除き、そして非常
に高い率でＤＮＡを捕獲し、そしてカプセル化する直径１６０ｎｍ以下の膜に通
すことにより、リポソームの形成および押出を可能にするための透析によってリ
ポソーム中に転換さる。カプセル化されたＤＮＡは、種々の固形ヒト腫瘍（乳癌
および前立腺癌を含むが、これらに制限されない）の根絶において治療的に高い
効力を有す。プラスミドは、抗癌性遺伝子を保有するＤＮＡを有して構築され、
この遺伝子としては、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ−２、ＭＤＲ
−１、ｐ２１、ｐｌ６、ｂａｘ、ｂｃｌ−ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ−Ｉ、ＶＥＧＦ
、アンジオスタチン、オンコスタチン（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチ
ン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４
、ＩＬ−７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＨＳＶ−ｔｋ（ガンシクロビルとの併用
）、Ｅ．ｃｏｌｉシトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシンとの併用）が挙
げられるが、これらに制限されず、カプセル化シスプラチンまたは癌を抑制する
ための他の同様な全身性送達抗新生物薬物と併用される。

【００１４】 （表の簡単な説明） 表１は、ミセル形成可能な分子の一覧表である。

【００１５】 表２は、いくつかのフソジェニックペプチドを列挙しており、参考文献と共に
これらの特性を記載している。

【００１６】 表３は、単一の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドを列挙している。

【００１７】 表４は、「二分」または「分裂」ＮＬＳペプチドを列挙している。

【００１８】 表５は、アルギニン／リジンの「非ポジティブＮＬＳ」ペプチド欠失クラスタ
ーを列挙している。

【００１９】 表６は、核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）を有するペプチドを列挙している
。

【００２０】 表７は、非膜タンパク質キナーゼ上に親核性（ｋａｒｙｏｐｈｉｌｉｃ）クラ
スターを有するペプチドを列挙している。

【００２１】 表８は、ＤＮＡ修復タンパク質上のペプチド核局在化シグナルを列挙している
。

【００２２】 表９は、転写因子におけるＮＬＳペプチドを列挙している。

【００２３】 表１０は、他の核タンパク質におけるＮＬＳペプチドを列挙している。

【００２４】 （本発明の実施形態） （定義） 本発明の実施は、他に指定のない限り、従来の免疫学、分子生物学、微生物学
、細胞生物学および組換えＤＮＡの技術を使用する。これらの方法は、以下の刊
行物に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ Ｃ
ＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）
；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬ
ＯＧＹ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編（１９８７）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ
ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｍ．Ｍａ
ｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ Ａ
ＰＰＲＯＡＣＨ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、編（１９９５）；ＡＮＴＩＢＯＤＩ
ＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ
，編（１９８８）；ならびに、ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ，Ｒ．
Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編（１９８７）を参照のこと。

【００２５】 本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形態の「ａ」、「
ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他に指示していない場合、複数基準を
含む。例えば、用語「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、それらの混合物を含む、複数
の細胞を含む。

【００２６】 用語「含んでいる」は、組成物および方法が、列挙したエレメントを含むが、
他のものは排除しないことを意味することが意図される。「本質的に〜からなる
」は、組成物および方法を規定するために使用する場合、組み合わせに対する任
意の本質的な有意性の他のエレメントを除外することを意味する。従って、本明
細書中で定義されるようなエレメントから本質的になる組成物は、単離方法およ
び精製方法による微量混入物、ならびに薬学的に受容可能なキャリア（例えば、
リン酸緩衝化生理食塩水、保存薬など）を除外しない。「〜からなる」は、他の
成分の微量より多いエレメント、および本発明の組成物を投与するための実質的
な方法工程を除外することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義さ
れる実施形態は、本発明の範囲内である。

【００２７】 用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチド
の重合体形態を相互交換可能に参照するのに使用される。ポリヌクレオチドは、
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらのアナログ
を含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任
意の機能を果たし得る。用語「ポリヌクレオチド」は、例えば、一本鎖分子、二
本鎖分子および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、
イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポ
リヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の
単離したＤＮＡ、任意の配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブ、ならびにプライ
マーを含む。核酸分子はまた、改変した核酸分子も含み得る。

【００２８】 「遺伝子」とは、転写および翻訳された後に、特定のポリペプチドまたはタン
パク質をコードし得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポ
リヌクレオチドをいう。

【００２９】 「遺伝子産物」とは、遺伝子が転写および翻訳される際に産生されるアミノ酸
（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）をいう。

【００３０】 以下の略語が本明細書中で使用される：ＤＤＡＢ：ジメチルジオクタデシルア
ンモニウムブロミド（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブ
ロミドと同じ）；ＤＯＤＡＣ：Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニ
ウムクロリド；ＤＯＤＡＰ：１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプ
ロパン；ＤＭＲＩＥ：Ｎ−［１−（２，３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−
Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド；ＤＭ
ＴＡＰ：１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン；ＤＯ
ＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン；ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡと同
じ）：Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ト
リメチルアンモニウムクロリド；ＤＯＳＰＡ：Ｎ−（１−（２，３−ジオレイル
オキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，
Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート；ＤＰＴＡＰ：１，２−ジパ
ルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン；ＤＳＴＡＰ：１，２−ジス
テロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン；ＤＯＰＥ、１，２−ｓｎ−ジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｈａｔ
ｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）；ＤＣ−Ｃｈｏｌ、３β−（Ｎ−（Ｎ’，
Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール。Ｇａｏら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：２８０〜２８５（１
９９１）を参照のこと。

【００３１】 本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に受容可能なアニオン」とは、薬学
的調製物中に無毒性塩を提供する有機酸および無機酸のアニオンをいう。このよ
うなアニオンの例としては、ハライドアニオン、塩化物、臭化物およびヨウ化物
、無機アニオン（例えば、硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩）ならびに、有機アニ
オンが挙げられる。有機アニオンは、単一有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸
、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタ
ンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などから誘導され得
る。薬学的に受容可能な塩の調製は、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．
６６：１−１９（１９７７）（本明細書中で参考として援用される）に記載され
ている。

【００３２】 生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、用いられる投薬量お
よび濃度においてレシピエントに無毒であり、そしてこれらには、以下が挙げら
れる：緩衝液（例えば、ホスフェート、シトレートおよび他の有機酸）；アスコ
ルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパ
ク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリ
マー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタ
ミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の糖
類（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート化剤（例え
ば、ＥＤＴＡ）：糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；
塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン界面活性
剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）。ＰＥＧ分子はまた、ＰＥＧ分子の末端に共有結合された付随の核局在
化シグナル（ＮＬＳ）を有するフソジェニックペプチドを含む。

【００３３】 用語「カチオン性脂質」とは、生理学的ｐＨにおいて正味正電荷を運ぶ、多数
の脂質種の任意をいう。このような脂質としては、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯ
ＤＡＣ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡおよびＤＣ−Ｃｈｏｌが挙げられる
がこれらに限定されない。さらに、本発明で使用され得る、多数の市販のカチオ
ン性脂質の調製物が利用可能である。これらとしては、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣ
ＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡか
らの、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム）；ＬＩＰ
ＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥ
を含む市販のカチオン性リポソーム）；ならびに、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡからの、エタノ
ール中のＤＯＧＳを含む市販のカチオン性脂質）。

【００３４】 本発明は、さらに、補足された治療薬物を用いてミセルを産生するための多数
の方法を提供する。この方法は、特に、薬物または正味の全体の負電荷を有する
組成物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは負に荷電した低分子）のミセルを産生
するのに有用である。例えば、ＤＮＡは、プラスミドベクター内に含まれ得、そ
して治療タンパク質（例えば、野生型ｐ５３、ＨＳＶ−ｔｋ、ｐ２１、Ｂａｘ、
Ｂａｄ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、アンギオスタチン、エンドスタ
チンおよびオンコスタチン）をコードする。１つの実施形態において、この方法
は、治療薬の有効量とカチオン性脂質の有効量との組み合わせを必要とする。本
発明の方法において有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるがこれら
に限定されない：ＤＤＡＢ，ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；Ｄ
ＭＲＩＥ：Ｎ−［１−（２，３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド；ＤＭＴＡＰ：１
，２−ジミリストイル−３−トリエチルアンモニウムプロパン；ＤＯＧＳ：ジオ
クタデシルアミドグリシルスペルミン；ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡと同じ）：Ｎ−
（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルア
ンモニウムクロリド；ＤＰＴＡＰ：１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルア
ンモニウムプロパン；ＤＳＴＡＰ：１，２−ジステロイル−３−トリメチルアン
モニウムプロパン。

【００３５】 １つの局面において、負に帯電した治療薬内に含まれる約３０〜約９０％の割
合のホスフェートは、脂質分子上の正電荷によって中和され（負電荷が超過であ
る）、エタノールの有効濃度において静電気的ミセル複合体を形成する。１つの
局面において、エタノール溶液は、約２０％〜約８０％のエタノールである。さ
らなる局面において、エタノール濃度は、約３０％である。次いで、エタノール
／カチオン性脂質／治療薬の複合体が、フソジェニック−親核性ペプチド結合体
の有効量と組み合わされる。１つの局面において、治療薬のリン酸基上の残存す
る負電荷の大部分を中和し、それによって複合体のほとんど完全な中和をもたら
すための結合体の有効量は、約０．０〜約０．３の割合の範囲（リン酸基上の負
電荷に対するペプチド上の正電荷）である。この最適条件はわずかに負に帯電し
た複合体を与える。しかし、カチオン脂質上の正電荷がＤＮＡ上の負電荷を越え
た場合、過剰な正電荷は、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロー
ル）およびその誘導体によってか、または最終ミセル複合体中の他のアニオン脂
質分子によって、中和される。

【００３６】 代替の実施形態において、上記方法は、スペルミン、スペルミジンおよびマグ
ネシウム、またはリン酸基を特定の割合（１〜２０％）で中和する他の二価の金
属イオンから選択されるＤＮＡ濃縮剤を加えることによって改変され得る。

【００３７】 さらなる実施形態において、カチオン性脂質は、有効量のフソジェニック脂質
ＤＯＰＥと種々のモル比で（例えば、約１：１のカチオン性脂質：ＤＯＰＥのモ
ル比で）合わせられる。代替的な実施形態において、このカチオン性脂質は、有
効量のフソジェニック／ＮＬＳペプチド結合体と合わせられる。フソジェニック
／ＮＬＳペプチド結合体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：（ＫＡＷＬＫＡＦ）_３（配列番号１）、ＧＬＦＫＡＡＡＫＬＬＫＳＬＷＫ
ＬＬＬＫＡ（配列番号２）、ＬＬＬＫＡＦＡＫＬＬＫＳＬＷＫＬＬＬＫＡ（配列
番号３）、ならびに基本型（疎水性３−核親和性１−疎水性２−核親和性１）_{２ −３} のすべての誘導体（ここで、疎水性は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｇ、Ｗ、Ｆの
いずれかであり、核親和性は、Ｋ、Ｒ、またはＨのいずれかであり、３番目また
は４番目のアミノ酸ごとに正に荷電した残基を含む）。これらは、αへリックス
を形成し、このヘリックスの同じ方向に正味の正荷電を方向付ける。さらなる例
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：インフルエンザウイル
ス血球凝集素ＨＡ−２に由来するＧＬＦＫＡＩＡＧＦＩＫＮＧＷＫＧＭＩＤＧＧ
ＧＹＣ（配列番号４）；ＨＩＶのＴＡＴに由来するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配
列番号５）；アヒルＢ型肝炎ウイルスのＳタンパク質のＮ末端領域に由来するＭ
ＳＧＴＦＧＧＩＬＡＧＬＩＧＬＬ（Ｋ／Ｒ／Ｈ）_１−６（配列番号６）。しかし
、１〜６の正に荷電したリジン、アルギニンまたはヒスチジン残基、およびこれ
らの組み合わせの付加により、プラスミドＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドＤＮ
Ａのリン酸基と直接相互作用し得、カチオン性脂質により提供された正荷電の一
部が補償される。ＧＡＡＩＧＬＡＷＩＰＹＦＧＰＡＡ（配列番号７）は、エボラ
ウイルス膜貫通タンパク質のフソジェニックペプチド；アポリポプロテイン（ａ
ｐｏ）ＡＩＩペプチドの残基５３〜７０（Ｃ末端ヘリックス）；ＨＩＶ−１膜貫
通糖タンパク質ｇｐ４１の２３残基フソジェニックＮ末端ペプチド；アルツハイ
マー病βアミロイドペプチドの２９〜４２残基フラグメント；センダイウイルス
の融合ペプチドおよびＮ末端７個反復；レシチンコレステロールアシルトランス
フェラーゼの５６〜６８螺旋形セグメントに由来する。これらの実施形態には、
これらペプチドのより短いバージョンが含まれ、これらペプチドは、単層脂質小
胞の融合を誘導することが公知であるか、または１〜６の正に荷電したリジン、
アルギニンまたはヒスチジン残基（Ｋ／Ｒ／Ｈ）_１−６）の付加により同様に誘
導体化され（プラスミドＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡのリン酸基と直
接総合作用し得る）、カチオン性脂質により提供された正荷電の一部を補償する
全てのものが含まれる。フソジェニック／ＮＬＳ結合体におけるフソジェニック
ペプチドは、疎水性アミノ酸ストレッチおよびこれらペプチド配列のより小さな
フラグメントを示し、これらは、小胞体に挿入される膜タンパク質または分泌タ
ンパク質に使用されるシグナルペプチド配列すべてを含む。あるいは、この結合
体は、膜貫通ドメインおよびこれらペプチド配列のより小さなフラグメントを示
す。

【００３８】 本発明の１つの局面において、フソジェニック／ＮＬＳペプチド結合体におけ
るＮＬＳペプチド成分は、フソジェニック疎水性ペプチドに由来する。しかし、
多くの公知の核局在シグナル（ＮＬＳ）ペプチド、およびプロリン（Ｐ）または
グリシン（Ｇ）に隣接する少なくとも４つの正に荷電したアミノ酸を含むタンパ
ク質中の５以上の核親和性アミノ酸ストレッチに関して、核タンパク質データベ
ースのサーチに由来する５〜６アミノ酸の核親和性 ＮＬＳが付加される。ＮＬ
Ｓペプチドの例は、表１〜８に示される。フソジェニック／ＮＬＳペプチド結合
体中のＮＬＳペプチド成分は、上記のＮＬＳを含む合成ペプチドであるが、この
ペプチドの中心部分でさらなるＫ、Ｒ、Ｈ残基により、あるいはＮ末端もしくは
Ｃ末端でＰまたはＧでさらに改変され得る。

【００３９】 さらなる局面において、フソジェニック／ＮＬＳペプチド結合体は、ＮＬＳの
場所にＨ_４−６（４〜６のヒスチジン残基）のストレッチが付加されていること
を除いて、上記のフソジェニック疎水性ペプチドに由来する。ミセル形成は、ｐ
Ｈ５〜６で生じ、ここで、ヒスチジル残基は正に荷電しているが、生物学的液体
のほぼ中性のｐＨにおいてそれらの電荷を失っている。従って、プラスミドＤＮ
ＡまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡが、それらの静電気相互作用から解放される
。

【００４０】 フソジェニックペプチド／ＮＬＳペプチド結合体は、内因性プロテアーゼ切断
部位を示す短いアミノ酸ストレッチと互いに連結される。

【００４１】 本発明の好ましい局面において、本発明において用いられる、好ましい基本型
フソジェニック／ＮＬＳペプチド結合体の構造は、ＰＫＫＲＲＧＰＳＰ（Ｌ／Ａ
／Ｉ）_{１２−２０}（配列番号８）である。ここで、（Ｌ／Ａ／Ｉ）_{１２−２０}は
、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｗ、Ｆおよび他の疎水性アミノ酸を含む１２〜２０の疎水性
アミノ酸のストレッチである。

【００４２】 上記の方法により作製されたミセルは、リポソームへの変換により本発明によ
りさらに提供される。リポソーム（約８０〜約１６０ｎｍの直径）の有効量、ま
たはコレステロール（約１０％〜約５０％）、例えば、硬化ダイズホスファチジ
ルコリン（ＨＳＰＣ）のような中性リン脂質（約４０％〜約９０％）、および誘
導体化された小胞形成脂質ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエ
タノールアミン）から構成された脂質溶液の有効量（約１〜約７モル％）が、ミ
セル溶液に添加される。

【００４３】 特定の実施形態において、リポソームは、小胞形成脂質から構成され、ポリエ
チレングリコールで誘導体化されたジステアロイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＳＰＥ）約１〜約７モル％から構成される。請求項２０に記載の組成物
（ここで、ポリエチレングリコールは、約１，０００〜５，０００ダルトンの間
の分子量である）。ミセルは、透過性の膜を通してリポソーム複合体の透析によ
るエタノールの除去によって達成され得るエタノール濃度の付随した減少により
リポソームに変換され得るか、または膜を通して押し出すことにより８０〜１６
０ｎｍの直径まで減少され得る。

【００４４】 上記の方法により生成されたリポソームカプセル化治療剤が、本発明によりさ
らに提供される。

【００４５】 また、プラスミドＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのような治療剤をインビボ
で、ミセルまたはリポソームの静脈内注射または他の型の注射により組織細胞に
送達するための方法が、本明細書中で提供される。この方法は、特異的に、原発
性腫瘍または転移腫瘍を、表面上にＰＥＧ鎖が露出していること、その小さなサ
イズ（８０〜１６０ｎｍ）および腫瘍における細胞外空間への腫瘍の血管を通し
た優先的管外遊出を支持する中心から、その周辺部への固形腫瘍における静水圧
の減少に起因する、ミセルもしくはリポソーム複合体の長期の循環時間により標
的とする。本明細書中に記載のミセルもしくはリポソーム複合体を用いた、腫瘍
の細胞膜障壁を通してプラスミドＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡを送達
するための方法は、この複合体中にフソジェニックペプチドが存在するので可能
である。特に、この複合体の静脈内注射の後に、肝臓、脾臓および骨髄にプラス
ミドＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡを送達するための方法が提供される
。治療遺伝子（血友病、多剤耐性の治療のための第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因
子、癌の免疫治療のためのサイトカイン遺伝子、疼痛の緩和のための遺伝子、糖
尿病の緩和のための遺伝子、および肝臓、脾臓および骨髄組織へ導入され得る遺
伝子が挙げられるが、これらに限定されない）を癌患者または非癌患者の肝臓、
脾臓および骨髄に送達するための方法が治療タンパク質の分泌形態を生成するた
めにさらに提供される。

【００４６】 開示された治療はまた、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ−２、Ｍ
ＤＲ−１、ｐ２１、ｐｌ６、ｂａｘ、ｂｃｌ−ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ−Ｉ ＶＥ
ＧＦ、アンギオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＨＳＶ−
ｔｋ（ガンシクロビルと合わせて）、Ｅ．ｃｏｌｉシトシンデアミナーゼ（５−
フルオロシトシンと合わせて）からなる群より選択される１以上の抗癌遺伝子を
有するカプセル化プラスミドＤＮＡと、カプセル化アンチセンスオリゴヌクレオ
チド（アンチセンスｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、Ｋ−ｒａｓ）、リボザイムまたは
３成分から形成されるオリゴヌクレオチド（細胞周期またはシグナル伝達経路を
制御する遺伝子に方向付けられる）とを合わせることにより腫瘍サイズを縮小す
るための方法を提供する。これらの方法は、１以上の抗癌遺伝子を有するカプセ
ル化プラスミドＤＮＡと、アドリアマイシン、アンギオスタチン、アザチオプリ
ン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルム
スチン、クロラムブシル、クロロメタミン、クロロキノキサリン、スルホンアミ
ド、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔ
ａｍ）、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ダイ
ドクス（ｄｉｄｏｘ）、ドキソルビシン、エンドスタチン、エンロプラチン（ｅ
ｎｌｏｐｌａｔｉｎ）、エストラムスチン、エトポシド、エクストラムスチンホ
スフェート（ｅｘｔｒａｍｕｓｔｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔ）、フルシトシン（ｆ
ｌｕｃｙｔｏｓｉｎｅ）、フルオロデオキシウリジン、フルオロウラシル、硝酸
ガリウム、ヒドロキシ尿素、ヨードウリジン（ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、イン
ターフェロン、インターロイキン、ロイプロリド、ロバプラチン、ロムスチン、
マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、メクロレタミン、メクロレタミ
ノキシド（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｏｘｉｄｅ）、メルファラン、メルカ
プトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、ミトブロニトール（ｍｉｔｏ
ｂｒｏｎｉｔｏｌｅ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノコダゾール（ｎ
ｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、オンコスタチン、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａ
ｔｉｎ）、パクリタキセル、ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）、白
金−トリアミン錯体、プリカマイシン、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏ
ｎｅ）、プレドニゾン、プロカルバジン、プロテインキナーゼＣインヒビター、
ピューロマイシン、セムスチン（ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）、シグナル伝達インヒビ
ター、スピロプラチン（ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）、ストレプトゾトシン（ｓｔ
ｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎｅ）、ストロメライシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）
インヒビター、タキソール、テガファー（ｔｅｇａｆｕｒ）、テロメラーゼイン
ヒビター、テニポシド、サリドマイド、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ
、チアミプリン、トレタミン（ｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリアジコン（ｔｒｉａ
ｚｉｑｕｏｎｅ）、トリフォスファミド、チロシンキナーゼインヒビター、ウラ
ムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、ビ
ンブラスチン、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、ビンデシン、ボロゾール
（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）、およびジノス
タチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）からなる群より選択されるカプセル化または遊
離の抗新生物薬物とを組み合わせることにより改変され得る。

【００４７】 以下の実施例は、例示であって、本発明を限定することを意図することを意図
しない。

【００４８】 （リポソーム組成物） リポソームは、同心の脂質二重層からなる微視的小胞である。構造的には、リ
ポソームは長い管から球状までサイズおよび形が変動し、直径は、数百Åからほ
んの数ミリメートルまでである。小胞形成脂質は、最終的な複合体の流動性また
は剛性の特異化された程度を達成するために選択され、外層の脂質組成を提供す
る。これらは、中性（コレステロール）または二極性であり、リン脂質（例えば
、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）および
他の型の二極性脂質）が挙げられる。この双極性脂質としては、１４〜２２の範
囲の炭化水素鎖長を有し、飽和されたかまたは１以上のＣ＝Ｃ結合を有するジオ
レオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられるが、これら
に限定されない。安定なリポソームを、単独または他の脂質成分と合わせて生成
し得る脂質の例は、硬化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、
ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノー
ルアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミ
エリン、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジス
テアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスフ
ァチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ
）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイル
オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイルホ
スファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）のようなリン脂質である。リポソ
ームに組み込まれ得る、さらなるリンを含有しない脂質としては、ステアリルア
ミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、トリ
エタノールアミン−ラウリル硫酸、硫酸アルキル−アリール、パルミチン酸アセ
チル、グリセロールリシノレート（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ
）、ステアリン酸ヘキサデシル、両性アクリル酸ポリマー、ポリエチルオキシ化
脂肪酸アミド、および上記で言及されたカチオン性脂質（ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ
、ＤＭＲＩＥ、ＤＭＴＡＰ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＳＰＡ
、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が挙げられる。負に荷電した脂質
としては以下が挙げられる：ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスフ
ァチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール
（ＤＯＰＧ）、およびジセチルホスフェート（小胞を形成し得る）。本発明にお
ける使用に好ましい脂質は、コレステロール、硬化したダイズホスファチジルコ
リン（ＨＳＰＣ）および誘導体化小胞形成脂質ＰＥＧ−ＤＳＰＥである。

【００４９】 代表的には、リポソームは、それらのラメラ構造の全体的サイズおよび性質に
基づいて、３つのカテゴリーに分けられ得る。この３つの分類（Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ Ａｃａｄｅｍｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ
ｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ」Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９７７により展開された）は、多層小胞（ＭＬＶ
）、小さな単層小胞（ＳＵＶ）および大きな単層小胞（ＬＵＶ）である。

【００５０】 ＳＵＶは、直径約２０〜５０ｎｍの範囲にあり、水性成分を取り囲む単一の脂
質二重層からなる。単層小胞はまた、直径が約５０〜６００ｎｍまでのサイズで
調製され得る。単層は、かなり均一なサイズの単一区画小胞であるが、ＭＬＶは
、主に、１０，０００ｎｍまたはそのあたりまでのサイズで変化し、その構造に
おいて多区画性であり、１を超える二重層を含む。ＬＵＶリポソームは、約６０
０ｎｍ〜３０，０００ｎｍの範囲にあるその大きな直径に起因してこのようによ
ばれている：これらは、１を超える二重層を含み得る。

【００５１】 リポソームは、多くの方法によって調製され得るが、その方法の全てが、この
３つの異なる型のリポソームを産生するわけではない。例えば、金属プローブを
直接ＭＬＶの懸濁物中に沈める方法による超音波拡散は、ＳＵＶを調製するため
の一般的方法である。

【００５２】 ＭＬＶクラスのリポソームの調製は通常、脂質を適切な有機溶媒中に溶解し、
次いで気流（ガスまたは空気）下でこの溶媒を除去する工程を含む。このことに
より、乾燥した脂質の薄いフィルムが容器の表面上に残る。次いで、水性溶液を
、この容器中に振盪しながら入れて、容器の側壁から脂質物質を遊離する。この
プロセスは、脂質を拡散して、脂質凝集体またはリポソームの形成を引き起こす
。ＬＵＶ種のリポソームは、脂質の薄層を、蒸留水またはある種の水性溶液でゆ
っくりと水和することによって作製され得る。あるいは、リポソームは、凍結乾
燥によって調製され得る。このプロセスは、脂質溶液をフィルムになるまで窒素
気流下で乾燥する工程を含む。次いでこのフィルムを揮発性溶液に溶解し、そし
て凍結し、凍結乾燥装置に配置して溶媒を除去する。薬物を含む薬学的処方物を
調製するためには、薬物溶液を凍結乾燥した脂質に添加することにより、リポソ
ームを形成する。

【００５３】 （カチオン性リポソーム／カチオン性ペプチド／核酸ミセルの調製） カチオン性脂質は、スフィンゴシンと原始的な生物形態の特定の脂質を例外と
して、天然に存在しない。本発明は、単鎖両親媒性物（アルキルトリメチルアン
モニウム界面活性剤（ＤＤＡＢ（ＤＯＤＡＢと同じ）またはＣＴＡＢという略語
のＣ１２鎖ならびにＣ１６鎖を含むがこれらに限定されない）の塩化物塩および
臭化物塩）を用いる。これらの分子の分子ジオメトリは、臨界ミセル濃度（溶液
中の遊離モノマーとミセル中の分子との間の割合）を決定する。２つの状態間で
の脂質の交換は、非常に動的なプロセスであり；リン脂質は、１０^−８Ｍ以下の
臨界ミセル濃度値を有し、リポソーム中でより安定であるが；しかし、単鎖界面
活性剤（例えば、ステアリルアミン）は、希釈または静脈注射時に、数ミリ秒で
、リポソーム膜から出てくる（Ｌａｓｉｃ、１９９７）。

【００５４】 カチオン性脂質は、以下を含むがこれらに限定されない：ＤＤＡＢ：ジメチル
ジオクタデシルアンモニウムブロマイド（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアンモニウムブロマイド）；ＤＭＲＩＥ：Ｎ−［１−（２，３−ジミリスチ
ルオキシ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｙ））プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロマイド；ＤＯＤＡＣ：Ｎ，Ｎ−ジ
オレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド；ＤＭＴＡＰ：１，２−ジ
ミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン；ＤＯＤＡＰ：１，２−ジ
オレオイル（ｄｉｏｌｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウムプロパン；ＤＯＧ
Ｓ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン；ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡと同じ
）：Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ））プ
ロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド；ＤＯＳＰＡ：Ｎ−
（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカ
ルボキシアミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテ
ート；ＤＰＴＡＰ：１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロ
パン；ＤＳＴＡＰ：１，２−ジステロイル（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌ）−３−トリメ
チルアンモニウムプロパン；ＤＣ−Ｃｈｏｌ、３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメ
チルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール。

【００５５】 遺伝子導入に用いる脂質ベースのベクターは、２つの方法のうち１つで処方さ
れる。１つの方法においては、核酸を、カチオン性脂質と中性脂質の混合物から
作られる予め形成されたリポソーム中に導入する。このようにして形成された複
合体は、漠然かつ複雑な構造を有し、トランスフェクション効率は、血清の存在
によってひどく減少する。完成したリポソームは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮおよび
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥとして市販されてる。第２の方法は、ＤＮＡ複合体
を、モノカチオン性脂質またはポリカチオン性脂質を用いて、中性脂質なしで形
成する工程を包含する。これらの複合体は、エタノール中で調製され、水中で不
安定である。さらに、これらの複合体は、不利な影響を、血清により受ける（Ｂ
ｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−７８（１９９３）を参照の
こと）。市販のポリカチオン性脂質の例は、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭである。脂
質ベースの処方物中にＤＮＡ被包するための他の試みは、これらの問題を克服し
なかった（Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９
：４６７（１９８０）；およびＤｅａｍｅｒ，米国特許第４，５１５，７３６号
を参照のこと）。

【００５６】 ヌクレオチドポリマーは、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ
もしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例は、構造遺
伝子、調節領域および終結領域を含む遺伝子、ならびにプラスミドＤＮＡのよう
な自己複製系が挙げられる。特に好ましい核酸は、プラスミドである。一本鎖核
酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡに相補的で
ある）、リボザイムならびに三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。安定
性を増大するために、いくつかの一本鎖核酸は、好ましくは、安定な非リン酸ジ
エステル結合（例えば、ホスホロチオネート結合、ホスホロジチオエート結合、
ホスホロセレネート結合、メチルホスホネート結合またはＯ−アルキルホスホト
リエステル結合が挙げられる）で置換されたヌクレオチド結合の一部または全て
を有する。

【００５７】 （カチオン性リポソーム／カチオン性ペプチド／核酸ミセルの中性リポソーム
中への被包化） フソジェニックペプチド／ＮＬＳ結合体と共に用いて粒子の内層を提供する、
カチオン性脂質は、以下の群から選択される多くの物質のいずれかであり得る（
ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＭＲＩＥ、ＤＭＴＡＰ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＡＰ（ＤＯ
ＴＭＡ）、ＤＯＳＰＡ，ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ。カチオン性
脂質をＤＯＰＥと合わせる。一群の実施形態において、好ましいカチオン性脂質
は、ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ １：１である。

【００５８】 粒子の外膜を提供するために本明細書中で用いられる、中性脂質は、生理学的
なｐＨにおいて、非荷電または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多く
の脂質種のいずれかであり得る。このような脂質は、ジアシルホスファチジルコ
リン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリ
ン、ケファリンおよびセレブロシドからなる群から選択される。一群の実施形態
において、炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ２２の範囲にある飽和脂肪酸、単価不飽和脂肪
酸または二価不飽和脂肪酸を含む脂質が好ましい。一般に、飽和度が少ない脂質
ほど、より容易に大きさを揃えられる（特に、濾過滅菌のため、リポソームが約
０．１６ミクロン未満に揃えられなければならない場合）。リポソームの大きさ
、最終調製物におけるリポソームの硬さおよび安定性、被包されたＤＮＡの漏出
のないその有効期間ならびに血流中での安定性は一般的に、本発明者らの遺伝子
ビヒクルの外側コーティングを提供するための中性脂質の選択を導く。鎖長およ
び飽和度の異なる種々のアシル鎖基を有する脂質は、利用可能であるか、または
周知の技術により単離もしくは合成され得る。別の群の実施形態において、炭素
鎖長がＣ１４〜Ｃ２２の範囲にある脂質を用いる。好ましくは、本発明において
用いられる中性脂質は、硬化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステ
ロールおよびＰＥＧ−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰ
Ｅ）またはＰＥＧ−セラミドである。

【００５９】 （リポソームの調製方法） 種々のリポソーム形態を調製する様々な方法は、いくつかの発行されている特
許（例えば、米国特許第４，２２９，３６０号；４，２２４，１７９号；４，２
４１，０４６号；４，７３７，３２３号；４，０７８，０５２号；４，２３５，
８７１号；４，５０１，７２８号；および４，８３７，０２８号）ならびにＳｚ
ｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９
８０）およびＨｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６
）の論文中に記載される。これらの方法は、３つの異なる型のリポソーム（ＭＬ
Ｖ、ＳＵＶ、ＬＵＶ）全ては産生しない。例えば、金属プローブを直接ＭＬＶの
懸濁物中に沈める方法による超音波拡散は、ＳＵＶを調製するための一般的方法
である。

【００６０】 ＭＬＶクラスのリポソームの調製は通常、脂質を適切な有機溶媒中に溶解し、
次いで気流（ガスまたは空気）下でこの溶媒を除去する工程を含む。このことに
より、乾燥した脂質の薄いフィルムが容器の表面上に残る。次いで、水性溶液を
、この容器中に振盪しながら入れて、容器の側壁から脂質物質を遊離する。この
プロセスは、脂質を拡散して、脂質凝集体またはリポソームの形成を引き起こす
。ＬＵＶ種のリポソームは、脂質の薄層を、蒸留水またはある種の水性溶液でゆ
っくりと水和することによって作製され得る。あるいは、リポソームは、凍結乾
燥によって調製され得る。このプロセスは、脂質溶液をフィルムになるまで窒素
気流下で乾燥する工程を含む。次いでこのフィルムを揮発性溶液に溶解し、そし
て凍結し、凍結乾燥装置に配置して溶媒を除去する。薬物を含む薬学的処方物を
調製するためには、薬物溶液を凍結乾燥した脂質に添加することにより、リポソ
ームを形成する。

【００６１】 リポソーム調製に続いて、このリポソームの大きさを揃えて、所望の大きさの
範囲および比較的狭いリポソームの大きさの分布を達成し得る。好ましくは、予
め形成されたリポソームは、平均直径約８０〜１６０ｎｍ（インビボ投与前の濾
過滅菌のための大きさの上限）に揃えられる。いくつかの技術は、リポソームを
所望の大きさに揃えるのに利用可能である。リポソーム懸濁物を水浴またはプロ
ーブのいずれかにより超音波処理することで、漸進的に大きさを減少して、大き
さが約０．０５ミクロン（５０ｎｍ）未満の単層小胞を生成する。ポリカーボネ
イトの小孔を通してリポソームを押し出すことは、リポソームの大きさを比較的
よく限定された大きさの分布に減少する、本発明者らの好ましい方法である。リ
ポソームは、連続的に小さくなる膜の孔を通して押し出され得て、リポソームの
大きさの漸進的な減少を達成する。

【００６２】 脂質でＤＮＡを被胞するのに用いられる１つの方法は、カチオン性脂質／ＤＮ
Ａ／界面活性剤複合体からの界面活性剤の枯渇を制御することである。この方法
は、血漿中で安定性を有する複合体を提供し得る。Ｈｏｆｌａｎｄら（１９９６
）は、このような複合体を、ＤＯＳＰＡ／ＤＯＰＥ／ＤＮＡ／オクチルグルコシ
ドの混合物を透析することによって調製した。

【００６３】 本発明のカチオン性リポソーム／核酸複合体を含む薬学的組成物は、標準的な
技術に従って調製され、そしてさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む。一
般に、通常の生理食塩水を薬学的に受容可能なキャリアとして用いる。

【００６４】 インビボ投与のために、薬学的組成物は、好ましくは非経口的投与（すなわち
、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、くも膜下投与、脊髄への注射、筋肉内投
与、関節内投与、門脈注射または腫瘍内投与）される。より好ましくは、薬学的
組成物は、静脈内または腫瘍内に、ボーラス注射で投与される。他の方法におい
て、薬学的調製物は、標的組織に対しこの処方物を直接適用することにより、そ
の組織と接触し得る。この適用は、局所的に「開放された」または「閉鎖された
」手順によって、なされ得る。用語「局所的」とは、薬学的調製物の、周囲の環
境に曝された組織への直接の適用（例えば、皮膚、任意の体表面、鼻咽頭、外耳
道、眼球投与および任意の体腔表面への投与、肺への吸入、生殖器粘膜への投与
など）を意味する。

【００６５】 「開放された」手順とは、患者の皮膚を切開して、薬学的処方物が適用される
内在的組織を直接可視化する工程を含む手順である。これは一般に、外科的手順
（例えば、肺にアクセスするための開胸術、腹部内臓にアクセスするための開腹
術、または標的組織への直接的な他の外科的アプローチ）によって、達成される
。

【００６６】 「閉鎖された」手順とは、内部標的組織が、直接可視化されないが、皮膚の小
さな創傷を通して器具を挿入することによりアクセスされる、侵襲的な手順であ
る。例えば、調製物は、ニードル洗浄によって腹膜に投与され得る。同様に、薬
学的調製物は、髄膜または脊髄へ、腰椎穿刺し、その後、脊椎麻酔法または脊髄
のメトリザマイドを用いた画像化で通常実施されるように、患者を適切な位置に
おく間に注入することによって投与され得る。あるいは、その調製物は内視鏡装
置を介して投与され得る。

【００６７】 （実施例） （材料および方法） ＤＤＡＢ、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）および
本明細書中に使用されるほとんどの他の脂質を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌ
ｉｐｉｄｓから購入した；ＰＥＧ−ＤＳＰＥはＳｙｎｇｅｎａから入手した。

【００６８】 （プラスミドｐＬＦの操作） ｐＧＬ３−Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ＸｂａＩで切断し、この平滑末端を、Ｅ
．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを使用して連結した。
次いで、これをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そして１６８９ｂｐのフラグメント（
これはルシフェラーゼ遺伝子を保有する）を、ゲル精製した。ｐＧＦＰ−Ｎ１プ
ラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そ
して４．７ｋｂのフラグメント（これはアガロースゲルから単離された）を、ル
シフェラーゼフラグメントと連結した。ＪＭ１０９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を形質転
換し、そして２０個のコロニーを選択した；これらのうち約半分が、挿入物の存
在を示した；挿入物を有する８つのクローンを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切
断し、ルシフェラーゼ遺伝子の存在をさらに確認した；これらのうち７つが陽性
であった。

【００６９】 放射標識したプラスミドｐＬＦを、^３Ｈ−チミジン−５’−トリホスフェート
または^３２Ｐ無機リン酸（５ｍＣｉ）（Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，
Ｍａｓｓ．）中でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを培養することによって産
生し、そして上記に記載される標準的な技術を使用して精製した。

【００７０】 （ＤＬＳ測定） Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ４Ｍ光散乱器具（ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を、９０°の角度で、２００秒の実行時間の設定で、４〜
２５マイクロ秒のサンプル時間を使用して、使用した。粒子サイズの分布のスキ
ャンを、２０℃でかつ０．０１ポアズ粘度で、１ｍｌのサンプル容量においてプ
ラスチックキュベットを使用して得た。

【００７１】 １つの局面において、本発明は、容量単位当たりのプラスミドの含有量を増大
させ、そしてプラスミドまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡを補足するために使用
されるカチオン性の脂質の毒性を減少させる、脂質中にＤＮＡを補足するための
方法を提供する。このＤＮＡは、最終複合体の内部膜二重層に隠される。さらに
、遺伝子転移複合体は、体液における長い循環時間を与え、そして好ましくは固
形腫瘍およびその転移巣および節に血管外遊出する。血管外遊出は、遺伝子保有
ビヒクルの静脈内注射の後、ヒトまたは動物の身体のほとんどの部位で、その血
管系を介して生じる。これは、その小さなサイズ（１００〜１６０ｎｍ）、その
外側の膜二重層における、中性からわずかに負に荷電した脂質における内容物、
およびＰＥＧでのそのコーティングに起因して生じる。これらの遺伝子送達ビヒ
クルは、これが細胞外腫瘍間隙に送達された後、核親和性ペプチド（ｋａｒｙｏ
ｐｈｉｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）と結合体化する紡錘細胞形成（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ）ペプチドの存在に起因して、細胞膜バリアを横切り得る。このビヒク
ルは、脂質膜において特定の所定の配向をとり、その正の末端はＤＮＡを指向し
、そして疎水性の尾部は疎水性の脂質二重層の中に埋もれている。不安定なＮＬ
Ｓ−紡錘細胞形成ペプチド連結を、エンドサイトーシスの後に切断し、そしてプ
ラスミドＤＮＡに結合する残りのＮＬＳペプチドは、その核の取り込みを補助す
る。このことは特に、非分裂細胞（例えば、血管外遊出についての主要な部位お
よび固形腫瘍以外のこれらのビヒクルの濃縮を示す、肝細胞、脾細胞または骨髄
細胞）が標的化される場合、生じる。

【００７２】 （有機溶媒） 所望の脂質成分からミセルを調製するための適切な溶媒は、エタノール、メタ
ノール、または他の脂肪族アルコール（例えば、プロパノール、イソプロパノー
ル、ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、イソ−ブタノール、ペンタノールおよ
びヘキサノール）である。２つ以上の溶媒の混合物を、本発明の実施において使
用し得る。少量でさえ、エタノール溶液との混和性である、任意の溶媒（クロロ
ホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン
、ベンゼン、およびトルエンが挙げられる）が使用され、ミセル形成、そして続
くそのリポソームへ転換を改善し得ることがまた、理解される。

【００７３】 （カチオン性脂質） さらなる実施形態において、本明細書中に記載される、リポソームでカプセル
化されるＤＮＡは、さらに有効量のカチオン性脂質をさらに含む。カチオン性脂
質は、遺伝子移入のために広範に使用されている；多くの臨床試験（１９９７年
１２月の、全部で２２０のＲＡＣ承認プロトコールのうち３４）が、カチオン性
脂質を使用する。多くの細胞培養研究が示されてきたが、インビボで、カチオン
性脂質と一緒に遺伝子を全身送達することは、非常に限定されている。全ての臨
床プロトコールは、皮下注射、皮内注射、腫瘍内注射、および頭蓋内注射、なら
びに鼻腔内投与、胸膜内投与、またはエアロゾル投与を使用するが、Ｉ．Ｖ．送
達は、カチオン性脂質およびＤＯＰＥの毒性に起因して使用しない（Ｍａｒｔｉ
ｎおよびＢｏｕｌｉｋａｓ，１９９８を参照のこと）。ＤＯＰＥから処方される
リポソーム、およびジアシルトリメチルアンモニウムプロパン（ジオレオイル−
トリメチルアンモニウムプロパン、ジミリストイル−トリメチルアンモニウムプ
ロパン、ジパルミトイル−トリメチルアンモニウムプロパン、ジステロイル−ト
リメチルアンモニウムプロパン、すなわち、それぞれＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、
ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ）またはＤＤＡＢに基づく、カチオン性脂質は、食作用
性の細胞（マクロファージおよびＵ９３７細胞）と共にインビトロでインキュベ
ートした場合、高度に毒性であるが、非食作用性Ｔリンパ細胞に関しては毒性で
はなかった。毒性のランク順位は、ＤＯＰＥ／ＤＤＡＢ＞ＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ
＞ＤＯＰＥ／ＤＭＴＡＰ＞ＤＯＰＥ／ＤＰＴＡＰ＞ＤＯＰＥ／ＤＳＴＡＰであり
；そしてこの毒性は、活性化マクロファージによって産生される一酸化窒素（Ｎ
Ｏ）およびＴＮＦ−αの合成に対するカチオン性リポソームの効果から決定され
た（ＦｉｌｉｏｎおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ、１９９７）。

【００７４】 Ｉ．Ｖ．注射が実行される前に考慮されるべき別の局面は、負に荷電した血清
タンパク質が、カチオン性リポソームと相互作用し、そしてカチオン性リポソー
ムの不活化を引き起こし得るということである（ＹａｎｇおよびＨｕａｎｇ、１
９９７）。プラスミド送達のために使用される濃縮剤（ポリリジン、トランスフ
ェリン−ポリリジン、第５世代ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマ
ー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリ（エチレンイミン）、およびいくつかのカチオ
ン性脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、ＤＯＧＳ／ＤＯＰＥ、およ
びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ）が挙げられる）は、補体系を活性化して、程度を変更
することが見出された。強力な補体の活性化が、長鎖のポリリジン、デンドリマ
ー、ポリ（エチレンイミン）、およびＤＯＧＳによって見られた。予め形成され
たＤＮＡ複合体の表面を、ポリエチレングリコールを用いて改変すること（Ｐｌ
ａｎｋら、１９９６）は、補体の活性化をかなり減少させた。

【００７５】 カチオン性脂質は、生物学的な膜（原形質膜、エンドソーム膜、およびリソソ
ーム膜が挙げられる）を不安定化することによって、トランスフェクションの効
率を上昇させる。単離されたリソソームを、低濃度のＤＯＴＡＰと共にインキュ
ベートすることによって、β−ガラクトシダーゼの遊離活性における著しい上昇
、および培地中への酵素の放出さえも引き起こした。これは、リソソーム膜は、
脂質によって深く不安定化されていることを示す。不安定化の機構は、カチオン
性リポソームとリソソーム膜の陰イオン性脂質との間の相互作用に関連し、従っ
て、脂質二重層の間の融合を可能にすると考えられた。このプロセスは、ｐＨ７
．４に比べてｐＨ５ではほとんど明らかでなく、そして陰イオン性の両親媒性脂
質は、この膜の不安定化を部分的に阻害することが可能であった（Ｗａｔｔｉａ
ｕｘら、１９９７）。

【００７６】 ｐＨ７．４で１００％荷電されたＤＯＴＡＰおよびＤＭＲＩＥと対照的に、Ｄ
Ｃ−ＣＨＯＬは、ｐＨ感受性の発蛍光団によってモニターした場合、たった約５
０％しか荷電しなかった。この相違により、リポソームの外表面における電荷を
減少させ、そしてプラスミドＤＮＡ由来のＤＣ−ＣＨＯＬを含む二重層の、より
容易な解離、およびエンドソームからのサイトゾルへのＤＮＡ−脂質複合体の放
出の上昇を促進しようと試みた（ＺｕｉｄａｍおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚ，１９
９７）。

【００７７】 カチオン性脂質は、遺伝子の送達のために広範に使用されているが、非常にわ
ずかな研究しか、カチオン性リポソーム−プラスミド複合体の全身的なＩ．Ｖ．
注射を使用しなかった。これは、動物モデル（ヒトではない）における脂質成分
の毒性に起因する。類似の構造のカチオン性脂質の２つの型（ＤＯＴＭＡおよび
ＤＯＴＡＰ）のＩ．Ｖ．注射による投与は、トランスフェクションの効率が、主
に、カチオン性脂質の構造、およびＤＮＡに対するカチオン性脂質の比によって
決定されることを示す；異なる器官におけるルシフェラーゼおよびＧＦＰ遺伝子
の発現は一過性であり、４時間と２４時間との間にピークレベルを有し、４日目
までにはピークレベルの１％未満にまで低下する（Ｓｏｎｇら、１９９７）。

【００７８】 インビボでの多くの異なる器官は、遺伝子またはオリゴヌクレオチドのリポソ
ーム送達の後に標的化され得る。マウスの尾静脈によるカチオン性リポソーム−
プラスミド複合体の静脈注射は、主に肺、およびより小さな程度で肝臓、脾臓、
心臓、腎臓および他の器官を標的化した（Ｚｈｕら、１９９３）。Ｋ−ｒａｓ点
変異を有するＡｓＰＣ−１膵臓癌細胞を腹腔内に接種されたヌードマウスにおい
てアンチセンスＫ−ｒａｓ ＲＮＡを発現する、プラスミド−リポソーム複合体
の腹腔内注射およびＰＣＲ分析は、注射されたＤＮＡが、脳を除く種々の器官に
送達されたということを示す（Ａｏｋｉら、１９９５）。

【００７９】 ＤＯＴＡＰ：コレステロール／ＤＮＡ複合体調製のための多くの因子（ＤＮＡ
：リポソームの比、穏やかな超音波処理、加熱、および排出が挙げられる）は、
改善された全身送達のために重要であることが見出された；２００〜４５０ｎｍ
の間のサイズのＤＮＡ：リポソーム複合体の均質な集団が使用された場合、最大
限の遺伝子発現が得られた。クリオ−電子顕微鏡検査は、ＤＮＡが、これらの処
方物における２つの脂質二重層の間の陥入リポソームの内部に濃縮されること、
インビボにおける高いトランスフェクションの効率、および広範な組織分布の原
因であると考えられる因子を示した（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９７）。

【００８０】 体細胞に対するリポソーム媒介遺伝子送達を改善するための工程は、血液循環
、細胞膜を横切る挿入および輸送の門におけるプラスミドの維持、エンドソーム
区画から細胞質への放出、核膜の孔複合体を介するドッキングによる核移入、適
切なプロモーター／エンハンサー制御エレメントによって駆動される発現、そし
て長期間わたる核におけるプラスミドの維持が挙げられる（Ｂｏｕｌｉｋａｓ、
１９９８ａ）。

【００８１】 （スペルミンを用いるプラスミド凝縮） さらなる実施形態において、本明細書中に記載されるＤＮＡをカプセル化する
リポソームは、スペルミンおよび／またはスペルミジンを用いて凝縮される。Ｄ
ＮＡは、ポリリジンのようなポリカチオン、またはプロタミンのような塩基性タ
ンパク質、総ヒストンまたは特異的ヒストン画分、プロタミンとの複合体として
培養中で細胞に対して示され得る（ＢｏｕｌｉｋａｓおよびＭａｒｔｉｎ、１９
９７）。硫酸プロタミンとのプラスミドＤＮＡの相互作用、続くＤＯＴＡＰカチ
オン性リポソームの付加により、酵素消化に対抗するプラスミドＤＮＡのより良
い保護を提供する。この方法により、ＤＯＴＡＰ／ＤＮＡ複合体と比較して、尾
部静脈注射を介して、マウスにおいて一貫してより高い遺伝子発現を得た。マウ
ス当たり５０μｇのルシフェラーゼ−プラスミドにより、肺において抽出した組
織タンパク質の１ｍｇ当たり２０ｎｇのルシフェラーゼタンパク質を得て、これ
は、注射の後１時間という早さで検出され、６時間でピークに達し、そしてその
後低下した。プロタミン／ＤＯＴＡＰ／ＤＮＡの門脈内注射によって、Ｉ．Ｖ．
注射と比較した場合、肺における遺伝子発現が約１００分の１まで減少した。内
皮細胞は、ｌａｃＺ導入遺伝子発現の初期位置であった（ＬｉおよびＨｕａｎｇ
、１９９７）。硫酸プロタミンは、一価のカチオン性リポソーム処方物（ＤＣ−
Ｃｈｏｌおよびリポフェクション）を使用して、インビトロでいくつかの異なる
型の細胞へのプラスミドの送達を増強した。この効果は、多価のカチオン性リポ
ソーム処方物（リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ））を用いては
、あまり明らかではなかった（Ｓｏｒｇｉら、１９９７）。

【００８２】 スペルミンは、細胞培養および動物研究において、ＤＮＡ−カチオン性リポソ
ーム複合体のトランスフェクション効率を増強することが見出される。高濃度で
のこの生物起源のポリアミンは、スペルミンの１つの分子（４つの正に荷電した
アミノ基）の２つ以上の脂質分子の極性頭部基（ｐｏｌａｒ ｈｅａｄ ｇｒｏ
ｕｐ）との同時相互作用によって最も促進されるようであるリポソーム融合を引
き起こした。低濃度（０．０３ｍＭ〜０．１ｍＭ）では、これは、細胞の表面に
対するリポソーム−ＤＮＡ複合体の固定を促進し、そしてトランスフェクション
効率を有意に増大させた（Ｂｏｕｌｉｋａｓ、未公開）。

【００８３】 ポリカチオンであるポリブレン、プロタミン、ＤＥＡＥ−デキストラン、およ
びポリ−Ｌ−リジンは、細胞培養物中のアデノウィルス媒介遺伝子移入の効率を
有意に増加させた。これは、アデノウィルス媒介遺伝子移入の効率を減少させる
膜糖タンパク質によって存在する負電荷を中和することによって作用すると考え
られた（Ａｒｃａｓｏｙら、１９９７）。

【００８４】 （オリゴヌクレオチド移入） さらなる実施形態において、リポソームは、オリゴヌクレオチドＤＮＡをカプ
セル化する。オリゴヌクレオチドのリポソームへのカプセル化は、オリゴヌクレ
オチドの治療係数を増加させ、培養された細胞中およびヒト血清中での分解を防
ぎ、そして細胞に対する毒性を減少させる（ＴｈｉｅｒｒｙおよびＤｒｉｔｓｃ
ｈｉｌｏ、１９９２；Ｃａｐａｃｃｉｏｌｉら、１９９３；Ｌｅｗｉｓら、１９
９６）。しかし、ほとんどの研究は、細胞培養物中で行われており、動物中のイ
ンビボでの研究は非常に少ない。これらのアプローチが臨床試験へと移行し得る
前に、重要な多くの改善が依然として必要である。

【００８５】 ＺｅｌｐｈａｔｉおよびＳｚｏｋａ（１９９７）は、蛍光的に標識されたオリ
ゴヌクレオチドとＤＯＴＡＰリポソームとの複合体が、主にコーティングされて
いない小胞を含む細胞内経路を用いて細胞に入ることを見い出した。オリゴヌク
レオチドは、点状の細胞質領域から核へと再分布された。このプロセスは、エン
ドソームのビシクルの酸性化と無関係であった。オリゴヌクレオチドの核への取
り込みは、いくつかの要因（例えば、粒子の電荷）に依存し、正に荷電した複合
体は、核の取り込みを高めるために必要とされた。ＤＯＴＡＰは、特異的な抗ル
シフェラーゼオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を１００倍以上増加した。
異なるカチオン性脂質組成物のオリゴヌクレオチド−リポソーム複合体の物理化
学的な研究は、細胞膜中のホスファチジルエタノールアミンまたは他の脂質上の
負電荷のいずれかが、細胞に対する移行を促進するためにカチオン性のリポソー
ム−オリゴヌクレオチド複合体との効率的な融合のために必要とされることを示
した（Ｊａａｓｋｅｌａｉｎｅｎら、１９９４）。

【００８６】 同様の結果は、Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら（１９９７）によって報告された。
ジポリカチオン性ＤＯＳＰＡおよびモノカチオン性ＤＤＡＢ（ヘルパー脂質とし
てのＤＯＰＥ）と複合体化したゴキシゲニン標識されたオリゴデオキシヌクレオ
チド（ＯＤＮ）は、エンドサイトーシスによって培養物中のＣａＳｋｉ細胞によ
って取り込まれた。核膜は、核周囲領域中に蓄積されるＯＤＮの核への移行に対
して障壁になることが見い出された。ＤＯＳＰＡ／ＤＯＰＥリポソームは、細胞
質ゾルへとＯＤＮを送達し得たが、これらは、ＯＤＮの核への移行を媒介するこ
とは不可能であった。反対に、正味の正電荷を有するオリゴヌクレオチド−ＤＤ
ＡＢ／ＤＯＰＥ複合体は、小胞から細胞質へと放出された。ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ
は、オリゴヌクレオチドの核への移行を媒介することが決定された。

【００８７】 ＤＯＰＥ−ヘム（第二鉄プロトポルフィリンＩＸ）結合体は、ＤＯＴＡＰを用
いてカチオン性脂質粒子中に挿入され、オリゴリボヌクレオチドをヒト血清中で
の分解から保護し、そして２．２．１５ヒト肝癌細胞へのオリゴリボヌクレオチ
ド取り込みを増加させた。ヘムの効果を高めることは、粒子中の正味の負電荷で
のみ明らかであった（Ｔａｋｌｅら、１９９７）。^１１１Ｉｎで標識されてかつ
ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＯＰＥで構成されたリポソームは、主に肝臓によって取
り込まれ、脾臓および皮膚にいくらか蓄積し、尾静脈注射後の肺中には非常にわ
ずかであった。カチオン性リポソームとホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
のプレインキュベーションは、肺中の脂質の蓄積を劇的に、しかし一過性に誘導
して肝臓に徐々に再分布した。肺取り込みの機構は、栓子を介した注射後１５分
での、肺毛細管内のオリゴヌクレオチドの大きな凝集体の捕捉を包含した。標識
されたオリゴヌクレオチドは、注射後２４時間で、クップファー細胞の食胞に主
として局在化した。インビボでのオリゴヌクレオチドの核の取り込みは、観測さ
れなかった（Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら、１９９６）。

【００８８】 （ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされたリポソーム） さらなる実施形態において、本明細書中に記載されるリポソームでカプセル化
されたＤＮＡは、ＰＥＧを用いてステップ２における最終の複合体のコーティン
グ（図１）をさらに含む。延長された半減期を与えるポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ））に対して脂質を結合体化することがしばしば望ま
しい。使用される誘導体化された脂質は、ＰＥＧ修飾されたＤＳＰＥまたはＰＥ
Ｇセラミドを含む。ＰＥＧ成分の添加は、複合体の凝集を防ぎ、粒子（リポソー
ム、タンパク質、他の複合体、薬物）の循環寿命を延長させ、そして脂質−核酸
複合体の標的組織への送達を増加させる。例えば、Ｍａｘｆｉｅｌｄら、Ｐｏｌ
ｙｍｅｒ １６：５０５−５０９（１９７５）；Ｂａｉｌｅｙ，Ｆ．Ｅ．ら：Ｎ
ｏｎｉｏｎｉｃ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ、Ｓｃｈｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．編、ｐｐ．
７９４−８２１（１９６７）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５２：３５８２−３５８６（１９７７）；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，
Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５−１８６
（１９８４）；Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４：１４８７−１４９１（１９８７）；Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．ら
、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３４３−３４６（１９９０）を参照のこ
と。

【００８９】 ＰＥＧへの結合体化は、免疫原性および毒性を減少させることが報告されてい
る。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５７８−３
５８１（１９７７）を参照のこと。ＰＥＧでコーティングすることによるリポソ
ームの血液循環時間の増大の程度は、米国特許第５，０１３，５５６号に記載さ
れている。代表的には、複合体中のＰＥＧ修飾されたリン脂質またはＰＥＧセラ
ミドの濃度は、約１〜７％である。特に好ましい実施形態において、ＰＥＧ修飾
された脂質は、ＰＥＧ−ＤＳＰＥである。

【００９０】 リポソームの表面を身体の宿主防御系からリポソームを偽装するように設計さ
れた不活性材料でコーティングすることは、リポソームの血漿寿命を顕著に増大
させることが示された。この「表面修飾された」副枝に関する生物学的な典型は
、赤血球、炭水化物群の高密度層でコーティングされる細胞、免疫系検出をうま
く逃れる細胞、および数ヶ月間、うまく循環する細胞であった（リポソーム除去
の原因となる細胞と同じ型の細胞によって除去される前）。

【００９１】 第１のブレークスルーは、糖脂質（脳組織誘導型ガングリオシドＧＭ１）が、
定義され、脂質マトリックス内に組込まれた１９８７年に訪れ、リポソームは血
流中に数時間にわたって循環可能に４あった（ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｎｎ、１
９８７）。第２の糖脂質であるホスファチジルイノシトールはまた、リポソーム
に対する長い血漿残留時間を与えることが見い出された。以降、これは、脳組織
からではなく大豆から抽出され、より薬学的受容可能な賦形剤であると考えられ
た（Ｇａｂｉｚｏｎら、１９８９）。

【００９２】 表面修飾された副枝中の大きな進歩は、ポリマーでコーティングされたリポソ
ームの発展であった（Ａｌｌｅｎら、１９９１）。ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）修飾は、長年にわたって使用されて生物学的タンパク質（例えば、酵素お
よび増殖因子）の半減期を延長し、そしてそれらの免疫原性を減少させた（例え
ば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、１９８３）。１９９０年代初期に、ＰＥＧでコーテ
ィングされたリポソームは、静脈内投与された後、驚くほど長い時間循環するこ
とが報告された。２４時間のオーダーでの半減期は、マウスおよびラット中に見
られ、そしてイヌ中で３０時間を超えた。用語「密かな（ｓｔｅａｌｔｈ）」は
、これらのリポソームに適用された。というのは、これらのリポソームは、免疫
系による妨害を巧みに逃げる能力を有するからである。ＰＥＧ親水性ポリマーは
、低濃度の保護ポリマーでさえ、高密度な「高次構造的な雲（ｃｏｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｕｄ）」を形成して他の高分子が表面で相互作用するのを
防ぐ（ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９９８；Ｐａ
ｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、１９９１；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎによる概説、１
９９８）。両親媒性のＰＥＧ５０００でコーティングされた後のリポソームの親
水性の増加は、細網内皮系による非特異的取り込みを減少させる。

【００９３】 一方、ＰＥＧでコーティングされた抗ミオシン免疫リポソームの半減期は、４
０分であったが、これらは、ウサギに対する静脈内注射の後、その半減期を１０
００分まで増加した（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、１９９２）。

【００９４】 （ミセル、界面活性剤および小さな単層小胞） さらなる実施形態において、本明細書中で記載されるリポソームでカプセル化
されたＤＮＡは、エタノール溶液中で、カチオン性脂質と凝縮したプラスミドま
たはオリゴヌクレオチドＤＮＡとの間のミセル形成を有する最初の段階をさらに
含む。ミセルは、小さな両親媒性コロイド粒子であり、このコロイド粒子は、濃
度、溶媒および温度が規定された条件下、特定の種類の脂質分子、界面活性剤（
ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）または界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）によって形成
される。これらは、単一の脂質層で構成される。ミセルは、親水性のヘッド基を
有し得、これらの基は溶媒（例えば、３０〜６０％のエタノール水溶液）に対し
てその疎水性の尾を曝して整列するか、またはこれらの構造を逆転させて溶媒（
例えば、１０％未満の低いエタノール濃度）に対して極性のヘッドを曝し得る（
逆ミセル）。ミセル系は、溶媒分子および環境と熱力学的に平衡にある。これに
よって、一定の相変化が生じ、生物学的物質と接触する場合（例えば、細胞培養
物に対して導入する場合、動物に対して注射する場合、希釈する場合、タンパク
質または他の高分子と接触する場合）は特にそうである。これらの変化は、迅速
なミセルの分解または凝結を生じる。これは、リポソーム二重層が非常に高い安
定性を有するのと対照的である。

【００９５】 一本鎖の界面活性剤は、ミセルを形成し得る（以下の表１を参照のこと）。こ
れらとしては、アニオン性界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、コレートまた
はオレエート）あるいはカチオン性界面活性剤（セチル−トリメチルアンモニウ
ムブロミド、ＣＴＡＢ）が挙げられる。ＣＴＡＢ、ＣＴＡＣ、およびＤＯＩＣミ
セルは、中性脂質およびＣＴＡＢ（１：１）を含む対応するＳＵＶ粒子より、さ
らに大きな溶解性ギャップ（より低濃度のコロイド的に懸濁されたＤＮＡ）を生
じた（Ｌａｓｉｃ、１９９７）。

【００９６】

【表１】 ラメラからミセルへの移行が生じる重要な界面活性剤／リン脂質比が存在する
。例えば、小胞−ミセル移行が、大きい単層のリポソームを有するドデシルマル
トシド（ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）について観察された。ドデシルマルトシドによる
可溶化プロセスの大きな特徴は、新しい相の発見であり、この相は、長さ１〜２
ミクロンにわたって、長い糸状の糸様ミセルから構成される非常に粘着性の「ゲ
ル様」構造からなる。

【００９７】 長循環複合体は、わずかにアニオン性である必要がある。従って、ミセルのリ
ポソームへの変換に使用されるリポソームは、二極性脂質（ＰＣ，ＰＥ）および
１〜３０％の負に荷電した脂質（ＤＰＰＧ）を含む。毒性であるカチオン性脂質
は、内側のリポソーム膜二重層に隠れている。固形腫瘍に達する脂質は、アポト
ーシスを引き起こすその毒性効果を発揮する。アポトーシスは、毒性薬物または
抗新生物遺伝子もしくはオリゴヌクレオチドの癌細胞への送達によって引き起こ
されるが、（プラスミドＤＮＡと共に）カチオン性脂質の核への核局在化によっ
てもまた引き起こされる。確かに、多数の研究によって、プラスミドＤＮＡが核
に輸送されること；その移行は、ＤＮＡに静電気的に結合したカチオン性脂質分
子をドッキングすることを示唆する。これらのカチオン性脂質分子は、ヌクレオ
ソームおよび局所的不安定化を引き起こすクロマチンのドメイン構造と干渉する
ことによってその毒性を発揮する。この妨害または異常なクロマチン認識は、プ
ラスミドＤＮＡが、転写、自律的複製、または組換えを介する組み込みのために
結合されるレベルの核マトリクスで発揮され得る。

【００９８】 界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソー
ムのような処方物中に広範な適用が見出される。多数の異なる型の界面活性剤（
天然および合成の両方）の特性を分類および順位付けする最も一般的な方法は、
親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による方法である。薬物製品、処方物
、およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、論評されている（Ｒｉｅｇ
ｅｒ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅ
ｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、２８５頁）。

【００９９】 非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品において広範な適用が見出され
、そして広範な範囲のｐＨ値にわたって有用である。一般に、これらのＨＬＢ値
は、これらの構造に依存して、２から約１８まで変化する。非イオン性界面活性
剤としては、エチレングリコールエステル、ポリプロピレングリコールエステル
、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロ
ースエステル、およびエトキシレート（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）エステルのよ
うな非イオン性エステルが挙げられる。脂肪性アルコールエトキシレート、プロ
ポキシレートアルコール、およびエトキシレート／プロポキシレートブロックポ
リマーのような非イオン性アルカノールアミドおよびエステルもまた、この分類
に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤の分類の
最も一般的なメンバーである。

【０１００】 アニオン性界面活性剤としては、セッケンのようなカルボン酸塩、アシルラク
チレート（ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸およ
びエトキシレートアルキル硫酸のような硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホ
ン酸のようなスルホン酸塩、アシルイセチオン酸、アシルタウレート（ｔａｕｒ
ａｔｅ）およびスルホコハク酸、ならびにリン酸塩が挙げられる。アニオン性仮
面活性剤の分類の最も重要なメンバーは、アルキル硫酸およびセッケンである。

【０１０１】 カチオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩およびエトキシレート
アミンが挙げられる。第４級アンモニウム塩は、この分類のうちで最も使用され
るメンバーである。界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれかを保有する
能力を有する場合、この界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤
としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよ
びホスファチドが挙げられる。

【０１０２】 古典的なミセルは、遺伝子移入ビヒクルとして効果的ではないかもしれないが
、薬物または核酸をカプセル化するリポソーム複合体の形成における重要な中間
体であり得る。単鎖界面活性剤−ＤＮＡ−コロイド系の安定性は、中性脂質およ
びＣＴＡＢ（１：１）を含むＳＵＶ粒子よりも低い。しかし、第２世代のミセル
は、インビボで腫瘍を標的化し得る。Ｗｅｉｓｓｉｎｇおよび共同研究者（１９
９８）は、腫瘍を標的化するモデルタンパク質としてダイズトリプシンインヒビ
ター（ＳＴＩ）を使用した。ＳＴＩを、Ｎ−グルタリル−ホスファチジル−エタ
ノールアミン（ＮＧＰＥ）の疎水性残基で改変し、そしてポリエチレングリコー
ル（ＭＷ５０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ
−ＤＳＰＥ）ミセル（＜２０ｎｍ）およびＰＥＧ−ＤＳＰＥ改変長期循環リポソ
ーム（約１００ｎｍ）の両方に組み込んだ。タンパク質結合ジエチレントリアミ
ン五酢酸（ＤＴＰＡ）を介してダイズトリプシンインヒビターに結合した^１１１ Ｉｎを使用するタンパク質標識から決定されるように、ＰＥＧ−脂質ミセルは、
尾静脈注射後にマウスにおける皮下に確立されたＬｅｗｉｓ肺癌において、長期
循環ＰＥＧ−リポソームに固着した同じタンパク質よりもより良く蓄積した。

【０１０３】 両親媒性薬物でのリポソーム分散剤の充填は、ミセル溶液への相変換を引き起
こし得る。ホスホリピド対薬物の高比率からの移行（２：１から１：１への下降
）は、乳白色の見かけのリポソーム分散剤（粒子サイズ２００ｎｍ）のほぼ透明
なミセル（粒子サイズ２５ｎｍ未満）への変換によって達成された。Ｓｃｈｕｔ
ｚｅおよびＭｕｌｌｅｒ−Ｇｏｙｍａｎｎ（１９９８）を参照のこと。

【０１０４】 （フソジェニックペプチド） さらなる実施形態において、本明細書中に記載されたリポソームカプセル化Ｄ
ＮＡは、有効量のフソジェニックペプチドをさらに含む。フソジェニックペプチ
ドは、長いらせん軸に沿った疎水性勾配によって特徴付けられるらせん状の両親
媒性ペプチドの分類に属する。この疎水性勾配は、膜におけるペプチドの傾斜し
た挿入を引き起こし、従って、脂質コアを不安定化し、それにより、膜融合を強
化する（Ｄｅｃｏｕｔら、１９９９）。

【０１０５】 血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザウイルスのホモ三量体の表面糖タンパ
ク質である。感染の際に、これは、低ｐＨで、ウイルスとエンドソーム膜との間
の膜融合を誘導する。各単量体は、レセプター結合ＨＡ１ドメインと膜相互作用
ＨＡ２タンパク質からなる。ＨＡ２ドメインのＮＨ_２末端領域（アミノ酸１〜１
２７）（いわゆる「融合ペプチド」）は、標的の膜に挿入され、そしてウイルス
とエンドソーム膜との間で融合を引き起こす際に重要な役割を果たす。領域５〜
１４におけるシステインでの８アミノ酸の置換およびスピン標識電子常磁性共鳴
に基づいて、ペプチドが、リン酸基から１５Åの最大深さを有する膜の水平面か
ら約２５度傾いたαへリックスを形成することが結論付けられた（Ｍａｃｏｓｋ
ｏら、１９９７）。インフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡ−２由来のフソジェ
ニックペプチドの使用は、細胞によるトランスフェリン−ポリリジンＤＮＡ複合
体の取り込みの効率を非常に強化した。ペプチドは、ポリリジンに結合され、そ
して複合体は、トランスフェリンレセプター媒介エンドサイトーシスによって送
達された（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，１９９８ａによって論評される）。このペプチド
は、配列：ＧＬＦＥＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＧＹＣ（配列番号９）
を有し、そして卵黄ホスファチジルコリンを用いて調製したリポソームからの蛍
光色素カルセインの放出を誘導し得る（これは、酸性ｐＨにおいてより高い）。
このペプチドはまた、培養中でＣＥＭ−ＳＳリンパ球を使用して、０．１〜１ｍ
Ｍの濃度で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの抗ＨＩＶ効力を１０倍まで増加
し得る。このペプチドは、エンドソームのわずかにより酸性の環境でコンホメー
ションを変化させ、エンドソーム膜を不安定化および破壊する（Ｂｏｕｌｉｋａ
ｓ，１９９８ａによって論評される）。

【０１０６】 膜における負に荷電した脂質の存在は、いくつかのペプチドのフソジェニック
特性の発現のために重要であるが、他のペプチドには重要ではない。ペプチドの
フソジェニック作用（これは、ファーティリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）（精子−卵
融合に関与する精子表面タンパク質）の推定融合ドメインを表す）は、負に荷電
した脂質の存在に依存するが、ＨＩＶ２ペプチドの膜融合作用は、依存しない（
ＭａｒｔｉｎおよびＲｕｙｓｓｃｈａｅｒｔ，１９９７）。

【０１０７】 例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡのフソジェニックペプチド上
の２つのドメインを分析するために、細胞質テールおよび／またはＨＡの膜貫通
ドメインが、センダイウイルスのフソジェニック糖タンパク質Ｆの対応するドメ
インで置換したＨＡキメラを設計した。細胞質テールがヒト１型ニューロフィブ
ロミン（ＮＦ１）（残基１４４１〜１５１８）またはｃ−Ｒａｆ−１（残基５１
〜１３１）のペプチドによって置換されたＨＡの構築物を作製し、そしてワクシ
ニアウイルスＴ７ポリメラーゼ一過性発現系を使用してＣＶ−１細胞中で発現さ
せた。ＣＶ−１細胞間の膜融合および親ＨＡタンパク質またはキメラＨＡタンパ
ク質によって媒介される結合ヒト赤血球（ＲＢＣ）は、ｐＨが低下した後、前充
填したＲＢＣからこのタンパク質が発現しているＣＶ−１細胞の細胞質への水性
発蛍光団カルセインの流れが生じることを示した。このことは、膜融合が、脂質
二重層の両方のリーフレットを含み、そして水性融合孔の形成を生じることを示
す（Ｓｃｈｒｏｔｈ−Ｄｉａｚら、１９９８）。

【０１０８】 注目すべき発見は、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質が細胞膜を横断し得（Ｇｒｅｅ
ｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，１９９８）、そしてＴＡＴの３６アミノ酸ド
メインが、異種タンパク質に化学的に架橋される場合、細胞中へ形質導入する能
力を付与するという発見であった。ＴＡＴの１１アミノ酸フソジェニックペプチ
ド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０））は、核小体局在化シグナルであ
る（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，１９９８ｂを参照のこと）。

【０１０９】 ＨＩＶの別のタンパク質（糖タンパク質ｇｐ４１）は、フソジェニックペプチ
ドを含む。ｇｐ４１外部ドメインの膜近位領域に由来する直鎖状ペプチドは、抗
ＨＩＶ薬剤としての潜在的な適用を有し、そしてらせん状コンホメーションを採
用することによって感染性を阻害する（Ｊｕｄｉｃｅら、１９９７）。２３アミ
ノ酸残基（ＨＩＶ−１ ｇｐ４１のＮ末端ペプチド）は、負に荷電した大きい単
層小胞を不安定化する能力を有する。カチオンの非存在下において、主要な構造
は、孔形成αへリックスであり、ここで、Ｃａ^２＋の存在下において、コンホメ
ーションは、膜融合性の主に伸長したβ型構造に変換した。ＨＩＶ（ａｌａ）（
Ｒ２２→Ａ置換を保有する）の融合活性は、７０％減少したが、膜融合性は、第
２の置換（Ｖ２→Ｅ）が含まれる場合に完全に無効化され、コレステロール含有
の電気的に中性な膜を活発に不安定化するのは、αへリックスではなく、ＨＩＶ
−１融合ペプチドによって採用された伸長構造であることを主張する（Ｐｅｒｅ
ｉｒａら、１９９７）。

【０１１０】 プリオンタンパク質（ＰｒＰ）は、ニューロンおよびグリア細胞の表面におい
て通常見出される未知の機能の糖タンパク質である。これは、ウシ海綿状脳障害
、およびヒトにおけるクロイツフェルト−ヤーコプ病のような疾患に関連し、こ
こで、ＰｒＰは、変更された形態（ＰｒＰＳｃと称される）に変換される。コン
ピューターモデリング計算に従って、ＰｒＰの１２０〜１３３ドメインおよび１
１８〜１３５ドメインは、傾斜した様式で脂質二重層に挿入される傾斜脂質結合
ペプチドであり、カプセル化されたカルセイン漏出を誘導するリポソームと相互
作用し得る（Ｐｉｌｌｏｔら、１９９７ｂ）。

【０１１１】 アルツハイマーアミロイドペプチドのＣ末端フラグメント（アミノ酸２９〜４
０および２９〜４２）は、インビトロでのリポソームの融合を誘導するウイルス
タンパク質の融合ペプチドの特性と関連した特性を有する。これらの特性は、ア
ミロイドペプチドの細胞膜との直接的な相互作用を媒介し得、そしてこれは、ア
ミロイドペプチドの細胞障害性の一部を説明する。アルツハイマー病の病理学と
アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）多型との間の疫学的および生化学的な関連を
考慮して、３つの共通のａｐｏＥアイソフォームとアミロイドペプチドのＣ末端
フラグメントとの間の潜在的な相互作用の調査は、ａｐｏＥ４ではなく、ａｐｏ
Ｅ２およびａｐｏＥ３のみがアミロイドペプチドフソジェニック特性および凝集
特性の強力なインヒビターであることを示した。アミロイド凝集物の形成に対す
るａｐｏＥの保護的効果は、安定なａｐｏＥ／アミロイドペプチド複合体の形成
によって媒介されると考えられた（Ｐｉｌｌｏｔら、１９９７ａ；Ｌｉｎｓら、
１９９９）。

【０１１２】 １１アミノ酸残基からなる両親媒性の正味陰性（ｎｅｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）
ペプチド（ＷＡＥ１１）のフソジェニック特性は、ペプチドがリポソーム膜に固
着される場合に強力に促進された。ペプチドの融合活性は、ｐＨおよび膜融合に
依存しないようであり、そしてリジン結合ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ
Ｅ−Ｋ）を組み込むことによって提供される標的膜は、正の電荷を必要とした。
結合ペプチドが、ＰＥ−Ｋとの非特異的静電気的相互作用を介する小胞凝集を引
き起こし得るが、遊離ペプチドは、ＰＥ−Ｋ小胞の凝集を誘導できなかった（Ｐ
ｅｃｈｅｕｒら、１９９７）。

【０１１３】 多数の研究によって、細胞またはリポソームの膜における脂質二重層における
挿入後、ペプチドのαへリックスの二次構造の安定化は、ペプチドの膜融合特性
を担うことが示唆されている。Ｚｎ^２＋は、αへリックス構造を安定化するので
、ペプチドのフソジェニック活性を強化する。例えば、Ｈｉｓｔａｔｉｎ−５の
Ｃ末端機能的ドメインに位置する、唾液抗菌ペプチドのＨＥＸＸＨ（配列番号１
１）ドメイン（認識された亜鉛結合モチーフ）は、らせん形コンホメーションで
存在する（Ｍａｒｔｉｎら、１９９９；Ｍｅｌｉｎｏら、１９９９；Ｃｕｒｔａ
ｉｎら、１９９９）。

【０１１４】 融合ペプチドは、ペプチドベースの遺伝子送達系を作製するために、ＤＮＡプ
ラスミドで処方されてきた。ＹＫＡＫｎＷＫ（配列番号１２）ペプチド（プラス
ミドを４０〜２００ｎｍのナノ粒子に濃縮するために使用される）とＧＬＦＥＡ
ＬＬＥＬＬＥＳＬＷＥＬＬＬＥＡ（配列番号１３）両親媒性ペプチド（これは、
エンドソームからのプラスミドの放出を容易にするように設計されたｐＨ感受性
の溶解剤である）との組み合わせは、βガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含
む発現系を増強した（Ｄｕｇｕｉｄら、１９９８）。以下の表２を参照のこと。

【０１１５】

【表２】 （フソジェニック脂質） ＤＯＰＥは、フソジェニック脂質である；Ｎ−メトキシ−スクシニル−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＤＯＰＥ（配列番号１９）のエラスターゼ切断は、
この誘導体をＤＯＰＥ（全体として正電荷）に変換して、カプセル化された蛍光
性プローブ（カルセイン）を細胞質に送達する（Ｐａｋら，１９９９）。β−エ
ンドルフィンｍＲＮＡの領域に相補的な３０塩基のオリゴデオキシ核配列は、そ
の配列がフソジェニック特性を有するジパルミトイル−ＤＬ−α−ホスファチジ
ル−Ｌ−セリンを含む小さな単層のベシクル（５０ｎｍ）内にカプセル化された
後に、細胞培養物中でのβ−エンドルフィン産生の濃度依存的阻害を誘発した（
Ｆｒｅｓｔａら，１９９８）。

【０１１６】 （核局在化シグナル（ＮＬＳ）） さらなる実施形態において、本明細書中に記載されるリポソームにカプセル化
されたプラスミドＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡは、有効量の核局在化
シグナル（ＮＬＳ）ペプチドをさらに含む。核タンパク質の、細胞質におけるそ
の合成部位から細孔複合体を介して核における作用部位への輸送は、核に移入さ
れるタンパク質上のＮＬＳによって媒介される（以下の表３〜１０）。細胞質か
ら核細胞質へのタンパク質の転位置は、以下を含む：（ｉ）ＮＬＳ−タンパク質
とカリオフェリン（ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎ）αの複合体の形成；（ｉｉ）カリ
オフェリンβの引き続く結合；（ｉｉｉ）ヌクレオポーリン上のＦＸＦＧペプチ
ド反復へのこの複合体の結合；（ｉｖ）ヌクレオポーリンおよびカリオフェリン
ヘテロ二量体への、ｐ１０によるＲａｎ−ＧＤＰのドッキング；（ｖ）ヌクレオ
ポーリン上での多くの会合−解離反応（これは、Ｒａｎ−ＧＤＰをＲａｎ−ＧＴ
Ｐへと形質転換しそしてカリオフェリンαによって触媒される同時性ＧＤＰ−Ｇ
ＴＰ交換反応を伴って、移入基質を核細胞質側へとドッキングする）；ならびに
（ｖｉ）カリオフェリンβからの解離およびＲａｎ−ＧＴＰによるカリオフェリ
ンα／ＮＬＳ−タンパク質の核細胞質への放出。

【０１１７】 核親和性（Ｋａｒｙｏｐｈｉｌｉｃ）かつ酸性のクラスターは、ほとんどの非
膜セリン／スレオニンプロテインキナーゼにおいて見出され、その一次構造が試
験されている（表６）。これらの核親和性クラスターは、その調節された核移入
のために、キナーゼ分子のトランスポータータンパク質への係合を媒介し得、そ
して核局在化シグナルを構成し得る。プロリンおよびグリシンヘリックスブレー
カーに隣接するヘキサペプチド内の少なくとも４つのアルギニン（Ｒ）およびリ
ジン（Ｋ）からなる強力な核親和性ペプチドを排他的に有する核であるタンパク
質転写因子とは対照的に、プロテインキナーゼは、しばしば、１つのヒスチジン
および３つのＫ＋Ｒ残基を含む（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，１９９６）。これは、総細
胞質キナーゼ分子の画分の核移入を生じ、そして異なるイオン強度の核環境にお
けるその弱い保持力を生じる弱いＮＬＳ構造を特定化するために、提唱された。
プロテインキナーゼにおける推定ＮＬＳペプチドはまた、強力なＮＬＳとして作
用するその能力をさらに減少するために提案される疎水性であるかまたはかさ高
い芳香族アミノ酸を含み得る。

【０１１８】 ＤＮＡ修復経路に関与する大部分の哺乳動物タンパク質は、６つのアミノ酸の
ストレッチにわたって少なくとも４つのＲ＋Ｋを含む強力な核親和性クラスター
を有するようである（表７）。

【０１１９】 （未知タンパク質の核局在化を予測するための法則） そのアミノ酸配列からの未知の機能のタンパク質の核局在化の予測のための、
いくつかの単純な法則が提唱されている： （ｉ）ＮＬＳは、ヘキサペプチド内の４つのアルギニン（Ｒ）およびリジン（
Ｋ）として規定される；核親和性ヘキサペプチドの四分子中の１つ以上のヒスチ
ジン（Ｈ）の存在（細胞質機能および核機能を有するプロテインキナーゼにおい
てしばしば見出される）は、弱いＮＬＳ（この機能は、リン酸化によって調節さ
れ得る）を特定化し得るか、または細胞質および核の両方において機能するタン
パク質を特定化し得る（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，１９９６）； （ｉｉ）Ｋ／Ｒクラスターは、α−ヘリックスブレーカーＧおよびＰに隣接し
、従って、ＮＬＳをヘリックス−ターン−ヘリックスまたはα−ヘリックスの末
端に配置する。負に荷電したアミノ酸（Ｄ，Ｅ）は、しばしば、ＮＬＳに隣接し
て見出され、そしていくつかの場合、正に荷電したＮＬＳクラスターを妨害し得
る； （ｉｉｉ）かさ高いアミノ酸（Ｗ，Ｆ，Ｙ）は、ＮＬＳヘキサペプチド内には
存在しない； （ｉｖ）ＮＬＳシグナルは、疎水性アミノ酸の長いストレッチ（例えば、５つ
）に隣接しなくてもよい；荷電したアミノ酸および疎水性アミノ酸の混合物は、
ミトコンドリアのターゲティングシグナルとして役立つ； （ｖ）ＮＬＳの数が増えるにつれて、分子はより迅速に核に移入される（Ｄｗ
ｏｒｅｔｚｋｙら，１９８８）。さらに小さなタンパク質（例えば、ヒストン（
１０〜２２ｋＤａ））は、細孔を介する低分子の拡散の遅い速度と比較して、そ
の移入速度を増加するために、活動的な移入を必要とする； （ｖｉ）シグナルペプチドは、タンパク質の輸送について、ＮＬＳよりも強力
な決定因子である。シグナルペプチドは、その分泌または細胞膜への挿入のため
に、タンパク質を小胞体の内腔へと指向する（膜貫通ドメインの存在）（Ｂｏｕ
ｌｉｋａｓ，１９９４）； （ｖｉｉ）タンパク質（疎水性アミノ酸と核親和性アミノ酸との混合物）のミ
トコンドリア移入についてのシグナルは、核移入シグナルをアンタゴナイズし得
、そして両方の型のシグナルを有するタンパク質は、ミトコンドリアおよび核の
両方に転位置され得る； （ｖｉｉｉ）タンパク質と大きな細胞質構造（膜タンパク質、中間フィラメン
ト）との強力な会合は、これらがＮＬＳ様ペプチドを保有していても、これらの
タンパク質を移入について利用不可能にする（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，１９９４）； （ｉｘ）転写因子および他の核タンパク質は、大きく異なる数の推定ＮＬＳス
トレッチを有する。推定ＮＬＳ構造の１６の可能な形態のうち、最も大量な型は
、θθｘθθ、θθθｘθ、θθθθおよびθθｘθｘθであり、ここで、θは
ＲまたはＫであり、一緒に、転写因子上の全ての核親和性クラスターのうち約７
０％の割合を占める（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，１９９４）； （ｘ）少数の核タンパク質は、代表的な核親和性ＮＬＳの空隙のようである。
その核移入についての非核親和性ペプチドの機能（そのようなものとして、分子
は二連ＮＬＳを有する）、またはこれらのＮＬＳのないタンパク質のいずれかは
、移入について、絶対的に、移入され得る核タンパク質パートナーとの細胞質中
でのその強力な複合体形成に依存する（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，１９９４）。この機
構は、核中の２つの分子の特定の化学量論比を保証し得、そして生理学的な有意
性を有し得る；ならびに （ｘｉ）多くのタンパク質は、古典的なＮＬＳに依存しない他の機構を介して
移入され得る。

【０１２０】 多くのプロセスが、核の移入（転写因子ＮＦ−κＢ、ｒＮＦＩＬ−６、ＩＳＧ
Ｆ３、ＳＲＦ、ｃ−Ｆｏｓ、ＧＲ、ならびにヒトサイクリンＡおよびＢ１、カゼ
インキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＩＩ、プロテインキナー
ゼＣ、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の核の転位置を含む）によって調節されることが
見出されている。細胞の、特定のタンパク質の核への移入の失敗は、発癌を導き
得る。例えば、ＢＲＣＡ１は、主に乳癌および卵巣癌の細胞の細胞質中に局在し
、一方、正常な細胞中では、このタンパク質は核である。ｍＲＮＡは、核搬出シ
グナル（ＮＥＳ）を有する核タンパク質との複合体と同じ経路を介して搬出され
る。ＮＥＳを有するタンパク質の大部分は、ＲＮＡに結合し、そして細胞質まで
このＲＮＡに同伴するＲＮＡ結合タンパク質である。しかし、ＮＥＳを有する他
のタンパク質は、タンパク質の搬出において機能する；ＣＲＭ１（これは、他の
タンパク質上のＮＥＳ配列に結合し、そして核孔複合体と相互作用する）は、真
核生物細胞におけるタンパク質のＮＥＳ依存性核輸送の本質的なメディエーター
である。核の局在化および搬送シグナル（ＮＬＳおよびＮＥＳ）は、多くの重要
な分子（ｐ５３、ｖ−Ｒｅｌ、転写因子ＮＦ−ＡＴｃ、ｃ−Ａｂｌ非レセプター
チロシンキナーゼ、およびぜい弱Ｘ症候群の精神遅滞遺伝子産物を含む）上で見
出される。その正常な移入／搬出輸送の調節解除は、ヒトの疾患についての重要
な関連を有する。核の移入および搬出プロセスの両方は、ＮＬＳまたはＮＥＳペ
プチドとタンパク質との結合によって操作され得る。遺伝子治療の間、外来ＤＮ
Ａは、その転写のために核に侵入する必要がある。プラスミドおよびオリゴヌク
レオチドと、その核移入の必要条件としてＮＬＳを有する初期の核タンパク質と
の複合体形成を含む経路が、提唱される。オリゴヌクレオチドおよびプラスミド
へのＮＬＳペプチドの共有結合、またはプラスミドと、複数のＮＬＳペプチドを
有するタンパク質との複合体の形成は、その移入速度および遺伝子発現の効率を
増大すると提唱された（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，１９９８ｂ）。癌細胞は、その増大
した増殖速度およびタンパク質移入速度のために、一定期間に分化された細胞と
比較して、外来ＤＮＡを核により効率的に移入すると予測された。

【０１２１】 （抗悪性腫瘍薬） さらなる実施形態において、本明細書中に記載されるリポソームでカプセル化
されたプラスミドまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡは、カプセル化されたかまた
は遊離の抗悪性腫瘍薬と組み合わせて、腫瘍サイズを減少するため、またはその
増殖を制限するための用途をさらに含む。抗悪性腫瘍薬は、好ましくは以下であ
る：（ｉ）ビス−（２−クロロエチル）−アミン基を有するアルキル化剤（例え
ば、クロルメチン、クロラムブシル、メルファラン、ウラムスチン、マンノムス
チン、リン酸エクストラムスチン（ｅｘｔｒａｍｕｓｔｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔ
）、メクロレタミンオキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、またはト
リホスファミド）；（ｉｉ）置換されたアジリジン基を有するアルキル化剤（例
えば、トレタミン、チオテパ、トリアジコン、またはマイトマイシン）；（ｉｉ
ｉ）メタンスルホン酸エステル型のアルキル化剤（例えば、ブスルファン）；（
ｉｖ）アルキル化Ｎ−アルキル−Ｎ−ニトロソ尿素誘導体（例えば、カルムスチ
ン、ロムスチン、セムスチン、またはストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏ
ｔｏｃｉｎｅ））；（ｖ）ミトブロニトール、ダカルバジン、またはプロカルバ
ジン型のアルキル化剤；（ｖｉ）錯化剤（例えば、シスプラチン）；（ｖｉｉ）
葉酸型の代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート）；（ｖｉｉｉ）プリン誘導
体（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、チアミプリン
、ビダラビン、またはプロマイシン）およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ
インヒビター；（ｉｘ）ピリミジン誘導体（例えば、フルオロウラシル、フロク
スウリジン、テガフール、シタラビン、イドクスウリジン、フルシトシン）；（
ｘ）抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、
ミトラマイシン、ブレオマイシンまたはエトポシド）；（ｘｉ）ビンカアルカロ
イド；（ｘｉｉ）癌細胞中で過剰発現されるタンパク質のインヒビター（例えば
、テロメラーゼインヒビター、グルタチオンインヒビター、プロテアソームイン
ヒビター）；（ｘｉｉｉ）シグナル伝達経路のモジュレーターまたはインヒビタ
ー（例えば、ホスファターゼインヒビター、プロテインキナーゼＣインヒビター
、カゼインキナーゼインヒビター、インスリン様増殖因子−１レセプターインヒ
ビター、ｒａｓインヒビター、ｒａｓ−ＧＡＰインヒビター、タンパク質チロシ
ンホスファターゼインヒビター）；（ｘｉｖ）腫瘍血管形成インヒビター（例え
ば、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、オンコスタチン（ｏｎｃｏ
ｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、サリドマイド）；
（ｘｖ）免疫応答のモジュレーターおよびサイトカイン（例えば、インターフェ
ロン、インターロイキン、ＴＮＦ−α）；（ｘｖｉ）細胞外マトリックスのモジ
ュレーター（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター、ストロ
メリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）インヒビター、プラスミノゲンアクチベー
ターインヒビター）；（ｘｖｉｉ）ホルモン依存性の癌（乳癌、前立腺癌）につ
いてのホルモンモジュレーター（例えば、抗男性ホルモン、エストロゲン）；（
ｘｖｉｉｉ）アポトーシスレギュレーター；（ｘｉｘ）ｂＦＧＦインヒビター；
（ｘｘ）多剤耐性遺伝子インヒビター；（ｘｘｉ）癌細胞において過剰発現され
る抗原に対するモノクローナル抗体または抗体フラグメント（乳癌について抗Ｈ
ｅｒ２／ｎｅｕ）；（ｘｘｉｉ）抗癌遺伝子（この発現は、アポトーシスを引き
起こし、細胞サイクルを停止し、癌細胞に対する免疫応答を誘導し、腫瘍の血管
形成（すなわち、血管の形成）を阻害する）、腫瘍サプレッサー遺伝子（ｐ５３
、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ−２、ＭＤＲ−１、ｐ２１、ｐｌ６、ｂａ
ｘ、ｂｃｌ−ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ−Ｉ ＶＥＧＦ、アンギオスタチン、オンコ
スタチン、エンドスタチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、
ＩＬ−７、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α）；ならびに（ｘｘｉｉｉ）アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、Ｋ−ｒａｓ）
。必要に応じて、これらの薬物は、クロルメタミン、プレドニゾロン、プレドニ
ゾン、またはプロカルバジンと組み合わせて投与されるか、あるいは放射線治療
と組み合わされる。将来、兵器に追加される新しい抗癌剤は、リボザイム、三重
鎖形成オリゴヌクレオチド、遺伝子不活化オリゴヌクレオチド、細胞増殖または
シグナル伝達経路を制御する遺伝子に対して指向される多くの新しい遺伝子、お
よびシグナル伝達をブロックする化合物であることが予期される。

【０１２２】 抗癌剤としては、以下が挙げられる：アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコ
ダゾール、アクロニン、アドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、アドリアマイ
シン、遺伝子組換え型インターロイキン２、アルトレタミン、アンボマイシン、
酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール（
ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスパーリ
ン（ａｓｐｅｒｌｉｎ）、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマス
タット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）、ベンゾデパ、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔ
ａｍｉｄｅ）、塩酸ビサントレン、ビスナフィド（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ）ジメシ
レート、ビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）、硫酸ブレオマイシン、ナトリウム
ブレキナル、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、
カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、
カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）、セデフィンゴル（ｃｅｄｅｆｉｎｇｏ
ｌ）、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン（ｃｌａ
ｄｒｉｂｉｎｅ）、クリスナトールメシレート、シクロホスファミド、シタラビ
ン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキ
ソルマプラチン（ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）、デザグアニン、デザグアンン
メシレート、ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅ
ｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロキシフェン、ドロキ
シフェンシトレート、プロピオン酸ドロモスタノロン、ズアゾマイシン、エダト
レキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン（ｅｎｌ
ｏｐｌａｔｉｎ）、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エル
ブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナ
トリウム、エタニダゾール（ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）、エトポシド、リン酸エ
トポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール（ｆａｄｒｏｚｏｌｅ ｈｙｄｒｏ
ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン
酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン（ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂ
ｉｎｅ）、ホスキドン、ナトリウムホストリエシン、ゲムシタビン、塩酸ゲムシ
タビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、
インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−
ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−ｉ ａ、インターフェ
ロンγ−ｉ ｂ、イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）、塩酸イリノテカン
（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸ランレオチド（
ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ
）、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ ｈｙｄｒｏｃ
ｈｌｏｒｉｄｅ）、ナトリウムロメトレキソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ ｓｏ
ｄｉｕｍ）、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ
ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレ
タミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガ
リル、メルカプトプリン、メトトレキサート、ナトリウムメトトレキサート、メ
トプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン（ｍｉｔｏ
ｃｒｏｍｉｎ）、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミ
トーテン、塩酸ミトザントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイ
シン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ（ｐ
ｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイ
シン、ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ピポブロマン、ピポス
ルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン（ｐｌｏｍｅ
ｓｔａｎｅ）、ナトリウムポルフィマー（ｐｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍ）、
ポルフィロマイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プレドニムスチン、プレド
ニゾン、塩酸プロカルバジン、プロマイシン、塩酸プロマイシン、ピラゾフリン
（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）、リボプリン、ログレチミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉ
ｄｅ）、サフィンゴル（ｓａｆｉｎｇｏｌ）、塩酸サフィンゴル、セムスチン、
シムトラゼン、スパルフォス酸、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、
スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ス
ロフェヌル、タリソマイシン、タキソール、ナトリウムテコガラン（ｔｅｃｏｇ
ａｌａｎ ｓｏｄｉｕｍ）、テガフール、塩酸テロザントロン（ｔｅｌｏｘａｎ
ｔｒｏｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、テモポルフィン（ｔｅｍｏｐｏｒ
ｆｉｎ）、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグ
アニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン（ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）
、塩酸トポテカン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリ
ビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン
、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポ
ルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチ
ン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫
酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン
、ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビ
シン。

【０１２３】 他の抗癌剤としては、以下が挙げられる：２０−ｅｐｉ−１，２５ ジヒドロ
キシビタミンＤ３，５−エチニルウラシル、アビラテロン（ａｂｉｒａｔｅｒｏ
ｎｅ）、アクラルビシン、アシルフルベン（ａｃｙｌｆｕｌｖｅｎｅ）、アデシ
ペノール（ａｄｅｃｙｐｅｎｏｌ）、アドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、
遺伝子組換え型インターロイキン２、ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト、アルトレタ
ミン、アムバムスチン、アミドックス（ａｍｉｄｏｘ）、アミホスチン、アミノ
レブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アムルビシン（ａｍ
ｒｕｂｉｃｉｎ）、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール（ａｎａｓ
ｔｒｏｚｏｌｅ）、アンドログラホリド（ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）、
新脈管形成インヒビター、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリッ
クス（ａｎｔａｒｅｌｉｘ）、抗背方化形態形成タンパク質−１（ａｎｔｉ−ｄ
ｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、
抗男性ホルモン、抗エストロゲン、アンチネオプラストン（ａｎｔｉｎｅｏｐｌ
ａｓｔｏｎ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィジコリングリシネート
（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ ｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、アポトーシス遺伝子モジュ
レーター、アポトーシスレギュレーター、アプリン酸、ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−
ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）、
アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン（ａｘｉｎａｓｔａｔｉｎ）
１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン（ａｚａｓｅｔｒ
ｏｎ）、アザトキシン（ａｚａｔｏｘｉｎ）、アザチロシン（ａｚａｔｙｒｏｓ
ｉｎｅ）、バッカチン（ｂａｃｃａｔｉｎ）ＩＩＩ誘導体、バラノール（ｂａｌ
ａｎｏｌ）、バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタ
ゴニスト、ベンゾコリン（ｂｅｎｚｏｃｈｌｏｒｉｎｓ）、ベンゾイルスタウロ
スポリン（ｂｅｎｚｏｙｌｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、βラクタム誘導体、
β−アレチン（ｂｅｔａ−ａｌｅｔｈｉｎｅ）、ベタクラミシン（ｂｅｔａｃｌ
ａｍｙｃｉｎ）Ｂ、ベツリン酸（ｂｅｔｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ｂＦＧＦイ
ンヒビター、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビサントレン、ビス
アジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテン（ｂｉｓｔｒａｔｅｎｅ
）Ａ、ビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）、ブレフレート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）
、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン（ｂｕｔｈｉｏｎｉｎ
ｅ ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）、カルシポトリオール、カルホスチン（ｃａｌｐ
ｈｏｓｔｉｎ）Ｃ、カンプトセシン誘導体、カナリポックス（ｃａｎａｒｙｐｏ
ｘ）ＩＬ−２、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボキサミド−
アミノ−トリアゾール、カルボキサミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ Ｍ３、Ｃ
ＡＲＮ ７００、軟骨由来のインヒビター、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉ
ｎ）、カゼインキナーゼインヒビター（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン（ｃａ
ｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）、セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）Ｂ、セトロレ
リックス（ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）、クロリン、クロロキノキサリンスルホンア
ミド、シカプロスト、シス−ポルフィリン、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎ
ｅ）、クロミフェンアナログ、クロトリマゾール、コリスマイシン（ｃｏｌｌｉ
ｓｍｙｃｉｎ）Ａ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａ
ｓｔａｔｉｎ）Ａ４、コンブレタスタチンアナログ、コナゲニン（ｃｏｎａｇｅ
ｎｉｎ）、クランベシジン（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ）８１６、クリスナトー
ル、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）８、クリプトフィシンＡ誘
導体、クラシン（ｃｕｒａｃｉｎ）Ａ、シクロペンタアントラキノン（ｃｙｃｌ
ｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ）、シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌ
ａｔａｍ）、シぺミシン（ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ）、シタラビンオクフォスフェー
ト（ｏｃｆｏｓｆａｔｅ）、細胞溶解性因子、サイトスタチン（ｃｙｔｏｓｔａ
ｔｉｎ）、ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）、デシタビン、デヒドロジ
デンミン（ｄｅｈｙｄｒｏｄｉｄｅｍｎｉｎ）Ｂ、デスロレリン、デキシホスフ
ァミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、デキスラゾキサン、デクスベラパミル
（ｄｅｘｖｅｒａｐａｍｉｌ）、ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ジデ
ンニン（ｄｉｄｅｍｎｉｎ）Ｂ、ダイドックス（ｄｉｄｏｘ）、ジエチルノルス
ペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール、９−ジオキサマ
イシン（ｄｉｏｘａｍｙｃｉｎ）、ジフェニルスピロムスチン、ドコサノール（
ｄｏｃｏｓａｎｏｌ）、ドラセトロン（ｄｏｌａｓｅｔｒｏｎ）、ドキシフルリ
ジン、ドロキシフェン、ドロナビノール、ズオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙ
ｃｉｎ）ＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルフォシン、エドレコロマブ（
ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エフロルニチン、エレメン（ｅｌｅｍｅｎｅ）、エ
ミテフル（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）、エピルビシン、エプリステリド（ｅｐｒｉｓｔ
ｅｒｉｄｅ）、エストラムスチンアナログ、エストロゲンアゴニスト、エストロ
ゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン（ｅ
ｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、ファドロゾール（ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）、ファザラビン
、フェンレチニド、フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、フィナステリ
ド、フラボピリドール（ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）、フレゼラスチン（ｆｌｅ
ｚｅｌａｓｔｉｎｅ）、フルアステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）、フルダラ
ビン、塩酸フルオロダウノルビシン、ホルフェニメクス、ホルメスタン（ｆｏｒ
ｍｅｓｔａｎｅ）、ホストリエシン、フォテムスチン、ガドリニウムガリウムニ
トレートテキサフリン、ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ガニレリ
ックス（ｇａｎｉｒｅｌｉｘ）、ゼラチナーゼインヒビター、ゲムシタビン、グ
ルタチオンインヒビター、ヘプスルファム（ｈｅｐｓｕｌｆａｍ）、ヘレグリン
（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバ
ンドロン酸（ｉｂａｎｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、イダルビシン、イドキシフェ
ン（ｉｄｏｘｉｆｅｎｅ）、イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）、イル
モホシン、イロマスタット（ｉｌｏｍａｓｔａｔ）、イミダゾアクリドン（ｉｍ
ｉｄａｚｏａｃｒｉｄｏｎｅ）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、免疫賦活
剤ペプチド、インシュリン様増殖因子１レセプターインヒビター、インターフェ
ロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨウ
化ドキソルビシン、イポメアノール（ｉｐｏｍｅａｎｏｌ）、４−、イリノテカ
ン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）、イルソグラ
ジン、イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）、イソホモハリコンドリ
ン（ｉｓｏｈｏｍｏｈａｌｉｃｏｎｄｒｉｎ）Ｂ、イタセトロン（ｉｔａｓｅｔ
ｒｏｎ）、ジャスプラキノリド（ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、カハラリド
（ｋａｈａｌａｌｉｄｅ）Ｆ、ラメラリン（ｌａｍｅｌｌａｒｉｎ）−Ｎトリア
セテート、ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）、レイナマイシン（ｌｅｉｎ
ａｍｙｃｉｎ）、レノグラスチム（ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍ）、レンチナンサル
フェート、レプトルスタチン（ｌｅｐｔｏｌｓｔａｔｉｎ）、レトロゾール（ｌ
ｅｔｒｏｚｏｌｅ）、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリ
ド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾ
ール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）、直鎖状ポリアミンアナログ、親油性二糖類ペプチ
ド、親油性白金化合物、リソクリナミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７、
ロバプラチン（ｌｏｂａｐｌａｔｉｎ）、ロムブリシン（ｌｏｍｂｒｉｃｉｎｅ
）、ロメトレキソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）、ロニダミン、ロソキサントロ
ン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ロバスタチン、ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉ
ｂｉｎｅ）、ルルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、ルテチウムテクサフィリ
ン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）、リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）、溶解
性ペプチド、メイタンシン、マンノスタチン（ｍａｎｎｏｓｔａｔｉｎ）Ａ、マ
リマスタット（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）、マソプロコール、マスピン（ｍａｓｐ
ｉｎ）、マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）インヒビター、マトリクス金属
結合タンパク質分解酵素インヒビター、メノガリル、メルバロン（ｍｅｒｂａｒ
ｏｎｅ）、メテレリン（ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）、メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏ
ｎｉｎａｓｅ）、メトクロプラミド、ＭＩＦインヒビター、ミフェプリストン、
ミルテフォシン、ミリモスチム（ｍｉｒｉｍｏｓｔｉｍ）、ミスマッチ二本鎖Ｒ
ＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシンアナログ、ミトナフィド
、ミトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）線維芽細胞増殖因子−サポリン（ｓａｐ
ｏｒｉｎ）、ミトキザントロン、モファロテン（ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅ）、モル
グラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン、モノホスホリル脂質Ａ＋マイコバクテリウム細胞壁ｓｋ、モピ
ダモール、多剤耐性遺伝子インヒビター、多発性腫瘍サプレッサー１に基づく治
療、マスタード抗癌剤、ミカペルオキシド（ｍｙｃａｐｅｒｏｘｉｄｅ）Ｂ、マ
イコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン（ｍｙｒｉａｐｏｒｏｎｅ）、Ｎ−
アセチルジナリン、Ｎ−置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスティップ（
ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ
）、ナフテルピン（ｎａｐｈｔｅｒｐｉｎ）、ナルトグラスチム（ｎａｒｔｏｇ
ｒａｓｔｉｍ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、ネモルビシン（ｎｅ
ｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ネリドロン酸（ｎｅｒｉｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、中
性エンドペプチドプチターゼ、ニルタミド、ニサマイシン（ｎｉｓａｍｙｃｉｎ
）、一酸化窒素モジュレーター、ニトロオキシド抗酸化剤、ニトルリン（ｎｉｔ
ｒｕｌｌｙｎ）、Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン（ｏｋ
ｉｃｅｎｏｎｅ）、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、
オンダンセトロン、オラシン（ｏｒａｃｉｎ）、口腔サイトカインインデューサ
ー、オルマプラチン、オサテロン（ｏｓａｔｅｒｏｎｅ）、オキサリプラチン、
オキサウノマイシン（ｏｘａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉ
ｔａｘｅｌ）アナログ、パクリタキセル誘導体、パラウアミン（ｐａｌａｕａｍ
ｉｎｅ）、パルミトイルリゾキシン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｒｈｉｚｏｘｉｎ）、
パミドロン酸（ｐａｍｉｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、パナキシトリオール（ｐａ
ｎａｘｙｔｒｉｏｌ）、パノミフェン（ｐａｎｏｍｉｆｅｎｅ）、パラバクチン
（ｐａｒａｂａｃｔｉｎ）、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ（ｐｅｇａｓｐａ
ｒｇａｓｅ）、ペルデシン（ｐｅｌｄｅｓｉｎｅ）、ペントサンポリサルフェー
トナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）、ペ
ルフルブロン（ｐｅｒｆｌｕｂｒｏｎ）、ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａ
ｍｉｄｅ）、ペリリルアルコール（ｐｅｒｉｌｌｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、フェ
ナジノマイシン（ｐｈｅｎａｚｉｎｏｍｙｃｉｎ）、フェニルアセテート、ホス
ファターゼインヒビター、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピ
リトレキシム（ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ）、プラセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ、
プラセチンＢ、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター、白金錯体、白金化
合物、白金三アミン錯体、ポルフィマーナトリウム（ｐｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄ
ｉｕｍ）、ポルフィロマイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プロピルビスア
クリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソームインヒビター、プロテイン
Ａに基づく免疫モジュレーター、プロテインキナーゼＣインヒビター、プロテイ
ンキナーゼＣインヒビター、微小藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ．）、プロテイン
チロシンホスファターゼインヒビター、プリンヌクレオシドホスホリラーゼイン
ヒビター、プルプリン、ピラゾロアクリジン（ｐｙｒａｚｏｌｏａｃｒｉｄｉｎ
ｅ）、ピリドキサール化した（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌａｔｅｄ）ヘモグロビンポリ
オキシエチレン結合体、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉ
ｔｒｅｘｅｄ）、ラモセトロン（ｒａｍｏｓｅｔｒｏｎ）、ｒａｓファルネシル
プロテイントランスフェラーゼインヒビター、ｒａｓインヒビター、ｒａｓ−Ｇ
ＡＰインヒビター、脱メチル化したレテリプチン、レニウムＲｅ １８６エチド
ロン酸、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、リボザイム、ＲＩＩレチンアミド、
ログレチミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）、ロヒツツカイン（ｒｏｈｉｔｕｋｉ
ｎｅ）、ロムルチド、ロキニメクス、ルビギノン（ｒｕｂｉｇｉｎｏｎｅ）Ｂ１
、ルボキシル（ｒｕｂｏｘｙｌ）、サフィンゴール（ｓａｆｉｎｇｏｌ）、サイ
ントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトール（ｓａｒｃ
ｏｐｈｙｔｏｌ）Ａ、サルグラスチム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、Ｓｄｉ
１模倣物、セムスチン、老化誘導インヒビター１、センスオリゴヌクレオチド、
シグナル伝達インヒビター、シグナル伝達モジュレーター、単鎖抗原結合タンパ
ク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート（ｓｏｄｉｕｍ
ｂｏｒｏｃａｐｔａｔｅ）、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール（ｓｏｌ
ｖｅｒｏｌ）、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン（ｓｏｎｅｒｍｉｎ）
、スパルホ酸（ｓｐａｒｆｏｓｉｃ ａｃｉｄ）、スピカマイシン（ｓｐｉｃａ
ｍｙｃｉｎ）Ｄ、スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、スプレノペン
チン（ｓｐｌｅｎｏｐｅｎｔｉｎ）、スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔ
ｉｎ）１、スクアラミン（ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ）、幹細胞インヒビター、幹細
胞分裂インヒビター、スチピアミド（ｓｔｉｐｉａｍｉｄｅ）、ストロメリシン
（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）インヒビター、スルフィノニン（ｓｕｌｆｉｎｏｓ
ｉｎｅ）、過度活動性血管作用腸性ペプチドアンタゴニスト、スラディスタ（ｓ
ｕｒａｄｉｓｔａ）、スラミン、スワインソシン（ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ）、
合成グリコサミノグリカン、タリムスチン（ｔａｌｌｉｍｕｓｔｉｎｅ）、タモ
キシフェンメチオジド（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）、タウロ
ムスチン、タザロテン（ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ）、テコガランナトリウム（ｔｅ
ｃｏｇａｌａｎ ｓｏｄｉｕｍ）、テガフール、テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕ
ｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）、テロメラーゼインヒビター、テモポルフィン（ｔｅｍ
ｏｐｏｒｆｉｎ）、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テ
トラゾミン（ｔｅｔｒａｚｏｍｉｎｅ）、サリブラスチン（ｔｈａｌｉｂｌａｓ
ｔｉｎｅ）、サリドマイド、チオコラリン（ｔｈｉｏｃｏｒａｌｉｎｅ）、トロ
ンボポイエチン、トロンボポイエチン模倣物、チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆ
ａｓｉｎ）、サイモポイエチンレセプターアゴニスト、サイモトリナン（ｔｈｙ
ｍｏｔｒｉｎａｎ）、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン（ｔｉ
ｎ ｅｔｈｙｌ ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）、チラパラザミン（ｔｉｒａｐａ
ｚａｍｉｎｅ）、チタノセンジクロリド（ｔｉｔａｎｏｃｅｎｅ ｄｉｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、トプセンチン（ｔｏｐｓｅｎ
ｔｉｎ）、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳インヒビター、トレチノイン
、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン
（ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、トロピセトロン、ツロステリド（ｔｕｒｏｓｔｅ
ｒｉｄｅ）、チロシンキナーゼインヒビター、チルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔ
ｉｎ）、ＵＢＣインヒビター、ウベニメクス、尿生殖洞誘導増殖阻害因子、ウロ
キナーゼレセプターアンタゴニスト、バプレオチド、バリオリン（ｖａｒｉｏｌ
ｉｎ）Ｂ、ベラレゾール（ｖｅｌａｒｅｓｏｌ）、ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ
）、ベルジン（ｖｅｒｄｉｎｓ）、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ
）、ビノレルビン、ビンタクサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）、ビタキシン（
ｖｉｔａｘｉｎ）、ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ザノテロン（ｚａｎｏｔ
ｅｒｏｎｅ）、ゼニプラチン、ジラスコルブ、ジノスタチンスチマラマー（ｚｉ
ｎｏｓｔａｔｉｎ ｓｔｉｍａｌａｍｅｒ）。

【０１２４】 （ｐＨ感受性ペプチド−ＤＮＡ複合体） 本発明のさらなる実施形態において、プラスミドＤＮＡ中の遺伝子は、フソジ
ェニックペプチド／ＮＬＳ結合体と相互作用する状態にされる。さらなる実施形
態において、このＮＬＳ部分は、約５〜６のｐＨにおいて正味の正電荷を装い得
、そしてｐＨ７を超えるとこの電荷の低減または完全な消失を示し得るヒスチジ
ン残基のストレッチである。ｐＨ５〜６で達成される、これらの正に荷電するペ
プチドと負に荷電するプラスミドＤＮＡ分子との静電相互作用は、生理学的的ｐ
Ｈで減退される（ｐＨ感受性ペプチド−ＤＮＡ複合体）。

【０１２５】 本発明の第一の工程は、ｐＨ５．０〜６．０における、ヒスチジン／フソジェ
ニックペプチド結合体を有するプラスミドまたはオリゴヌクレオチドＤＮＡと１
０〜９０％エタノール中の脂質成分との間の複合体形成を包含する。この条件は
、ヒスチジン残基が正味の正電荷を有し、そしてプラスミド、オリゴヌクレオチ
ドまたは負に荷電した薬物と静電相互作用を達成し得る条件でなければならない
。同時に、この正に荷電した脂質分子の存在が、ミセルの形成を促進する。第二
の工程において、ミセルが水を用いた希釈、およびｐＨ５〜６での予め作製され
たリポソームまたは脂質との混合によってリポソームに変換される。この後に、
ｐＨ ７に対する透析および膜を介した押出が続き、非常に高収率でプラスミド
またはオリゴヌクレオチドをエントラップし、そしてカプセル化する。

【０１２６】 第一の工程におけるペプチドおよびカチオン性脂質の組成物は内側の二重層の
脂質を提供するが、第二工程で添加されるリポソームまたは脂質の型は、最終的
なリポソーム処方物の外側の被覆を提供する（図１）。ペプチドの処方物につい
ての例としては、以下が挙げられる：ＨＨＨＨＨＳＰＳＬ_１６（配列番号６２３
）、およびＨＨＨＨＨＳＰＳ（ＬＡＩ）_５（配列番号６２４）。

【０１２７】 これらは、モル比１：０．５：０．５（ＤＮＡ上の負の電荷：カチオン性リポ
ソーム：ヒスチジンペプチド）で添加される。このペプチドは、脂質二重層の内
部にαヘリックスコンフォメーションで挿し込み、そしてＤＮＡ凝縮を達成する
だけではなく、この複合体に膜融合特性を与え、この細胞膜を横切る出入りを改
善する。このペプチド鎖における疎水性アミノ酸の型（例えば、芳香族アミノ酸
の含有）は、この複合体の完全性および剛性を確保する際にペプチド鎖の長さ同
様に大変重要である。この複合体の外表をポリエチレングリコール、ヒアルロン
酸および脂質に結合した他のポリマーで被覆することによって、体液中での長時
間の循環特性ならびに固形腫瘍および静脈注射後のこれらの転移を標的化する能
力、ならびにまた、腫瘍細胞膜を通過する能力が、この粒子に与えられる。

【０１２８】 （ＮＬＳとフソジェニック部分との間のペプチド中のプロテアーゼ感受性結合
） （リポソームへのミセルの変換） 本発明の重要な結果は、エタノールの存在下における、リポソームへの、ＤＮ
Ａとカチオン性脂質との間に形成されたミセルの変換である。これは、予め形成
されたリポソームの水溶液にミセル複合体を直接添加することによってなされる
。このリポソームは、８０〜１６０ｎｍの平均サイズを有し、また逆も同様であ
り、１０％未満の最終エタノール濃度の溶液となる。薬学的用途のためならびに
ヒトおよび動物への注射のための用途に適切な処方物は、このリポソームがＰＥ
Ｇで被覆した天然成分（例えば、コレステロール、ＰＥ、ＰＣ）からなることを
必要とする。

【０１２９】 しかし、別の重要な局面は、本発明の研究への応用（例えば、培養物内におけ
る細胞のトランスフェクションのため）である。このリポーソーム水溶液の組成
は、カチオン性脂質を含み、そしてそれゆえ培養物中の細胞のトランスフェクシ
ョンに適切なリポソームの任意の型（例えば、ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ １：１）で
ある。これらのリポソームは、予め形成され、そして超音波または膜を介する押
出によって直径８０〜１６０ｎｍまでサイズダウンされる。次いで、このエタノ
ール性ミセル調製物は、エタノール溶液を１０％未満に同時希釈して、リポソー
ム水溶液に添加される。この工程は、さらなるＤＮＡの凝集、またはＤＮＡ上の
負に荷電したリン酸基と、脂質上の正荷電した基との相互作用を生じる。ＤＮＡ
上の負電荷の部分のみがミセル中の脂質によって中和されるように注意を払わな
ければならない。このＤＮＡの残余電荷の中和は、第二工程における予め形成さ
れたリポソームのカチオン性成分によって提供される。

【０１３０】 （調節性ＤＮＡおよび核マトリクス結合ＤＮＡ） 本発明のさらなる実施形態において、プラスミドＤＮＡ中の遺伝子は、ショッ
トガン選択アプローチを使用して核マトリクス結合ＤＮＡから単離された調節性
ＤＮＡ配列によって駆動される。

【０１３１】 クロマチンのコンパクトな構造構成および細胞内における個々の染色体の適切
な空間的配向は、この核マトリクスによって部分的に提供される。この核マトリ
クスは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質から構成され、そして核内の、ＤＮＡ
複製、遺伝子転写、ＤＮＡ修復、および染色体結合の部位として役割を果たす。
ＤＮＡ配列の多様なセットが、核マトリクスに結合することが見出され、そして
これらはマトリクス結合領域すなわちＭＡＲと称される。このＭＡＲは、多くの
機能の役割を果たし、遺伝子転写のアクチベーター、遺伝子発現のサイレンサー
、転写活性のインシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、核保持シグナル、およ
びＤＮＡの複製起点として作用する。現在の研究は、ＭＡＲの異なる部分集合が
異なる組織型の中に見出され、そして細胞の特定の機能を調節することを補助し
得ることを示す。このマトリクス中の、構造性分子および調節性分子のこの複合
体の組み合わせの存在、ならびにこのマトリクスに対するＤＮＡ複製および転写
複合体のインサイチュ局在は、核マトリクスが、核のプロセスにおける基礎的で
、独特な役割を担っていることを強く示唆する。ドメインへのゲノムの構造化は
、機能的に有意である。遺伝子移入ベクターにおける特定のＭＡＲエレメントの
取り込みは、多くの実験用途および遺伝子治療用途において有用性を有する。多
くの遺伝子治療用途は、長期間にわたる標的化された細胞型における１つ以上の
遺伝子の特定の発現を必要とする。ベクター内のＭＡＲは、導入された導入遺伝
子の転写を増強し得るか、その核内でのその配列の保持を延長し得るか、または
、同時形質導入された遺伝子の発現からその導入遺伝子の発現を絶縁し得る（Ｂ
ｏｕｌｉｋａｓ，１９９５；Ｂｏｄｅら，１９９６によって概説される）。

【０１３２】 種々の生化学的手順を使用して、遺伝子における調節領域を同定した。もとも
とは、調節性ＤＮＡ配列の同定および選択は、単調な手順（例えば、インビトロ
もしくはインビボでの転写因子のフットプリンティング、またはレポーター遺伝
子の上流のより大きいゲノムＤＮＡ配列からのより小さいフラグメントのサブク
ローニング）に依存する。これらの方法を主に使用して、遺伝子の５’末端の近
位の領域を同定した。しかし、多くの例において、調節領域は、この遺伝子の近
位５’末端から相当な距離で見出され、そして細胞型特異性および発生段階特異
性を与える。例えば、ＧｒｏｓｖｅｌｄおよびＥｎｇｅｌ（Ｌａｋｓｈｍａｎａ
ｎら、１９９９）のグループの研究は、ＧＡＴＡ−３遺伝子座の周辺の６２５ｋ
ｂを超えるゲノム配列は、トランスジェニックマウスにおけるこの遺伝子の正確
な発生的な発現にとって必要であることを示した。この遺伝子の５〜２０ｋｂ離
れた上流にある広範なＤＮＡストレッチが、発現の中枢神経系特異性の原因とな
ることが見出された。この遺伝子の２０ｋｂと１３０ｋｂとの間の上流領域は、
ＧＡＴＡ−３の尿性器特異的発現のための調節領域を保有したが、この遺伝子の
９０〜１８０ｋｂ下流の配列は、心臓内特異的な発現を与えた。

【０１３３】 ここで開示された方法は、調節性制御領域の迅速な同定の潜在能力を有してい
る。細胞において、クロマチンループが形成され、そして異なる結合領域が、異
なる細胞型または異なる発生段階において使用され、遺伝子の発現を調節する。
調節領域の核マトリクスへの結合に基づく、調節領域を単離するためのここで開
示された方法は、この遺伝子からの距離に関係なく調節領域を同定し得る。ヒト
ゲノム計画は、２０００年までにほとんど完成すると期待されるが、大多数の推
定された５００，０００個の調節領域の位置および性質についての情報は利用可
能ではない。

【０１３４】 （実施例１） プラスミドＤＮＡは、様々なカチオン性リポソームの処方物はもとより様々な
薬剤と縮合する。この縮合は、Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞培養物のトランスフェ
クション後のレポーターβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現レベルに影響を与え
る。リポソーム組成は、以下の表および図２において示される。全ての脂質は、
Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（７００ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐ
ａｒｋ Ｄｒｉｖｅ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ， ＡＬ ３５００７）製である。脂
質のＤＮＡに対する最適な比は、７ｎｍｏｌ総脂質／μｇＤＮＡであった。この
トランスフェクション試薬（７０ｎｍｏｌ総脂質を混合した１０μｇＤＮＡ）を
、小さな培養フラスコに移入し、その後１０ｍｌのＫ５６２細胞培養物を添加し
た（全部で約２００万細胞）；細胞とこのトランスフェクション試薬との混合は
、ＤＮＡをリポソームと混合した後の５〜１０分であった。細胞を、トランスフ
ェクション後１〜３０日間に幾度かβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイ
した。このトランスフェクトされた細胞を、正常細胞培養物として細胞培養物中
に維持した。

【０１３５】 最も良好な結果を、トランスフェクションのために使用された細胞が低い数に
あって、コンフルエンスの近くにない場合に得た。全ての実施形態において、こ
のトランスフェクションの材料を、血清および抗生物質の存在下で直接添加し、
トランスフェクション試薬の除去またはこの細胞の洗浄をしなかった。これは、
トランスフェクション手順を単純化し、そして、リンパ細胞培養物およびこのデ
ィッシュに付着せず懸濁物中で増殖する他の型の細胞培養物について適切である
。全てのＤＮＡ凝集薬剤を、Ｓｉｇｍａから購入した。これらを、水中で０．１
ｍｇ／ｍｌで懸濁した。プラスミドｐＣＭＶβは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入し
、そしてこれをＡｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ）のＡｎａｃｏｎｄａキットを使用して精製した。ポリＫは、ポリリジン
であり、これのｍｗは９，４００である。ポリＲは、ポリアルギニンである。ポ
リＨは、ポリヒスチジンである。

【０１３６】 １００μｌプラスミド溶液（１０μｇの総プラスミドＤＮＡ）に、２０μｌま
たは５０μｌのポリＫ、ポリＲ、ポリＨを添加した；この体積を、水を用いて２
５０μｌに調節し、その後約７０μｌのリポソーム（７ｎｍｏｌ／μｇ ＤＮＡ
）を添加した。１０分間〜１時間の２０℃でのインキュベーション後、このトラ
ンスフェクション混合物を、この細胞培養物と接触させた。最も良好なＤＮＡ凝
縮試薬は、良く知られているポリリジンと比較されるポリヒスチジンであった。
最も良好なカチオン性脂質は、ＤＣコレステロール（ＤＣ−ＣＨＯＬ：３β［Ｎ
−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール）であ
る。ＳＦＶは、β−ガラクトシダーゼを発現するＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ
ウイルスである。この結果を、図２に示す。

【０１３７】

【表３】 （実施例２） （遺伝子ビヒクル（リポジーン（Ｌｉｐｏｇｅｎｅ））を使用した腫瘍に対す
る遺伝子の標的化） 図３に示されるように、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウスにおける腫瘍
の標的化に、二つの部位で、ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞を皮下に移植した。この細
胞が、接種後約３０日で、大きく、測定可能な固形腫瘍を発達することを可能に
した。マウスに、この細菌性β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を保持する
動物当たり０．２ｍｇのプラスミドｐＣＭＶβ ＤＮＡ（プラスミドのサイズは
約４ｋｂである）を腹腔内に注射した。プラスミドＤＮＡ（２００μｇ、２．０
ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌ）を、以下の組成の２００μｌの中性リポソームと共に
５分間インキュベーションした：４０％コレステロール、２０％ジオレオイルホ
スホファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１２％パルミトイルオレオイル
ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１０％水素付加ダイズホスファチジルコリ
ン（ＨＳＰＣ）、１０％ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳ
ＰＥ）、５％スフィンゴミエリン（ＳＭ）および３％誘導体化小胞形成脂質Ｍ−
ＰＥＧ−ＤＳＰＥ。

【０１３８】 この段階において、中性（両性イオンの）リポソームとのプラスミドＤＮＡの
微弱な複合体化が生じる。これは、カチオン性リポソームの添加の次の工程にお
けるリポソームに対するプラスミドＤＮＡの一様な分布を確かなものとする。両
性イオンリポソームとのプラスミドＤＮＡの複合体化後、５０μｌのカチオン性
リポソーム（ＤＣ−Ｃｈｏｌ １μｍｏｌ／ｍｌ：ＤＯＰＥ １．４μｍｏｌ／
ｍｌ）を添加し、そして室温で１０分間インキュベーションした。この段階にお
いて、混合されたリポソーム集団が存在し、最も起こり得るものとして、両性イ
オン性脂質およびカチオン性脂質由来の脂質を含有するリポソーム−ＤＮＡ錯体
の型の形成が生じる。この材料は、動物の腹腔に注射される（全容量０．３５ｍ
ｌ）。注射後５日目において、この動物を屠殺し、この皮膚を除去し、そしてこ
の屠殺体をＸ−ｇａｌ染色溶液中に、３７℃で３０分間インキュベートした。こ
の動物を、約３０分間のＸ−ｇａｌ染色の際に、固定液中でインキュベートし（
１００μｌの濃厚なグルタルアルデヒドを、３０ｍｌのＸ−ｇａｌ染色溶液に添
加した）、染色溶液中でインキュベーションを継続した。写真を、インキュベー
ション期間中の時間的経過において撮り、β−ガラクトシダーゼ発現が生じる好
ましい器官を明らかにした。

【０１３９】 図３Ｅに示される腫瘍脈管構造標的化によって、このデータは、アンギオスタ
チン、エンドスタチンまたはオンコスタチンの遺伝子（これらの遺伝子産物は、
血管増殖を制限し、この腫瘍への血液供給を阻害する）の腫瘍への移入は、癌処
置について合理的なアプローチであると期待されることを意味する。また、腫瘍
標的化リポソームにカプセル化された薬物と共に抗癌リポジーンを使用する併用
療法は、合理的な癌治療方法と思われる。

【０１４０】 本発明は、上記の実施例と共に記載されるが、上記の記述およびそれに続く実
施例は、本発明の範囲を例示することを意図し、これを制限することを意図しな
いことが理解される。本発明の範囲にある、他の局面、利点および改変は、本発
明が属する技術における当業者にとって明らかである。

【０１４１】

【表４】

【０１４２】

【表５】

【０１４３】

【表６】

【０１４４】

【表７】

【０１４５】

【表８】

【０１４６】

【表９】

【０１４７】

【表１０】

【０１４８】

【表１１】 （参考文献） （米国特許書類） 米国特許第４，３９４，４４８号、１９８３年７月、Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．ら。

【０１４９】 同第４，５９８，０５１号、１９８６年７月、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏ
ｓら。

【０１５０】 同第５，０１３，５５６号、１９９１年５月、Ｗｏｏｄｌｅら。

【０１５１】 （学術論文）

【０１５２】

【表１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、癌標的化リポソーム複合体の構造を示す。

【図２】 図２は、Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞培養物のトランスフェクション後に、レポ
ーターβガラクトシダーゼ遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす際の種々の薬剤お
よび種々のカチオン性リポソームの処方物を用いたプラスミドＤＮＡ濃縮の結果
を示す。

【図３Ａ】 図３は、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍標的化を示す。図３Ａは、移入遺伝子の
発現を試験するためのＸ−Ｇａｌを用いた染色前および染色後の大および小のヒ
ト乳房腫瘍を有するＳＣＩＤマウスを示す。腫瘍の両方は、濃い青を示す。青色
の強さはβガラクトシダーゼ遺伝子の発現に対して比例する。

【図３Ｂ】 図３は、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍標的化を示す。図３Ｂは、小さい腫瘍の
最初の染色において、注射領域の皮膚および腸が、青くなる最初の器官であるこ
とを示す。

【図３Ｃ】 図３は、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍標的化を示す。図３Ｃは、動物の背中を
示す。２つの腫瘍は、皮膚の除去後を明瞭に視覚化する（上）。小さい腫瘍の濃
い染色および大きな腫瘍の明るい青の染色は、染色の最初の段階で明らかである
（下）。

【図３Ｄ】 図３は、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍標的化を示す。図３Ｄは、動物の前側を
示す。２つの腫瘍は、皮膚の除去後を明瞭に視覚化する。下の図の両腫瘍の濃い
染色は、染色中の後段階で明らかである。

【図３Ｅ】 図３は、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍標的化を示す。図３Ｅは、染色中の後段
階における両腫瘍の濃い染色のより高い倍率野を示す（前（上）および後（下）
）。小さい腫瘍の周りの脈管系の染色もまた見られ得る（下）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 48/00 ＺＮＡ Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 3/10 3/10 7/04 7/04 25/04 25/04 29/00 29/00 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA01 CA11 DA02 DA03 EA04 GA11 GA13 HA17 HA20 4C076 AA19 BB13 CC27 DD15H DD16E DD37E DD70H EE41N FF15 FF23 GG41 4C084 AA03 AA13 CA62 MA02 MA05 MA24 MA66 NA05 NA13 ZB261 ZB262

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 捕捉された治療因子を含むミセルを生成する方法であって： ａ）約２０％〜約８０％エタノール中で、有効量の負電荷治療因子と有効量の
   カチオン性脂質を、約３０％〜約９０％の負電荷原子が脂質分子上の正電荷によ
   り中和され、静電気的ミセル複合体を形成するような比で合わせる工程； ｂ）工程ａ）のミセル複合体と有効量のフソジェニック−親核性ペプチド結合
   体を、約０．０〜約０．３の範囲の比で合わせ、それによって、捕捉された治療
   因子を含むミセルを生成する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記負電荷治療因子が、ポリヌクレオチドおよび負電荷薬物
   からなる群より選択される治療因子である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 工程ａ）において、有効量のアニオン性脂質を合わせる工程
   をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記カチオン性脂質が、フソジェニック脂質ＤＯＰＥと、約
   １：１〜約２：１のモル比で合わされる、請求項１または２に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記フソジェニック−親核性ペプチドが、ＮＬＳペプチドで
   ある、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 工程ｂ）において、有効量のカプセル化脂質溶液を合わせる
   工程をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により生成される
   、捕捉された治療因子を含むミセル。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の方法により生成される治療因子がカプセル
   化された、リポソーム。
9. 【請求項９】 被験体に治療因子を送達する方法であって、請求項７または
   ８に記載の有効量のミセルを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
10. 【請求項１０】 治療的投与のための医薬の調製における、請求項１〜６の
    いずれか１項に記載の方法により獲得可能な治療因子をカプセル化したミセルの
    使用。