JP6025721B2 - カチオン性水中油型エマルジョン - Google Patents
カチオン性水中油型エマルジョン Download PDFInfo
- Publication number
- JP6025721B2 JP6025721B2 JP2013518815A JP2013518815A JP6025721B2 JP 6025721 B2 JP6025721 B2 JP 6025721B2 JP 2013518815 A JP2013518815 A JP 2013518815A JP 2013518815 A JP2013518815 A JP 2013518815A JP 6025721 B2 JP6025721 B2 JP 6025721B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oil
- composition
- cationic
- rna
- emulsion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
- A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/113—Multiple emulsions, e.g. oil-in-water-in-oil
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
本出願は、2010年7月6日に出願された米国仮出願第61/361,892号の利益を主張し、上記米国仮出願の全教示は参考として本明細書に援用される。
核酸治療剤は、遺伝性障害から後天性状態の範囲の疾患、例えば、がん、感染性障害(AIDS)、心疾患、関節炎、および神経変性障害(例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病)などの処置に関して有望である。遺伝的欠損を修復するか、または外来遺伝子産物の発現を誘導するために機能遺伝子を送達することができるだけでなく、内在性遺伝子発現を阻害することによって、治療効果をもたらすために核酸を送達することもできる。遺伝子発現の阻害は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖RNA(例えば、siRNA、miRNA)、またはリボザイムによって媒介され得る。
ている。しかし、血清はアニオン性物質を含有するので、少量の血清でさえ(約10%)、リポソーム/DNA複合体のトランスフェクション活性を劇的に低減させ得る。最近、細胞内にDNA分子を送達するためのカチオン性脂質エマルジョンが開発された。例えば、非特許文献3を参照。
る。RNAワクチンは、DNAワクチンと比較した場合、ある特定の利点を提供する。第1に、RNAは、宿主ゲノム中に組み込まれず、したがって、悪性腫瘍のリスクをなくす。第2に、RNAは急速に分解されるために、異質な導入遺伝子の発現は長続きしないことが多く、抗原の制御されない長期間の発現を回避する。第3に、RNA分子は、コードされる抗原を発現するのに細胞質に送達される必要があるだけであり、一方、DNA分子は、核膜を透過しなければならない。
コレステロール)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA)、1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、ジパルミトイル(C16:0)トリメチルアンモニウムプロパン(DPTAP)、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン(DSTAP)、WO2011/076807(参照により本明細書に組み込まれている)の表6(112〜139頁)に開示されている脂質E0001〜E0118もしくはE0119〜E0180、またはこれらの組合せ。特に好適なカチオン性脂質として、DOTAP、DCコレステロール、およびDDAが挙げられる。
張化剤をさらに含む。
れており(例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで)、約6.0〜約8.0、好ましくは、約6.2〜約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩(例えば、NaCl)を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
テロールを含み、水中油型エマルジョンが、約2.46mg/ml〜約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、負に荷電した分子はRNAであり、エマルジョン粒子の平均直径は、約80nm〜約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており(例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで)、約6.0〜約8.0、好ましくは、約6.2〜約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩(例えば、NaCl)を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
m〜約180nmであり、エマルジョンのN/Pは、少なくとも4:1である。任意選択により、組成物は、緩衝化されており(例えば、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファーなどで)、約6.0〜約8.0、好ましくは、約6.2〜約6.8のpHを有し、30mM以下の無機塩(例えば、NaCl)を含有する。任意選択により、組成物は、組成物を等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
ルジョンを等張性にするのに十分な量で、糖、糖アルコール、またはこれらの組合せなどの非イオン性等張化剤をさらに含む。
01年12月12日;20巻(5〜6号):711〜23頁を参照。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)25℃で液相である油コア、および
(b)カチオン性脂質
を含む、組成物。
(項目2)
前記油コアが4℃で液相である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記粒子が界面活性剤をさらに含む、項目1または2に記載の組成物。
(項目4)
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、項目3に記載の組成物。
(項目5)
前記界面活性剤が、SPAN85(ソルビタントリオレエート)、Tween80(ポリソルベート80)、またはこれらの組合せである、項目3または4に記載の組成物。
(項目6)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.01%〜約2.5%(v/v)の界面活性剤を含む、項目3から5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目7)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.08%(v/v)のTween80を含む、項目3から6のいずれか一項に記載の組成物。
(項目8)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.5%(v/v)のTween80、および約0.5%(v/v)のSPAN85を含む、項目3から6のいずれか一項に記載の組成物。
(項目9)
約0.005%〜約1.25%(v/v)の界面活性剤を含む、項目3から5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目10)
約0.04%(v/v)のTween80を含む、項目3から5および9のいずれか一項に記載の組成物。
(項目11)
約0.25%(v/v)のTween80、および約0.25%(v/v)のSPAN85を含む、項目3から5および9のいずれか一項に記載の組成物。
(項目12)
前記界面活性剤がポリエチレングリコール(PEG)−脂質である、項目3または4に記載の組成物。
(項目13)
前記界面活性剤が、ポリエチレングリコール(PEG) 2000 PE、PEG 5000 PE、PEG 1000 DMG、PEG 2000 DMG、PEG 3000 DMG、またはこれらの組合せである、項目12に記載の組成物。
(項目14)
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、項目3から13のいずれか一項に記載の組成物。
(項目15)
前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、項目3から14のいずれか一項に記載の組成物。
(項目16)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.2%〜約20%(v/v)の油を含む、項目3から15のいずれか一項に記載の組成物。
(項目17)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約4%〜約5%(v/v)の油を含む、項目3から16のいずれか一項に記載の組成物。
(項目18)
約0.1%〜約10%(v/v)の油を含む、項目3から15のいずれか一項に記載の組成物。
(項目19)
約2%〜約2.5%(v/v)の油を含む、項目3から16のいずれか一項に記載の組成物。
(項目20)
前記粒子がリン脂質をさらに含む、項目1または2に記載の組成物。
(項目21)
前記リン脂質が、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、卵ホスファチジルコリン(卵PC)、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPyPE)、またはこれらの組合せである、項目20に記載の組成物。
(項目22)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml〜約10mg/mlのDOPEを含む、項目20または21に記載の組成物。
(項目23)
約0.05mg/ml〜約5mg/mlのDOPEを含む、項目20または21に記載の組成物。
(項目24)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml〜約10mg/mlの卵PCを含む、項目20または21に記載の組成物。
(項目25)
約0.05mg/ml〜約5mg/mlの卵PCを含む、項目20または21に記載の組成物。
(項目26)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml〜約10mg/mlのDPyPEを含む、項目20または21に記載の組成物。
(項目27)
約0.05mg/ml〜約5mg/mlのDPyPEを含む、項目20または21に記載の組成物。
(項目28)
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、項目20から27のいずれか一項に記載の組成物。
(項目29)
前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、項目20から28のいずれか一項に記載の組成物。
(項目30)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.2%〜約20%(v/v)の油を含む、項目20から29のいずれか一項に記載の組成物。
(項目31)
約0.1%〜約10%(v/v)の油を含む、項目20から29のいずれか一項に記載の組成物。
(項目32)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、該エマルジョンの水相中にポリマーまたは界面活性剤をさらに含む、項目1または2に記載の組成物。
(項目33)
前記ポリマーがポロキサマーである、項目32に記載の組成物。
(項目34)
前記ポリマーがPluronic(登録商標)F127である、項目32または33に記載の組成物。
(項目35)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1%〜約10%(v/v)のポリマーを含む、項目32から34のいずれか一項に記載の組成物。
(項目36)
ポリマーまたは界面活性剤をさらに含む、項目1または2に記載の組成物。
(項目37)
前記ポリマーがポロキサマーである、項目36に記載の組成物。
(項目38)
前記ポリマーがPluronic(登録商標)F127である、項目36または37に記載の組成物。
(項目39)
約0.1%〜約10%(w/v)ポリマーを含む、項目36から38のいずれか一項に記載の組成物。
(項目40)
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、項目32から39のいずれか一項に記載の組成物。
(項目41)
前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含む、項目32から40のいずれか一項に記載の組成物。
(項目42)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.2%〜約20%(v/v)の油を含む、項目32から41のいずれか一項に記載の組成物。
(項目43)
約0.1%〜約10%(v/v)の油を含む、項目32から41のいずれか一項に記載の組成物。
(項目44)
前記カチオン性脂質が、1,2−ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)、3β−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール(DCコレステロール)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA)、1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、ジパルミトイル(C 16:0 )トリメチルアンモニウムプロパン(DPTAP)、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン(DSTAP)、および米国仮特許出願第61/284,787号に開示された脂質E0001〜E0118からなる群より選択される、項目1から43のいずれか一項に記載の組成物。
(項目45)
前記カチオン性脂質が、1,2−ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)、3β−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール(DCコレステロール)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA)、1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、ジパルミトイル(C 16:0 )トリメチルアンモニウムプロパン(DPTAP)、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン(DSTAP)、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N−ジオレオイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−エチルホスホコリン(DOEPC)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン(DODAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、および米国仮特許出願第61/284,787号に開示された脂質E0001〜E0118からなる群より選択される、項目1から43のいずれか一項に記載の組成物。
(項目46)
前記カチオン性脂質がDOTAPである、項目1から45のいずれか一項に記載の組成物。
(項目47)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml〜約3.0mg/mlのDOTAPを含む、項目46に記載の組成物。
(項目48)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml〜約1.6mg/mlのDOTAPを含む、項目46または47に記載の組成物。
(項目49)
約0.4mg/ml〜約1.5mg/mlのDOTAPを含む、項目46に記載の組成物。
(項目50)
約0.4mg/ml〜約0.8mg/mlのDOTAPを含む、項目43または44に記載の組成物。
(項目51)
前記カチオン性脂質がDCコレステロールである、項目1から45のいずれか一項に記載の組成物。
(項目52)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.62mg/ml〜約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む、項目51に記載の組成物。
(項目53)
約0.31mg/ml〜約2.46mg/mlのDCコレステロールを含む、項目51に記載の組成物。
(項目54)
前記カチオン性脂質がDDAである、項目1から45のいずれか一項に記載の組成物。
(項目55)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.73mg/ml〜約1.45mg/mlのDDAを含む、項目54に記載の組成物。
(項目56)
約0.365mg/ml〜約1.725mg/mlのDDAを含む、項目54に記載の組成物。
(項目57)
前記カチオン性脂質がDOTMAである、項目1から45のいずれか一項に記載の組成物。
(項目58)
約0.4mg/ml〜約0.8mg/mlのDOTMAを含む、項目57に記載の組成物。
(項目59)
前記カチオン性脂質がDOEPCである、項目1から45のいずれか一項に記載の組成物。
(項目60)
約0.4mg/ml〜約0.9mg/mlのDOEPCを含む、項目59に記載の組成物。
(項目61)
前記カチオン性脂質がDODACである、項目1から45のいずれか一項に記載の組成物。
(項目62)
約0.365mg/ml〜約0.725mg/mlのDODACを含む、項目61に記載の組成物。
(項目63)
約280mM〜約300mMのスクロース、マンニトール、トレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む、項目1から62のいずれか一項に記載の組成物。
(項目64)
約280mMのスクロース、約10mMのNaCl、約1mMのクエン酸塩、および約0.5%(w/v)のPluronic F127を含む、項目1から63のいずれか一項に記載の組成物。
(項目65)
前記RNA分子が、抗原をコードする自己複製RNA分子である、項目1から64のいずれか一項に記載の組成物。
(項目66)
前記自己複製RNAがアルファウイルス由来RNAレプリコンである、項目65に記載の組成物。
(項目67)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該カチオン性水中油型エマルジョンは、
(a)約0.5%(v/v)の油、および
(b)カチオン性脂質
を含む、組成物。
(項目68)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、
(a)約0.25%(v/v)の油、および
(b)カチオン性脂質
を含む、組成物。
(項目69)
前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、項目67または68に記載の組成物。
(項目70)
前記核酸分子がRNA分子である、項目69に記載の組成物。
(項目71)
前記RNA分子が自己複製RNA分子である、項目70に記載の組成物。
(項目72)
前記自己複製RNAがアルファウイルス由来RNAレプリコンである、項目71に記載の組成物。
(項目73)
前記粒子が界面活性剤をさらに含む、項目67から72のいずれか一項に記載の組成物。
(項目74)
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、項目73に記載の組成物。
(項目75)
前記界面活性剤が、SPAN85(ソルビタントリオレエート)、Tween80(ポリソルベート80)、またはこれらの組合せである、項目73または74に記載の組成物。
(項目76)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.01%〜約2.5%(v/v)の界面活性剤を含む、項目73から75のいずれか一項に記載の組成物。
(項目77)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.08%(v/v)のTween80を含む、項目73から76のいずれか一項に記載の組成物。
(項目78)
約0.005%〜約1.25%(v/v)の界面活性剤を含む、項目73から75のいずれか一項に記載の組成物。
(項目79)
約0.04%(v/v)のTween80を含む、項目73から75および78のいずれか一項に記載の組成物。
(項目80)
前記カチオン性脂質が、1,2−ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)、3β−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール(DCコレステロール)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA)、1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、ジパルミトイル(C 16:0 )トリメチルアンモニウムプロパン(DPTAP)、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン(DSTAP)、および米国仮特許出願第61/284,787号に開示された脂質E0001〜E0118からなる群より選択される、項目67から79のいずれか一項に記載の組成物。
(項目81)
前記カチオン性脂質が、1,2−ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)、3β−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール(DCコレステロール)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA)、1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、ジパルミトイル(C 16:0 )トリメチルアンモニウムプロパン(DPTAP)、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン(DSTAP)、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N−ジオレオイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−エチルホスホコリン(DOEPC)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン(DODAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、および米国仮特許出願第61/284,787号に開示された脂質E0001〜E0118からなる群より選択される、項目67から79のいずれか一項に記載の組成物。
(項目82)
前記カチオン性脂質がDOTAPである、項目67から81のいずれか一項に記載の組成物。
(項目83)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml〜約3.0mg/mlのDOTAPを含む、項目82に記載の組成物。
(項目84)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/ml〜約1.6mg/mlのDOTAPを含む、項目82または83に記載の組成物。
(項目85)
約0.4mg/ml〜約1.5mg/mlのDOTAPを含む、項目82に記載の組成物。
(項目86)
約0.4mg/ml〜約0.8mg/mlのDOTAPを含む、項目82または85に記載の組成物。
(項目87)
前記カチオン性脂質がDCコレステロールである、項目67から81のいずれか一項に記載の組成物。
(項目88)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.62mg/ml〜約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む、項目87に記載の組成物。
(項目89)
約0.31mg/ml〜約2.46mg/mlのDCコレステロールを含む、項目87に記載の組成物。
(項目90)
前記カチオン性脂質がDDAである、項目67から81のいずれか一項に記載の組成物。
(項目91)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.73mg/ml〜約1.45mg/mlのDDAを含む、項目90に記載の組成物。
(項目92)
約0.365mg/ml〜約1.725mg/mlのDDAを含む、項目90に記載の組成物。
(項目93)
前記カチオン性脂質がDOTMAである、項目67から81のいずれか一項に記載の組成物。
(項目94)
約0.4mg/ml〜約0.8mg/mlのDOTMAを含む、項目93に記載の組成物。
(項目95)
前記カチオン性脂質がDOEPCである、項目67から81のいずれか一項に記載の組成物。
(項目96)
約0.4mg/ml〜約0.9mg/mlのDOEPCを含む、項目95に記載の組成物。
(項目97)
前記カチオン性脂質がDODACである、項目67から81のいずれか一項に記載の組成物。
(項目98)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.365mg/ml〜約0.725mg/mlのDODACを含む、項目97に記載の組成物。
(項目99)
前記油コアが25℃で液相である、項目67から98のいずれか一項に記載の組成物。
(項目100)
前記油コアが4℃で液相である、項目67から99のいずれか一項に記載の組成物。
(項目101)
前記油が、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、鉱油、またはこれらの組合せである、項目67から100のいずれか一項に記載の組成物。
(項目102)
前記油が、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、スクアレン、またはこれらの組合せである、項目67から101のいずれか一項に記載の組成物。
(項目103)
約280mM〜約300mMのスクロース、マンニトール、トレハロース、スクロース、ソルビトール、またはデキストロースを含む、項目67から102のいずれか一項に記載の組成物。
(項目104)
約280mMのスクロース、約10mMのNaCl、約1mMのクエン酸塩、および約0.5%(w/v)のPluronic F127を含む、項目67から103のいずれか一項に記載の組成物。
(項目105)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、
(b)カチオン性脂質、および
(c)リン脂質
を含む、組成物。
(項目106)
前記リン脂質が1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPyPE)である、項目105に記載の組成物。
(項目107)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml〜約10mg/mlのDPyPEを含む、項目106に記載の組成物。
(項目108)
約0.05mg/ml〜約5mg/mlのDPyPEを含む、項目106に記載の組成物。
(項目109)
前記リン脂質が卵PCである、項目105に記載の組成物。
(項目110)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml〜約10mg/mlの卵PCを含む、項目109に記載の組成物。
(項目111)
約0.05mg/ml〜約5mg/mlの卵PCを含む、項目109に記載の組成物。
(項目112)
前記リン脂質がDOPEである、項目105に記載の組成物。
(項目113)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.1mg/ml〜約10mg/mlのDOPEを含む、項目112に記載の組成物。
(項目114)
約0.05mg/ml〜約5mg/mlのDOPEを含む、項目112に記載の組成物。
(項目115)
前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、項目105から114のいずれか一項に記載の組成物。
(項目116)
前記核酸分子がRNA分子である、項目115に記載の組成物。
(項目117)
前記RNA分子が自己複製RNA分子である、項目116に記載の組成物。
(項目118)
前記自己複製RNAがアルファウイルス由来RNAレプリコンである、項目117に記載の組成物。
(項目119)
前記油コアが、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、月見草油、魚油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ラッカセイ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、および鉱油からなる群より選択される油を含む、項目105から118のいずれか一項に記載の組成物。
(項目120)
前記油コアが、ダイズ油、ヒマワリ油、オリーブ油、またはスクアレンを含む、項目105から119のいずれか一項に記載の組成物。
(項目121)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.2%〜約20%(v/v)の油を含む、項目105から120のいずれか一項に記載の組成物。
(項目122)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約4%〜約5%(v/v)の油を含む、項目105から121のいずれか一項に記載の組成物。
(項目123)
約0.1%〜約10%(v/v)の油を含む、項目105から120のいずれか一項に記載の組成物。
(項目124)
約2%〜約2.5%(v/v)の油を含む、項目105から120および123のいずれか一項に記載の組成物。
(項目125)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DOTAP
を含み、該水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml〜約3.0mg/mlのDOTAPを含む、組成物。
(項目126)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約0.8mg/mlのDOTAPを含む、項目125に記載の組成物。
(項目127)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約1.2mg/mlのDOTAPを含む、項目125に記載の組成物。
(項目128)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約1.4mg/mlのDOTAPを含む、項目125に記載の組成物。
(項目129)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約1.6mg/mlのDOTAPを含む、項目125に記載の組成物。
(項目130)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DOTAP
を含み、該組成物は、約0.4mg/ml〜約1.5mg/mlのDOTAPを含む、組成物。
(項目131)
約0.4mg/mlのDOTAPを含む、項目130に記載の組成物。
(項目132)
約0.6mg/mlのDOTAPを含む、項目130に記載の組成物。
(項目133)
約0.7mg/mlのDOTAPを含む、項目130に記載の組成物。
(項目134)
約0.8mg/mlのDOTAPを含む、項目130に記載の組成物。
(項目135)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DCコレステロール
を含み、該水中油型エマルジョンは、約2.46mg/ml〜約4.92mg/mlのDCコレステロールを含む、組成物。
(項目136)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約2.46mg/mlのDCコレステロールを含む、項目135に記載の組成物。
(項目137)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DCコレステロール
を含み、該組成物は、約1.23mg/ml〜約2.46mg/mlのDCコレステロールを含む、組成物。
(項目138)
約1.23mg/mlのDCコレステロールを含む、項目135に記載の組成物。
(項目139)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DDA
を含み、該水中油型エマルジョンは、約0.73mg/ml〜約1.45mg/mlのDDAを含む、組成物。
(項目140)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、約1.45mg/mlのDDAを含む、項目139に記載の組成物。
(項目141)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DDA
を含み、該組成物は、約0.365mg/ml〜約0.725mg/mlのDDAを含む、組成物。
(項目142)
約0.725mg/mlのDDAを含む、項目139に記載の組成物。
(項目143)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DOTMA
を含み、該組成物は、約0.4mg/ml〜約0.8mg/mlのDOTMAを含む、組成物。
(項目144)
約0.675mg/mlのDOTMAを含む、項目143に記載の組成物。
(項目145)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DOEPC
を含み、該組成物は、約0.4mg/ml〜約0.9mg/mlのDOEPCを含む、組成物。
(項目146)
約0.85mg/mlのDOEPCを含む、項目145に記載の組成物。
(項目147)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、および
(b)DODAC
を含み、該組成物は、約0.365mg/ml〜約0.725mg/mlのDODACを含む、組成物。
(項目148)
約0.585mg/mlのDODACを含む、項目106に記載の組成物。
(項目149)
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、
A.カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、該エマルジョンは、
(1)約0.2%〜約20%(v/v)の油、
(2)約0.01%〜約2.5%(v/v)の界面活性剤、ならびに
(3)カチオン性脂質であって、
i.約0.8mg/ml〜約1.6mg/mlのDOTAP、
ii.約2.46mg/ml〜約4.92mg/mlのDCコレステロール、
iii.約0.73mg/ml〜約1.45mg/mlのDDA、
iv.約0.8mg/ml〜約1.6mg/mlのDOTMA、
v.約0.8mg/ml〜約1.8mg/mlのDOEPC、および
vi.約0.73mg/ml〜約1.45mg/mlのDODAC
からなる群より選択される、カチオン性脂質
を含む、ステップと、
B.該負に荷電した分子が該エマルジョンの該粒子と複合体を形成するように、該負に荷電した分子を該カチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップと
を含む、方法。
(項目150)
前記負に荷電した分子が、抗原をコードする核酸分子である、項目149に記載の方法。
(項目151)
前記核酸分子がRNA分子である、項目150に記載の方法。
(項目152)
前記RNA分子が自己複製RNA分子である、項目151に記載の方法。
(項目153)
RNA−カチオン性粒子複合体のRNA分子が、複合体を形成していないRNA分子と比較した場合に、RNase分解に対してより耐性である、項目151または152に記載の方法。
(項目154)
ステップBが、
(1)前記RNA分子およびPluronic(登録商標)F127を含む溶液を調製することと、
(2)該RNA/Pluronic(登録商標)F127溶液を前記水中油型エマルジョンに添加することと
を含む、項目151から153のいずれか一項に記載の方法。
(項目155)
前記カチオン性水中油型エマルジョンが、
(1)前記油および前記カチオン性脂質を合わせることによって、該エマルジョンの油相を形成するステップと、
(2)該エマルジョンの水相を提供するステップと、
(3)均質化によって該水相中に該油相を分散させるステップと
を含むプロセスによって調製される、項目149から154に記載の方法。
(項目156)
前記油相および前記水相が合わされる前に、該油相にジクロロメタン(DCM)を添加するステップをさらに含む、項目155に記載の方法。
(項目157)
DCM中に前記カチオン性脂質を溶解させるステップをさらに含む、項目155または156に記載の方法。
(項目158)
均質化の前にDCMを蒸発させるステップをさらに含む、項目156または157に記載の方法。
(項目159)
均質化の後にDCMを蒸発させるステップをさらに含む、項目156または157に記載の方法。
(項目160)
ステップAが、
(1)前記カチオン性脂質を適当な溶媒と混合することによって、リポソーム懸濁物を形成することと、
(2)該リポソーム懸濁物を、前記油、前記界面活性剤、および水性溶液と混合することによって、水中油型エマルジョンを形成することと
を含む、項目149から155のいずれか一項に記載の方法。
(項目161)
ステップBが、
(i)RNA分子を含む水性溶液を提供することと、
(ii)前記カチオン性水中油型エマルジョンおよび該RNA溶液を合わせて、前記組成物を調製することと
を含む、項目149から160のいずれか一項に記載の方法。
(項目162)
前記カチオン性水中油型エマルジョンおよび前記RNA溶液が、約1:1(v/v)の比で合わされる、項目161に記載の方法。
(項目163)
前記RNA分子を含む前記水性溶液が塩を含む、項目161または162に記載の方法。
(項目164)
前記塩がNaClである、項目163に記載の方法。
(項目165)
前記水性溶液が約20mMのNaClを含む、項目164に記載の方法。
(項目166)
前記RNA分子を含む前記水性溶液がバッファーである、項目161から165のいずれか一項に記載の方法。
(項目167)
前記バッファーがクエン酸バッファーである、項目166に記載の方法。
(項目168)
前記バッファーが約2mMのクエン酸塩を含む、項目167に記載の方法。
(項目169)
前記RNA分子を含む前記水性溶液が重量オスモル濃度調整剤を含む、項目161から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目170)
前記重量オスモル濃度調整剤が、スクロース、トレハロース、ソルビトール、またはデキストロースから選択される、項目169に記載の方法。
(項目171)
前記重量オスモル濃度調整剤がスクロースである、項目170に記載の方法。
(項目172)
前記水性溶液が約560mMのスクロースを含む、項目171に記載の方法。
(項目173)
前記RNA分子を含む前記水性溶液がポリマーを含む、項目161から172のいずれか一項に記載の方法。
(項目174)
前記ポリマーがPluronic(登録商標)F127である、項目173に記載の方法。
(項目175)
前記水性溶液が、約0.05%〜約20%(w/v)のポリマーを含む、項目173または174に記載の方法。
(項目176)
前記水性溶液が、約1%(w/v)のPluronic(登録商標)F127を含む、項目173から175のいずれか一項に記載の方法。
(項目177)
項目149から176のいずれか一項に記載の方法によって調製される組成物。
(項目178)
前記カチオン性水中油型エマルジョンの前記粒子の平均直径が200nm以下である、項目1から148および177のいずれか一項に記載の組成物。
(項目179)
前記エマルジョン粒子の平均直径が約80nm〜約180nmであり、前記エマルジョンのN/P比が少なくとも4:1である、項目1から104のいずれか一項に記載の組成物。
(項目180)
前記負に荷電した分子がRNA分子であり、前記エマルジョン粒子の平均直径が約80nm〜約180nmであり、前記エマルジョンのN/P比が少なくとも4:1である、項目105から148のいずれか一項に記載の組成物。
(項目181)
項目179または180に記載の組成物であって、該組成物が、緩衝化されており、かつ約6.0〜約8.0のpHを有する、組成物。
(項目182)
前記pHが約6.2〜約6.8である、項目181に記載の組成物。
(項目183)
項目179から182のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が無機塩をさらに含み、無機塩の濃度が30mM以下である、組成物。
(項目184)
項目179から183のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が、非イオン性等張化剤をさらに含み、かつ等張性である、組成物。
(項目185)
被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、免疫応答を必要とする被験体に、項目1から148および177から184のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
本発明は、一般に、RNA分子などの負に荷電した分子を細胞に送達するのに使用することができるカチオン性水中油型エマルジョンに関する。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、静電気力および疎水性/親水性相互作用を通じて、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。本明細書に記載されるカチオン性エマルジョンは、RNA分子(例えば、タンパク質またはペプチドをコードするRNA、低分子干渉RNA、自己複製RNAなど)などの核酸分子を、in vivoで細胞に送達するのに特に適している。
に使用することができるという発見に基づく。エマルジョン粒子は、油コア、および負に荷電した分子と相互作用することができるカチオン性脂質を含む。好適な実施形態では、RNA分子は、例えば、静電気力および疎水性/親水性相互作用を通じて、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成する。複合体を形成したRNA分子は、遊離RNAと比べて、安定化され、RNase媒介分解から保護され、細胞によってより効率的に取り込まれる。さらに、RNAが、RNAワクチンとの関連などで、コードされるタンパク質の発現を誘導するために送達される場合、コードされるタンパク質の免疫原性は、エマルジョンのアジュバント効果により増強され得る。したがって、負に荷電した分子(例えば、抗原をコードするRNA分子)のより効率的な送達に加えて、カチオン性エマルジョンは、アジュバント活性を通じて免疫応答を増強することもできる。
本明細書において、単数形の「a」「an」および「the」は、内容が明らかに別段の指示をしていない限り、複数形への参照を含む。
連続した順序で以下のエレメントを含有することができる:複製のためにシスで必要とされる5’ウイルス配列(バックグラウンドでは5’CSEとも呼ばれる)、発現されると、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質(例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)をコードする配列、複製のためにシスで必要とされる3’ウイルス配列(バックグラウンドでは3’CSEとも呼ばれる)、およびポリアデニレートトラクト(polyadenylate tract)。アルファウイルス由来自己複製RNAは、ウイルスサブゲノムの「ジャンクション領域」プロモーター、1つまたは複数の構造タンパク質遺伝子に由来する配列またはこれらの部分、組換えアルファウイルス粒子の産生を可能にするのに十分なサイズの外来性核酸分子(複数可)、ならびに発現される異種配列(複数可)も含有することができる。
体、例えば、トル様受容体(TLR)、およびヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン(NOD)タンパク質など、ならびに食作用を誘導する受容体、例えば、スカベンジャー受容体、マンノース受容体、およびβ−グルカン受容体などが含まれる。報告されたTLR(本発明の様々な実施形態おいて免疫原性分子として使用することができる、いくつかの報告されたリガンドの例とともに)として、とりわけ、以下のものが挙げられる:TLRl(Mycobacteria、Neisseria由来の細菌リポタンパク質)、TLR2(ザイモサン酵母粒子、ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポペプチド、糖脂質、リポ多糖)、TLR3(ウイルス二本鎖RNA、ポリ:IC)、TLR4(細菌リポ多糖、植物生成物タキソール)、TLR5(細菌性フラジェリン)、TLR6(酵母ザイモサン粒子、リポテイコ酸(lipotechoic acid)、マイコプラズマ由来のリポペプチド)、TLR7(一本鎖RNA、イミキモド、レシミキモド(resimiquimod)、ならびにロキソリビンおよびブロピリミンなどの他の合成化合物)、TLR8(一本鎖RNA、レシミキモド)、およびTLR9(CpGオリゴヌクレオチド)。樹状細胞は、ナイーブCD4+ヘルパーT(TH)細胞のプライミングを開始し、CD8+T細胞のキラー細胞への分化を誘導するための最も重要な細胞型の一部として認識される。TLRシグナル伝達は、例えば、観察される特定の型のTH応答(例えば、TH1応答対TH2応答)を決定するTLRシグナルの性質とともに、これらのヘルパーT細胞応答の質の決定において重要な役割を果たすことが報告されている。抗体(体液)および細胞性免疫の組合せが、THI型応答の一部として生成され、一方、TH2型応答は、大部分は抗体応答である。CpG DNA(TLR9)、およびイミダゾキノリン(TLR7、TLR8)などの様々なTLRリガンドが、in vitroで免疫細胞からのサイトカイン産生を刺激することが立証されている。イミダゾキノリンは、TLRアゴニストであることが示された最初の小さな薬物様化合物である。さらなる情報については、例えば、A. Pashine、N. M. Valiante、およびJ. B. Ulmer、Nature Medicine 11巻、S63〜S68頁(2005年)、K. S. RosenthalおよびD. H. Zimmerman、Clinical and Vaccine Immunology、13巻(8号)、821〜829頁(2006年)、ならびにこれらに引用された参考文献を参照。
原での再刺激に応答したT細胞によるサイトカイン産生の測定などによって判定することができる。このようなアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Ericksonら(1993年)J. Immunol、151巻:4189〜4199頁;Doeら(1994年)Eur. J. Immunol、24巻:2369〜2376頁を参照。したがって、免疫応答は、本明細書において、CTLの産生および/またはヘルパーT細胞の産生もしくは活性化を刺激するものである場合がある。目的の抗原は、抗体媒介免疫応答も誘発することができる。したがって、免疫応答として、例えば、とりわけ、以下の作用のうちの1つまたは複数を挙げることができる:例えば、B細胞による抗体の産生、ならびに/または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する1つまたは複数の抗原に特異的に向けられるサプレッサーT細胞および/もしくはγδT細胞の活性化。これらの応答は、例えば、感染力を中和するように、かつ/または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞毒性(ADCC)を媒介して、免疫化された宿主に対して保護をもたらすように、機能することができる。このような応答は、当技術分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して判定することができる。
本明細書に開示されるカチオン性水中油型エマルジョンは、一般に、エマルジョンを調製するのに使用される成分の濃度によって、当技術分野で慣例的な様式で記述される。滅菌および他の下流プロセスを含めたエマルジョンを生成するプロセスの間に、少量の油(例えば、スクアレン)、カチオン性脂質(例えば、DOTAP)、または他の成分が失われる場合があり、最終生成物(例えば、投与の準備ができているパッケージング、滅菌されたエマルジョン)中のこれらの成分の実際の濃度は、場合により、出発量よりわずかに低い場合があることが(最大約10%または最大約20%)、当技術分野において理解されている。
に界面活性剤(複数可)でコーティングされることによって、ミセル様液滴を形成する。同様に、1つまたは複数の脂質(例えば、中性脂質、グリコール脂質、またはリン脂質)も、このような脂質が油滴を分散させるための乳化剤として使用される場合、エマルジョン粒子の表面上に存在することができる。
Eのゼータ電位は、Malvern Nanoseries Zetasizer(Westborough、MA)を使用して測定される。試料は、水中で1:100に希釈され(粘度:0.8872cp、RI:1.330、誘電率:78.5)、ポリスチレンラテックスキャピラリーセル(Malvern、Westborough、MA)に添加される。ゼータ電位は、2分の平衡時間とともに25℃で測定され、Smoluchowskiモデル(F(Ka)値=1.5)を使用して分析される。データは、mVで報告される。
カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、油コアを含む。好ましくは、油は、代謝可能な無毒性の油であり、より好ましくは、それだけに限らないが、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにこれらの対応する酸およびアルコール、これらのエーテルおよびエステル、ならびにこれらの混合物を含めた、約6〜約30炭素原子のうちの1つである。油は、エマルジョンが投与されることになる被験体の体によって代謝され得、被験体に毒性ではない任意の植物油、魚油、動物油、または合成的に調製された油とすることができる。被験体は、動物、一般的に、哺乳動物、好ましくは、ヒトとすることができる。
適当な温度で貯蔵および使用することができる。油コアは、4℃で液相であることが好ましい。
、一般に、テルペノイドと呼ばれる。スクアレン(2,6,10,15,19,23−ヘキサメチル−2,6,10,14,18,22−テトラコサヘキサエン)は、分岐、不飽和のテルペノイドであり、本明細書で特に好適である。スクアレンの主要な供給源はサメ肝油であるが、アマランサス種子、米糠、コムギ胚芽、およびオリーブ油を含めた植物性油(plant oil)(主に植物油(vegetable oil))も適当な供給源である。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好適である。スクアレンおよびスクアランを含めた魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当技術分野で公知の方法によって得ることができる。
本明細書に記載されるエマルジョン粒子は、カチオン性脂質を含み、これは、負に荷電した分子と相互作用し、それによって、分子をエマルジョン粒子につなぎ留めることができる。
g/ml〜約25mg/ml、約1.3mg/ml〜約25mg/ml、約1.4mg/ml〜約25mg/ml、約1.5mg/ml〜約25mg/ml、約1.6mg/ml〜約25mg/ml、約1.7mg/ml〜約25mg/ml、約0.5mg/ml〜約24mg/ml、約0.5mg/ml〜約22mg/ml、約0.5mg/ml〜約20mg/ml、約0.5mg/ml〜約18mg/ml、約0.5mg/ml〜約15mg/ml、約0.5mg/ml〜約12mg/ml、約0.5mg/ml〜約10mg/ml、約0.5mg/ml〜約5mg/ml、約0.5mg/ml〜約2mg/ml、約0.5mg/ml〜約1.9mg/ml、約0.5mg/ml〜約1.8mg/ml、約0.5mg/ml〜約1.7mg/ml、約0.5mg/ml〜約1.6mg/ml、約0.6mg/ml〜約1.6mg/ml、約0.7mg/ml〜約1.6mg/ml、約0.8mg/ml〜約1.6mg/ml、約0.8mg/ml〜約3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約21.8mg/ml、約24mg/mlなどでDOTAPを含むことができる。
/ml、約0.5mg/ml〜約5mg/ml、約0.6mg/ml〜約5mg/ml、約0.73mg/ml〜約5mg/ml、約0.8mg/ml〜約5mg/ml、約0.9mg/ml〜約5mg/ml、約1.0mg/ml〜約5mg/ml、約1.2mg/ml〜約5mg/ml、約1.45mg/ml〜約5mg/ml、約2mg/ml〜約5mg/ml、約2.5mg/ml〜約5mg/ml、約3mg/ml〜約5mg/ml、約3.5mg/ml〜約5mg/ml、約4mg/ml〜約5mg/ml、約4.5mg/ml〜約5mg/ml、約1.2mg/ml、約1.45mg/mlなどでDDAを含むことができる。あるいは、カチオン性水中油型エマルジョンは、約20mg/ml、約21mg/ml、約21.5mg/ml、約21.6mg/ml、約25mg/mlでDDAを含むことができる。
24mg/ml、約0.5mg/ml〜約22mg/ml、約0.5mg/ml〜約20mg/ml、約0.5mg/ml〜約18mg/ml、約0.5mg/ml〜約15mg/ml、約0.5mg/ml〜約12mg/ml、約0.5mg/ml〜約10mg/ml、約0.5mg/ml〜約5mg/ml、約0.5mg/ml〜約4mg/ml、約0.5mg/ml〜約3mg/ml、約0.5mg/ml〜約2mg/ml、約0.5mg/ml〜約1.9mg/ml、約0.5mg/ml〜約1.8mg/ml、約0.5mg/ml〜約1.7mg/ml、約0.5mg/ml〜約1.6mg/ml、約0.6mg/ml〜約1.7mg/ml、約0.7mg/ml〜約1.7mg/ml、約0.8mg/ml〜約1.7mg/ml、約0.8mg/ml〜約3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約1.7mg/ml、約1.8mg/ml、約1.9mg/ml、約2.0mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約22.5mg/ml、約25mg/mlなどでDOEPCを含むことができる。
/ml、約1.8mg/ml、約1.9mg/ml、約2.0mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約22.5mg/ml、約25mg/mlなどでDODAPを含むことができる。
本明細書に記載されるカチオン性水中油型エマルジョンは、追加の成分をさらに含むことができる。例えば、エマルジョンは、粒子形成を促し、負に荷電した分子とカチオン性粒子との間の複合体形成を改善し、または負に荷電した分子の安定性を増大させる(例えば、RNA分子の分解を防止する)ことができる成分を含むことができる。
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、界面活性剤をさらに含む。
1.高級脂肪酸(C10〜C22)のナトリウム、カリウム、アンモニウム、およびアルカノール−アンモニウムの塩などの水溶性石けん、特に、ナトリウムタロウおよびカリウムタロウならびにココナツ石けん。
活性剤は、1つを超える様式で分類することができるので、この段落で示した界面活性剤のいくつかのクラスは、以前に記載した界面活性剤のクラスと重複する。
、または市販されている。
リオキシエチレン脂肪酸;ポリオキシエチレンラノリン由来界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル;高HLBポリオキシエチレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル界面活性剤;またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤、もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸を使用することによって達成することができる。
AN85、約0.8%のTween80と約0.8%のSPAN85、約0.9%のTween80と約0.9%のSPAN85、または約1%のTween80と約1.0%のSPAN85を含有することができる。
ある特定の実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子は、リン脂質をさら
に含む。
水中油型エマルジョンの水相(連続相)は、緩衝化塩溶液(例えば、食塩水)または水である。緩衝化塩溶液は、塩(例えば、NaCl)、バッファー(例えば、クエン酸バッファー)を含む水性溶液であり、重量オスモル濃度調整剤(osmolality adjusting agent)(例えば、サッカリド)、ポリマー、界面活性剤、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。エマルジョンが非経口投与用に処方される場合、組成物の投与後の膨張または急速な吸収などの望まれない投与後の結果を防止するために、張性、すなわち、重量オスモル濃度が正常な生理学的な液と本質的に同じであるように、最終的な緩衝化溶液を作製することが好ましい。正常な生理的条件と適合性のpHを維持するために、水相を緩衝化することも好ましい。また、ある特定の事例では、エマルジョンのある特定の成分の安定性を保証するために、pHを特定のレベルに維持することが望ましい場合がある。
グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールなどは、本発明において有用な非イオン性等張化剤である。非イオン性張性調整剤は、使用される作用物質に応じて、約0.1%〜約10%または約1%〜約10%の濃度で存在し得る。
負に荷電した分子が送達される場合、これは、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成させることができる。負に荷電した分子は、例えば、負に荷電した分子と粒子の表面上のカチオン性脂質との間の相互作用、ならびに負に荷電した分子と粒子の表面との間の疎水性/親水性相互作用によって、エマルジョン粒子と複合体を形成する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望まないが、負に荷電した分子は、非共有結合性イオン電荷相互作用(静電気力)を通じてカチオン性脂質と相互作用し、複合体の強度、ならびに粒子と複合体を形成することができる負に荷電した化合物の量は、粒子中のカチオン性脂質の量に関係すると考えられる。さらに、負に荷電した分子と粒子の表面との間の疎水性/親水性相互作用も、役割を果たす場合がある。
できる。一般に、N/P比は、RNA−粒子複合体が細胞によって取り込まれる場合、RNA分子の少なくとも約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、または約95%が、RNA−粒子複合体から放出される値であるべきである。少なくとも4:1のN/P比が好適である。
に96を超える天然に存在するヌクレオシド修飾が見つかっている。例えば、Limbachら、Nucleic Acids Research、22巻(12号):2183〜2196頁(1994年)を参照。ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオシドの調製は、例えば、米国特許第4373071号、同第4458066号、同第4500707号、同第4668777号、同第4973679号、同第5047524号、同第5132418号、同第5153319号、同第5262530号、同第5700642号から当技術分野で周知であり、これらの特許のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれており、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが市販されている。
mnm5se2U(5−メチルアミノメチル−2−セレノウリジン);ncm5U(5−カルバモイルメチルウリジン);ncm5Um(5−カルバモイルメチル−2’−O−メチルウリジン);cmnm5U(5−カルボキシメチルアミノメチルウリジン);cnmm5Um(5−カルボキシメチルアミノメチル−2−L−Oメチルウリジン);cmnm5s2U(5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン);m62A(N6,N6−ジメチルアデノシン);Tm(2’−O−メチルイノシン);m4C(N4−メチルシチジン);m4Cm(N4,2−O−ジメチルシチジン);hm5C(5−ヒドロキシメチルシチジン);m3U(3−メチルウリジン);cm5U(5−カルボキシメチルウリジン);m6Am(N6,T−O−ジメチルアデノシン);rn62Am(N6,N6,O−2−トリメチルアデノシン);m2’7G(N2,7−ジメチルグアノシン);m2’2’7G(N2,N2,7−トリメチルグアノシン);m3Um(3,2T−O−ジメチルウリジン);m5D(5−メチルジヒドロウリジン);f5Cm(5−ホルミル−2’−O−メチルシチジン);m1Gm(1,2’−O−ジメチルグアノシン);m’Am(1,2−O−ジメチルアデノシン)イリノメチルウリジン;tm5s2U(S−タウリノメチル−2−チオウリジン);imG−14(4−ジメチル(demethyl)グアノシン);imG2(イソグアノシン);ac6A(N6−アセチルアデノシン)、ヒポキサンチン、イノシン、8−オキソ−アデニン、その7−置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−アミノウラシル、5−(C1〜C6)−アルキルウラシル、5−メチルウラシル、5−(C2〜C6)−アルケニルウラシル、5−(C2〜C6)−アルキニルウラシル、5−(ヒドロキシメチル)ウラシル、5−クロロウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヒドロキシシトシン、5−(C1〜C6)−アルキルシトシン、5−メチルシトシン、5−(C2〜C6)−アルケニルシトシン、5−(C2〜C6)−アルキニルシトシン、5−クロロシトシン、5−フルオロシトシン、5−ブロモシトシン、N2−ジメチルグアニン、7−デアザグアニン、8−アザグアニン、7−デアザ−7−置換グアニン、7−デアザ−7−(C2〜C6)アルキニルグアニン、7−デアザ−8−置換グアニン、8−ヒドロキシグアニン、6−チオグアニン、8−オキソグアニン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、2,4−ジアミノプリン、2,6−ジアミノプリン、8−アザプリン、置換7−デアザプリン、7−デアザ−7−置換プリン、7−デアザ−8−置換プリン、水素(無塩基残基)、m5C、m5U、m6A、s2U、W、または2’−O−メチル−Uが挙げられる。これらの修飾核酸塩基およびこれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、商業的供給者から入手可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれているWO2011/005799を参照。
いくつかの態様では、カチオン性水中油型エマルジョンは、自己複製RNA分子を含有する。ある特定の実施形態では、自己複製RNA分子は、アルファウイルスに由来し、またはこれに基づく。
ドするが、レプリコンは、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好適である。したがって、好適なレプリコンは、細胞内でそれ自体のゲノムRNAコピーの産生をもたらすことができるが、RNA含有ビリオンの産生をもたらすことはできない。これらのビリオンを生成することができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、好適なレプリコンは、感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスの永続に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、好適なレプリコンにはなく、その場所は、目的の抗原をコードする遺伝子(複数可)によって奪われており、その結果、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく抗原をコードする。
ら、またはこれらに基づいて得られる。適当な野生型アルファウイルス配列は、周知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Mdなどの配列受託機関から入手可能である。適当なアルファウイルスの代表的な例として、アウラ(ATCC VR−368)、ベバルウイルス(ATCC VR−600、ATCC VR−1240)、カバッソウ(Cabassou)(ATCC VR−922)、チクングニアウイルス(ATCC VR−64、ATCC VR−1241)、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス(ATCC VR−65、ATCC VR−1242)、フォートモーガン(ATCC VR−924)、ゲタウイルス(ATCC VR−369、ATCC VR−1243)、キジラガハ(Kyzylagach)(ATCC VR−927)、マヤロ(ATCC VR−66)、マヤロウイルス(ATCC VR−1277)、ミドルバーグ(ATCC VR−370)、ムカンボウイルス(ATCC VR−580、ATCC VR−1244)、ヌドゥム(ATCC VR−371)、ピクスナウイルス(ATCC VR−372、ATCC VR−1245)、ロスリバーウイルス(ATCC VR−373、ATCC VR−1246)、セムリキ森林(ATCC VR−67、ATCC VR−1247)、シンドビスウイルス(ATCC VR−68、ATCC VR−1248)、トナテ(Tonate)(ATCC VR−925)、トリニチ(Triniti)(ATCC VR−469)、ウナ(ATCC VR−374)、ベネズエラウマ脳脊髄炎(ATCC VR−69、ATCC VR−923、ATCC VR−1250 ATCC VR−1249、ATCC VR−532)、西部ウマ脳脊髄炎(ATCC VR−70、ATCC VR−1251、ATCC VR−622、ATCC VR−1252)、ワタロア(ATCC VR−926)、およびY−62−33(ATCC VR−375)が挙げられる。
ド抗原をコードすることができる。エピトープは、ヘルパーT細胞応答、もしくは細胞傷害性T細胞応答、またはその両方を誘発することができることが好ましい。
酸配列の転写、翻訳、および発現のための適当な方法は、当技術分野で公知であり、慣例的である。(一般に、Current Protocols in Molecular
Biology、2巻、Ausubelら編、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience、13章、1988年;Glover、DNA Cloning、II巻、IRL Press、Wash.、D.C.、3章、1986年;Bitterら、Methods in Enzymology 153巻:516〜544頁(1987年);The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、Strathernら編、Cold Spring Harbor Press、I巻およびII巻、1982年;ならびにSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、1989年を参照)。
きる。FACS選択の別の利点は、異なるレベルの発現について選別することができることである。場合により、より低い発現が望まれる場合がある。特定の抗原を発現する細胞を同定するための他の適当な方法は、プレート上のモノクローナル抗体を使用するパニング、またはモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する捕捉を伴う。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される負に荷電した分子は、抗原をコードする核酸分子(例えば、RNA分子)である。適当な抗原には、それだけに限らないが、細菌性(bactertial)抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、原生動物(protazoan)抗原、植物抗原、がん抗原、またはこれらの組合せが含まれる。
ZV)、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6(HHV6)、ヒトヘルペスウイルス7(HHV7)、およびヒトヘルペスウイルス8(HHV8)など;パポバウイルス、例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなど、アデノウイルス(Adenoviruess)、ならびにアレナウイルスに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
ducreyi、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Helicobacter pylori、Staphylococcus saprophyticus、Yersinia enterocolitica、E.coli(腸毒素産生性E.coli(ETEC)、腸管凝集性E.coli(EAggEC)、分散接着性E.coli(DAEC)、腸管病原性E.coli(EPEC)、腸外病原性E.coli(ExPEC;尿路疾患性E.coli(UPEC)、および髄膜炎/敗血症関連E.coli(MNEC)など)、ならびに/または腸管出血性E.coli(EHEC))、Bacillus anthracis(炭疽)
、Yersinia pestis(ペスト)、Mycobacterium tuberculosis、Rickettsia、Listeria monocytogenes、Chlamydia pneumoniae、Vibrio cholerae、Salmonella typhi(腸チフス)、Borrelia burgdorfer、Porphyromonas gingivalis、Klebsiella、Mycoplasma pneumoniaeなどに由来するタンパク質およびペプチドが挙げられる。
ブ、雑草、および草の花粉アレルゲン);昆虫またはクモ形類のアレルゲン(吸入アレルゲン、唾液アレルゲン、および毒液アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリおよび小昆虫のアレルゲン、膜翅目(hymenopthera)毒液アレルゲン);動物の毛アレルゲンおよびフケアレルゲン(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどからの);ならびに食物アレルゲン(例えば、グリアジン)から得られる。樹木、草、ならびにハーブに由来する重要な花粉アレルゲンは、それだけに限らないが、カバノキ(Betula)、ハンノキ(Alnus)、ハシバミ(Corylus)、シデ(Carpinus)、およびオリーブ(Olea)、シーダー(CryptomeriaおよびJuniperus)、プラタナス(Platanus)を含めたFagales、Oleales、Pinalesの分類学上の目およびスズカケノキ科、Lolium属、Phleum属、Poa属、Cynodon属、Dactylis属、Holcus属、Phalaris属、Secale属、およびSorghum属の草を含むPoales目、Ambrosia属、Artemisia属、およびParietaria属のハーブを含むAsterales目およびUrticales目が起源であるものである。他の重要な吸入性アレルゲンは、Dermatophagoides属およびEuroglyphus属のイエダニ、貯蔵庫ダニ、例えば、Lepidoglyphys、Glycyphagus、およびTyrophagusに由来するもの、ゴキブリ、小昆虫、およびノミ、例えば、Blatella、Periplaneta、Chironomus、およびCtenocepphalidesに由来するもの、ならびに哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、およびウマなどに由来するもの、ミツバチ(Apidae)、スズメバチ(Vespidea)、およびアリ(Formicoidae)を含む膜翅目の分類学上の目からのものなどの刺咬昆虫(stinging or biting insect)が起源であるものを含めた毒液アレルゲンである。
連する)、HLA−A2−R1701、βカテニン(例えば、黒色腫に関連する)、TCR(例えば、T細胞非ホジキンリンパ腫に関連する)、BCR−abl(例えば、慢性骨髄性白血病に関連する)、トリオースリン酸イソメラーゼ、KIA0205、CDC−27、およびLDLR−FUT、(c)過剰発現抗原、例えば、ガレクチン4(例えば、結腸直腸がんに関連する)、ガレクチン9(例えば、ホジキン病に関連する)、プロテイナーゼ3(例えば、慢性骨髄性白血病に関連する)、WT1(例えば、様々な白血病に関連する)、炭酸脱水酵素(例えば、腎がんに関連する)、アルドラーゼA(例えば、肺がんに関連する)、PRAME(例えば、黒色腫に関連する)、HER−2/neu(例えば、乳房、結腸、肺、および卵巣のがんに関連する)、アルファ−フェトプロテイン(例えば、肝細胞がんに関連する)、KSA(例えば、結腸直腸がんに関連する)、ガストリン(例えば、膵がん、および胃がんに関連する)、テロメラーゼ触媒タンパク質、MUC−1(例えば、乳がん、および卵巣がんに関連する)、G−250(例えば、腎細胞がんに関連する)、p53(例えば、乳がん、結腸がんに関連する)、およびがん胎児性抗原(例えば、乳がん、肺がん、および結腸直腸がんなどの胃腸管のがんに関連する)、(d)共通抗原、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、MART−1/メランA、gp100、MC1R、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−1/TRP1、およびチロシナーゼ関連タンパク質−2/TRP2など(例えば、黒色腫に関連する)、(e)例えば、前立腺がんに関連する前立腺関連抗原、例えば、PAP、PSA、PSMA、PSH−P1、PSM−P1、PSM−P2など、(f)免疫グロブリンイディオタイプ(例えば、骨髄腫およびB細胞リンパ腫に関連する)が挙げられる。
負に荷電した分子(RNAなど)は、一般に、水性溶液の形態、または水性溶液中に容易に溶解することができる形態(例えば、凍結乾燥した)で提供される。水性溶液は、水、または塩(例えば、NaCl)、バッファー(例えば、クエン酸バッファー)、重量オスモル濃度もしくは張性の調整剤(例えば、サッカリド)、ポリマー、界面活性剤、もしくはこれらの組合せを含む水性溶液とすることができる。処方物がin vivo投与のために意図されている場合、水性溶液は、正常な生理的条件と適合性であるpHを維持する生理学的に許容されるバッファーであることが好ましい。また、ある特定の場合では、処方物のある特定の成分の安定性を保証するために、pHを特定のレベルに維持すること
が望ましい場合がある。
1kg当たり約315mOsmである。場合により、高浸透圧性溶液として、負に荷電した分子を含む水性溶液を調製し、純水または低浸透圧性バッファーを使用してカチオン性エマルジョンを調製することが好ましい場合がある。エマルジョンと負に荷電した分子が合わされると、生理的な重量オスモル濃度が達成される。エマルジョンと負に荷電した分子を含む水性溶液の所望の相対量(例えば、1:1(v/v)の混合、2:1(v/v)の混合、1:2(v/v)の混合など)に基づいて、等浸透圧性の混合物を達成するのに必要とされる水性溶液の重量オスモル濃度を容易に決定することができる。
別の態様では、本発明は、カチオン性水中油型エマルジョンを調製するステップであって、エマルジョンが、(1)約0.2%〜約20%(v/v)の油、(2)約0.01%〜約2.5%(v/v)の界面活性剤および(3)カチオン性脂質を含む、ステップと、負に荷電した分子がエマルジョンの粒子と複合体を形成するように、負に荷電した分子をカチオン性水中油型エマルジョンに添加するステップとを含む、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法を提供する。
Tween 80を含むエマルジョン(本明細書において「CNE17」と呼ばれる)が、560mMスクロース、20mM NaCl、2mMクエン酸塩および1%(w/v
)Pluronic F127を含むRNA水性溶液と、1:1(v:v)で合わされる場合には、複合体形成後組成物は、2.15%(w/v)スクアレン、0.7mg/mL
DOTAP、0.25% v/v SPAN85、0.25% v/v Tween 80、280mMスクロース、10mM NaCl、1mMクエン酸塩および0.5%(w/v)Pluronic F127を含む。
ADJUVANTS(O’Hagan編)、Humana Press中の、Ottら
、Methods in Molecular Medicine、2000年、第42巻、211〜228頁参照のこと。例えば、MF59の製造プロセスと同様に、エマルジョンの油相および水相を合わせ、インラインホモジナイザーにおいて処理して、粗エマルジョンを得ることができる。次いで、粗エマルジョンをマイクロフルイダイザー中に送り、そこでさらに処理して、安定なサブミクロンエマルジョンを得ることができる。粗エマルジョンを、所望の粒子サイズが得られるまで、マイクロフルイダイザーの相互作用チャンバーに繰り返し通してもよい。次いで、バルクエマルジョンを濾過して(例えば、窒素下で0.22μmフィルターを通して)、大きな粒子を除去し、エマルジョンバルクを得、これを適した容器(例えば、ガラス瓶)中に充填してもよい。自己貯蔵(self storage)について、水中油型エマルジョンの存在下での長期の安定性を実証したワクチン抗原については、抗原およびエマルジョンを合わせ、無菌濾過(例えば、0.22μmフィルターメンブランを通して)してもよい。合わせた単一バイアルワクチンを、単回用量容器中に充填してもよい。長期の安定性が実証されていないワクチン抗原については、エマルジョンを別個のバイアルとして供給することができる。このような場合には、エマルジョンバルクを濾過滅菌(例えば、0.22μmフィルターメンブランを通して)し、最終単回用量バイアルに充填し、パッケージングしてもよい。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む医薬組成物を提供し、1種または複数の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ワクチンとして使用することができる免疫原性組成物である。
または免疫応答をブースト(boost)するために使用してもよい。
る。したがって、ヒト被験体は、1歳未満、1〜5歳、5〜15歳、15〜55歳または少なくとも55歳であり得る。組成物を受け取るのに好ましい被験体は、高齢者(例えば、>50歳、>60歳、好ましくは、>65歳)、若年者(例えば、<5歳)、入院患者、医療従事者、軍職員および軍人、妊婦、慢性疾患患者または免疫不全患者である。しかし、組成物は、これらの群にのみ適しているのではなく、集団においてより全般的に使用してもよい。
1.ミネラル含有組成物;
2.油エマルジョン;
3.サポニン処方物;
4.ビロソームおよびウイルス様粒子;
5.細菌または微生物誘導体;
6.生体接着剤(bioadhesive)および粘膜付着剤(mucoadhesive);
7.リポソーム;
8.ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物;
9.ポリホスファゼン(PCPP);
10.ムラミルペプチド;
11.イミダゾキノロン化合物;
12.チオセミカルバゾン化合物;
13.トリプタントリン化合物;
14.ヒト免疫調節物質;
15.リポペプチド;
16.ベンゾナフチリジン;
17.微粒子
18.免疫賦活性ポリヌクレオチド(RNAまたはDNAなど;例えば、CpG含有オリゴヌクレオチド)。
カチオン性水中油型エマルジョンの開発
自己複製RNAの送達のために、3種のカチオン性ナノエマルジョン(CNE)を開発した。タイプ1エマルジョンは、「MF59」様エマルジョンである。これらのエマルジョンは、カチオン性脂質が添加された点を除いてMF59と同一成分から作製した。タイプ2エマルジョンは、MF59中のSpan85およびTween80をリン脂質で置き換えたエマルジョンである。タイプ3エマルジョンは、脂質またはその他の界面活性剤のいずれかによって安定化され、エマルジョンの水相中にさらなるポリマーまたは界面活性剤を有し得るハイブリッドエマルジョンである。
このクラスのエマルジョンについては、Tween80、Span85、スクアレンおよびクエン酸バッファーの比は、変更しなかった。これらのエマルジョンは、MF59と同一濃度で調製した。用量あたりの与えられるカチオン性脂質の全量は、脂質濃度にかかわらず、一定のままである。例えば、10/1のN/P比で0.8mg/ml DOTAPエマルジョンを用いてエマルジョンにおいて送達されるRNAの10μgの用量は、2×希釈を必要とする。したがって、送達されるスクアレンの量は、MF59を用いる免疫化の際に普通に投与されるものの1/2となる。あるいは、10/1のN/P比で1.6mg/ml DOTAPを用いたエマルジョンにおいて送達されるRNAの10μgの用量は、4×希釈を必要とする。
スクアレンの百分率は、タイプ2CNEの場合には変動した。MF59からのもう1つ
の相違は、これらのエマルジョンは、クエン酸バッファー中ではなく水中で作製したという点である。これらのエマルジョンは、脂質安定化剤として1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)およびホスファチジルコリン(卵PC)を用いて作製した。エマルジョンは、タイプ1エマルジョン研究から得られた最適濃度のDOTAP、DCコレステロールまたはDDAのいずれかとともにDOPEおよび卵PCを使用して作製した。
w/wのMF59濃度)を含有していた。
DOTAP/卵PCエマルジョンとの複合体形成の前の、RNAへのPluronic(登録商標)F127(ポロキサマー)の添加は、ポロキサマーが添加されなかったサンプルと比較して、より大きなRNase安定性につながった。これは、油滴とのより良好なRNA複合体形成を可能にすることにおけるこのポリマーの役割を示す。
スクアレン、ソルビタントリオレエート(Span 85)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80)は、Sigma(St.Louis、MO、USA)から入手した。ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)、3β−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール塩酸塩(DC−コレステロールHCl)は、Avanti Lipidsから購入した。L−α−リゾホスファチジルコリン(卵、ニワトリ)および1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(DOTAP)は、Lipoid(Ludwigshafen Germany)から購入した。
一次エマルジョンを、およそ15k〜20k PSIの均質化圧で、氷浴冷却コイルを備えたマイクロフルイダイザーM110Sホモジナイザー(Microfluidics、Newton、MA)に3回から5回通した。ユニットから20mlのバッチサンプルを取り出し、4℃で保存した。表2には、エマルジョンの成分が記載されている。
RNA−粒子複合体の調製
1.材料および方法
RNA合成
アルファウイルスレプリコン(自己複製RNA)をコードするプラスミドDNAを、in vitroでのRNAの合成のための鋳型として使用した。各レプリコンは、RNA複製に必要な遺伝子エレメントを含有するが、粒子アッセンブリに必要な遺伝子産物をコードする配列を欠く。アルファウイルスゲノムの構造遺伝子を異種タンパク質(その発現が、アルファウイルスサブゲノムプロモーターによって駆動される)をコードする配列によって置換した。レプリコンが真核細胞へ送達されると、プラス鎖RNAが翻訳されて、4種の非構造タンパク質が生じ、これはゲノムRNAを一緒に複製し、異種タンパク質をコードする大量のサブゲノムmRNAを転写する。アルファウイルス構造タンパク質の発現がないために、レプリコンは、感染粒子を生成できない。バクテリオファージT7プロモーターを、アルファウイルスcDNAの上流に配置して、in vitroでレプリコンRNAの合成を促進し、ポリ(A)テールのすぐ下流に位置するデルタ肝炎ウイルス(HDV)リボザイムが、その自己切断活性によって正しい3’末端を作製する。実施例において使用された4種のプラスミドの配列が図7A〜7B中に示されている。
溶液中の窒素数を、カチオン性脂質濃度から算出した。例えば、DOTAPは、分子あたり1個のプロトン化され得る窒素を有する。RNA濃度を使用し、RNA1マイクログラムあたり3nmolのリン酸という推定値を使用して溶液中のリン酸量を算出した。RNA:脂質の量を変えることによって、N/P比を改変することができる。RNAを様々な窒素/リン酸比(N/P)でCNEと複合体形成させた。N/P比の算出は、1ミリリ
ットルあたりのエマルジョン中のプロトン化できる窒素のモル数を算出することによって行った。リン酸数を算出するために、RNA1マイクログラムあたり3nmolのリン酸という定数を使用した。値を決定した後、RNAに適当な割合のエマルジョンを添加した。これらの値を使用して、RNAを適当な濃度に希釈し、軽くボルテックス処理しながら等容積のエマルジョン中に直接添加した。溶液をおよそ2時間室温に放置した。複合体形成後、得られた溶液を適当な濃度に希釈し、1時間以内に使用した。
変性ゲル電気泳動を実施して、RNAのカチオン性処方物との結合およびRNaseAの存在下での安定性を評価した。ゲルは以下のとおりに成型した:2gのアガロース(Bio−Rad、Hercules、CA)を180mlの水に添加し、溶解するまで電子レンジ中で加熱し、次いで、60℃に冷却した。次いで、アガロース溶液に20mlの10×変性ゲルバッファー(Ambion、Austin、TX)を添加した。ゲルを注ぎ、室温で少なくとも45分間放置した。次いで、ゲルをゲルタンク中に入れ、1×MOPSランニングバッファー(Ambion、Austin、TX)を添加してゲルを数ミリメートル覆った。
RNase消化は、RNA1マイクログラムあたり6.4mAUのRNaseA(Ambion、Hercules、CA)とともに室温で30分間インキュベートすることによって達成した。RNaseは、プロテイナーゼK(Novagen、Darmstadt、Germany)とともにサンプルを55℃で10分間インキュベートすることによって不活化した。RNase不活性化後、サンプルと、25:24:1、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールとの1:1混合物を用いて、サンプルを脱複合体化した。サンプルを数回反転させて混合し、次いで、12k RPMで遠心機に15分間かけた。有機相から水相を収集し、RNAを分析するために使用した。ローディング(ウェルあたり460ng)の前に、すべてのサンプルをホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、65℃で10分間変性させ、室温に冷却した。RNA構築物の分子量を見積もるためにAmbion Millenniumマーカーを使用した。ゲルは、130Vで泳動した。ゲルを、水中で、0.1% SYBRゴールドを製造業者のガイドライン(Invitrogen、Carlsbad、CA)に従って使用し、室温で1時間振盪することによって染色した。ゲル画像は、Bio−Rad Chemidoc XRSイメージングシステム(Hercules、CA)で取得した。すべての研究は、Clonetech(Mountain View、CA)製のマウス胸腺RNAを使用した。
RNAを上記のように複合体形成させた。RNA/CNE複合体を、種々の濃度のヘパリンスルフェート(Alfa Aesar、Ward Hill MA)とともに室温で30分間インキュベートした。得られた溶液を、15〜20分間遠心分離した。遠心管をツベルクリンシリンジで穿刺し、下層部(subnatant)を収集した。次いで、Quant−it Ribogreen RNAアッセイキット(Invitrogen、Carlsbad CA)を製造業者の指示に従って使用して、溶液をRNA濃度についてアッセイした。サンプルをBiotek Synergy 4(Winooski、VT)蛍光プレートリーダーで分析した。遊離RNA値を標準曲線を使用して算出した。
エマルジョンの粒子サイズは、Zetasizer Nano ZS(Malvern
Instruments、Worcestershire、UK)を製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。粒子サイズは、多分散指数(pdi)とともにZ平均(
ZAve)として報告した。測定の前にすべてのサンプルを水で希釈した。さらに、エマルジョンの粒子サイズは、Horiba LA−930粒子サイズ分析計(Horiba
Scientific、USA)を使用して測定した。測定の前にサンプルを水で希釈した。ゼータ電位は、Zetasizer Nano ZSを使用し、希釈サンプルを使用して製造業者の使用説明書に従って測定した。
抗原産生の動態および量を評価するために、SEAPをコードするRNAレプリコンを、処方物とともにおよび処方物を伴わずにマウス筋肉内に投与した。8〜10週齢の、約20gの体重の3または5匹の雌性のBalb/Cマウスの群を、示されたN/P比でSEAPをコードするレプリコンRNAと複合体を形成したCNEを用いて免疫化した。裸のRNAを、RNaseフリー1×PBS中で処方した。各マウスに、四頭筋中に100μl用量を投与した(部位あたり50μl)。注射の1、3および6日後に血液サンプルを採取した。採取後直ちに血清を血液から分離し、使用まで−30℃で保存した。
エレクトロポレーションは、プラスミドDNAワクチンの送達にとって極めて効果的な方法であり、この技術を使用して、自己複製RNAを送達した。イソフルオラン下でマウスを麻酔し、念入りに両後肢の毛を剃り、処理される肢上の領域を露出させた。ワクチンの30μlの用量を、1/2ccインスリン用シリンジを使用して後肢の四頭筋に注射した。Elgen(登録商標)DNA Delivery System(Inovio、San Diego)を使用して筋肉にエレクトロポレーションした。機器パラメータは以下のとおりである:60V、各60msで2パルス。第2の肢に別の用量を同様に送達し、続いて、エレクトロポレーションを行った。
本発明者らは、RNAワクチンを、リポーター遺伝子または抗原のin vivo発現を達成するための伝統的なRNAベクターによるアプローチと比較するために、Perriらによって記載された方法によってBHK細胞において産生されたウイルスレプリコン粒子(VRP)を利用した。この系では、抗原(またはリポーター遺伝子)レプリコンは、シンドビスウイルスの3’末端配列(3’UTR)およびシンドビスウイルスパッケージングシグナル(PS)(Perri S.ら、J Virol第77巻:10394〜10403頁(2003年)の図2参照のこと)を含有するよう遺伝子操作されたベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)のゲノムに由来するアルファウイルスキメラレプリコン(VCR)からなるものであった。これらのレプリコンを、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞中に、シンドビスウイルスカプシドおよび糖タンパク質遺伝子(Perriらの図2参照のこと)をコードする欠損ヘルパーRNAとともに共エレクトロポレーション
することによってVRPにパッケージングした。次いで、標準方法によってVRPを収集し、力価測定し、培養液またはその他の等張性バッファー中で動物に接種した。
作製後、エマルジョンを粒子サイズおよびゼータ電位について分析した。表3および4は、4:1および10:1のN/P比での複合体形成前および複合体形成後に得られたデータ粒子サイズおよびゼータ電位データを要約している。エマルジョンの粒子サイズは、Nano ZS粒子サイズ分析計で測定された場合に、試験された処方物のすべてについて160nm未満であった。複合体形成後、一部の粒子サイズは、特に、4:1 N/P比で大幅に増大した。これは、凝集および複数のエマルジョン液滴間のRNAの架橋による可能性が高い。Horribaデータは、全般的に、nanoZSで分析され得ない大きな粒子集団があると思われる2、3の場合(CNE02およびCNE32)を除いて、NanoZS測定値とよく一致していた。CNE02およびCNE32を除くすべてのCNEは、Horiba粒子サイズ分析計で測定した場合に190nm未満のサイズであった。サイズにおける変動性が小さいことから、添加されるカチオン性脂質の量またはタイプにかかわらない堅調な処理方法が示される。平均粒子サイズは、無菌濾過を可能にするよう200nm未満のサイズであることが特に望ましい。試験したすべてのサンプルがこの基準を通過する。
記複合体形成後ゼータ電位は、おそらくはエマルジョンにおける過剰の電荷のために、一般に、複合体形成前ゼータ電位から大きくは変化しない。
エマルジョンの、RNase分解から保護する能力を評価するために、処方物をスクリーニングするためのin−vitroアッセイを開発した。図1は、10:1および4:1 N/P比のCNE01およびCNE17のRNase保護アッセイの結果を示す。CNE01は、4:1比と比較して10:1比でRNAを良好に保護した。CNE17は、10:1で良好な保護を示した。図2は、CNE17がまた、4:1のN/P比でRNAを保護できることを示す。CNE12および13もまた、両電荷比でRNAを保護した(CNE17と同様に)(図2)。図3は、4:1 N/P比で、あまり良好には保護しないCNE01を用いた図1と同様の結果を示す。CNE02は、試験した両N/P比でRNaseを極めて良好に保護した(図3および4)。CNE04は、RNAをRNase消化から保護しなかったが、CNE05は、試験した両電荷比でRNAを保護できた(図5)。CNE27が、極めて少ないRNase保護を示したのに対し、CNE32は、わずかにより多い保護を示したが、これまでに記載された処方物より全体的に少なかった。CNE35(図6)は、RNAをRNaseからの分解からわずかに保護できた。5種の異なる処方物全部が、in vitroでRNAの分解を防ぐことができた。
分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を発現するA306レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のin vivoでのタンパク質発現レベルを決定した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、SEAP(5×105IU)を発現するVRP、裸の自己複製RNA(A306、1μg)、エレクトロポレーションを使用して送達される自己複製RNA(A306+EP、それぞれ、1および0.1μg)、ならびに先に記載したように作製された、10:1のN/P比でCNE17、CNE05およびCNE35を用いて処方した自己複製RNA(1μgまたは0.1μg A306)
を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種(下肢あたり50μL)を行った。0日目の筋肉内ワクチン接種の1、3および6日後の血清SEAPレベル(相対光単位(relative light unit)、RLU)が表5に示されている。データは、群あたり5匹の個々のマウスの算術平均力価として表されている。
分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を発現するA306レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のin vivoでのタンパク質発現レベルを決定した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、裸の自己複製RNA(A306、1μg)、以下のN/P比6:1、7:1、8:1、10:1、12:1、13:1、14:1、16:1において、記載したように作製されたCNE17を用いて処方した自己複製RNA(A306、1μg)を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種(下肢あたり50μL)を行った。
分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を発現するA306レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のin vivoでのタンパク質発現レベルを決定した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、裸の自己複製RNA(A306、1μg)、以下のN/P比6:1、8:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1において、先に記載したように作製したCNE13を用いて処方した自己複製RNA(1μg A306)を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種(下肢あたり50μL)を行った。
分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を発現するA306レプリコンを使用して、アルファウイルスベクターの投与後のin vivoでのタンパク質発現レベルを決定した。BALB/cマウス、群あたり5匹の動物に、裸の自己複製RNA(A306、1μg)、以下のN/P比4:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1において、先に記載したように作製したCNE01を用いて処方した自己複製RNA(1μg A306)を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種(下肢あたり50μL)を行った。
種々の油を用いたタンパク質発現レベルの評価
種々の油を使用するが、CNE17の基本処方、すなわち、5%油、0.5% Tween 80、0.5% span85および1.4mg/ml DOTAPにおいて、一連のエマルジョンを作製した。以下の表12には、群の各々の油の変化が概説されている。油の分類も表12に列挙されている。
達される自己複製RNA(A306+EP、1および0.1μg)、ならびに先に記載したように作製したCNE36、CNE37、CNE38およびCNE41を用いて処方された自己複製RNA(1μg A306)を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種(下肢あたり50μL)を行った。0日目の筋肉内ワクチン接種の1、3および6日後の血清SEAPレベル(相対光単位、RLU)が表13に示されている。データは、群あたり5匹の個々のマウスの算術平均RLUとして表されている。
マウスモデルにおける、RSV−F抗原のCNE17によって増強された免疫原性
1.方法
マウス免疫原性研究
この研究には、RSVの表面融合糖タンパク質(RSV−F)を発現するA317レプリコンを使用した。8〜10週齢で、体重約20gのBALB/cマウス、群あたり10匹の動物に、両側筋肉内ワクチン接種を行った。すべての動物に、RSV−Fを発現するVRP(1×106IU)、裸の自己複製RNA(A317、1μg)、エレクトロポレーションを使用して送達される自己複製RNA(10μg A317+EP)またはCNE17中に処方された自己複製RNA(0.1μgまたは1μg A317)を用いて、0日目および21日目に、2本の後肢中、四頭筋に注射し、各々等容積(下肢あたり50μL)を投与した。14日目(2wp1)、35日目(2wp2)および49日目(4wp2)に抗体分析のために血清を採取した。T細胞応答の測定が必要であった場合には、T細胞分析のために35日目または49日目に群あたり5匹のマウスから脾臓を摘出した。
等しくワクチン接種されたBALB/cマウスから得た2から5個の脾臓を、プールし、培養のために単細胞懸濁物を調製した。各脾細胞プールについて、2つの抗原によって刺激された培養物および2つの非刺激培養物を確立した。抗原によって刺激された培養物は、1×106個の脾細胞、RSV Fペプチド85〜93(1×10−6M)、RSV
Fペプチド249〜258(1×10−6M)、RSV Fペプチド51〜66(1×10−6M)、抗CD28mAb(1mcg/mL)およびブレフェルジンA(1:1000)を含有していた。非刺激培養物は、RSV Fペプチドを含有しておらず、その他の点では、刺激された培養物と同一であった。37℃で6時間培養した後、培養物を免疫蛍光のために処理した。細胞を洗浄し、次いで、蛍光標識された抗CD4および抗CD8モノクローナル抗体(mAb)を用いて染色した。細胞を再度洗浄し、次いで、Cytofix/cytopermを用いて20分間固定した。次いで、Perm洗浄バッファー
を用いて固定された細胞を洗浄し、次いで、IFN−g、TNF−a、IL−2およびIL−5に特異的な蛍光標識mAbを用いて染色した。染色された細胞を洗浄し、次いで、LSR IIフローサイトメーターで分析した。FlowJoソフトウェアを使用して、取得したデータを分析した。CD4+8−およびCD8+4−T細胞サブセットを、別個に分析した。所与のサンプル中の各サブセットについて、サイトカイン陽性細胞%を決定した。RSV F抗原特異的T細胞%を、抗原によって刺激された培養物中のサイトカイン陽性細胞%と非刺激培養物中のサイトカイン陽性細胞%との間の相違として算出した。抗原特異的細胞%の95%信頼限界は、標準法(Statistical Methods、第7版、G.W.SnedecorおよびW.G.Cochran)を使用して決定した。
分泌型サイトカインアッセイのための培養物は、ブレフェルジンAが省かれた点を除いて細胞内サイトカイン免疫蛍光アッセイのものと同様であった。37℃で一晩培養した後に培養上清を収集し、Meso Scale Discovery製のマウスTh1/Th2サイトカインキットを使用して複数のサイトカインについて分析した。培養物あたりの各サイトカインの量を、製造業者によって供給された精製組換えサイトカインを使用して作成した標準曲線から決定した。
14、35および49日目のF特異的血清IgG力価が、表14、15および16に示されている。35および49日目のRSV血清中和力価が表17に示されており、49日目のT細胞応答が表18および19に示されている。
25の力価(検出限界)を有していた場合、5の力価を割り当てた。
ラットモデルにおけるRNA−粒子複合体の免疫原性
1.方法
RSV−F三量体サブユニットワクチン
RSV F三量体は、融合ペプチド領域が欠失した(その他の三量体との会合を防ぐ)、RSV Fの外部ドメインを含む組換えタンパク質である。得られた構築物は、同種三量体を形成することがサイズ排除クロマトグラフィーによって観察され、融合後Fコンホメーションと一致する予測された表現型を有することが電子顕微鏡によって観察された。タンパク質は、昆虫細胞において発現され、構築物のC末端と融合したHISタグ、さらに、従来の技術を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。得られたタンパク質サンプルは、95%超の純度を示す。F−サブユニットワクチンのin vivo評価のために、100μg/mL三量体タンパク質を、10mMヒスチジンバッファー、pH6.3を使用して2mg/mLアラム(alum)上に吸着させ、塩化ナトリウムを用いて等張へ調整した(150mMに)。F−サブユニットタンパク質を、2〜8℃で穏やかに撹拌しながらアラム上に一晩吸着させた。
雌性のコットンラット(Sigmodon hispidis)は、Harlan Laboratoriesから入手した。すべての研究は、Novartisの動物の管理および使用に関する委員会(Novartis Animal Care and Us
e Committee)によって承認され、これに従って実施した。0日目および21日目に、示されたワクチンを用いて、動物の群を、筋肉内で免疫化した(i.m.、100μl)。第1の免疫化の3週間後および第2の免疫化の2週間後に血清サンプルを採取した。免疫化された動物またはワクチン接種されていない対照動物に、最終免疫化の4週間後に、1×105PFU RSVを用いて鼻腔内(i.n.)チャレンジを行った。精密気化器(precision vaporizer)を使用し、3%イソフルランを用いる採血および麻酔下でのRSVチャレンジを実施した。
個々の血清サンプルを、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)によってRSV F特異的IgGの存在についてアッセイした。ELISAプレート(MaxiSorp 96ウェル、Nunc)を、PBS中、1μg/mlの精製RSV F(delp23−furdel−trunc非切断型)を用いて4℃で一晩コーティングした。洗浄(0.1% Tween−20を含むPBS)後、プレートを、PBS中のSuperblockブロッキングバッファー(Thermo Scientific)を用いて、37℃で少なくとも1.5時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、実験または対照コットンラットから得た、アッセイ希釈剤(0.1% Tween−20および5%ヤギ血清を含むPBS)での血清の段階希釈物を添加し、プレートを37℃で2時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ニワトリ抗コットンラットIgG(Immunology Consultants Laboratory、Inc、アッセイ希釈剤で1:5,000希釈)とともに37℃で1時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、各ウェルに100μlのTMBペルオキシダーゼ基質溶液(Kirkegaard & Perry Laboratories、Inc)を添加した。100μlの1M H3PO4を添加することによって反応を停止させ、プレートリーダーを使用して450nmで吸光度を読み取った。各血清サンプルについて、光学濃度(OD) 対 血清希釈の逆数の対数のプロットを、非線形回帰(GraphPad Prism)によって作成した。力価は、およそ0.5のODでの血清希釈の逆数として定義した(各プレートに含まれていた、1:2500の定義された力価を有する、RSV感染したコットンラットから得たプールされた標準の血清に正規化された)。
血清サンプルを、プラーク減少中和試験(PRNT)によって中和抗体の存在について試験した。HI−血清の2倍段階希釈物(5% HI−FBSを含むPBS中)を、以前に力価測定された等容積のRSV Longに添加した(およそ115PFU/25μlを生じる)。血清/ウイルス混合物を37℃および5%CO2で2時間インキュベートして、ウイルス中和が生じるのを可能にし、次いで、25μlのこの混合物(およそ115PFUを含有する)を96ウェルプレート中のHEp−2細胞の2連のウェルに接種した。37℃および5%CO2で2時間後、細胞を0.75%メチルセルロース/EMEM5%HI−FBSで覆い、42時間インキュベートした。免疫染色とそれに続く自動計数によるシンシチウム形成の検出によって感染性ウイルス粒子の数を決定した。中和力価は、対照(血清なし)に対して、ウェルあたりのシンシチウム(synctia)の数の少なくとも60%の減少を生じる、血清希釈の逆数として定義される。
肺中のウイルス量は、プラークアッセイによって決定した。具体的には、RSV感染の5日後に肺を摘出し、1つの右葉を、2.5mlの25%スクロースを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM、Invitrogen)中に入れ、組織ホモジナイザーを用いて破壊した。これらのサンプルから得た細胞不含上清を、−80℃で保存した。感染性ウイルスのアッセイのために、清澄化した肺ホモジネートの希釈物(5%熱不活化ウシ
胎仔血清を含むPBS、HI−FBS中)を、200μl/ウェル(12ウェルプレート)の容積で集密なHEp−2細胞単層上に接種した。周期的に穏やかに振盪し(37℃、5% CO2)、2時間後、接種材料を除去し、細胞を、1.5mlの、5% HI−FBS、グルタミンおよび抗生物質が補充されたイーグルの最小必須培地(EMEM、Lonza)中の1.25%のSeaPlaqueアガロース(Lonza)で覆った。3〜4日間インキュベートした後、細胞を、1mlの、0.1%ニュートラルレッド(Sigma)を含有するEMEM(Sigma)中の1.25%のアガロースで再度覆った。プラークは、1日後にライトボックスを用いて計数する。
RSVチャレンジの5日後、肺を摘出し、各動物から得た4葉を集め、穏やかな気管内注入とそれに続く浸漬固定によって、10%中性緩衝化ホルマリン(NBF)を用いて固定化した。組織を慣例的に処理して、顕微鏡検査のためのヘマトキシリン&エオシン染色切片を調製した。以下のパラメータ:細気管支周囲炎、肺胞炎、気管支炎、血管周囲細胞性浸潤および間質性肺炎についてのこれまでに公開された基準[Prince GAら、2001年]の改変を使用して、所見を評価した。病変は4点の半定量的スケールで類別した。最小(+)変化は、1つまたは2、3個の小さい病巣を含有していた;軽度(++)変化は、小〜中程度のサイズの病巣からなっていた;中程度(+++)変化は、高頻度の、および/または中程度のサイズの病巣を含有していた;著しい(++++)変化は、組織のほとんど/すべてに影響を及ぼす広範な病巣から集密的な病巣を示した。
この研究には、RSVの表面融合糖タンパク質(RSV−F)を発現するA317レプリコンを使用した。コットンラット(Sigmodon hispidus)、群あたり8匹の動物に、裸の自己複製RNA(A317、1μgまたは10μg)、CNE17を用いて処方された自己複製RNA(A317、0.1μgまたは1μg)、RSV−Fを発現するVRP(5×106IU)、F三量体/アラムサブユニット(10μg)またはホルマリン不活化RSVワクチン(5200FI−pfu)を用いて0日目および21日目に両側筋肉内ワクチン接種(下肢あたり50μL)を行った。14日目(2wp1)および35日目(2wp2)に抗体分析のために血清を採取した。すべての動物を、49日目に1×105pfuのRSVを用いて鼻腔内でチャレンジし、ウイルス量および肺の病理の決定のために54日目(5dpc)に肺を採取した。
免疫原性に対する粒子サイズの影響
この実施例は、粒子サイズが、CNE/RNA処方物の免疫原性に影響を及ぼすことを示す。
、2wp1および2wp2の時点でのBALB/cマウスにおける個々の動物の全IgG力価を示す。
免疫原性に対する代替カチオン性脂質の影響の評価
1.材料および方法
CNEの調製
以下のカチオン性脂質:DLinDMA、DOTMA、DOEPC、DSTAP、DODACおよびDODAPを使用して一連のエマルジョンを作製した。表25には、エマルジョンの成分が記載されている。
エマルジョンを10:1 N/P、12:1 N/Pまたは18:1 N/P比で試験した(表26参照のこと)。そこで、RNAレプリコンおよびエマルジョンを、実施例2に先に記載したように複合体形成させた。BALB/cマウス、群あたり5〜10匹の動物に、裸の自己複製RNA(A317、1μg)、RV01(15)(40% DlinDMA、10% DSPC、48% Chol、2% PEG DMG 2000を含有するリポソーム中に処方された1μgのA317)、CNE13、CNE17、CMF37、CMF38またはCMF42を用いて処方された自己複製RNA(A317、1μg)を用いて0日目に両側筋肉内ワクチン接種(下肢あたり50μL)を行った。
14日目および35日目にBALB/cマウスの群から得た全血清IgG力価(幾何平均力価)が表26に示されている(群1〜8)。CMF37(DOTMA)を用いて処方されたRNAは、宿主免疫応答を良好に増強し、IgG力価は、CNE17(DOTAP)のものと同等であった。CMF38(DOEPC)を用いて処方されたRNAは、CN
E17のものよりもわずかに高いIgG力価を誘発したが、増強は、統計上有意ではなかった。DSTAPを用いて処方されたRNAは、宿主免疫応答を有意に増強せず、この低いIgG力価は、スクアレンにおけるDSTAPの低い溶解度による可能性が高い。CNE13を用いて処方されたRNAは、IgG力価を、リポソーム(DDA)を用いて処方されたRNAのものよりも、約1.5倍高く増強した。CMF43(DODAC)を用いて処方されたRNAによって誘導された全抗体力価は、CNE17のものよりも低かった(表28、群7および8)。
免疫原性に対するバッファー組成の影響の評価
この実施例では、CNE17をベースとするが、異なるバッファー成分を含む種々のエマルジョンを調製した。表27は、バッファーが改変されたエマルジョンの組成を示す。
免疫原性に対するPEG脂質の影響の評価
この実施例では、PEG脂質を使用して一連のエマルジョンを製造した。表29には、これらのPEG脂質をベースとするエマルジョンの組成が示されている。
Claims (33)
- カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成したRNA分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)25℃で液相である油コア、および
(b)カチオン性脂質
を含む、組成物であって、
ここで、該油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含み、
ここで、該RNA分子が抗原をコードする自己複製RNA分子であり、該RNA分子はウイルス様粒子内に被包されず、該RNA分子は感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができない、組成物。 - 前記粒子が界面活性剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項2に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、ソルビタントリオレエート、もしくはポリソルベート80、またはこれらの組合せである、請求項2から3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カチオン性水中油型エマルジョンが、0.01%〜2.5%(v/v)の非イオン性界面活性剤を含む、請求項3または4に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、前記水中油型エマルジョンの水相中に存在する、請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 0.2%〜9%(v/v)の油を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、1,2−ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)、3β−[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール(DCコレステロール)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA)、1,2−ジミリストイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、ジパルミトイル(C16:0)トリメチルアンモニウムプロパン(DPTAP)、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン(DSTAP)、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N−ジオレオイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−エチルホスホコリン(DOEPC)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン(DODAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)からなる群より選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質がDOTAPであり、前記カチオン性水中油型エマルジョンが、0.5mg/ml〜5mg/mlのDOTAPを含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質がDCコレステロールであり、前記組成物が、0.1mg/ml〜5mg/mlのDCコレステロールを含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質がDDAであり、前記組成物が、0.1mg/ml〜5mg/mlのDDAを含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質がDOTMAであり、前記組成物が、0.5mg/ml〜5mg/mlのDOTMAを含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質がDOEPCであり、前記組成物が、0.5mg/ml〜5mg/mlのDOEPCを含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質がDODACであり、前記組成物が、0.5mg/ml〜5mg/mlのDODACを含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記カチオン性水中油型エマルジョンが、該水中油型エマルジョンの水相中にポリマーをさらに含む、請求項1から14までのいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ポリマーがポロキサマーである、請求項15に記載の組成物。
- 前記カチオン性水中油型エマルジョンが、0.1%〜10%(v/v)のポリマーを含む、請求項15または16に記載の組成物。
- 前記エマルジョンの粒子の平均直径が200nm以下である、請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記エマルジョンのN/P比が4:1〜14:1である、請求項1から18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記エマルジョンの粒子の平均直径が80nm〜180nmであり、前記エマルジョンのN/P比が少なくとも4:1である、請求項1から19のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が、緩衝化されており、かつ6.0〜8.0のpHを有する、組成物。
- 前記pHが6.2〜6.8である、請求項21に記載の組成物。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が無機塩をさらに含み、無機塩の濃度が30mM以下である、組成物。
- 請求項1から23のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物が、非イオン性等張化剤をさらに含む、組成物。
- 前記非イオン性等張化剤が、糖もしくは糖アルコールまたはこれらの組み合わせである、請求項24に記載の組成物。
- 前記非イオン性等張化剤が、280mM〜300mMの濃度で存在する、請求項24または25に記載の組成物。
- 前記組成物が、等張性である、請求項1から26のいずれか一項に記載の組成物。
- カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物であって、該粒子は、
(a)油コア、
(b)カチオン性脂質、および
(c)リン脂質
を含む、組成物であって、
ここで、該油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含み、
ここで、該負に荷電した分子が抗原をコードする自己複製RNA分子であり、該RNA分子はウイルス様粒子内に被包されず、該RNA分子は感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができない、組成物。 - 前記リン脂質が、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、卵ホスファチジルコリン(卵PC)、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPyPE)、またはこれらの組合せである、請求項28に記載の組成物。
- カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成した負に荷電した分子を含む組成物を調製する方法であって、該方法は、
(a)カチオン性水中油型エマルジョンであって、該エマルジョンの粒子は、
(i)25℃で液相である油コア、および
(ii)カチオン性脂質、ならびに必要に応じて
(iii)リン脂質
を含む、カチオン性水中油型エマルジョンと、
(b)負に荷電した分子を含む水性溶液と
を提供するステップと、
該負に荷電した分子が該カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体を形成するように、(a)と(b)とを合わせるステップと
を含む、方法であって、
ここで、該油コアは、スクアレン、スクアラン、またはこれらの組合せを含み、
ここで、該負に荷電した分子が抗原をコードする自己複製RNA分子であり、該RNA分子はウイルス様粒子内に被包されず、該RNA分子は感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができない、方法。 - 前記カチオン性水中油型エマルジョンおよび前記水性溶液が、1:1(v/v)の比で合わされる、請求項30に記載の方法。
- 免疫応答を生じさせるための薬剤の製造における、請求項1から29のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 免疫応答を生じさせるために使用される、請求項1から29のいずれか一項に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36189210P | 2010-07-06 | 2010-07-06 | |
US61/361,892 | 2010-07-06 | ||
PCT/US2011/043108 WO2012006380A2 (en) | 2010-07-06 | 2011-07-06 | Cationic oil-in-water emulsions |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016172965A Division JP2016204389A (ja) | 2010-07-06 | 2016-09-05 | カチオン性水中油型エマルジョン |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013531680A JP2013531680A (ja) | 2013-08-08 |
JP2013531680A5 JP2013531680A5 (ja) | 2014-08-07 |
JP6025721B2 true JP6025721B2 (ja) | 2016-11-16 |
Family
ID=44629230
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013518815A Active JP6025721B2 (ja) | 2010-07-06 | 2011-07-06 | カチオン性水中油型エマルジョン |
JP2016172965A Withdrawn JP2016204389A (ja) | 2010-07-06 | 2016-09-05 | カチオン性水中油型エマルジョン |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016172965A Withdrawn JP2016204389A (ja) | 2010-07-06 | 2016-09-05 | カチオン性水中油型エマルジョン |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9295646B2 (ja) |
EP (2) | EP2590625B1 (ja) |
JP (2) | JP6025721B2 (ja) |
CN (2) | CN103327963A (ja) |
AU (1) | AU2011276236B2 (ja) |
BR (1) | BR112013000391B8 (ja) |
CA (1) | CA2804591C (ja) |
ES (1) | ES2649896T3 (ja) |
MX (1) | MX343410B (ja) |
NZ (1) | NZ606591A (ja) |
RU (1) | RU2625546C2 (ja) |
WO (1) | WO2012006380A2 (ja) |
Families Citing this family (174)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SI2591114T1 (sl) | 2010-07-06 | 2016-10-28 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Imunizacija velikih sesalcev z majhnimi odmerki RNA |
SI2590676T1 (sl) | 2010-07-06 | 2016-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Virionu podobni delci za dajanje za samorepliciranje RNA molekul |
HUE026646T2 (en) | 2010-07-06 | 2016-07-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Preferred liposomes containing lipids of PKA value for delivery of RNA |
MX343410B (es) * | 2010-07-06 | 2016-11-04 | Novartis Ag * | Emulsiones cationicas de agua en aceite. |
US9770463B2 (en) | 2010-07-06 | 2017-09-26 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Delivery of RNA to different cell types |
HUE047796T2 (hu) | 2010-07-06 | 2020-05-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | RNS bevitele több immunútvonal bekapcsolására |
EP3578205A1 (en) | 2010-08-06 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
HUE060524T2 (hu) | 2010-08-31 | 2023-03-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Pegilált liposzómák immunogén kódoló RNS beszállítására |
RU2013120302A (ru) | 2010-10-01 | 2014-11-20 | Модерна Терапьютикс, Инк. | Сконструированные нуклеиновые кислоты и способы их применения |
EP3520813B1 (en) | 2010-10-11 | 2023-04-19 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Antigen delivery platforms |
JP2014511687A (ja) | 2011-03-31 | 2014-05-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド | 工学操作された核酸の送達および製剤 |
IL307511A (en) | 2011-06-08 | 2023-12-01 | Shire Human Genetic Therapies | Preparations of lipid nanoparticles and methods for administration of mRNA |
EP3854413A1 (en) | 2011-07-06 | 2021-07-28 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Immunogenic combination compositions and uses thereof |
BR112014000235A8 (pt) * | 2011-07-06 | 2018-03-06 | Novartis Ag | emulsões de óleo em água catiônicas |
AU2012280901B2 (en) | 2011-07-06 | 2016-11-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
US9428535B2 (en) | 2011-10-03 | 2016-08-30 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
LT2791160T (lt) | 2011-12-16 | 2022-06-10 | Modernatx, Inc. | Modifikuotos mrnr sudėtys |
CA2868391A1 (en) | 2012-04-02 | 2013-10-10 | Stephane Bancel | Polynucleotides comprising n1-methyl-pseudouridine and methods for preparing the same |
US9192651B2 (en) | 2012-04-02 | 2015-11-24 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of secreted proteins |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
US9254311B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of proteins |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
CN104853770A (zh) * | 2012-07-06 | 2015-08-19 | 诺华股份有限公司 | 免疫原性组合物及其应用 |
CN104853771A (zh) | 2012-07-06 | 2015-08-19 | 诺华股份有限公司 | 巨细胞病毒蛋白的复合物 |
WO2014028429A2 (en) | 2012-08-14 | 2014-02-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Enzymes and polymerases for the synthesis of rna |
FR2998899B1 (fr) * | 2012-11-30 | 2015-07-17 | Commissariat Energie Atomique | Methode de criblage a haut-debit pour l'identification de biomarqueurs, cibles therapeutiques ou d'agents therapeutiques |
FR2994849B1 (fr) * | 2012-08-30 | 2015-01-02 | Commissariat Energie Atomique | Formulation pour la delivrance de sequences nucleotidiques susceptibles de moduler des mecanismes endogenes d'arn interferents |
US10253315B2 (en) | 2012-08-30 | 2019-04-09 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Method for transfection of nucleic acids into eukaryotic cells in 3D scaffold |
WO2014081507A1 (en) | 2012-11-26 | 2014-05-30 | Moderna Therapeutics, Inc. | Terminally modified rna |
MX2015008847A (es) | 2013-01-10 | 2015-10-30 | Novartis Ag | Composiciones inmunogenicas de virus de influenza y usos de las mismas. |
AU2013374345A1 (en) | 2013-01-17 | 2015-08-06 | Moderna Therapeutics, Inc. | Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes |
WO2014159813A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
EP2971010B1 (en) | 2013-03-14 | 2020-06-10 | ModernaTX, Inc. | Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
PL2970948T3 (pl) | 2013-03-15 | 2019-06-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Sposoby oczyszczania rna |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
EP3041938A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
AU2014315287A1 (en) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
EP3052106A4 (en) | 2013-09-30 | 2017-07-19 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
CA2926218A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
EP3122774B1 (en) | 2014-03-25 | 2020-11-04 | Yale University | Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors |
CN106659803A (zh) | 2014-04-23 | 2017-05-10 | 摩登纳特斯有限公司 | 核酸疫苗 |
EP2974739A1 (en) | 2014-07-15 | 2016-01-20 | Novartis AG | RSVF trimerization domains |
EP3160938B1 (en) | 2014-06-25 | 2020-09-16 | Acuitas Therapeutics Inc. | Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
EP3169693B1 (en) | 2014-07-16 | 2022-03-09 | ModernaTX, Inc. | Chimeric polynucleotides |
US20170210788A1 (en) | 2014-07-23 | 2017-07-27 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of intrabodies |
EP3048114A1 (en) | 2015-01-22 | 2016-07-27 | Novartis AG | Cytomegalovirus antigens and uses thereof |
EP3061826A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-08-31 | Novartis AG | Flavivirus replicons |
CA2979998A1 (en) * | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia |
EP3313829B1 (en) | 2015-06-29 | 2024-04-10 | Acuitas Therapeutics Inc. | Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
US11364292B2 (en) | 2015-07-21 | 2022-06-21 | Modernatx, Inc. | CHIKV RNA vaccines |
US11007260B2 (en) | 2015-07-21 | 2021-05-18 | Modernatx, Inc. | Infectious disease vaccines |
US10849920B2 (en) | 2015-10-05 | 2020-12-01 | Modernatx, Inc. | Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs |
CA3002912A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Modernatx, Inc. | Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv) |
EP3364950A4 (en) | 2015-10-22 | 2019-10-23 | ModernaTX, Inc. | VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES |
US20180289792A1 (en) | 2015-10-22 | 2018-10-11 | ModernaTX. Inc. | Sexually transmitted disease vaccines |
HRP20230209T1 (hr) | 2015-10-28 | 2023-04-14 | Acuitas Therapeutics Inc. | Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina |
WO2017087763A1 (en) * | 2015-11-18 | 2017-05-26 | Orbis Health Solutions Llc | T7 alpha viral vector system |
PL3394093T3 (pl) | 2015-12-23 | 2022-05-16 | Modernatx, Inc. | Metody stosowania polinukleotydów kodujących ligand ox40 |
MA43587A (fr) | 2016-01-10 | 2018-11-14 | Modernatx Inc | Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4 |
WO2017147470A1 (en) * | 2016-02-26 | 2017-08-31 | The Regents Of The University Of California | Bicontinuous microemulsions and methods of use thereof |
WO2017162265A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Trans-replicating rna |
WO2017162266A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Rna replicon for versatile and efficient gene expression |
WO2017196979A1 (en) * | 2016-05-10 | 2017-11-16 | The Regents Of The University Of Michigan | Emulsion adjuvant for intramuscular, intradermal and subcutaneous administration |
MA45051A (fr) | 2016-05-18 | 2019-03-27 | Modernatx Inc | Polynucléotides codant la relaxine |
EP3463445A1 (en) | 2016-06-02 | 2019-04-10 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Zika viral antigen constructs |
CA3034681A1 (en) | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions and methods for delivering messenger rna |
BE1024774B1 (fr) | 2016-09-29 | 2018-07-02 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Compositions et procedes de traitement |
GB201616904D0 (en) | 2016-10-05 | 2016-11-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccine |
CN107951862B (zh) * | 2016-10-17 | 2021-03-12 | 南京绿叶制药有限公司 | 一种抑制bcl-2的反义寡聚核酸的脂质纳米粒及其制备方法 |
US10925958B2 (en) | 2016-11-11 | 2021-02-23 | Modernatx, Inc. | Influenza vaccine |
EP3541416A1 (en) | 2016-11-17 | 2019-09-25 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Zika viral antigen constructs |
EP3551230A1 (en) | 2016-12-08 | 2019-10-16 | CureVac AG | Rna for treatment or prophylaxis of a liver disease |
US11103578B2 (en) | 2016-12-08 | 2021-08-31 | Modernatx, Inc. | Respiratory virus nucleic acid vaccines |
WO2018104540A1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-14 | Curevac Ag | Rnas for wound healing |
EP3558354A1 (en) | 2016-12-23 | 2019-10-30 | CureVac AG | Lassa virus vaccine |
US11141476B2 (en) | 2016-12-23 | 2021-10-12 | Curevac Ag | MERS coronavirus vaccine |
WO2018140425A1 (en) * | 2017-01-24 | 2018-08-02 | Nuvox Pharma Llc | Iso-osmotic and near iso-osmotic oxygen therapeutic formulations and methods thereof |
WO2018170256A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Herpes simplex virus vaccine |
US11045540B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-06-29 | Modernatx, Inc. | Varicella zoster virus (VZV) vaccine |
WO2018170245A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Broad spectrum influenza virus vaccine |
WO2018170260A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Respiratory syncytial virus vaccine |
JP2020514370A (ja) | 2017-03-17 | 2020-05-21 | キュアバック アーゲー | 組合せ抗癌療法のためのrnaワクチン及び免疫チェックポイント阻害剤 |
AU2018240515A1 (en) | 2017-03-24 | 2019-08-01 | CureVac SE | Nucleic acids encoding CRISPR-associated proteins and uses thereof |
MX2019013259A (es) | 2017-05-08 | 2020-01-13 | Gritstone Oncology Inc | Vectores de neoantigeno de alfavirus. |
KR101950579B1 (ko) * | 2017-05-12 | 2019-02-20 | 고려대학교 산학협력단 | 이산화탄소 흡수제 및 그 제조 방법 |
ES2952779T3 (es) | 2017-05-18 | 2023-11-06 | Modernatx Inc | ARN mensajero modificado que comprende elementos de ARN funcionales |
JP7285220B2 (ja) | 2017-05-18 | 2023-06-01 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 連結したインターロイキン-12(il12)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子 |
MA49395A (fr) | 2017-06-14 | 2020-04-22 | Modernatx Inc | Polynucléotides codant pour le facteur viii de coagulation |
US11141377B2 (en) * | 2017-06-15 | 2021-10-12 | Infectious Disease Research Institute | Nanostructured lipid carriers and stable emulsions and uses thereof |
BR112019028280A2 (pt) | 2017-07-04 | 2020-07-14 | Curevac Ag | moléculas de ácido nucleico |
US20200277627A1 (en) | 2017-09-13 | 2020-09-03 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Rna replicon for reprogramming somatic cells |
WO2019053056A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | RNA REPLICON FOR EXPRESSING A T CELL RECEPTOR OR ARTIFICIAL LYMPHOCYTIC T CELL RECEPTOR |
EP3681514A4 (en) | 2017-09-14 | 2021-07-14 | ModernaTX, Inc. | RNA VACZINE AGAINST ZIKA VIRUS |
EP3461497A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-03 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Viral antigens |
US20220233568A1 (en) | 2017-10-19 | 2022-07-28 | Curevac Ag | Novel artificial nucleic acid molecules |
WO2019094702A1 (en) | 2017-11-10 | 2019-05-16 | Cocoon Biotech Inc. | Ocular applications of silk-based products |
US11859215B2 (en) | 2017-11-22 | 2024-01-02 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders |
JP7423521B2 (ja) | 2017-11-22 | 2024-01-29 | モダーナティエックス・インコーポレイテッド | フェニルケトン尿症の治療用のフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド |
MA50802A (fr) | 2017-11-22 | 2020-09-30 | Modernatx Inc | Polynucléotides codant pour des sous-unités alpha et bêta de propionyl-coa carboxylase pour le traitement de l'acidémie propionique |
CA3084042A1 (en) * | 2017-12-04 | 2019-06-13 | Intervet International B.V. | Vaccination with replicon particles and oil adjuvant |
WO2019110067A1 (en) * | 2017-12-07 | 2019-06-13 | Aarhus Universitet | Hybrid nanoparticle |
JP2021509823A (ja) | 2018-01-04 | 2021-04-08 | アイコニック セラピューティクス インコーポレイテッド | 抗組織因子抗体、抗体薬物コンジュゲート、及び関連する方法 |
US11802146B2 (en) | 2018-01-05 | 2023-10-31 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies |
MA54676A (fr) | 2018-01-29 | 2021-11-17 | Modernatx Inc | Vaccins à base d'arn contre le vrs |
EP3758747A1 (en) | 2018-02-28 | 2021-01-06 | University of Washington | Self-asssembling nanostructure vaccines |
WO2019200171A1 (en) | 2018-04-11 | 2019-10-17 | Modernatx, Inc. | Messenger rna comprising functional rna elements |
MA52709A (fr) | 2018-05-23 | 2021-03-31 | Modernatx Inc | Administration d'adn |
EP3581201A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-18 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof |
WO2020023390A1 (en) | 2018-07-25 | 2020-01-30 | Modernatx, Inc. | Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders |
JP2021534182A (ja) | 2018-08-17 | 2021-12-09 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 免疫原性組成物及びその使用 |
EP3846776A1 (en) | 2018-09-02 | 2021-07-14 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency |
MA53608A (fr) | 2018-09-13 | 2021-07-21 | Modernatx Inc | Polynucléotides codant pour les sous-unités e1-alpha, e1-beta et e2 du complexe alpha-cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée pour le traitement de la leucinose |
US20230009009A1 (en) | 2018-09-13 | 2023-01-12 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase for the treatment of glycogen storage disease |
EP3850102A1 (en) | 2018-09-14 | 2021-07-21 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome |
WO2020069169A1 (en) | 2018-09-27 | 2020-04-02 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency |
US20220001026A1 (en) | 2018-11-08 | 2022-01-06 | Modernatx, Inc. | Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients |
WO2020144295A1 (en) | 2019-01-10 | 2020-07-16 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Localized administration of rna molecules for therapy |
US11453639B2 (en) | 2019-01-11 | 2022-09-27 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents |
CN109771373B (zh) * | 2019-01-23 | 2021-03-02 | 浙江工商大学 | 脂质体稳定的水包油Pickering乳液及其制备方法 |
US11351242B1 (en) | 2019-02-12 | 2022-06-07 | Modernatx, Inc. | HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition |
US20220226438A1 (en) | 2019-05-08 | 2022-07-21 | Astrazeneca Ab | Compositions for skin and wounds and methods of use thereof |
WO2020243719A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | Gritstone Oncology, Inc. | Modified adenoviruses |
CA3142608A1 (en) | 2019-06-04 | 2020-12-10 | Cocoon Biotech Inc. | Silk-based products, formulations, and methods of use |
WO2020263883A1 (en) | 2019-06-24 | 2020-12-30 | Modernatx, Inc. | Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof |
EP3986480A1 (en) | 2019-06-24 | 2022-04-27 | ModernaTX, Inc. | Messenger rna comprising functional rna elements and uses thereof |
KR20220035457A (ko) | 2019-07-21 | 2022-03-22 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 치료 바이러스 백신 |
US11679163B2 (en) | 2019-09-20 | 2023-06-20 | Hdt Bio Corp. | Compositions and methods for delivery of RNA |
CN110624472B (zh) * | 2019-09-28 | 2023-06-20 | 重庆威能钻井助剂有限公司 | 一种乳化剂及其制备方法和应用 |
EP3819377A1 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-12 | Justus-Liebig-Universität Gießen | Circular rna and uses thereof for inhibiting rna-binding proteins |
CA3171219A1 (en) | 2020-03-09 | 2021-09-16 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for inducing immune responses |
JP2023518976A (ja) | 2020-03-23 | 2023-05-09 | エイチディーティー バイオ コーポレーション | Rnaを送達するための組成物および方法 |
US20230364219A1 (en) | 2020-04-16 | 2023-11-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Sars cov-2 spike protein construct |
AU2021285812A1 (en) | 2020-06-01 | 2023-01-05 | Modernatx, Inc. | Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof |
US20230265454A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-08-24 | BioNTech SE | RNA Replicon for Versatile and Efficient Gene Expression |
US20230234992A1 (en) | 2020-06-05 | 2023-07-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified betacoronavirus spike proteins |
US20230256090A1 (en) | 2020-06-29 | 2023-08-17 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Adjuvants |
EP4182297A1 (en) | 2020-07-16 | 2023-05-24 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Cationic lipids for use in lipid nanoparticles |
EP4192496A2 (en) | 2020-08-06 | 2023-06-14 | Gritstone bio, Inc. | Multiepitope vaccine cassettes |
WO2022040773A1 (en) * | 2020-08-26 | 2022-03-03 | Canadian Nano Pharmaceutical Technology Inc. | Nano-emulsion based compositions, methods for their preparation and their use in delivery of active ingredients |
WO2022104131A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis |
MX2023005633A (es) | 2020-11-13 | 2023-05-24 | Icosavax Inc | Vacuna de nanoparticula a base de proteinas contra metapneumovirus. |
EP4008785A1 (en) | 2020-12-03 | 2022-06-08 | Justus-Liebig-Universität Gießen | Circular nucleic acids and uses thereof for interfering with genome expression and proliferation of coronaviruses |
EP4267593A2 (en) | 2020-12-23 | 2023-11-01 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Self-amplifying messenger rna |
EP4277654A1 (en) | 2021-01-18 | 2023-11-22 | Conserv Bioscience Limited | Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof |
EP4032546A1 (en) | 2021-01-20 | 2022-07-27 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Therapeutic viral vaccine |
WO2022204369A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia |
WO2022204371A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof |
WO2022204380A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof |
WO2022204390A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof |
JP2024512026A (ja) | 2021-03-24 | 2024-03-18 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療を目的とした脂質ナノ粒子及びオルニチントランスカルバミラーゼをコードするポリヌクレオチド |
CN117377491A (zh) | 2021-03-26 | 2024-01-09 | 葛兰素史克生物有限公司 | 免疫原性组合物 |
EP4346894A1 (en) | 2021-05-24 | 2024-04-10 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Adjuvants |
EP4352247A1 (en) | 2021-06-09 | 2024-04-17 | GlaxoSmithKline Biologicals s.a. | Release assay for determining potency of self-amplifying rna drug product and methods for using |
WO2022266083A2 (en) | 2021-06-15 | 2022-12-22 | Modernatx, Inc. | Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression |
WO2022271776A1 (en) | 2021-06-22 | 2022-12-29 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome |
GB202110644D0 (en) * | 2021-07-23 | 2021-09-08 | Sisaf Ltd | Improved nucleic acid vector particles |
CA3171750A1 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Tim SONNTAG | Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases |
WO2023018345A1 (ru) * | 2021-08-09 | 2023-02-16 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение "Квантовые технологии" | Реагент для очистки сточных вод и способ его получения |
WO2023020992A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods |
WO2023020994A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods |
WO2023020993A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods |
WO2023056044A1 (en) | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease |
AU2022372325A1 (en) | 2021-10-18 | 2024-05-02 | BioNTech SE | Methods for determining mutations for increasing modified replicable rna function and related compositions and their use |
AU2022369342A1 (en) | 2021-10-18 | 2024-03-14 | BioNTech SE | Modified replicable rna and related compositions and their use |
WO2023144193A1 (en) | 2022-01-25 | 2023-08-03 | CureVac SE | Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i |
WO2023161350A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-31 | Io Biotech Aps | Nucleotide delivery of cancer therapy |
WO2023183909A2 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia |
WO2023213378A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | BioNTech SE | Replicon compositions and methods of using same for the treatment of diseases |
WO2023225562A1 (en) | 2022-05-17 | 2023-11-23 | Icosavax, Inc. | Multivalent vaccine for paramyxoviruses and uses thereof |
US20230381303A1 (en) * | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Akagera Medicines, Inc. | Lipid Nanoparticles for Delivery of Nucleic Acids and Methods of Use Thereof |
WO2024017479A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | BioNTech SE | Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production |
WO2024026254A1 (en) | 2022-07-26 | 2024-02-01 | Modernatx, Inc. | Engineered polynucleotides for temporal control of expression |
WO2024056856A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | BioNTech SE | Systems and compositions comprising trans-amplifying rna vectors with mirna |
Family Cites Families (67)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US367363A (en) | 1887-08-02 | Joseph f | ||
CA583561A (en) | 1959-09-22 | H. Edgerton William | Therapeutically valuable esters and methods for obtaining the same | |
US3130011A (en) | 1958-09-17 | 1964-04-21 | British Titan Products | Production of silicon halides |
FR1317586A (ja) | 1961-03-17 | 1963-05-08 | ||
US5132418A (en) | 1980-02-29 | 1992-07-21 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4500707A (en) | 1980-02-29 | 1985-02-19 | University Patents, Inc. | Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides |
US4973679A (en) | 1981-03-27 | 1990-11-27 | University Patents, Inc. | Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates |
US4668777A (en) | 1981-03-27 | 1987-05-26 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite nucleoside compounds |
US4373071A (en) | 1981-04-30 | 1983-02-08 | City Of Hope Research Institute | Solid-phase synthesis of polynucleotides |
CA1341482C (en) | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
US4689225A (en) | 1984-11-02 | 1987-08-25 | Institut Merieux | Vaccine for cytomegalovirus |
US5153319A (en) | 1986-03-31 | 1992-10-06 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
DK341386D0 (da) | 1986-07-18 | 1986-07-18 | Voetman Karin Glassau | Fremgangsmaade og apparat til oprulning af flade dejstykker, f.eks. til roulader |
WO1989004669A1 (en) | 1987-11-18 | 1989-06-01 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics and vaccines |
JP2607712B2 (ja) | 1988-01-29 | 1997-05-07 | カイロン コーポレイション | 組換えcmv中和タンパク |
US5262530A (en) | 1988-12-21 | 1993-11-16 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
US5047524A (en) | 1988-12-21 | 1991-09-10 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
WO1990011089A1 (en) | 1989-03-17 | 1990-10-04 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics and vaccines |
HU212924B (en) | 1989-05-25 | 1996-12-30 | Chiron Corp | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
EP1624068A1 (en) | 1993-06-01 | 2006-02-08 | Life Technologies Inc. | Genetic immunization with cationic lipids |
US6015686A (en) | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
US5885613A (en) | 1994-09-30 | 1999-03-23 | The University Of British Columbia | Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes |
US5795587A (en) | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
US5700642A (en) | 1995-05-22 | 1997-12-23 | Sri International | Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers |
CA2220950A1 (en) * | 1995-05-26 | 1996-11-28 | Somatix Therapy Corporation | Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes |
US5654452A (en) * | 1995-06-07 | 1997-08-05 | Molecular Biosystems, Inc. | Lipophilic contrast agents for use in hepatocyte-selective oil-in-water emulsions |
US6120794A (en) | 1995-09-26 | 2000-09-19 | University Of Pittsburgh | Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells |
US6451592B1 (en) | 1996-04-05 | 2002-09-17 | Chiron Corporation | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
EP1997900A3 (en) | 1996-04-05 | 2010-10-06 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
JP2001503735A (ja) | 1996-07-03 | 2001-03-21 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ | 親水性活性試薬のためのエマルジョン処方物 |
CN1138533C (zh) | 1996-09-13 | 2004-02-18 | 利普森有限公司 | 脂质体 |
US6171586B1 (en) * | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
CA2295740A1 (en) | 1997-07-08 | 1999-01-21 | Chiron Corporation | Use of submicron oil-in-water emulsions with dna vaccines |
PT1042001E (pt) | 1997-12-16 | 2002-09-30 | Chiron Corp | Uso de microparticulas combinadas com emulsoes submicronicas oleo-em-agua |
JP2002521423A (ja) * | 1998-07-31 | 2002-07-16 | コリア インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロージ | 遺伝子又は薬物運搬体としての脂質エマルジョン及び固形脂質微粒子 |
US6770282B1 (en) | 1998-10-23 | 2004-08-03 | Heska Corporation | Cationic lipid-mediated enhancement of nucleic acid immunization of cats |
CA2363141C (en) * | 1999-02-26 | 2010-04-06 | Chiron Corporation | Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles |
GB0012597D0 (en) * | 2000-05-25 | 2000-07-12 | Astrazeneca Ab | Formulation |
AU2001294898B2 (en) | 2000-09-28 | 2006-02-02 | Novartis Vaccines And Diagnostic Inc. | Microparticle compositions and methods for the manufacture thereof |
DK1322287T3 (da) | 2000-09-28 | 2006-07-24 | Chiron Corp | Mikropartikler til administration af heterologe nukleinsyrer |
US20030077829A1 (en) | 2001-04-30 | 2003-04-24 | Protiva Biotherapeutics Inc.. | Lipid-based formulations |
AR045702A1 (es) | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
NZ533237A (en) * | 2001-11-26 | 2005-11-25 | Univ Queensland | Flavivirus vaccine delivery system |
US6861410B1 (en) | 2002-03-21 | 2005-03-01 | Chiron Corporation | Immunological adjuvant compositions |
US20060189554A1 (en) | 2002-09-24 | 2006-08-24 | Russell Mumper | Nanoparticle-Based vaccine delivery system containing adjuvant |
ATE471335T1 (de) | 2002-12-23 | 2010-07-15 | Vical Inc | Impfstoffe gegen infektionen mit dem humanen zytomegalivirus auf grundlage von codonoptimierten polynukleotiden |
AU2004233851B2 (en) * | 2003-04-25 | 2009-07-30 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Compositions comprising cationic microparticles and HCV E1E2 DNA and methods of use thereof |
US7803397B2 (en) | 2003-09-15 | 2010-09-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof |
US7303881B2 (en) | 2004-04-30 | 2007-12-04 | Pds Biotechnology Corporation | Antigen delivery compositions and methods of use |
WO2005116270A2 (en) | 2004-05-18 | 2005-12-08 | Vical Incorporated | Influenza virus vaccine composition and method of use |
WO2006002538A1 (en) | 2004-07-02 | 2006-01-12 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Immunostimulatory sirna molecules and uses therefor |
US7749520B2 (en) * | 2004-07-07 | 2010-07-06 | Statens Serum Institut | Compositions and methods for stabilizing lipid based adjuvant formulations using glycolipids |
FR2885813B1 (fr) * | 2005-05-19 | 2008-01-11 | Oreal | Vectorisation de dsrna par des particules cationiques et leur utilisation sur modele de peau. |
ES2367194T3 (es) * | 2005-11-04 | 2011-10-31 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Cambio del equilibrio th1/th2 en vacunas contra la gripe fraccionadas con adyuvantes. |
US8877206B2 (en) | 2007-03-22 | 2014-11-04 | Pds Biotechnology Corporation | Stimulation of an immune response by cationic lipids |
HUE034483T2 (en) * | 2008-04-15 | 2018-02-28 | Protiva Biotherapeutics Inc | New lipid preparations for introducing a nucleic acid |
BRPI0910464B1 (pt) | 2008-04-17 | 2021-08-10 | Pds Biotechnology Corporation | Uso de uso de um lipídio catiônico quiral consistindo de r-dotap a preparação de composição farmacêutica |
CN102112110A (zh) * | 2008-06-06 | 2011-06-29 | 米尔纳医疗股份有限公司 | 用于RNAi试剂体内递送的新型组合物 |
US20110250237A1 (en) | 2008-07-15 | 2011-10-13 | O'hagan Derek | Immunogenic amphipathic peptide compositions |
US20110300205A1 (en) | 2009-07-06 | 2011-12-08 | Novartis Ag | Self replicating rna molecules and uses thereof |
CA2785492C (en) | 2009-12-23 | 2018-07-24 | Novartis Ag | Lipids, lipid compositions, and methods of using them |
US8804125B2 (en) | 2010-03-12 | 2014-08-12 | Konica Minolta, Inc. | Detection method for intermolecular interaction and detection device thereof |
SI2590676T1 (sl) | 2010-07-06 | 2016-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Virionu podobni delci za dajanje za samorepliciranje RNA molekul |
MX343410B (es) * | 2010-07-06 | 2016-11-04 | Novartis Ag * | Emulsiones cationicas de agua en aceite. |
JP6136343B2 (ja) | 2012-06-12 | 2017-05-31 | 株式会社リコー | 情報処理システム、情報処理方法、プログラム、及び記録媒体 |
-
2011
- 2011-07-06 MX MX2013000171A patent/MX343410B/es active IP Right Grant
- 2011-07-06 CN CN2011800427868A patent/CN103327963A/zh active Pending
- 2011-07-06 CN CN201810021419.3A patent/CN108042799A/zh active Pending
- 2011-07-06 CA CA2804591A patent/CA2804591C/en active Active
- 2011-07-06 EP EP11738344.8A patent/EP2590625B1/en active Active
- 2011-07-06 AU AU2011276236A patent/AU2011276236B2/en active Active
- 2011-07-06 EP EP17191981.4A patent/EP3449910A1/en not_active Withdrawn
- 2011-07-06 BR BR112013000391A patent/BR112013000391B8/pt active IP Right Grant
- 2011-07-06 WO PCT/US2011/043108 patent/WO2012006380A2/en active Application Filing
- 2011-07-06 JP JP2013518815A patent/JP6025721B2/ja active Active
- 2011-07-06 RU RU2013104870A patent/RU2625546C2/ru active
- 2011-07-06 ES ES11738344.8T patent/ES2649896T3/es active Active
- 2011-07-06 NZ NZ606591A patent/NZ606591A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-09-18 US US13/235,454 patent/US9295646B2/en active Active
-
2016
- 2016-03-11 US US15/067,216 patent/US10238733B2/en active Active
- 2016-09-05 JP JP2016172965A patent/JP2016204389A/ja not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-03-07 US US16/295,563 patent/US11135287B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2590625A2 (en) | 2013-05-15 |
BR112013000391B1 (pt) | 2020-12-15 |
RU2013104870A (ru) | 2014-08-20 |
CN103327963A (zh) | 2013-09-25 |
AU2011276236B2 (en) | 2016-03-10 |
CA2804591A1 (en) | 2012-01-12 |
JP2016204389A (ja) | 2016-12-08 |
BR112013000391A2 (pt) | 2016-06-07 |
ES2649896T3 (es) | 2018-01-16 |
MX2013000171A (es) | 2013-03-05 |
US20190262448A1 (en) | 2019-08-29 |
BR112013000391B8 (pt) | 2022-10-04 |
AU2011276236A1 (en) | 2013-02-21 |
CA2804591C (en) | 2019-01-22 |
JP2013531680A (ja) | 2013-08-08 |
NZ606591A (en) | 2015-02-27 |
EP2590625B1 (en) | 2017-09-20 |
CN108042799A (zh) | 2018-05-18 |
EP3449910A1 (en) | 2019-03-06 |
US9295646B2 (en) | 2016-03-29 |
WO2012006380A3 (en) | 2012-07-05 |
US20120156251A1 (en) | 2012-06-21 |
US20160256541A1 (en) | 2016-09-08 |
MX343410B (es) | 2016-11-04 |
US10238733B2 (en) | 2019-03-26 |
US11135287B2 (en) | 2021-10-05 |
RU2625546C2 (ru) | 2017-07-14 |
WO2012006380A2 (en) | 2012-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6025721B2 (ja) | カチオン性水中油型エマルジョン | |
JP6059220B2 (ja) | 核酸を含む水中油型エマルジョン | |
JP6120839B2 (ja) | カチオン性水中油型エマルジョン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140620 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140620 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150312 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20150313 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150611 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150713 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150907 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151126 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160606 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160905 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160926 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161011 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6025721 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |