BR112013000391B1 - Composição de emulsão catiônica de óleo em água e seu uso - Google Patents

Abstract

emulsões de óleo em água catiônicas a presente invenção geralmente refere-se a emulsões de óleo em água catiônicas que podem ser usadas para distribuir moléculas carregadas negativamente, tais como uma molécula de rna. as partículas da emulsão compreendem um núcleo oleoso e um lipídeo catiônico. o lipídeo catiônico pode interagir com a molécula carregada negativamente, assim, ancorando a molécula às partículas da emulsão. as emulsões catiônicas aqui descritas são particularmente apropriadas para distribuir moléculas de ácido nucleico (tal como uma molécula de rna que codifica para um antídeno) para células e formular vacinas à base de ácido nucleico.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 61/361.892, depositado em 6 de Julho de 2010, todos os ensinamentos dos quais sendo aqui incorporados por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As terapêuticas de ácidos nucleicos têm a promessa para o tratamento de doenças que vão desde doenças hereditárias adquiridas a condições como o câncer, distúrbios infecciosos (AIDS), doenças do coração, artrite e distúrbios neurodegenerativos (por exemplo, de Parkinson e Alzheimer). Os genes funcionais não só podem ser distribuídos para reparar uma deficiência genética ou induzir a expressão de produtos de genes exógenos, mas os ácidos nucleicos podem também ser distribuídos para inibir a expressão do gene endógeno para fornecer um efeito terapêutico. A inibição da expressão gênica pode ser mediada por, por exemplo, por oligonucleotídeos antisense, RNAs de fita dupla (por exemplo, siRNAs, miRNAs), ou ribozimas.

Uma etapa chave para essa terapia é a distribuição de moléculas de ácido nucleico para as células in vivo. No entanto, a distribuição in vivo de moléculas de ácidos nucleicos, em moléculas de RNA específicas, enfrenta uma série de obstáculos técnicos. Em primeiro lugar, devido a nucleases celulares e do soro, a meia vida do RNA injetado in vivoé apenas cerca de 70 segundos (ver, por exemplo, Kurreck, Eur. J. Bioch 270:1628-1644 (2003)). Têm sido feitos esforços para aumentar a estabilidade do RNA injetados através do uso de modificações químicas; no entanto, existem vários casos em que as alterações químicas levaram a aumento dos efeitos citotóxicos ou a perda de função ou função diminuída. Em um exemplo específico, as células foram intolerantes a doses de um duplexo de RNAi em que cada sequndo fosfato foi substituído por fosforotioato (Harborth, et al. , Antisense Nucleic Acid Drogas Rev. 13 (2) :83-105 (2003)) . Como tal, existe a necessidade de desenvolver sistemas de distribuição que podem fornecer quantidades suficientes de moléculas de ácidos nucleicos (em determinadas moléculas de RNA) in vivo para induzir uma resposta terapêutica, mas que não sejam tóxicos para o hospedeiro.

As vacinas baseadas em ácidos nucleicos são uma abordagem atraente para a vacinação. Por exemplo, a imunização intramuscular (IM) de DNA de plasmídeo que codifica o antígeno pode induzir respostas celulares e imunes humorais e proteger contra o desafio. As vacinas de DNA oferecem algumas vantagens sobre as vacinas tradicionais que utilizam antígenos de proteína, ou patógenos atenuados. Por exemplo, em comparação com as vacinas de proteínas, as vacinas de DNA podem ser mais eficazes na produção de um antígeno propriamente dobrado na sua conformação nativa, e na geração de uma resposta imune celular. As vacinas de DNA também não têm alguns dos problemas de segurança associados com patógenos mortos ou atenuados. Por exemplo, uma preparação virai morta pode conter vírus vivos residuais, e um vírus atenuado pode mutar e reverter para um fenótipo patogênico.

Outra limitação das vacinas baseadas em ácidos nucleicos é que grandes doses de ácido nucleico são geralmente necessárias para se obter respostas imunes potentes em primatas não humanos e humanos. Portanto, os sistemas de distribuição e os adjuvantes são necessários para aumentar a potência das vacinas baseadas em ácidos nucleicos. Vários métodos têm sido desenvolvidos para a introdução de moléculas de ácidos nucleicos em células, tais como a transfecção com fosfato de cálcio, transfecção com polipreno, fusão de protoplastos, eletroporação, microinjecção, e lipofecção.

Os lipideos catiônicos têm sido amplamente formulados como lipossomas para distribuir genes nas células. No entanto, mesmo uma pequena quantidade de soro (-10%) pode reduzir significativamente a atividade de transfecção dos complexos de lipossomas/DNA, porque o soro contém materiais aniônicos. Recentemente, a emulsão de lipideo catiônico foi desenvolvida para fornecer moléculas de DNA em células. Ver, por exemplo, Kim, et al., International Journal of Pharmaceutics, 295, 35-45 (2005).

As Patentes U.S. n° . 6.753.015 e 6.855.492 descrevem um método de distribuição de moléculas de ácido nucleico a um vertebrado em questão usando microparticulas catiônicas. As microparticulas compreendem um polimero, tal como um poli(a-hidróxi ácido), um ácido poli-hidróxi butirico, uma policaprolactona, um poliortoéster, um polianidrido, e similares, e são formados com surfactantes catiônicos. As moléculas de ácido nucleico são adsorvidas nas superficies das microparticulas.

Kim et al. (Pharmaceutical Research, vol. 18, páginas 54-60, 2001), e Chung et al. (Journal of Controlled Release, Volume 71, páginas 339-350, 2001) descrevem várias formulações de emulsão de óleo em água que são usadas para intensificar a eficiência de transfecção in vitroe in vivo de moléculas de DNA.

Ott et al. (Journal of Controlled Release, volume 79, páginas 1-5, 2002) descreve uma abordagem envolvendo uma emulsão submicron catiônica como um sistema/adjuvante de distribuição para o DNA. A abordagem da emulsão submicron baseia-se em MF59, um esqualeno potente em adjuvante de água que tenha sido fabricado em grande escala e tenha sido usado em um produto comercialmente aprovado (Fluad®). 1,2- dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) foi usado para facilitar a distribuição intracelular de DNA de plasmideo.

Apesar das vacinas baseadas em DNA serem uma grande promessa para a prevenção e tratamento de doenças, preocupações gerais têm sido levantadas quanto à sua segurança. As moléculas de DNA introduzidas poderiam integrar-se potencialmente no genoma do hospedeiro ou, devido à sua distribuição a vários tecidos, poderiam levar a expressão sustentada indesejável de antigenos. Além disso, certos virus de DNA também têm sido usados como um veiculo para distribuir moléculas de DNA. Devido às suas propriedades infecciosas, tais virus atingem uma taxa de transfecção elevada. Os virus usados são geneticamente modificados de modo que nenhuma particula infecciosa funcional é formada na célula transfectada. Apesar destas precauções, no entanto, não é possivel excluir o risco de propagação descontrolada do gene introduzido e dos genes virais, por exemplo, devido a eventos de recombinação em potencial. Isto também implica o risco do DNA ser inserido num gene intacto do genoma da célula hospedeira, por exemplo, recombinação, com a consequência de que este gene pode ser mutado e, portanto, completamente ou parcialmente inativado ou pode dar origem a informações erradas. Em outras palavras, a síntese de um produto de gene que é essencial para a célula pode ser completamente suprimida ou, alternativamente, um produto de gene modificado ou incorreto é expresso. Além disso, é geralmente difícil incrementar a produção e purificação de vetores virais grau clínico.

Um risco particular ocorre se o DNA é integrado em um gene que está envolvido na regulação do crescimento celular. Neste caso, a célula hospedeira pode ser degenerada e levar à formação de tumores ou câncer. Além disso, se o DNA introduzido na célula deve ser expresso, é necessário que o veículo de DNA correspondente contenha um promotor forte, tal como o promotor de CMV viral. A integração de tais promotores no genoma da célula tratada pode resultar em alterações indesejáveis da regulação da expressão do gene na célula. Um outro risco do uso de DNA como um agente para induzir uma resposta imune (por exemplo, como uma vacina) é a indução de anticorpos anti- DNA patogênicos do paciente em quem o DNA estranho foi introduzido, assim provocando uma resposta imune indesej ável.

As moléculas de RNA que codificam um antígeno ou um derivado do mesmo podem também ser usadas como vacinas. As vacinas de RNA oferecem determinadas vantagens em comparação com as vacinas de DNA. Primeiro, o RNA não pode integrar-se no genoma do hospedeiro, assim, abolindo o risco de doenças malignas. Em segundo lugar, devido à rápida degradação do RNA, a expressão do transgene estranho é frequentemente de pouca duração, evitando a expressão de longo prazo não controlada do antigeno. Em terceiro lugar, as moléculas de RNA apenas necessitam ser distribuídas ao citoplasma para expressar o antigeno codificado, ao passo que as moléculas de DNA devem penetrar através da membrana nuclear.

No entanto, em comparação com vacinas baseadas em DNA, atenção relativamente menor tem sido dada às vacinas baseadas em RNA. Os RNAs e oligonucleotídeos são hid ro f i. ! icos, moléculas carregadas negativamente que são altamente suscetíveis à degradação por nucleases, quando administradas como um agente terapêutico ou vacina. Além disso, os RNAs e os oligonucleotídeos não são ativamente transportados para as células. Ver, por exemplo, Vajdy, M., et al., Mucosal adjuvants and delivery systems for protein- , DNA- e RNA- based vaccines, Immunol Cell Biol, 2004. 82 (6) : p. 617-27.

Ying et al. (Nature Medicine, vol. 5, páginas 823-827, 1999) descreve uma vacina de RNA autorreplicante em que o RNA nu que codifica β-galactosidase foi distribuído e a indução de células CD8+ foi relatada.

Montana et al. (Bioconjugate Chem. 2007, 18, páginas 302-308) descreve o uso de nanopartícuias de lipídeos catiônicos sólidas como transportadores de RNA para a transferência de genes. Foi mostrado que as nanopartícuias de lipídeos sólidas protegeram a molécula de RNA da degradação, e a expressão de proteína repórter (fluoresceína) foi detectada após a microinjeção do  complexo de RNA-partícula em ovos de ouriço do mar.

O documento WO 2010/009277 divulga Partículas de Peptídeos Nanolipídicas (NLPPs) que compreendem (a) um peptideo antipático, (b) um lipídeo, e (c) pelo menos uma espécie imunogênicas. Em certas modalidades, os NLPPs também incorporam um "agente de captura" caregada positivamente, tal como um lipídeo catiônico. O agente de captura é usado para ancorar uma espécie imunogênica carregada negativamente (por exemplo, uma molécula de DNA ou uma molécula de RNA) . A preparação de NLPP requer peptídeos antipáticos, que são usados para solubilizar o componente lipídico e formar nanopartículas.

Portanto, existe uma necessidade de fornecer sistemas de distribuição de moléculas de ácidos nucleicos ou outras moléculas carregadas negativamente. Os sistemas de distribuição são úteis .para o ácido nucleico com base em vacinas, em particular vacinas baseadas em RNA.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção geralmente refere-se a emulsões de óleo em água catiônicas que podem ser usadas para distribuir moléculas carregadas negativamente, tais como uma molécula de RNA para as células. As partículas da emulsão compreendem um núcleo oleoso e um lipídeo catiônico. 0 lipídeo catiônico pode interagir com a molécula carregada negativamente, assim, ancorando a molécula para as partículas da emulsão. As emulsões catiônicas aqui descritas são particularmente apropriadas para distribuir moléculas de ácido nucleico (tal como uma molécula de RNA que codifica um antígeno) para células e formular as vacinas à base de ácido nucleico.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso que está em fase líquida, a 25°C, e (b) um lipídeo catiônico. Preferencialmente, a partícula de emulsão de óleo em água catiônica não é uma Partícula de Peptídeo Nanolipídicas (NLPP) . Preferencialmente, o núcleo do óleo está na fase líquida, a 4 °C Opcionalmente, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Opcionalmente, a emulsão é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; preferencialmente cerca de 6,2 a cerca de 6,8, e contém não mais do que 30 mM de inorgânico sal (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a emulsão compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a emulsão isotônica.

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende ainda um surfactante, tal como um surfactante não iônico. Exemplos de surfactantes não iônicos incluem, por exemplo, SPAN85 (trioleato de sorbtiano), Tween 80 (polissorbato 80; monooleato de polioxietileno), ou uma combinação dos mesmos. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,01% a cerca de 2,5% (v/v) de surfactante. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender cerca de 0,08% (v/v) de Tween 80, ou, alternativamente, cerca de 0,5%  (v/v) de Tween 80 e cerca de 0,5% (v/v) SPAN85. Um polietileno glicol (PEG), ou PEG-lipideo, tal como PEG2000PE, PEG5000PE, PEGIQOQDMG, PEG2000DMG, PEG3QQ0DMG, ou uma combinação dos mesmos, pode também ser usado.

A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,005% a cerca de 1,25% (v/v) de surfactante. Por exemplo, a composição compreendendo o complexo de RNA-emulsão pode compreender cerca de 0,04% (v/v) de Tween 80 (polissorbato 80; monooleato de polioxietileno) ou, alternativamente, cerca de 0,25% (v/v) de Tween 80 e cerca de 0,25% (v/v) SPAN85 (trioleato de sorbitano).

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende ainda um fosfolipídeo. Os fosfolipldeos exemplares incluem, 1,2-dioleoil-sn-glicero- 3-fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-diftanoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DPyPE), ou fosfatidilcolina de ovo (PC de ovo). Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml (preferencialmente, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml) DOPE ou, alternativamente, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml (preferencialmente, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml) de DPyPE ou, alternativamente, de cerca de 0, 1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml (preferencialmente, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml) de PC de ovo.

A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 10 mg/ml (preferencialmente, entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml de DOPE) ou, alternativamente, de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 10 mg/ml (preferencialmente, entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml) de DPyPE, ou, alternativamente, de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 10 mg/ml de PC de ovo (preferencialmente, entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml).

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende ainda um polímero ou um surfactante na fase aquosa da emulsão. Exemplos de polímeros incluem poloxâmeros, tais como Pluronic® F127 (copolímero de bloco de óxido de etileno/óxido de propileno: H (OCH2CH2) x (OCH3CH (CH3) ) y (OCH2CH2) zOH) . Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,05% a cerca de 20% (p/v) de polímero, ou de cerca de 0,1% a cerca de 10% (p/v) de polímero, tal como 0,5% (p/v) ou 1% (p/v) de Pluronic® F127. A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de ó-l eo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,025% a cerca de 10% (v/v) de polímero, ou de cerca de 0,5% a cerca de 5% (v/v) polímero, tal como de 0,25% (p/v), ou 0,5% (p/v) de Pluronic® F127.

As emulsões podem compreender componentes que podem promover a formação de partículas, melhorar a complexação entre as moléculas carregadas negativamente e as partículas catiônicas, facilitar descomplexação/liberação apropriada das moléculas carregadas negativamente (tal como uma molécula de RNA), aumentar a estabilidade da molécula carregada negativamente (por exemplo, para evitar a degradação de uma molécula de RNA), ou evitar a agregação das partículas da emulsão.

Em certas modalidades, o núcleo oleoso pode compreender um óleo que é selecionado a partir do seguinte: óleo de ricino, óleo de coco, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de primula, óleo de peixe, óleo de jojoba, óleo de banha de porco, óleo de linhaça, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de cártamo, óleo de sésamo, óleo de soja, esqualeno, óleo de. girassol, óleo de gérmen de trigo, óleo mineral, ou uma combinação dos mesmos. Preferencialmente, o óleo é o óleo de soja, óleo de girassol, óleo de oliva, esqualeno, ou uma combinação dos mesmos. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,2% a cerca de 20% (v/v) de óleo, preferencialmente, cerca de 0,08% a cerca de 5% de óleo de, cerca de 0,08% de óleo, cerca de 4% a cerca de 5% de óleo, cerca de 4% de óleo, cerca de 4,3% de óleo, ou cerca de 5% de óleo. A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,1% e cerca de 10% (v/v) de óleo, preferencialmente, de cerca de 2% a cerca de 2,5% (v/v) de óleo.

Em certas modalidades, o lipideo catiônico é selecionado a partir de um dos seguintes: 1,2-dioleoiloxi- 3-(trimetilamônio) propano (DOTAP), 3β-[N-(N',N/'- Dimetilaminoetano)-carbamoil]Colesterol (Colesterol DC), dimetildioctadecilamônio (DDA), 1,2-dimiristoil-3-Trimetil- Amônio-Propano (DMTAP), dipalmitoil (Ci6:o) trimetil amónio propano (DPTAP), distearoil-trimetil-amônio propano (DSTAP), Lipideo E0001-E0118 ou E0119-E0180 como descrito na Tabe-la 6 (páginas 112-139) do WO 2011/076807 (aqui incorporado por referência), ou uma combinação dos mesmos.

Os lipídeos catiônicos particularmente preferidos incluem DOTAP, Colesterol DC, e DDA.

Em certas modalidades, o lipídeo catiônico é selecionado a partir de um dos seguintes: 1,2-dioleoiloxi- 3-(trimetilamônio)propano (DOTAP), 3β-[N-(N',N'- Dimetilaminoetano)-carbamoil]Colesterol (Colesterol DC), dimetildioctadecilamônio (DDA), 1,2-dimiristoil-3-Trimetil- Amônio-Propano (DMTAP), dipalmitoil (Ci6:o) trimetil amónio propano (DPTAP), distearoil-trimetil-amônio propano (DSTAP), Lipídeo E0001-E0118 ou E0119-E0180 como descrito na Tabela 6 (páginas 112-139) do WO 2011/076807 (aqui incorporado por referência), Cloreto de N-[l-(2,3- dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), cloreto de N, N-dioleoil-N,N-dimetilamônio (DODAC), 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), 1,2-dioleoil-3-dimetil- amônio-propano (DODAP), 1,2-dilinoleilóxi-3- dimetilaminopropano (DLinDMA), ou uma combinação dos mesmos. Os lipídeos catiônicos particularmente preferidos incluem DOTAP, Colesterol DC, DDA, DOTMA, DOEPC, DSTAP, DODAC, DODAP e DLinDMA.

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, preferencialmente, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml de DOTAP.

A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml, preferencialmente, de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml de DOTAP. Opcionalmente, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de β,0 a cerca de 8,0, e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl) . Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,62 mg/ml a cerca de 4,92 mg/ml de colesterol DC.

A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma particula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,31 mg/ml a cerca de 2,46 mg/ml de colesterol DC. Opcionalmente, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; preferencialmente, cerca de 6,2 a cerca de 6,8, e contém não meais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,73 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml de DDA.

A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,365 mg/ml a cerca de 0,725 mg/ml de DDA. Opcionalmente, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um. pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; preferencialmente, cerca de 6,2 a cerca de 6,8, e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, preferencialmente, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml de DOTMA.

A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml, preferencialmente, de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml de DOTMA. Opcionalmente, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; preferencialmente, cerca de 6,2 a cerca de 6,8, e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, preferencialmente, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml de DOEPC.

A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml, preferencialmente, de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 0,9 mg/ml de DOEPC. Opcionalmente, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; pref erencialmente, cerca de 6,2 a cerca de 6,8, e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quan1.'idade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,73 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml de DODAC.

A composição que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,365 mg/ml a cerca de 0,725 mg/ml de DODAC. Opcionalmente, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; preferencialmente, cerca de 6,2 a cerca de 6,8, e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em um exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a emulsão de óleo em água catiônica compreende (a) cerca de 0,5% v/v (de óleo), e (b) um lipideo catiônico.

Em um exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a composição compreende (a) cerca de 0,25% (v/v) de óleo, e (b) um lipideo catiônico.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso, (b) um lipideo catiônico e, (c) um fosfolipideo. Os fosfclipideos preferidos incluem, por exemplo, DPyPE, DOPE, e PC de ovo. Preferencialmentefa composição (com complexo de emulsão-molécula carregada negativamente) compreende de cerca de 0,05 'mg/ml a cerca de 10 mg/ml (mais preferencialmente, entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml) de DOPE, ou, alternativamente, de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 10 mg/ml (mais preferencialmente, entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml) de DPyPE, ou, alternativamente, de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 10 mg/ml (mais preferencialmente, entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 5 mg/ml de PC de ovo).

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) DOTAP, e em que a emulsão de óleo em água compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 3,0 mg/ml de DOTAP, preferencialmente, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml de DOTAP. Em algumas modalidades, a molécula carregada negativamente é RNA, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é, pelo menos, 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl) . Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) DOTAP, e em que a composição compreende entre cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml de DOTAP, tal como 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, etc.. Em algumas modalidades, a molécula carregada negativamente é RNA, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; preferencialmente, cerca de 6,2 a cerca de 6,8, e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) Colesterol DC, e em que a emulsão de óleo em água compreende de cerca de 2,4 6 mg/ml a cerca de 4,92 mg/ml de colesterol DC. Em algumas modalidades, a molécula carregada negativamente é RNA, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é, pelo menos, 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0; preferencialmente, cerca de 6,2 a cerca de 6,8, e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) Colesterol DC, e em que a composição compreende de cerca de 1,23 mg/ml a cerca de 2,46 mg/ml de colesterol DC, tal como 1,23 mg/ml. Em algumas modalidades, a molécula carregada negativamente é RNA, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é, pelo menos, 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, preferencialmente, cerca de 6,2 e cerca de 6,8; e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) DDA, e em que a emulsão de óleo em água compreende de cerca de 0,73 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml de DDA. Em alguns modalidades, a molécula carregada nega t .ivamente é RNA, o diâmetro médio das particulas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é, pelo menos, 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, preferencialmente, cerca de 6,2 e cerca de 6,8; e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma particula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a particula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) DDA, e em que a composição compreende de cerca de 0,365 mg/ml a cerca de 0, 725 mg/ml de DDA, tal como 0,725 mg/ml. Em algumas modalidades, a molécula carregada negativamente é RNA, o diâmetro médio das particulas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é, pelo menos, 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, preferencialmente, cerca de 6,2 e cerca de 6,8; e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) DOTMA, e em que a composição compreende entre cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml, preferencialmente, de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml de DOTMA. Em algumas modalidades, a molécula carregada negativamente é RNA, o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é, pelo menos, 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, preferencialmente, cerca de 6,2 e cerca de 6,8; e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) DOEPC, e em que a composição compreende entre cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml, preferencialmente, de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 0,9 mg/ml de DOEPC. Em algumas modalidades, a molécula carregada negativamente é RNA, o diâmetro médio das particulas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é, pelo menos, 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, preferencialmente, cerca de 6,2 e cerca de 6,8; e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em / uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Em outro exemplo, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma particula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a particula compreende (a) um núcleo oleoso e (b) DODAC, e em que a composição compreende de cerca de 0,365 mg/ml a cerca de 0,725 mg/ml de DODAC. Em algumas modalidades, a molécula carregada negativamente é RNA, o diâmetro médio das particulas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é, pelo menos, 4:1. Opcionalmente, a composição é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, preferencialmente, cerca de 6,2 e cerca de 6,8; e concern não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl). Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a composição isotônica.

Exemplos de moléculas carregadas negativamente incluem antigenos contendo peptideos carregados negativamente, as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA), que codificam um ou mais antigenos contendo peptideos, moléculas pequenas carregadas negativamente e adjuvantes imunológicos carregados negativamente. Os adjuvantes imunológicos carregados negativamente incluem, por exemplo, os oligonucleotideos imunoestimulantes (por exemplo, oligonucleotideos CpG), RNA de fita única, potenciadores imunes de pequenas moléculas (SMIPs), etc.. As moléculas pequenas carregadas negativamente incluem, por exemplo, fosfonato, fluorofosfonato, etc..

Em certas modalidades, a molécula carregada negativamente é uma molécula de ácido nucleico, tal como uma molécula de RNA, que codifica um antigeno. Em certas modalidades, a molécula de RNA é uma molécula de RNA autorreplicante, tal como um replicon de RNA derivado de alfavirus.

Ern outro aspecto, a invenção fornece emulsão de óleo em água catiônica imunogênica compreendendo partículas de emulsão que contêm um núcleo oleoso (preferencialmente, que se encontra em fase liquida, a 25°C) e um lipideo catiônico e uma molécula de ácido nucleico que é complexada com as partículas da emulsão, e em que o diâmetro médio das partículas da emulsão é de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm e o N/P da emulsão é pelo menos 4:1. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico é um RNA, tal como RNA  autor rep .1 lean Le. Preferencialmente, a emulsão de óleo em água catiônica imunogênica é tamponada (por exemplo, com um tampão de citrato, um tampão de succinato, tampão de acetato, etc.) e tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, 5 preferencialmente, cerca de 6,2 e cerca de 6,8; e contém não mais do que 30 mM de sal inorgânico (por exemplo, NaCl) . Preferencialmente, a emulsão de óleo em água catiônica imunogênica compreende adicionalmente um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar, um álcool de 10 açúcar ou combinação dos mesmos, em uma quantidade suficiente para tornar a emulsão isotônica.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de preparação de uma composição que compreende uma molécula carregada negativamente complexada com uma particula de uma 15 emulsão de óleo em água catiônica, que compreende: (A) preparar uma emulsão de óleo em água catiônica em que a emulsão compreende: (1) de cerca de 0,2% a cerca de 20% (v/v) de óleo, (2) de cerca de 0,01 a cerca de 2,5% (v/v) de surfactante, e (3) um lipídeo catiônico que é 20 selecionado a partir do grupo consistindo em: (i) de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml de DOTAP, (ii) de cerca de 2,4 6 mg/ml a cerca de 4,92 mg/ml de colesterol DC, e (iii) de cerca de 0,73 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml de DDA, e (B) adicionar a molécula carregada negativamente para a 25 emulsão de óleo em água catiônica de modo que a molécula carregada negativamente complexa com a partícula da emulsão.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de preparação de uma composição que compreende uma molécula 30 carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, que compreende: (A) preparar uma emulsão de óleo em água catiônica em que a emulsão compreende: (1) de cerca de 0,2% a cerca de 20% (v/v) de óleo (2), de cerca de 0,01% a cerca de 2,5% (v/v)de surfactante, e (3) um lipideo catiônico que é selecionado a partir do grupo consistindo em: (i) de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml de DOTAP, (ii) de cerca de 2,46 mg/ml a cerca de 4,92 mg/ml de colesterol DC, (iii) de cerca de 0,73 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml de DDA, (iv) de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml de DOTMA, (v) de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml de DOEPC, e (vi) de cerca de 0,73 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml de DODAC, e (B) adicionar a molécula carregada negativamente para a emulsão de óleo em água catiônica de modo que a molécula carregada negativamente complexa com a particula da emulsão.

Em certas modalidades, a emulsão de óleo em água catiônica é preparada pelo processo que compreende: (1) combinar o óleo e o lipideo catiônico para formar a fase oleosa da emulsão; (2) fornecer a fase aquosa (isto é, a fase continua) da emulsão; e (3) dispersar a fase oleosa na fase aquosa por homogeneização. O lipideo catiônico pode ser dissolvido diretamente no óleo. Alternativamente, o lipideo catiônico pode ser dissolvido em qualquer solvente apropriado, tal como o clorofórmio (CHC13) ou diclorometano (DCM). Álcool isopropilico pode também ser usado. O solvente pode ser evaporado antes da fase oleosa ser adicionada à fase aquosa, ou após a fase oleosa ser adicionada à fase aquosa, mas antes da homogeneização. Alternativamente, nos casos em que a solubilidade lipidica pode ser um problema, uma emulsão primária pode ser feita com o solvente (por exemplo, DCM), ainda na fase oleosa. Nesse caso, o solvente seria evaporado diretamente a partir da emulsão, antes de uma homogeneização secundária.

Outras etapas opcionais para promover a formação de partículas, para melhorar a complexação entre as moléculas carregadas negativamente e as partículas catiônicas, para aumentar a estabilidade da molécula carregada negativamente (por exemplo, para evitar a degradação de uma molécula de RNA) , para facilitar a descomplexação/liberação apropriada das moléculas carregadas negativamente (tal como uma molécula de RNA), ou para evitar a agregação das partículas da emulsão podem ser incluídas. Por exemplo, um polímero (por exemplo, Pluronic® F127) ou um surfactante pode ser adicionado à fase aquosa da emulsão. Em uma modalidade exemplar, o Pluronic® F127 é adicionado à molécula de RNA antes da complexação com as partículas da emulsão. A adição de Pluronic® F127 pode aumentar a estabilidade da molécula de RNA e reduzir ainda mais a degradação do RNA. Os polímeros de poloxâmero podem também promover a liberação da molécula de RNA e evitar a agregação das partículas da emulsão. Finalmente, os polímeros de poloxâmero têm também efeito imunomodulador. Veja-se, por exemplo, Westerink et al. Vaccine,. Dez. 2001 12;20(5-6): 711-23.

Preferencialmente, a molécula de RNA do complexo partícula catiônica-RNA é mais resistente à degradação de RNase em comparação com molécula de RNA não complexada.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, tal como aqui descrito, e pode compreender ainda um ou mais carreadores, diluentes, ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em modalidades preferidas, a composição farmacêutica é uma vacina.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para gerar uma resposta imune em um sujeito, compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma composição tal como aqui descrito.

A invenção também se refere a uma composição farmacêutica tal como aqui descrita para uso em terapia, e o uso de uma composição farmacêutica tal como aqui descrita para a fabricação de um medicamento para potencializar ou gerar uma resposta imune.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a estabilidade do RNA do timo de camundongo na presença de RNase após a molécula de RNA ter sido complexada com particulas de nanoemulsão catiônicas (CNE). Todas as amostras foram incubadas com a RNase durante 30 minutos. RNase foi inativado com proteinase K. As amos iras que foram formuladas com CNEs foram descomplexadas e analisadas para a integridade do RNA por desnaturação em eletroforese em gel. A pista não marcada contém marcadores de peso molecular. As pistas 1 e 2: RNA do timo de camundongo antes (1) e depois (2) da digestão com RNase; pistas 3 e 4: RNA do timo de camundongo complexado corn CNE01 com uma razão de N/P de 10:1 antes (3) e depois (4) da digestão com RNase; pistas 5 e 6: RNA do timo de camundongo complexado com CNE01 com uma razão de N/P de 4:1 antes (5) e depois (6) da digestão com RNase; pistas 7 e 8: RNA do timo de camundongo complexado com um CNE17 a uma razão de N/P de 10:1, antes (7) e depois (8) da digestão com RNase; pista 9: RNA do timo de camundongo complexado com CNE17 a uma razão de N/P de 4:1, antes (9) da digestão com RNase.

A Figura 2 mostra a estabilidade do RNA do timo de camundongo na presença de RNase após a molécula de RNA ser complexada com particulas de CNE. Todas as amostras foram incubadas com a RNase durante 30 minutos. RNase foi inativada com proteinase K. As amostras que foram formuladas com CNEs foram descomplexadas e analisadas para a integridade do RNA por desnaturação em eletroforese em gel. A pista não marcada contém marcadores de peso molecular. Pista 10: RNA do timo de camundongo complexado com CNE17 com uma razão de N/P de 4:1 depois (10) da digestão com RNase; pistas 11 e 12: RNA do timo de camundongo antes (11) e depois (12) da digestão com RNase; pistas 13 e 14: RNA do timo de camundongo complexado com CNE 12 com uma razão de N/P de 10:1 antes (13) e depois (14) da digestão com RNase; pistas 15 e 16: RNA do timo de camundongo complexado com CNE12 com uma razão de N/P de 4:1 antes (15) e depois de (16) da digestão com RNase; pistas 17 e 18: RNA do timo de camundongo complexado com CNE13 com uma razão de N/P de 10:1 antes (17) e depois (18) da digestão com RNase; pistas 19 e 20: RNA do timo de camundongo complexado com CNE13 com uma razão de N/P de 4:1 antes (19) e depois (20) da digestão com RNase.

A Figura 3 mostra a estabilidade do RNA do timo de camundongo na presença de RNase após a molécula de RNA ser complexada com particulas de CNE. Todas as amostras foram incubadas com a RNase durante 30 minutos. RNase foi inativada com proteinase K. As amostras que foram formuladas com CNEs foram descomplexadas e analisadas para a integridade do RNA por desnaturação em eletroforese em gel. A pista não marcada contém marcadores de peso molecular. As pistas 1 e 2: RNA do timo de camundongo antes (1) e após (2) a digestão com RNase; as pistas 3 e 4: RNA do timo de camundongo complexado com CNE01 com uma razão de N/P de 10:1, antes (3) e depois (4) da digestão com RNase; pistas 5 e 6: RNA do timo de camundongo complexado com CNE01 com uma razão de N/P de 4:1 antes (5) e depois (6) da digestão com RNase; pistas 7 e 8: RNA do timo de camundongo complexado corn CNE02 a uma razão de N/P de 10:1, antes (7) e depois (8) da digestão com RNase; pista 9: RNA do timo de camundongo complexado com CNE02 com uma razão de N/P de 4:1, antes (9) da digestão com RNase.

A Figura 4 mostra a estabilidade do RNA do timo de camundongo na presença de RNase após a molécula de RNA ser complexada com partículas de CNE. Todas as amostras foram incubadas com a RNase durante 30 minutos. RNase foi inativada com proteinase K e amostras que foram formuladas foram descomplexadas e analisadas para a integridade do RNA por desnaturação em eletroforese em gel. A pista não marcada contém marcadores de peso molecular. As pistas 15 e 16: RNA do timo de camundongo antes (15) e depois (16) da digestão com RNase; pistas 17 e 18: RNA do timo de camundongo complexado com CNE04 com uma razão de N/P de 10:1 antes (17) e depois (18) da digestão com RNase; pistas 19 e 20: RNA do timo de camundongo complexado com CNE04 com uma razão de N/P de 4:1 antes (19) e depois (20) da digestão com RNase; pistas 21 e 22: RNA do timo de camundongo complexado com CNE05 a uma razão de N/P de 10:1 antes (21) e depois (22) da digestão com RNase; pistas 23 e 24: RNA do timo de camundongo complexado com CNE05 com uma razão de N/P de 4:1 antes (23) e depois (24) da digestão com RNase.

A Figura 5 mostra a estabilidade do RNA do timo de camundongo na presença de RNase após a molécula de RNA ser complexada com particulas de CNE. Todas as amostras foram incubadas com a RNase durante 30 minutos. RNase foi inativada com proteinase K e amostras que foram formuladas foram descomplexadas e analisadas para a integridade do RNA por desnaturação em eletroforese em gel. As pistas não marcadas contêm marcadores de peso molecular. As pistas 1 e 2: RNA do timo de camundongo antes (1) e depois (2) da digestão com RNase; pistas 3 e 4: RNA do timo de camundongo complexado com CNE17 com uma razão de N/P de 10:1 antes (3) e depois (4) da digestão com RNase; pistas 5 e 6: RNA do timo de camundongo complexado com CNE17 em uma razão de N/P de 4:1, antes de (5) e depois (6) da digestão com RNase; pistas 7 e 8: com um CNE27 na razão de N/P de 10:1, antes de (7) e depois (8) da digestão com RNase; pistas 9 e 10: RNA do timo de camundongo complexado com CNE27 com uma razão de N/P de 4:1 antes (9) e depois (10) da digestão com RNase; pistas 11 e 12: RNA do timo de camundongo antes (11) e depois (12) da digestão com RNase; pistas 13 e 14: RNA do timo de camundongo complexado com CNE32 com uma razão de N/P de 10:1 antes (13) e depois (14) da digestão com RNase; pistas 15 e 16: RNA do timo de camundongo complexado com CNE32 com uma razão de N/P de 4:1 antes (15) e depois (16) da digestão com RNase.

A Figura 6 mostra a estabilidade do RNA do timo de camundongo na presença de RNase após a molécula de RNA ser complexada com partículas de CNE. Todas as amostras foram incubadas com a RNase durante 30 minutos. RNase foi inativada com proteinase K e amostras que foram formuladas foram descomplexadas e analisadas para a integridade do RNA por desnaturação em eletroforese em gel. As pistas não marcadas contêm marcadores de peso molecular. As pistas 1 e 2: RNA do timo de camundongo antes (1) e depois (2) da digestão com RNase; pistas 3 e 4: RNA do timo de camundongo complexado com CNE35 com uma razão de N/P de 10:1 antes (3) e depois (4) da digestão com RNase; pistas 5 e 6: RNA do timo de camundongo complexado com CNE35 com uma razão de N/P de 4:1, antes (5) e depois (6) da digestão com RNase; pista 7: RNA do timo de camundongo, antes da digestão com RNase.

A Figura 7 mostra a sequência de vetores usados nos exemplos. A Figura 7A mostra a sequência de plasmídeo A317 (SEQ ID NO: 1), que codifica o antígeno de RSV-F. A Figura 7B mostra a sequência de plasmídeo A306 (SEQ ID NO: 2), que codifica fosfatase alcalina da placenta humana secretada (SEAP) . A Figura 70 mostra a sequência de plasmídeo A375 (SEQ ID NO: 3), que codifica um antígeno de RSV-F.

A Figura 8A mostra os resultados do ensaio de SEAP in vivo, usando 1 μg de replicon de RNA A306 complexado com CNE17 a uma razão de N/P de 10:1. A Figura 8B mostra a as titulações de: IgG total em camundongos BALB/c nos pontos de tempo 2wpl e 2wp2 (replicon de RNA A317 complexado com CNE17 foram administrados a camundongos BALB/c).

As Figuras 9A-9C mostram os efeitos de diferentes composições tampões no tamanho da partícula. A Figura 9A mostra os efeitos do açúcar, do sal e do polímero F127 no tamanho da partícula de emulsões de CNE17 com RNA complexado em N/P de 10:1. A Figura 9B mostra o efeito do tampão de citrato no tamanho de partícula da emulsão de CNE17. A Figura 9C mostra o efeito dos polímeros (F68, F127 e PEG300) no tamanho da partícula.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 1. VISÃO GERAL

A presente invenção geralmente refere-se a emulsões de óleo em água catiônicas que podem ser usadas para distribuir moléculas carregadas negativamente, tais como uma molécula de RNA para células. As partículas da emulsão compreendem um núcleo oleoso e um lipídeo catiônico. O lipídeo catiônico pode interagir com a molécula carregada negativamente, por exemplo, através de forças eletrostáticas e interações hidrofóbicas/hidrofílicas, assim ancorando a molécula para as partículas da emulsão. As emulsões catiônicas aqui descritas são particularmente apropriadas para distribuir moléculas de ácido nucleico, tal como uma molécula de RNA (por exemplo, RNA que codifica uma proteína ou peptídeo, pequenos RNAs interferentes, RNA autorreplicante, e similares) para as células in vivo.

A presente invenção é baseada na verificação de que emulsões de óleo em água catiônicas podem ser usadas para distribuir moléculas negativamente carregadas para as células. As partículas da emulsão compreendem um núcleo oleoso e um lipídeo catiônico que pode interagir com a molécula carregada negativamente. Em modalidades preferidas, uma molécula de RNA é complexada, por exemplo, através de forças eletrostáticas e interações hidrofóbicas/hidrofilicas, com uma particula de uma emulsão de óleo em água catiônica. A molécula de RNA complexada é estabilizada e protegida da degradação mediada por RNase, e é mais eficientemente absorvida pelas células em relação ao RNA livres. Além disso, quando o RNA é fornecido para induzir a expressão de uma proteina codificada, tal como, no contexto de uma vacina de RNA, a imunogenicidade da proteina codificada pode ser melhorada devido a efeitos adjuvantes da emulsão. Portanto, além de distribuição mais eficiente de uma molécula carregada negativamente (por exemplo, uma molécula de RNA que codifica um antigeno) , as emulsões catiônicas também podem aumentar a resposta imune através da atividade adjuvante.

Por exemplo, como descrito e exemplificado aqui, os inventores avaliaram os efeitos in vivo de uma série de emulsões de óleo em água catiônicas, usando-se um modelo de camundongo e um modelo de rato do algodão da imunização do virus respiratório sincicial (RSV). Os resultados demonstram que as formulações em que as moléculas de RNA foram complexadas com emulsões catiônicas geraram respostas imunes significativamente maiores em comparação com as formulações livres de RNA. Em alguns casos, as titulações médias de anticorpos contra uma proteina codificada por RNA foram obtidas após a administração de 1 μg de RNA complexado com emulsõão de óleo em água catiônica, foram comparáveis às titulações obtidas usando 10 vezes mais RNA livre (10 μg de dose de RNA livre) . Outra vantagem das formulações como descrito aqui, além do aumento da resposta imune no hospedeiro, é que houve menos flutuação nas respostas imunes nos animais hospedeiros entre os  diferentes estudos e diferentes animais hospedeiros, em comparação com RNA livre (Não formulado).

Assim, em um aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende (a) um núcleo oleoso que está em fase líquida, a 25°C, e (b) um lipídeo catiônico. Preferencialmente, a partícula de emulsão de óleo em água catiônica não é um Partícula de Peptídeo Nanolipídica (NLPP). Preferencialmente, o núcleo oleoso está na fase líquida, a 4 °C

As partículas de emulsão catiônica podem compreender ainda um surfactante (por exemplo, Tween 80 (polissorbato 80; monooleato de polioxietileno), SPAN85 (trioleato de sorbitano), ou uma combinação dos mesmos), um fosfolipídeo, ou uma combinação dos mesmos. A emulsão pode também compreender um polímero (por exemplo, Pluronic® F127) na fase aquosa (fase contínua) da emulsão.

Em outro aspecto, a invenção também fornece várias formulações específicas de emulsões de óleo em água catiônicas que podem ser usadas para distribuir moléculas carregadas negativamente.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de preparação de uma composição que compreende uma molécula carregada negativamente complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica. Uma abordagem exemplar para produzir emulsões catiônicas aqui descritas é através da dispersão da fase oleosa na fase aquosa por homogeneização. Etapas opcionais adicionais para promover a formação de partículas, para aumentar a complexação entre as moléculas carregadas negativamente e as partículas catiônicas, para aumentar a estabilidade da molécula carregada negativamente (por exemplo, para evitar a degradação de uma molécula de RNA), a fim de facilitar a descomplexação/liberação apropriada das moléculas carregadas negativamente (tal como uma molécula de RNA), ou para impedir a agregação das partículas da emulsão incluem, por exemplo, adicionar diclorometano (DCM ou cloreto de meti leno) na fase oleosa, e permitir que o DCM se evapore antes ou depois da homogeneização; misturar o lipídeo catiônico com um solvente adequado para formar uma suspensão de lipossomas; ou adicionar um polímero (por exemplo, Pluronic® F127) ou um surfactante à fase aquosa da emulsão. Alternativamente, o lipídeo catiônico pode ser dissolvido diretamente no óleo.

As emulsões catiônicas desta invenção podem ser usadas para disi.ribuir uma molécula carregada negativamente, tal como um ácido nucleico (por exemplo, RNA) . As composições podem ser administradas a um sujeito com necessidade das mesmas, para gerar ou potencializar uma resposta imune. As composições podem também ser co-distribuídas com uma outra molécula imunogênica, composição ou vacina imunogênica para intendificar a eficácia da resposta imune induzida.

2. DEFINIÇÕES

Tal como usado aqui, as formas singulares "um", "uma" e "o, a" incluem referências plurais a menos que o conteúdo dite claramente de outra forma.

O termo "cerca", tal como usado aqui, refere-se a +/- 10% de um valor.

O termo "surfactante" é um termo da técnica e, geralmente, refere-se a qualquer molécula contendo tanto um grupo hidrofílico (por exemplo, um grupo polar), que energeticamente prefere solvatação por água, quanto um grupo hidrofóbico que não é bem solvatado por água. 0 "surfactante não iônico" é um termo conhecido na técnica e refere-se geralmente a uma molécula de surfactante hidrofilica, cujo grupo (por exemplo, o grupo polar) não é carregado eletrostaticamente.

0 Lermo "polimero" refere-se a uma molécula que consiste em unidades quimicas individuais, que podem ser iguais ou diferentes, que são unidas em conjunto. Como usado aqui, o termo "polimero" refere-se a grupos químicos individuais que estão unidos extremidade-a-extremidade para formar uma molécula linear, bem como grupos químicos individuais unidos na forma de uma estrutura ramificada (por exemplo, um "braço-multi" ou "forma estrela"). Exemplos de polímeros incluem, por exemplo, poloxâmeros. Os poloxâmeros são copolímeros de tribloco não iônicos possuindo uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueada por duas cadeias hidrófilas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)).

Um "tampão" refere-se a uma solução aquosa que resiste a alterações no pH da solução.

Ta.l como usado aqui, "análogo de nucleotídeo" ou "nucleotideo modificado" refere-se a um nucleotídeo que contém uma ou mais modificações químicas (por exemplo, substituições) em, ou sobre a base nitrogenada de nucleosídeo (por exemplo, citosina (C), timina (T) ou uracila (U) , adenina (A) ou guanina (G) ) . Um análogo de nucleotídeo pode conter outras modificações químicas em, ou sobre a fração de açúcar do nucleosideo (por exemplo, ribose, desoxirribose, ribose modificada, desoxirribose modificada, análogo de açúcar de seis membros, ou análogo de açúcar de cadeia aberta), ou o fosfato.

Como usado aqui, "sacarídeo" engloba monossacarídeos, oligossacarídeos ou polissacarídeos, em cadeia linear ou formas de anel, ou uma combinação dos mesmos, para formar uma cadeia de sacarídeo. Oligossacarídeos são sacarídeos possuindo dois ou mais resíduos de monossacarídeos. Exemplos de sacarídeos incluem glicose, maltose, maltotriose, maltotetraose, sacarose e trealose.

Os termos "RNA autorreplicante", "replicon de RNA" ou "vetor de RNA" são termos da técnica e, em geral, referem- se a uma molécula de RNA que é capaz de dirigir sua própria amplificação ou autorreplicação in vivo, tipicamente dentro uma célula alvo. O replicon de RNA é usado diretamente, sem a necessidade de introdução de DNA em uma célula e o transporte para o núcleo, onde a transcrição pode ocorrer. Usando o vetor de RNA para distribuição direta para o citoplasma da célula hospedeira, a replicação e a tradução autônoma da sequência de ácidos nucleicos heteróloga ocorre de forma eficiente. Um RNA autorreplicante derivado de alfavírus pode conter os seguintes elementos em ordem sequencial: sequências virais 5' necessárias em cis para a replicação (também referidas como 5' CSE, na base), as sequências que, quando expressas, codificam proteínas não estruturais de alfavírus biologicamente ativos (por exemplo, nsPl, nsP2, nsP3, nsP4), sequências virais 3' necessárias em cis para a replicação (também referidas por  3' CSE, na base), e um trato de poliadenilato. 0 RNA autorreplicante derivados de alfavirus pode também conter um promotor da "região de junção"subgenômica viral, sequências de um ou mais genes de proteinas estruturais ou porções das mesmas, molécula(s) de ácido nucleico estranho que são de um tamanho suficiente para permitir a produção de partículas de alfavirus recombinantes, bem como de sequências heterólogas serem expressas.

O termo "adjuvante"refere-se a qualquer substância que auxilia ou modifica a ação de um fármaco, incluindo mas não limitados a, adjuvantes imunológicos, que aumentam e/ou diversificam a resposta imune a um antigeno. Assim, adjuvantes imunológicos incluem compostos que são capazes de potencializar uma resposta imune a antigenos. Adjuvantes imunológicos podem potencializar a imunidade humoral e/ou celular. As substâncias que estimulam uma resposta imune inata são incluídas dentro da definição de adjuvantes imunológicos deste documento. Adjuvantes imunológicos podem também ser referidos como "imunopotenciadores".

Tal como usado aqui, um "antigeno" ou "imunogene"refere-se a uma molécula que contém um ou mais epitopos (por exemplo, lineares, conformacionais, ou ambos), que provocam uma resposta imune. Como usado aqui, um "epitopo" é a parte da dada espécie (por exemplo, uma molécula antigênica ou complexo antigênico), que determina a sua especificidade imunológica. Um epitopo está dentro do escopo da presente definição de antigeno. O termo "antigeno" ou "imunogene", como usado aqui, inclui antigenos de subunidade, ou seja, antigenos que são separados e discretos a partir de um organismo completo com o qual o antigeno está associado na natureza. Anticorpos, tais como anticorpos anti-idiotipos, ou seus fragmentos, e mimotopos de peptideos sintéticos, que podem mimetizar um determinante antigênico ou de antigeno, também são capturados sob a definição de antigeno tal como usado aqui.

Uma "resposta imunológica" ou "resposta imune" é o desenvolvimento em um sujeito de uma resposta imune celular e/ou humoral para um antigeno ou um adjuvante imunológico.

As respostas imunes incluem respostas imunes inatas e adaptativas. Respostas imunes inatas são respostas de ação rápida que fornecem uma primeira linha de defesa para o sistema imune. Em contraste, a imunidade adaptativa utiliza seleção e expansão clonal de células imunes tendo genes de receptores somaticamente rearranjados (por exemplo, receptores de células T- e B-) que reconhecem antigenos de um dado patógeno ou distúrbio (por exemplo, um tumor), fornecendo, assim, a especificidade e memória imunológica. As respostas imunes inatas, entre os seus vários efeitos, levam a uma ruptura rápida de citocinas inflamatórias e à ativação de células apresentadoras de antigenos (APCs) tais como macrófagos e células dendriticas. Para distinguir patógenos de autocomponentes, o sistema imune inato usa uma variedade de receptores relativamente invariáveis que detectam assinaturas de patógenos, conhecidas como padrões moleculares associados a patógeno ou PAMPs. A adição de componentes microbianos para vacinas experimentais é conhecida por levar ao desenvolvimento de respostas imunes adaptativas duráveis e robustas. O mecanismo subjacente a esta potencialização das respostas imunes tem sido relatado como envolvendo receptores padrões de reconhecimento  (PRRs), que são expressos diferencialmente em uma variedade de células do sistema imune, incluindo neutrófilos, macrófagos, células dendriticas, células assassinas naturais, células B e algumas células não imunes, tais como células epiteliais e endoteliais. O envolvimento de PRRs conduz à ativação de algumas dessas células e a sua secreção de citocinas e quimiocinas, bem como à maturação e migração de outras células. Em paralelo, isso cria um ambience inflamatório que leva ao estabelecimento da resposta imune adaptativa. Os PRRs incluem receptores não fagociticos, tais como receptores semelhantes a Toll (TLRs) e proteinas do dominio de oligomerização de ligação de nucleotideos (NOD) , e receptores que induzem a fagocitose, tais como os receptores sequestrantes, receptores de manose e receptores β-glucano. Os TLRs relatados (juntamente com alguns exemplos de ligantes relatados, os quais podem ser usados como molécula imunogênica em várias modalidades da invenção) incluem o seguinte: TLR1 (lipoproteinas bacterianas de Mycobacteria, Neisseria), TLR2 (particulas de levedura zimosan, peptidoglicano, lipoproteinas, lipopeptideos, glicolipideos, lipopolissacarideo), TLR3 (RNA virais de fita dupla, poli:IC), TLR4 (lipopolissacarideos bacterianos, produto de planta taxol), TLR5 (M agel. inas bacterianas), TLR6 (particulas de levedura zimosana, ácido lipotecóico, lipopeptideos de micoplasma), TLR7 (RNA de fita única, imiquimod, resimiquimod, e outros compostos sintéticos, tais como loxoribina e bropirimina), TLR8 (RNA de fita única, resimiquimod) e TLR9 (oligonucleotideos CpG), entre outros. As células dendriticas são reconhecidas como alguns dos tipos de células mais Importantes para o começo da iniciação de T CD4+ auxiliares naive (TR) e para induzir as células T CD8+ à diferenciação em células assassinas. A sinalização de TLR tem sido relatada como desempenhando um papel importante na determinação da qualidade destas respostas de células T auxiliares, por exemplo, com a natureza do sinal de TLR que determina o tipo especifico de resposta de TR que é observada (por exemplo, resposta de TH1 contra TH2) . Uma combinação de anticorpos (humoral) e imunidade celular é produzida como parte de uma resposta de tipo TH1, enquanto que uma resposta do tipo TH2 é predominantemente uma resposta de anticorpos. Diversos ligantes de TLR, tais como CpG DNA (TLR9) e imidazoquinolinas (TLR7, TLR8) foram documentadas como estimulando a produção de citocinas a partir de células imunes in vitro.As imidazoquinolinas são os primeiros compostos semelhantes a drogas pequenas mostrados como sendo agonistas de TLR. Para mais informações, ver, por exemplo, A. Pashine, N.M. Valiante e J.B. Ulmer, Nature Medicine 11, S63-S68 (2005), K.S. Rosenthal e D.H. Zimmerman, Clinical and Vccine Immunology, 13(8), 821-829 (2006), e as referências ai citadas.

Para os fins da presente invenção, uma resposta imune humoral refere-se a uma resposta imune mediada por moléculas de anticorpos, enquanto que uma resposta imune celular é uma resposta mediada por linfócitos T e/ou outros glóbulos brancos. Um aspecto importante da imunidade celular envolve uma resposta especifica de antigeno por células T citoliticas (CTLs). As CTLs possuem especificidade para antigenos peptidicos que são apresentados em associação com proteinas codificadas pelo complexo de histocompatibilidade principal (MHC) e expressos na superfície celular. As CTLs ajudam a induzir e promover a destruição intracelular dos micro-organismos intracelulares, ou a lise de células infectadas com tais micro-organismos. Outro aspecto da imunidade celular envolve uma resposta especifica de antígeno por células t auxiliares. As células T auxiliares agem para ajudar a estimular a função, e concentrar a atividade de células efetoras não specíficas contra as células que apresentam antigenos de peptídeos em associação com moléculas de MHC em sua superfície. Uma "resposta imune celular" também se refere à produção de citocinas, quimiocinas e outras dessas moléculas produzidas por células T ativadas e/ou outras células brancas do sangue, incluindo as derivadas de células de células-T CD4+ e CD8+.

Uma composição tal como uma composição imunogênica ou vacina que provoca uma resposta imune celular pode, assim, servir para sensibilizar um sujeito vertebrado através da apresentação de antígeno em associação com moléculas MHC na superfície celular. A resposta imune mediada por células é dirigida a, ou próxima a, células apresentadoras de antígeno na sua superfície. Além disso, os linfócitos T específicos de antigenos podem ser gerados para permitir a futura proteção de um hospedeiro imunizado. A capacidade de um antígeno ou composição determinada para estimular uma resposta imune mediada por células pode ser determinada por uma série de ensaios conhecidos na técnica, tais como por ensaios de linfoproliferação (ativação de linfócitos), ensaios de células citotóxicas de CTL, por ensaio para linfócitos T específico para o antígeno em um sujeito sensibilizado, ou por medição da produção de citocinas pelas células T em resposta a re-estimulação com antigeno. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Erickson et al. (1993) J. Immunol 151:4189-4199; Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol 24:2369-2376. Assim, uma resposta imune, tal como usado aqui pode ser uma que estimula a produção de CTLs e/ou a produção ou ativação de células-T auxiliares. O antigeno de interesse pode também provocar uma resposta imune mediada por anticorpos. Assim, uma resposta imune pode incluir, por exemplo, um ou mais dos seguintes efeitos, entre outros: a produção de anticorpos, por exemplo, por células-B; e/ou a ativação de células-T supressoras e/ou células-T yδ dirigidas especificamente a um antigeno ou antigenos presentes na composição ou vacina de interesse. Estas respostas podem servir, por exemplo, para neutralizar a infectividade e/ou mediar o anticorpo-complemento, ou a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) para fornecer proteção a um hospedeiro imunizado. Tais respostas podem ser determinadas usando imunoensaios padrões e ensaios de neutralização, bem conhecidos na técnica.

As composições de acordo com a presente invenção apresentam "imunogenicidade intensifiçada" para um dado antigeno, já que elas possuem uma maior capacidade para provocar uma resposta imune do que a resposta imune provocada por uma quantidade equivalente do antigeno em uma composição diferente (por exemplo, em que o antigeno é administrado como uma proteina solúvel). Assim, a composição pode apresentar imunogenicidade intensificada, por exemplo, devido a composição gerar uma resposta imune mais forte, ou devido a uma dose mais baixa ou doses menores do antigeno serem necessárias para atingir uma resposta imune no sujeito ao qual a mesma é administrada. Tal imunogenicidade intensificada pode ser determinada, por exemplo, através da administração de uma composição da invenção e um antigeno de controle para animais e comparação dos resultados do ensaio dos dois.

3. EMULSÕES DE ÓLEO EM ÁGUA CATIÔNICAS

As emulsões de óleo em água catiônicas descritas aqui são geralmente descritas na maneira que é convencional na técnica, por concentrações de componentes que são usadas para preparar as emulsões. Entende-se na técnica que durante o processo de produção de emulsões, incluindo a esterilização e outros processos a jusante, pequenas quantidades de óleo (por exemplo, esqualeno) , de lipideo catiônico (por exemplo, DOTAP), ou de outros componentes, podem ser perdidas, e as concentrações reais de um destes componentes no produto final (por exemplo, uma emulsão esterilizada embalada, que está pronta para administração) pode ser ligeiramente menor do que as quantidades de partida, por vezes de cerca de 10%, ou de cerca de 20%.

A presente invenção geralmente refere-se a emulsões de óleo em água catiônicas que podem ser usadas para distribuir moléculas carregadas negativamente, tais como uma molécula de RNA. As partículas da emulsão compreendem um núcleo oleoso e um lipideo catiônico. 0 lipideo catiônico pode interagir com a molécula carregada negat .i varnente, por exemplo, através de forças eletrostáticas e interações hidrofóbicas/hidrofilicas, assim ancorando a molécula para as partículas da emulsão.

As emulsões catiônicas aqui descritas são particularmente apropriadas para a distribuição de uma molécula carregada negativamente, tal como uma molécula de RNA que codifica um antigeno ou pequeno RNA de interferência para as células in vivo. Por exemplo, as emulsões catiônicas descritas aqui fornecem vantagens para a distribuição de RNA que codifica antigenos, incluindo RNAs autorreplicantes, como vacinas.

As partículas das emulsões de óleo em água se assemelham a uma micela com um núcleo central de óleo. 0 núcleo é revestido de óleo com o lipideo catiônico, o qual dispersa a gota de óleo na fase aquosa (continua) como gotas tipo micelas. Um ou mais componentes opcionais podem estar presentes na emulsão, tais como surfactantes e/ou fosfolipideos, como descrito abaixo. Por exemplo, um ou mais surfactantes podem ser usados para promover a formação de partículas e/ou estabilizar as partículas da emulsão. Neste caso, o núcleo oleoso é revestido com o lipideo catiônico bem como o(s) surfactante (s) de modo a formar micelas tipo gotas. Do mesmo modo, um ou mais lipideos (por exemplo, lipideos neutros, glicol-lipideos ou fosfolipideos) podem também estar presentes na superfície das partículas da emulsão, se tais lipídeos são usados como ernul si onan t es para dispersar as goticulas de óleo.

As paruiculas de emulsões de óleo em água têm um diâmetro médio (isto é, o diâmetro médio numérico), de 1 micron ou menos. É particularmente desejável que o tamanho médio das partículas (isto é, o diâmetro médio numérico) das emulsões catiônicas seja de cerca de 900 nm ou menos, cerca de 800 nm ou menos, cerca de 700 nm ou menos, cerca de 600 nm ou menos, cerca de 500 nm ou menos, cerca de 400  nm ou menos, 300 nm ou menos, ou 200 nm ou menos, por exemplo, de cerca de 1 nm a cerca de 1 μm, de cerca de 1 nm a cerca de 900 nm, de cerca 1 nm a cerca de 800 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 700 nm, de cerca de 1 nm a cerca 5 de 600 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 500 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 400 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 300 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 175 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 125 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 1 nm a cerca de 75 nm, ou entre cerca de 1 nm a cerca de 50 nm.

É particularmente desejável que o diâmetro médio de particula das emulsões catiônicas seja de cerca de 180 nm ou menos, cerca de 170 nm ou menos, cerca de 160 nm ou 15 menos, cerca de 150 nm ou menos, cerca de 140 nm ou menos, cerca de. 3.30 nm ou menos, cerca de 120 nm ou menos, a cerca de 110 nm ou menos, ou cerca de 100 nm ou menos, por exemplo, de cerca de 8 0 nm a 18 0 nm, de cerca de 80 nm a 170 nm, de cerca de 80 nm a 160 nm, de cerca de 80 nm a 150 20 nm, de cerca de 80 nm a 140 nm, de cerca de 80 nm a 130 nm, de cerca de 80 nm a 120 nm, de cerca de 80 nm e 110 nm, ou de cerca de 80 nm a 100 nm. Particularmente o diâmetro médio da particula é cerca de 100 nm.

O tamanho das particulas da emulsão pode ser variado 25 mudando-se a razão de surfactante para óleo (o aumento da razão diminui o tamanho das gotas), operando a pressão de homogeneização (o aumento da pressão operacional da homogeneização tipicamente reduz o tamanho das gotas), temperatura (o aumento da temperatura diminui o tamanho das 30 gotas), a alteração do tipo de óleo, e outros parâmetros do processo, como descrito em detalhe abaixo. A inclusão de certos tipos de tampões na fase aquosa pode também afetar o tamanho da partícula.

Em alguns casos, no contexto de uma vacina de RNA, o tamanho das partículas da emulsão pode afetar a imunogenicidade do complexo de emulsão-RNA. Portanto, a faixa preferida de tamanho médio de partícula de emulsões deve ser de cerca de 80 nm a cerca de 180 nm de diâmetro.

As partículas de emulsões descritas aqui podem ser complexadas com uma molécula carregada negativamente. Antes da cornplexação com a molécula carregada negativamente, a carga líquida global das partículas (tipicamente medida como potencial-zeta) deve ser positiva (catiônica). A carga líquida global das partículas pode variar, dependendo do tipo do lipídeo catiônico e da quantidade de lipídeo catiônico na emulsão, da quantidade de óleo na emulsão (por exemplo, a porcentagem mais elevada de óleo normalmente resulta em menos carga na superfície das partículas), e também pode ser afetada por qualquer componente adicional (por exemplo, surfactante(s) e/ou fosfolipídeos(s) ) que está presente na emulsão. Nas modalidades exemplares, o potencial zeta, das partículas de pré-complexação são tipicamente superiores a 10 mV.

Preferencialmente, o potencial-zeta, das partículas de pré-comp l.exação são não mais do que cerca de 50 mV, não mais do que cerca de 45 mV, não mais do que cerca de 40 mV, não mais do que cerca de 35 mV, não mais do que cerca de 30 mV, não mais do que cerca de 25 mV, não mais do que cerca de 20 mV, de cerca de 5 mV a cerca de 50 mV, de cerca de 10 mV a cerca de 50 mV, de cerca de 10 mV a cerca de 45 mV, de  cerca de 10 mV a cerca de 40 mV, de cerca de 10 mV a cerca de 35 mV, de cerca de 10 mV a cerca de 30 mV, de cerca de 10 mV a cerca de 2 5 mV, mV ou de cerca de 10 a cerca de 2 0 mV. O potencial-zeta pode ser afetado por (i) pH da emulsão, (ii) condutividade da emulsão (por exemplo, salinidade), e (iii) concentração dos vários componentes da emulsão (polimero, surfactantes não iônicos, etc.). O potencial-zeta de CNEs é medido usando um Malvern Nanoseries Zetasizer (Westborough, MA). A amostra é diluida a 1:100 em água (viscosidade: 0,8872cp RI: 1,330, constante die 1étrica: 78,5) e adiciona-se a uma célula capilar de látex de poliestireno (Malvern, Westborough, MA) . 0 potencial zeta é medido a 25 °C com urn tempo de equilibrio de 2 minutos e analisado usando o modelo de Smoluchowski (valor F(Ka) = 1,5). Os dados são referidos em mV.

Uma emulsão catiônica exemplar da presente invenção é CNE17. O núcleo oleoso de esqualeno é CNE17 (em 4,3% p/v) e o lipideo catiônico é DOTAP (a 1,4 mg/ml). CNE17 também inclui os surfactantes SPAN85 ((trioleato de sorbitano) a 0,5% v/v) e Tween 80 ( (polissorbato 80; monooleato de polioxíetíleno) a 0,5% v/v). Assim, as partículas de CNE17 compreendem um núcleo de esqualeno revestido com SPAN85, TweenSO, e DOTAP. As moléculas de RNA mostraram para complexar com partículas de CNE17 eficientemente a uma razão de N/P de 4:1 e uma razão de N/P de 10:1. Outros exemplos de emulsões catiônicas incluem, por exemplo, CNE05 (0,5% p/v de esqualeno, 0,08% de Tween 80, e 1,2 mg/ml de DOTAP) , CNIO2 (4,3% de esqualeno, 0,5% de SPAN85, 0,5% de Tween 80, e 2,46 mg/mL de colesterol DC), CNE13 (4,3 % de esqualeno, 0,5% de SPAN85, 0,5% de Tween 80, e 1,45 mg/ml  de DDA), e outras emulsões aqui descritas.

Os componentes individuais das emulsões de óleo em água da presente invenção são conhecidos na técnica, embora tais composições não sejam combinadas na forma aqui descri La. Por conseguinte, os componentes individuais, embora descritos abaixo, globalmente e em algum detalhe para as modalidades preferidas, são bem conhecidos na técnica, e os termos aqui usados, como o núcleo do óleo, surfactante, fosfolipideos, etc., são suficientemente bem conhecidos um versado na técnica sem descrição adicional. Além disso, embora as faixas preferidas da quantidade dos componentes individuais das emulsões sejam fornecidas, as razões reais dos componentes de uma emulsão em particular podem ter que ser ajustadas de tal modo que as partículas de emulsão de tamanho e propriedades fisicas desejadas possam ser adequadamente formadas. Por exemplo, se uma quantidade particular de óleo é usada (por exemplo, 5% v/v de óleo), então, a quantidade de surfactante deve estar ao nivel que seja suficiente para dispersar a gota de óleo para a fase aquosa para formar uma emulsão estável. A quantidade real de surfactante requerida para dispersar a gota de óleo em fase aquosa depende do tipo de surfactante e do tipo de núcleo oleoso usado para a emulsão; e a quantidade de óleo pode também variar de acordo com o tamanho da gota (já que isto muda a área da superfície entre as duas fases). As quantidades reais e as proporções relativas dos componentes de uma emulsão desejada podem ser proniamente determinadas por um versado na técnica.

A. Núcleo oleoso

As partículas das emulsões de óleo em água catiônicas compreendem um núcleo oleoso. Preferencialmente, o óleo é um óleo metabolizável, não tóxico, mais preferencialmente um de cerca de 6 a cerca de 30 átomos de carbono incluindo, mas não se limitando a, alcanos, alquenos, alquinos e os seus ácidos e álcoois correspondentes, éteres e ésteres dos mesmos, e misturas dos mesmos. O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo preparado sinteticamente que pode ser metabolizado pelo corpo do sujeito ao qual a emulsão vai ser administrada, e não é tóxico para o sujeito. O sujeito pode ser um animal, tipicamente um mamifero e, preferencialmente, um humano.

Em certas modalidades, o núcleo oleoso está na fase liquida a 25°C. 0 núcleo oleoso está na fase liquida a 25 °C, quando apresenta as propriedades de um fluido (como distinguido do sólido e do gás, e tendo um volume definido, mas nenhuma forma definida), quando armazenado a 25°C. A emulsão, no entanto, pode ser armazenada e usada a qualquer temperatura adequada. Preferencialmente, o núcleo do óleo está na fase liquida, a 4 °C.

O óleo pode ser qualquer alcano, alqueno ou alquino de cadeia longa, ou um ácido ou derivado de álcool do mesmo, quer como o ácido livre, seu sal ou um éster tal como um mono-, di- ou triéster, como os triglicerideos e ésteres de 1,2-propanodiol ou poli-hidróxi álcoois semelhantes. Álcoois podem ser acilados empregando um mono- ou poliácido funcional, por exemplo, ácido acético, ácido propanóico, ácido citrico, ou similares. Éteres derivados de álcoois de cadeia longa, que são óleos e preenchem os outros critérios estabelecidos aqui também podem ser usados.

A fração de alcano, alqueno ou alquino individual e seus derivados de álcool e ácido terão geralmente de cerca de 6 a cerca de 30 átomos de carbono. O radical pode ter uma estrutura de cadeia linear ou ramificada. Pode ser completamente saturado ou ter uma ou mais ligações duplas ou triplas. Sempre que os óleos à base de éteres ou mono- ou poli-ésteres são usados, a limitação de cerca de 6 a cerca de 30 átomos de carbono aplica-se às frações de ácido graxo ou de álcoois graxos individuais, e não à contagem de carbono total.

É particularmente desejável que o óleo possa ser metabolizado pelo hospedeiro ao qual a emulsão é administrada.

Quaisquer óleos adequados a partir de uma fonte de peixe, animal ou vegetal podem ser usados. As fontes de óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos e óleos adequados incluem óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco, óleo de oliva e outros. Outros óleos de sementes adequados incluem óleo de cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de sementes de sésamo e similares. No grupo de grãos, óleo de milho, e o óleo de outros grãos de cereais, tais como o trigo, aveia, centeio, arroz, milho painço, triticale e similares podem igualmente ser usados. A tecnologia para obter óleos vegetais está bem desenvolvida e bem conhecida. As composições destes e outros óleos similares podem ser encontradas, por exemplo, no índice da Merck, e as matérias-primas em alimentos, nutrição e tecnologia de de alimentos.

Cerca de seis a cerca de dez carbonos de ésteres de ácidos graxos de glicerol e de 1,2-propanodiol, embora não ocorram naturalmente em óleos de sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação de materiais partindo de óleos de nozes e sementes adequados. Estes produtos estão disponíveis comercialmente sob os nomes de NEOBEES de PVO International, Inc., Chemical Specialties Division, 416 Division Street, Boongon, N.J. e outros.

Os óleos e gorduras animais estão, muitas vezes, em fase sólida, em temperaturas fisiológicas devido ao fato de existirem como triglicerideos e terem um grau mais elevado de saturação do que os óleos de peixe ou vegetais. No entanto, os ácidos graxos são obtidos a partir de gorduras animais por saponificação parcial ou completa dos triglicerideos que fornece os ácidos graxos livres. Gorduras e óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis e podem, portanto, ser usadas na prática da presente invenção. Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para obtenção de óleos puros de origem animal são bem conhecidos na técnica.

A maior parte dos peixes contém óleos metabolizáveis que podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, o óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão e óleo de baleia tais como espermacete exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser usados na presente invenção. Uma série de óleos de cadeia ramificada é sintetizada bioquimicamente em unidades de isopreno com 5 carbonos e são geralmente referidos como terpenóides. O esqualeno (2,6,1 0, 1 5, .1 9,23-hexametil-2, 6, 10,14,18,22-tetracosa- hexaeno), um terpenóide insaturado ramificado, é particularmente preferido no presente documento. Uma das principais fontes de esqualeno é óleo de figado de tubarão, embora os óleos de plantas (principalmente óleos vegetais), incluindo óleo de sementes de amaranto, de farelo de arroz, de germe de trigo, e de oliva, também sejam fontes adequadas. O esqualano, o análogo saturado do esqualeno, também é preferido. Os óleos de peixe, incluindo esqualeno e esqualano, estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica.

Em certas modalidades, o núcleo oleoso compreende um óleo que é selecionado a partir do grupo consistindo em: óleo de rícino, óleo de coco, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de prímula, óleo de peixe, óleo de jojoba, óleo de banha de porco, óleo de linhaça, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de cártamo, óleo de sésamo, óleo de soja, esqualeno, óleo de girassol, óleo de gérmen de trigo, e óleo mineral. Em modalidades exemplares, o núcleo oleoso compreende óleo de soja, óleo de girassol, óleo de oliva, esqualeno, ou uma combinação dos mesmos. Esqualano também pode ser usado como o óleo. Em modalidades exemplares, o núcleo oleoso compreende esqualeno, esqualano, ou uma combinação dos mesmos.

A componente oleoso da emulsão pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,2% a cerca de 20% (v/v) . Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,2% a cerca de 20% (v/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 15% de óleo (v/v), de cerca de 0,2 % a cerca de 10% (v/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 9% (v/v) de óleo, de cerca de 0,2%) a cerca de 8% o óleo (v/v), de cerca 0,2% a cerca de 7% (v/v) de óleo, de  cerca de 0,2% a cerca de 6% (v/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 5% (v/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 4,3% (v/v) de óleo, de cerca de 0,3% a cerca de 20% (v/v) de óleo, de cerca de 0,4% a cerca de 20% (v/v) de óleo, de cerca de 0,5% o a cerca de 20% o óleo (v/v), de cerca de 1% a cerca de 20% (v/v) de óleo, de cerca de 2% a cerca de 20% (v/v) de óleo, de cerca de 3% a cerca de 20% (v/v) de óleo, de cerca de 4% a cerca de 20% (v/v) de óleo, de cerca de 4,3% a cerca de 20% (v/v) de óleo, de cerca de 5% a cerca de 20 % (v/v) de óleo, cerca de 0,5% (v/v) de óleo, cerca de 1% (v/v) de óleo, cerca de 1,5% (v/v) de óleo, cerca de 2% (v/v) de óleo, cerca de 2,5% (v/v) de óleo, cerca de 3% (v/v) de óleo, cerca de 3,5% (v/v) de óleo, cerca de 4% (v/v) de óleo, cerca de 4,3% (v/v) de óleo, cerca de 5% >* 1.5 (v/v) de óleo, ou cerca de 10% de óleo (v/v) .

Alternativamente, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,2% a cerca de 10% (p/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 9% (p/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 8% (p/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 7% (p/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 6% (p/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 5% (p/v) de óleo, de cerca de 0,2% a cerca de 4,3% (p/v) de óleo, ou cerca de 4,3% (p/v) de óleo.

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água 25 catiônica compreende cerca de 0,5% (v/v) de óleo. Em outra modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende cerca de 4,3% (v/v) de óleo. Em outra modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende cerca de 5% (v/v) de óleo. Em outra modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende cerca de 4,3% (p/v) de esqualeno.

Conforme observado acima, a porcentagem de óleo acima descrito é determinada com base na quantidade inicial de óleo que é usada para preparar as emulsões. Entende-se na 5 técnica que a concentração real do óleo no produto final (por exemplo, uma emulsão esterilizada embalada que está pronta para administração) pode ser ligeiramente mais baixa, por vezes a cerca de 10% ou cerca de 20%.

B. Lipídeos Catiônicos

As partículas de emulsões aqui descritas compreendem um lipídeo catiônico, a qual pode interagir com a molécula carregada negativamente, assim, ancorando a molécula para as partículas da emulsão.

Qualquer lipídeo catiônico adequado pode ser usado. r 15 Geralmente, o lipídeo catiônico contém um átomo . de nitrogênio que está carregado positivamente, sob condições fisiológicas. Os lipídeos catiônicos adequados incluem, cloreto de benzalcônio (BAK), cloreto de benzetônio, cetrimida (que contém brometo de tetradeciltrimetilamônio e 20 eventualmente pequenas quantidades de brometo de dodeciltrimetilamônio e brometo de hexadeciltrimetil amónio), cloreto de cetilpiridínio (CPC), cloreto de cetil- ' trimetilamônio (CTAC), aminas primárias, aminas secundárias, aminas terciárias, incluindo, mas não limitado a, N,N',N'-polioxietileno(10)-N-sebo-1,3-diaminopropano, outros sais de amina quaternária, incluindo, mas não limitados a brometo de dodeciltrimetilamônio, brometo de hexadeciltrimetil amónio, brometo de trimetil-alquil-amônio misto, cloreto de benzil-dimetil-dodecil-amônio, cloreto de benzil-dimetil-hexadecil-amônio, metóxido de benzil-  trimetil-amônio, brometo de cetil-dimetil-etil-amônio, brometo de dimetil-diocta-decil amónio (DDAB), cloreto de metilbenzetônio, cloreto de decametônio, cloreto de metil trialquil amónio misto, cloreto de metil trioctilamônio), cloreto de N,N-dimetil-N-[2(2-metil-4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)-fenoxi]-etoxi)-etil]-benzenometanaminio (DEBDA), sais de dialquildimetilamônio, cloreto de [l-(2,3- dioleiloxi)-propil]-N,N,N, trimetilamônio, 1,2-diacil-3- (trimetilamônio)propano (grupo acil = dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil, dioleoil), l,2-diacil-3 (dimetilamônio)propano (grupo acil = dimiristoil, dipalmitoil, distearoil, dioleoil), 1,2-dioleoil-3-(4'- trimetil-amônio)butanoil-sn-glicerol, éster de de colina de 1,2-dioleoil-3-succinil-sn-glicerol, colesteril(4'- trimetilamônio)butanoato), sais de N-alquil-piridinio (por exemplo, brometo de cetilpiridinio e cloreto de cetilpiridínio), sais de N-alquilpiperidinio, eletrólitos de bolaforma dicatiônicos (C^Mee; CI2BU6) , dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a- dioleoilfosfatidiletanolamina, éster de colina de hemissuccinato de colesterol, lipopoliaminas, incluindo, mas não se limitando a, dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), dipalmitoil-fosfatidiletanol amidoespermina (DPPES), Lipopoli-L (ou D)-lisina (LPLL, LPDL) , poli (L (ou D)-lisina conjugado com N-glutarilfosfatidiletanolamina, éster de didodecil glutamato com o grupo amino pendente (C^GluBhCnN1) , éster de ditetradecil glutamato com o grupo amino pendente (Ci4GluCnN+) , derivados catiônicos do colesterol, incluindo, mas não se limitando a, sal de coles teril-3β-oxisuccinamidoetilenotrimetilamônio, sal de  coles terol-3β - ox.:i succinamidoe ti lenodime ti lamina, colesterol-3 β-carboxiamidoetilenotrimetilamônio, colesterol-3 β-carboxiamidoetilenodimetilamina, e 3y-[N- ([N',N-dimetilaminoetanocarbomoil colesterol]) (Colesterol- DC), 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamônio)propano (DOTAP), dimetildioctadecilamônio (DDA), 1,2-Dimiristoil-3- TrimetilAmônioPropano (DMTAP) , dipalmitoil (Ci6:o) trimetil amónio propano (DPTAP), distearoil-trimetil-amônio propano (DSTAP), e combinação dos mesmos. Outros lipídeos catiônicos adequados para uso na presence invenção incluem, por exemplo, os lipídeos catiônicos descritos nas Publicações de Patente U.S. 2008/0085870 (publicada em 10 de abril de 2008) e 2008/0057080 (publicado em 6 de março de 2008) . Outros lipídeos catiônicos adequados para uso na presente invenção incluem, por exemplo, Lipídeos E0001- E0118 ou E0119-E0180, como divulgados na Tabela 6 (páginas 112-139) de; WO 2011/076807 (que também descreve métodos de preparação, e método de uso destes lipídeos catiônicos). Lipídeos catiônicos adicionais adequados incluem cloreto de N-[l-(2, 3-dioleiloxi) propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), cloreto de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamônio (DODAC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), 1,2- dioleo.L 1-3-dimetil-propano (DODAP) , 1,2-dilinoleilóxi-3- dimetilaminopropano (DLinDMA).

A emulsão pode compreender qualquer combinação de dois ou mais dos lipídeos catiônicos descritos no presente documento.

Em modalidades preferidas, o lipídeo catiônico é selecionado a partir do grupo consistindo em 1,2- dioleoiloxi-3-(trimetilamônio)propano (DOTAP), 3 β-[N- (N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]Colesterol (Colesterol DC), dimetildioctadecilamônio (DDA) , 1,2-dimiristoil-3- Trimetil-Amônio-Propano (DMTAP) , dipalmitoil (Ci6:0) trimetil amónio propano (DPTAP), distearoil-trimetil-amônio propano (DSTAP), Lipídeos E0001-E0118 ou E0119-E0180 como descrito na Tabela 6 (páginas 112-139) do WO 2011/076807, e combinações dos mesmos.

Em outras modalidades preferidas, o lipideo catiônico é selecionado a partir do grupo consistindo em 1,2- dioleoiloxi-3-(trimetilamônio)propano (DOTAP), 3β-[N- (N',N'-Dimetilaminoetano)-carbamoil]Colesterol (Colesterol DC), dimetildioctadecilamônio (DDA), 1,2-dimiristoil-3- Trimetil-Amônio-Propano (DMTAP), dipalmitoil (Ci6:0) trimetil amónio propano (DPTAP), distearoil-trimetil-amônio propano (DSTAP), cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), cloreto de N,N-dioleoil-N,N- dimetamónio (DODAC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- etilf osfoco.iina (DOEPC) , 1,2-dioleoil-3-dimetil-propano (DODAP), 1,2-dilinoleilóxi-3-dimetilaminopropano (DLinDMA), Lipídeos E0001-E0118 ou E0119 -E0180 como divulgado na Tabela 6 (páginas 112-139) do WO 2011/076807, e combinações dos mesmos.

Em certas modalidades, o lipídeo catiônico é DOTAP. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml de DOTAP. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DOTAP de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de  cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,3 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,4 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 24 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 22 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 18 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 15 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 12 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 2 mg/ml , de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,9 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca 3,0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, cerca de 0,8 mg/ml, cerca de 0,9 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de .1,6 mg/ml, cerca de 12 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 21,8 mg/ml , cerca de 24 mg/ml, etc..

Km uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml de DOTAP, tal como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml ou 1, 6 rng/rnl .

Em certas modalidades, o lipideo catiônico é colesterol DC. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender colesterol DC de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml de colesterol DC. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode conter colesterol DC de cerca de 0,1 mg/ml á cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,2 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,3 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,62 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 2 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 2,46 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 3 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 3,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 4 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 4,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 4,92 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 4,5 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 4 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 3,5 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2,46 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml , de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0,62 mg/ml, cerca de 0,15 mg/ml, cerca de 0,3 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,62 mg/ml , cerca de 0,9 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 2,4 6 mg/ml, cerca de 4,92 mg/ml, etc.

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,62 mg/ml a cerca de 4,92 mg/ml de colesterol DC, tal como 2,46 mg/ml.  emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml de DDA. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DDA em de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 4,5 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 4 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 3,5 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2,5 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1,5 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml, de cerca de 0,2 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,3 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,73 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 1,45 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 2 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 2,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml , de cerca de 3 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 3, 5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 4 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 4,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,45 mg/ml, etc Alternaiivamente, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DDA menos cerca de 20 mg/ml, cerca de 21 mg/ml, cerca de 21., 5 mg/ml, cerca 21,6 mg/ml, cerca de 25 mg/ml.

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,73 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml de DDA, tal como 1,45 mg/ml. emulsão de óLeo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml de DOTMA. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DOTMA de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,3 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,4 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 24 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 22 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 18 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 15 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 12 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 2 mg/ml , de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,9 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca 3,0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, cerca de 0,8 mg/ml, cerca de 0,9 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,35 mg/ml, cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 1,6 mg/ml, cerca de  12 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 20 mg/ml , cerca de 22.5mg/ml, cerca de 25 mg/ml etc..

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml de DOTMA, tais como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml ou 1,6 mg/ml.

Em. certas modalidades, o lipideo catiônico é DOEPC. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml de DOEPC. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DOEPC de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,3 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,4 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 24 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 22 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 18 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 15 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 12 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 4 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, de cerca de 0,5 rng/m.l a cerca de 1,9 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca 1,7 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 3,0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, cerca 0,8 mg/ml, cerca de 0,9 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 1,6 mg/ml, cerca de 1,7 mg/ml, cerca de 1,8 mg/ml, cerca de 1,9 mg/ml, cerca de 2,0 mg/ml, cerca de 12 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 22.5mg/ml , cerca de 25 mg/ml, etc

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml de DOEPC, tais como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml, 1,6 mg/ml, 1,7 mg/ml, ou 1,8 mg/ml.

Em certas modalidades, o lipídeo catiônico é DSTAP. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 50 mg/ml DSTAP. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DSTAP de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,3 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,4 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 24 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de  22 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 18 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 15 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 12 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 4 mg/ml , de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,9 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,7 10 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca 1,7 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 3,0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, cerca 15 0,8 mg/ml, cerca de 0,9 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 1,6 mg/ml, cerca de 1,7 mg/ml, cerca de 1,8 mg/ml, cerca de 1,9 mg/ml, cerca de 2,0 mg/ml, cerca de 12 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 20 20 mg/ml, cerca de 22.5mg/ml , cerca de 25 mg/ml, etc

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml OSTAP, tais como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml ou 1,6 mg/ml.

Em certas modalidades, o lipideo catiônico é DODAC. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 50 mg/ml de DODAC. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DODAC a de cerce de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml. a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,3 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,4 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 24 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 22 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 18 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 15 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 12 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 4 mg/ml , de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,9 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca 1,7 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 3,0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, cerca 0,8 mg/ml, cerca de 0,9 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml, cerca de 1,15 mg/ml, cerca de 1,16 mg/ml, cerca de 1,17 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 1,6 mg/ml, cerca de 1,7 mg/ml, cerca de 1,8 mg/ml, cerca de 1,9 mg/ml, cerca de 2,0 mg/ml, cerca de 12 mg/ml , cerca de 18 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca 22.5mg/ml, cerca de 25 mg/ml etc..

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de 0,73 mg/ml a cerca de 1,45 mg/ml de DODAC, tal como 1,45 mg/ml.

Em certas modalidades, o lipídeo catiônico é DODAP. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 50 mg/ml DODAP. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DODAP de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,9 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,3 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,4 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,6 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 1,7 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 24 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 22 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de cerc<a de 0,5 mg/ml a cerca de 18 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 15 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 12 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 4 mg/ml , de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 3 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,9 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,8 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml, de cerca de 0,6 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,7 mg/ml a cerca 1,7 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,7 mg/ml, de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 3,0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, cerca 0,8 mg/ml, cerca de 0,9 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 1,6 mg/ml, cerca de 1,7 mg/ml, cerca de 1,8 mg/ml, cerca de 1,9 mg/ml, cerca de 2,0 mg/ml, cerca de 12 mg/ml, cerca de 18 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 22.5mg/ml , cerca de 25 mg/ml, etc..

Err uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende de cerca de 0,8 mg/ml a cerca de 1,6 mg/ml DODAP, Lais como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml ou 1,6 mg/ml.

Em alguns casos, pode ser desejável o uso de um lipideo catiônico que é solúvel no núcleo oleoso. Por exemplo, DOTAP DOEPC, DODAC, DOTMA e são solúveis em esqualeno ou esqualano. Em outros casos, pode ser o uso de um lipídeo catiônico que não é solúvel em núcleo oleoso. Por exemplo, DDA e DSTAP não é solúvel em esqualeno. Está dentro do conhecimento na técnica determinar se um lipídeo particular é solúvel ou insolúvel no óleo e escolher um óleo adequado e uma combinação de lipídeos em conformidade. Por exemplo, a solubilidade pode ser prevista com base nas estruturas dos lipídeos e óleos (por exemplo, a solubilidade de um lipídeo pode ser determinada pela estrutura de sua cauda). Por exemplo, os lipídeos que têm uma ou duas cadeias de ácidos graxos insaturados (por exemplo, caudas de oleoil), como o DOTAP, DOEPC, DODAC, DOTMA, são solúveis em esqualeno ou esqualano, e que os lipídeos que têm cadeias de ácidos graxos saturados (por exemplo, caudas de estearoil) são não solúveis em esqualeno. Alternativamente, a solubilidade pode ser determinada de acordo com a quantidade de lipídeos, que se dissolve em uma determinada quantidade de óleo para formar uma solução saturada.

Conforme observado acima, a concentração de um lipídeo descrito acima é determinada com base na quantidade inicial de lipídeo que é usada para preparar as emulsões. Entende- se na técnica que a concentração real do óleo no produto final (por exemplo, uma emulsão esterilizada embalada, que está pronta para administração) pode ser ligeiramente mais baixa, por vezes a cerca de 20%.

C. Componentes Adicionais

As ernuJ sões de óleo em água catiônicas aqui descritas podem ainda compreender componentes adicionais. Por exemplo, as emulsões podem conter componentes que podem promover a formação de partículas, melhorar a complexação entre as moléculas carregadas negativamente e as partículas catiônicas, ou aumentar a estabilidade da molécula carregada negativamente (por exemplo, para evitar a degradação de uma molécula de RNA).

Surfactantes

Em certas modalidades, as partículas da emulsão de óleo em água catiônica compreendem ainda um surfactante.

Um número substancial de surfactantes tem sido usado nas ciências farmacêuticas. Estes incluem materiais de origem natural, tais como gomas de árvores, proteínas vegetais, polímeros à base de açúcar como alginatos e celulose, e similares. Oxipolímeros determinados ou polímeros tendo um hidróxido ou outro substituinte hidrof1lico no esqueleto de carbono possuem atividade  surfactante, por exemplo, povidona, álcool polivinilico, e compostos mono- e polifuncionais à base de glicol-éter. Os compostos derivados de ácidos graxos de cadeia longa formam um terceiro grupo substancial de agentes emulsionantes e 5 agentes de suspensão que podem ser usados na presente invenção.

Os exemplos específicos de surfactantes apropriados incluem os seguintes: 1. Sabões solúveis em água, tais como os sais de 10 sódio, potássio, amónio e alcanol-amônio de ácidos graxos superiores (C]0_C22) , em particular, sabões de sódio e de sebo com potássio e coco. 2. Surfactantes não sabão sintéticos aniônicos, que podem ser representados pelos sais solúveis em água de ■15 produtos de reação de ácido sulfúrico orgânico possuindo na sua estrutura molecular um radical alquil contendo de cerca de 8 a 22 átomos de carbono e um radical selecionado a partir do grupo que consiste em radicais de ácido sulfônico e ésteres de ácido sulfúrico. Exemplos destes são os 20 sulfatos de alquila de sódio ou de potássio, derivados de sebo ou óleo de coco; sulfonatos de alquil benzeno de sódio ou de potássio; sulfonatos de éter alquil gliceril de sódio; sulfatos e sulfonatos de monoglicerídeos de ácidos graxos de óleo de coco sódico; sais de sódio ou de potássio 25 de ésteres de ácido sulfúrico do produto da reação de um mol de um álcool graxo superior e cerca de 1 a 6 moles de óxido de etileno; sulfonatos de éter de óxido de alquil fenol et.ileno de sódio ou de potássio, com 1 a 10 unidades de óxido de etileno por molécula e em que os radicais 30 alquil contêm de 8 a 12 átomos de carbono; o produto de reação de ácidos graxos esterifiçados com ácido isetiônico e neutralizados com hidróxido de sódio; sais de sódio ou de potássio de amida de ácido graxo de um taureto de metila, e os sais de sódio e de potássio de α-olefinas C10-C24 5 sulfonadas com S03 . 3. Surfactant.essintéticos não iônicos produzidos pela condensação de grupos de óxido de alquileno com um composto orgânico hidrofóbico. Os grupos hidrofóbicos tipicos incluem produtos de condensação de óxido de propileno com 10 propileno glicol, alquil fenóis, produtos de condensação de óxido de propileno e etileno diamina, álcoois alifáticos tendo 8 a 22 átomos de carbono, e amidas de ácidos graxos. 4. Surfactantes não iônicos, tais como óxidos de amina, óxidos de fosfina e sulfóxidos, tendo - 15 características semipolares. Exemplos específicos de óxidos de amina de cadeia longa terciárias incluem óxido de dimetildodecilamina e bis-(2-hidróxietil) dodecilamina. Exemplos específicos de óxidos de fosfina são encontrados na Patente U.S. n°. 3.304.263, concedida em 14 de fevereiro 20 de 3967, e incluem o óxido de dimetildodecilfosfina e óxido de dimet.il-(2hidróxidodecil] ) fosfina. 5. Sulfóxidos de cadeia longa, incluindo os 19 19 correspondentes a formula R -SO-R em que R e R são radicais aiquil substituídos ou não substituídos, o último 25 contendo de cerca de 10 a cerca de 28 átomos de carbono, ao passo que R" contém de 1 a 3 átomos de carbono. Exemplos específicos destes sulfóxidos incluem dodecil metil sulfóxido e 3-hidróxi tridecil metil sulfóxido. 6. Surfactant.essintéticos anfoliticos, tais como 3- 30 dodecLlaminopropionato de sódio e 3-dodecilaminopropano  sul tona no de; sódio. 7. Surfactantes sintéticos Zwitteriônicos, tais como 3 - (N,N-dimetil-N-hexadecilamónio)propano-1-sulfonato e 3- (N,N-dimetil-N-hexadecilamônio)-2-hidróxi-propano-l- sulfona to.

Além disso, todos os seguintes tipos de surfactantes podem ser usados em uma composição da presente invenção: (a) sabões (isto é, sais de metais alcalinos) de ácidos graxos; ácidos de colofónia, e óleo de tall, (b) sulfonatos de alquil areno; (c) sulfatos de alquila incluindo surfactantes com grupos hidrofóbicos de cadeia ramificada e de cadeia linear, bem como grupos de sulfato primários e secundários; (d) sulfatos e sulfonatos contendo uma ligação intermediária entre os grupos hidrofóbicos e hidrofilicos, tais como as metil tauridas aciladas graxas e os monoglicerídeos sulfatados graxos; (e) ésteres de ácidos de cadeia longa de polietilenoglicol, especialmente os ésteres de óleo de tall; (f) éteres de polietileno glicol de alquilfenóis; (g) éteres de polietileno glicol de álcoois de cadeia longa e mercaptanos; e (h) acil-dietanol amidas graxas. Uma vez que os surfactantes podem ser classificados em mais de uma maneira, várias classes de surfactantes estabelecidas neste parágrafo coincidem com classes de surfactantes anteriormente descritas.

Há uma série de surfactantes especificamente concebidos para e comummente usada em situações biológicas. Estes surfactantes são divididos em quatro tipos básicos: aniônicos, catiônicos, zwitteriônicos (anfotérico), e não iônicos. Exemplos de surfactantes aniônicos incluem, por exemplo, perfluorooctanoate (PEOA ou PFO) ,  ■perfluorooctanesulfonate (PFOS), sais de sulfato de alquilo, tais como dodecilsulfato de sódio (SDS) ou lauril sulfato de amónio, sulfato de sódio laureth (também conhecido como sulfato de éter laurilico de sódio, SLES), 5 alquil-benzeno-sulfonato, e sais de ácidos graxos. Exemplos de surfactantes catiônicos incluem, por exemplo, sais de alquiItrimetilamônio, tais como brometo de cetil- trimetilamônio (CTAB ou brometo de hexadecil trimetil amónio), cloreto de cetilpiridinio (CPC), a amina de sebo 10 polietoxi]ado (POEA), cloreto de benzalcônio (BAC), cloreto de benzeLônío (BZT). Exemplos zwiteriônicos (anfotérico) surfactantes incluem, betaina, por exemplo, dodecilo, cocamidopropil betaina, e coco glicinato anfo. Exemplos de surfactantes não iônicos incluem, por exemplo, alquil poli - 15 (óxido de etileno), alquilfenol de poli (óxido de etileno), copolimeros de poli (óxido de etileno) e poli (óxido de propileno) (poloxâmeros comercialmente chamados ou poloxaminas), poliglucósidos AAYL (por exemplo, octilglucósido ou decilo maltósido), álcoois graxos (por 20 exemplo, álcool cetilico ou álcool oleilico), cocamida MEA, cocamida DEA, Pluronic® F-68 (bloco de polioxietileno- polioxipropileno copolimero), e os polissorbatos, tais como Tween 20 (polissorbato 20), Tween 80 (polissorbato 80; monooleato de polioxietileno), o óxido de dodecil- 25 dimetílamina, e tocoferol vitamina E succinato de propilenoglicol (Vitamina E TPGS).

Um grupo particularmente útil de surfactantes são os sorbitano à base de surfactantes não iônicos. Estes surfactantes são preparados por desidratação de sorbitol 30 para gerar 1, 4-sorbitano, que é então reagido com um ou mais equivalentes de um ácido graxo. O radical de ácido graxo substituído pode ser ainda feito reagir com óxido de etileno para gerar um segundo grupo de surfactantes.

Os surfactantes de sorbitano substituídos ácidos com graxos são produzidos por reação de 1,4-sorbitano com um ácido graxo tal como ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ou um ácido graxo de cadeia longa semelhante para gerar o mono-éster 1,4-sorbitano, sesquiester 1,4-sorbitano ou triéster 1,4-sorbitano. Os nomes comuns para estes surfactantes incluem, por exemplo, monolauraco de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, monooleato de sorbitano, sesquioleato de sorbitano e trioleato de sorbitano. Estes surfactantes estão disponíveis comercialmente sob o nome SPAN® ou ARLACEL®, normalmente com uma letra ou designação de número que distingue entre os vários mono-, di- e triésteres de sorbitanos substituídos.

Os surfactantes SPAN® e ARLACEL® são hidrofílicos e são geralmente solúveis ou dispersáveis em óleo. Eles também são solúveis na maioria dos solventes orgânicos. Em água são geralmente insolúveis, mas dispersáveis. Geralmente estes surfactantes terão um número de equilíbrio hidrofílico-lipofilico (HLB) de 1,8 a 8,6. Estes surfactantes podem ser facilmente feitos através de meios conhecidos na técnica ou estão disponíveis comercialmente.

Um grupo relacionado de surfactantes compreende monoésteres de olioxietileno sorbitano e triésteres de olioxiet,:.leno sorbitano. Estes materiais são preparados por adição de óxido de etileno a um monester ou triéster de 1,4-sorbitano. A adição de polioxietileno converte o surfactante mono- ou triéster de sorbitano lipofilico a um surfactante hidrofílico geralmente solúvel ou dispersável em água e solúvel em graus variados em líquidos orgânicos.

Estes materiais, comercialmente disponíveis sob a marca TWEEN®, são úteis para a preparação de emulsões e dispersões de óleo em água ou para a solubilização de óleos e produção de unguentos anidros solúveis em água ou laváveis. Os surfactantes TWEEN® podem ser combinados com um surfactante de triéster ou monester de sorbitano respectivo para promover a estabilidade da emulsão. Os surfactantes TWEEN® têm, geralmente, um valor de HLB compreendido entre 9,6-16,7. Os surfactantes TWEEN® estão disponíveis comercialmente.

Um terceiro grupo de surfactantes não iônicos que podem ser usados individualmente ou em conjunto com surfactantes SPANS, ARLACEL® e TWEENS são os ácidos graxos de polioxietileno produzidos por reação de óxido de etileno com um ácido graxo de cadeia longa. O surfactante mais comum disponível deste tipo é sólido sob a designação MYRJS® e ó um derivado de polioxietileno do ácido esteárico. Os surfactantes MYRJ® são hidrofílicos e solúveis ou dispersáveis em água, como os surfactantes TWEEN®. Os surfactantes MYRJ® podem ser misturados com surfactante TWEEN® ou com misturas de surfactantes de TWEEN®/SPAN® ou ARLACEL® para uso na formação de emulsões. Os surfactantes MYRJ® podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica ou estão disponíveis comercialmente.

Um quarto grupo de polioxietileno à base de surfactantes não iônicos são os éteres de ácidos graxos de polioxietileno derivados de álcoois laurílicos, acetílicos, estearilico e oleilico. Estes materiais são preparados como acima pela adição de óxido de etileno de um álcool graxo. O nome comercial para estes surfactantes é BRIJ®. Os surfactantes BRIJ® podem ser hidrofílicos ou lipofílicos, dependendo do tamanho da fração de polioxietileno no surfactante. Embora a preparação destes compostos estarem disponíveis a partir da técnica, ela também está prontamente disponível a partir de fontes comerciais.

Outros surfactantes não iônicos que podem potencialmente ser usados são, por exemplo, polioxietileno, ésteres de ácido graxo de poliol, éteres de polioxietileno, éteres graxos de polioxietileno, derivados de cera de abelha contendo polioxietileno, derivado de lanolina de polioxietileno, glicerideos graxos de polioxietileno, ésteres de ácidos graxos de glicerol ou outros álcoois ácidos de polioxietileno ou derivados de éter de ácidos graxos de cadeia longa de 12-22 átomos de carbono.

Conforme as emulsões e as formulações da invenção destinam-se a ser sistemas de multifase, é preferível escolher um surfactante não iônico formador de emulsão de que possui um valor de HLB na faixa de cerca de 7 a 16. Este valor pode ser obtido através do uso de um surfactante não iônico único tal como um surfactante TWEEN® ou pode ser conseguido através do uso de uma mistura de surfactantes tal como um surfactante à base de mono di- ou triéster de sorbitano; um ácido graxo de polioxietileno de éster de sorbitano, um éster de sorbitano em combinação com um surfactante derivado de polioxietileno de lanolina, um surfactante de éster de sorbitano em combinação com um surfactant.e de éter graxo de polioxietileno de alto HLB, ou um surfactant.e de éter graxo de polietileno ou ácido graxo de polioxietileno sorbitano.

Em certas . modalidades, a emulsão compreende um surfactante não iônico único, mais particularmente, um 5 surfactante TWEEN®, tal como surfactante não iônico estab-i lizan.te de emulsão. Em uma modalidade exemplar, a emulsão compreende TWEEN® 80, também conhecido como polissorbato 80 ou polioxietileno 20 monooleato de sorbirano. Em outras modalidades, a emulsão compreende dois 10 ou mais surfactantes não iônicos, em particular, um surfactante TWEEN® e um surfactante SPAN®. Em uma modalidade exemplar, a emulsão compreende TWEEN®80 e SPAN®85.

As emulsões de óleo em água podem conter de cerca de - 15 0,01% a cerca de 2,5% de surfactante (v/v ou p/v), cerca de 0,01% a cerca de 2% de surfactante, 0,01% a cerca de 1,5% de surfactante, 0,01% a cerca de 1% de surfactante, cerca de 0,01% a 0,5% de surfactante, 0,05% a cerca de 0,5% de surfactante, 0,08% a cerca de 0,5% de surfactante, cerca de 20 0,08% de surfactante, cerca de 0,1% de surfactante, cerca de 0,2% de surfactante, cerca de 0,3% de surfactante, cerca de 0,4% de surfactante, cerca de 0,5% de surfactante, cerca de 0,6% do surfactante, cerca de 0,7% de surfactante, cerca de 0,8% cie surfactante, cerca de 0,9% de surfactante, ou 25 cerca de 1% de surfactante.

Em alternativa, ou em adição, as emulsões de óleo em água podem conter de 0,05% a cerca de 1%, 0,05% a cerca de 0,9%, 0,05% a cerca de 0,8%, 0,05% a cerca de 0,7%, 0,05% a cerca de 0,6 %, 0,05% a cerca de 0,5%, cerca de 0,08%, 30 cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, ou cerca de 1% de Tween 80 (polissorbato 80; monooleato de polioxietileno).

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água contém 0,08% de Tween 80.

Em alternativa, ou em adição, as emulsões de óleo em água podem conter de 0,05% a cerca de 1%, 0,05% a cerca de 0,9%, 0,05% a cerca de 0,8%, 0,05% a cerca de 0,7%, 0,05% a cerca de 0,6 %, 0,05% a cerca de 0,5%, cerca de 0,08%, cerca dc 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, ou cerca de l%de SPAN85 (trioleate de sorbitano).

Em alternativa, ou em adição, as emulsões de óleo em água podem conter uma combinação de surfactantes aqui descrita. Por exemplo, uma combinação de Tween 80 (polissorbato 80; monooleato de polioxietileno) e SPAN85 (trioleato de sorbitano) pode ser usada. As emulsões podem conter várias quantidades de Tween80 e SPAN85 (por exemplo, os exemplificados acima), incluindo quantidades iguais destes surfactantes. Por exemplo, as emulsões de óleo em água podem conter cerca de 0,05% Tween80 e cerca de 0,05% de SPAN8 5, cerca de 0,1% de Tween 8 0 e cerca de 0,1% de S PAN 8 5, cerca de 0,2% de Tween 80 e cerca de 0,2% de SPAN85, cer ca de 0,3 % de Tween 80 e cerca de 0,3% de SPAN85, cerca de 0,4% de Tween 80 e cerca de 0,4% de S PAN 8 5, cercea de 0,5% de Tween 80 e cerca de 0,5% de SPAN85, cerca de 0,6% de Tween 80 e cerca de 0,6% de SPAN85, cerca de 0,7% de Tween 80 e cerca de 0,7 SPAN85 %, cerca do 0,8% de Tween 80 e cerca de 0,8% de SPAN85 cerca de 0,9% de Tween 80 e cerca de 0,9% de SPAN85, ou cerca de 1% de Tween 80 e cerca de 1,0% de SPAN85. l^olietileno Glicol (PEG) -lipídeos, tais como o PEG acoplado ao dialquiloxipropilas (PEG-DAA), PEG ligado ao diacilglicerol (DAG-PEG), PEG acoplado ao fosfatidiietanolamina (PE) (PEG-PE), ou alguns outros fosfolipideos (PEG-fosfolipideos) , PEG conjugado com ceramidas (PEG-Cer), ou uma combinação dos mesmos, podem também ser usados como surfactantes (ver, por exemplo, Patente US n°s. 5.885.613,. publicações de Pedidos de Patente US n°s. 2003/0077829, 2005/0175682 e 2006/0025366). Outros PEG-lipídeos adequados incluem, por exemplo, lipídeos de PEG-dialquiloxipropila (DAA) ou os lipídeos PEG-diacilglicerol (DAG). Exemplos de lipídeos PEG-DAG incluem, por exemplo, lipídeos de PEG-dilauroilglicerol (C12) , lipídeos de PEG dimiristoilglicerol-(C14) , lipídeos de PEG dipalmitoilglicerol- (Cie) , ou lipídeos de PEG- distea roíIglicerol (Ci8) . Exemplos de lipídeos de PEG-DAA incluem, por exemplo, lipídeos de PEG-dilauroiloxipropila (C12) , lipídeos de PEG-dimiristiloxipropila (C14), lipídeos PEG-dipalmitiloxipropila (Cis) , ou lipídeos de PEG- disteariloxipropila (Cig) .

Os PEGs são classificados pelos seus pesos moleculares, por exemplo, PEG 2000 tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons, e PEG 5000 tem um peso molecular médio de cerca de 5.000 daltons. PEGs são comercia 1 mente disponíveis a partir de Sigma Chemical Co., assim como as outras empresas e incluem, por exemplo, o seguinte: monometoxipolietileno glicol (MePEG-OH), succinato de monometoxipolietileno glicol (MePEG-S), succinato de glicol succinimidil monometoxipolietileno (MePEG-S-NHS) , monometoxipolietileno glicol-amina (MePEG- NH2) , glicol tresilato de monometoxipolietileno (MePEG- TRES; e monometoxipolietilenode glicol-imidazolil-carbonil (MePEG-IM). Além disso, monometoxipolietilenoglicol-acético (MePEG-CH2COOH) , é particularmente útil para a preparação do conjugados de PEG-lipideo, incluindo, por exemplo, conjugados de PEG-DAA.

Preferencialmente, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 5000 daltons (por exemplo, PEGiooo, PEG2OOO, PEG3000, PEG4000, PEG5000) • O PEG pode ser opcionalmente substituído por um grupo alquil, alcóxi, acil ou aril. O PEG pode ser conjugado diretamente ao lipídeo ou pode ser ligado ao lipídeo, através de uma fração ligante. Qualquer fração ligante apropriada para acoplar o PEG a um lipídeo pode ser usada, incluindo, por exemplo, as frações ligantes contendo não éster e frações ligantes contendo éster.

Em modalidades exemplares, PEG2QOOPE, PEG5OOQPE, PEGKJCO^MG, PEG2OOODMG, PEG30OODMG, OU uma combinação dos mesmos é usada como um surfactante. Em certas modalidades exemplares, a emulsão de óleo em água contém entre cerca de 1 mg/ml a cerca de 80 mg/ml PEG2000PE, PEG5000PE, PEGIQOQDMG, PEG2OO()BMG OU PEG3000DMG.

Fosfolipideos

Em certas modalidades, as partículas da emulsão de óleo em água catiônica compreendem ainda um fosfolipídeo.

Os fosfolipídeos são os ésteres de ácidos graxos em que o componente de álcool da molécula contém um grupo fosfato. Os fosfolipideos incluem glicerofosfatídeos  (contendo glicerol) e as esfingomielinas (contend esfingosina). Os fosfolipideos exemplares incluem fosfacíd1Lcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina e esfingomielina; e fosfolipídeos sintéticos compreendendo 5 dimiristoi1 i'osfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, diestearoil fosfatidilcolina, distearoil fosfatidilglicerol dipalmitoil fosfatidilglicerol, dimiristoil fosfatidilserina, distearoil fosfatidilserina, e serina dipalmrtoila.

Os seguintes fosfolipideos exemplares podem ser usados.

Em certas modalidades, pode ser vantajoso o uso de um lipídeo neutro. Também pode ser vantajoso o uso de um fosfolipideo, incluindo um fosfolipideo zwiteriônico, por exemplo, um fosfolipideo contendo um ou mais radicais 5 alquila ou alcenila de cerca de 12 a cerca de 22 carbonos de comprimento (por exemplo, cerca de 12 a cerca de 14, a cerca de 16, a cerca de 18, a cerca de 20, a cerca de 22 átomos de carbono), cujos radicais podem conter, por exemplo, 0 a 1 a 2 a 3 ligações duplas. Pode ser vantajoso 10 usar um fosfolipideo zwiteriônico.

Os fosfolipideos preferidos incluem, por exemplo, 1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE), fosfatidilcolina de ovo (ovo PC) , palmitoil oleoil fosfatidLlcolina (POPC), fosfatidilcolina de dimiristoila (DMPC), dicleoil fosfatidilcolina (DOPC), DPPC, dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), palmitoil fosfatidilcolina linoleil (PLPC), DPyPE, ou uma combinação dos mesmos.

Em certas modalidades, o fosfolipideo é DOPE. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de DOPE. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DOPE a menos de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, ou de cerca de 1,5 mg/ml a cerca 7,5 mg/ml de DOPE.

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende cerca de 1,5 mg/ml de DOPE.

Em certas modalidades, o fosfolipideo é PC de ovo. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de PC de ovo. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender PC de ovo de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, ou de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 3,5 mg/ml de PC de ovo.

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende cerca de 1,55 mg/ml de PC de ovo.

Em certas modalidades, o fosfolipideo é DPyPE. A emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de DPyPE. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender DPyPE a cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, de cerca de 1,5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, ou de cerca de 1,5 mg/ml a cerca 5 mg/ml de DPyPE.

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água catiônica compreende cerca de 1,6 mg/ml de DPyPE.

Em certas modalidades, as particulas da emulsão podem compreender uma combinação de um surfactante e um fosfolipideo aqui descrito.

D. Fase aquosa (Fase contínua)

A fase aquosa (fase contínua) das emulsões de óleo em água é uma solução salina tamponada (por exemplo, salina), ou água. A solução salina tamponada é uma solução aquosa que compreende um sal (por exemplo, NaCl), um tampão (por exemplo, um tampão de citrato), e pode compreender ainda um 10 agente de ajuste da osmolalidade (por exemplo, um sacarideo), um polímero, um surfactante, ou uma combinação dos mesmos. Se as emulsões são formuladas para administração parentérica, é preferível fazer-se soluções tamponadas finais de modo que a tonicidade, ou seja, a ■ 15 osmolaJidade seja essencialmente a mesma que os fluidos fisiológicos normais de modo a evitar consequências indesejáveis após a administração, tais como absorção rápida ou expansão da composição após a administração. Também é preferível tamponar a fase aquosa de modo a manter 20 um pH compatível com as condições fisiológicas normais.

Além disso, em certos casos, pode ser desejável manter o pH a um nível particular de modo a assegurar a estabilidade de determinados componentes da emulsão.

Por exemplo, pode ser desejável preparar uma emulsão, 25 que é isotônica (ou seja, a mesma concentração de soluto permeável (por exemplo, sal) que as células normais do corpo e do sangue) e isosmótica. Para controlar a tonicidade, a emulsão pode compreender um sal fisiológico, tal como ura sal de sódio. Cloreto de sódio (NaCl), por 30 exemplo, pode ser usado a cerca de 0,9% (p/v) (solução salina fisiológica). Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, di-hidrogenofosfato de potássio, fosfato dissódico, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.. Agentes de tonicidade não iônicos também 5 podem ser usados para controlar a tonicidade. Um número de agentes modificadores de tonicidade não iônicos é normalmente conhecido pelos versados na técnica. Estes são tipicamente os carboidratos de várias classificações (ver, por exemplo, Voet e Voet (1990)Biochemistry (John Wiley & 10 Sons, New York). Os monossacarideos classificados como aldoses tais como a glicose, manose, arabinose, e ribose, bem como os classificados como cetoses, como a frutose, sorbose, e xilulose podem ser usados como agentes de tonicidade não iônicos na presente invenção. Dissacarideos 15 tais como a sacarose, maltose, trealose, lactose e também podem ser usados. Além disso, os alditóis (álcoois de polihidróxi aciclicos, também referidos como os álcoois de açúcar), tais como glicerol, manitol, xilitol, e sorbitol são agentes de tonicidade não iônicos úteis na presente 20 invenção. Agentes modificadores de tonicidade não iônicos podem estar presentes em uma concentração de cerca de 0,1% a cerca de 10% ou cerca de 1% a cerca de 10%, dependendo do agente que. é usado.

A fase aquosa pode ser tamponada. Qualquer tampão 25 fisio1ogicamente aceitável pode ser usado na presente invenção, tal como água, tampões de citrato, tampões de fosfato, tampões de acetato, tampões de Tris, tampões de bicarbonato, tampões de carbonato, tampão de succinato, ou similares. O pH do componente aquoso estará 30 preferencialmente entre 6,0-8,0, preferencialmente, a cerca de 6,2 e cerca de 6,8. Em uma modalidade exemplar, o tampão é tampão de citrato 10 mM com urn pH de 6,5. Em uma outra modalidade exemplar, a fase aquosa é, ou o tampão preparado usando Rnase isenta de água ou água tratada com DEPC. Em alguns casos, a elevada quantidade de sal no tampão pode interferir com a complexação da molécula carregada negativamente para a particula de emulsão, portanto, é evitada. Em outros casos, certa quantidade de sal no tampão pode ser incluida.

Em uma modalidade exemplar, o tampão é tampão de citrato lOmM com um pH de 6,5. Em uma outra modalidade exemplar, a fase aquosa é, ou o tampão é, preparado(a) usando, RNase isenta de água e DEPC tratado com água.

A faso aquosa pode também compreender componentes adicionais, tais como as moléculas que alteram a osmolaridade da fase aquosa, ou moléculas que se estabilizam a molécula carregada negativamente após complexação. Preferencialmente, a osmolaridade da fase aquosa é ajustada usando um agente de tonificação não iônico, tal como um açúcar (por exemplo, a trealose, sacarose, dextrose, frutose, palatinose reduzida, etc.), um álcool de açúcar (tais como o manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, glicerol, maltitol, etc.), ou combinações dos mesmos. Se desejado, um polimero não iônico (por exemplo, um glicol de (poli alquil) tal como polietileno glicol, polipropileno glicol, ou polibutileno glicol) ou surfactante não iônico pode ser usado.

Em alguns casos, a água não adulterada pode ser preferida como a fase aquosa da emulsão quando a emulsão é preparada inicialmente. Por exemplo, o aumento da concentração de sal pode tornar mais difícil alcançar o tamanho de partícula desejado (por exemplo, menos do que cerca de 200 nm).

Em certas modalidades, a fase aquosa da emulsão de óleo ern água catiônica pode compreender ainda um polímero ou um surfactante, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água contém um polaxâmero. Os poloxâmeros são copolímeros de tribloco não iônicos tendo uma cadeia hidrofóbica de central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueada por duas cadeias hidrófilas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)). Os poloxâmeros também são conhecidos pelos nomes comerciais de polímeros Pluronic®. Os polímeros de poloxâmero podem conduzir a uma maior estabilidade e resistência à RNase aumentada da molécula de RNA após a complexação de RNA.

Em alternativa, ou em adição, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender de cerca de 0,1% a cerca de 20% (p/v) de polímero, ou de cerca de 0,05% a cerca de 10% (p/v) de polímero. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender um polímero (por exemplo, um poloxâmero Pluronic® tal como F127), de cerca de 0,1% a cerca de 20% (p/v), de cerca de 0,1% a cerca de 10% (p/v), de cerca de 0,05% a cerca de 10% (p/v), ou de cerca de 0,05% a cerca de 5% (p/v).

Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água compreende cerca de 4% (p/v) , ou cerca de 8% (p/v) de Pluronic® El 27.

A quantidade do componente aquoso empregada nestas composições será a quantidade necessária para levar o valor da composição à unidade. Isto é, uma quantidade de componente aquoso suficiente para fazer com que 100% sejam misturados com os outros componentes listados acima, a fim de levar as composições ao volume desejado.

4. MOLÉCULAS CARREGADAS NEGATIVAMENTE

Quando uma molécula carregada negativamente deve ser emitida, a mesma pode ser complexada com as particulas da emulsão de óleo em água catiônica. A molécula carregada negativamente é complexada com as particulas da emulsão, 10 por exemplo, as interações entre a molécula carregada negativamente e o lipideo catiônico na superficie das particulas, assim como as interações hidrofóbicas/hidrofilicas entre a molécula carregada negativamente e a superficie das particulas. Embora não - 15 pretendendo se ater a qualquer teoria particular, acredita- se que as moléculas carregadas negativamente interagem com o lipideo catiônico através de interações de cargas iônicas não covalentes, (forças eletrostáticas), e a força do complexo, bem como a quantidade do composto negativamente 20 carregado que pode ser complexado com uma particula está relacionada com a quantidade de lipideo catiônico na particula. Além disso, as interações hidrofóbicas/hidrofilicas entre a molécula carregada negaiivamenle e a superficie das particulas pode também 25 desempen.nar um papel importante.

Exemplos de moléculas carregadas negativamente incluem peptídeos carregados negativamente, polipeptideos ou proteínas, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA de fita simples ou dupla), pequenas moléculas (por 30 exemplo, potenciadores imunes de  (SMTPs), fosfonato, fluorofosfonato, etc.) e similares. Em aspectos preferidos, a molécula carregada negativamente é uma molécula de RNA, tal como um RNA que codifica moléculas de RNA autorreplicante incluindo uma proteina, peptideo, polipeptioeo ou um pequeno RNA interferente.

O complexo pode ser formado por meio de técnicas conhecidas na técnica, exemplos do qual sendo aqui descritos. Por exemplo, um complexo de ácido nucleico- particuia pode ser formado por mistura de uma emulsão catiônica, com a molécula de ácido nucleico, por exemplo, por agitação em vórtex. A quantidade da molécula carregada negativamente e de lipideo catiônico nas emulsões pode ser ajustada ou otimizada para fornecer uma resistência desejada de ligação e de capacidade ligação.

Por exemplo, como descrito e exemplificado na presente invenção, exemplos de complexos de RNA-particula foram produz idos através da variação das razões de RNA:lipídeos catiônicos (tal como medido pela "razão de N/P") . A razão de N/P refere-se à quantidade (moles) de átomos de nitrogênio protonáveis no lipídeo catiônico dividida pela quantidade (moles) de fosfatos no RNA. As razões de N/P preferidas são de cerca de 1:1 a cerca de 20:1, de cerca de 2:1 a cerca de 18:1, de cerca de 3:1 a 16:1, de cerca de 4:1 a cerca de 14:1, de cerca de 6:1 a cerca de 12:1, cerca de 3:1, de cerca de 4:1, cerca de 5:1, de cerca de 6:1, cerca de 7:1, a cerca de 8:1, cerca de 9:1, cerca de 10:1, cerca de 11:1, cerca de 12:1, cerca de 13:1, cerca de 14:1, cerca de 15:1, ou cerca de 16:1. Alternativamente, as razões de N/P preferenciais são pelo menos cerca de 3:1, pelo menos cerca de 4:1, pelo menos cerca de 5:1, pelo  menos cerca de 6:1, pelo menos cerca de 7:1, pelo menos cerca de 8:1, pelo menos cerca de 9:1, pelo menos cerca de 10:1, pelo menos cerca de 11:1, pelo menos cerca de 12:1, pelo menos cerca de 13:1, pelo menos cerca de 14:1, pelo 5 menos cerca de 15:1, ou pelo menos cerca de 16:1. A razão de N/P mais preferida é de cerca de 4:1 ou mais.

Cada emulsão pode ter a sua própria razão de N/P ideal ou preferida para produzir os efeitos desejados (por exemplo, o nível desejado de expressão de RNA complexado), 10 o que pode ser determinado experimentalmente (por exemplo, usando os ensaios, tal como aqui descritos, ou outras técnicas conhecidas na técnica, tais como a medição de nível de expressão de uma proteína que é codificada pelo RNA, ou medição da porcentagem de moléculas de RNA a ser • 15 liberada a partir do complexo na presença de heparina) . Geralmente, a razão de N/P deve ser a um valor a que pelo menos cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% , cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85% o, cerca de 90%, ou cerca de 95% das moléculas de RNA são liberadas a partir dos complexos de RNA-partícu1 a quando os complexos de RNA-partícula são absorvidos pelas células. Uma razão de N/P de pelo menos 25 4:1 é a preferida.

As emulsões de óleo em água catiônicas aqui descritas são oa r: i :::A! armen Le adequadas para a formulação de vacinas à base de ácidos nucleicos (por exemplo, as vacinas de DNA, vacinas de RNA) . A formação de um complexo de ácido 30 nucleico-partícula da emulsão facilita a absorção do ácido ' nucleico nas células hospedeiras, e protege a molécula de ácido nucleico da degradação da nuclease. As células transíectadas podem então expressar o antigeno codificado pela mofécula de ácido nucleico, que pode produzir uma resposta .imune ao antigeno. Como vírus vivos ou atenuados, as vacinas à base de ácidos nucleicos podem envolver eficazmente tanto vias de MHC-I e MHC-II que permitem a indução de respostas de células T CD8+ e CD4+, enquanto que o antigeno presente na forma solúvel, como a protein recombinante, geralmente induz apenas respostas de anticorpos.

A sequência da molécula de RNA pode ser códon otimizada ou desotimizada para a expressão em um hospedeiro desejado, tal como uma célula humana.

Em certas modalidades, a molécula carregada negativamente aqui descrita é uma molécula de RNA. Em certas modalidades, a molécula de RNA codifica um antigeno (peptídeo, polipeptídeo ou proteína) e a emulsão de óleo em água catiônica é adequada para uso como uma vacina à base de RNA. A composição pode conter mais do que uma molécula de RNA que codifica um antigeno, por exemplo, duas, três, cinco ou dez moléculas de RNA que são complexadas com as partículas da emulsão. Isto é, a composição pode conter uma ou mais espécies diferentes de moléculas de RNA, cada uma codificando um antigeno diferente. Em alternativa ou adiciona J men te, uma molécula de RNA pode também codificar para ma.i s do que um antigeno, por exemplo, uma molécula de RNA bicisLrônica, ou tricistrônica que codifica antígenos diferentes ou idênticos. Por conseguinte, a emulsão de óleo em água catiônica é adequada para uso como uma vacina à base de RNA que é monovalente ou multivalente.

A sequência da molécula de RNA pode ser modificada, se desejado, por exemplo, para aumentar a eficácia da expressão ou da replicação do RNA, ou para fornecer uma 5 estabilidade adicional ou resistência à degradação. Por exemplo, a sequência de RNA pode ser modificada no que diz respeito ao seu uso do códon, por exemplo, para aumentar a eficácia de tradução e da meia vida do RNA. A cauda de poli-A (por exemplo, de cerca de 30 residues de adenosina 10 ou mais) pode ser ligada à extremidade 3' do RNA para aumentar a sua meia vida. A extremidade 5' do RNA pode ser nivelada com um ribonucleotideo modificado com a estrutura de m7G(5')ppp(5')N (estrutura de cap 0) ou um seu■derivado, que pode ser incorporado durante a sintese de RNA ou pode ser enzimaticamente projetado após a transcrição de RNA (por exemplo, através do uso de Enzima niveladora de vírus Vaccinia (VCE) consistindo em mRNA trifosfatase, guanilil- transferase e guanina-7-metiltransferase, que catalisa a construção de estruturas de cap 0 N7-monometiladas). As 20 estrutura de Cap 0 desempenham um papel importante na manutenção da estabilidade e da eficácia da tradução da molécula de RNA. 0 cap 5' da molécula de RNA pode ser adi ciona .) men te modificado por uma 2 ' -O-metiltransf erase o que resulta na geração de uma estrutura de cap 1 25 (m7Gppp[m2'-O]N), o qual pode, além disso aumentar a eficácia de tradução.

Se desejado, a molécula de RNA pode compreender um ou mais nuc.l eotídeos modificados. Isso pode ser em adição a qualquer estrutura de cap 5'. Existem mais do que 96 30 modificações de nucleosídeos que ocorrem naturalmente encontradas em RNA de mamíferos. Ver, por exemplo, Limbach et al., Nucleic Acids Research, 22 (12 ) : 2183-2196 (1994). As preparações de nucleotideos e nucleotideos e nucleosídeos modificados são bem conhecidas na técnica, por exemplo, a partir das Patentes US n°s. 4.373.071, 4.458.066, 4.500.707, 4.668.777, 4.973.679, 5.047.524, 5.132.418, 5.153.319, 5.262.530, 5.700.642 todas as quais sendo incorporadas por referência na sua totalidade neste documento, e mui tos nucleosídeos modificados e nucleotideos modificados estão disponíveis comercialmente.

As nucleobases modificadas que podem ser incorporadas em nucleosídeos e nucleotideos modificados e estar presentes nas moléculas de RNA incluem: m5C (5- metilcitidina) , m5U (5-metiluridina), m6A (N6- metiladenosina) , s2U (2-tiouridina), Um (2'-O- metiluridina) , mlA (1-metiladenosina) ; m2A (2- metiladenosina) ; Am (2-1-O-metiladenosina) ; ms2m6A (2- metil-tio-N6-metiladenosina); io6A (N6- isopenteniladenosina); ms2i6A (2-metiltio-N6- isopenteniladenosina); io6A (N6-(cis-hidróxi-isopentenil) adenosina); ms2io6A (2-metil-tio-N6-(cis-hidróxi- isopentenll) adenosina); g6A (N6- glicina.Lcarbamoiladenosina) ; t6A (N6-treonil carbamoiladenosina); ms2t6A (2-metil-tio-N6-treonil carbamoi iadenosina); m6t6A (N6-metil-N6- treoni 1 carbarnori ladenosina) ; hn6A (N6-hidróxi- norvalilcarbamoil adenosina); ms2hn6A(2-metil-tio-N6- hidróxi-norvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2"-O- ribosi1adenosina (fosfato)); I (inosina); mil timet 4 L1nosina) ; m'lm (1,2 ' -O-dimetilinosina) ; m3C (3-  met i lei t.i dina ) ; Cm (2T-0-metilcitidina) ; s2C (2- tiocit.Idina); ac4C (N4-acetilcitidina) ; f5C (5- fonilcitidina); m5Cm (5,2-0-dimetilcitidina); ac4Cm (N4- aceti’l 2T0metj Icitidina) ; K2C (lisidina); mlG (1- metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7- metilguanosina) ; Gm (2'-O-metilguanosina); m22G (N2,N2- dimetilguanosina); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-0- ribosilguanosina (fosfato)); yW (wybutosina); o2yW (peróxi- wybutosina) ; OHyW (hidróxi-wybutosina) ; OHyW* (hidróxi- wybutosina modificada); imG (wyosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ(epóxi-queuosina); galQ (galtactosil-queuosina); manQ (manosil-queuosina); preQo (7 -ciano-7-deazaguanosina); preQi (7-aminometil-7- deazaguanosina); G* (arqueoosina); D (dihidrouridina); m5Um (5,2’-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5- metil-2-triouridina) ; s2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3-amino-3-carboxi-propil)-uridina); ho5U (5-hidróxi- uridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (uridina 5- 20 oxiacético); mcmo5U (metil éster de uridina 5-oxiacético); chm5U (5-(carbóxi-hidróxi-metil) uridina)); mchm5U (metil éster de 5-(carbóxi-hidróxi-metil) uridina); mcm5U (5- metoxicanbonil-metiluridina); mcm5Um (S- rnetc'x i ca rbon i J me' i. I-2-O-metiluridina) ; mcm5s2U (5- 25 metoxicarboni.;-2-tiouridina) ; nm5s2U (5-aminometil-2- tiounidina); mnm5U ( 5-metilaminometiluridina) ; mnm5s2U (5- metllaminometil-2-tiouridina); mnm5se2U (5-metilaminometil- 2-se Lenou ri d.i na ) ; ncm5U (5-carbamoilmetil uridina); ncm5Um (5-carbamoil-2'-O-metiluridina) ; cmnm5U (5-carbóxi- 30 meti 1 ami nometiluridina); cnmm5Um (5-carbóxi- meti '1 am i nornet i 1 -2-L-u.ridina Ometil) ; cmnm5s2U (5-carbóxi- met i Iam Lnome t i ..! -2-1iouridina) ; m62A (N6,N6- dimetiladonosina); Tm (2'-O-metilinosina); m4C (N4- metileitidina); m4Cm (N4,2-0-dimetilcitidina); hm5C (5- hidróxi.-meuileiuidina) ; m3U (3-metiluridina) ; cm5U (5- carbóxi-metiluridina); ■ mβAm (N6,T-O-dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,2-0-trimetiladenosina); m2'7G (N2,7- dimetiIguanosina); m2'2'7G (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-O-dimetiluridina); m5D (5-metildihidrouridina); f5Cm ( 5-formi .1-2 ' -O-metilcitidina) ; mlGm (l,2'-0- dimetilguanosina); m'Am (1,2-0-dimetil adenosina) irinometiluridina); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-desmetil guanosina); imG2 (Isoguanosina); acβA (N6-acet i l.adenosina) , hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, seus derivados 7-substituidos, di-hidrouracila, pseudouracilíi, 2-t iouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, 5- (CA -C;0 -alquiluracila, 5-metiluracila, 5- (C2-C6) - alqueni.lurac11, 5-(C2~C6) -alquiniluracil, 5-(hidróxi-metil) uracila, 5-clorouracila, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-hidróxi-citosina, 5-(Ci-Cg)-alquileitosina, 5- metilcitosina, 5-(C2-C6)-alquenileitosina, 5- (C2-C6) - alquin.i.lcitosi na, 5-clorocitosina, 5-f luorocitosina, 5- bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8- azaguanina, 7-desaza-7-guanina substituída, 7-desaza-7-(C2~ Cfi) a i.qu i.ni Iquanina, 7-deaza-8-guanina substituída, 8- hidr óx i-guan i.na, 6-tioguanína, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-G-cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6- dianiinopurina, 8-azapurina, 7-deazapurina substituída, 7- deaza-7-purina substituída, 7-desaza-8- purina substituída, hidrogênio (resíduo abásico), m5C, m5U, m6A, s2U, W, ou 2'- 0-metil-U. Muitas destas nucleobases modificadas e seus ribonucleosídeos correspondentes estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Ver, por exemplo, o documento WO 2011/005/99 que é aqui incorporado por referência.

O RNA usado com a invenção inclui preferencialmente apenas ligações fosfodiéster entre os nucleosídeos mas, em algumas modalidades, pode conter ligações de fosforamidato, fosforotioato e/ou metilfosfonato.

Em algumas modalidades, a molécula de RNA não inclui nucleotideos modificados, por exemplo, não inclui nucleobases modificadas, e todos os nucleotideos na molécula de RNA são ribonucleotídeos convencionais padrões A, U, G e C, com a exceção de um cap 5' opcional que pode incluir, por exemplo, 7-metilguanosina. Em outras modalidades, o RNA pode incluir um cap 5' compreendendo uma 7'-metiIguanosina, e o primeiro 1,2 ou 3, 5'- ribonucleotídeos pode ser metilado na posição 2'da ribose.

A. RNA autorreplicante

Em alguns aspectos, a emulsão de óleo em água catiônica contém uma molécula de RNA autorreplicante. Em certas modalidades, a molécula de RNA autorreplicante é derivada a partir de, ou com base em, um alfavírus.

As moléculas de RNA autorreplicante são bem conhecidas na técnica e podem ser produzidas pelo uso de elementos de replicação derivados de, por exemplo, alfavírus, e substituindo as proteínas estruturais virais com uma sequência de nucleotideos que codifica uma proteína de interesse. A molécula de RNA autorreplicante é tipicamente uma molécula de fita-(+) que pode ser diretamente traduzida após a distribuição a uma célula, e esta tradução proporciona uma RNA polimerase dependente de RNA que produz, então, transcritos antisenses e senses a partir do RNA distribuído. Assim, o RNA distribuído leva à produção de múLtipios RNAs filhos. Estes RNAs filhos, assim como transcrições subgenômicas colineares, podem ser traduzidos por si sós para fornecer na expressão in situde um antigeno codificado, ou podem ser transcritos para fornecer transcritos adicionais com o mesmo sense que o RNA distribuído que são traduzidos para fornecer a expressão in situdo antigeno. Os resultados globais da presente sequência de transcrição é uma amplificação enorme no número de RNAs de replicon introduzidos de modo que o antigeno codificado torna-se um produto principal polipeptüdico das células. As células transfectadas com RNA autorrepil icante produzem brevemente o antigeno antes de sofrer a morte por apoptose. Esta morte é um resultado provável de requisitos de intermediários de RNA de fita dupla (ds), que também mostraram superativar as células dendriticas. Assim, a imunogenicidade aumentada de autorreplicação de RNA pode ser um resultado da produção de dsRNA pró-inflamatório, que mimetiza uma infecção por vírus de RNA de células hospedeiras.

Com vantagem, o maquinário celular é usado por moléculas de RNA autorreplicante para gerar um aumento exponencial de produtos de genes codificados, tais como proteínas ou antígenos, que podem se acumular nas células ou podem ser secretadas das células. A superexpressão de proteínas pelas moléculas de RNA autorreplicante aproveita os efeitos adjuvantes imunoestimulantes, incluindo a estimulação de receptores semelhantes a toll (TLR) 3, 7 e 8  e as vias de não TLR (por exemplo, RIG-1, MD-5) pelos produtos da replicação do RNA e, amplificação e tradução que induz apoptose da célula transfectada.

O RNA autorreplicante geralmente contém pelo menos um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em replicases virais, proteases virais, helicases virais e outras proteínas virais não estruturais, e também compreendem sequências de replicação ativas na extremidade cis 5' e 3'e, se desejado, sequências heterólogas que codificam uma sequência de aminoácidos desejada (por exemplo, um antigeno de interesse). Um promotor subgenômico que dirige a expressão da sequência heteróloga pode ser incluído no RNA autorreplicante. Se desejado, a sequência heteróloga (por exemplo, um antigeno de interesse) pode ser fundida na estrutura a outras regiões de codificação no RNA autorreplicante e/ou podem estar sob o controle de um sítio de entrada do ribossoma interno (IRES).

Em certas modalidades, a molécula de RNA autorreplicante não é encapsulada em uma particular semelhante a vírus. As moléculas de RNA autorreplicante da presente invenção podem ser projetadas de modo que a molécula de RNA autorreplicante não pode induzir a produção de partículas virais infecciosas. Isto pode ser conseguido, por exemplo, omitindo um ou mais genes virais que codificam as proteínas estruturais que são necessárias para a produção de partículas virais no RNA autorreplicante. Por exemplo, quando a molécula de RNA autorreplicante é baseada em um vírus alfa, tal como vírus Sinebis (SIN), vírus Semliki floresta e vírus da encefalite equina venezuelana (VEE), um ou mais genes que codificam as proteínas estruturais virais, tais como o do capsideo e/ou glicoproteínas de envelope, podem ser omitidos.

Se desejado, as moléculas de RNA autorreplicante da invenção podem também ser projetadas para induzir a produção do partículas virais infecciosas que são atenuadas ou virulentas, ou para a produção de partículas virais que são capazes de uma única rodada de infecção subsequente.

Um sistema adequado para a realização de autorreplicação desta forma é o uso de um replicon à base de alfavírus. Os alfavírus compreendem um conjunto de vírus portadores de artrópodes relacionados geneticamente, estruturalmente, e sorologicamente da família Togaviridae. Vinte e seis vírus conhecidos e subtipos de vírus foram classificados dentro do gênero alfavírus, incluindo, Sindbis vírus, vírus Floresta Semliki, vírus Ross River, e vírus da encefalite equina venezuelana. Como tal, o RNA autorreplicante da invenção pode incorporar uma replicase de RNA derivada de vírus da floresta de Semliki (SFV), vírus Sindbis (SIN), vírus da encefalite equina venezuelana (VEE), vírus do rio Ross (RRV), O vírus da Encefalite Equina Oriental, ou outros vírus pertencentes à família de alfavírus.

Os vetores de expressão de "replicon" à base de alfavírus podem ser usados na invenção. Os vetores de rep]icon podem ser usados em vários formatos, incluindo DNA, RNA, e partículas de replicon recombinantes. Tais vetores de replicon foram derivados de alfavírus que incluem, por exemplo, vírus de Sindbis (Xiong et al. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et al. (1998) J. Virol. 72:950-958;

Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4 603), Floresta Semliki virus (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; ’ Berglund, et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565), e virus da encefalite equina venezuelana (Pushko et al. (1997) 5 Virology 239:389-401). Os replicons derivados de alfavírus são geralmente bastante semelhantes nas características gerais (por exemplo, estrutura, replicação), os alfavírus individuais podem apresentar alguma propriedade particular (por exemplo, ligação ao receptor, sensibilidade a 10 interferon, e perfil de doenças) que é única. Portanto, replicons de alfavírus quiméricos feitos a partir de famílias de vírus diferentes podem também ser úteis.

OS replicons de RNA à base de Alfavírus são tipicamente RNAs de fita-(+) que conduzem à tradução de uma - 15 replicase (ou replicase-transcriptase) após à distribuição a uma célula. A replicase é traduzida como uma poliproteina, que se autocliva para fornecer um complexo de replicação que cria cópias de fita-(-) genômicas do RNA distribuído a fita-(+). Estes transcritos de fita-(-) podem 20 eles próprios ser transcritos para gerar mais cópias de RNA de origem de fita-(+), e também para gerar a transcrição subgenômi.ca que codifica o antigeno. A tradução da transcrição subgenômica conduz, assim, a expressão do antigeno in situpela célula infectada. Os replicons de alfavírus adequados podem usar uma replicase de um vírus Sindbfs, um vírus da floresta de Semliki, um vírus da encefalite equina do leste, um vírus da encefalite equina venezuelana, etc..

Um replicon de RNA, preferencialmente, compreende um 30 genoma de RNA a partir de um picornavírus, togavírus, flaviv.irus, coronavirus, paramixovirus, virus da febre amarela, ou alfavirus (por exemplo, virus Sindbis, virus da floresta de Sem.liki, virus da encefalite equina venezuelana ou virus do rio Ross), o qual foi modificado pela substituição de urn ou mais genes da proteina estrutural de uma sequência de ácido nucleico heteróloga selecionada que codifica um produto de interesse.

Um replicon preferido codifica (i) uma RNA-polimerase dependente de RNA que pode transcrever RNA do replicon e (ii) um antigeno. A polimerase pode ser um exemplo de uma replicase de al favirus compreendendo uma ou mais das proteínas de alfavirus nsPl, nsP2, nsP3 e nsP4. Embora os genomas de alfavirus naturais codifiquem proteínas de virion estruturais, em adição à poliproteina replicase não estrutural, prefere-se que o replicon não codifique as proteínas estruturais de alfavirus. Assim, um replicon preferido pode levar à produção de cópias de RNA genômico de uma célula em si, mas não à produção de RNA contendo viriões. A incapacidade de produzir esses viriões significa que, ao contrário de um alfavirus do tipo selvagem, o replicon preferido não pode perpetuar-se na forma infecciosa. As proteínas estruturais de alfavirus necessárias para a perpetuação de virus do tipo selvagem estão ausenl.esdo replicon preferido e o seu lugar é tomado pelo(s) gene(s) que codifica o antigeno de interesse, de tal modo que a transcrição subgenômica codifica o antigeno, em vez das proteínas do virião de alfavirus estrutural.

Um replicon útil de acordo com a invenção pode ter duas estruturas de leitura aberta. A primeira estrutura de leitura aberto (5') codifica uma replicase, a segunda estrutura de leitura aberta (3') codifica um antigeno. Em algumas modalidades, o RNA pode ter estruturas de leitura aberta adicionais (por exemplo, a jusante), por exemplo, para codi f icar antigenos adicionais ou para codificar polipepiá deos acessórios.

Um replicon preferido tem um cap 5' (por exemplo, uma 7-metilguanosina), que muitas vezes pode melhorar a tradução in vivo do RNA. Em algumas modalidades a sequência de 5' do replicon pode precisar ser selecionada para assegurar a compatibilidade com a replicase codificada.

Um replicon pode ter uma cauda 3' poli-A. Também pode incluir? uma sequência de reconhecimento de poli-A poll me rasei (por exemplo, AAUAAA) próxima da sua extremidade 3' .

Os replicons podem ter vários comprimentos, mas são tipicamente 5000-25000 nucleotideos de comprimento, por exemplo, 8000-15000 nucleotideos 9000-12000, ou nucleotideos.

O replicon pode ser convenientemente preparado por transcrição in vitro(IVT) . IVT pode usar um modelo (cDNA) criado e propagado na forma de plasmideo em bactérias, ou criado sinteticamente (por exemplo por sintese de genes e/ou métodos de engenharia da reação em cadeia de polimerase (PCR)). Por exemplo, uma DNA polimerase dependente de RNA (tais como o bacteriófago T7, T3 ou SP6 RNA polimerases) pode ser usada para transcrever a partir de replicon de um molde de DNA. O As reacções de adição de poli-A c nivelamento adequado podem ser usadas conforme necessário (embora o replicon de poli-A seja geralmente codificado dentro do molde de DNA). Estas RNA polimerases podem ter requisitos rigorosos para o(s) nucleotideo(s) 5' transcrito(s) e em algumas modalidades estes requisitos têm que ser combinados com os requisitos da replicase codificada, para assegurar que os RNA transcritos IVT possam funcionar eficientemente como um substrato para a sua replicase autocodifiçada. Os exemplos específicos incluem plasmideos à base de vírus Sindbis (pSIN) como pSINCP, descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n°s. 5.814.482 e 6.015.686, bem como nas Publicações Internacionais n°s. WO 97/38087, WO 99/18226 e WO 02/26209. A construção de tais replicons, em geral, é descrita nas Patentes U.S. n°s. 5.814.482 e 6.015.686.

Em outros aspectos, a molécula de RNA autorreplicante é derivada de, ou com base em, um vírus que não seja um alfavírus, preferencialmente, um vírus de RNA de fita positiva, e mais preferencialmente, um picornavírus, flavivírus, rubivírus, pestivírus, hepacivírus, calicivirus, ou coronavirus. As sequências de alfavírus de tipo selvagem adequadas são bem conhecidas e estão disponíveis a partir de depositários de sequências, "tais como a American Type Culture Collection, Rockville, Md. Exemplos representativos de alfavírus adequados incluem Aura (ATCC VR-368), vírus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR- 1240), Cabassou (ATCC VR-922), vírus Chikungunya (ATCC VR- 64, ATCC VR-1241), vírus da encefalomielite equina do oeste (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), vírus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), vírus Mayaro (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), vírus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), vírus Pixuna (ATCC VR- 372,  ATCC V.R-1245), virus Ross River (ATCC VR-373, ATCC VR- 1246), Semliki Forest (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), virus de Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalomielite 5 equina venezuelana (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR -532), encefalomielite equine ociαental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR- 1252), Whataroa (ATCC VR-926), e Y-62-33 (ATCC VR-375).

As moléculas de RNA autorreplicante da presente invenção são maiores do que outros tipos de RNA (por exemplo, mRNA) que foram preparados usando os nucleotideos modificados. Normalmente, as moléculas de RNA autorreplicante da invenção contêm pelo menos cerca de 4kb. /

Por exemplo, o RNA autorreplicante pode conter, pelo menos 15 cerca oe 5 kb, pelo menos cerca de 6kb, pelo menos cerca de 7kb, pelo menos cerca de 8kb, pelo menos cerca de 9kb, pelo menos cerca de 10kb, pelo menos cerca de 11KB, pelo menos cerca de 12kb ou' mais de 12kb. Em certos exemplos, o RNA autorreplicante é de cerca de 4kb a cerca de 12kb, cerca de 5kb a cerca de 12kb, cerca de βkb a cerca de 12kb, cerca de 7kb a cerca de 12kb, cerca de 8kb a cerca de 12kb, cerca de 9kb a cerca de 12kb, cerca de 10kb a cerca de 12kb, cerca de 11 KB a cerca de 12kb, cerca de 5kb a cerca de 11 kB, cerca de 5kb a cerca de 10kb, cerca de 5kb a cerca de 9kb, cerca de 5kb a cerca de 8kb, cerca de 5kb a cerca de 7kb, cerca de 5kb a cerca de βkb, cerca de βkb a cerca de 12kb, cerca de βkb a cerca de llkB, cerca de βkb a cerca de 10kB, cercei de βkb a cerca de 9kb, cerca de βkb a cerca de 8kb, cerca de βkb a cerca de 7kb, cerca de 7kb a cerca de llkB, sobre 7kb a cerca de 10kb, cerca de 7kb a cerca de 9kb, cerca ao / kb a cerca de 8kb, cerca de 8kb a cerca de llkB, cerca de 8kb a cerca de 10kb, cerca de 8kb a cerca de 9kb, cerca de 9kb a cerca de llkB, sobre 9kb a cerca de 10kB, ou cerca de 10kB a cerca de 1 LKB.

As moléculas de RNA autorreplicante da presente invenção podem compreender um ou mais tipos de nucleotideos modificados (por exemplo, pseudouridina, N6-metiladenosina, 5-meti l.citidina, 5-metiluridina) .

A molécula de RNA autorreplicante pode codificar um antigeno de polipeptideo heterólogo único ou, opciona.Imente, dois ou mais antigenos de polipeptideo heterólogos ligados entre si de um modo que cada uma das sequências mantenha a sua identidade (por exemplo, ligadas em série), quando expressas como uma sequência de aminoácidos. Os polipeptideos heterólogos gerados a partir do RNA autorreplicante podem depois ser produzidos como um polipeptideo de fusão ou construídos de modo a resultar em diferentes sequências de polipeptideos ou peptideos.

O RNA autorreplicante da invenção pode codificar um ou mais antigenos de polipeptideos que contêm uma variedade de epitopos. Preferencialmente os epitopos capazes de induzir ou uma resposta de células-T auxiliares ou uma resposta de célu Las-l' citotóxicas, ou ambos.

As moléculas de RNA autorreplicante aqui descritas podem ser construídas para expressar várias sequências de nucleotioeos, a partir de duas ou mais estruturas de leitura aberta, permitindo, assim, a coexpressão das proteínas, tais como dois ou mais antigenos em conjunto com citocinas ou outros imunomoduladores, o que pode aumentar a geração de uma resposta imune. Tal molécula de RNA autorrepiicante pode ser particularmente útil, por exemplo, na produção de vários produtos de gene (por exemplo, proteínas), ao mesmo tempo, por exemplo, como uma vacina bivaLente ou muJtivalente.

As moléculas de RNA autorreplicante da invenção podem ser preparadas usando qualquer método adequado. Vários métodos adequados são conhecidos na técnica para a produção de moléculas de RNA que contêm os nucleotideos modificados. Por exemplo, uma molécula de RNA autorreplicante que contém nucleotideos modificados pode ser preparada por transcrição (por exemplo, a transcrição in vitro)de um DNA que codifica a molécula de RNA autorreplicante usando uma DNA polimerase dependente de RNA adequada, tal como RNA polimerase do fago T7, RNA polimerase do fago SP6, RNA polimerase do fago T3, e similares, ou mutantes destas polirnerases que permitem a incorporação eficiente de nucleotideos modificados em moléculas de RNA. A reação de transcrição irá conter nucleotideos e nucleotideos modificados, e outros componentes que suportam a atividade da polimerase selecionada, tal como um tampão adequado, e sais adequados. A incorporação de análogos de nucleotideos em um RNA autorreplicante pode ser construída, por exemplo, para alterar a estabilidade de tais moléculas de RNA, para aumentar a resistência contra RNases, para estabelecer a replicação após introdução em células hospedeiras apropriadas ("1nfectividade" do RNA), e/ou induzir ou reduzir respostas imunes inatas e adaptativas.

Os métodos sintéticos adequados podem ser usados individualmente, ou em combinação com um ou mais de outros métodos (por exemplo, tecnologia de DNA ou RNA recombinante) , para produzir uma molécula de RNA autorreplicante da presente invenção. Os métodos adequados para a síntese de novo são bem conhecidos na técnica e podem ser adaptados para aplicações especificas. Os métodos exemplares incluem, por exemplo, sintese quimica, usando grupos de proteção adequados, tais como a CEM (Masuda et al., (2007) Nucleic Acids Symposium Series 57:3-4), o método da fosforamidite β-cianoetil (Beaucage S L et al. (1981) Tetrahedron Lett22:1859); método de nucleosideo H- fosfonato (Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett27:4051- 4;. Froehler B C et al. (1986) Nucl Acid Res14:5399-407; Garegg. !?’ ou al (1986) Tetrahedron Lett27:4055-8; Gaffney B L et al. (1988) Tetrahedron Lett29:2619-22). Estes produtos químicos podem ser realizados ou adaptados para uso com sintetizadores de ácidos nucleicos automatizados que se encontram comercialmente disponíveis. Os métodos sintéticos adicionais adequados estão descritos em Uhlmann et al. (1990) Chem Rev 90:544-84, e Goodchild J (1990) Biocong uga te Chem 1:16'5. A síntese do ácido nucleico também pode sor realizada usando métodos recombinantes adequados, que são bem conhecidos e convencionais na técnica, incluindo a clonagem, processamento e/ou expressão de polinucleotídeos e produtos de genes codificados por esses polinucleotídeos. O embaramento de DNA por fragmentação aleatória e reconstituição por PCR dos fragmentos de genes e polinucleotídeos sintéticos são exemplos de técnicas conhecidas que podem ser usadas para projetar e construir as sequências de polinucleotídeos. A mutagênese dirigida pode sor usada para alterar os ácidos nucleicos e as proteínas codificadas, por exemplo, para inserir novos sítios de restrição, alterar os padrões de glicosilação, alterar preferência de códons, produzir variantes de processamento, introduzir mutações e similares. Os métodos adequados para a transcrição, tradução e expressão de sequências de ácidos nucleicos são conhecidos e convencionais na técnica. (Ver, em geral, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish Assoc & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., DC, Ch. 3, 1986;. Bitter, et al., em Methods in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds Strathern et al, Cold Spring Harbor Press, Vols I e II, 1 982, e Sarnbrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Press, 1989).

A presença e/ou quantidade de um ou mais nucleotideos modificados em uma molécula de RNA autorreplicante pode ser determinada usando qualquer método adequado. Por exemplo, um RNA autorreplicante pode ser digerido para monofosfatos (por exemplo, usando nuclease PI) e desfosforilado (por exemplo, usando uma fosfatase apropriada, tal como CIAP), e os núcleosídeos resultantes analisados por HPLC de fase reversa (por exemplo, usando uma coluna ODS-AQ empacotada com YMC (5 micron, 4,6 x 250 mm) e eluir usando um gradiente, B a 30% (0-5 min) até B a 100% (5-13 min) e a B a 100% (13-40) min, Taxa de fluxo (0,7 ml/min) , detecção por UV (comprimento de onda: 260 nm), temperatura da coluna (30°C) . O tampão A (ácido acético 20 mM - acetato de amónio pH 3,5), tampão B (ácido acético 20 mM - acetato de amónio pH 3,5/metanol. [90/10])).

Opciona I mente, as moléculas de RNA autorreplicante da  presente invenção podem incluir um ou mais nucleotideos modificados de modo que a molécula de RNA autorreplicante vai ter menos atividade imunomoduladora no momento da introdução ou entrada em uma célula hospedeira (por 5 exemplo, uma célula humana) em comparação com a molécula de RNA autorreplicante correspondente que não contém nucleotideos modificados.

Se desejado, as moléculas de RNA autorreplicante podem ser rastreadas ou analisadas para confirmar as suas 10 propriedades terapêuticas e profiláticas usando vários métodos do teste in vitro ou in vivo que são conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, as vacinas que compreendem molécula de RNA autorreplicante podem ser testadas quanto ao seu efeito sobre a indução da 15 proliferação ou função efetora de linfócitos do tipo específico de interesse, por exemplo, células-B, células-T, linhagens de células-T e clones de células T. Por exemplo, as células do baço de camundongos imunizados podem ser isoladas e capacitar os linfócitos T citotóxicos para lisar 20 células-alvos autólogas que contêm uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um antigeno de polipeptideo. Além disso, a diferenciação de células-T auxiliares pode ser analisada através da medição da proliferação ou produção de citocinas TH1 (IL-2 e IFN-y) e/ou TH2 (IL-4 e 25 IL-5) por líLTSA, quer diretamente por células T CD4+ por coloração citoplasmática de citocinas e citometria de fluxo.

As moléculas de RNA autorreplicante que codificam um antigeno de polipeptideo também podem ser testadas quanto à 30 capacidade de induzir respostas imunes humorais, como evidenciado, por exemplo, por indução da produção de células B de anticorpos específicos para um antigeno de interesse. Estes ensaios podem ser realizados usando, por exemplo, linfócitos B periféricos de indivíduos imunizados.

Tais métodos de ensaio são conhecidos dos versados na técnica. Outros ensaios que podem ser usados para caracterizar as moléculas de RNA autorreplicante da presente invenção podem envolver a detecção de expressão do antigeno codificado pelas células alvos. Por exemplo, o FACS pode ser usado para detectar a expressão do antigen na superfície da célula ou no meio intracelular. Outra vantagem de seleção por FACS é que se pode classificar os diferentes níveis de expressão já que, por vezes, a expressão mais baixa pode ser desejada. Outro método adequado para a identificação de células que expressam um antigeno particular envolve o panningusando anticorpos monoclonais em uma placa ou a captura usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos monoclonais.

B. Antigenos

Em certas modalidades, a molécula carregada negativamente aqui descrita é uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de RNA) que codifica um antigeno. Antigenos adequados incluem, mas não estão limitados a, urn antigeno bactertiano, um antigeno virai, um antigeno fúngico, um antigeno de protozoário, um antigeno de piar, ta, um antigeno do câncer, ou uma combinação dos mesmos.

Antigenos adequados incluem proteínas e peptídeos a partir de um agente patogênico como um vírus, bactéria, fungo, protozoário, planta ou a partir de um tumor.

Antigenos virais e imunogenes que podem ser codificados pela molécula de RNA autorreplicante incluem, mas não estão limicados a, proteínas e peptideos a partir de um ortomixovirus, tal como Influenza A, B e C; Virus Paramyxov.i ridae ( da peste bovina), tais como Pneumoviruses (RSV), Paramixovirus (PIV), Metapneumovirus e Morbilliviruses (por exemplo, virus do sarampo); Pneumoviruses, tais como o virus sincicial respiratório (RSV), vírus respiratório sincicial bovino, virus da pneumonia de camundongos, e virus da rinotraqueite dos Perus; Paramixovirus, tais como o virus da parainfluenza tipos 1-4 (PIV), vírus da caxumba, vírus Sendai, vírus Simian 5, virus da parainfluenza bovina, Nipahvírus, Henipavírus e vírus da doença de Newcastle; Poxviridae, incluindo um Ortopoxvírus como Varíola vera (incluindo, mas não limitado a, Varíola maior e Varíola menor);

Metapneumovirus, como metapneumovirus humano (hMPV) e metapneumovirus aviário (aMPV); Morbilliviruses, tais como o Sarampo; Picornavírus, como Enterovirus, Rinovírus, Heparnavírus, Parecovírus, Cardiovírus e Aphthovírus; Enterovíruseses, como Poliovirus tipos de 1, 2 ou 3, vírus de Coxsackie A tipos 1 a 22 e 24, vírus de Coxsackie B tipos 1 a 6, Echovirus (ECHO) tipos 1 a 9, 11 a 27 e 29 a 34 e Ennorovirus 68 a 71, Buniavírus, incluindo um Ortobuciavírus como a vírus da encefalite da Califórnia, um Phlebovírus, como o vírus da febre do Vale de Rift; uma Nairovú rus, como o vírus da febre hemorrágica de Crimeia- Congo; Heparnavíruses, tais como, vírus da hepatite A (HAV); Togavíruses (rubéola) , tal como um Rubivírus, um Alfavírus, ou um Arterivírus; Flavivírus, tal como vírus da encefalíte por carrapato (TBE), Dengue (tipos 1, 2, 3 ou 4), vírus da febre amarela, vírus da encefalíte Japonesa, vírus da Floresta, de Kyasanur, vírus da encefalíte do Nilo Ocicentai, vírus da encefalíte de St. Louis, vírus da encefalíte russa de primavera-verão, vírus da encefalíte Powassan; Pestivírus, como a diarréia virai bovina (BVDV), febre suína clássica (CSFV) ou doença de Fronteiras (BDV); Hepadnavíruses, tais como vírus da hepatite B, vírus da hepatite C; Rhabdovíruses, como um Lyssavirus (vírus da raiva) e Vesiculovirus (VSV), Caliciviridae, tais como vírus Norwalk c vírus tipo Norwalk, como o Vírus Havaí e Vírus da Montanha de Neve; Coronavirus, como SARS, o coronavirus respiratório humano, bronquite infecciosa das aves (IBV) , vírus da hepatite de camundongo (MHV) ; e vírus da gastroenterite da Porcina transmissível (TGEV); retrovirus tais como um Oncovirus, um Lentivírus ou um Spumav.írus; Reovírus, tal como um Ortoreoví rus, um rotavirus, um Orbivírus, ou um Coltivírus; Parvoviruses; como o Parvovirus B19; vírus da hepatite delta (HDV), vírus da hepatite E (HEV), vírus da hepatite G (HGV); herpesvirus humanos, tais como, Vírus Herpes Simplex (HSV), vírus varicela-zoster (VZV), vírus de Epstein-Barr (EBV) Citomegalovírus (CMV), Herpesvirus Humano 6 (HHV6), herpesvirus humano 7 (HHV7), e Herpesvirus Humano 8 (HHV8); Papovavirus, uais como o vírus do papiloma bovino e PoLiomavíras, Adenovirus e Arenavirus.

Em algemas modalidades, o antígeno provoca uma resposta imune contra um vírus que infecta peixes, tais como: o vírus da anemia infecciosa do salmão (ISAV), virus da doença pancreática do salmão (SPDV), vírus da necrose pancreática infecciosa (IPNV), virus do bagre do canal (CCV), vírus da doença linfocitica de peixe (FLDV), virus da necrose infecciosa hematopoiética (IHNV), herpesvirus de koi, vírus como Picorna de salmão (também conhecido como vírus como Picorra de salmão do Atlântico), vírus do salmão do litoral (LSV), rotavirus do salmão do Atlântico (ASR), vírus da doença da truta de morango (TSD) , vírus do tumor salmão coho (CSTV), ou vírus da septicemia hemorrágica virai (VHS).

Em algumas modalidades o antigeno provoca uma resposta imune contra um parasita do gênero Plasmodium, tais como P. falciparum, P. vivax, P. ovaleou P.malariae. Assim, a invenção pode ser usada para a imunização contra a malária. Em aigumas modalidades o antigeno provoca uma resposta imune: contra um parasita da família Caligidae, particularmente aqueles do gênero Lepeophtheirus e Caligus, por exemplo, piolhos do mar, tais como Lepeophtheirus salmon is ou Caligus rogercresseyi.

Os antigenos e imunogenes bacterianos que podem ser codificados pela molécula de RNA autorreplicante incluem, mas não estão limitados a, proteínas e peptídeos de Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Burkholderia sp.(Por exemplo, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei e Burkholderia cepacia), Staphyl.ococcus aureus, Staphylococcus epiderme, Haemophilus influenzae, Clostridium tetani(Tétano), Clostridium perfrIngens, Clostridium botulinums (Botulismo), Cornynoeactoriurn diphtheriae(Difteria), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii,

Brucella sp.(Por exemplo, B. abortus, B. canis, B. melitensi s, B. neotomae, B. ovis, B. suis e B. pinnipediae), Francisella sp.(Por exemplo, F. novicida, F. tularensis e F. philomiragia), Streptococcus agalactiae, Neiser ria gonorrhoeas, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum(sífilis), Haemophilus ducreyi, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Helicobacter pylori, Staphylococcus saprophyticus, Yersinia enterocolitica, E. coli (como E. colienterotoxigênicas (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), E. colidifusamente aderente (DAEC), E. colienteropatogênica (EPEC), E. colipatogênica extraintestinal (ExPEC; tais como E. coliuropatogênica (UPEC) e E. coliassociada a meningite/sepsia (MNEC)), e/ou de E. collenterohemorrágica (EHEC), Bacillus anthracis (antraz), Yersinia pestis(peste), Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia, Listeria monocytogenes, Chlamydia pneumoniae, Vibrio cholerae, Salmonella typhi(febre tifóide) , Borre lia Burgdorfer, Porphyromonas gingivalis, Klebsiella, Mycoplasma, pneumoniae, etc..

Os antigenos fúngicos e imunogenes que podem ser codificados pela molécula de RNA autorreplicante incluem, mas não estão limitados a, proteínas e peptídeos de Dermatophytres, incluindo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distor turn, MLcrosporum equinum, Microsporum gypson, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophytoh gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton qui nckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoonl o l.ni, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, e/ou Trichophyton faviforme,ou a partir de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, BlasLoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusej. , Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neofdrmans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsula turn, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoo spp., Septata intestinalis e Enterocytozoon bieneusi; os menos comuns são Brachiola spp., Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp., Paracoccidioides bras iliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penici.llium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wanglella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Coni d:i obol us spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp., MortiereIla spp., Çunninghamella spp., Saksenaea spp., Alternaria spp., Curvularia spp., Helminthosporium spp., Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Monolinla spp., Rhizoctonia spp., Paecilomyces spp., Pithomyces spp. e Cladosporium spp..

Os antigenos e imunogenes de protozoários que podem ser codificados pela molécula de RNA autorreplicante incluem, mas não estão limitados a, proteinas e peptideos de Entamoeba histolitica, Giardia lambli, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensise Toxoplasma.

Antigenos e imunogenes de plantas que podem ser codificados pela molécula de RNA autorreplicante incluem, mas não estão limitados a, proteinas e peptideos de Ricinus communis.

Antigenos adequados incluem proteinas e peptideos a pact.Lr de um vírus tal como, por exemplo, o vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus do herpes simplex (HSV), citomegalovírus (CMV), vírus da influenza (gripe), vírus sincicial respiratório (RSV), parvovorus, norovirus, vírus do papiloma humano (HPV), rinovirus, vírus da febre amarela, vírus da raiva, vírus da febre de Dengue, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da rubéola, vírus da varicela zoster, enterovirus (por exemplo, enterovirus 71), vírus ebola, e vírus da diarreia bovina. Preferencialmente, a substância antigênica é selecionada a partir do grupo consistindo em glicoproteína gD de HSV, HIV glicoproteína gpl20 de HIV, glicoproteína de gp 40 de HIV, p55 gag de HIV, e os polipeptídeos das regiões de po 1. e tat. Em outras modalidades preferidas da invenção, o antigeno é uma proteína ou peptídeo derivado de uma bactéria, tal como, por exemplo, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, Vibrio cholerae(cólera), C. diphtherias(difteria), C. tetani(toxóide), Neisseria meningitidis, B. pertussis, Mycobacterium tuberculosis, e  similares.

Os antigenos de HIV que podem ser codificados pelas moléculas de RNA autorreplicante da presente invenção são descritos nos Pedidos U.S. n°.de série 490.858, depositado 09 março de 1990, e Pedido Europeu publicado número 181150 (14 de maio de 1986), bem como os Pedidos U.S. n°s. 60/168.471 e 09/475.515 e 09/475.504, e 09/610.313, cujas descrições são aqui incorporadas por referência na sua total idade.

Os antigenos de Citomegalovirus que podem ser codificados pelas moléculas de RNA autorreplicante da presente invenção são descritos na Patente U.S. n° . 4.689.225, Pedido U.S. n°. de série 367.363, depositado 16 de junho de 1989 e a Publicação PCT WO 89/07143, cujas descrições são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. hepatite C que podem ser codificados pelas moléculas de RNA autorreplicante da presente invenção são descritos no PCT/US88/04125, Pedido Europeu publicado número 328216 (31 de maio de 1989), Publicação do pedido Japonês número 1-500565 depositado em 18 de novembro de 1988, Pedido Canadense 583.561, e EPO 388.232, as divulgações dos quais sendo aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Um conjunto diferente de antigenos de HCV é descrito no pedido de patente Europeu 90/302866.0, depositado em 16 de março de 1990, e no Pedido U.S. n. ° . de série 4 56.637, depositado em 21 de dezembro de 1989 c PCT/US90/01348, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Fim algumas modalidades, o antigeno é derivado de um alérgeno, tais como alérgenos do pólen (alérgenos de pólen de árvores, de ervas, de ervas daninhas, e de grama); alérgenos de insetos ou aracnídeos (alérgenos de inalantes, salivas e veneno, por exemplo, ácaros, alérgenos, por exemplo, alérgenos de barata e mosquitos, alérgenos de veneno de hymenopthera); alérgenos de pêlos e caspa animal (por exemplo, cão, gato, cavalo, rato, camundongo, etc.), e alérgenos alimentares (por exemplo, gliadina). Alérgenos de pólen importantes de árvores, gramineas e ervas são como originários das ordens taxonômicas de Fagales, Oleales, Pinales e Piatanaceae, incluindo, mas não limitados a, vidoeiro (Bécu.la), amieiros (Alnus), avelã (Corylus), carpa (Carpinas) e oliveira (Olea), cedro (Cryptomeria e Juniperus), plátano (Platanus), a ordem de Poales incluindo gramineas do gênero Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale, e Sorgo, as ordens de Asterales e Urticales incluindo ervas do gênero Ambrosia, Artemisia, e Parietaria. Outros alérgenos de inalação importantes são os de ácaros dos gêneros Dermatophagoides e Euroglyphus, armazenamento de ácaros, por exemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus e Tyrophagus, os de baratas, mosquitos e pulgas, por exemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus e Ctenocepphajides, e os alérgenos de mamiferos, como cães, gatos e cavalos, tais como provenientes de veneno de picadas ou mordidas de insetos, como os de ordem taxonômica de Hymenoptera, incluindo as abelhas (Apidae), vespas (Vespictea) e formigas (Formicoidae).

Em cenas modalidades, um imunogene ou antigeno de tumor, ou imunogene ou antigeno de câncer, pode ser codificado peia molécula de RNA autorreplicante. Em certas modalidades, os antigenos e os imunogenes tumorais são antigenos contendo peptideos de tumor, tais como um antigeno tumoral de polipeptideo ou antigenos tumorais de glicoproteina.

Imunogenes e antigenos tumorais adequados para uso na presente invenção incluem uma grande variedade de moléculas, tais como (a) antigenos tumorais contendo polipeptideos, incluindo polipeptideos (que pode variar, por exemplo, de 8-20 aminoácidos de comprimento, embora comprimentos de fora desta faixa também sejam comuns), lipopolipeptideos e glicoproteinas.

Em certas modalidades, os imunogenes do tumor são, por exemplo, (a) moléculas de comprimento total associadas com as células cancerosas, (b) homólogos e formas modificadas dos mesmos, incluindo moléculas com porções deletadas, adicionadas e/ou substituídas, e (c) fragmentos dos mesmos. Imunogenes tumorais incluem, por exemplo, antigenos de restrição de classe I reconhecidos por linfócitos CD8+ ou antigenos restritos de classe II reconhecidos por linfócitos CD4-I-.

Em certas modalidades, os imunogenes tumorais incluem, mas não estão limitados a, (a) antigenos de câncer dos testículos, tais como NY-ESO-1, SSX2, SCP1, bem como polipeptideos da familia RAGE, BAGE GAGE e MAGE, por exemplo , GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, e MAGE-12 (o qual pode ser usado, por exemplo, para tratar o melanoma, tumores de pulmão, da cabeça e pescoço, NSCLC, da mama, gastrointestinal, e bexiga), (b) antigenos mutados, por exemplo, p53 (associados com diversos tumores sólidos, por exemplo,  colorretai, do pulmão, da cabeça e do pescoço), p21/Ras (associado com, por exemplo, melanoma, câncer do pâncreas e câncer colorretai), CDK4 (associada com, por exemplo, melanoma), MUM1 (associada, por exemplo, melanoma), caspase-8 (associado com, por exemplo, câncer da cabeça e pescoço), CIA 0205 (associado com, por exemplo, câncer da bexiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (associado com, por exemplo, melanoma), TCR (associado com, por exemplo, linfoma do céLulas-T não-Hodgkins), BCR-abl (associado com, por exemplo, leucemia mielógena crônica), triosefosfato isomerase, KIA 0205, CDC-27, e LDLR-FUT, (c) antigenos superexpressos, por exemplo, Galectina 4 (associada com, por exemplo, câncer colorretal), Galectina 9 (associada com, por exemplo, doença de Hodgkins), proteinase 3 (associada, por exemplo, à leucemia mielogênica crônica), WT I (associada, por exemplo, com diferentes leucemias), aniorase carbônica (associado com, por exemplo, cânce renal), aldolase A (associado, por exemplo, a câncer do pulmão), FRAME (associada, por exemplo, a melanoma), HER- 2/neu (associada a, por exemplo, câncer da mama, pulmão, cólon e do ovário), alfa-fetoproteina (associada, por exemplo, a hepatoma), KSA (associado com, por exemplo, câncer coiorretal), gastrina (associada, por exemplo, a câncer gástrico e pancreático), proteina telomerase catalítica, MUC-1 (associada, por exemplo, a câncer de mama, do ovário), G-250 (associado com, por exemplo, carcinoma de célula renal), p53 (associado, por exemplo, a câncer de mama, de cólon), e antigeno carcinoembriônico (associado, por exemplo, a câncer da mama, câncer do pulmão, e cânceres do trato gastrointestinal, tais como câncer colorretal), (d) antigenos compartilhados, por exemplo, antigenos de diferenciação de melanoma- melanócito tais como MART-1 /Melan A, gplOO, MC1R, receptor hormonal estimulante de melanócito, tirosinase, proteina-l/TRPl relacionada com tirosinase e proteina-2/TRP2 relacionada com tirosinase (associada, por exemplo, a melanoma), (e) antigenos associados a próstata, tais como o PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, associadas com, por exemplo, câncer de próstata, (f) idiotipos de imunoglobulina (associados a mieloma e linfoma de células B, por exemplo).

Em certas modalidades, os imunogenes de tumores incluem, mas não estão limitados a, antigenos pl5, Hom/Mel- 40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antigenos do virus de Epstein Barr, EBNA, Papilomavirus Humano (HPV), incluindo E6 e E7, antigenos do virus da hepatite B e C, antigenos do virus linfotrópico de células-T humanas, TSP- 180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 39-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 7'91 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29/BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA- 50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de ligação Mac-2\proteina-C associada a cicl o f'i 1 L na ) , TAAL6, TAG72, TLP, TPS, e similares.

C. Solução aquosa para a molécula carregada negativamente

A molécula carregada negativamente (tais como RNA) é geralmente fornecida na forma de uma solução aquosa, ou em uma forma que pode ser facilmente dissolvida em uma solução aquosa (por exemplo, liofilizada). A solução aquosa pode ser água, ou uma solução aquosa que compreende um sal (por exemplo, NaCl), um tampão (por exemplo, um tampão de citrato), um agente de ajuste da osmolalidade ou de tonicidade (por exemplo, um sacarideo), um polímero, um surfactante, ou uma combinação dos mesmos. Se a formulação é pretendida para administração in vivo, é preferível que a solução aquosa seja um tampão fisiologicamente aceitável que mantém um pH que é compatível com condições fisiológicas normais. Além disso, em certos casos, pode ser desejável manter o pH a um nível particular de modo a assegurar a estabilidade de certos componentes da formulação.

Por exemplo, pode ser desejável preparar uma solução aquosa que é isotônica e/ou isosmótica. Soluções hipertônicas e hipotônicas, por vezes, podem provocar complicações e efeitos indesejáveis quando injetadas, tais como inchaço após a administração ou a absorção rápida da composição devido a concentrações de íons diferenciais entre a composição e os fluidos fisiológicos. Para controlar a tonicidade, a emulsão pode compreender um sal fisiológico, tal como um sal de sódio. Cloreto de sódio (NaCl), por exemplo, pode ser usado a cerca de 0,9% (p/v) (solução salina fisiológica). Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, di-hidrogenofosfato de potássio, fosfato dissódico desidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.. Em uma modalidade exemplar, a solução aquosa compreende NaCl 10 mM e outros sais ou agentes de tonicidade não iônicos. Como aqui descrito, agentes de tonicidade não iônicos também podem ser usados para controlar a tonicidade.

A solução aquosa pode ser tamponada. Qualquer tampão fisiologicamente aceitável pode ser usado na presente invenção, tais como tampões de citrato, tampões de fosfato, tampões de acetato, tampão de succinato, tampões Tris, 5 tampões do bicarbonato, tampões de carbonato, ou similares.

O pH da solução aquosa será, preferencialmente, entre 6,0- 8,0, preferencialmente, cerca de 6,2 e cerca de 6,8. Em alguns casos, certa quantidade de sal pode ser incluida no tampão. Em outros casos, o sal no tampão pode interferir 10 com a complexação da molécula carregada negativamente para a partícula de emulsão, portanto, é evitada.

A solução aquosa pode também compreender componentes adicionais, tais como as moléculas que alteram a osmolaridadc da solução aquosa ou de moléculas que 15 estabilizam a molécula carregada negativamente após complexação. Por exemplo, a osmolaridade pode ser ajustada usando agentes de tonificação não iônicos, que são geralmente carboidratos, mas podem também ser polímeros. (Ver, por exemplo, Voet e Voet (1990) Biochemistry (John 20 Wiley S Sons, New York) Exemplos de agentes de tonicidade não iônicos incluem açúcares (por exemplo, a trealose, sacarose, dextrose, frutose, palatinose reduzida, etc.), álcoois de açúcares (tais como manitol, sorbitol, xilitol, eritrítol, lactitol, glicerol, maltitol, etc.), e 25 combinações dos mesmos. Se desejado, um polímero não iônico (por exemplo, um poli (alquil glicol) tal como polietileno glicol, pol ipropileno glicol, ou polibutileno glicol) ou um surfactante não iônico podem ser usadas. Estes tipos de agentes, em especial o açúcar e os álcoois de açúcar, 30 também são críoprotetores que podem proteger o RNA, e outras moléculas carregadas negativamente quando liofilizados. Em modalidades exemplificativas, o tampão compreende de cerca de 560 nM a 600 mM de trealose, sacarose, sorbitol, ou dextrose.

Err. alguns casos, pode ser preferível preparar uma solução aquosa que compreende a molécula carregada negativamente como uma solução hipertônica, e preparar a emulsão catiônica usando a água não adulterada ou um tampão hipotônico. Quando a emulsão e a molécula carregada negativamente são combinadas, a mistura torna-se isotônica. Por exemplo, uma solução aquosa contendo o RNA pode ser uma solução 2X hipertônica, e a emulsão catiônica pode ser preparada usando tampão de citrato lOmM. Quando a solução de RNA e a emulsão são misturadas a razão de 1:1 (v/v), a composação torna-se isotônica. Com base em quantidades relativas desejadas da emulsão para a solução aquosa que compreende a molécula carregada negativamente (por exemplo, mistura 1:1 (v/v), mistura 2:1 (v/v), mistura 1:2 (v/v), etc.), pode-se facilmente determinar a tonicidade da solução aquosa que é necessária a fim de conseguir uma mistura isotônica. l)o mesmo modo, as composições que têm a osmolalidade fisiológica podem ser desejáveis para a administração in vivo. Z\ osmolaridade fisiológica é de cerca de 255 mOsm/kg água a cerca de 315 mOsm/kg de água. Por vezes, pode ser preferível, preparar uma solução aquosa que compreende a molécula carregada negativamente como uma solução hiperosmolar, e preparar a emulsão catiônica usando água ou um tampão puro hipo-osmolar. Quando a emulsão e a molécula carregada negativamente são combinadas, a osmolaridade fisiológica é alcançada. Com base em quantidades relativas desejadas da emulsão para a solução aquosa que compreende a molécula carregada negativamente (por exemplo, mistura 1:1 (v/v), mistura 2:1 (v/v), mistura 1:2 (v/v), etc.), pode-se facilmente determinar a osmolalidade da solução aquosa que é necessária a fim de conseguir uma mistura iso-osmolar.

Em certas modalidades, a solução aquosa que compreende a molécula carregada negativamente pode compreender ainda um polímero ou um surfactante, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade exemplar, a emulsão de óleo em água contém um polaxâmero. Em particular, os inventores observaram que a adição de Pluronic® F 127 à solução aquosa de RNA antes da complexação a partículas da emulsão catiônica levou a uma maior estabilidade e resistência à RNase da molécula de RNA aumentada. A adição de Pluronic F 127 para a solução aquosa de RNA também foi observada como reduzindo o tamanho das partículas do complexo de RNA/CNE. Os polímeros de poloxâmero podem também facilitar a descomplexação/liberação apropriada da molécula de RNA, evitar a agregação das partículas da emulsão, e têm efeito imunomodulador. Outros polímeros que podem ser usados Incluem, por exemplo, Pluronic® F68 ou PEG300.

Em a 1 i.ernat:i va, ou em adição, a solução aquosa que compreenoe a molécula carregada negativamente pode compreender de cerca de 0,05% a cerca de 20% (p/v) de polímero. Por exemplo, a emulsão de óleo em água catiônica pode compreender um polímero (por exemplo, um poloxâmero Pluronic® F127 tal como, Pluronic® F68, ou PEG300), de cerca de 0,05% a cerca de 10% (p/v), tal como 0,05%, 0,5%, 1%, ou 51.

O sistema tampão pode compreender qualquer combinação de duas ou mais moléculas descritas acima (sal, tampão sacarídeo, polimero, etc.) Em uma modalidade preferida, o tampão é composto por sacarose 560 mM, NaCl 20 mM, e citrato 2 mM, que pode ser misturado com um óleo catiônico na emu!são de água descrita na presente invenção para produzir uma fase aquosa final que compreende sacarose 280 mM, NaCl 10 mM e citrato 1 mM.

5. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de preparação de uma composição que compreende uma molécula carregada negativamente complexada com uma particula de uma emulsão de óleo em água catiônica, que compreende: a preparação de uma emulsão de óleo em água em que a emulsão catiônica compreende: (1) de cerca de 0,2% a cerca de 20% (v/v) de óleo (2), de cerca de 0,01 a cerca de 2,5%) de surfactante (v/v), e (3) um lipideo catiônico; e adição da molécula carregada negativamente para a emulsão de óleo em água catiônica de modo que a molécula carregada negativamente complexa com a particula da emulsão.

Um método exemplar para gerar a emulsão de óleo em água catiônica é por um processo que compreende: (1) combinar o óleo e o lipideo catiônico para formar a fase oleosa da emulsão, (2) fornecer uma solução aquosa para formar a fase aquosa da emulsão, e (3) dispersar a fase oleosa na fase aquosa, por exemplo, por homogeneização. A homogeneização pode ser realizada de qualquer maneira adequada, por exemplo, usando um homogeneizador comercial (por exemplo, homogeneizador IKA T25, disponível na VWR International (West Chester, PA)).

O Jipjdeo catiônico pode ser dissolvido em um solvente adequado, tal corno o clorofórmio (CHCI3) , diclorometano (DCM) , etar.ol, acetona, tetra-hidrofurano (THF) , 2,2,2 tr 1 f luoroeta.no]., acetonitrila, acetato de etila, hexano, dimeti Iformamida (DMF), dimetil sulfóxido (DMSO), etc., e adicionado diretamente ao componente de óleo da emulsão. Alternativamente, o lipideo catiônico pode ser adicionado a um solvente adequado para formar uma suspensão de lipossomas, em seguida, a suspensão de lipossomas pode ser adicionada ao componente de óleo da emulsão. 0 lipideo catiônico pode também ser dissolvido diretamente no óleo.

Pode ser desejável aquecer o óleo a uma temperatura entre cerca de 30°C a cerca de 65°C para facilitar a dissolução do lipideo.

A quantidade desejada do lipideo catiônico (por exemplo, DOTAP) pode ser medida e/ou dissolvida em um solvente, em água ou diretamente em óleo para se atingir uma concentração final desejada, como descrito e exempt 1 f içado aqui .

Os solventes, tais como o clorofórmio (CHCI3) ou diclorometano (DCM), podem ser removidos a partir da fase oleosa, por exemplo, por evaporação, antes de se combinar a fase aquosa e a fase oleosa, ou antes da homogeneização. Alternativamente, nos casos em que a solubilidade lipidica pode ser um problema, uma emulsão primária pode ser feita com o solvente (por exemplo, DCM), ainda na fase oleosa. Em tais casos, o solvente pode ser removido (por exemplo, deixa-se evaporar) a partir da emulsão primária antes de uma homogeneização secundária.

Se a emulsão compreende um ou mais surfactantes, o(s) surfactante(s) pode ser incluído na fase oleosa ou na fase aquosa de acordo com a prática convencional na técnica. Por exemplo, SPAN85 pode ser dissolvido na fase oleosa (por exeripi.o, esqualeno), e Tween 80 pode ser dissolvido na fase aquosa (por exemplo, em um tampão de citrato).

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de preparação de uma composição que compreende uma molécula com carregada negativamente (por exemplo, RNA) complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, que compreende: (i) fornecer uma emulsão de óleo em água catiônica, lai como aqui descrito, (ii) fornecer uma solução aquosa que compreende a molécula carregada negativamente (por exemplo, RNA), e (iii) combinar a emulsão de: óleo em água de (i) e a solução aquosa de (iii), de modo que a molécula carregada negativamente complexa com a partícula da emulsão. Por exemplo, uma emulsão de óleo em água catiônica pode ser combinada com uma solução aquosa que compreende uma molécula com carregada negativamente (por exemplo, uma solução aquosa de RNA), em quantidades relativas desejadas, por exemplo, cerca de 1:1 (v/v), cerca 1.5:1 (v/v) , cerca de 2:1 (v/v), cerca de 2,5:1 (v/v), cerca de 3:1 (v/v), cerca de 3,5:1 (v/v), cerca 4:1 (v/v), a cerca de 5:1 (v/v), cerca de 10:1 (v/v), cerca de 1:1,5 (v/v), cerca de 1: 2 (v/v), cerca 1: 2,5 (v/v), cerca de 1: 3 (v/v), cerce: de 1: 3,5 (v/v), cerca de 1: 4 (v/v), cerca de 1:1,5 (v/v), ou cerca de 1:1,10 (v/v), etc..

A conccr: n r ação do cada componente da composição pós- compkxo (por exemplo, complexo de RNA-emulsão) pode ser prontamente determinada de acordo com as quantidades relativas do pré-complexo da emulsão de óleo em água e da solução aquosa que compreende a molécula carregada negativamente (por exemplo, uma solução aquosa de RNA) que são usadas. Por exemplo, quando uma emulsão de óleo em água catiônica é combinada com uma solução aquosa que compreende uma molécula com carregada negativamente (por exemplo, uma solução aquosa de RNA) a razão de 1:1 (v:v), as concentrações do óleo e lipídeo catiônico tornam-se 1/2 da emulsão de pré-complexos. Portanto, se uma emulsão que compreende 4,3% (p/v) de esqualeno, 1,4 mg/ml de DOTAP, 0,5% v/v de SPAN85 e 0,5% v/v de Tween 80 (referido aqui como "CNF,'! 7") é combinada com uma solução aquosa de RNA que compreende sacarose 560 mM, NaCl 20 mM, Citrato 2 mM, e 1% (p/v) de Pluronic F127 a 1:1 (v:v), a composição de pós- complexo compreende 2,15% (p/v) de esqualeno, 0,7 mg/ml de DOTAP, 0,25% v/v de SPAN85, 0,25% v/v de Tween 80, sacarose 280 mM, NaCl 10 mM, citrato 1 mM, e 0,5% (p/v) de Pluronic F127.

As etapas opcionais adicionais para promover a formação de partículas, melhorar a complexação entre as moléculas carregadas negativamente e as partículas catiônicas, aumentar a estabilidade da molécula carregada negativamente (por exemplo, para evitar a degradação de uma molécula de RNA), a fim de facilitar descomp.l exação/li beração apropriada das moléculas carregadas negativamente (tal como uma molécula de RNA), ou para evitar a agregação das partículas da emulsão, podem ser incluídas. Por exemplo, um polímero (por exemplo, Pluronic;^ F.127) ou um surfactante pode ser adicionado à solução aquosa que compreende a molécula carregada negai vamente (por exemplo, RNA). Em uma modalidade  exemplar, o Pluronic® F 127 é adicionado à molécula de RNA antes da complexação com a particula de emulsão.

O tamanho das particulas da emulsão pode ser variado mudando-se a razão de surfactante para o óleo (o aumento da razão diminui o tamanho das gotas), pressão de operação (o aumento da pressão de operação reduz o tamanho das gotas), a temperatura (o aumento da temperatura reduz o tamanho das gotas), c outros parâmetros do processo. O tamanho da particuLa real irá também variar de acordo com o surfactante particular, óleo e lipideo catiônico usado e com as condições de operação especificas selecionadas. A emulsão de tamanho de particula pode ser verificada pelo uso de instrumentos de dimensionamento, tais como o Analisador de Particulas SubMicron comercial (Modelo N4MD) fabricado poLa Coulter Corporation, e os parâmetros podem ser variados, usando as diretrizes estabelecidas acima até que o diâmetro médio das particulas seja inferior a 1 μm, inferior a 0,9 μm, inferior a 0,8 μm, inferior a 0,7 μm, inferior a 0,6 μm, inferior a 0,5 μm, inferior a 0,4 μm, 20 inferior a 0,3 μm, inferior a 0,2 μm, ou inferior a 0,1 μm.

Preferencialmente, as particulas têm um diâmetro médio de cerca de 4 00 nm ou menos, a cerca de 300 nm ou menos, a cerca do 2 00 nm ou menos, cerca de 180 nm ou menos, cerca des 150 nm ou menos, ou cerca de 140 nm ou menos, de cerca 25 de 50 nm a 180 nm, de cerca de 60 nm a 180 nm, de cerca de 70 a 180 nm, ou de cerca de 80 nm a 180 nm, de cerca de 80 nm a 170 nm, de cerca de 80 nm a 160 nm, de cerca de 80 nm a 150 nm, ou de cerca de 80 nm a 140 nm. Em alguns casos, pode ser desejável que a dimensão média de particula das emulsões catiônicas seja de 200 nm ou menos, para permitir a fill, ração estéril. Em outros casos, a esterilização por filtração não é necessária e o tamanho médio da partícula das emulsões catiônicas pode ser maior do que 200 nm.

Os processos opcionais para a preparação da emulsão de óleo em água catiônica (pré-emulsão de complexação), ou o complexo de molécula carregada negativamente-emulsão, incluem, por exemplo, a esterilização, a seleção de tamanho de parti cuia (por exemplo, a remoção de partículas granoes), carga, embalagem, rotulagem e etc..

Por exemplo, se a emulsão de pré-complexação, ou a complexo de molécula carregada negativamente-emulsão é formulada para administração in vivo, a mesma pode ser esterilizada, por exemplo, por filtração através de um filtro de? grau de esterilização (por exemplo, através de um de filtro de 0,22 micron). Outras técnicas de esterilização incluem um processo térmico ou um processo de esterilização por radiação, ou o uso de luz pulsada para produzir uma composição estéril.

A emulsão de óleo em água catiônica aqui descrita pode ser usada para a fabricação de vacinas. As emulsões de óleo em água catiônicas de grau clínico e/ou estéreis podem ser preparadas através de métodos semelhantes aos descritos para o Mi;"59. Ver, por exemplo, Ott et al., Methods in Molecular Medicine, 2000, Volume 42, 211-228, VACCINE ADJUVANTS (O'Hagan ed.), Humana Press. Por exemplo, semelhante ao processo de fabricação de MF59, a fase oleosa e a fase aquosa da emulsão podem ser combinadas e tratadas em um homogeneizador em linha para produzir uma emulsão grossa. A emulsão grossa pode então ser alimentada a um microfLuidizador, onde ela pode ser ainda processada para  se obter uma emulsão de submicron estável. A emulsão grossa pode ser passada através da câmara de interação do microf! u i d i f:icador repetidamente até que o tamanho de particula desejado seja obtido. A emulsão de massa pode 5 então ser filtrada (por exemplo, através de um filtro de 0,22 μm em atmosfera de nitrogênio), para remover particulas grandes, resultando na massa da emulsão que pode ser introduzida em recipientes adequados (por exemplo, garrafas de vidro) . Para antigenos de vacina que 10 demonstraram a estabilidade em longo prazo na presença de emulsão oe óleo em água para o autoarmazenamento, o antigeno e a emulsão podem ser combinados e esterilizados por filtração (por exemplo, através de um filtro de memmbrana de 0,22 μm) . A vacina de frasco único combinada 15 pode ser cheia em recipientes de dose única. Para antigenos de vacina, onde a estabilidade em longo prazo não foi demonstrada, a emulsão pode ser fornecida como um frasco separado. Nesses casos, a massa da emulsão pode ser esterilizada filtrada (por exemplo, através de um filtro de 20 memmbrana de 0,22 μm), cheia, e embalada em frascos de dose única finais.

O controle de qualidade pode ser opcionalmente realizado em uma amostra pequena da massa da emulsão ou mistura da vacina, e a vacina em massa ou misturada sera empacotada em doses apenas se a amostra passa pelo teste de controle de qualidade.

6. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO

Em out.ro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula carregada 30 negativamente complexada com uma particula de uma emulsão de óleo em água catiônica, tal como aqui descrito, e pode compreender ainda um ou mais carreadores, diluentes, ou excipientes íarmaceuticamente aceitáveis. Em modalidades prefer:das, a composição farmacêutica é uma composição imunogênica, que pode ser usado como uma vacina.

Em alternativa, as composições aqui descritas podem ser usadas para distribuir uma molécula carregada negativamente para as células. Por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA) podem ser distribuídas para as células para uma variedade de fins, por exempts, para Induzir a produção de um produto genético desejado (por exemplo, proteínas), para regular a expressão de um gene, para a terapia de gene e similares. As composições aqui descritas podem também ser usadas para fornecer uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) para as células para fins terapêuticos, tais como para o tratamenro de uma doença, como o câncer ou doenças prol i fera t. ivas , doenças metabólicas, doenças cardiovasculares, infecções, alergias, para induzir uma resposta imune e similares. Por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos podem ser distribuídas às células para inibir a expressão de um gene alvo. Tais moléculas de ácido nucleico incluem, por exemplo, oligonucleotideos antisense, RNA de fita dupla, tais como pequenos RNAs interferentes e similares. Moléculas de RNA de fita dupla, tais como pequenos RNAs interferêntes podem desencadear a interferência de RNA, que especificamente silencia o gene alvo correspondente (gene knock down). Os oligonucleotideos antisense são fitas simples de DNA ou RNA que são comp'lemenl.ares a uma sequência escolhida. Geralmente, o RNA antisense pode prevenir a tradução da proteína de certas fitas de RNA mensageiro pela ligação a eles. O DNA anti sense pode ser usado para atingir um RNA complementar, específico (de codificação ou não codificação). Portanto, as emuisões catiônicas aqui descritas são úteis para a distribuição de oligonucleotideos antisense ou RNA de fita dupla para o tratamento, por exemplo, do câncer, inibindo a produção de um alvo de oncologia.

As composições farmacêuticas aqui fornecidas podem ser administradas isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. O método de administração inciui, mas não está limitado a, administração oral, administração retal, administração parentérica, administração subcutânea, administração intravenosa, administração intravítrea, intramuscular, por inalação, administração intranasal, administração tópica, a administração oftálmica, ou administração ótica.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições aqui, descritas pode variar dependendo, entre outros, da doença indicada, da gravidade da doença, da idade e da saúde relativa do indivíduo, da potência do composto administrado, da via de administração e do tratamento desejado.

Em outras modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Os agentes terapêuticos adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, antibióticos ou agentes antibacterianos, agentes anti eméti.cos, agentes antifúngicos, agentes anti- inflamatórios, agentes antivirais, agentes imunomodu J.ado res, citocinas, hormônios, antidepressivos, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos antitumorais, agentes anti-mitóticos, inibidores da topoisomerase, agentes citostáticos, agentes anti-invasão, agentes anLi-angLogênicos, inibidores do fator de crescimento, inibioores da função de replicação virai, inibidores de enzimas virais, agentes anticâncer, OÍ- interferons, β-interferons, ribavirina, hormônios, e outros moduladores do receptor de toll como, imunoglobulinas (Igs), e função Ig de modulação de anticorpos (tais como anti-IgE (Omalizumab)).

Em certas modalidades, as composições farmacêuticas aqui fornecidas são usadas no tratamento de doenças infocciosas, incluindo, mas não limitado a, doença causada por agentes patogênicos aqui descritos, incluindo as doenças virais, tais como as verrugas genitais, verrugas comuns, verrugas plantares, raiva, virus sincicial respiratório (RSV), virus da hepatite B, virus de hepatite C, dengue, febre amarela, virus de herpes simplex (a titulo de exemplo apenas, HSV-I, HSV-II, CMV, ou VZV), molusco contagioso, vaccinia, variola, lentivirus, virus da imunodeficiência humana (HIV), virus do papiloma humano (HPV1, virus da hepatite (virus da hepatite C, virus da hepatite B, virus da hepatite A), citomegalovirus (CMV), virus varicela zoster (VZV), rinovirus, enterovirus (por exemplo, EV71), adenovirus, coronavirus (por exemplo, SARS), influenza, para-influenza, virus da caxumba, virus do sarampo, virus da rubéola, papovavirus, hepadnavirus, flavivirus, retrovirus, arenavirus (a titulo de exemplo apenas, LCM, virus Junin, virus Machupo, virus Guanarito e  Febre de Lassa), e filovirus (a titulo de exemplo apenas, virus Ebola ou Marburg) .

Em certas modalidades, as composições farmacêuticas agua fornecidas são usadas no tratamento de infecções bact.eri.anas, fúngicas, por protozoários incluindo, mas não limitadas a, malária, tuberculose e mycobacterium avium, lepra; Pneumocystis carnii,criptosporidiose, histoplasmose, toxoplasmose, infecção por tripanossoma, leishmaniose, Infecções causadas por bactérias do gênero Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Aureus, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, e Chlamydia, e infecções fúngicas tais como candidiase, aspergilose, histoplasmose, e meningite criptocócica.

Em certas modalidades, as composições farmacêuticas aqui fornecidas são usadas no tratamento de doenças e/ou distúrbios cio aparelho respiratório, doenças e/ou distúrbios dermatológicas, doenças e/ou distúrbios oculares, doenças e/ou distúrbios geniturinários, incluindo, a rejeição de aloenxertos, autoimunes e alérgicas, câncer, ou pele lesada ou envelhida, como cicatrizes e rugas.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para gerar ou ootencializar uma resposta imune em um sujeito com necess Idade do mesmo, tal como um mamifero, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição tal como aqui divulgada. A resposta imune é, preferencialmente, de proteção e, preferencialmente, envolve anticorpos e/ou imunidade celular. O método pode ser usado para induzir uma resposta imune primária e/ou para aumentar uma resposta imune.

Em certas modalidades, as composições aqui descritas podem ser usadas como um medicamento, por exemplo, para uso no aumen.roou melhoria de uma resposta imune num sujeito com necessidade do mesmo, tal como um mamifero.

Em certas modalidades, as composições aqui descritas podem ser usadas na fabricação de um medicamento para gerar ou potencializar uma resposta imune em um sujeito com necessidade do mesmo, tal como um mamifero.

A i nvenção também fornece um dispositivo de distribuição pré-preenchido com uma composição ou uma vacina aqui descrita.

O mamifero é preferencialmente um humano, mas pode ser, por exemplo, uma vaca, um porco, uma galinha, um gato ou um cão, já que os patógenos abrangidos no presente documento podem ser problemáticos em uma grande variedade de espécies. Sempre que a vacina é para uso profilático, o humano é, preferencialmente, uma criança (por exemplo, um bebê ou lactente) , um adolescente ou um adulto, em que a vacina é para uso terapêutico, o humano é, preferencialmente, um adolescente ou um adulto. Uma vacina destinada a crianças pode também ser administrada a adultos, por exemplo, para avaliar a segurança, a dosagem, a imunogen.i ci dade, etc..

Uma forma de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve o monitoramento da infecção patogênica, após a administração das composições ou vacinas aqui descritas. Uma maneira de verificar a eficácia do tratamento profilático envolve o monitoramento de respostas imunes, sistêmicas (por exemplo, monitoramento do nivel de produção de IgGl e IgG2a) e/ou nas mucosas (por exemplo, mon j. to ramen to do nível de produção de IgA), contra o antigeno. Tipicamente, as respostas de anticorpos no soro específicas oe antigeno são determinadas pós-imunização, mas pré-desafío enquanto que as respostas de anticorpos nas mucosas específicas de antigeno são determinadas pós- imunização e pós-desafio.

Uma outra forma de avaliar a imunogenicidade das composições ou vacinas aqui divulgadas onde a molécula de ácido nucleico (por exemplo, o RNA) codifica uma proteína antigênica é expressar o antigeno de proteína de modo recombínante para rastrear secreções mucosas ou soro do paciente por immunoblot e/ou micromatrizes. Uma reação positiva entre a proteína e a amostra do paciente indica que o paciente montou uma resposta imune à proteína em questão. Este método também pode ser usado para identificar os antigenos imunodominantes e/ou epítopos dentro de antigenos proteicos.

A eficácia das composições pode também ser determinada in vivopeio desafio dos modelos animais apropriados do agente patogênico da infecção de interesse.

A dosagem pode ser feita por um esquema de dose única ou um esquema de dose múltipla. As doses múltiplas podem ser usadas em um esquema de imunização primários e/ou em um esquema de imunização de reforço. Em um esquema de dose múltipla as várias doses podem ser administradas por rotas iguais ou diferentes, por exemplo, um início parentérico e um reforço mucosal, um início mucosal e um reforço parentérico, etc.. As doses múltiplas serão tipicamente administradas com pelo menos 1 semana de intervalo (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, a cerca de 8 semanas, a cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.).

As composições aqui descritas que incluem um ou mais 5 antigenos ou são usadas em conjunto com um ou mais antigenos podem ser usadas para tratar crianças e adultos. Assim, um sujeito humano pode ter menos que a 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade, ou pelo menos 55 anos de idade. Os sujeitos preferidos para receber as composições são os idosos (por exemplo, > 50 anos de idade, > 60 anos de idade, e pref eronc i a 1 rnente> 65 anos de idade), os jovens (por exemplo, <5 anos), pacientes hospitalizados, trabalhadores de saúde, serviço armado e pessoal das forças armadas, 15 mulheres grávidas, doentes crônicos, ou imunodeficientes.

As composições não são adequadas apenas para estes grupos, no entanto, e podem ser usadas de modo mais geral em uma população.

As composições divulgadas aqui que incluem um ou mais 20 antigenos ou são usadas em conjunto com um ou mais antigenos podem ser administradas a pacientes, substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta ou visita médica a um profissional de saúde ou cem.ro de vacinação) outras vacinas, por exemplo, 25 substancialmente ao mesmo tempo que uma vacina de sarampo, uma vacina da caxumba, vacina de rubéola, vacina de MMR, uma vacina de varicela, vacina de MMRV, uma vacina de difteria, uma vacina de tétano, vacina de tosse convulsa, a vacina de DTP, vacina do conjugado de H. influenzaetipo b, 30 uma vacina de poliovirus inativado, uma vacina do virus de hepatite B, uma vacina conjugada meningocócica (tal como uma vacina tetravalente A C W135 Y) , uma vacina de virus sincicial respiratório, etc..

Em certas modalidades, as composições aqui fornecidas 5 incluem ou, opcionalmente, incluem um ou mais agentes imunorrequLadores, tais como adjuvantes. Adjuvantes exempt Cf'4 cativos incluem, mas não estão limitados a, um adjuvante TH1 e/ou um adjuvante TH2, discutido abaixo. Em certas modalidades, os adjuvantes usados nas composições 10 imunogênicas da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: 1. Composições Contendo Minerais; 2. Emulsões de Óleo; 3. Formulações de Saponina; 4. Virossomas e partículas semelhantes a vírus; 5. Derivados bacterianos ou microbianos; 6. Bioadesivos e mucoadesivos; 7. Lipossomas; 8. Formulações de éter de polioxietileno e ésteres de polioxietileno; 9 . Polifosfazeno (PCPP); 10 . Peptideos muramil; 11. . Compostos de Imidazoquinolone; 12 . Compostos de tiossemicarbazona; 13 . Compostos de Triptantrina; 14 . Imunornoduladores humanos; 15 . L 1 p o p e p t í d e o s ; 16 . B e n z o n a f t i r i d i n a s ; 17 . M i. c r o p a r 11 c u 1 a s 18. Fo l.i nuc I eotldeo imunoestimulador (tal como RNA ou  DNA; por exemplo, oligonucleotídeos contendo CpG)

EXEMPLIFICAÇÃO

A invenção agora sendo geralmente descrita, será mais facilmente compreendida por referência aos exemplos seguintes, que são incluidos apenas para efeitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não se destinam a limitar a invenção.

EXEMPLO 1: DESENVOLVIMENTO DE EMULSÕES DE ÓLEO EM ÁGUA CATIÔNICAS

Três tipos de nanoemulsões catiônicas (CNES) foram desenvolvidos para a distribuição de RNA autorreplicante. As emulsões do tipo 1 são emulsões seelhantes a "MF59". Estas emulsões foram feitas a partir dos mesmos componentes de MN59 com a exceção de que os lipideos catiônicos são adicionados. As emulsões do tipo 2 são emulsões que substituem o Span 85 e Tween 80 em MF59 com fosfolipideos. As emulsões do tipo 3 são emulsões de hibridos que são estabilizados por meio de lipideos ou outros surfactantes e podem ter polimeros ou surfactantes adicionais na fase aquosa da emulsão.

Três lipideos diferentes foram usados para a preparação de emulsões de tipo 1: 1,2-dioleoil-3- c.r.i met ,i ! amón i o-propano (sal de cloreto) (DOTAP), cloridrato de 33- i i\:- (N' , N ’ -d.i metilaminoetano) -carbamoil] colesterol (Colesterol DC) e Dimetildioctadecilamônio (Sal de Brometo) (DDA). DOTAP foi usado na preparação de emulsões do Tipo 2 e Tipo 3.

A razão de N/P refere-se à quantidade de nitrogênio no lipideo catiônico em relação à quantidade de fosfato no RNA. o nitrogênio é o elemento portador de carga no interior dos lipídeos catiônicos testados. O fosfato pode ser encontrado no esqueleto do RNA. Uma razão de carga N/P, de 10/1 indica que existem 10 nitrogénios carregados positivamente a partir do lipídeo catiônico presente para cada fosfato carregado negativamente no RNA.

CNFls tipo 1:

A razão de Tween 80, Span 85, esqualeno, e de tampão citrato não foi alterada para esta classe de emulsões. Estas emulsões foram preparadas com as mesmas concentrações de Mt'5 9. A quantidade total de lipídeo catiônico dada por dose permanece constante, independentemente da concentração de lipídeos. Por exemplo, uma dose de 10 μg de RNA distribuídos em uma emulsão com 0,8mg/ml de DOTAP a uma razão de N/P de 10/1 exigiria uma diluição de 2x. Por isso, a quantidade de esqualeno distribuída seria de 1/2 da que é normaImenLe administrada durante a imunização com MF59. Alterna Livamen te, um 10 μg de dose de RNA distribuídos em uma emulsão com l,6mg/ml de DOTAP com uma razão de N/P de 10/1 exigiria uma diluição de 4x.

Neste exemplo, 17 diferentes formulações de emulsões de tipo 1 foram preparadas. As faixas de lipídeos catiônicos que foram capazes de ser feitas em emulsões são listadas abaixo: Tabela 1

Todas as formulações com concentrações de 0,8mg/ml de DOTAP até 1,6 mg/ml produziram emulsões estáveis. Todas as formulações com concentrações de colesterol DC de 0, 62 mg/ml até 2,46 mg/ml produziram emulsões estáveis. Todas as formulações com concentrações de 0,73 mg/ml de DDA até 1,64 mg/ml produziram emulsões estáveis.

CNEs tipo 2:

A porcentagem de esqualeno variou com o CNEs tipo 2. Outra diferença é que a partir de MF59 estas emulsões foram feitas em água não em tampão de citrato. Estas emulsões foram feitas com l,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfatidiletanolamina (DOPE) e fosfatidilcolina (PC de ovo), como estabilizadores de lipideos. As emulsões foram feitas ('.or DOPE e PC de ovo ou com DOTAP colesterol DC, ou DDA nas concentrações otimizadas a partir dos Estudos de emulsão tipo 1.

Uma série separada de emulsões foi feita usando DOTAP como o único estabilizador. Estas emulsões continham diversas quantidades de esqualeno (a partir de 0,43% p/p até à concentração de MF59 de 4,3% p/p).

CNEs tipo 3:

A adição de Pluronic® F127 (poloxômero) para o RNA antes de complexação com uma emulsão de PC de ovo/DOTAP levou a uma maior estabilidade quando comparada com RNase de uma amostra que não tinha o polaxâmero adicionado a ela. Isto indica o papel, deste polímero para permita uma melhor complexação de RN7\ com a gota de óleo.

A adição de uma pequena quantidade de Tween 80 (0,08% p/p), durante a etapa de emulsificação das emulsões de DOTAP apenas conduziu a um menor tamanho de gotícula.

Métodos para preparação de emulsões catiônicas:

O esqualeno, trioleato de sorbitano (Span 85), monoeleato de polióxi-etileno-sorbitano (Tween 80) foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO, EUA) . Dimetildioctadecilamônio (DDA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfoeoanolamina (DOPE), Cloridrato de 3β-[N-(N',N'- dimet ilam ;noetano)-carbamoil] Colesterol (DC-Colesterol HCL), foram adquiridos de Lipideos Avanti. L-α- lisofosratidileolino-(ovo, frango) e 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio-propano (DOTAP) foram adquiridos de Lipoid (Ludwigshafen Alemanha).

As nanoemulsões catiônicas (CNEs) foram preparadas semelhantes a MF59 carregado como descrito anteriormente com modificações menores (Ott, Singh et al. 2002) . Resumidamente, os componentes solúveis em óleo (ou seja, Squalene, span 85, lipideos catiônicos, surfactantes lipádicos) foram combinados em um béquer, componentes lipidicos foram dissolvidos em clorofórmio (CHCI3) ou diclorometano (DCM). A solução de lipideo resultante foi adicionada diretamente ao óleo com Span 85. Para um subconjunto de emulsões (CNE01, 02, 17), o solvente foi deixado evaporar à temperatura ambiente durante 2 horas em uma campanula de fumo antes de se combinar a fase aquosa e homogeneizar a amostra. Para as emulsões restantes (CNE 12, 13, 27, 32, 35), a fase oleosa foi combinada com a fase aquosa o imediatamente homogeneizada durante 2 minutos usando um homogeneizador IKA T2 5 a 24K RPM de modo a fornecer uma matéria-prima homogênea. CNE05 foi preparado através da preparação de uma solução de estoque de lipossomas. Os lipossomas foram preparados por evaporação a 10mg/m1 do solução de clorofórmio DOTAP em um evaporador rotativo (modelo Buchi número R200) à pressão de 300 miliTorr, durante 30 minutos a uma temperatura de 50°C. A  evaporação do clorofórmio residual foi segurada através da colocação das amostras durante a noite em um liofilizador Labccrco. O filme de lipideo foi hidratado e disperso por adição de 1,0 mL de água desionizada destilada, filtrada e colocíido a 50°C para assegurar a suspensão completa do lipioeo. Os llpossomas resultantes foram adicionados diretamence ao esqualeno e foram imediatamente emulsionados durante 2 min, usando um homogeneizador IKA T25 a 24K RPM. As emulsões foram então deixadas em repouso à temperatura ambiente sobre uma placa de agitação durante 2-3 horas após a homogeneização primária em uma campânula. As emulsões primárias foram passadas três a cinco vezes através de um homogeneizador Microfluidezer MHOS com uma serpentina de resfriamento de banho de gelo, a uma pressão de homogeneização de cerca de 15k - 20k PSI (Microfluidics, Newton, MA) . As amostras do lote de 20 ml foram removidas da unidade e armazenadas a 4 °C. A Tabela 2 descreve os componentes das emulsões. Tabela 2

Um método de adição de lipídeos para a fase oleosa das emulsões foi adição de diclorometano (DCM ou cloreto de metileno) para a fase oleosa. Uma vez adicionado o DCM pode ser deixado evaporar completamente. Depois da evaporação, a emulsão foi então passada através do Microfluidizador. Alternacivamente, nos casos em que a solubilidade lipidica foi um problema, a emulsão primária pode ser feita com o DCM ainda na fase orgânica. Nesse caso, o DCM seria deixado evaporar diretamente a partir da emulsão antes da homogeneização secundária.

Um método alternativo para emulsões que continham lipídeos como estabilizadores era fazer um filme lipídico e hidratar o filme, de modo que os lipídeos formassem lipossomas. Os lipossomas foram então adicionados à fase oleosa e processados como o MF59 padrão foi processado.

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS DE RNA-PARTÍCULA 1. Materiais e Métodos. Síntese de RNA

O DNA de plasmídeo que codifica um replicon de alfavírus (RNA autorreplicante) foi usado como um molde para a síntese de RNA in vitro.Cada replicon contém os elementos genéticos necessários para a replicação do RNA, mas não tem as sequências que codificam os produtos de genes que são necessários para a montagem da particula. Os genes esrruturais de alfavirus do genoma foram substituídos por sequências que codificam uma proteina heteróloga (cuja expressão é conduzida pelo promotor subgenômico de alfavírus). Após a distribuição dos replicons para células euca ri ót icas, o RNA de fita positiva é traduzido para produzir qualro proteínas não estruturais as quais, em conjunio, replicam o RNA genômico e transcrevem mRNAs subgenômicos abundantes que codificam a proteína heteróloga. Devido à falta de expressão das proteínas estruturais de alfavírus, os replicons são incapazes de gerar partículas infecciosas. Um promotor T7 de bacterióiago está localizado a montante do DNAc de alfavirus para facilitar a síntese do replicon de RNA in vitro,e a ribozima do vírus da hepatite delta (HDV) situada imediatamente a jusante da cauda poli(A) gera a extremidade 3' correta através da sua atividade de autoclivagem. As sequências dos quatro plasmídeos usados nos exemplos são apresentadas nas Figuras 7A-7B.

Após a linear i zação do DNA de plasmídeo a jusante da ribozima de HDV com uma endonuclease de restrição adequada, as transcrições executadas foram sintetizadas in vitro usando RNA polimerase dependente de DNA derivado de bacterióiago T7 ou SP6. As transcrições foram realizadas durante 2 horas a 37°C na presença de 7,5 mM (RNA polimerase de T7) ou 5 mM (RNA polimerase de SP6) de concentração final de cada um dos trifosfatos de fornecidas pelo fabricante (Ambion, Austin, TX) . Após a transcrição, o molde de DNA foi digerido com TURBO DNase (Ambion, Austin, TX). O replicon de RNA foi precipitado com LiCl e reconstituído em água isenta de nuclease. O RNA não nivelado foi nivelado pós-transcricionalmente com Enzima de Nivelamento de Vaccinia (VCE), usando o sistema e nivelamento ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI), conforme descrito no manual do usuário. O RNA nivelado pós-transcricionalmente foi precipitado com LiCl e reconstituído em água isenta de nuclease. Alternativamente, os replicons podem ser nivelados com suplementação das reações de transcrição com 6 mM (para RNA polimerase de T7) ou 4 mM (para RNA polimerase de SP6) de m7G(5')ppp(5')G, um análogo da estrutura de nivelamento não reversível (New England Biolabs, Beverly, MA) e a diminuição da concentração de trifosfato de guanosina a 1,5 mM (para RNA polimerase de T7) ou 1 mM (para RNA polimerase de SP6) . Os transcritos podem ser então purificados por digestão em TURBO DNase (Ambion, Austin, TX) seguido de precipitação em LiCl e uma lavagem com etanol a 75%.

A concentração das amostras de RNA foi determinada medindo a densidade óptica a 260 nm. A integridade dos transcri tos in vitrofoi confirmada por eletroforese em gel de agarose desnaturante para a presença do construtoo de com.pi i meat.o total. .

Comp lextiçao de RNA

O número de átomos de nitrogênio na solução foi calculado a parti.r da concentração de lipideo catiônico, DOTAP, por exemplo, tem 1 nitrogênio que pode ser protonado por molécula. A concentração de RNA foi usada para calcular a quantidade de fosfato em solução por meio de uma estimativa de 3 nmoles de fosfato por micrograma de RNA. Variando a quantidade de RNA:Lipideo, a razão de N/P pode ser modificada. 0 RNA foi complexado para os CNEs em uma faixa do razões de nitrogênio/fosfato (N/P) . O cálculo da razão de N/P foi feito por meio do cálculo do número de moles de átomos de nitrogênio protonáveis na emulsão por mililitro. Para calcular o número de fosfatos, uma constante de 3 nmoles de fosfato por micrograma de RNA foi usada. Depois que os valores foram determinados, a razão apropriaoa da emulsão foi adicionada ao RNA. Usando estes valores, o RNA foi diluido para a concentração apropriada e adicionado diretamente para um volume igual de emulsão enquanto vortexando levemente. A solução foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. Uma vez complexada a solução resultante foi diluida para a concentração apropriada e usada dentro de 1 hora.

Eletroforese em gel

A desnaturação de eletroforese em gel foi realizada para avaliar a ligação de RNA, com as formulações catiônicas e estabilidade na presença de RNase A. O gel foi expresso como segue: 2 g de agarose (Bio-Rad, Hercules, CA) foram adicionados a 180 ml de água e aquecidos em um forno de micro-ondas até se dissolver e depois resfriou-se a 60 °C. 20 rnl. de tampão de gel desnaturante 10 x (Ambion, Austin, TX) foram, então, adicionados à solução de agarose. O gel loi vertido e foi deixado a repousar durante pelo menos 4 5 minutos à temperatura ambiente. 0 gel foi então colocado ern um tanque de gel, e tampão de execução de lx MOPS (Ambion, Austin, TX) foi adicionado para cobrir o gel por a 1 g ans m i 11 met ros .

Ensaio de Proteção de RNase

A digestão com RNase foi alcançada por incubação com 6,4 mAU de RNase A por micrograma de RNA (Ambion, Hercules, CA) duraram 30 minutos à temperatura ambiente. RNase foi inativada com Proteinase K (Novagen, Darmstadt, Alemanha), por incubação da amostra a 55 °C durante 10 minutos. As amostras de inativação pós-RNase foram descomplexadas com uma mistura da amostra de 1:1 para 25:24:1, de fenol: clorofórmio:álcool isoamilico. As amostras foram invertidas várias vezes para misturar e, em seguida, colocadas em uma centrifuga durante 15 minutos a 12k RPM. A fase aquosa foi removi da da fase orgânica e usada para analisar o RNA. Antes da carga (460 ng por poço), todas as amostras foram incubadas com o corante de carga de formaldeido, desnaturadas durante 10 minutos a 65°C e resfriadas até à temperatura ambiente. Marcadores Ambion Milênio foram usados para o peso molecular aproximado do construto de RNA. O gel foi corrido a 130 V. O gel foi corado com 0,1% de SYBR de ouro de acordo com as orientações do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) em água com agitação à temperatura ambiente durante 1 hora. As imagens de gel foram realizadas em um sistema de imageamento Bio-Rad Chemddoc XRS (Hercules, CA). Todos os estudos utilizaram RNA do timo de camundongo de Clonetech (Mountain View, CA).

Ensaio de ligação a heparina

O RNA foi. complexado, tal como descrito acima. O complexo de RNA/CNE foi incubado com várias concentrações de sulfato de heparina (Alfa Aesar, Ward Hill MA) durante 30 minutos á temperatura ambiente. As soluções resultantes foram centrifugadas durante 15-20 minutos. Os tubos de centrífuga foram perfurados com uma seringa de tuberculina e o sobrenadánte foi removido. A solução foi então ensaiada quanto à concentração de RNA usando Kit de ensaio de RNA Quarvi-.it Ribogreen (Invitrogen, Carlsbad CA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram analisadas em um leitior de placas fluorescentes de Biotek Synergy 4 (Winooski, VT) . Os valores de RNA livre foram calculados usando uma curva padrão.

Ensaio de tamanho de partícula

O tamanho das partículas da emulsão foi medido usando um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, RU), de acordo com as instruções do fabricante. Os tamanhos de partículas são referidos como o Z-média (ZAve) com o índice de poiid.i spersidade (pdi). Todas as amostras foram diluídas em água antes de serem medidas. Além disso, o tamanho das partículas da emulsão foi medido usando dimensionador de partículas Horiba LA-930 (Horiba Scientific, EUA) . As amostras foram diluídas em água antes de serem medidas. 0 potencial zeta foi medido usando Zetasizer Nano ZS usando amostras diluídas de acordo com as instruções do fabricante.

Ensaio de fosfatase alcalina secretada (SEAP)

Para avaliar a cinética de produção e a quantidade de antigeno, um replicon de RNA que codifica SEAP foi administrado com e sem formulação para camundongos, por via intramuscular. Os grupos de 3 ou 5 camundongos Balb/C fêmeas com. idade de 8-10 semanas e pesando aproximadamente 20 g foram imunizados com CNEs complexadas com replicon de RNA que codifica o SEAP nas razões de N/P indicadas. O RNA nu foi formulado em RNase livre IX PBS. Uma dose de lOOμl foi administrada a cada camundongo (50 μl por local) no músculo quadriceps. As amostras de sangue foram tomadas de 1, 3 e 6 dias após a injeção. 0 soro foi separado do sangue imeo:i.a uamen te após a coleta, e armazenado a -30°C até o seu uso .

Um Sistema Phospha-Light de ensaio SEAP quimiol uminescente (Applied Biosystems, Bedford, MA) foi usado para analisar o soro. Os soros do camundongo foram diluidos a 1:4 em tampão de diluição phospha-Light IX. As amostras foram colocadas em um banho de água vedado com folha de aluminio de vedação e inativadas pelo calor durante 30 minutos a 65 °C. Após resfriamento em gelo durante 3 minutos, e equilibrio à temperatura ambiente, 50 μl de phospha-Light tampão de ensaio foram adicionados aos poços e as amostras foram deixadas à temperatura ambiente durante 5 minutos. Em seguida, 50 μL de tampão de reação contendo 1:20 do substrato de CSPD® (substrato de fosfato alcalino quimioluminescente) foram adicionados, e a luminescência foi medida após 20 minutos de incubação à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um luminômetro Berthold LB Centra 960 (Oak Ridge, TN) com uma integração de 1 segundo por poço. A atividade da SEAP em cada amos ara foi medida em duplicata, e a média das duas medições é mostrada.

Ele1roporação

A e.l. etroporação foi um método muito eficaz para a distribuição de vacinas de DNA de plasmideo e esta técnica foi usada para distribuição de RNA autorreplicante. Os camundongos foram anestesiados com isofluorano, ambas as patas traseiras foram intimamente raspadas para expor a área do membro a ser tratado. A dose de 30 μl de vacina foi injetada no músculo quadriceps do membro posterior usando seringa de insulina de 1/2 cc. O músculo foi eletroporado usando o Sistema de distribuição de DNA Elgen® (Inovio, San Diego) . Os parâmetros do instrumento são os seguintes: 60V, dois pui sos de cada um de 60ms. Outra dose foi igualmente distribuída ao segundo membro, seguindo-se a eletroporação.

Partículas de Replicon Virais (VRP)

Para comparar as vacinas de RNA com abordagens de vetores de RNA tradicionais para alcançar a expressão in vivo de genes ou antigenos repórteres, foram usadas particulas de replicon virais (VRPs) produzidas em células BHK com os métodos descritos por Perri et al. Neste sistema, os replicons de antigeno (ou gene repórter) consistiam em replicons quiméricos de alfavírus (VCR) derivados a partir do genoma do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) projetado para conter as sequências terminais 3' (3'UTR) do vírus de Sindbis e um sinal de empacotamento do vírus Sindbis (PS) (ver Fig. 2 de Perri S., et al, J Virol 77: 10394-10403 (2003)). Estes replicons foram empacotados em VRPs por coeletroporação dos mesmos em células do rim de hamster bebê (BHK), juntamente com os RNAs auxiliares defeituosos que codificam o capsídeo do vírus Sindbis e os genes das glicoproteínas (ver fig. 2 de Perri eu al.) As VRPs foram então colhidas e tituladas por métodos padrões e inoculadas em animais em fluido de cultura ou outros tampões isotônicos.

2. Análise de tamanho de partícula das emulsões de óleo em água.

Depois da fabricação, as emulsões foram analisadas para o tamanho das partículas e o potencial zeta. As Tabelas 3 e 4 resumem os dados de tamanho de partículas e dados de potencial zeta obtidos de pré- e de pós- complexação com uma razão de N/P de 4:1 e 10:1. 0 tamanho de partícula das emulsões foi inferior 160 nm para todas as formulações testadas, quando medidas no dimensionador de partículas Nano ZS. Após complexação, alguns dos tamanhos de particula aumentaram de forma significativa especialmente na razão de N/P de 4:1. Isto é provavelmente devido á agregação e ponte do RNA entre múltiplas gotículas da emulsão. Dados de Horriba geralmente combinavam bem com as medições de NanoZS exceto para alguns casos (CNE02 e CNE32), onde parece haver uma população maior de partícula que não é capaz de ser analisada em nanoZS. Todas as CNEs com exceção de CNE02 e CNE32 tinham menos de 190nm de tamanho, quando medidas no dimensionador de partículas Horiba. A baixa variabilidade no tamanho indica um método de processamento robusto, independentemente da quantidade ou tipo de lipídeo catiônico adicionado. É particularmente desejável que o tamanho médio de partícula seja inferior a 200 nm de tamanho para permitir a filtração estéril. Todas as amostras testadas passaram neste critério. Tabela 3: Dados de Tamanho de Partículas

O potencial Zeta foi ligeiramente mais variável do que os dados de tamanho de particulas (Tabela 4). Isto está de acordo com as nossas expectativas uma vez que uma série de diferenças nestas formulações é a alteração na concentração 5 de lipideo catiônico. Por exemplo, CNE01, CNE02, e CNE17, cada, contendo 0,8, 1,6 e 1,2 mg/ml de DOTAP respectivamente. 0 potencial zeta para estes lotes estavam de acordo com as expectativas com CNE01 tendo o menor potencial zeta de pré-complexação de 15, 9mV, seguido por 10 CNE17 com um potencial zeta de pré-complexação de 33,4mV e, por último, CNE02 com um potencial zeta de 43mV. O potencial zeta de pós-complexação não é geralmente muito mudando a partir da pré-complexação de potencial zeta provavelmente devido ao excesso de carga nas emulsões. Tabela 4: Potencial Zeta

3. Ensaio de estabilidade de RNase:

Para avaliar a capacidade das emulsões para proteger da degradação de Rnase, um ensaio in vitrofoi desenvolvido para rastrear as formulações. A Figura 1 mostra os resultados do ensaio de proteção de RNase e de CNE01 e CNE17 a uma. razão de N/P de 10:1 e 4:1. CNE01 protegeu o RNA melhor em uma razão de 10:1 em comparação com a razão de 4:1 . CNE17 mostrou boa proteção em 10:1 A Figura 2 mostra que CNE 17 também foi capaz de proteger o RNA a uma razão de N/P de 4:1. CNE 12 e 13 também protegeu o RNA (semelhante a CNE17) em ambas as razões de carga (Figura 2). A Figura 3 mostra resultados semelhantes aos da Figura 1 com CNE01 não protegendo muito bem a uma razão de N/P de 4:1. CNE02 protegeu contra RNases muito bem em ambas as razões de N/P testadas (Figuras 3 e 4). CNE04 não protegeu o RNA a partir de digestão com RNase, mas CNE05 foi capaz de proteger o RNA em ambas as razões de carga testadas (Figura 5) . CNE27 mostrou muito pouca proteção de RNase, enquanto que CNE32 mostrou ligeiramente mais proteção, mas em gerai, menos do que as formulações anteriormente mencionadas. CNE 35 (Figura 6) foi capaz de proteger ligei, ramen t..e o RNA da degradação de RNase. Em geral 5 diferentes formulações foram capazes de evitar a degradação do RNA in vitro.

4. Rastreio de SEAP in vivo:

O replicon A306, que expressa a fosfatase alcalina secretada (SEAP), foi usado para determinar o nível de expressão da proteína in vivo, após a administração de vetores de alfavírus. Os camundongos BALB/c, 5 animais por grupo, :oram administrados com vacinações bilaterais intramusculares (50 μL por perna) nos dias 0 com SEAP expressando VRP (5x10sUI), RNA autorreplicante nu (A306, 1 μg) , RNA autorreplicant.esdistribuído usando eletroporação (A306 + EP, 1 e 0,1 μg, respectivamente) e RNA de autorreplicação formulado com CNE17, CNE05 e CNE35 com uma razão de N/P de 10:1 produzido como anteriormente descrito (1 μg ou 0,1 μg de A306) . Os niveis séricos de SEAP (unidades relativas de luz, RLU), nos dias 1, 3 e 6 após a vacinação intramuscular no dia 0 são mostrados na Tabela 5. Os dados estão representados como médias aritméticas das titulações de 5 camundongos individuais por grupo. Tabela 5

A Tabela 5 mostra que os niveis séricos de SEAP aumentaram quando o RNA foi formulado em CNE 17 em relação ao controle de RNA nu com uma dose similar. A expressão de SEAP foi aumentada quando o RNA foi formulado em CNE em relação ao controle de VRP, mas a cinética de expressão foi muiic diference. A distribuição da eletroporação resultou em expressão de EAP aumentada em relação ao controle de RNA nu, mas estes níveis foram mais baixos em comparação com o nível de expressão de SEAP quando o RNA foi formulado com CNE17. CNE05 e CNE35 reduziram o nível de expressão de proteína.

5. Efeito das razões de N/P na expressão de SEAP  (CNE17)

O replicon A306, que expressa a fosfatase alcalina secret.ala (SEAP), foi usado para determinar o nivel de expressão da proteína in vivo, após a administração de vetores de alfavírus. Camundongos BALB/c, 5 animais por grupo, foram admistrados com vacinas intramusculares bilaterais (50μl por pata) no dia 0 com RNA nu autorreplicante (A306, 1 μg), RNA autorreplicante formulado com CNE.17, produzido como previamente descrito (A30 6, 1 μg), ruas seguintes razões de N/P de 6:1, 7:1, 8:1, 10:1, 12:1, 13:1, 14:1, 16:1.

Os níveis séricos de SEAP (unidades relativas de luz, RLE) , nos dias 1, 3 e 6 após a vacinação intramuscular no dia 0 são mostrados na Tabela 6. Os dados estão representados como médias aritméticas das tituações de 5 camundongos individuais por grupo. Uma correlação da ligação de sulfato de heparina em comparação com o dia 6 da expressão de SEAP está descrita na Tabela 7. As porcentagens de RNA liberado do complexo em sulfato de heparina 6x, 8x, e 10x, respectivamente, são indicadas. Tabela 6: Niveis séricos SEAP (CNE17)

Tabela 7: Ligação a heparina e expressão de SEAP no dia 6 (CNE17) 

As Tabelas 6 e 7 mostram que os níveis séricos de SEAP aumentaram quando o RNA foi formulado com uma razão de N/P de 10:1 em. relação ao controle de RNA nu, em uma dose similar. A. outra razão de N/P testada expressou quantidades menores de expressão de proteína em comparação com a razão de N/P de JO:1, mas todos mostraram uma resposta superior a do RNA nu. Deve-se destacar que os valores médios de SEAP do RNA nu flutuaram consideravelmente, o que é exempli ficado nas Tabelas 5 e 6, com a expressão de aproximadamente 35.000 em uma experiência, e 5.000 na outra. O nível de expressão da proteína no dia 6 se correlaciona bem com a liberação de heparina.

6. Efeito de razões de N/P na expressão de SEAP (CNE13)

O replicon A306, que expressa a fosfatase alcalina secretada (SEAP), foi. usado para determinar o nível de expressão da proteína in vivo, após a administração de vetores de alfavírus. Os camundongos BALB/c, 5 animais por grupo, foram administrados com vacinas intramusculares bilaterais (50 μl por pata) no dia 0 com RNA autorrepl1 cante nu (A306, 1 μg), RNA autorreplicante formulado com CNE13, produzidas como previamente descrito (1 μg 71306), o seguinte N/P de 6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1.

Os níveis séricos de SEAP (unidades relativas de luz, RLU), rcs dias 1, 3 e 6 após a vacinação intramuscular no 5 dia 0 são mostrados na Tabela 8. Os dados estão repieseinados como médias aritméticas das tituações de 5 camundongos individuais por grupo. A correlação da ligação de sulfato de heparina em comparação com a expressão de SEAP no dia 6 está descrita na Tabela 9. As porcentagens de 10 RNA Liberado do complexo em sulfato de heparina a 6x, 8x, e 10x, respectivamente, são indicadas. Tabela 8: Níveis séricos de SEAP (CNE13)

Tabela 9: Ligação a Heparina e expressão de SEAP no dia 6 (CNE13)

As Tabelas 8 e 9 mostram que os niveis sericos de SEAP aumentaram quando o RNA foi formulado em todas as razões de N/P testadas em relação ao RNA nu de controle, na dose similar. A expressão da proteina no dia 6 se correlacionou bem com a liberação de heparina.

7 . Efeito das razões de N/P na expressão de SEAP (CNE01)

O replicon A306, que expressa a fosfatase alcalina secretada (SEAP), foi usado para determinar o nível de expressão da proteína in vivo, após a administração de vetores de alfavírus. Camundongos BALB/c, 5 animais por grupo, (oram administrados com vacinas intramusculares bilaterais (50 μl por pata) no dia 0 com RNA autorrepl : carn:e nu (A306, 1 μg) , RNA autorreplicante formulado com CNE01, produzidos como previamente descrito (1 μg, A306) corn as seguintes Razões de N/P de 4:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1

Os níveis séricos de SEAP (unidades relativas de luz, RLU) , nos dias 1, 3 e 6 após a vacinação intramuscular no dia 0 são mostrados na Tabela 10. Os dados são representados como média aritmética das unidades relativas de luz (RLUs) de 5 camundongos individuais por grupo. A correlação da ligação de sulfato de heparina em comparação com a expressão de SEAP no dia 6 é descrita na Tabela 11. As porcentagens de RNA libertado do complexo em 6x, 8x, e 10x de sulfato de heparina, respectivamente, são indicadas. Tabela 10: Níveis séricos de SEAP (CNE01)

Tabela 11: Ligação de heparina e expressão de SEAP no dia 6 de CNE01

As Tabelas 10 e 1.1 mostram que os niveis séricos de SEAP aumentaram quando o RNA foi formulado em todas as razões de N/P testadas em relação ao controle de RNA nu, na dose simi1 ar.

EXEMPLO 3: AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA USANDO ÓLEOS DIFERENTES

Uma série de emulsões foi produzida usando óleos diferentes, mas dentro da formulação de base de CNE17, isto é, 5% de óleo, 0,5% de Tween 80, 0,5% de Span 85 e 1,4 mg/ml de DOTAP. A Tabela 12 abaixo apresenta as mudanças nos óleos para cada um dos grupos. As classificações dos óleos são também listadas na Tabela 12.

As emulsões foram testadas a uma mistura razão de N/P de 10:1 e foram complexadas como descrito anteriormente. Camundongos BALB/c, 5 animais por grupo, foram administrados com vacinações intramusculares bilaterais (50 μl, perna oer) no dia 0 com SEAP expressando VRP (5xl05 Ui), RNA autorreplicante nu (A306, 1 μg), RNAs autorrepJ.J carn.esdistribuídos usando eletroporação (A306 + EP, 1 e 0,1 μg) e RNA autorreplicante formulado com CNE36, CNE37, CNR38 e CNE41 produzidos como descrito anteriormente (1 μg, A306). Os níveis séricos de SEAP (unidades relativas de luz, RLU), nos dias 1, 3 e 6 após a vacinação intramuscular no dia 0 são mostrados na Tabela 13. Os dados são representados como média aritmética de RLUs de 5 camundongos individuais por grupo. Tabela 12

Tabela 13

Conforme mostrado na Tabela 13, CNE17 mostra o nível mais elevado de expressão ao longo dos estudos. Todas as outras emulsões foram inferiores a uma dose de Iμg de RNA nu. CNE36) resultou em maior expressão dos novos óleos, seguido de CNE41 e CNE38. Uma dose de Iμg de RNA adicionada diretamente a MF5 9 mudou a resposta.

EXEMPLO 4: IMUNOGENICIDADE MELHORADA DE CNE17 DO ANTIGENO RSV-F EM UM MODELO DE CAMUNDONGO 1. Métodos Estudos de imunogenicidade de murinos

O replicon A317 que expressa a glicoproteína de fusão de superficie de vírus sincicial (RSV-F) foi usado para este csuido. Camundongos BALB/c, com idades entre 8-10 semanas e pesando cerca de 20 g, 10 animais por grupo, foram admin is trados com vacinas intramusculares bilaterais. Todos os animais foram injetados nos quadriceps nas duas patas traseiras de cada obter um volume equivalente (50 μl por pata) nos dias 0 e 21 com VRP do expressando RSV-F (IxlO6 Ui), RNA autorreplicante nu (A317, 1 μg) , RNA autorrepJ i.canie distr ibuído usando eletroporação (10 μg ou A317 -r ElP) , ou RNA autorreplicante formulado em CNE17 (0,1 μg ou I ug de A317) . O soro foi recolhido para análise de anticorpos nos dias 14 (2wpl) , 35 (2wp2) e 49 (4wp2) . Quando a medição da resposta das células T foi necessária, os baços foram colhidos a partir de 5 camundongos por grupo no dia 35 ou 49 para a análise de células T.

fnsaios da. função células T de camundongo: ensaio de imunof!uorescência de citocinas intracelulares

Dois a cinco baços de camundongos BALB/c vacinados de forma idêntica foram agrupados e suspensões de células isoladas foram preparadas para cultura. Duas culturas estimuladas por antigenos e duas culturas não estimuladas foram estabelecidas para cada pool de esplenócitos. As culturas estimuladas por antigenos continham IxlO6 esplenócitos, peptideo 85-93 de RSV F (1x10sM) , peptideo 249-258 de RSV F (IxlO6 M) , peptideo 51-66 de RSV F (IxlO6 M), m.7\b ant..i-CD28 (1 mcg/mL), e Brefeldin A (1:1000) . Culturas não estimuladas não continha peptideos RSV F, e eram idênticas às culturas estimuladas. Após cultura durante 6 horas a 37 °C, as culturas foram processadas por imunofluorescência. As células foram lavadas e, em seguida, coradas com anticorpos monoclonais (mAh) anti-CD4 e anti-CD 8 marcados de forma fluorescente. As células foram novamente lavadas e depois fixadas com Cytofix/cytoperm durante 20 minutos. As células fixadas foram então lavadas com tampão de lavagem de Perm e, em seguida, coradas com mAbs marcados de forma fluorescente específicos para IFN-g, TNF-a, 11,-2 e IL-5. As células coradas foram lavadas e, em seguida, analisadas em um citômetro de fluxo de LSR II. O software itowJo foi usado para analisar os dados adquiridos. As subpopulações de células-T CD4+8 e células-T CD-i 8-4 foram analisadas separadamente. Para cada subconjunto de uma determinada amostra, a % de células positivas para citocina foi determinada. A % de células-T espec.í ficas de antigeno RSV F foi calculada como a diferença entre a % de células positivas para citocinas nas culturas estimuladas por antigeno e a % de células posieivas para citocina nas culturas não estimuladas. Os limites de confiança a 95% para as % de células especificas de antígeno foram determinadas usando métodos padrões (Métodos Is tatísLicos, 7aedição, G.W. Snedecor e W.G. Cochran).

Llnsa ios da função de células de camundongo: ensaio de citocinas secretadas

As culturas para o ensaio de citocinas secretadas foram semelhantes às apresentadas para o ensaio de imunofluorescência de citocinas intracelulares exceto que Brefeídin A foi omitido. Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos após cultura durante a noite a 37 °C, e foram analisados por múltiplas citocinas usando kits de citocinas Thl/Th2 de camundongo a partir de Meso Scale Discovery. A quantidade de cada citocina por cultura foi determinada a partir de curvas padrões produzidas usando citocinas recow.binantes purificadas fornecidas pelo fabricante.

2. Imunogenicidade Melhorada de CNE17 de antígeno RSV- F em um Modelo de Camundongo

As titulações de IgG sérica especifica de F no dia 14, 35 e 4 9 são apresentadas nas Tabelas 14, 15 e 16. As titulações de neutralização do soro de RSV nos dias 35 e 49 são mostradas na Tabela 17 e as respostas das células T no dia 4 9 s-io mostradas na Tabela 18 e 19. Tabela 14: Titulações de IgG sérica específica de F de camundongos no dia 14

O soro foi recolhido para análise de anticorpos nos dias 14 (2wpl). Os dados são representados como animais individuais e as o i. tulações médias geométricos de 10 camundongos individuais por grupo. Se um animal individual tinha uma 5 titulação de <25 (limite de detecção) o mesmo era atribuído com uma titulação de 5. Tabela 15: Titulações séricas de IgG especificas de F dos camundongos no dia 35

O soro foi recolhido para análise de anticorpos nos dias 35 (2wp2). Os dados são representados como animais individuais e as titulações médias geométricas de 10 camundongos individuais por grupo. Se um animal individual tinha uma titulação de <25 (limite de detecção) o mesmo era atribuido 15 com una titulação de 5. Tabela 16: Titulações séricas de IgG específicas de F  dos camundongos no dia 49

O soro foi coletado para análise de anticorpos no dia 4 9 (4wp2). Os dados são representados como animais individuais e r..i tulações médias geométricas de 10 camundongos individuais por grupo. Se um animal tinha uma titulação de <25 (limite de detecção) o mesmo foi atribuído com uma titulação de 5. Tabela 17: Titulações de neutralização de RSV do soro

O soro roi coletado para análise no dia 35 (2wp2) e 4 9 (4wp2) . Os dados são representados como 60% de titulações de neutralização de redução de placas de camundongos individuals e titulação média geométrica de 10 camundongos individuals por grupo. Se um animal tinha uma titulação de <40 (limite de detecção) o mesmo foi atribuído com uma titulação de 20. NA = não analisado. Tabela 18 : Frequências de células T esplénicas CD4+ especificas de RSV F no dia 49 (4wp2)

São mostradas as frequências liquidas positivas para citocma (%) (antígeno-especí ficas) ± 95% de confiança de metade dn intervalo. As frequências líquidas mostradas em negrito indicam respostas estimuladas que foram estatisticamente significativas > 0. Tabela 19: Frequências de células-T esplénicos CD8+ especificas de RSV F no dia 49 (4wp2)

São mostradas as frequências líquidas positivas para citocinas (%) (antígeno-específicas) ± 95% de confiança da metade do intervalo. As frequências líquidas mostradas em negrito indicam respostas estimuladas que foram  estatisticamente significativas > 0.

Conforme mostrado nas Tabelas 14-19, a formulação de CNE] 7 melhorou a :i munogenicidade, tal como'determinado pelo aumento das tituações de IgG especifica para F (aumento de 5-vezes de 4wp2), titulações de neutralização, respostas de células T CD4 e CD8, em relação ao controle de RNA nu. Eletroporação imunogenicidade melhorada de RNA em relação ao controle de RNA nu, mas foi inferior a distribuição CNE17. Importantemente, as respostas imunes provocadas nos grupos CNE17 flutuaram muito menos em comparação com as de RNA nu. Por exemplo, as amostras dos dias 14 a partir de lμg do grupo de RNA autorreplicante nu geraram as titulações de anticorpos entre 529 e 5110, ao passo que as amostras de RNA formuladas com CNE17 em uma dose de lμg geraram as titulações de anticorpos entre 1927 e 5731. Além disso, todos os animais do grupo CNE17 responderam com uma resposta robusta e reforçaram muito bem. Em contraste, alguns dos animais do grupo de RNA nu não reforçaram sign!ficativamente.

EXEMPLO 5 : IMUNOGENICIDADE DOS COMPLEXOS DE RNA- PARTICULA EM UM MODELO DE CAMUNDONGO 1. Métodos Vacina de subunidade de RSV-F trímero

O RSV F trímero é uma proteína recombinante que compreende o ectodomínio de RSV F, com uma deleção da região oo pept.ídeo de fusão que previne a associação de outros trimeros. A construção resultante forma um trímero homooêneo, tal como observado por cromatografia de exclusão por tamanho, e tem um fenótipo esperado de acordo com uma conformação de F pós-fusão como observado por microscopia eletrônica, A proteína foi expressa em células de inseto e purificada por virtude de um HIS-tag na fusão com o terminal C do construto seguido por cromatografia de exclusão por tamanho através de técnicas convencionais. A amostra do proteína resultante apresenta mais do que 95% de pureza. Para a avaliação in vivo da vacina de subunidade F, 100 μg/ml de proteína de trímero foram adsorvidos em 2 mg/ml de alume usando tampão de histidina 10 mM, pH 6,3 e a isotonicidade ajustada com cloreto de sódio a 150 mM. A proteína de subunidade F foi adsorvida em alume, com agitação suave durante a noite a 2-8 °C.

•Vacinação e desafio de ratos de algodão

Os raios do algodão do sexo feminino (Sigmodon hispidis) foram obtidos a partir de Harlan Laboratories. Todos os estudos foram aprovados e realizados de acordo com a Novartis Animal Care e o Use Committee. Grupos de animais foram imunizados por via intramuscular (i.m., 100 μl) com as vacinas indicadas nos dias 0 e 21. As amostras de soro foram recolhidas 3 semanas após a primeira imunização e 2 semanas após a segunda imunização. Os animais de controle imunizados ou não vacinados foram desafiados intranasalmente (i.n.) com IxlO5 de PFU RSV 4 semanas após a imuni.zação final. A coleta de sangue e desafio de RSV foi realizado em anestesia com isoflurano a 3% usando um vaporizador de precisão.

ELISA específico para RSV F

As amostras individuais de soro foram analisadas para a presença de 1 gG específica para RSV-F por ensaio de absorção de ligação a enzima (ELISA). Placas de ELISA (96 poços de MaxiSorp, Nunc) foram revestidas durante a noite a 4 °C com 1. μg/ml de RSV F purificado (delp23-furdel-trunc não clivado) em PBS. Após a lavagem (PBS com 0,1% de Tween- 20) , as placas foram bloqueadas com tampão de bloqueio Superb Lock em PBS (Thermo Scientific) durante pelo menos 1,5 horas, a 37 °C. As placas foram então lavadas, diluições em série de soro em diluente de ensaio (PBS com 0,1% de Tween-20 e 5% de soro de cabra) a partir de camundongos de algodão experimentais ou de controle foram adicionadas, e as placas foram incubadas durante 2 horas a 37 °C . Após a lavagem, as placas foram incubadas com IgG de rato anti- algodão de galinha conjugada a peroxidase de rábano (HRP) (Immunology Consultants Laboratory, Inc, diluido 1:5000 em diluenue de ensaio) durante 1 hr a 37 °C. Finalmente, as placas foram lavadas e 100 μl da solução de substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard &Perry Laboratories, Inc), foram adicionados a cada poço. As reações foram interrompidas pela adição de 100 μl de H3PO4 IM, e a absorvância foi lida a 450 nm usando um leitor de placas. Para cada amostra de soro, um gráfico da densidade óptica (DO) versus logaritmo da diluição de soro reciproca foi gerado por meio de regressão não linear (GraphPad Prism). As titulações foram definidas como a diluição de soro reciproca a uma DO de aproximadamente 0,5 (normalizado a um soro de pooi padrão a partir de ratos de algodão infectados com RSV com uma titulação definida de 1: 2500, que foi incluída em cada placa).

fnsaío de Microneutralização

As amostras de soro foram testadas para a presença de anticorpos de neutralização por úm teste de neutralização por redução do placa (PRNT). Duas diluições em série de soro-Hi’ (em PBS com HI-FBS a 5%) foram adicionadas a urn volume igual de RSV longo previamente titulado para gerar aproximadamente 115 PFU/25 μl. Misturas de soro/virus foram incubadas durante 2 horas a 37 °C e 5% de CO2, para permitir que a neutralização do virus ocorra e, em seguida, 25 μl desta mistura (contendo aproximadamente 115 PFU) foi inoculada em poços em duplicata de células HEp-2 em placas de 96 poços. Após 2 horas, a 370C e 5% de CO2, as células foram cooertas com 0,75% de Metil Celulose/EMEM 5% de HI- FBS e incubadas durante 42 horas. 0 número de partículas de vírus infecciosas foi determinado por detecção da formação de sincícios por imunocoloração seguida de contagem automatizada. A titulação de neutralização é definida como o recíproco da diluição do soro que produz pelo menos uma redução do 60% no número de sincícios por poço, em relação aos controles (sem soro).

Cã rga vi ra 1

A carga viral no pulmão foi determinada por ensaio de placa. Especificamente, os pulmões foram retirados 5 dias após a infecção por RSV e um lobo direito foi colocado em 2,5 ml de meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) com 25% de sacarose e rompidos com um homogeneizador de tecidos. Os sobrenadantes livres de células destas amostras foram armazenados a -80°C. Para ensaiar para o vírus infeccioso, as diluições do homogeneizado de pulmão clarificado (em PBS com 5% de soro fetal bovino inativado por calor, HI-FBS) foram inoculadas em monocamadas de células HEp-2 confluentes em um volume de 200 μl/poço de uma placa de 12 poços. Após 2 horas com agitação suave periódica (37°C, 5% de CO2) , o inóculo foi removido e as células foram cobertas com 1,5 ml de 1,25% de SeaPlaque agarose (Lonza) em Meio Mínimo Essencial de Eagle (EMEM, Eoriza), suplementado com 5% de HI-FBS, glutamina e antibióticos. Após 3-4 dias de incubação, as células foram novamente cobertas com 1 ml de 1,25% de agarose em EMEM (Sigma) contendo 0,1% de vermelho neutro (Sigma). As placas são contadas um dia depois com a ajuda de uma caixa de luz.

Patologia, pulmonar de rato de algodão

Cinco dias após a provocação por RSV os pulmões foram colhidos e quatro lóbulos de cada animal foram recolhidos e fixados com formalins tamponada neutra a 10% (NBF) por instilação intratraqueal suave seguido por fixação de imersão. Os tecidos foram processados rotineiramente para preparar seções coradas de hematoxilina & eosina para exame microscópico. Os resultados foram avaliados usando uma modificação de critérios .previamente publicados [Prince GA, et al, 2001] para os seguintes parâmetros: peribronquiolite, alveolite, bronquite, infiltrados celulares perivasculares e pneumonite intersticial. As lesões foram classificadas em uma escala semiquantitativa de 4 pontos. A mudança mínima (+) continha um ou alguns pequenos focos, a mudança leve (++) foi composta de focos de tamanho pequeno a médio; a mudança moderada (+++) continha focos de tamanho frequentes e/ou moderado, e a mudança acentuada (++++) mostrou focos extensos a confluenies afetando mais/todos os tecidos.

2. Estudo de desafio por RSV de rato de algodão

O replicon A317, que expressa a glicoproteína de fusão de superfície de vírus sincicial (RSV-F) foi usada para este estudo. Ratos do algodão (Sigmodon hispidus), 8  animais por grupo, foram administrados com vacinas int.ramuscu.1 a rcs bilaterais (50 μl por pata) nos dias 0 e 21 corn RNA autorreplicante nu (A317, 1 μg ou 10 μg) , RNA fautorreplicante formulado com CNE17 (A317, 0,1 μg ou 1 μg), VRPs (5xl06 UI) expressando RSV-F, subunidade de F- trímero/alume (10 μg) , ou vacina de RSV inativada por formalina (5200 Fl-pfu). O soro foi recolhido por análise de anticorpos nos dias 14 (2wpl) e 35 (2wp2) . Todos os animais foram desafiados com IxlO5pfu de RSV por via intrmnsδl no dia 49 e os pulmões foram colhidos no dia 54 (5dpc) para a determinação da carga viral e patologia pulmonar.

As titulações de IgG sérica especifica de F no dia 14 e 35 são mostradas na Tabela 20; as titulações de anticorpos individuais para 8 animais dos grupos selecionados de 2wp2 são mostradas na Tabela 21; as titulações de neutralização de RSV do soro nos dias 14 e 35 são mostradas na Tabela 22; as titulações pulmonares virais 5 dias após desafio dom RSV são mostradas na Tabela 23, e pontuações de alveolite de pulmão 5 dias pós desafio com RSV são mostradas na Tabela 24. Tabela 20: Titulações de IgG sérica específica de F dos ratos de algodão {Sigiaodon hispidus)

8 animais por grupo, após as vacinações intramusculares nos dias 0 e 21. O soro foi recolhido para análise de anticorpos nos dias 14 (2wpl) e 35 (2wp2), todos os animais foram desafiados com IxlO5de RSV pfu por via intranasal no 5 dia 49. Os pulmões foram colhidos no dia 54 (5dpc) para a determinação da carga viral e patologia pulmonar. Os dados são representados como as titulações médias geométricas de 8 ratos de algodão individuais por grupo. Se um animal tinha uma uitulação de <25 (limite de detecção) o mesmo era 10 atribuído com uma titulação de 5. Tabela 21: As titulações de anticorpos individuais na 2wp2

As titulações de anticorpos individuais para 8 animais dos grupos selecionados (RNA nu e RNA formulado com CNE). Tabela 22: Titulações de neutralização de RSV do soro de ratos do algodao (Sigmodon hispidus)

8 animais por grupo, após as vacinações intramusculares nos dias 0 e 21. O soro foi recolhido para análise no dia 14 (2wpl) e 35 (2wp2). Os dados são representados como 60% de titulações de neutralização de redução de placas. Titulação média geométrica de 2 pools de 4 ratos de algodão por grupo. Se um animal tinha uma titulação de <25 (limite de detecção) o mesmo era atribuído com uma titulação de 5. Tabela 23: Titulações virais pulmonares 5 dias após o desafio por RSV em ratos de algodão (Sigmodon hispidus)

8 animais por grupo, após as vacinações intramusculares nos dias 0 e 21. 0 soro foi recolhido para análise no dia 14 (2wpl) e 35 (2wp2) . Os dados são representados como 60% de titulações de neutralização de redução de placas. Titulação média geométrica de 2 pools de 4 ratos de algodão por grupo. Se um animal tinha uma titulação de <25 (limite de detecção) o mesmo era atribuído com uma titulação de 5. Tabela 24: Alveoli te pulmonar 5 dias após o desafio com RSV de ratos de algodão (Sigmodon hispidus)

8 animais por grupo, após as vacinações intramusculares nos dias 0 o 21. Todos os animais foram desafiados com IxlO5 de RSV pfu por via intranasal no dia 49. Os pulmões foram colhidos no dia 54 (5dpc) para a determinação da carga viral e patologia do pulmão. As lesões foram classificados em uma escala semiquantitativa de 4 pontos. Mudança minima (1) continha um ou poucos focos pequenos; mudança leve (2) foi composta por focos de tamanho de pequeno a médio; mudança moderada (3) contida focos de tamanho moderado e/ou frequentes; e as mudanças acentuadas (4) mostraram focos extensos a confluentes que afentando a maioria/todos os teci d os. idste escudo mostra a imunogenicidade e a capacidade de proteção de replicon RNA no modelo RSV do rato de algodão. 0 replicon de RNA não formulado induziu anticorpos de neutralização de RSV e IgG específicos de F do soro após uma vacinação, e estas respostas foram reforçadas por uma segunda vacinação. CNE foi eficaz neste modelo, reforçando as tituações de IgG especifica para F para 1 μg de replicon de RNA aproximadamente 9 vezes e titulações de neutralização por 4 vezes após a segunda vacinação. Além disso, CNE1'7 reduziu as variações consideráveis das respostas imunes que foram observadas quando foi usado RNA nu, independentemente das doses (0,1 ou 1 μg) , e todos os animais responderam à vacinação. Todas as vacinas de replicon de RNA forneceram proteção contra um desafio por RSV nasal, .^eduzindo a carga viral do pulmão 5 dias após o desafio por RSV por mais de 3 ordens de grandeza. A magnitude e a capacidade protetora da resposta imune gerada por 1 μg de replicon de RNA formulada com CNE estava dentro de 2 vezes a resposta indizida por 5xl06 VRPs.

EXEMPLO 6: EFEITO DO TAMANHO DAS PARTÍCULAS SOBRE AIMUNOGENICIDADE

Este exemplo mostra que o tamanho das partículas afeta a imunogenicidade das formulações de CNE/RNA.

Os protocolos para ensaio do tamanho de partícula e ensaio SEAP Jn vivo estão descritos no Exemplo 2. Os protocolos para os estudos de imunogenicidade de murino são descritos no Exemplo 3. A Figura 8A mostra os resultados (média aritmética) de ensaio de SEAP in vivo. A Figura 8B mostra as ritulações de IgG total de animais individuais nos camundongos BALB/c nos pontos de tempo 2wpl e 2wp2.

A complexação de RNA com CNE17 aumentou o tamanho de partículas de cerca de 220 nm para cerca de 300 nm (dados não mostrados) . Como mostrado nas Figuras 8A e 8B, na medida em que a dimensão da partícula aumentou, os níveis de expressão de SEAP foram reduzidos, e as respostas do sistema imune hospedeiro foram também diminuídas.

EXEMPLO 7 : AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE LIPÍDEOS CATIÔNICOS ALTERNATIVOS SOBRE A IMUNOGENICIDADE 1. Materiais e Métodos. Prepa ração dc CNEs

Urna série de emulsões foi produzida usando os seguintes lipídeos catiônicos: DLinDMA, DOTMA, DOEPC, DSTAP, DODAC, e DODAP. A Tabela 25 descreve os componentes das emulsões.

As CNEs foram preparadas de acordo com os protocolos descritos no Hxemplo 1. 0-complexo de RNA/CNE foi preparado de acordo corn os protocolos descritos no Exemplo 2. Tabela 25

Estudos de imunogenicidade em murinos

As emulsões foram testadas a razões de N/P de 10:1, N/P de 12:1. ou N/P de 18:1 (ver Tabela 26) . Em seguida, o replicor: de RNA e as emulsões foram complexados como descrito snteriormente no Exemplo 2. Os Camundongos BALB/c, 5 5-10 animais por grupo, foram administrados com vacinas intramusculares bilaterais (50 μl por pata) nos dias 0 com RNA autorreplicante nu (A317, 1 μg) , RV01 (15) (1 μg de A317 formulado em um lipossoma que continha 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de Choi, 2% de PEG DMG 2000), RNA 10 autorreplicante (A317, lμg) formulado com CNE13, CNE17, CMF37, CMF38 ou CMF42.

2. Imunogenicidade melhorada de RNA formulado com CNE do antigeno de RSV-F em um modelo de camundongo

As titulações de igG total (titulações médios 15 geométricos) a partir dos grupos de camundongos BALB/c no dia 14 e 35 são mostradas na Tabela 26 (grupos 1-8) . RNA formulado com CMF37 (DOTMA) melhorou a resposta imune do hospedeiro também, e as titulações de IgG eram comparáveis às de CNE17 (DOTAP). RNA formulado com CMF38 (DOEPC) 20 provocou uma uiiulação de IgG ligeiramente maior do que o com CNE17, mas a melhoria não foi estatisticamente significativa. RNA formulado com DSTAP não melhorou sign.: f i.car.ivamente a resposta imune do hospedeiro, e as baixas i: : tulações de IgG foram provavelmente devido à baixa 25 solubilidade do DSTAP em esqualeno. RNA formulado com CNE13 melhorou as titulações de IgG para de cerca de 1,5 vezes ma.: os do que a dc RNA formulado com lipossomas (DDA) . As titulações de anticorpos totais induzidos por RNA formulado com CMF43 (DODAC)- foram menores do que as de CNE17 (Tabela 30 28, Grupos 7 e 8). Tabela 26

Grupos 1-8 tiveram 5 animais/grupo, e grupos de 9-12 tiveram 10 animais/grupo

EXEMPLO 8: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE COMPOSIÇÕES DE 5 TAMPÃO SOBRE A IMUNOGENICIDADE

Neste exemplo, várias emulsões baseadas em CNE17, mas com diferentes componentes do tampão foram preparadas. A Tabela 27 mostra as composições das emulsões de tampão- modi íói ca das . Tabela 27

O ensaio de ligação in vitromostrou que a redução da concentração de tampão de citrato fez com que o RNA se ligasse mais fortemente (dados não mostrados).

Os resultados dos estudos de imunogenicidade de murinos mostraram que a adição de açúcares para CNE17 não impactou signrf icat.i.vamente a imunogenicidade de RNA formulado com. CNF,17 (Tabela 26, grupos 9-12) . Ligeiros aunemos das titulações de IgG foram observados com a adição de sorbitol e dextrose.

A Tabela 28 resume os resultados dos estudos de imunogenicidade de murino quando RNAs formulados com CNE17 foram preparados usando sistemas de tampão diferentes. Tabela 28

* replicon VA375, ** replicon vA317. Os replicons foram transcritos por Ambion em tampão HEPES, então (i) precipitados com LiCl, (ii) nivelados no tampão Tris, e (iii) precipitados com LiCl. Todos os grupos tiveram 8 anima :i s/g rapo .

As composições de tampão diferentes também afetaram o tamanho das partículas. Como mostrado na Figura 9, a adição de açúcar (sacarose) diminuiu o tamanho das partículas do complexo de RNA/CNE (Figura 9A) ; adição de baixas concentrações de NaCl (em lOmM) também diminuiu o tamanho das partículas do complexo de RNA/CNE (Figura 9A). O tampão de o i taw não afetou o tamanho das partículas do complexo de RNA/CN(F1 g u r a 9B) .

Os eleitos de polímeros sobre o tamanho de partícula são apresentados na Figura 9C. Em particular, a adição de 0,5% de pluronic F127 para tampão de RNA reduziu o tamanho das partículas do complexo de RNA/CNE ao tamanho de pré- complexação (partículas CNE sem RNA).

As titulações de anticorpos totais e as titulações de anticorpos de neutralização de CNE17 em sistemas de tampão preferidos, sacarose 2 80 mM, NaCl lOmM e citrato lmM, ou sacarose 2.80mM, NaCl lOmM, citrato lmM, e 0,5% (p/v) de Pluronic Kl 27, são apresentados na Tabela 28 (grupos 4 e 5) .

EXEMPLO 9: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO PEG-LIPÍDEOS SOBRE A IMUNOGENICIDADE

Neste eXemplo, uma série de emulsões foi produzida usando PEG- ipldeos. A Tabela 29 mostra as composições destas emulsoes lipidicas a base de PEG Tabela 29

Para todas as emulsões, uma solução de estoque de 10 mg/ml de DOTAP cm DCM foi usada, e o solvente foi evaporado após a '° homogeneização. Estudos de imunogenicidade em murines foram real izados como descrito acima no Exemplo 7.

A Tabela 30 mostra as titulações de anticorpos de pool nos pontos de tempo 2wpl e 4wp2. Para o grupo de CNE13, a média das tituações de animais individuais, e as titulações médias geométricas são mostradas. Como mostrado na Tabela 30, as emulsões feitas com' PEG-lipideos foram eficazes na indução de resposta imune contra o antigeno de RSV-F, mas as Ululações de anticorpos totais foram em um nivel inferior em relação ao RNA formulado com CNE17. Além disso, 5 o aumento da concentração de PEG-lipideos levou a uma redução das tituações de anticorpos. Tabela 30

*replicon vA317, Grupos 1-10 tiveram 5 animais/grupo e grupo 11 teve 10 anumais/grupo

O relatorio prontamente reconhece que muitas outras modalidades são abrangidas pela invenção. Todas as publicações e patentes citadas nesta divulgação são incorporadas por referência na sua totalidade. Na medida em que o material incorporado por 5 referência contradiz ou não consiste com o presente relatório descritivo, o relatório descritivo irá substituir qualquer material desse tipo. A citação de qualquer referência aqui não é uma admissão de que tais referências são estado da técnica em relação à presente invenção.

Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalern.esdestinam-se a ser englobados pelas seguintes 15 modalidades.

Claims (17)

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de RNA complexada com uma partícula de uma emulsão de óleo em água catiônica, em que a partícula compreende: (a) um núcleo oleoso que está em fase líquida a 25°C selecionado a partir do grupo que consiste em: óleo de soja, óleo de girassol, óleo de oliva, esqualeno, esqualano ou uma combinação dos mesmos, e (b) um lipídeo catiônico selecionado do a partir do grupo que consiste em: 1,2-dioleoiloxi-3- (trimetilamônio)propano (DOTAP), 3β-[N-(N',N'- dimetilaminoetano)-carbamoil] colesterol (Colesterol DC), dimetildioctadecilamônio (DDA), 1,2-dimiristoil-3-Trimetil Amônio Propano (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetil amônio propano (DPTAP), distearoiltrimetilamônio propano (DSTAP), cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), cloreto de N,N-dioleoil-N,N- dimetilamônio (DODAC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- etilfosfocolina (DOEPC), 1,2-dioleoil-3-dimetil-amônio- propano (DODAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLinDMA); de modo que a carga líquida total da partícula de emulsão antes da complexação do RNA seja positiva e em que a referida molécula de RNA seja um RNA auto-replicante que codifica um antígeno protéico e o referido RNA seja ancorado à superfície da referida partícula por interações não covalentes.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a partícula compreende ainda um surfactante dentre Trioleato de Sorbitano, polissorbato 80 ou uma combinação dos mesmos.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a emulsão de óleo em água catiônica compreende de 0,01% a 2,5% (v/v) de surfactante não iônico.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o surfactante está em uma fase aquosa da emulsão de óleo em água.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição compreende de 0,2% a 9% (v/v) de óleo.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o lipídeo catiônico é DOTAP e a emulsão de óleo em água catiônica compreende de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml de DOTAP.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o lipídeo catiônico é Colesterol DC e a composição compreende de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml de colesterol DC.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o lipídeo catiônico é DDA e a composição compreende de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml de DDA.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o lipídeo catiônico é DOTMA e a composição compreende de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml de DOTMA.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o lipídeo catiônico é DOEPC e a composição compreende de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml de DOEPC.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o lipídeo catiônico é DODAC e a composição compreende de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml de DODAC.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um antígeno.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das partículas da emulsão não é maior do que 200 nm.

14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a razão N/P da emulsão é de 4:1 a 14:1.

15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das partículas da emulsão é de 80 nm a 180 nm, e a razão N/P da emulsão é de pelo menos 4:1.

16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um agente de tonificação de sacarose, manitol, trealose sorbitol ou dextrose.

17. Uso de uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para gerar uma resposta imune.

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