ES2945135T3 - Plataformas de suministro de antígenos - Google Patents

Abstract

Esta descripción proporciona plataformas para el suministro de proteínas del virus del herpes a las células, particularmente proteínas que forman complejos. En algunas realizaciones, estas proteínas y los complejos que forman provocan potentes anticuerpos neutralizantes. Por tanto, la presentación de proteínas del virus del herpes utilizando las plataformas descritas permite la generación de respuestas inmunitarias amplias y potentes útiles para el desarrollo de vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plataformas de suministro de antígenos

ANTECEDENTES

El virus del herpes se ha difundido ampliamente y causa un amplio intervalo de enfermedades en seres humanos que en el peor de los casos puede conducir a morbidez y mortalidad sustancial, principalmente en individuos inmunocomprometidos (por ejemplo, en receptores de trasplante e individuos infectados con VIH). Los humanos son susceptibles a la infección a través de al menos ocho virus del herpes. El virus del herpes simple 1 (VHS-1, VHH-1), virus de Herpes simple-2 (VHS-2, VHH-2) y virus de Varicela zoster (VVZ, VHH-3) son los virus de la subfamilia alfa, citomegalovirus (CMV, VHH-5) y Roseolovirus (VHH-6 y VHH-7) son virus de la subfamilia beta, virus de Epstein-Barr (VEB, VHH-4) y el virus del herpes asociado a sarcoma de Kaposi (VHSK, VHH-8) son virus de la subfamilia gama que infectan a humanos.

La infección por CMV conduce a una morbilidad y mortalidad sustancial en individuos inmunocomprometidos (por ejemplo, receptores de trasplantes e individuos infectados con VIH) e infección congénita que pueda resultar en defectos devastadores en el desarrollo neurológico en neonatos. Las glucoproteínas de envuelta gB, gH, gL, gM y gN del CMV representan candidatos de vacuna atractivos ya que se expresan en la superficie vírica y pueden provocar respuestas inmunes humorales neutralizantes del virus protectoras. Algunas estrategias de vacunas CMV se han dirigido a la glucoproteína de superficie principal B (gB), que puede inducir una respuesta de anticuerpo dominante. (Go y Pollard, JID 197:1631-1633 (2008)). La glucoproteína gB de CMV puede inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes, y una gran fracción de los anticuerpos que neutralizan la infección de los fibroblastos en suero de pacientes positivos CMV se dirige contra gB (Britt 1990). De forma similar, se ha informado que gH y gM/gN son dianas de la respuesta inmune a infección natural (Urban y col. (1996) J. Gen. Virol. 77 (Pt. 7):1537-47; Mach y col. (2000) J. Virol. 74(24):11881-92).

Los complejos de proteínas de CMV también son candidatos de vacuna atractivos porque parece que están implicados en procesos importantes en el ciclo de vida vírico. Por ejemplo, el complejo gH/gL/gO parece que tiene papeles importantes tanto en la entrada de fibroblastos como de células epiteliales/endoteliales. El modelo prevalente sugiere que el complejo gH/gL/gO media la infección de los fibroblastos. Los mutantes hCMV gO-nulos producen pequeñas placas de fibroblastos y virus a muy bajos títulos indicando el papel en la entrada (Dunn (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14223-28; Hobom (2000) J. Virol. 74:7720-29). Los recientes estudios sugieren que gO no se incorpora en los viriones con gH/gL, pero puede actuar como una chaperona molecular, aumentando la exportación de gH/gL del RE al aparato Golgi y la incorporación en los viriones (Ryckman (2009) J. Virol 82:60-70). A través de experimentos de búsqueda de pulso, se ha demostrado que pequeñas cantidades de gO permanecen unidas a gH/gL durante largos períodos de tiempo pero la mayor parte de los gO se disocian y/o se degradan del complejo gH/gL/gO, ya que no se encuentran en viriones extracelulares o se secretan de la célula. Cuando gO se elimina de una cepa clínica de CMV (TR) esas partículas víricas tienen cantidades significativamente reducidas de gH/gL incorporadas en el virión. Adicionalmente, gO eliminado del virus TR también inhibe la entrada en células epiteliales y endoteliales, sugiriendo que gH/gL también se requiere para la entrada de la célula epitelial/endotelial (Wille (2010) J. Virol. 84(5):2585-96).

gH/gLdel CMV también puede asociarse a UL128, UL130, y UL131A (denominado en el presente documento UL131) y formar un complejo pentamérico que se requiere para la entrada en varios tipos celulares, incluyendo células epiteliales, células endoteliales, y células dendríticas (Hahn y col. (2004) J. Virol. 78(18):10023-33; Wang y Shenk (2005) Proc. Natl. Acad. Sci USA 102(50):18153-8; Gerna y col. (2005). J. Gen. Virol. 84(Pt 6):1431-6; Ryckman y col. (2008) J. Virol. 82:60-70). En contraste, este complejo no se requiere para infección de fibroblastos. Los aislados hCMV de Laboratorio llevan mutaciones en el locus LTL128-LTL131, y surgen mutaciones en aislados clínicos después de solamente unos cuantos pasajes en los fibroblastos cultivados (Akter y col. (2003) J. Gen. Virol. 84(Pt 5): 1117-22). Durante la infección natural, el complejo pentamérico provoca que los anticuerpos que neutralizan la infección de las células epiteliales, las células endoteliales (y probablemente cualquier otro tipo celular en el que el complejo pentamérico media la entrada vírica) con muy alta potencia (Macagno y col. (2010) J. Virol. 84(2): 1005-13). También parece que los anticuerpos de este complejo contribuyen significativamente a la capacidad del suero humano de neutralizar la infección de las células epiteliales (Genini y col. (2011) J. Clin. Virol. 52(2):113-8).

El documento US 5.767.250 desvela procedimientos para fabricar ciertos complejos proteicos CMV que contienen gH y gL. Los complejos se producen mediante la introducción de un complejo de ADN que codifica gH y un montaje de ADN que codifica gL en una célula de tal forma que gH y gL se co-expresan.

El documento WO 2004/076645 describe moléculas de ADN recombinantes que codifican proteínas de CMV. De acuerdo con este documento, las combinaciones de distintas moléculas de ADN que codifican diferentes proteínas de CMV, pueden introducirse en células para provocar la co-expresión de las proteínas de CMV codificadas. Cuando gM y gN se co-expresaron en esta forma, formaron un complejo enlazado por disulfuro. Los conejos inmunizados con montajes de ^a Dⁿ que produjeron el complejo gM/gN o con el montaje de ADN que codificaba gB produjeron respuestas de anticuerpo neutralizante equivalentes.

Existe la necesidad de ácidos nucleicos que codifiquen dos o más proteínas del virus del herpes, de procedimientos de expresión de dos o más proteínas del virus del herpes en la misma célula y de procedimientos de inmunización que produzcan mejores respuestas inmunes.

Sumario de la invención

La invención es una composición que comprende una molécula de ARN autorreplicante y un sistema de administración de ARN como se define en la reivindicación 1.

Preferentemente, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteína como se reivindica en la composición de la invención no son la misma proteína o fragmentos de la misma proteína, y no son fragmentos unas de otras.

En un ejemplo de un montaje pentacistrónico, la primera secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un primer elemento de control, la segunda secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un segundo elemento de control, la tercera secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un tercer elemento de control, la cuarta secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un cuarto elemento de control y la quinta secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un quinto elemento de control. Los elementos de control presentes en el montaje (por ejemplo, primero, segundo, tercero, cuarto y quinto elementos de control) pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un promotor subgenómico, un IRES y un sitio 2A (por ejemplo, FMDV) vírico.

El virus del herpes puede ser VHS-1, 1, VHS-2, VVZ, VEB de tipo 1, VEB de tipo 2, CMV, VHH-6 de tipo A, VHH-6 de tipo B, VHH-7 y VHH-8. En ciertas realizaciones, el virus del herpes es CMV o VVZ.

Cuando la molécula de ARN autorreplicante incluida en la composición de la invención codifica proteínas VVZ, las proteínas pueden seleccionarse del grupo que consiste en gB, gE, gH, gI, gL y un fragmento (por ejemplo, de al menos 10 aminoácidos) de las mismas.

En una realización, cuando la molécula de ARN autorreplicante codifica proteínas de CMV, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas de CMV pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en gB, gH, gL; gO; gM, gN; UL128, UL130, LTL131 y un fragmento de una cualquiera de las anteriores. Preferentemente, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas de CMV no son la misma proteína o fragmentos de la misma proteína, ni fragmentos unas de otras. Los elementos de control pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un promotor subgenómico e IRES y un sitio 2A vírico.

En otra realización, la molécula de ARN autorreplicante incluida en la composición de la invención codifica la proteína gH del CMV o un fragmento de la misma, la proteína gL del CMV o un fragmento de la misma, el fragmento UL128 de la proteína UL128 del CMV, la proteína UL130 del CMV o un fragmento de la misma y la proteína UL131 del CMV o un fragmento de la misma.

En una realización, la molécula de ARN autorreplicante incluida en la composición de la invención es un replicón de alfavirus.

La composición de la invención contiene como sistema de suministro de ARN un liposoma, una nanopartícula polimérica, una nanoemulsión catiónica de aceite en agua o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la molécula de ARN de auto-replicación puede encapsularse en un liposoma.

La composición también puede comprender un adyuvante.

La invención también proporciona un procedimiento in vitro para formación de un complejo proteico, que comprende la administración de una composición de la invención a una célula, y el mantenimiento de la célula en condiciones adecuadas para la expresión del ARN autorreplicante, en el que se forma un complejo proteico.

La invención también proporciona una composición de la invención para uso en medicina, en particular, para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo. Preferentemente, la respuesta inmune inducida comprende la producción de anticuerpos anti-CMV neutralizantes. Más preferentemente, los anticuerpos neutralizantes son independientes del complemento.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un esquema de CMV que identifica complejos glucoproteicos conocidos implicados en la entrada de CMV en células diana. Las glucoproteínas de envuelta representan candidatos de vacuna atractivos ya que se expresan en la superficie vírica y pueden provocar las respuestas inmunes humorales neutralizantes del virus protectoras y de larga duración. Las glucoproteínas estructurales que median estos procesos pueden dividirse en dos clases; aquellas que se conservan en toda la familia del virus del herpes y aquellas que no. Entre las que se conservan están gB, gH, gL, gM y gN. Muchas de estas glucoproteínas forman complejos entre sí (gH/gL/±gO; gH/gL/UL128/UL130/UL131; gM/gN) para facilitar la localización de la superficie vírica y para llevar a cabo sus funciones en el acoplamiento vírico, la entrada y la fusión celular.

Las FIGS. 2A-2F son esquemas de montajes de CMV. La FIG. 2A, Esquema de los montajes gB (“gB FL”, gB de longitud completa; gB solubles “gB sol 750” y “gB sol 692”) descritos en el Ejemplo 1. Se construyeron dos versiones solubles diferentes de gB; gB sol 750 carece del dominio de extensión transmembrana y del dominio citoplasmático, gB sol 692 también carece de una región hidrófoba y es similar a gB sol según se describe en Reap et al. (2007) Clin. Vacc. Immunol. 14:748-55. La FIG. 2B, Esquema de los vectores de replicón gB usados para producir partículas de replicación vírica (VRP, por sus siglas en inglés). La FIG. 2C, Esquema de los montajes gH (“gH FL”, gH de longitud completa; gH soluble “gH sol”) descrito en el Ejemplo 1. Se construyó una versión soluble individual de gH que careció del dominio de extensión transmembrana. La FIG. 2D, Esquema de los vectores de replicón gH usados para producir VRP. La FIG. 2E, Esquema del montaje gL descrito en el Ejemplo 1. La FIG. 2F, Esquema del vector de replicón gL usado para producir VRP En las Figuras 2B, 2D y 2F, “NSP1”, “NSP2”, “NSP3”, y “NSP4”, son proteínas no estructurales alfavirus 1-4, respectivamente, requeridas para la replicación del virus.

Las FIGS. 3A y 3B muestran que ratones inmunizados con VRP gB (FL, sol 750, sol 692) o gH (FL, sol) indujeron respuestas de anticuerpo que fueron neutralizantes en presencia del complemento de cobayos. El ensayo de neutralización se realizó a través de la preincubación de las cepas del virus CMV TB40UL32E-GFP (que codifica la proteína fluorescente verde GFP mejorada, Sampaio et al. (2005) J. Virol. 79(5):2754-67), con suero de ratón y complemento de cobaya antes de la infección de las células epiteliales ARPE-19. Cinco días después de la infección, se determinó el número de células positivas GFP La FIG. 3A, Curvas de dilución de suero de todos los sueros analizados en células ARPE-19 en presencia de complemento. La FIG.

3B, Títulos de neutralización del 50% para las muestras de suero. Los virus incubados con suero preinmunizado dieron una baja neutralización a bajas diluciones (1:40-1:80). Los sueros gB (FL, sol 750, sol 692) tuvieron una muy fuerte actividad neutralizante con títulos del 50 % de neutralización entre 1:1800-1:2100. Todos los ratones inmunizados con gB produjeron un perfil de neutralización similar. Los sueros gH (FL, sol) tuvieron una actividad neutralizante con títulos del 50 % de neutralización alrededor de 1:160. Véase el Ejemplo 1.

La FIG. 4A es una ilustración esquemática de replicones monocistrónicos que codifican la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) o la proteína fluorescente roja (mCherry) y un replicón bicistrónico que codifica GFP y mCherry. “NSP1”, “NSP2”, “NSP3”, y “NSP4”, son proteínas 1-4 no estructurales de alfavirus, respectivamente. El sistema de replicón de alfavirus policistrónico se diseñó haciendo modificaciones al sistema replicón de alfavirus existente para acomodar múltiples promotores subgenómicos que dirigen los genes de interés.

La FIG. 4B son gráficas de fluorescencia que muestran el análisis FACS de células BHKV infectadas con VRP que contienen ARN mono- y bicistrónicos. Las VRP de alfavirus policistrónicas produjeron más células que expresan ambos genes de interés en cantidades aproximadamente iguales (GFP y mCherry; 72,48 %) que la co-infección de VRP GFP VRP mCherry (26,30 %). Véase el Ejemplo 2.

La FIG. 5A es una ilustración esquemática de la construcción de montajes de replicón de alfavirus policistrónico que codifica gH/gL y gH/gL/gO.

La FIG. 5B muestra que gH/gL forma un complejo in vitro. Las VRP que contienen replicones que codifican gH, gL, gO, gH/gL o gH/gL/gO se produjeron en células BHKV. Las VRP resultantes se usaron para infectar células ARPE-19 para demostrar la formación del complejo in vitro. Las células ARPE-19 infectadas con alfavirus se cosecharon y analizaron para la presencia de gH y gL. Las células ARPE-19 infectadas con VRP que codifican gH/gL produjeron complejos enlazados a disulfuro de gH/gL (véase en la ausencia de DTT, calor). gO no alteró detectablemente la asociación gH/gL. La gráfica del lado izquierdo muestra la expresión de la proteína gH. La gráfica de la derecha muestra la expresión de la proteína gL. Los marcadores de peso molecular se indican entre las transferencias. • = gH monomérico, • • = gL monomérico, < = heterodímero (gH gL), * = dímero de heterodímeros.

La FIG. 5C muestra la inmunoprecipitación de complejos gH y gH/gL de células BHKV infectadas con VRP La inmunoprecipitación se realizó usando anticuerpos IgG de ratón como un control (Carriles 2, 4, 7, y 10) o anticuerpos anti-gH de ratón (Genway) para inmunoprecipitar gH (Carriles 3, 5, 8, y 11). Las Transferencias Western se realizaron usando anticuerpos anti-gL de conejo y anticuerpos gH de conejo combinados. Los carriles 1, 6 y 9 muestran la proteína gH (banda superior ~75 kDa) y la proteína gL (banda inferior ~ 30 kDa) para referencia. Los carriles 2 y 3 son lisados infectados con gH-VRP El carril 2 muestra que el anticuerpo de control no inmunoprecipitó gH. El carril 3 muestra que el anticuerpo anti-gH inmunoprecipitó gH. Los carriles 4 y 5 son de lisados infectados con gL-VRP solamente. No se inmunoprecipitó ninguna proteína gH. Los carriles 7 y 8 son de lisados infectados con gH/gL-VRP bicistrónica. El carril 8 muestra que gL se inmunoprecipitó usando el anticuerpo gH. (Véase el asterisco). Los carriles 10 y 11 son de lisados infectados con gH/gL/gO-VRP tricistrónicas. El carril 11 muestra que gL se inmunoprecipitó usando el anticuerpo gH. (Véase el asterisco). Los marcadores de peso molecular también se muestran (MW). Véase el Ejemplo 3.

La FIG. 6 muestra que las VRP que afectan la formación del complejo gH/gL in vitro inducen potentes respuestas inmunes a CMV que son cualitativa y cuantitativamente superiores a las respuestas a VRP gB.

La FIG. 6A y FIG. 6B muestran curvas de dilución séricas para ratones inmunizados con VRP gH, gL, gO, gH gL, gH gL gO, gH/gL y gH/gL/gO en la neutralización de la infección TB40-UL32-EGFP de células ARPE-19 en presencia (FIG. 6A) o ausencia (FIG. 6B) del complemento. Se pre-incubaron diversas diluciones de suero con TB40UL32E-GFP en presencia o ausencia de complemento de cobayas y después se añadieron a células epiteliales ARPE-19. Después 5 días de infección con el virus, se contaron las células positivas a GFP La Figura 6C es una gráfica que muestra títulos del 50 % de neutralización obtenidos en presencia y ausencia del complemento. “3wp3”, tres semanas después de la tercera inmunización. Las VRP que expresan proteínas de CMV individuales (VRP gH, gL, gO o VRP gH, gL y gO coadministrados) no potenciaron la actividad neutralizante más allá de gH solo. En contraste, los sueros de ratones inmunizados con VRP gH/gL bicistrónicas o gH/gL/gO tricistrónicas demostraron respuestas neutralizantes potentes. Además, las respuestas de neutralización potentes fueron similares en presencia y ausencia del complemento de cobaya, mostrando que las VRP policistrónicas exitosamente indujeron una respuesta inmune independiente del complemento. Véase el Ejemplo 4.

La FIG. 7 muestra que las VRP que afectan la formación del complejo gH/gL in vitro indujeron anticuerpos que neutralizaron potentemente la infección de células de fibroblasto MRC-5. La Figura 7A muestra las curvas de dilución séricas para ratones inmunizados con VRP gH, gL, gO, gH gL, gH gL gO, gH/gL y gH/gL/gO en células MRC-5 en la ausencia del complemento. Se pre-incubaron diversas diluciones de sueros con TB40GFP en presencia o ausencia del complemento de cobaya y después se añadieron a las células de fibroblasto MRC-5. Después 5 días de infección con el virus, se contaron las células positivas a GFP La Figura 7B es una gráfica que muestra títulos del 50 % de neutralización obtenidos en el modelo de células de fibroblasto MRC-5 en ausencia del complemento. “3wp3”, tres semanas después de la tercera inmunización. Las VRP que expresan proteínas de CMV individuales (VRP gH, gL, gO o VRP gH, gL y gO coadministrados) no potenciaron la actividad neutralizante más allá de gH solo. En contraste el suero de ratones inmunizados con VRP gH/gL bicistrónica o gH/gL/gO tricistrónica demostró respuestas neutralizantes extremadamente potentes. Véase el Ejemplo 4.

Las FIGS. 8A y 8B son gráficos que muestran que los anticuerpos neutralizantes inducidos por el suministro de las VRP policistrónicas fueron anticuerpos de neutralización cruzada. Los sueros de ratones inmunizados con VRP gH/gL y gH/gL/gO fueron capaces de neutralizar las cepas clínicas TB40UL32E-GFP y VR1814 de CMV tanto en células epiteliales ARPE-19 (FIG. 8A) y de fibroblastos MRC-5 (FIG. 8B) en ausencia de complemento de cobayo en un ensayo de neutralización de IE-1.

La FIG. 9 es un gráfico que muestra que los anticuerpos neutralizantes producidos contra gH FL/gL son independientes del complemento y similares a la inmunidad natural en título. Los ratones fueron inmunizados con VRP gB FL o gH FL/gL a 1x106 IU, 3 veces, con una separación de 3 semanas antes del sangrado terminal. Los sueros se analizaron para su capacidad para neutralizar la infección de CMV TB40UL32E-EGFP de células ARPE-19 en presencia y ausencia de complemento de cobaya en un ensayo de neutralización. A diferencia de los anticuerpos producidos por gB, los anticuerpos producidos por gH FL/gL son independientes del complemento. Adicionalmente, los anticuerpos gH FL/gL en estos ratones vacunados fueron similares en concentración a aquellos encontrados en sujetos humanos naturalmente infectados.

La FIG. 10 muestra un mapa de plásmidos para gH-SGPgL-SGPgO modificado con pVCR.

La FIG. 11 muestra un mapa de plásmidos para gH-SGPgL modificado con pVCR.

La FIG. 12 muestra un mapa de plásmidos para gH sol-SGPgL modificado con pVCR.

La FIG. 13 muestra un mapa de plásmidos para gH sol-SGPgL-SGPgO modificado con pVCR.

La FIG. 14A-14G muestran la secuencia de nucleótidos del plásmido que codifica la molécula de ARN autorreplicante A160 que codifica la glucoproteína H (gH) de superficie de CMV y la glucoproteína L (gL) de superficie de CMV. Las secuencias de nucleótidos que codifican gH y gL están subrayadas.

Las FIGS. 15A-15H muestran la secuencia de nucleótidos del plásmido que codifica la molécula de ARN de auto-replicación A322 que codifica las formas solubles de la glucoproteína H (gHsol) de superficie de CMV y la glucoproteína L (gL) de superficie de CMV. Las secuencias de nucleótidos que codifican gHsol y gL están subrayadas.

Las FIGS. 16A-16H muestran la secuencia de nucleótidos del plásmido que codifica la molécula de ARN de auto-replicación A323 que codifica la glucoproteína B (gB) de superficie de CMV. La secuencia de nucleótidos que codifica gB está subrayada.

La FIG. 17A y 17B son histogramas que muestran títulos del 50 % de neutralización de sueros de ratones que se inmunizaron con VRP o ARN autorreplicante. La FIG. 17A muestra títulos neutralizantes del 50% contra la cepa humana de CMV TB40LTL32E-EGFP ("TB40) en células ARPE-19, y la FIG. 17B muestra títulos neutralizantes del 50% frente a la cepa 8819 de CMV humano en células ARPE-19.

La FIG. 18 es un esquema de replicones de ARN pentacistrónicos, A526, A527, A554, A555 y A556, que codifican cinco proteínas de CMV. Los promotores subgenómicos se muestran con flechas, otros elementos de control están marcados.

La FIG. 19 es un histograma de fluorescencia que muestra las células BHKV transfectadas con el replicón de ARN A527 que expresa el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131. La tinción de la célula se realizó usando anticuerpos que se unen a un epítopo conformacional presente en el complejo pentamérico (Macagno (2010) J. Virol. 84(2):1005-13).

La FIG. 20 es un esquema y un gráfico. El esquema muestra los replicones de ARN bicistrónicos, A160 y A531-A537, que codifican gH y gL de CMV. La gráfica muestra la actividad neutralizante del suero inmune de ratones inmunizados con VRP que contenían los replicones.

La FIG. 21 es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpo de la proteína anti-VVZ en el suero inmune de ratones inmunizados con replicones de ARN monocistrónicos que codifican proteínas VVZ o replicones de ARN bicistrónicos que codifican gE y gl, o gH y gL VVZ. Los ratones se inmunizaron con 7 |jg de ARN formulado con un CNE (véase el Ejemplo 7).

La FIG. 22 es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpo de la proteína anti-VVZ en el suero inmune de ratones inmunizados con replicones de ARN monocistrónicos que codifican proteínas VVZ o replicones de ARN bicistrónicos que codifican gE y gl, o gH y gL VVZ. Los ratones se inmunizaron con 1 jg de ARN formulado con un CNE (véase el Ejemplo 7).

Descripción detallada

La invención es como se define en las reivindicaciones.

La divulgación proporciona plataformas para coadministrar proteínas de virus del herpes, tal como proteínas de citomegalovirus (CMV), a células, particularmente proteínas que forman complejos in vivo. Estas proteínas y los complejos que forman logran anticuerpos neutralizantes potentes. La respuesta inmune producida por la coadministración de virus del herpes (por ejemplo, CMV), particularmente aquellas que forman complejos in vivo (por ejemplo, gH/gL), puede ser superior a la respuesta inmune producida usando otros enfoques. Por ejemplo, una molécula de ARN (por ejemplo, un replicón) que codifica tanto gH como gL de CMV pueden inducir mejores concentraciones neutralizantes y/o inmunidad protectora en comparación con una molécula de ARN que codifica gB y una molécula de ARN que codifica gH, una molécula de ARN que codifica gL, o incluso una mezcla de moléculas de ARN que individualmente codifican gH o gL. Además, un replicón que codifica gH/gL/UL128/UL130/UL131 puede proporcionar respuestas superiores a las que codifican solamente gH/gL.

En un aspecto general, la divulgación se refiere a plataformas para administrar dos o más proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) a células. Las plataformas comprenden moléculas de ácidos nucleicos policistrónicas recombinantes que contienen una primera secuencia que codifica una primera proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma, y una segunda secuencia que codifica una segunda proteína virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma. Si se desea, una o más secuencias adicionales que codifican proteínas adicionales, por ejemplo, una tercera proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma, una cuarta proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma, una quinta proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma, etc., pueden estar presentes en la molécula de ácido nucleico policistrónico recombinante. Las secuencias que codifican proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o fragmentos de las mismas están operativamente enlazadas a uno o más elementos de control adecuados de tal forma que las proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o fragmentos de las mismas se producen a través de una células que contiene el ácido nucleico policistrónico recombinante.

En los ácidos nucleicos policistrónicos descritos en la presente memoria, la primera y segunda proteínas de virus del herpes codificadas o fragmentos, y la tercera, cuarta, y quinta proteínas de virus del herpes codificadas o fragmentos, si están presentes, general y preferentemente son del mismo virus del herpes. En ciertos ejemplos, todas las proteínas de virus del herpes o fragmentos codificados por un vector policistrónico son proteínas de CMV o proteínas de VVZ.

Las moléculas de ácido nucleico policistrónicas recombinantes descritas en la presente memoria proporcionan la ventaja de suministrar secuencias que codifican dos o más proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) a una célula, y dirigen la expresión de las proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) a niveles suficientes para dar como resultado la formación de un complejo proteico que contiene las dos o más proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) in vivo. Usando este enfoque, las dos o más proteínas del virus del herpes (por ejemplo, c Mv ) codificadas pueden expresarse a suficientes niveles intracelulares para la formación de los complejos proteicos (por ejemplo, gH/gL) del virus del herpes (por ejemplo, CMV). Por ejemplo, las proteínas de virus del herpes codificadas (por ejemplo, CMV) o fragmentos de las mismas pueden expresarse sustancialmente al mismo nivel, o si se desea, a diferentes niveles mediante la selección de secuencias de control de expresión apropiadas (por ejemplo, promotores, IRES, sitio 2A, etc.). Esta es una forma significativamente más eficiente para producir complejos proteicos in vivo que a través del co-suministro de dos o más moléculas de ADN individuales que codifican diferentes virus del herpes (por ejemplo, CMV) en la misma célula, que puede ser ineficiente y altamente variable. Véase, por ejemplo, el documento WO 2004/076645.

La molécula de ácido nucleico policistrónica recombinante está basada en ARN. Cualquier ADN o ARN adecuado puede usarse como el vector de ácido nucleico que lleva los marcos de lectura abiertos que codifican las proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o fragmentos de las mismas. Los vectores de ácido nucleico adecuados tienen la capacidad de llevar y dirigir la expresión de más de un gen de proteína. Tales vectores de ácido nucleico son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ARN obtenido a partir de virus de ARN adecuados, tal como un alfavirus. Si se desea, la molécula de ácido nucleico policistrónica recombinante puede modificarse, por ejemplo, contener nucleobases modificadas y/o enlaces como se describe adicionalmente en el presente documento.

Se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico policistrónica que contiene una secuencia que codifica una gH del virus del herpes o un fragmento de la misma y una gL de virus del herpes o un fragmento de la misma. Las proteínas gH y gL, o fragmentos de las mismas, pueden ser de cualquier virus del herpes deseado tales como VHS-1, VHS-2, VVZ, VEB de tipo 1, VEB de tipo 2, CMV, VHH-6 de tipo A, VHH-6 de tipo B, VHH-7, VHSK, y similares. Preferentemente, el virus del herpes es VVZ, VHS-2, VHS-1, VEB (tipo 1 o tipo 2) o CMV. Más preferentemente, el virus del herpes es VVZ, VHS-2 o CMV. Incluso más preferentemente, el virus del herpes es CMV. Las secuencias de las proteínas gH y gL y de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de virus del herpes son bien conocidas en la técnica. Las secuencias ejemplares se identifican en la Tabla 1. La molécula de ácido nucleico policistrónica puede contener una primera secuencia de codificación de una proteína gH desvelada en la Tabla 1, o un fragmento de la misma, o una secuencia que es al menos aproximadamente un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, o un 99 % idéntica a la misma. La molécula de ácido nucleico policistrónica también puede contener una segunda secuencia que codifica una proteína gL desvelada en la Tabla 1, o un fragmento de la misma, o una secuencia que es al menos aproximadamente un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, o un 99 % idénticas a la misma.

En esta descripción de la divulgación, para facilitar una clara descripción de los ácidos nucleicos, los componentes de secuencias particulares se denominan una “primera secuencia”, una “segunda secuencia”, etc. Ha de comprenderse que la primera y la segunda secuencias pueden aparecer en cualquier orden y orientación deseados, y no se pretende establecer ningún orden u orientación particular por las palabras “primero”, “segundo”, etc. De forma similar, los complejos proteicos se denominan a través del listado de las proteínas que están presentes en los complejos, por ejemplo, gH/gL. Esto pretende describir el complejo a través de las proteínas que están presentes en el complejo y no indican cantidades relativas de las proteínas y el orden u orientación de las secuencias que codifican las proteínas en un ácido nucleico recombinante.

Ciertas realizaciones preferentes, tal como una molécula de ARN autorreplicante incluida en la composición de la invención que contiene secuencias que codifican proteínas CMV, se describen con más detalle en la presente memoria. Se pretende que las secuencias que codifican proteínas de CMV en tales realizaciones preferentes, puedan reemplazarse con secuencias que codifican proteínas, tal como gH y gL de otros virus del herpes.

Plataformas de VRP de Alfavirus

Las proteínas de CMV pueden administrarse a una célula usando partículas de replicón de alfavirus (VRP) que emplean replicones policistrónicos (o vectores) como se describe más adelante. El término “policistrónico” puede incluir vectores bicistrónicos así como vectores que comprenden tres o más cistrones. Los cistrones en un vector policistrónico pueden codificar proteínas de CMV de las mismas cepas de CMV o diferentes cepas de CMV. Los cistrones pueden orientarse en cualquier orden 5' - 3'. Cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de CMV puede usarse para producir la proteína. Las secuencias ejemplares útiles para preparar los ácidos nucleicos policistrónicos que codifican dos o más proteínas de CMV o fragmentos de las mismas se describen en el presente documento.

Como se usa en la presente memoria, el término “alfavirus” tiene su significado convencional en la técnica e incluye diversas especies tal como el virus de encefalitis equina venezolana (VEEV; por ejemplo, burro Trinidad, TC83CR, etc.), el Virus del bosque Semliki (SFV), el virus Sindbis, el virus del Río Ross, el virus de encefalitis equina del Oeste, el virus de encefalitis equina del Este, el virus Chikungunya, el virus S.A. AR86, el virus Everglades, el virus Mucambo, el virus del bosque Barmah, el virus Middelburg, el virus Pixuna, el virus O'nyong-nyong, el virus Getah, el virus Sagiyama, el virus Bebaru, el virus Mayaro, el virus Una, el virus Aura, el virus Whataroa, el virus Banbanki, el virus Kyzylagach, el virus Highlands J, el virus Fort Morgan, el virus Ndumu y el virus Buggy Creek. El término alfavirus también puede incluir alfavirus quiméricos (por ejemplo, como se describe por Perri y col., (2003) J. Virol. 77(19): 10394-403) que contienen secuencias genómicas de más de un alfavirus.

Una “partícula de replicón de alfavirus” (VRP) o “partícula de replicón” es un replicón de alfavirus empaquetado con proteínas estructurales de alfavirus.

Un “replicón de alfavirus” (o “replicón”) es una molécula de ARN que puede dirigir su propia amplificación in vivo en una célula diana. El replicón codifica la polimerasa o polimerasas que catalizan la amplificación de ARN (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) y contiene secuencias de ARN cis requeridas para la replicación cuando se reconocen y se utilizan por la polimerasa o polimerasas codificadas. Un replicón de alfavirus normalmente contiene los siguientes elementos ordenados: secuencias víricas 5' requeridas en cis para la replicación, secuencias que codifican proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activas (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), secuencias víricas 3' requeridas en cis para la replicación, y un tracto de poliadenilato. Un replicón de alfavirus también puede contener uno o más promotores de “región de unión” subgenómicos víricos que dirigen la expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas, que pueden modificarse con el fin de aumentar o reducir la transfección vírica del fragmento subgenómico y de la secuencia o secuencias heterólogas a expresar. Pueden usarse otros elementos de control, como se describe más adelante.

Los replicones de alfavirus que codifican proteínas de CMV se usan para producir VRP. Tales replicones de alfavirus comprenden secuencias que codifican al menos dos proteínas de CMV o fragmentos de las mismas. Estas secuencias están operativamente enlazadas a uno o más elementos de control, tal como un promotor subgenómico, un IRES (por ejemplo, EMCV, EV71), y un sitio 2A vírico, que pueden ser iguales o diferentes. La administración de componentes de estos complejos usando los vectores policistrónicos descritos en la presente memoria es una forma eficiente de proporcionar secuencias de ácido nucleico que codifican dos o más proteínas de CMV en cantidades relativas deseadas; mientras que si se usan múltiples montajes alfavirus para suministrar proteínas de CMV individuales para la formación del complejo, se requeriría la coadministración eficiente de VRP

Cualquier combinación de elementos de control adecuados puede usarse en cualquier orden. En un ejemplo, un promotor subgenómico individual está operativamente enlazado a dos secuencias que codifican dos proteínas de CMV diferentes, y un IRES se coloca entre las dos secuencias codificantes. En otro ejemplo, dos secuencias que codifican dos proteínas diferentes de CMV están operativamente enlazadas a promotores separados. En aún otro ejemplo, las dos secuencias que codifican dos proteínas diferentes de CMV están operativamente enlazadas a un solo promotor. Las dos secuencias que codifican dos diferentes proteínas de CMV se enlazan entre sí a través de una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio 2A vírico, y de esta forman codifican una sola cadena de aminoácidos que contiene las secuencias de aminoácido de ambas proteínas de CMV. El sitio 2A vírico en este contexto se usa para generar dos proteínas de CMV a partir de la poliproteína codificada.

Promotores subgenómicos

Los promotores subgenómicos, también conocidos como promotores de región de unión, pueden usarse para regular la expresión proteica. Los promotores genómicos alfavíricos regulan la expresión de las proteínas estructurales alfavíricas. Véase Strauss y Strauss, “The alphaviruses: gene expression, replication, and evolution”, Microbiol Rev. Sep de 1994; 58(3):491-562. Un polinucleótido policistrónico puede comprender un promotor subgenómico de cualquier alfavirus. Cuando están presentes dos o más promotores subgenómicos en un polinucleótido policistrónico, los promotores pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, el promotor subgenómico puede tener la secuencia CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA. Los promotores subgenómicos pueden modificarse con el fin de aumentar o reducir la transcripción vírica de las proteínas. Véase la Patente de EE.UU. N.° 6.592.874.

Sitio de entrada ribosómica interna (IRES)

Uno o más elementos de control puede ser un sitio de entrada ribosómica interna (IRES). Un IRES permite que se produzcan múltiples proteínas en un solo transcrito de ARNm como ribosomas que se unen a cada IRES e inician la traducción en la ausencia de una caperuza 5', que normalmente se requiere para iniciar la traducción de la proteína en células eucariotas. Por ejemplo, el IRES puede ser EV71 o EMCV.

Sitio 2A vírico

La proteína FMDV 2A es un péptido corto que sirve para separar las proteínas estructurales de FMDV de una proteína no estructural (FMDV 2B). El trabajo anterior sobre este péptido sugirió que actúa como una proteasa catalítica pero otros trabajos (por ejemplo, Donnelly y col., (2001), J.Gen.Virol. 82, 1013-1025) sugiere que esta corta secuencia y el siguiente aminoácido individual de FMDV 2B (Gly) actúan como la detención-inicio de la traducción. Independientemente del modo de acción preciso, la secuencia puede insertarse entre dos polipéptidos, y efectúa la producción de múltiples polipéptidos individuales de un solo marco de lectura abierto. En el contexto de esta divulgación, las secuencias FMDv 2A puede insertarse entre las secuencias que codifican al menos dos proteínas de CMV, permitiendo su síntesis como parte de un solo marco de lectura abierto. Por ejemplo, el marco de lectura abierto puede codificar una proteína gH y una proteína gL separadas por una secuencia que codifica un sitio 2A vírico. Un solo ARNm se transcribe entonces, durante la etapa de traducción, los péptidos gH y gL se producen de manera separada debido a la actividad del sitio 2A vírico. Cualquier secuencia vírica 2A adecuada puede usarse. Por lo general, un sitio 2A vírico comprende la secuencia consenso Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro, en la cual X es cualquier aminoácido. Por ejemplo, la secuencia del péptido de la Enfermedad de Boca-Manos-Pies del Virus 2A es DVESNPGP. Véase Trichas y col., “Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice”, BMC Biol. 2008 Sep 15;6:40, y Halpin et al., "Self-processing 2A-polyproteins--a system for co-ordinate expression of multiple proteins in transgenic plants," Plant J. 1999 Feb; 17(4):453-9.

El replicón de alfavirus puede ser un replicón quimérico, tal como el replicón quimérico VEE-Sindbis (VCR) o un replicón TC83 de la cepa VEE (TC83R) o un replicón quimérico TC83-Sindbis (TC83CR). Un VCR puede contener la señal de empaquetado y UTR 3' de un replicón Sindbis en lugar de las secuencias en nsP3 y en el extremo 3' del replicón VEE; véase Perri et al., J. Virol. 77, 10394-403, 2003. Un TC83CR contiene la señal de empaquetado UTR 3' de un replicón Sindbis en lugar de las secuencias del nsP3 y el extremo 3' de un replicón TC83 de una cepa VEE.

Producción de VRP

Los procedimientos para preparar VRP son bien conocidos en la técnica. Un alfavirus puede ensamblarse en una VRP usando una célula de empaquetado. Una “célula de empaquetado de alfavirus” (o “célula de empaquetado”) es una célula que contiene uno o más casetes de expresión proteicos estructurales de alfavirus y que produce partículas de alfavirus recombinantes después de la introducción de un replicón de alfavirus, el sistema de iniciación de vector estratificado eucariota (por ejemplo, Patente de los EE.UU. 5.814.482), o la partícula de alfavirus recombinante. El uno o más casetes proteicos estructurales de alfavirus diferentes sirven como “auxiliares” proporcionando las proteínas estructurales de alfavirus. Un “casete proteico estructural de alfavirus” es un casete se expresión que codifica una o más proteínas estructurales de alfavirus y comprende al menos una y hasta cinco copias (es decir, 1, 2, 3, 4, o 5) de una secuencia de reconocimiento de replicasa de alfavirus. Los casetes de expresión de proteínas estructurales típicamente comprenden, de 5' a 3', una secuencia 5' que inicia la transcripción del ARN del alfavirus, un promotor de la región subgenómica de alfavirus opcional, una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural de alfavirus, una región sin traducir 3' (que también dirige la transcripción de ARN), y un tracto poliA. Véase, por ejemplo, el documento WO 2010/019437.

Pueden usarse dos casetes proteicos estructurales de alfavirus diferentes (auxiliares defectuosos “de corte y empalme”) en una célula de empaquetado para minimizar los eventos de recombinación que podrían producir un virus competente de replicación. Un casete proteico estructural de alfavirus codifica la proteína cápside (C) pero ninguna de las glucoproteínas (E2 y E1). Alternativamente, un casete de proteína estructural de alfavirus puede codificar la proteína de la cápside y las glicoproteínas E1 o E2 (pero no ambas), o un casete de proteína estructural de alfavirus puede codificar las glicoproteínas E2 y/o E1 pero no la proteína de la cápside.

Las VRP se producen a través de la introducción simultánea de replicones y ARN auxiliares en células de varias fuentes. Bajo estas condiciones, por ejemplo, las células BHKV (1x107) se someten a electroporación a, por ejemplo, 220 voltios, 1000 |jF, 2 pulsos manualmente con 10 |jg de ARN de replicón: 6 |jg de ARN Cap auxiliar defectuoso: 10 |jg de ARN Gly auxiliar defectuoso, el sobrenadante que contiene el alfavirus se recolecta ~24 horas después. Los replicones y/o auxiliares también pueden introducirse en formas ADN que producen ARN adecuados dentro de las células transfectadas.

Una célula de empaquetado puede ser una célula de mamífero o una célula no de mamífero, tal como un insecto (por ejemplo, SF9) o una célula aviar (por ejemplo, fibroblasto o línea celular primaria de fibroblasto de pollo o pato ). Véase la Patente de EE.UU. 7.445.924. Las fuentes aviares de células pueden incluir, pero sin limitación, células madre embrionarias aviares tal como EB66® (VIVALIS); células de pollo, incluyendo células madre embrionarias de pollo tal como células EBx®, fibroblastos embrionarios de pollo, y células germinales embrionarias de pollo; células de pato tal como AGE1.CR y líneas celulares AGEl.CRpIX (ProBioGen) que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y documento WO2005/042728); y células de ganso. Una célula de empaquetado puede ser un fibroblasto primario de pato o una línea celular retinal de pato, tal como AGE.CR (PROBIOGEN).

Las fuentes de mamífero de las células para la introducción de ácido nucleico simultáneo y/o células de empaquetado incluyen, pero sin limitación, células de primate humano o no humano, incluyendo células PerC6 (PER.C6) (CRUCELL N.V.), que se describen, por ejemplo, en el documento WO 01/38362 y ^w O 02/40665, así como depositadas bajo el número de depósito ECACC 96022940); MRC-5 (ATCC CCL-171); WI-38 (ATCC CCL-75); células de pulmón de rhesus fetal (ATCC CL-160); células de riñón embrionario humano (por ejemplo, células 293, típicamente transformadas por ADN de tipo 5 de adenovirus cortado; células VERO de riñones de mono); células de caballo, vacas (por ejemplo, células MDBK), oveja, perro (por ejemplo, células MDCK de riñones de perro, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) o MDCK 33016, número de depósito DSM Ac C 2219 como se describe en WO 97/37001); gato, y roedor (por ejemplo, células de hámster tal como células BHK₂1-F, HKCC, o células de ovario de hámster Chino (CHO)), y pueden obtenerse una amplia diversidad de fases de desarrollo, incluyendo por ejemplo, adulto, neonatal, fetal y embrionario.

Una célula de empaquetado se transforma establemente con uno o más casetes de expresión proteicos estructurales. Los casetes de expresión proteicos estructurales pueden introducirse en las células usando técnicas de ADN recombinante convencionales, incluyendo transferencias de ADN medidas por policatión de transferrina, la transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposoma, transportación intracelular de perlas de látex recubiertas con ADN, fusión de protoplasto, infección vírica, electroporación, procedimientos de “pistola génica” y DEAE o transfección mediada por fosfato de calcio. Típicamente, los casetes de expresión de proteína estructural se introducen en una célula hospedadora como moléculas de ADN, pero también pueden introducirse como ADN transcrito in vitro. Cada casete de expresión puede introducirse de manera separada o sustancialmente de forma simultánea.

Las líneas celulares estables de empaquetado de alfavirus pueden usarse para producir partículas de alfavirus recombinantes. Existen células permisibles alfavirus que comprenden casetes de ADN que expresan un ARN auxiliar defectuoso establemente integrado en sus genomas. Véase, Polo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4598-603, 1999. Los ARN auxiliares se expresan constitutivamente pero las proteínas estructuradas de alfavirus no, debido a que los genes están bajo el control de un promotor subgenómico de alfavirus (Polo et al., 1999). Después de la introducción de un replicón de alfavirus en el genoma de unas células de empaquetado por transfección o infección VRP, se producen las enzimas replicasa y se activa la expresión de la cápside y los genes de glucoproteínas en los ARN auxiliares, y se producen las VRP de salida. La introducción del replicón puede obtenerse a través de una variedad de procedimientos, incluyendo tanto transfección como infección con reservas definidas de partículas de replicón de alfavirus. Esta célula empaquetado después se incuba bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para producir partículas de replicón de alfavirus empacadas en el sobrenadante del cultivo.

De esta forma, las células de empaquetado permiten que las VRP actúen como virus de autopropagación. Esta tecnología permite que las VRP sean producidas en su mayor parte en la misma forma, y usando el mismo equipo, como se usa para vacunas atenuadas vivas y otros vectores víricos que tienen líneas celulares productoras disponibles, tales como vectores de adenovirus incompetentes de replicación cultivados en células que expresan los genes E1A y E1B de adenovirus.

Puede utilizarse un procedimiento de dos etapas: la primera etapa comprende producir una reserva de semillas de partículas de replicón de alfavirus mediante la transfección de una célula de empaquetado con un ARN de replicón o un replicón con base en ADN de plásmido. Una reserva mucho mayor de partículas de replicón después se produce en una segunda etapa, mediante la infección de un cultivo fresco de células de empaquetado con la reserva de semillas. Esta infección puede llevarse a cabo usando varias multiplicidades de la infección (MOI, por sus siglas en inglés), incluyendo MOI=0,00001, 0,00005, 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 3, 5, 10 o 20. La infección puede llevarse a cabo a una MOI baja (por ejemplo, menor que 1). Con el tiempo, las partículas de replicón pueden cosecharse de las células de empaquetado infectadas con la reserva de semillas. Las partículas de replicón después pueden hacerse pasar en cultivos aún más grandes de células de empaquetado naive mediante la infección de baja multiplicidad repetida, dando como resultado preparaciones a escala comercial con el mismo título alto.

Plataformas de ARN de Auto-Replicación

Se producen proteínas de CMV a través de la expresión de ácidos nucleicos recombinantes que codifican las proteínas en las células de un individuo. Las moléculas de ácido nucleico recombinante pueden codificar dos o más proteínas de CMV, por ejemplo, son policistrónicas. Como se define anteriormente, “policistrónico” incluye bicistrónico. Los ácidos nucleicos que pueden administrarse a un individuo para causar la producción de proteínas de CMV son moléculas de ARN autorreplicante. Las moléculas de ARN autorreplicante de la composición de la invención se basan en ARN genómico del virus de ARN, pero carecen de los genes que codifican una o más proteínas estructurales. Las moléculas de ARN de auto-replicación son capaces de ser traducidas para producir proteínas no estructurales del virus de ARN y proteínas de CMV codificadas por el ARN de auto-replicación.

El ARN autorreplicante generalmente contiene al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en replicasa vírica, proteasas víricas, helicasas víricas y otras proteínas víricas no estructurales, y también comprende secuencias de replicación activas cis de extremo 5' y 3', y una secuencia heteróloga que codifica dos o más proteínas de CMV deseadas. Un promotor subgenómico que dirige la expresión de la secuencia o secuencias heterólogas puede incluirse en el ARN de auto-replicación. Si se desea, una secuencia heteróloga puede fusionarse en la estructura en otras regiones de codificación en el ARN de auto-replicación y/o puede estar bajo el control de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés).

Las moléculas de ARN autorreplicante como se describen en la presente memoria pueden diseñarse de tal forma que la molécula de ARN autorreplicante no puede inducir la producción de partículas víricas infecciosas. Esto puede lograrse, por ejemplo, omitiendo uno o más genes víricos que codifican proteínas estructurales que son necesarias para la producción de partículas víricas en el ARN de auto-replicación. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN de auto-replicación se basa en un virus alfa, tal como un virus Sindbis (SIN, por sus siglas en inglés), un virus del bosque Semliki y un virus de encefalitis equina Venezolano (VEE, por sus siglas en inglés), uno o más genes que codifican proteínas estructurales víricas, tales como cápside y/o glucoproteínas de envuelta, pueden omitirse. Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicante como se describen en la presente memoria pueden diseñarse para inducir la producción de partículas víricas infecciosas que están atenuadas o virulentas o para producir partículas víricas que son capaces de una sola ronda de la infección posterior.

Una molécula de ARN autorreplicante, cuando se suministra a una célula de vertebrado aún sin ninguna proteína, puede conducir a la producción de múltiples ARN hijos a través de la transcripción de sí mismo (o de una copia antisentido de sí mismo). El ARN de auto-replicación puede traducirse directamente después del suministro en la célula, y esta traducción proporciona una polimerasa de ARN dependiente de ARN, que después produce transcritos del ARN suministrado. De esta forma, el ARN suministrado conduce a la producción de múltiples ARN hijos. Estos transcritos son antisentido con relación al ARN suministrado y pueden traducirse a sí mismos para proporcionar la expresión in situ de la proteína de CMV, o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido como el ARN suministrado que se traduce para proporcionar la expresión in situ de la proteína o proteínas de CMV codificadas.

Un sistema adecuado para lograr la autorreplicante es usar un replicón de ARN a base de alfavirus, tal como un replicón de alfavirus como se describe en la presente memoria. Estos replicones de estructura de cadena se traducen después del suministro en la células para producir una replicasa (o replicasa-transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se auto-escinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de estructura de cadena - genómica de ARN suministrado de estructura de cadena . Estos transcritos de estructura de cadena -por sí mismos pueden transcribirse para dar copias adicionales del ARN progenitor de estructura de cadena y también para dar a uno o más transcritos sub-genómicos que codifican dos o más proteínas de CMV. La traducción del transcrito subgenómico de esta forma conduce a la expresión in situ de la proteína o proteínas de CMV a través de la célula infectada. Los replicones alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus del bosque Semliki, un virus de encefalitis equina del este, un virus de encefalitis equina de Venezuela, etc.

Una molécula de ARN autorreplicante preferente de esta forma codifica (i) una polimerasa de ARN dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) dos o más proteínas de CMV o fragmentos de las mismas. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende la proteína nsP4 de alfavirus. La proteína nsP4 es el componente catalítico clave de la replicasa.

Mientras los genomas de alfavirus naturales codifican proteínas de virión estructurales además de la poliproteína de replicasa no estructural, es preferente que una molécula de ARN autorreplicante a base de alfavirus como se describe en la presente memoria no codifique todas las proteínas estructurales de alfavirus. De esta forma el ARN de autoreplicación puede dar lugar a la producción de copias de ADN genómicas de sí misma en una célula, pero no la producción de viriones de alfavirus que contienen ARN. La incapacidad de producir estos viriones significa que, a diferencia del alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN de auto-replicación no puede perpetuarse a sí misma en la forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en virus de tipo silvestre están ausentes de los ARN autorreplicante de la divulgación y su lugar se toma por el gen o genes que codifican en el producto génico deseado (proteína de CMV o un fragmento de la misma), de tal manera que el transcrito subgenómico codifica el producto génico deseado en lugar de las proteínas de virión alfavirus estructurales.

De esta forma una molécula de ARN autorreplicante útil con la divulgación tiene dos secuencias que codifican diferentes proteínas de CMV o fragmentos de las mismas. Las secuencias que codifican las proteínas de CMV o fragmentos pueden estar en cualquier orientación deseada, y pueden estar operativamente enlazadas al mismo o separados promotores. Si se desea, las secuencias que codifican las proteínas de CMV o fragmentos pueden ser parte de un solo marco de lectura abierto. El ARN puede tener una o más secuencias adicionales (corriente abajo) o marcos de lectura abiertos, por ejemplo que codifican otras proteínas de CMV adicionales o fragmentos de las mismas. La molécula de ARN de auto-replicación puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.

En un aspecto, la molécula de ARN autorreplicante deriva de o se basa en un alfavirus, tales como un replicón de alfavirus como se define en la presente memoria. En otros aspectos, la molécula de ARN de auto-replicación deriva de o se basa en un virus diferente de un alfavirus, preferentemente, un virus de ARN de estructura de cadena positiva, y más preferentemente un picornavirus, flavivirus, rubivirus, pestivirus, hepacivirus, calicivirus, o coronavirus. Las secuencias de alfavirus de tipo silvestre adecuadas son bien conocidas y están disponibles de los depósitos de secuencias, tal como la Colección de Cultivo de Tipo Americano, Rockville, Md. Los ejemplos representativos de alfavirus adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368), el virus de Bebaru (ATCC VR-600, A^t CC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), el virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), el virus de encefalomielitis equina del Este (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), el virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), el virus Mayaro (ATCC VR-66; ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), el virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), el virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), el virus Ross River (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), del bosque Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), el virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalitis equina de Venezuela (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielitis de equino del Oeste (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926), e Y-62-33 (ATCC VR-375).

Las moléculas de ARN autorreplicante de la divulgación pueden contener uno o más nucleótidos modificados y por consiguiente tener estabilidad mejorada y ser resistentes a la degradación y la depuración in vivo, y otras ventajas. Sin desear quedar ligado a teoría alguna particular, se cree que las moléculas de ARN de auto-replicación que contienen nucleótidos modificados evitan o reducen la estimulación de los receptores inmunes endosómicos y citoplasmáticos cuando el ARN de auto-replicación se suministra en una célula. Esto permite que ocurra la autoreplicación, amplificación y expresión de la proteína. Esto también reduce las preocupaciones en cuanto a seguridad con relación al ADN autorreplicante que no contiene nucleótidos modificados, porque el ARN autorreplicante que contiene nucleótidos modificados reduce la activación del sistema inmune innato y las posteriores consecuencias indeseadas (por ejemplo, la inflamación en el sitio de inyección, irritación en el sitio de inyección, dolor y similares). También se cree que las moléculas de ARN producidas como un resultado de auto-replicación se reconocen como ácidos nucleicos foráneos a través de los receptores inmunes citoplasmáticos. De esta forma, las moléculas de ARN de auto-replicación que contienen nucleótidos modificados proporcionan la eficiente amplificación de ARN en una célula hospedadora y la expresión de las proteínas de CMV, así como efectos adyuvantes.

La secuencia de ARN puede modificarse con respecto a su uso de codón, por ejemplo, para aumentar la efectividad de la traducción y la vida media del ARN. Una cola poli A (por ejemplo, de aproximadamente 30 restos de adenosina o más) puede acoplarse al extremo 3' del ARN para aumentar su vida media. El extremo 5' del ARN puede taparse con una caperuza con un ribonucleósido modificado por la estructura m7G (5') ppp (5') N (estructura de caperuza 0) o un derivado del mismo, que puede incorporarse durante la síntesis del ADN o puede enzimáticamente modificarse después de la transcripción del ARN (mediante el uso de la enzima de Recubrimiento del Virus de Vacuna (VCE, por sus siglas en inglés) que consiste en trifosfatasa de ARNm, guanilil-transferasa y guanina-7-metilransferasa, que cataliza la construcción de estructuras de caperuza 0 N7-monometiladas). La estructura de caperuza 0 puede proporcionar estabilidad y efectividad en la traducción de la molécula de ARN. La caperuza 5' de la molécula de ARN además puede modificarse por una 2'-O-metiltransferasa que da como resultado la generación de una estructura de caperuza 1 (m7Gppp [m2 '-O] N), que puede además aumentar la eficacia de la traducción. Una estructura de sello 1 también puede aumentar la potencia in vivo.

Como se usa en la presente memoria, “nucleótido modificado” se refiere a un nucleótido que contiene una o más modificaciones químicas (por ejemplo, sustituciones) en o sobre la base nitrogenosa del nucleósido (por ejemplo, citosina (C), timina (T) o uracilo (U), adenina (A) o guanina (G)). Si se desea, una molécula de ARN autorreplicante puede contener modificaciones químicas en o sobre la fracción de azúcar del nucleósido (por ejemplo, ribosa, desoxirribosa, ribosa modificada, desoxirribosa modificada, análogo de azúcar de seis miembros, o análogo de azúcar de cadena abierta), o el fosfato.

Las moléculas de ARN autorreplicante pueden contener al menos un nucleótido modificado, que preferentemente no es parte de la caperuza 5' (por ejemplo, además de la modificación que es parte de la caperuza 5"). Por consiguiente, la molécula de ARN autorreplicante puede contener un nucleótido modificado en una sola posición, puede contener un nucleótido modificado particular (por ejemplo, pseudouridina, N6-metiladenosina, 5-metilcitidina, 5-metiluridina), en dos o más posiciones, o puede contener dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más nucleótidos modificados (por ejemplo, cada uno en una o más posiciones). Preferentemente, las moléculas de ARN de autoreplicación comprenden nucleótidos modificados que contienen una modificación en o sobre la base nitrogenosa, pero no contiene fracciones de azúcar o fosfato modificadas.

En algunos ejemplos, entre 0,001 % y 99 % o 100 % de los nucleótidos en una molécula de ARN autorreplicante son nucleótidos modificados. Por ejemplo, 0,001 % - 25 %, 0,01 %-25 %, 0,1 %-25 %, o 1 %-25 % de los nucleótidos en una molécula de ARN de auto-replicación son nucleótidos modificados.

En otros ejemplos, entre 0,001 % y 99 % o 100 % de un nucleótido no modificado particular en una molécula de ARN autorreplicante está reemplazado con un nucleótido modificado. Por ejemplo, aproximadamente el 1 % de los nucleótidos en la molécula de ARN de auto-replicación que contienen uridina puede modificarse, tal como a través del reemplazo de uridina con pseudouridina. En otros ejemplos, la cantidad deseada (porcentaje) de dos, tres, o cuatro nucleótidos particulares (nucleótidos que contienen uridina citidina, guanosina, o adenina) en una molécula de ARN de auto-replicación son nucleótidos modificados. Por ejemplo, 0,001 % - 25 %, 0,01 %-25 %, 0,1 %-25, o 1 %-25 % de un nucleótido particular en una molécula de ARN de auto-replicación son nucleótidos modificados. En otros ejemplos, 0,001 % - 20 %, 0,001 % -15 %, 0,001 % -10 %, 0,01 %-20 %, 0,01 %-15 %, 0,1 %-25, 0,01 %-10 %, 1 %20 %, 1 %-15 %, 1 %-10 %, o aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 % del nucleótido particular en una molécula de ARN de auto-replicación son nucleótidos modificados.

Es preferente que menos del 100 % de los nucleótidos en una molécula de ARN autorreplicante sean nucleótidos modificados. También se prefiere que menos del 10 % de un nucleótido particular en una molécula de ARN de autoreplicación sean nucleótidos modificados. De esta forma, las moléculas de ARN de auto-replicación preferidas comprenden al menos algunos nucleótidos no modificados.

Existen más de 96 modificaciones de nucleótido de existencia natural encontradas en el ARN de mamíferos. Véase, por ejemplo, imbach et al., Nucleic Acids Research, 22(12):2183-2196 (1994). La preparación de nucleótidos y nucleótidos modificados y nucleósidos es bien conocida en la técnica, por ejemplo, de las Patentes de la EE.UU. Números 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679, 5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642, y muchos nucleósidos modificados y nucleótidos modificados están disponibles en el mercado.

Las nucleobases modificadas pueden incorporarse en nucleósidos y nucleótidos modificados y pueden estar presentes en las moléculas de ARN que incluyen: m5C (5-metilcitidina), m5U (5-metiluridina), m6A (N6-metiladenosina), s2U (2-tiouridina), Um (2'-O-metiluridina), m1A (1-metiladenosina); m2A (2-metiladenosina); Am (2-1-0-metiladenosina); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina); i6A (N6-isopenteniladenosina); ms2i6A (2-metiltio-N6isopenteniladenosina); io6A (N6-(cishidroxiisopentenil) adenosina); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil) adenosina); g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-treonil carbamoiladenosina); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina); hn6A(N6-hidroxinorvalilcarbamoil adenosina); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2'-O-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); m1I (1-metilinosina); m'Im (1,2'-Odimetilinosina); m3C (3-metilcitidina); Cm (2T-Ometilcitidina); s2c (2-tiocitidina); ac4C (N4-acetilcitidina); f5C (5-fonnilcitidina); m5Cm (5,2-O5 10 152025 54 dimeti1citidina); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidina); k2C (lisidina); m1G (1-metilguanosina); m2G (N₂-metilguanosina); m7G (7-metilguanosina); Gm (2'-O-metilguanosina); m22G (N₂,N₂-dimetilguanosina); m2Gm (N₂,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N₂,N₂,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-Oribosilguanosina (fosfato)); iW (wibutosina); o2yW (peroxiwibutosina); OHyW (hidroxiwibutosina); OHyW* ( hidroxiwibutosina con escasa modificación); imG (wiosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galtactosil-queuosina); manQ (mannosil-queuosina); preQo (7-ciano-7-deazaguanosina); preQi (7-aminometil-7-deazaguanosina); G* (arcaeosina); D (dihidrouridina); m5Um (5,2'-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5-metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (ácido uridin 5-oxiacético); mcmo5U (éster metílico de ácido uridin 5-oxiacético); chm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina)); mchm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina metil éster); mcm5U (5-metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (5-metoxicarbonilmetil-2-O-metiluridina); mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5-metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetil uridina); ncm5Um (5-carbamoilmetil5 10152025552'-O-metiluridina); cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5-carboximeti1aminometil-2-L-Ometi1uridina); cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2'-O-metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3-metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-O-dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenosina); m2'7G (N₂,7-dimetilguanosina); m2'2'7G (N₂,N₂,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-Odimetiluridina); m5D (5-metildihidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-O-metilcitidina); m1Gm (1,2'-O-dimetilguanosina); m'Am (1,2-O-dimetil adenosina) irinometiluridina); tm5s2U (Staurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-demetil guanosina); imG2 (isoguanosina); ac6A (N6-acetiladenosina), hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, sus derivados 7-sustituidos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-(C1-C6)-alquiluracilo, 5-metiluracilo, 5-(C2-C6)-alqueniluracilo, 5-(C2-C6)-alquiniluracilo, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-(C1-C6 )-alquilcitosina, 5-metilcitosina, 5-(C2-C6)-alquenilcitosina, 5-(C2-C6)-alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N₂-dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8-azaguanina, 7-deaza-7-guanina sustituida, 7-deaza-7-(C2-C6)alquinilguanina, 7-deaza-8-guanina sustituida, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-deazapurina sustituida, 7-deaza-7-purina sustituida, 7-deaza-8-purina sustituida, hidrógeno (resto abásico), m5C, m5U, m6A, s2U, W, o 2'-O-metil-U. Una cualquiera o cualquier combinación de estas nucleobases modificadas puede incluirse en el ARN autorreplicante de la invención. Muchas de estas nucleobases modificadas y sus ribonucleósidos correspondientes están disponibles de proveedores comerciales.

Si se desea, la molécula de ARN autorreplicante puede contener enlaces de fosforoamidato, fosforotioato, y/o metilfosfonato.

Las moléculas de ARN autorreplicante que comprenden al menos un nucleótido modificado pueden prepararse usando cualquier procedimiento adecuado. Varios procedimientos adecuados son conocidos en la técnica para producir moléculas de ARN que contienen nucleótidos modificados. Por ejemplo, una molécula de ARN autorreplicante que contiene nucleótidos modificados puede prepararse transcribiendo (por ejemplo, transcripción in vitro) un ADN que codifica la molécula de ARN autorreplicante usando una polimerasa de ARN dependiente de ADN adecuada, tal como ARN polimerasa del fago T7, ARN polimerasa del fago SP6, ARN polimerasa del fago T3 y similares, o mutantes de estas polimerasas que permiten la incorporación eficiente de los nucleótidos modificados en las moléculas de ARN.

La reacción de transcripción contendrá nucleótidos y nucleótidos modificados, y otros componentes que soportan la actividad de la polimerasa seleccionada, tal como tampón adecuado y sales adecuadas. La incorporación de los análogos de nucleótidos en un ARN de auto-replicación puede modificarse, por ejemplo, para alterar la estabilidad de tales moléculas de ARN, para aumentar la resistencia frente a RNasas, para establecer la replicación después de la introducción en células hospedadoras apropiadas (“inefectividad” del ARN), y/o para inducir o reducir las respuestas inmunes innatas o adaptativas.

Los procedimientos sintéticos adecuados pueden usarse solos, o en combinación con uno o más otros procedimientos distintos (por ejemplo, tecnología de ADN o ARN recombinantes) para producir la molécula de ARN autorreplicante que contiene uno o más nucleótidos modificados. Los procedimientos adecuados para la síntesis de novo son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse para aplicaciones particulares. Los procedimientos ejemplares incluyen, por ejemplo, síntesis química usando grupos protectores adecuados tal como CEM (Masuda et al., (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51:3-4), el procedimiento p-cianoetil fosforoamidita (Beaucage S L et al. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); el procedimiento de nucleósido H-fosfonato (Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler B C et al. (1986) Nucl Acid Res 14:5399-407; Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney B L et al. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22). Estas químicas pueden llevarse a cabo o adaptarse para usarse con sintetizadores de ácido nucleico automatizados que están disponibles en el mercado. Los procedimientos sintéticos adecuados adicionales se describen en Uhlmann y col. (1990) Chem Rev 90:544-84, and Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165. La síntesis de ácido nucleico también puede llevarse a cabo usando procedimientos recombinantes adecuados que son bien conocidos y convencionales en la técnica incluyendo clonación, procesamiento y/o la expresión de polinucleótidos y productos génicos codificados por tales polinucleótidos. La transposición de ADN a través de fragmentación aleatoria y re-ensamblaje por PCR de fragmentos génicos y polinucleótidos sintéticos son ejemplos de técnicas conocidas que pueden usarse para diseñar y modificar secuencias de polinucleótido. La mutagénesis dirigida al sitio puede usarse para alterar los ácidos nucleicos y proteínas codificadas, por ejemplo, para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes de división, introducir mutaciones y similares. Los procedimientos adecuados para transcripción, traducción y expresión de secuencias de ácido nucleico son conocidos y convencionales en la técnica. (Véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; Bitter, et al., in Methods in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982; and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989).

La presencia y/o cantidad de uno o más nucleótidos modificados en una molécula de ARN autorreplicante puede determinarse usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, un ARN autorreplicante puede digerirse en monofosfatos (por ejemplo, usando nucleasa P1) y desfosforilarse (por ejemplo, usando una fosfatasa adecuada tal como CIAP), y los nucleósidos resultantes analizados a través de HPLC de fase inversa (por ejemplo, usando una columna YMC Pack ODS-AQ (5 micrómetros, 4,6 X 250 mm) y eluyendo usando un gradiente, 30 % de B (0-5 min) a 100 % de B (5 - 13 min) y a 100 % de B (13-40) min, caudal (0,7 ml/min), detección UV (longitud de onda: 260 nm), temperatura de columna (30 °C). Tampón A (20 mM de ácido acético - acetato de amonio pH 3,5), tampón B (20 mM de ácido acético - acetato de amonio pH 3,5 / metanol [90/10])).

El ARN autorreplicante está asociado a un sistema de distribución. El ARN de auto-replicación puede administrarse con o sin un adyuvante.

Sistemas de Suministro de ARN

Los ARN autorreplicante descritos en la presente memoria son adecuados para la administración en una diversidad de realizaciones, tal como la administración de ARN desnudo o en combinación con lípidos, polímeros u otros compuestos que facilitan la entrada en las células. Las moléculas de ARN autorreplicante pueden introducirse en células o individuos diana usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, a través de inyección directa, microinyección, electroporación, lipofección, biolísticos, y similares. La molécula de ARN de auto-replicación también puede introducirse en las células mediante endocitosis mediada por el receptor. Véase, por ejemplo la Patente de los EE. UU. Núm. 6.090.619; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 263: Chem., 263:14621 (1988); y Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850 (1991). Por ejemplo, la Patente de los EE. UU. Por ejemplo, la Patente de los EE. UU. Núm.

6.083.741 describe la introducción de un ácido nucleico exógeno en células de mamífero mediante la asociación del ácido nucleico a un resto del policatión (por ejemplo, poli-L-lisina que tiene 3-100 residuos de lisina), que por sí misma se acopla a un resto de unión del receptor de integrina (por ejemplo un péptido cíclico que tiene la secuencia Arg-Gly-Asp.

Las moléculas de ARN autorreplicante pueden suministrarse en células a través de anfífilos. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. Num. 6.071.890. Típicamente, una molécula de ácido nucleico puede formar un complejo con el anfífilo catiónico. Las células de mamífero en contacto con el complejo pueden tomarlo fácilmente.

El ARN autorreplicante de la composición de la invención se administra en combinación con un sistema de administración, tal como un sistema de administración de partículas o emulsiones. Un gran número de sistemas de distribución son bien conocidos por el experto en la materia. Tales sistemas de distribución incluyen, por ejemplo, administración a base de liposoma (Debs and Zhu (1993) documento WO 93/24640; Mannino and Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose Patente de los EE. UU. Núm. 5.279.833; Brigham (1991) documento WO 91/06309; y Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414), así como el uso de vectores víricos (por ejemplo, adenovírico (véase, por ejemplo, Berns et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: 95-104; Ali et al. (1994) Gene Ther. 1: 367-384; y Haddada y col. (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199 (Pt 3): 297-306 para revisión), papilomavírico, retrovírico (véase, por ejemplo, Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann y col. (1992) J. Virol. 66 (5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson y col. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); Wong-Staal et al., PCT/US94/05700, y Rosenburg and Fauci (1993) in Fundamental Immunology, Third Edition Paul (ed) Raven Press, Ltd., New York y sus referencias, y Yu et al., Gene Therapy (1994) supra.), y vectores víricos adeno-asociados (véase, West et al. (1987) Virology 160:38-47; Carter y col. (1989) Patente de los EE. UU. Núm. 4.797.368; Carter et al. WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94:1351 y Samulski (supra) para una revisión de los vectores AAV; véase también, Lebkowski, Patente de los EE. UU. Núm. 5.173.414; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260; Tratschin, y col. (1984) Mol. Cell. Biol., 4:2072-2081; Hermonat and Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; McLaughlin y col. (1988) y Samulski y col. (1989) J. Virol., 63:03822-3828), y similares.

Tres sistemas de administración particularmente útiles son (i) liposomas, (ii) micropartículas de polímero no tóxicas y biodegradables, y (iii) emulsiones de aceite en agua submicrométricas catiónicas.

Liposomas

En una realización, el sistema de administración de ARN incluido en la composición de la invención es un liposoma.

Diversos lípidos anfífilos pueden formar bicapas en un entorno acuoso para encapsular un centro acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo principal hidrófilo aniónico, catiónico o zwitteriónico. La formación de liposomas de fosfolípidos aniónicos data de los 60 y los lípidos formadores de liposomas catiónicos han sido estudiados desde los 90. Algunos fosfolípidos son aniónicos mientras otros son zwitteriónicos. Las clases de fosfolípidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolípidos útiles se listan en la Tabla 2. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleiloxi-N,Ndimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Los lípidos zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a lípidos acil zwitteriónicos y lípidos éter zwitteriónicos. Los ejemplos de lípidos zwitteriónicos son DPPC, DOP^c y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden estar saturados o insaturados.

Los liposomas pueden formarse a partir de un solo lípido o de una mezcla de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos aniónicos (ii) una mezcla de lípidos catiónicos (iii) una mezcla de lípidos zwitteriónicos (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwitteriónicos (vi) una mezcla de lípidos zwitteriónicos y lípidos catiónicos o (vii) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwitteriónicos. De forma similar, una mezcla puede comprender tanto lípidos saturados como insaturados. Por ejemplo, una mezcla una mezcla puede comprender DSPC (zwitteriónico, saturado) DlinDMA (catiónico, insaturado), y/o DMPG (aniónico, saturado). Cuando se usa una mezcla de lípidos, no todos los lípidos componentes en la mezcla deben ser anfífilos, por ejemplo, uno o más lípidos anfífilos pueden mezclarse con colesterol.

La porción hidrófila de un lípido puede estar PEGilada (es decir, modificada por un acoplamiento covalente de un polietilenglicol). Esta modificación puede aumentar la estabilidad y prevenir la absorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos pueden conjugarse con PEG usando técnicas como las desveladas en Heyes et al. (2005) J Controlled Release 107:276-87.

Una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMPG y colesterol puede usarse para formar liposomas. Un aspecto separado de la divulgación es un liposoma que comprende DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol. Este liposoma preferentemente encapsula ARN, tal como un ARN autorreplicante, por ejemplo, que codifica un inmunógeno.

Los liposomas habitualmente se dividen en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV, por sus siglas en inglés); vesículas unilaminares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés); y vesículas unilaminares grandes (LUV, por sus siglas en inglés). Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. SUV y LUV tienen una sola bicapa que encapsula un núcleo acuoso; las SUV típicamente tienen un diámetro de < 50 nm, y las LUV tienen un diámetro de >50 nm. Los liposomas útiles con la composición de la invención son idealmente LUV con un diámetro de intervalo de 50-220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) al menos un 80 % en número deberá tener diámetros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diámetro promedio (Zav, por intensidad) de la población está idealmente en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) el diámetro deberá tener un índice de polidispersidad de <0,2.

Las técnicas para preparar liposomas adecuados son bien conocidas en la técnica, por ejemplo véase Liposomes: Methods and Protocols, Volumen 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols, (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X; Liposome Technology, volúmenes I, II y III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006; y Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds.

Arshady & Guyot). Citus Books, 2002. Un procedimiento útil implica el mezclado (i) de una solución etanólica de los lípidos, (ii) una solución acuosa de ácido de nucleico y (iii) tampón, seguido por el mezclado, equilibrio, dilución y purificación (Heyes y col. (2005) J Controlled Release 107:276-87.).

El ARN preferentemente se encapsula dentro de unos liposomas, y así el liposoma forma una capa exterior alrededor de un núcleo que contiene el ARN acuoso. Esta encapsulación se ha encontrado que protege el ARN de la digestión por RNasa. Los liposomas pueden incluir algún ARN externo (por ejemplo, en la superficie de los liposomas) pero preferentemente, se encapsula al menos la mitad del ARN (e idealmente sustancialmente todo este).

Micropartículas poliméricas

Diversos polímeros pueden formar micropartículas para encapsular o adsorber ARN. El uso de un polímero sustancialmente no tóxico significa que un receptor puede de manera segura recibir las partículas, y el uso de un polímero biodegradable significa que las partículas pueden metabolizarse después del suministro para evitar la persistencia a largo plazo. Los polímeros útiles también son esterilizables para ayudar en la preparación de las formulaciones de clase farmacéutica.

Los polímeros no tóxicos y biodegradables adecuados incluyen, pero sin limitación, ácidos poli(a-hidroxi), ácidos polihidroxi butíricos, polilactonas (incluyendo policaprolactonas), polidioxanonas, polivalerolactona, poliortoésteres, polianhídridos, policianoacrilatos, policarbonatos derivados de tirosina, polivinil-pirrolidinonas o poliéster amidas, y combinaciones de los mismos.

Las micropartículas pueden estar formadas por ácidos poli(a-hidroxi), tal como poli(lactidas) (“PLA”), copolímeros de lactida y glicolida tal como poli (D,L-lactida-co-glicolida) (“PLG”), y copolímeros de D,L-lactida y caprolactona. Los polímeros PLG útiles incluyen aquellos que tienen una proporción molar de lactida/glicolida en el intervalo de, por ejemplo 20:80 a 80:20 por ejemplo 25:75, 40:60, 45:55, 55:45, 60:40, 75:25. Los polímeros PLG útiles incluyen aquellos que tienen un peso molecular entre, por ejemplo, 5.000-200.000 Da por ejemplo entre 10.000-100.000, 20.000-70.000, 40.000-50.000 Da.

Las micropartículas idealmente tienen un diámetro en el intervalo de 0,02 μm a 8 μm. Para una composición que comprende una población de micropartículas con diferentes diámetros al menos 80 % en número deberán tener diámetros en el intervalo de 0,03-7 μm.

Las técnicas para preparar micropartículas adecuadas son bien conocidas en la técnica, véase por ejemplo Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002; Polymers in Drug Delivery. (eds. Uchegbu & Schatzlein). CRC Press, 2006. (en particular capítulo 7) y Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines. (eds. Cohen & Bernstein). CRC Press, 1996. Para facilitar la absorción del ARN, una micropartícula puede incluir un agente tensioactivo catiónico y/o lipídico, por ejemplo, como se describe en O'Hagan y col. (2001) J Virology 75:9037-9043; y Singh et al. (2003) Pharmaceutical Research 20: 247-251. Una forma alternativa de fabricar micropartículas poliméricas es por moldeo y curación, por ejemplo, como se describe en el documento WO2009/132206.

Las micropartículas pueden tener un potencial zeta de entre 40-100 mV. El ARN puede adsorberse en las micropartículas, y la adsorción se facilita mediante la inclusión de materiales catiónicos (por ejemplo, lípidos catiónicos) en la micropartícula.

Emulsiones catiónicas de aceite en agua

Las emulsiones de aceite en agua son conocidas por adyuvantar las vacunas de la gripe, por ejemplo, el adyuvante MF59™ en el producto FLUAD™ y el adyuvante a S03 en el producto PREPANDRIX™. El suministro de la Ar N puede obtenerse con el uso de una emulsión de aceite en agua, siempre que la emulsión incluya una o más moléculas catiónicas. Por ejemplo, un lípido catiónico puede incluirse en la emulsión para proporcionar una superficie de gotículas positivamente cargadas a la cual se puede acoplar el ARN negativamente cargado.

En una realización, el sistema de administración de ARN incluido en la composición de la invención es una nanoemulsión catiónica de aceite en agua.

La emulsión comprende uno o más aceites. El aceite o aceites adecuados incluyen aquellos de, por ejemplo, un animal (tal como un pez) o una fuente vegetal. El aceite idealmente es biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Las fuentes para aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nueces. El aceite de jojoba puede usarse, por ejemplo, obtenido de la judía de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceites del cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también pueden usarse el aceite de otros granos de cereal tal como de trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propandiol, a pesar de que no existen de forma natural en los aceites de semilla, pueden prepararse a través de hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de nuez y semilla. Las grasas y los aceites de leche de mamífero son metabolizables y por lo tanto pueden usarse. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica.

La mayor parte de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado bacalao, aceite de hígado de tiburón, y aceite de ballena tal como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden usarse en la presente memoria. Un número de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoides. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también puede usarse. Los aceites de pescado, que incluyen escualeno y escualano están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden obtenerse a través de procedimientos conocidos en la técnica.

Otros aceites útiles son los tocoferoles, particularmente en combinación con escualeno. Donde la fase oleosa de una emulsión incluye tocoferol, cualquiera de los tocoferoles a, p, ^y, 5, £ o ^ puede usarse, pero se prefieren los atocoferoles. D-a-tocoferol y DL-a-tocoferol ambos pueden usarse. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol. Puede usarse una combinación de aceites que comprende escualeno y tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol).

Las emulsiones preferentes comprenden escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide insaturado ramificado (C30H50; [(CH₃)₂C[=CHCH₂CH₂C(CHa)]2=CHCH₂-]2; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9).

El aceite en la emulsión puede comprender una combinación de aceites, por ejemplo, escualeno y al menos un aceite adicional.

El componente acuoso de la emulsión puede ser agua simple (por ejemplo, w.f.i.) o puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampón, por ejemplo, sales de citrato o fosfato, tales como sales de sodio. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris, un tampón borato; un tampón succinato, un tampón histidina, o un tampón citrato. Una fase acuosa regulada en su pH es preferida, y tampones típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM.

La emulsión también incluye un lípido catiónico. Preferentemente este lípido es un agente tensioactivo de tal forma puede facilitar la formación y estabilización de la emulsión. Los lípidos catiónicos útiles generalmente contienen un átomo de nitrógeno que está positivamente cargado bajo condiciones fisiológicas, por ejemplo, una amina terciaria o cuaternaria. Este nitrógeno puede estar el grupo principal hidrófilo de un agente tensioactivo anfífilo. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero sin limitación: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 3'-[N-(N',N'-Dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (Colesterol DC), dimetildioctadecil-amonio (DDA por ejemplo el bromuro), 1.2- Dimiristoil-3-Trimetil-AmonioPropano (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetil amonio propano (DPTAP), distearoiltrimetilamonio propano (DSTAP). Otros lípidos catiónicos útiles son: cloruro de benzalconio (BAK), cloruro de bencetonio, cetramida (que contiene bromuro tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dedeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetil amonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de cetil trimetilamonio (CTAC), N,N',N'-polioxietileno (10)-N-sebo-1,3-diaminopropano, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetil-amonio bromuro, bromuro de alquil-trimetil-amonio mixto, cloruro de bencildimetildodecilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecil-amonio, benciltrimetilamonio metóxido, bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDAB), cloruro metilbenzetonio, cloruro de decametonio, cloruro de trialquil amonio metílico mixto, cloruro metil de trioctilamonio), cloruro de N,N-dimetil-N-[2 (2-metil-4-(1,1,3,3tetrametilbutil)-fenoxi]-etoxi)etil]-benzenemeta-naminp (DEBDA), sales de dialquildimetilamonio, cloruro de [l-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N,trimetilamonio, 1,2-diacil-3-(trimetilamonio) propano (grupo acilo =dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), 1,2-diacil-3 (dimetilamonio)propano (grupo acilo=dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), 1.2- dioleoil-3-(4'-trimetil-amonio)butanoil-sn-glicerol, éster colina 3-succinil-sn-glicerol de 1,2-dioleoilo, colesteril (4'-trimetilamonio) butanoato), sales de N-alquil piridinio (por ejemplo, bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio), sales de N-alquilpiperidinio, electrolitos bolaform dicatiónicos (C12Me6; C12BU6), dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a dioleoilfosfatidiletanolamina, colesterol hemisuccinato colin éster, lipopoliaminas, incluyendo pero no limitándose a dioctadecilamidoglicilesperminea (DOGS), dipalmitoil fosfatidiletanol-amidoespermina (DPPES), lipopoli-L (o D)-lisina (LPLL, LPDL), poli (L (o D)-lisina conjugada con N-glutarilfosfatidiletanolamina, didodecil glutamato éster con un grupo amino pendiente (CAGluPhCnN), ditetradecil glutamato éster con un grupo amino pendiente (Cl4GIuCnN+), derivados catiónicos de colesterol, incluyendo, pero sin limitación, sal de colesteril-3 poxisuccinamidoetilentrimetilamonio, colesteril-3p-oxisuccinamidoetilen-dimetilamina, sal de colesteril-3pcarboxiamidoetilentrimetilamonio, y colesteril-3p-carboxiamidoetilendimetilamina. Otros lípidos catiónicos útiles se describen en los documentos US 2008/0085870 y US 2008/0057080. El lípido catiónico preferentemente es biodegradable (metabolizable) y biocompatible.

Además del aceite y el lípido catiónico, una emulsión puede incluir un agente tensioactivo no iónico y/o un agente tensioactivo zwitteriónico. Tales agentes tensioactivos incluyen, pero sin limitación: los agentes tensioactivos de ésteres de polioxietilen sorbitán (comúnmente referidos como los Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), y/u óxido de butileno (BO), comercializado bajo la marca comercial DOWFAX™, tal como los copolímeros de bloque EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos epoxi de repetición (oxi-1,2-etandiilo), con octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol) siendo de particular interés; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tal como fosfatidilcolina (lecitina); ésteres grasos de polioxietileno derivados de alcohol laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como agentes tensioactivos Brij) tal como el éster monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30); polioxietilen-9-lauril éter; y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como Spans), tal como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaureato de sorbitán. Los agentes tensioactivos preferidos para incluirse en la emulsión son polisorbato 80 (Tween 80; polioxietilen sorbitán monooleato), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.

Pueden incluirse mezclas de estos agentes tensioactivos en la emulsión, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85, o mezclas de Tween 80/Triton-X100. Una combinación del éster de polioxietilen sorbitán tal como monooleato de polioxietilen sorbitán (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxi-polietoxietanol (Triton X-100) también es adecuada. Otras combinaciones útiles comprenden lauret 9 más un éster de polioxietilen sorbitán y/o un octoxinol. Las mezclas útiles pueden comprender un agente tensioactivo con un valor HLB en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, polisorbato 80, con un HLB de 15,0) y un agente tensioactivo con un valor HLB en el intervalo 1-10 (por ejemplo, trioleato de sorbitán, con un HLB de 1,8).

Las cantidades preferentes de aceite (% en volumen) en la emulsión final están entre 2-20 % por ejemplo 5-15 %, 6­ 14 %, 7-13 %, 8-12 %. Un contenido de escualeno de aproximadamente 4-6 % o de aproximadamente 9-11 % es particularmente útil.

Las cantidades preferentes de agentes tensioactivos (% en peso) en la emulsión final están entre 0,001 % y 8 %. Por ejemplo: ésteres de polioxietilen sorbitán (tal como polisorbato 80) del 0,2 al 4 %, en particular entre el 0,4-0,6 %, entre el 0,45-0,55 %, aproximadamente el 0,5 % o entre el 1,5-2 %, entre el 1,8-2,2 %, entre el 1,9-2,1 %, aproximadamente el 2 %, o el 0,85-0,95 %, o aproximadamente el 1 %; ésteres de sorbitán (tal como trioleato de sorbitán) del 0,02 al 2 %, en particular de aproximadamente el 0,5 % o de aproximadamente el 1 %; octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (tal como Triton X-100) del 0,001 al 0,1 %, en particular del 0,005 al 0,02 %; ésteres de polioxietileno (tal como lauret 9) del 0,1 al 8 %, preferentemente del 0,1 al 10 % y en particular del 0,1 al 1 % o de aproximadamente el 0,5 %.

Las cantidades absolutas de aceite y agente tensioactivo, y su proporción, puede variarse dentro de amplios límites mientras aún forman una emulsión. Un experto en la técnica puede fácilmente variar las proporciones relativas de los componentes para obtener una emulsión deseada pero una proporción en peso de entre 4:1 y 5:1 para el aceite y el agente tensioactivo es típica (aceite en exceso).

Un parámetro importante para asegurar la actividad inmunoestimulante de una emulsión, particularmente en animales grandes, es el tamaño de gotícula de aceite (diámetro). Las emulsiones más efectivas tienen un tamaño de gotícula en el intervalo de submicrómetros. Adecuadamente los tamaños de gotícula estarán en el intervalo de 50-750 nm. Más habitualmente el tamaño de gotícula promedio es menor de 250 nm por ejemplo menor de 200 nm, menor de 150 nm. El tamaño de gotícula promedio útilmente está en el intervalo de 80-180 nm. Idealmente al menos el 80 % (en número) de las gotículas de aceite en la emulsión son menores de 250 nm en diámetro y preferentemente al menos el 90 %. Los aparatos para determinar el tamaño de gotícula promedio en una emulsión, y la distribución de tamaño, están disponibles en el mercado. Estos típicamente usan las técnicas de difusión de luz dinámica y/o percepción óptica de partícula individual, por ejemplo, Accusizer™ y Nicomp™ de la serie de instrumentos disponibles de Particle Sizing Systems (Santa Barbara, EE. UU.), o los instrumentos Zetasizer™ de Malvern (RU), o los instrumentos Particle Size Distribution Analyzer de Horiba (Kyoto, Japón).

Idealmente, la distribución de los tamaños de gotícula (en número) tienen solamente un máximo, es decir, existe una única población de gotículas distribuida alrededor de un promedio (modo), en lugar de tener dos máximos. Las emulsiones preferidas tienen una polidispersidad de <0,4 por ejemplo, 0,3, 0,2, o menor.

Las emulsiones adecuadas con gotículas submicrométricas y estrecha distribución de tamaño pueden obtenerse a través del uso de microfluidización. Esta técnica reduce el tamaño de gotícula de aceite promedio a través de corrientes de propulsión de componentes de entrada a través de canales geométricamente fijados a alta presión y a alta velocidad. Estas corrientes se ponen en contacto con las paredes del canal, las paredes de la cámara y entre sí. Los resultados cortantes, de impacto y de cavitación causan una reducción en el tamaño de las gotículas. Los casos repetidos de la microfluidez pueden llevarse a cabo hasta que se obtiene una emulsión con un promedio de tamaño de gotícula deseado y una distribución.

Como una alternativa a la microfluidización, los procedimientos térmicos pueden usarse para causar la inversión de fase. Estos procedimientos también proporcionar una emulsión submicrométrica con una distribución de tamaño de partícula precisa.

Las emulsiones preferentes pueden esterilizarse por fltración, es decir, sus gotículas pueden pasar a través de un filtro de 220 nm. Así como la provisión de una esterilización, este procedimiento también elimina cualquier gotícula grande en la emulsión.

El lípido catiónico de la emulsión puede ser DOTAR La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml de DOTAP Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DOTAP a de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,3 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,4 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 24 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 22 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 18 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,9 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,8 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,7 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml, aproximadamente 1,1 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 1,4 mg/ml, aproximadamente 1,5 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21,8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml de DOTAP, tal como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml o 1,6 mg/ml.

El lípido catiónico puede ser Colesterol DC. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender Colesterol DC de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de Colesterol DC. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender Colesterol DC de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,46 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,92 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,46 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 2,46 mg/ml, aproximadamente 4,92 mg/ml, etc. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 4,92 mg/ml de Colesterol DC, tal como 2,46 mg/ml.

El lípido catiónico puede ser DDA. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml DDA. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DDA de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,45 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,45 mg/ml, etc. Alternativamente, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DDA de aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 21,5 mg/ml, aproximadamente 21,6 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml de DDA, tal como 1,45 mg/ml.

Los catéteres o dispositivos similares pueden usarse para suministrar moléculas de ARN autorreplicante de la invención, como ARN desnudo en combinación con un sistema de suministro, en un órgano o tejido diana. Los catéteres adecuados se desvelan en, por ejemplo, las Patentes de los EE. UU. Núm.

4.186.745; 5.397.307; 5.547.472; 5.674.192 y 6.129.705.

La presente divulgación incluye el uso de sistemas de administración adecuados, tal como liposomas, micropartículas de polímero o micropartículas de emulsión submicrométrica con ARN autorreplicante encapsulado o adsorbido, para suministrar una molécula de ARN autorreplicante que codifica dos o más proteínas de CMV, por ejemplo, para provocar una respuesta inmune sola, o en combinación con otra macromolécula. La invención incluye liposomas, micropartículas de emulsiones submicrométricas con moléculas de ARN de auto-replicación adsorbidas y/o encapsuladas y combinaciones de los mismos.

Las moléculas de ARN autorreplicante asociadas a liposomas y micropartículas de emulsión submicrométrica pueden administrarse de forma eficaz a una célula huésped y pueden inducir una respuesta inmune a la proteína codificada por el ARN autorreplicante.

Las moléculas de ARN autorreplicante policistrónicas que codifican proteínas de CMV, y las VRP producidas usando replicones de alfavirus policistrónicos, pueden usarse para formar los complejos proteicos de CMV en una célula. Los complejos incluyen, pero sin limitación, gB/gH/gL; gH/gL; gH/gL/gO; gM/gN; gH/gL/UL128/UL130/UL131; y UL128/UL130/UL131.

Proteínas de CMV

Las proteínas de CMV adecuadas incluyen gB, gH, gL, gO, y pueden ser de cualquier cepa de CMV. Otras proteínas de CMV adecuadas incluyen LTL128, LTL130 y UL131, y pueden ser de cualquier cepa de CMV. Por ejemplo, las proteínas de CMV pueden ser de las cepas Merlin, AD169, VR1814, Towne, Toledo, TR, PH, TB40, o Fix de c Mv . Las proteínas de CMV ejemplares y fragmentos se describen en el presente documento. Estas proteínas y fragmentos pueden codificarse a través de cualquier secuencia de nucleótidos adecuada, incluyendo secuencias que están optimizadas o desoptimizadas en codón para la expresión en un hospedador deseado, tal como una célula de humano. Las secuencias ejemplares de proteínas de CMV y ácidos nucleicos que codifican las proteínas se proporcionan en la Tabla 2.

Tabla 2.

Proteínas gB CMV

Una proteína gB puede ser de longitud completa o puede omitir o más regiones de la proteína. Alternativamente, los fragmentos de una proteína gB pueden usarse. Los aminoácidos gB se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido fB de longitud completa (gB CMV FL), que tiene 907 aminoácidos de longitud. Las regiones adecuadas de una proteína gB, que pueden excluirse de la proteína de longitud completa o incluirse como fragmentos incluyen: la secuencia de señal (aminoácidos 1-24), un dominio de tipo desintegrina gB-DLD (aminoácidos 57-146), un sitio de escisión de furina (aminoácidos 459-460), una región de repetición heptad (679-693), un dominio de diseminación de membrana (aminoácidos 751-771), y un dominio citoplasmático de los aminoácidos 771-906. Una proteína gB puede incluir los aminoácidos 67-86 (Epitopo Neutralizante AD2) y/o los aminoácidos 532-635 (Epitopo Inmunodominante AD1). Los ejemplos específicos de fragmentos gB, incluyen “gB sol 692”, que incluye los primeros 692 aminoácidos de gB, aminoácidos de gB, ay “gB sol 750”, que incluye los primeros 750 aminoácidos de gB. La secuencia de señal, los aminoácidos 1-24, pueden estar presentes o ausentes de sol 692 gB y sol 750 gB según se desee. Opcionalmente, la proteína gB puede ser un fragmento gB de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento pueden comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, o 875 aminoácidos. Un fragmento gB puede iniciar en cualquier número de resto: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105.

106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122:, 123, 124, 125., 126, 127, 128, 129 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152.

153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175.

176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313.

314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612

613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635

636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658

659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681

682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704

705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727

728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750

751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773

774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796

797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819

820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842

843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865

866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888

889, 890, 891, 892, 893, 896 u 897.

Opcionalmente, un fragmento gB puede extenderse además en el extremo N terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos del residuo de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gB puede extenderse además en C-terminal en 5,

10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.

Proteínas gH CMV

Una proteína gH puede ser una proteína gH de longitud completa (CMV gH FL, por ejemplo, que es una proteína 743 aminoácidos). gH tiene un dominio de diseminación de membrana y un dominio citoplasmático que parte en la posición

716 a la posición 743. La retirada de los aminoácidos de 717 a 743 proporciona un gH soluble (por ejemplo, CMV gH sol,). La proteína gH puede ser un fragmento gH de 10 aminoácidos o mayor. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300,

325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 725 aminoácidos. Opcionalmente, la proteína gH puede ser un fragmento gH de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300,

325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 725 aminoácidos. Un fragmento gH puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,

24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 1 113, 114, 115, 116, '117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130', 131 , 132, 133, 134, 135, 136,

137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159,

160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182,

183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205,

206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228,

229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251,

252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274,

275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297,

298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320,

321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343,

344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366,

367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389,

390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412,

413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435,

436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458,

459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481,

482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504,

505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527,

528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550,

551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573,

574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596,

597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619,

620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642,

643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665,

666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688,

689, 690, 691, 692 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711,

712, 713, 714, 715, 716, 717, '718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731 o 732. Los residuos gH se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácidos gH de longitud completa (CMV gH FL). Opcionalmente un fragmento gH puede extenderse además en N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gH puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.

Proteínas gL CMV

Una proteína gL es una proteína gL de longitud completa (CMV gL FL, por ejemplo, que es una proteína de 278 aminoácidos). Alternativamente, puede usarse un fragmento gL. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, o 250 aminoácidos. Un fragmento gL puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263, 264, 265, 266, 267 o 268. Los residuos gL se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácidos gL de longitud completa (CMV gL FL). Opcionalmente, un fragmento gL puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gL puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.

Proteínas gO CMV

Una proteína gO puede ser una proteína gO de longitud completa (CMV gO FL, por ejemplo, que es una proteína de 472 aminoácidos). Alternativamente, la proteína gO puede ser un fragmento gO de 10 aminoácidos o mayor. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, o 450 aminoácidos. Un fragmento gO puede iniciar en cualquier número de resto: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 o 462. Los residuos gO se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácidos gO de longitud completa (CMV gO FL). Opcionalmente, un fragmento gO puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gO puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.

Proteínas gM CMV

Una proteína gM puede ser una proteína gM de longitud completa (CMV gM FL, por ejemplo, que es una proteína de 371 aminoácidos). Alternativamente, la proteína gM puede ser un fragmento gM de 10 aminoácidos o mayor. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, o 350 aminoácidos. Un fragmento gM puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257,

258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280,

281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303,

304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326,

327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349,

350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360 o 361. Los residuos gM se numeran de acuerdo con la secuencia completa de aminoácidos gM (CMV gM FL). Opcionalmente, un fragmento gM puede extenderse además dentro de

N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gM

puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.

Proteínas gN CMV

Una proteína gN puede ser una proteína gN de longitud completa (CMV gN FL, por ejemplo, que es una proteína 135 aminoácidos). Alternativamente, la proteína gN puede ser un fragmento gN de 10 aminoácidos o mayor. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o 125 aminoácidos. Un fragmento gN puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 7 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 o 125. Los residuos gN

se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácidos gN de longitud completa (CMV gN FL). Opcionalmente, un fragmento gN puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gN puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.

Proteínas UL128 CMV

Una proteína UL128 es una proteína UL128 de longitud completa (CMV UL128 FL, por ejemplo, que es una proteína de 171 aminoácidos). Alternativamente, la proteína UL128 puede ser un fragmento UL128 de 10 aminoácidos o mayor.

Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,

125, o 150 aminoácidos. Un fragmento UL128 puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,

42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,

73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,

103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,

127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149,

150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, o 161.

Los residuos LTL128 se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido LTL128 de longitud completa (CMV LTL128 FL). Opcionalmente, un fragmento LTL128 puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento UL128 puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.

Proteínas UL130 CMV

Una proteína UL130 es una proteína UL130 de longitud completa (CMV UL130 FL, por ejemplo, que es una proteína

214 aminoácidos). Alternativamente, la proteína UL130 puede ser un fragmento UL130 de 10 aminoácidos o mayor.

Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,

125, 150, 175, o 200 aminoácidos. Un fragmento UL130 puede iniciar en cualquier número de resto: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,

40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,

102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,

126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,

149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,

172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194,

195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, o 204.

Los residuos LTL130 se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido LTL130 de longitud completa (CMV LTL130 FL). Opcionalmente, un fragmento LTL130 puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un UL130 fragmento UL130 puede extenderse además en el extremo C terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último residuo del fragmento.

Proteínas UL131 CMV

Una proteína UL131 es una proteína UL131 de longitud completa (CMV UL131, por ejemplo, que es una proteína de 129 aminoácidos). Alternativamente, la proteína UL131 puede ser un fragmento UL131 de 10 aminoácidos o mayor. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, o 200 aminoácidos. Un fragmento UL131 puede iniciar en cualquier número de resto: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119.

Los residuos LTL131 se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido LTL131 de longitud completa (CMV UL131 FL). Opcionalmente, un fragmento LTL131 puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, a UL131 fragmento puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.

Como se indicó anteriormente, la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico policistrónicas recombinantes que contienen una primera secuencia que codifica una primera proteína de virus del herpes o un fragmento de la misma, y una secuencia que codifica una segunda proteína de virus del herpes o un fragmento de la misma. En consecuencia, la descripción anterior de ciertos aspectos preferentes de la divulgación, tal como VRP de alfavirus, y ARN autorreplicantes que contienen secuencias que codifican dos o más proteínas de CMV o fragmentos de las mismas, son ilustrativos de la presente divulgación pero no limitan el alcance de la misma. Se apreciará que las secuencias que codifican proteínas de CMV en tales realizaciones preferentes, pueden ser reemplazadas con secuencias que codifican proteínas, tal como gH y gL o fragmentos de las mismas que son de 10 aminoácidos de longitud o mayor, desde otros virus del herpes, tal como VHH-1, VHH-2, VHH-3, VHH-4, VHH-6, VHH-7 y VHH-8. Por ejemplo, por ejemplo, las proteínas VVZ (VHH-3) adecuadas incluyen gB, gE, gH, gl, y gL, y sus fragmentos que son de 10 de aminoácidos de largo o más largas y pueden de cualquier cepa VVZ. Por ejemplo, las proteínas VVZ o fragmentos de las mismas pueden ser de las cepas pOka, Dumas, HJO, CA123, o DR de VVZ. Estas proteínas VVZ ejemplares y sus fragmentos pueden codificarse a través de cualquier secuencia de nucleótidos adecuada, incluyendo secuencias que están optimizadas en codón o desoptimizadas en codón para la expresión en un hospedero deseado, tal como una célula de humano. Las secuencias ejemplares de proteínas VVZ se proporcionan en el presente documento.

Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, la molécula de ácido nucleico policistrónica contiene una primera secuencia que codifica una proteína gH VVZ o un fragmento de la misma, y una segunda secuencia que codifica una proteína gL VVZ o un fragmento de la misma.

En algunos aspectos de la divulgación, cada una de las secuencias que codifica una proteína de virus del herpes o fragmento que están presentes en la molécula de ácido nucleico policistrónica está operativamente enlazada a sus propios elementos de control. Por ejemplo, cada secuencia que codifica una proteína de virus del herpes o fragmento está operativamente enlazada a su propio promotor subgenómico. De esta forma la molécula de ácido nucleico policistrónica, tal como alfavirus, puede contener dos, tres, cuatro o cinco promotores subgenómicos, cada uno de los cuales controla la expresión de una proteína virus del herpes o fragmento. Cuando este tipo de molécula de ácido nucleico policistrónica es un ARN de auto-replicación, tal replicón de alfavirus, puede empaquetarse como una VRP, o asociarse o formularse con un sistema de suministro de ARN.

PROCEDIMIENTOS Y USOS

En algunos aspectos de la divulgación, las moléculas de ARN autorreplicante o VRP se administran a un individuo para estimular una respuesta inmune. En tales aspectos, las moléculas de ARN autorreplicante o VRP típicamente están presentes en una composición que puede comprender un vehículo aceptable para uso farmacéutico y, opcionalmente, un adyuvante. Véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 6.299.884; U.S. 7.641.911; U.S. 7.306.805; y US 2007/0207090.

La respuesta inmune puede comprender una respuesta inmune humoral, una respuesta inmune mediada por células, o ambas. Se puede inducir una respuesta inmunitaria contra cada proteína de CMV administrada. Una respuesta inmune mediada por células puede comprender una respuesta de célula T auxiliar (Th), una respuesta de célula T citotóxica CD8+ (CTL), o ambas. Cuando la respuesta inmune comprende una respuesta inmune humoral, los anticuerpos pueden ser anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes bloquean la infección vírica de las células. CMV infecta las células epiteliales y también las células de fibroblasto. La respuesta inmune puede reducir, o previene, la infección de ambos tipos celulares. Las respuestas de los anticuerpos neutralizantes pueden ser dependientes del complemento o independientes del complemento. La respuesta del anticuerpo neutralizante es de neutralizante cruzado; es decir, un anticuerpo generado contra una composición administrada que neutraliza un virus CMV de una cepa diferente de la cepa usada en la composición.

Una medición útil de la potencia del anticuerpo en la técnica es “título del 50 % de neutralización”. Para determinar el título del 50 % de neutralización, el suero de los animales inmunizados se diluye para evaluar cómo el suero diluido aún puede retener la capacidad de bloquear la entrada de 50 % de los virus en las células. Por ejemplo, una concentración de 700 significa que el suero retuvo la capacidad de neutralizar 50 % del virus después de diluirse 700 veces. De esta forma, los títulos más altos indican respuestas de anticuerpo neutralizantes más potentes. En algunos aspecto de la divulgación, este título está en un intervalo que tiene un límite inferior de aproximadamente 200, aproximadamente 400, aproximadamente 600, aproximadamente 800, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500, aproximadamente 3000, aproximadamente 3500, aproximadamente 4000, aproximadamente 4500, aproximadamente 5000, aproximadamente 5500, aproximadamente 6000, aproximadamente 6500, o aproximadamente 7000. El intervalo de 50 % del título de neutralización puede tener un límite superior de aproximadamente 400, aproximadamente 600, aproximadamente 800, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 200, aproximadamente 2500, aproximadamente 3000, aproximadamente 3500, aproximadamente 4000, aproximadamente 4500, aproximadamente 5000, aproximadamente 5500, aproximadamente 6000, aproximadamente 6500, aproximadamente 7000, aproximadamente 8000, aproximadamente 9000, aproximadamente 10000, aproximadamente 11000, aproximadamente 12000, aproximadamente 13000, aproximadamente 14000, aproximadamente 15000, aproximadamente 16000, aproximadamente 17000, aproximadamente 18000, aproximadamente 19000, aproximadamente 20000, aproximadamente 21000, aproximadamente 22000, aproximadamente 23000, aproximadamente 24000, aproximadamente 25000, aproximadamente 26000, aproximadamente 27000, aproximadamente 28000, aproximadamente 29000, o aproximadamente 30000. Por ejemplo, el título del 50 % de neutralización puede ser de aproximadamente 3000 a aproximadamente 6500. “Aproximadamente” significa más o menos 10 % del valor mencionado. El título de neutralización puede medirse como se describe en los ejemplos específicos, a continuación.

Una respuesta inmune puede estimularse a través de la administración de VRP o ARN autorreplicante a un individuo, típicamente un mamífero, incluyendo un ser humano. La respuesta inmune inducida puede ser una respuesta inmune protectora, es decir, la respuesta reduce el riesgo y la severidad de la infección CMV. La estimulación de una respuesta inmune protectora es particularmente deseable en algunas formaciones particularmente en riesgo de infección o enfermedad CMV. Por ejemplo, las poblaciones en riesgo incluyen pacientes con trasplante de órganos sólidos (SOP, por sus siglas en inglés), pacientes con trasplante de médula espinal, y pacientes con trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT, por sus siglas en inglés). Las VRP pueden administrarse en un pre-trasplante de donador de trasplante, o un pre- y/o post-trasplante de receptor de trasplante. Debido a la transmisión de madre a hijo es una fuente común de infantes infectados, administrando VRP o ARN de auto-replicación a la mujer que ha quedado embaraza es particularmente útil.

Puede usarse cualquier vía de administración adecuada. Por ejemplo, una composición puede administrarse por vía intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o transdérmica o, alternativamente, por vía intramucosa, tal como intraoral, intranasal, intravaginal, e intrarectal. Las composiciones pueden administrarse de conformidad con cualquier programa adecuado.

La divulgación anterior es una descripción general. Un entendimiento más completo puede obtenerse por referencia a los siguientes específicos.

EJEMPLO 1 (Ejemplo de antecedentes)

Administración de antígenos CMV individuales usando una plataforma VRP

Cada una de las glucoproteínas de CMV gB y gH induce las respuestas neutralizantes, y gB es el antígeno dominante entre los anticuerpos en suero humano que neutraliza la infección de fibroblastos (Britt et al. (1990) J. Virol. 64(3): 1079-85). Los siguientes experimentos demuestran en ratones una respuesta neutralizante contra estos antígenos suministrados usando una plataforma VRP

Cada antígeno CMV se clonó en un vector pcDNA-6His (Invitrogen) y ensayó para expresión de proteína antes de la clonación en un vector replicón de alfavirus, pVCR 2.1 SalI/XbaI derivado del plásmido descrito por Perri et al. (J. Virol 77(19)10394-10403 (2003)) produciendo los montajes mostrados en la Figura 2. pVCR 2.1 SalI/XbaI es un vector de ARN de auto-replicación que, cuando se electropora con cápside auxiliar defectuosa y ARN de glucoproteína, forma una partícula de alfavirus infecciosa.

Se usaron los vectores pVCR para producir el ARN que se sometió a electroporación en células de riñón de hámster bebé (BHKV, por sus siglas en inglés) en presencia de cápside auxiliar defectuosa y ARN de glucoproteína derivada del virus de encefalitis equina de Venezuela (VEE). Después de la electroporación, el sobrenadante que contiene las partículas de vector alfavirus (VRP, por sus siglas en inglés) secretadas se recolectó, purificó, ajustó, y utilizó para estudios de inmunización de ratón. Los ratones se inmunizaron con 1x106 unidades infecciosas (IU)/ratón en una serie de dos inmunizaciones, con tres semanas de separación entre sí. El sangrado terminal fue tres semanas después de la segunda inmunización.

VRP gB, gH y gL monocistrónicos

Se construyeron dos diferentes versiones de gB soluble: “gB sol 750” carece del dominio de extensión de transmembrana y de domino citoplasmático; y “gB sol 692” también carece de región hidrófoba (FIG. 2A) y es similar a Reap y otros montajes. También se construyó un gH soluble que carece de dominio de extensión de transmembrana y de domino citoplasmático (“gH sol 716”) (FIG. 2C). El suero de los ratones inmunizados se clasificó en varios ensayos. Los ensayos de inmunotransferencia (datos no mostrados) y de inmunofluorescencia se usaron para confirmar las respuestas de anticuerpo específicas a los antígenos. Los ensayos de neutralización se usaron para demostrar que las respuestas de anticuerpo producidas fueron capaces de neutralizar la infección por CMV.

El suero de los ratones inmunizados se examinó por inmunofluorescencia para reconocimiento de gB en células 293TR transfectadas con montajes que expresan gB-6His. Las células se sondearon con ya sea anticuerpos anti-His (“anti-6His”), un anticuerpo gB monoclonal (“anti-gB 27-156”), o se recolectaron de suero de ratón agrupado. El suero pre­ inmune fue negativo en todos los casos. En las células transfectadas con montajes que expresan gB FL-6His, fijadas y permeabilizadas, la tinción anti-6His reveló un patrón de expresión de expresión de superficie con un patrón citoplasmático punteado más probablemente correspondiente a la trayectoria de tráfico endocítica/exocítica. Ambos, anti-gB 27-156 y el suero de ratón agrupado mostraron un patrón de expresión similar. El suero de los ratones inmunizados con cada uno de los VRP gB FL, VRP gB sol 750, y VRP gB sol 692 mostraron el mismo patrón de expresión.

Los ratones inmunizados con VRP gH FL y VRP gH sol 716 produjeron anticuerpos específicos para gH. El análisis de inmunofluorescencia de células 293TR transfectadas con montajes que expresan gH FL-6His detectó un fuerte reconocimiento de gH mediante anti-6His, anti-gH, y suero de ratón combinado. El suero recolectado de ratones inmunizados con VRP gL produjo una respuesta de anticuerpo específico como se determina por el análisis de inmunotransferencia e inmunofluorescencia. Los VRP gL fallaron en la producción de respuestas neutralizantes.

El suero de los ratones inmunizados con VRP gB o VRP gH se analizó para la presencia de anticuerpos neutralizantes usando un ensayo de neutralización CMV. El suero a varias diluciones se pre-incubó con el virus CMV TB40UL32EGFP (“TB40-GFP,” un aislado clínico modificado para expresar GFP y después se añadió a células epiteliales ARPE-19 e incubó por 5 días. Cinco días después de la infección, las células GFP positivas se contaron. En este ensayo, las células se incubaron con suero conteniendo anticuerpos neutralizantes que tienen menos células GFP-positivas comparadas con células incubadas con el virus solo o con virus incubado con suero pre-inmune. El suero de ratones inmunizados con VPR gB, VRP gB FL, VRP gB sol 750, o VRP gB sol 692 tuvo una fuerte actividad neutralizante en presencia de complemente de cobaya (50 % de concentración de neutralización a una dilución sérica de 1:1280-1:2560; FIG. 3). El suero de ratones inmunizados con VRP gH FL o VRP gH sol tuvo algo de actividad neutralizante que fue independiente del complemento de cobaya (FIG. 3).

Ejemplo 2

Construcción de Vectores Alfavirus Policistrónicos

CMV produce diversos complejos multiproteicos durante la infección. Para determinar si un solo replicón que expresa todos los componentes de un complejo deseado puede usarse para producir el complejo CMV en un sujeto, o si los componentes del complejo podrían ser co-suministrados de múltiples vectores replicón, se diseñó una plataforma que permite la expresión controlada de múltiples proteínas de CMV.

Se modificó un vector alfavirus (pVCR 2.1 SalI/XbaI) para permitir el ensamble de múltiples promotores subgenómicos (SGP, por sus siglas en inglés) y genes de interés (GOI, por sus siglas en inglés). El sitio pVCR 2.1SalI/XbaI ApaI en 11026-31 pb se cambió de GGGCCC a GGCGCC. Los sitios de restricción ClaI y PmlI se añadieron en la región inmediatamente en corriente abajo del primer promotor subgenómico y los sitios de inserto SalI-XbaI. La secuencia en 7727-7754 pb se cambió de ctcgatgtacttccgaggaactgatgtg a ATCGATGTACTTCCGAGGAACTCACGTG.

Se diseñó un sistema de vector de transporte para permitir la inserción de un GOI directamente corriente abajo de un SGP usando los sitios SalI-XbaI. Se modificó pcDNA 3.1 (-)C de la siguiente manera. Se eliminaron tres sitios SalI: posiciones 1046-1051bp, 3332-3337bp y 5519-21, 1-3 pb de GTCGAC a GTCTAC. El pcDNA 3.1 (-)C se modificó para mutar un sitio XbaI en la posición 916-921 pb de TC ^t A^g A a TCAAGA. El pcDNA 3.1 (-)C se modificó para añadir un sitio ClaI y un sitio SacII en las posiciones 942-947 (ClaI) y 950-955 (SacII) pb de ctggatatctgcag a ATCGATATCCGCGG.

Una vez que se añadieron los sitios de restricción y se verificó la secuencia resultante, la región de pb 7611-7689 (ctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtcgaccaagcctct agacggc gcgcccaccca) se amplificó del vector alfavirus pVCR 2.1 modificado usando los siguientes cebadores.

SGP S-X Not F Directo:

5'ATAAGAAT GCGGCCGCCTATAACTCTCTACGGCTAACC3'

SGP S-X Cla R Inverso: 5'CCATCGATTGGGTGGGCGCGCCGTCTAG3' o

SGP S-X Cla F Directo: 5'CCATCGATCTATAACTCTCTACGGCTAACC3' y

SGP S-X Sac R Inverso: 5'TCCCCGCGGTGGGTGGGCGCGCCGTCTAG 3'.

Las regiones amplificadas se añadieron en el vector pcDNA 3.1(-)C modificado para formar los vectores de transporte (pcDNA SV) entre los sitios apropiados (Notl-Clal o ClaI-SacII). La inserción de Notl-SGP Sal-Xba-Clal forma el casete 2 de pcDNA SV, la inserción de ClaI-SGP Sal-Xba-SacII forma el casete 3 de pcDNA SV. Estos casetes SV se secuenciaron. El casete 2 de pcDNA SV contiene 12 pb adicionales entre el sitio XbaI y el sitio ClaI (CCACTGTGATCG) porque el sitio ClaI no se cortó en el vector del casete 2 de pcDNA SV. Por lo tanto se añadió un sitio PmlI. Para el casete 2 de pcDNA SV, se insertó el sitio PmlI a pb 1012 (CACGTG). Para el casete 3, se añadió el sitio PmlI a pb 935-940 (ACTGTG que se cambió a CACGTG).

Para cada vector policistrónico, el primer gen se insertó directamente en el vector modificado pVCR 2.1 usando los sitios SalI-XbaI. El segundo gen se ligó en el casete 2 de pcDNA SV usando SalI-XbaI y se extirpó usando NotI-PmlI, NotI-SacII o PCRed usando los iniciadores para NotI-ClaI y digirió usando NotI y ClaI. El insertó resultante SGP— SalI—GOI—Xba se ligó en el vector pVCR 2.1 modificado usando el sitio NotI-PmlI, NotI- SacII, o NotI-ClaI. El inserto NotI-ClaI se utilizó solamente un gen deseado en el montaje contuvo un sitio PmlI.

En algunos casos se ligó un tercer gen en el casete 3 de pcDNA SV usando SalI-XbaI y se extirpó usando PmlI-SacII o PCRed usando los cebadores para ClaI-SacII y se digirió usando ClaI y SacII. El inserto resultante SGP— SalI— GOI—XbaI se ligó en el pVCR 2.1 modificado usando PmlI-SacII o ClaI-SacII.

Se utilizó digestión de SalI-XbaI para validar la construcción de ADN del vector policistrónico. Después de la digestión con SalI-XbaI, se realizó la electroforesis en gel de agarosa para confirmar la presencia de los GOI. El ADN del vector policistrónico después se linearizó con PmeI durante la noche, purificó usando el kit de purificación PCR de Qiagen, y utilizó como plantilla para fabricar ARN usando el kit Ambion mMessage mMachine. La calidad del ARN se verificó corriendo una alícuota de muestra en el gel de agarosa de ARN.

Expresión de un Vector Policistrónico

Las proteínas fluorescentes GFP (proteína fluorescente verde) y mCherry (proteína fluorescente roja) se usaron como GOI para evaluar la capacidad del vector policistrónico para expresar dos proteínas. Se preparó un vector bicistrónico en donde GFP se expresaría usando un primer promotor y mCherry se expresaría de un segundo promotor subgenómico (FIG. 4A). Los polinucleótidos que contienen secuencias de codificación para estas proteínas se insertaron usando los sitios SalI-XbaI. El primer polinucleótido (GFP) se insertó directamente en un vector replicón de alfavirus modificado. El segundo polinucleótido (mCherry) se insertó primero en un vector de transporte que contiene un promotor subgenómico directamente en corriente abajo de la secuencia de codificación. Se aisló un fragmento que contiene ambos, el segundo promotor subgenómico y el segundo polinucleótido y se ligó en el vector replicón de alfavirus modificado conteniendo el primer polinucleótido, proporcionando un replicón de alfavirus con múltiples promotores subgenómicos.

Las VRP se produjeron en células BHKV por electroporación de ARN replicón con ARN auxiliares defectuosos para Cap y Gly. Las VRP se cosecharon 24 horas después de la electroporación y se usaron para infectar células BHKv a una multiplicidad de infección (MOI) de 20 unidades infecciosas (IU, por sus siglas en inglés) por célula.

En el experimento se probaron cuatro grupos de VRP: una VRP que expresa solamente GFP; una VRP que expresa mCherry; una VRP que expresa solamente GFP y una VRP que expresa solamente mCherry, ambos a una MOI de 20 IU/célula; y una VRP que contiene el vector bicistrónico GFP(1)—SGPmCherry(2). Las células BHKV infectadas con VPR se examinaron 24 horas después de la infección para determinar el porcentaje de colocación. Casi todas las células fueron positivas para GFP o mCherry cuando se infectaron individualmente. Las células infectadas con dos VRP separadas aparecieron ya sea verdes o rojas. Muy pocas células fueron amarillas, indicando que pocas células expresaron GFP y mCherry a niveles iguales y que un hubo un bajo nivel de co-infección. Estos datos se confirmaron usando el análisis FACS (F ⁱG. 4B).

En contraste, todas las células infectadas con alfavirus que contienen el vector bicistrónico GFP(1)—SGPmCherry(2) resultaron amarillas, lo que indica una expresión aproximadamente igual de GFP y mCherry. Este estudio demuestra que múltiples proteínas pueden expresarse exitosamente de un solo vector replicón de alfavirus policistrónico.

Ejemplo 3

Producción de Complejos CMV

Este ejemplo demuestra que los complejos proteicos CMV pueden formarse en una célula después de la administración de los componentes del complejo de un vector replicón de alfavirus policistrónico.

Complejos gH/gL y gH/gL/gO

Los replicones alfavirus gH/gL y gH/gL/gO policistrónicos se construyeron como se describe anteriormente (mostrado esquemáticamente en la FIG. 5a ). Las VRP conteniendo replicones de codificación gH, gL, gO, gH/gL y gH/gL/gO se produjeron en células BHKV como se describe anteriormente y se usaron para infectar células BHKV para demostrar la formación del complejo in vitro. Las células ARPE-19 infectadas con VRP produjeron complejos enlazados a disulfuro de gH/gL. gO no alteró detectablemente la asociación de gH/gL (FIG. 5B).

Se condujeron estudios de inmunofluorescencia para evaluar la localización de gH y gL administrados solos y cuando se suministraron usando un alfavirus policistrónico para buscar la relocalización de las proteínas cuando se coexpresaron. En apariencia, la localización de gH no cambia en presencia o ausencia de gL, o gL/gO. La localización de gL cambia en presencia de gH y gH/gO.

Finalmente, la asociación gH/gL se examinó a través de inmunoprecipitación. Se utilizó un anticuerpo gH comercial (Genway) para investigar a asociación de gH y gL. En todos los casos, el anticuerpo gH eficientemente inmunoprecipitó gH (FIG. 5C). Cundo gH no estuvo presente, gL no se inmunoprecipitó. Cuando gL se expresó en presencia de gH o gH/gO, hubo una asociación de gL con gH (FIG. 5C).

La relocalización de gL en presencia de gH y la asociación de gH/gL (con o sin gO) indica que todos los componentes de los replicones alfavirus policistrónicos se expresaron y asociaron para formar un complejo.

EJEMPLO 4 (Ejemplo de antecedentes)

Las VTP que efectúan la formación del complejo gH/gL in vitro inducen una potente respuesta inmune para CMV que es cualitativa y cuantitativamente superior a la respuesta inmune lograda para VRP gB.

Este ejemplo demuestra la inducción de respuestas inmunes sólidas a complejos formados mediante el suministro de VRP gH/gL policistrónicos o VRP gH/gL/gO en comparación con las respuestas inmunes obtenidas usando el suministro de componentes individuales VRP o VRP de componente individual administrados en combinación o a respuestas logradas por VPR gB.

Los ratones se infectaron tres veces con VRP administrados con 3 semanas de separación (106 IU por ratón; 5 ratones BalbC/grupo). El suero recolectado de las inmunizaciones con VRP individuales y policistrónicos se clasificó para anticuerpos neutralizantes usando un ensayo neutralizante CMV cono se describe anteriormente. El título de neutralización se midió como sigue. Se pre-incubaron varias diluciones de suero con TB40-UL32-EGFP en presencia o ausencia de complemento de cobaya y después se agregaron a células epiteliales ARPE-19 o células de fibroblasto MRC-5 e incubaron por 5 días. Después de 5 días de la infección con el virus, se contaron las células GFP-positivas. Los resultados para las células ARPE-19 se muestran en la FIG. 6A, FIG. 6B, y FIG. 6C. Los resultados para las células MRC-5 se muestran en la FIG. 7A y FIG. 7B.

El suero de ratones inmunizados con VRP gH FL tuvo una actividad neutralizante independiente del complemento baja (FIG. 6A y FIG. 6B). No se observó ninguna actividad neutralizante usando suero de ratones inmunizados con solamente gL o gO en presencia o ausencia de complemento de cobaya. (FIG. 6C). El suero combinado de la inmunización con varias proteínas gB CMV (gB FL, gB sol 750, y gB sol 692) demostró una fuerte actividad neutralizante en presencia de complemento de cobaya, con una concentración de neutralización de 50 % a una dilución sérica de 1:1280. Sin embargo, no hubo una actividad neutralizante en la ausencia del complemento de cobaya en células ARPE-19 para el suero gB combinado. Las VRP que expresan proteínas de CMV individuales (VRP gH- o gL-o coadministración de VRP gH-, gL-, y gO- a 106 IU/ratónNRP) no mejoran la actividad neutralizante más allá de gH solo.

En contraste, el suero de ratones inmunizados con VRP gH/gL bicistrónico o VRP gH/gL/gO tricistrónico (1x106 IU/ratón) demostró respuestas neutralizantes sólidas. Además, las respuestas fueron similares en presencia y ausencia del complemento de cobaya, mostrando que las VPR policistrónicas indujeron exitosamente una respuesta inmune independiente del complemento. (FIG. 6C.) El título de neutralización de 50 % fue 1:3500-6400+ de dilución sérica en células ARPE-19 con el virus CMV TB40-GFP El título es aproximadamente 3-4 veces una concentración mayor que el título de 50 % de neutralización dependiente del complemento para suero combinado gB.

Los resultados en las células de fibroblasto MRC-5 fueron similares a los de las células ARPE-19 (FIGS. 7A y 7B). El suero de ratones inmunizados con VRP gH/gL bicistrónico o gH/gL/gO tricistrónico demostraron una fuerte actividad neutralizante comparados con suero de ratones inmunizados con VRP que codifican gH solo, gL solo, o gO solo y el suero de ratones inmunizados mediante la coadministración de los VRP gH y VRP gL, o la co-administración de los VRP gH, VRP gL y VRP gO. Estos resultados demuestran que la administración de las VRP policistrónicas indujo una respuesta inmune que proporciona una buena neutralización independiente del complemento de infección c Mv de células de fibroblasto. Para evaluar el alcance y la potencia del suero inmune gH/gL frente a diferentes cepas de CMV, se hizo una comparación de la capacidad del suero para bloquear infección de fibroblastos y células epiteliales con seis diferentes cepas de CMV. La Figura 8 muestra que el suero gH/gL potencialmente neutraliza la infección de ambos tipos de célula con un amplio intervalo de cepas.

Estos datos también demuestran una fuerte actividad neutralizante para suero de ratones inmunizados con las VRP policistrónicas pero no con combinaciones mixtas de VRP que expresan solamente una proteína. Esto muestra los replicones policistrónicos que codifican los componentes de un complejo proteico en un solo replicón dan como resultado una eficiente producción del complejo in situ. Además, debido a que se usaron proteínas de CMV de la cepa Merlin para estimular estas respuestas, los datos in vitro obtenidos usando la el virus CMV de la cepa TB40 demuestran que los anticuerpos neutralizantes inducidos por el suministro de VRP policistrónicas con anticuerpos neutralizantes cruzados.

EJEMPLO 5

Síntesis de ARN

El ADN de plásmido que codifica replicones de alfavirus (véanse las Figs. 14 - 16) sirvió como una plantilla para la síntesis de ARN in vitro. Los replicones alfavirus contienen los elementos genéticos requeridos para la replicación de ARN pero carecen de aquellos productos génicos de codificación necesarios para el ensamble de la partícula; los genes estructurales del genoma alfavirus se reemplazan por secuencias que codifican una proteína heteróloga. Después del suministro de los replicones a células eucariotas, el ARN de estructura de cadena positivo ser traduce para producir cuatro proteínas no estructurales, que juntas replican el ARN genómico y transcriben abundantes ARNm subgenómicos que codifican el producto génico heterólogo o el gen de interés (GOI). Debido a la falta de expresión de las proteínas estructurales alfavirus, los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor bacteriófago (T7 o SP6) en corriente arriba del ADNc alfavirus facilita la síntesis del replicón de ARN in vitro, y la ribozima del virus delta de hepatitis (HDV) inmediatamente en corriente abajo de la cola poli(A) genera el extremo 3' correcto a través de su actividad de autoescisión.

Con el fin de permitir la formación de un complejo proteico antigénico, la expresión de los componentes individuales en tal complejo en la misma célula es de gran importancia. En teoría, esto puede lograrse mediante la co-transfección de las células con los genes que codifican los componentes individuales. Sin embargo, en el caso de ARN no víricos o de replicón de alfavirus suministrados con VRP, esta estrategia se obstaculiza por el ineficiente co-suministro de múltiples ARN a la misma célula o, alternativamente, por el ineficiente lanzamiento de múltiples ARN de autoreplicación en una célula individual. Una forma potencialmente más eficiente para facilitar la co-expresión de los componentes de un complejo proteico es suministrar los genes respectivos como parte de la misma molécula de ARN de auto-replicación. En este punto, se modificaron los montajes de replicón de alfavirus que codifican múltiples genes de interés. Cada GOI fue precedido por su propio promotor subgenómico que se reconoce por la maquinaria de transcripción de alfavirus. Por lo tanto, se sintetizan múltiples especies de ARN mensajero subgenómico en una célula individual permitiendo el ensamble de complejos proteicos multi-componente.

Tras la linearización del ADN de plásmido en corriente abajo de la ribozima HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, los transcritos ejecutados se sintetizaron in vitro usando polimerasa de ARN dependiente de ADN derivada del bacteriófago T7. Las transcripciones se realizaron por 2 horas a 37 °C en presencia de 7.5 mM de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones provistas por el fabricante (Ambion, Austin, TX). Después de la transcripción, el ADN de plantilla se digirió con TURBO DNase (Ambion, Austin, TX). El ARN de replicón se precipitó con LiCl y reconstituyó en agua sin nucleasa. El ARN sin cubrir se selló después de la transcripción con Enzima de Cubierta de Vacuna (v Ce , por sus siglas en inglés) usando el Sistema de Sellado ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) como se describe en el manual del usuario. El ARN sellado después de la transcripción se precipitó con LiCl y reconstituyó en agua sin nucleasa. La concentración de las muestras de ADN se determinó mediante la medición de la densidad óptica a 260 nm. La integridad de los transcritos in vitro se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizado.

Formulación de Nanopartículas Lípidas (LNP)

1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DlinDMA) se sintetizó usando un procedimiento previamente publicado [Heyes, J., Palmer, L., Bremner, K., MacLachlan, I. Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids. Journal of Controlled Release, 107: 276-287 (2005)]. La 1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC) se compró de Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Lois, MO). El 1,2-dimiristoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (PEG DMG 2000), se obtuvo de Avanti Polar Lipids.

Los LNP (RV01(14)) se formularon usando el siguiente procedimiento. Lote de 150 |jg, (fibras huecas PES y sin mustang): Se prepararon soluciones de reserva de lípido fresco en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de Colesterol y 8,07 mg de PEG DMG 2000 y disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solución de reserva frescamente preparada se balanceó ligeramente a 37 °C durante aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogénea. Después, se agregaron 453 j l de la reserva a 1,547 ml de etanol para hacer una solución de reserva de lípido operativa de 2 ml. Esta cantidad de lípidos se utilizó para formar las LNP con 150 jg de ARN a una proporción de 8:1 de N:P (Nitrógeno a Fosfato). El nitrógeno protonable en DlinDMA (el lípido catiónico) y los fosfatos en el ARN se usaron para este cálculo. Cada jg de la molécula de ARN de auto-replicación se asume que contiene 3 nmoles de fosfato aniónico, cada jg de DlinDMA se asume que contiene 1,6 nmoles de nitrógeno catiónico. También se preparó una solución de trabajo de 2 ml de ARN de una solución madre de ~ 1 jg / j l en 100 mM de tampón de citrato (pH 6) (Teknova). Se enjuagaron tres frascos de 20 ml (con barras de agitación) con Solución RNase Away (Molecular BioProducts) y lavaron con mucha agua MilliQ antes de uso para descontaminar los frascos de RNases. Uno de los frascos se utilizó para la solución de trabajo de ARN y las otras para recolectar las mezclas de lípido y ARN (como se describe más adelante). Las soluciones de trabajo de lípido y ARN se calentaron a 37 °C por 10 min antes de cargarse en jeringas luer-lok de 3cc (BD Medical). Se cargaron 2 ml de tampón de citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas que contienen el ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador T (empalme ID PEEK™ 500 jm ) usando tubería FEP ([etileno-propileno fluorinado] 2mm ID x 3mm OD, Idex Health Science, Oak Harbor, WA). La conexión de salida del mezclador T también fue una tubería FEP (2mm ID x 3mm). La tercera jeringa que contiene el tampón de citrato se conectó a una pieza de tubería separada (2mm ID x 3mm DO). Todas las jeringas después se condujeron a una caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa (de kdScientific, modelo N.° ^k DS-220). Las conexiones de salida del tubo se colocaron para recolectar las mezclas en un frasco de vidrio de 20 ml (con agitación). La barra de agitación se removió y etanol/solución acuosa se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante 1 h. Después, la mezcla se cargó en una jeringa de 5 cc (BD Medical), que se adaptó a una pieza de la tubería FEP (2mm ID x 3mm OD) y en otra jeringa de 5 cc con igual longitud a la tubería FEP, se cargó un volumen igual de 100 mM de tampón de citrato (pH 6). Las dos jeringas se condujeron a una caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa y se recolectó la mezcla final en un frasco de vidrio de 20 ml (con agitación). Después, las LNP se concentraron a 2 ml y se dializaron contra 10-15 volúmenes de 1X de PBS (de Teknova) usando el sistema de Filtración de Flujo Tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibra hueca se compraron de Spectrum Labs y se usaron de acuerdo con las instrucciones de fabricante. Se usaron membranas de filtración de fibra hueca de polietersulfona (PES) (número de parte P-C1-100E-100-01N) con un corte de tamaño de poro de 100 kD y un área de 20 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentración de ARN requerida con 1X de PBS (de Teknova).

Tamaño de Partícula

El tamaño de partícula se midió usando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, RU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los tamaños de partícula se reportaron como el promedio Z con el índice de polidispersidad (pdi). Los liposomas se diluyeron en 1X de PBS antes de la medición.

Eficiencia de la Encapsulación y Concentración de ARN

El porcentaje de ARN encapsulado y la concentración de ARN se determinaron mediante el kit del reactivo de ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen). Se siguieron las instrucciones del fabricante en el ensayo. El estándar de ARN ribosómico provisto en el kit se utilizó para generar una curva estándar. Los LNP ya sea obtenidos del procedimiento 1 o de los procedimientos 2-5 se diluyeron diez veces o cien veces respectivamente en 1X de tampón TE (del kit), antes de la adición del colorante. De forma separada, las LNP se diluyeron diez o cien veces en 1X de tampón con 0,5 % de Triton X (Sigma-Aldrich), antes de la adición del colorante. A continuación, se añadió una cantidad equitativa de colorante a cada solución y después se cargaron ~180 μL de cada solución después de la adición del colorante por duplicado en una placa de cultivo tisular de 96 cavidades (obtenida de VWR, catálogo # 353072). La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyó en un lector de microplacas (de BioTek Instruments, Inc.).

Se utilizó Triton X para alterar las LNP, proporcionando una lectura de fluorescencia correspondiente a la cantidad de ARN total y la muestra sin Triton X proporcionó la fluorescencia correspondiente a ARN no encapsulado. El % de encapsulación de ARN se determinó como sigue: Encapsulación de ARN LNP (%) = [(Ft-F¡)/Ft] x 100, en la que Ft es la intensidad fluorescente de las LNP con la adición de triton X y Fi es la intensidad fluorescente de la solución LNP sin la adición del detergente. Estos valores (Ft y Fi) se obtuvieron después de la sustracción de la intensidad fluorescente en blanco (1X de tampón TE). La concentración del ARN encapsulado se obtuvo comparando Ft-Fi con la curva estándar generada. Todas las formulaciones LNP se dosificaron in vivo con base en la dosis encapsulada.

Partículas de Replicón vírico (VRP)

Para comparar las vacunas de ARN con procedimientos con vectores de ARN tradicionales para obtener la expresión in vivo de los genes o antígenos reporteros, se usaron partículas de replicón vírico (VRP), producidas en células BHK a través de los procedimientos descritos por Perri et al. (J. Virol 77(19): 10394-10403 (2003)), codificando para la expresión de los mismos antígenos como los montajes de ARN correspondientes. En este sistema, el antígeno consistió en replicones quiméricos alfavirus (VCR) derivados del genoma del virus de encefalitis equina de Venezuela (VEEV) modificado para contener las secuencias 3' terminal (3' UTR) del virus Sindbis y una señal de empaque del virus Sindbis (PS) (véase la Fig. 2 de Perri et al.). Los replicones se empacaron en VRP electroporándolos en células de riñón de hámster bebe (BHK) junto con ARN auxiliares defectuosos que codifican la cápside del virus Sindbis y genes de glucoproteína (ver Fig. 2 de Perri y col.). Las VRP después se cosecharon y purificaron parcialmente por ultracentrifugación en un cojín de sacarosa y se concentraron en un concentrador Amicon. La reserva VRP resultante se tituló mediante procedimientos estándar e inoculó en animales en fluido de cultivo u otros tampones isotónicos. Una quimera de partícula de replicón de alfavirus derivada de encefalitis equina venezolana y virus sindbis es un vector de suministro de vacunas a base de gen muy potente. J. Virol. 77, 10394-10403.

Estudios de inmunogenicidad en murinos

Se inmunizaron grupos de 10 ratones hembra BALB/c de 8-10 semanas de edad y pesando aproximadamente 20 g con 1x106 IU (VRP) o 1,0 μg (ARN) en el día 0, 21 y 42 con sangrados tomados 3 semanas después de la 2a y 3a semanas después de la 3a vacunación. Todos los animales se inyectaron en el cuádriceps en las dos patas traseras, cada una obteniendo un volumen equivalente (50 μl por sitio).

Ensayo de Micro-Neutralización

Se probaron muestras séricas para la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante una prueba de neutralización por reducción. Las diluciones seriales dobles de suero HI (en DMEM con 10 % HI de FBS) se agregaron a un volumen igual de CMV (cepa TB40 o aislado clínico 8819) previamente titulados para dar aproximadamente 200 IU/50 ml. Las cepas VR1814, Towne, AD169 y los aislados clínicos 8822 también se usaron. Las mezclas de suero/virus se incubaron por 2 horas a 37 °C y 5 % de CO₂, para dejar que ocurriera la neutralización del virus, y después se inocularon 50 ml de esta mezcla (con aproximadamente 200 iU) en cavidades por duplicado de células a Rp E-19 en placas de 96 medias cavidades. Las placas se incubaron por 40-44 horas. A menos que se indique lo contrario, el número de sitios infectados positivos se determinó por inmunotinción con un anticuerpo monoclonal IE1 CMV conjugado con AlexaFluor 488 seguido por el conteo automático. El título de neutralización se define como el recíproco de la dilución sérica produciendo un 50 % de reducción en el número de sitios de virus positivos por cavidad, con relación a los controles (sin suero).

Inmunogenicidad de VRP gH/gL y ARN formulado con LNP

Para este experimento se usaron el replicón A323 que expresa la glucoproteína B de superficie (gB) de CMV, el replicón A160 que expresa el complejo de membrana de las glucoproteínas H y L de longitud completa (gH/gL), y el replicón A322 que expresa el complejo de membrana de la forma soluble de las glucoproteínas H y L (gHsol/gL). A ratones BALB/c, 10 animales por grupo, se les administraron vacunas intramusculares bilaterales (50 μL por pata) en los días 0, 21 y 42 con VRP que expresan gB (1x106 IU), VRP que expresan gH/gL (1x106 IU), VRP que expresan gHsol/gL (1x106 IU) y PBS como los controles. Los tres grupos de prueba recibieron ARN de auto-replicación (A160, A322 o A323) formulado en LNP (RV01(14). El suero se recolectó para análisis inmunológico en los días 39 (3wp2) y 63 (3wp3).

Resultados

La clasificación y el porcentaje de ARN encapsulado en las formulaciones RV01(14) fabricadas para el experimento se muestran en la Tabla 3.

Los títulos neutralizantes al 50% para el suero terminal (día 63, tres semanas después de la vacunación final) se muestran en la Tabla 4.

ARN que expresa una forma de longitud completa o presunta forma soluble del complejo HCMV gH/gL produce altas concentraciones de anticuerpo neutralizante, como se ensaya en células epiteliales usando dos diferentes cepas HCMV. Estas concentraciones promedio de los ARN gH/gL no son al menos tan altas como la concentración promedio para los VRP gH/gL correspondientes (véase la FIG. 17).

Ejemplo 6 Proteínas de CMV que Codifican Ácidos Nucleicos Bicistrónicos y Pentacistrónicos

Se prepararon replicones alfavirus bicistrónicos y pentacistrónicos adicionales que expresan complejos de glucoproteína de citomegalovirus humano (HCMV), y se muestran esquemáticamente en las FIGS. 18 y 20. Los replicones alfavirus se basaron en el virus de encefalitis equina venezolano (VEE). Los replicones se empacaron en partículas de replicones víricos (VRP), encapsularon en nanopartículas de lípidos (LNP), o formularon con una nanoemulsión catiónica (CNE). La expresión de las proteínas HCMV codificadas y los complejos proteicos de cada uno de los replicones se confirmó por inmunotransferencia, co-inmunoprecipitación, y citometría de flujo. La citometría de flujo se utilizó para verificar la expresión del complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131 de replicones pentaméricos que codifican los componentes de la proteína del complejo, usando anticuerpos monoclonales humanos específicos para los epítopos conformacionales presentes en el complejo pentamérico (Macagno y col. (2010), J. Virol.

84(2): 1005-13). La FIG. 19 muestra que estos anticuerpos se unen a células BHKV transfectadas con el ARN replicón que expresa el complejo pentamérico HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 (A527). Se obtuvieron resultados similares cuando las células se infectaron con VRP hechas del mismo montaje replicón. Esto muestra que los replicones designados para expresar el complejo pentamérico ciertamente expresan el antígeno deseado y no el subproducto potencial gH/gL.

Las VRP, el ARN encapsulado en las LNP, y el ARN formulado con CNE se usaron para inmunizar ratones Balb/c por inyecciones intramusculares en los cuádriceps traseros. Los ratones se inmunizaron tres veces, con 3 semanas de separación, y las muestras séricas se recolectaron antes de cada inmunización también con tres semanas de diferencia después de la tercera y la final inmunización. El suero se evaluó en ensayos de micro-neutralización para medir la potencia de la respuesta del anticuerpo neutralizante que se produjo por las vacunaciones. Los títulos se expresaron como 50 % de título de neutralización.

Se evaluó la inmunogenicidad de un número de configuraciones diferentes de un casete de expresión bicistrónico para un complejo soluble HCMV gH/gL en VRP La FIG. 20 muestra que las VRP que expresan el complejo gH/gL de longitud completa, anclado a membrana, produjo potentes anticuerpos neutralizantes a concentraciones ligeramente más altas que el complejo soluble (gHsol/gL) expresado de un casete de expresión bicistrónico similar. Cambiando el orden de los genes que codifican gHsol y gL o reemplazando uno de los promotores subgenómicos con un IRES o sitio FMDV 2A no mejora sustancialmente la inmunogenicidad.

El alcance y la potencia de la actividad neutralizante de HCMV en suero de ratones inmunizados con VRP VEE/SIN que expresan gH/gL se evaluaron usando el suero para bloquear la infección de fibroblastos y células epiteliales con diferentes cepas de HCMV. La Tabla 5 muestra gH/gL inmuniza el suero ampliamente y lo neutraliza potencialmente frente a seis diferentes cepas de HCMV en ambos tipos celulares en la ausencia del complemento. La adición del complemento tuvo un efecto ligeramente negativo en la potencia de la neutralización del suero.

Se evaluó la inmunogenicidad de ARN encapsulados en LNP que codifican el complejo pentamérico (A526 y A527) en comparación con el ARN encapsulado con LNP (A160) y las VRP (gH-SGPgL modificado con pVCR) que expresan gH/gL. La Tabla 6 shows que los replicones que expresan el complejo pentamérico produjeron potencialmente más anticuerpos neutralizantes que replicones que expresan gH/gL.

El replicón ARN a base de VEE pentacistrónico que logró los títulos más altos de anticuerpos neutralizantes (A527) se empaquetó como VRP y la inmunogenicidad de las VRP se comparó con las VRP que expresan gH/gL y replicones encapsulados LNP que expresan gH/gL y el complejo pentamérico. La Tabla 7 muestra que las VRP que expresan el complejo pentamérico produjeron títulos más altos de anticuerpos neutralizantes que las VRP que expresan gH/gL. Además, 1o6 unidades infecciosas de VRP son al menos tan potentes como 1 |jg de ARN encapsulado en LNP cuando las VRP y el ARN codifican los mismos complejos proteicos.

El alcance y la potencia de la actividad neutralizante de HCMV en suero de ratones inmunizados con ARN con base en VEE que codifica el complejo pentamérico (A527) se evaluó usando el suero para bloquear la infección de los fibroblastos y las células epiteliales con diferentes cepas de HCMV. La Tabla 8 muestra que suero inmune antigH/gL/UL128/UL130/UL131 amplia y potencialmente neutralizó la infección de las células epiteliales. Este efecto fue independiente del complemento. En contraste, el suero tuvo un efecto reducido o no detectable en la infección de los fibroblastos. Estos resultados fueron lo que se esperaba para suero inmune que contiene en su mayor parte anticuerpos específicos para el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131, porque el complejo pentamérico no se requiere para la infección de los fibroblastos y, en consecuencia, los anticuerpos para UL128, UL130, y UL131 no bloquean la infección de los fibroblastos (Adler y col. (2006), J. Gen. Virol. 87(Pt.9):2451-60; Wang y Shenk (2005), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(50):18153-8). De esta forma, estos datos demuestran que los replicones pentaméricos que codifican el complejo pentamérico gH/gL/LTL128/UL130/LTL131pentameric específicamente producen anticuerpos para para el complejo in vivo.

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Para determinar si los replicones bicistrónicos y pentacistrónicos que expresan los complejos gH/gL y pentamérico producirían anticuerpos neutralizantes en diferentes formulaciones, se inmunizaron ratas de algodón con replicones bicistrónicos o pentacistrónicos mezclados con una nanoemulsión catiónica (CNE, por sus siglas en inglés). La Tabla 9 muestra que los replicones en CNE produjeron concentraciones de anticuerpos neutralizantes comparables a los mismos replicones encapsulados en LNP

Ejemplo 7. Replicones que codifican proteínas VVZ

Los ácidos nucleicos que codifican proteínas VVZ se clonaron en un vector replicón VEE para producir replicones monocistrónicos que codifican gB, gH, gL, gE, y gI, y para producir replicones bicistrónicos que codifican gH/gL o gE/gI. En los replicones bicistrónicos, la expresión de cada marco de lectura abierto VVZ se condujo por medio de un promotor subgenómico separado.

Para preparar el ARN replicón, el plásmido que codifica el replicón se linealizó por digestión con PmeI, y el plásmido linealizado se extrajo con fenol/cloroformo/isoamil alcohol, se precipitó en acetato de sodio/etanol y volvió a suspender en 20 |jl de agua sin RNasa.

El ARN se preparó por transcripción in vitro de 1 jg de ADN linearizado usando el kit MEGAscript T7 (AMBION# AM1333). Después se determinó una reacción de 20 jL de acuerdo con las instrucciones del fabricante sin análogo cap y se incubó durante 2 horas 32 °C. Se añadió TURBO DNasa (1 j l ) y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 32 °C. Se añadió la solución de agua sin RNasa (30 j l ) y acetato de amonio (30 jl). La solución se mezcló y enfrió durante al menos 30 min a -20 °C. Después la solución se centrifugó a máxima velocidad por 25 minutos a 4 °C. El sobrenadante se descartó, y los gránulos se enjuagaron con 70 % de etanol, y se nuevo se centrifugaron a máxima velocidad durante 10 minutos a 4 °C. Los gránulos se secaron con aire y se volvieron a suspender en 50 j l de agua sin RNasa. La concentración del ARN se midió y la calidad se verificó en un gel desnaturalizado.

La caperuza de ARN se colocó usando el Sistema de Colocación de Caperuza ScriptCap m7G (Epicentre #SCCE0625). La reacción se escaló combinando el ARN y el agua sin RNasa. El ARN después se desnaturalizó por 5-10 minutos a 65 °C. El ARN desnaturalizado se transfirió rápidamente a hielo y se agregaron los siguientes reactivos en el siguiente orden: Tampón de sellado ScriptCap, 10 mM GTP, 2 mM de ^sA^m recién preparado, inhibidor RNasa ScriptGuard, y Enzima de Sellado ScriptCap. La mezcla se incubó por 60 minutos a 37 °C. La reacción se detuvo mediante la adición de agua sin RNasa y 7,5 M de LiCl, mezclando bien y almacenando la mezcla durante al menos 30 min a -20 °C. Después, la mezcla se centrifugó a velocidad máxima durante 25 minutos a 4 °C, los gránulos se enjuagaron con 70 % de etanol, se volvieron a centrifugar a máxima velocidad por 10 minutos a 4 °C y los gránulos se secaron con aire. Los gránulos se volvieron a suspender en agua sin RNasa. La concentración del ARN se midió y la calidad se verificó en un gel desnaturalizado.

Transfección del ARN

Las células (células BHK-V) se sembraron en placas de 6 pocillos llevadas a una confluencia de 90-95 % en el momento de la transfección. Para cada transfección se diluyeron 3 jg de ARN en 50 ml de medio OPTIMEM en un primer tubo. Se añadió lipofectamina 2000 a un segundo tubo con 50 ml de medio OPTIMEM. El primero y segundo tubos se combinaron y mantuvieron por 20 minutos a temperatura ambiente. El medio de cultivo en placas de 6 cavidades se reemplazó con medio fresco, el complejo de ARN-Lipofectamina se colocó en las células, y se mezcló haciendo oscilar ligeramente la placa. Las placas se incubaron por 24 horas a 37 °C en una incubadora con CO2.

La expresión de las proteínas VVZ en las células transferidas se evaluó por Western blot e inmunofluorescencia. Para los Transferencias Western, los lisados de células transfectadas se separaron por electroforesis (5 jg de proteína total/carril) y se tiñeron. Se utilizó una suspensión vírica aclarada (7 jg de proteína total/carril) derivada de la cepa de la vacuna OKNMerck como un control positivo. Las tinciones se sondearon usando anticuerpos disponibles en el mercado (dilución 1:1000) que se unen a las proteínas VVZ.

Para inmunofluorescencia, las células transfectadas se cosecharon y sembraron en una placa de 96 pocillos, y se llevó a cabo la tinción intracelular usando mAbs de ratón comercialmente disponibles (intervalo de dilución 1:100 a 1:400). Los granulados de célula se fijaron y permeabilizaron con soluciones Citofix-Citoperm. Se utilizó un reactivo secundario, F(ab')₂ de anti-ratón de cabra marcado con Alexa488 (1:400 de dilución final).

La expresión de gE y gl de proteínas VVZ se detectó en células transfectadas con montajes monocistrónicos (gE o gl), y la expresión de ambas gE y gl se detectó en células transfectadas con un montaje bicistrónico gE/gl en Western blot usando anticuerpos de ratón comercialmente disponibles, 13B1 para gE y 8C4 para gl. La expresión de gB de la proteína VVZ se detectó en células transfectadas con un montaje monocistrónico que codifica gB, por inmunofluorescencia usando el anticuerpo 10G6 comercialmente disponible. La expresión del complejo gH/gL de la proteína VVZ se detectó por inmunofluorescencia en células transfectadas con gH monocistrónico y gL monocistrónico, o con un montaje gH/gL bicistrónico. El complejo gH/gL se detectó usando el anticuerpo SG3 comercialmente disponible.

Estudios de inmunogenicidad en murinos

Grupos de ocho ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad y con un peso de aproximadamente 20 g se inmunizaron intramuscularmente con 7,0 o 1,0 jg de ARN replicón formulado con CNE o LNP (RV01) en el día 0, 21 y 42. Las muestras de sangre se tomaron de los animales inmunizados 3 semanas después de la 2a inmunización y 3 semanas después de la 3a inmunización. Los grupos se muestran en la Tabla 10.

Respuesta inmune a antígenos VVZ Las muestras séricas se probaron por la presencia de anticuerpos para gB, por tinción intracelular de células MCR-5 transfectadas con replicón VVZ. Las células MRC-5 se mantuvieron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco con 10 % de suero de bovino fetal. La vacuna de la cepa VVZ (obtenida de ATCC) se utilizó para infectar el cultivo de la célula MRC-5 culture y se usaron células enteras infectadas para el sub-pasaje del virus. La proporción entre las células infectadas y no infectadas fue 1: 10. Treinta horas después de la infección las células se dispersaron con tripsina para sembrarlas en una placa de 96 cavidades para llevar a cabo la tinción intracelular con combinaciones de suero de ratones (intervalo de dilución 1:200 a 1:800) obtenido después de la inmunización. Los mAbs comerciales se usaron como controles para cuantificar el nivel de infección. Los granulados de células se fijaron y permeabilizaron con soluciones Citofix-Citoperm. Se utilizó un reactivo secundario, F(ab')₂ anti-ratón de cabra marcado con Alexa488 (dilución final 1:400).

Se usaron anticuerpos comerciales para gB (10G6), gH (SG3), y gE (13B1 (SBA) y 8612 (Millipore)) como controles positivos, y cada una de las células MRC-5 infectadas fue sometida intracelularmente a tinción. El suero inmune obtenido 3 semanas después de la tercera inmunización con ya sea 1 o 7 |jg de ARN formulado con CNE o LNP se diluyó 1/200, 1/400 y 1/800 y utilizó para teñir intracelularmente las células MRC-5 infectadas. Los resultados se muestran en la FIG. 21 (Estudio 1, grupos 1, 5, 7, 9, 11, 13 y 15, formulación CNE) y FIG. 22 (Estudio 2, grupos 1-7, formulación LNP).

Ensayo de Neutralización

El suero de cada ratón inmunizado se diluyó en serie en aumentos de dos veces partiendo de 1:20 en medio de cultivo estándar, y se añadió a un volumen igual de suspensión VVZ en presencia de complemento de cobayo. Después de 1 hora de incubación a 37 °C, se añadió la línea de células epiteliales humanas A549. Las células infectadas pueden medirse después de una semana del cultivo contando las placas formadas en el cultivo bajo el microscopio. Del número de placas se calculó el % de inhibición en cada dilución sérica. Se hizo una gráfica de cada muestra sérica graficando el valor del % de inhibición contra la escala logarítmica del factor de dilución. Posteriormente se trazó una línea aproximada de la relación entre el factor de dilución y el % de inhibición. Después se determinó el 50 % del título de neutralización como el factor de dilución en donde la línea cruzó el valor del 50 % de inhibición.

La Tabla 11 muestra que el suero obtenido de ratones inmunizados con gE monocistrónico, gE/gI bicistrónico, y gH/gL bicistrónico contenía títulos sólidos de anticuerpo neutralizante.

REFERENCIAS

Britt WJ, Alford CA. Cytomegalovirus. In Fields BN, Knipe DM, Howley PM (ed.). Fields Virology, 3a edición, Philadelphia, PA: Lippincott/Raven; 1996. p. 2493-523.

Chee MS, Bankier AT, Beck S, Bohni R, Brown CM, Cerny R, Horsnell T, Hutchinson CA, Kouzarides T, Martignetti JA, Preddie E, Satchwell SC, Tomlinson P, Weston KM y Barrell BG. 1990. Analysis of the proteincoding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD 169. Curr. Top. Microbiol. Immunol.

154:125-70.

Davison AJ, Dolan A, Akter P, Addison C, Dargan DJ, Alcendor DJ, McGeoch DJ y Hayward GS. 2003. The human cytomegalovirus genome revisited: comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome. J. Gen. Virol. 84:17-28. (Erratum, 84:1053).

Crumpacker CS y Wadhwa S. 2005. Cytomegalovirus, p 1786-1800. In G.L. Mandell, J.E. Bennett, y R. Dolin (ed.), Principles y practice of infectious diseases, vol 2. Elsevier, Philadelphia, PA.

Pomeroy C y Englund JA. 1987. Cyotmegalovirus: epidemiology y infection control. Am J Infect Control 15: 107-119.

Murphy E, Yu D, Grimwood J, Schmutz J, Dickson M, Jarvis MA, Nelson JA, Myers RM y Shenk TE. 2003. Coding potential of laboratory and clinical strains of cytomegalovirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14976-81.

Mocarski ES y Tan Courcelle C. 2001. Cytomegalovirus and their replication, p. 2629-73. In DM Knipe and PM Howley (ed.) Fields Virology, 4th edition, vol. 2. Lippincott Williams y Wilkins, Philadelphia, PA.

Compton T. 2004. Receptors y immune sensors: the complex entry path of human cytomegalovirus. Trends Cell. Bio. 14(1): 5-8.

Britt WJ y Alford CA. 2004. Human cytomegalovirus virion proteins. Hum. Immunol. 65:395-402.

Varnum SM, Streblow DN, Monroe ME, Smith P, Auberry KJ, Pasa-Tolic L, Wang D, Camp II DG, Rodland K, Wiley, Britt W, Shenk T, Smith RD y Nelson JA. 2004. Identification of proteins in human cytomegalovirus (HCMV) particles: the HCMV proteome. J. Virol. 78:10960-66. (Erratum, 78:13395).

Ljungman P, Griffiths P y Paya C. 2002. Definitions of cytomegalovirus infection and disease in transplant recipients. Clin. Infect. Dis. 34: 1094-97.

Rubin R. 2002. Clinical approach to infection in the compromised host, p. 573-679. In R. Rubin and LS Young (ed), Infection in the organ transplant recipient. Kluwer Academic Press, New York, NY

Stagno S y Britt WJ. 2005. Cytomegalovirus, p. 389-424. In JS Remington and 10 Klein (ed), Infectious diseases of the fetus and newborn infant, 6htt edición. WB Saunders, Philadelphia, PA.

Britt WJ, Vugler L, Butfiloski EJ y Stephens EB. 1990. Cell surface expression of human cytomegalovirus (HCMV) gp55-116 (gB): use of HCMV-vaccinia recombinant virus infected cells in analysis of the human neutralizing antibody response. J. Virol. 64:1079-85.

Reap EA, Dryga SA, Morris J, Rivers B, Norberg PK, Olmsted RA y Chulay JD. 2007. Cellular and Humoral Immune Responses to Alphavirus Replicon Vaccines expressing Cytomegalovirus pp65, IL1 y gB proteins. Clin. Vacc. Immunol. 14:748-55.

Balasuriya UBR, Heidner HW, Hedges JF, Williams JC, Davis NL, Johnston RE y MacLachlan NJ. 2000. Expression of the two major envelope proteins of equine arteritis virus as a heterodimer is necessary for induction of anticuerpos neutralizantes in ratones inmunizados with recombinant Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles. J. Virol. 74:10623-30.

Dunn W, Chou C, Li H, Hai R, Patterson D, Stoic V, Zhu H y Liu F. 2003. Functional profiling of a human cytomegalovirus genome. Proc. Natl. Acad. Sci USA 100:14223-28.

Hobom U, Brune W, Messerle M, Hahn G y Kosinowski UH. 2000. Fast screening procedures for random transposon llibraries of cloned virus del herpes genomes: mutational analysis of human cytomegalovirus envelope glycoprotein genes. J. Virol. 74:7720-29.

Ryckman BJ, Chase MC y Johnson DC.2009. HCMV TR strain glycoprotein O acts as a chaperone promoting gH/gL incorporation into virions, but is not present in virions. J. Virol.

Wille PT, Knoche AJ, Nelson JA, Jarvis MA y Johnson JC. 2009. An HCMV gO-null mutant fails to incorpórate gH/gL into the virion envelope and is unable to enter fibroblastos, epithelial, y endothelial cells. J. Virol. Shimamura M, Mach M y Britt WJ. 2006. Human Cytomegalovirus infection elicits a glycoprotein M (gM)/gN-specific virus-neutralizing antibody response. J. Virol. 80:4591-4600.

Cha TA, Tom E, Kemble GW, Duke GM, Mocarski ES y Spaete RR. 1996. Human cytomegalovirus clinical isolates carry at least 19 genes not found in laboratory strains. J. Virol. 70:78-83.

Wang D y Shenk T 2005. Human cytomegalovirus virion protein complex required for epithelial y endothelial cell tropism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:18153-58.

Adler B, Scrivano L, Ruzcics Z, Rupp B, Sinzger C y Kosinowski U. 2006. Role of human cytomegalovirus UL131A in cell type-specific virus entry and release. J. Gen. Virol. 87:2451-60.

Ryckman BJ, Rainish BL, Chase MC, Borton JA, Nelson JA, Jarvis JA y Johnson DC. 2008. Characterization of the human cytomegalovirus gH/gL/UL128-UL131 complex that mediates entry into epithelial y endothelial cells. J. Virol. 82: 60-70.

SECUENCIAS

g c a g g c g

a Secuencia de nucleótidos de EMCV IRES;

Secuencia de nucleótidos EV71 IRES;

Promotor subgenómico VEE 5'-CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA-3'

Vector gH sol-SGP gL modificado por pVCR

Vector gH FL-SGP gL modificado por pVCR

Vector gH sol-SGP gL-SGP gO modificado por pVCR

Vector gH sol-SGP gL-SGP gO modificado por pVCR

Vector A526: SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-2A-UL130-2Amod-UL131

Vector A527: SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-EMCV-UL130-EV71-UL131

Vector A531: SGP-gHsol-SGP-gL

Vector A532: SGP-gHsol-2A-gL

Vector A533: SGP-gHsol-EV71-gL

Vector A534: SGP-gL-EV71-gH

Vector A535: SGP-342-EV71-gHsol-2A-gL

VectorA536: SGP-342-EV71-gHsol-EMCV-gL

Vector A537: SGP-342-EV71-gL-EMCV-gHsol

Vector A554: SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131

Vector A555: SGP-gHsol-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131

Vector A556: SGP-gHsol6His-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131

VVZ gB

VVZ gH

VVZ gL

VVZ gl

VVZ gE

VVZ VEERep.SGPgB

VVZ VEERep.SGPgH

VVZ VEERep.SGPgL

VZV VEERep.SGPgH-SGPgL

VVZ VEERep.SGPgE

VVZ VEERep.SGPgl

VVZ VEErep.SGPgE-SGPgl

Replicón que codifica eGFP basado en VEE

Auxiliar de caperuza de VEE

Auxiliar de gly de VEE

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición comprendiendo una molécula de ARN autorreplicante y un sistema de administración de ARN, en la que la molécula de ARN autorreplicante comprende un polinucleótido que comprende:

a. una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína o un fragmento de la misma de un virus del herpes;

b. una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes;

c. una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes;

d. una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes; y

e. una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes;

dicha primera proteína o fragmento de la misma, segunda proteína o fragmento de la misma, tercera proteína o fragmento de la misma, cuarta proteína o fragmento de la misma y quinta proteína o fragmento de la misma son proteínas del virus del herpes que forman complejos pentaméricos entre sí; y

en la que la primera secuencia de nucleótidos, la segunda de nucleótidos, la tercera secuencia de nucleótidos, la cuarta secuencia de nucleótidos y la quinta secuencia de nucleótidos están operativamente enlazadas a uno o más elementos de control de tal forma que cuando se introduce la molécula de ARN autorreplicante en una célula adecuada, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas del virus del herpes o fragmentos de las mismas se producen en una cantidad suficiente para la formación de un complejo en la célula que contiene la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas o fragmentos; y en la que el sistema de suministro de ARN es un liposoma, una nanopartícula polimérica, una nanoemulsión catiónica de aceite en agua o combinaciones de los mismos.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la primera proteína, la segunda proteína, la tercera proteína, la cuarta proteína y la quinta proteína no son la misma proteína o fragmentos de la misma proteína, ni un fragmento unas de otras.

3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el virus del herpes es citomegalovirus (CMV) o el virus de varicela zoster (VVZ).

4. La composición de la reivindicación 3, en la que el virus del herpes es CMV y:

a. la primera proteína o fragmento, la segunda proteína o fragmento, la tercera proteína o fragmento, la cuarta proteína o fragmento y la quinta proteína o fragmento se seleccionan independientemente del grupo que consiste en gB, gH, gL; gO; gM; gN; UL128, UL130, UL131 y un fragmento de uno cualquiera de los anteriores; o

b. la primera proteína o fragmento es gH o un fragmento de la misma y la segunda proteína o fragmento es gL o un fragmento de la misma, la tercera proteína o fragmento es UL128 o un fragmento de la misma, la cuarta proteína o fragmento es UL130 o un fragmento de la misma y la quinta proteína o fragmento es UL131 o un fragmento de la misma.

5. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que la molécula de ARN autorreplicante es un replicón de alfavirus.

6. La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que el sistema de administración de ARN es un liposoma.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el sistema de administración de ARN es una nanoemulsión catiónica de aceite en agua.

8. Un procedimiento in v itro para formación de un complejo proteico, que comprende administrar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 a una célula, y mantener la célula en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ARN autorreplicante.

9. La composición definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en medicina.

10. La composición para uso de la reivindicación 9 para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un individuo.