JP2020513824A - Crispr関連タンパク質をコードする核酸、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
人工核酸分子:人工核酸分子は、典型的に、自然界には存在しない核酸分子(例えば、DNA又はRNA)であると理解してよい。言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子として理解してよい。かかる核酸分子は、その個々の配列(自然界には存在しない)及び/又は他の修飾(例えば、自然界には存在しないヌクレオチドの構造的修飾)から非天然であり得る。人工核酸分子は、DNA分子であってもよく、RNA分子であってもよく、DNA部分とRNA部分とを含むハイブリッド分子であってもよい。典型的に、人工核酸分子は、所望の人工ヌクレオチド配列(異種配列)に相当するように遺伝子修飾方法によって設計及び/又は作製することができる。これに関連して、人工配列は、通常、自然界には存在し得ない配列である、即ち、少なくとも1つのヌクレオチドが野生型配列とは異なる。用語「野生型」とは、自然界に存在する配列であると理解してよい。更に、用語「人工核酸分子」の意味は、「1つの単一分子」には限定されず、典型的に、同一分子の集合体を含むと理解される。したがって、人工核酸分子とは、アリコートに含有されている複数の同一分子に関する場合もある。
5’UTR
本明細書に記載の人工核酸は、本明細書に記載の遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメントを含む。
本明細書に特定される5’UTRエレメントの幾つかは、TOP遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来し得る。
本発明に係る人工核酸は、17−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ4をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片(好ましくは5’TOPモチーフを欠く)に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、リボソームラージタンパク質(RPL)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含むことができ、前記5’UTRエレメントは、好ましくは5’TOP(末端オリゴピリミジントラクト)モチーフを欠く。
本発明に係る人工核酸は、シトクロムcオキシダーゼサブユニット(NDUFA4)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、溶質輸送体ファミリー7メンバー3(SLC7A3)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアATPシンターゼサブユニットアルファ(ATP5A1)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含むことができ、前記5’UTRエレメントは、好ましくは5’TOPモチーフを欠く。
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアATPシンターゼサブユニットアルファ(ASAH1)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、又は断片に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含むことができ、前記5’UTRエレメントは、好ましくは5’TOPモチーフを欠く。
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアATPシンターゼサブユニットアルファ(MP68)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含むことができ、前記5’UTRエレメントは、好ましくは5’TOPモチーフを欠く。
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアATPシンターゼサブユニットアルファ(RPL31)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含むことができ、前記5’UTRエレメントは、好ましくは5’TOPモチーフを欠く。
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアATPシンターゼサブユニットアルファ(TUBB4B)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含むことができ、前記5’UTRエレメントは、好ましくは5’TOPモチーフを欠く。
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアATPシンターゼサブユニットアルファ(UBQLN2)をコードする遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる5’UTRエレメントを含むことができ、前記5’UTRエレメントは、好ましくは5’TOPモチーフを欠く。
本明細書に記載の人工核酸は、本明細書に記載の遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片の3’UTRに由来する少なくとも1つの3’UTRエレメントを更に含む。「3’−UTR」という用語は、オープンリーディングフレームの3’(即ち「下流」)に位置し、タンパク質に翻訳されない核酸分子の一部を意味する。本発明の文脈において、3’−UTRは、タンパク質コード配列の終止コドン、好ましくはタンパク質コード配列の終止コドンの3’の直近と、人工核酸分子のポリ(A)配列との間に位置する配列に対応する(好ましくはRNAである)。
本発明に係る人工核酸は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質G(s)サブユニットアルファアイソフォームショート(GNAS)をコードする遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる3’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、カスパーゼ−1(CASP1)をコードする遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる3’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、プロテアソームサブユニットベータ3型(PSMB3)をコードする遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる3’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、血清アルブミン(ALB)をコードする遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる3’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、40Sリボソームタンパク質S9(RPS9)をコードする遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる3’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、COX6B1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる3’UTRエレメントを含み得る。
本発明に係る人工核酸は、NDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる3’UTRエレメントを含み得る。
好ましくは、少なくとも1つの5’UTRエレメント及び少なくとも1つの3’UTRエレメントは相乗的に作用して、前記UTRに機能可能に連結された少なくとも1つのコード配列の発現を上昇させる。本明細書では、列挙された5’−UTR及び3’−UTRを任意の有用な組合せで利用することが想定される。特に有用な5’及び3’UTRを以下の表1Aに示す。5’UTRと3’−UTRの特に有用な組合せを以下の表1Bに示す。本発明の特に好ましい実施形態は、最適なCDS、即ちCas9、Cpf1、CasX、CasY、又はCas13と、HSD17B4/Gnas.1;Slc7a3.1/Gnas.1;ATP5A1/CASP.1;Ndufa4.1/PSMB3.1;HSD17B4/PSMB3.1;RPL32var/アルブミン7;32L4/アルブミン7;HSD17B4/CASP1.1;Slc7a3.1/CASP1.1;Slc7a3.1/PSMB3.1;Nosip.1/PSMB3.1;Ndufa4.1/RPS9.1;HSD17B4/RPS9.1;ATP5A1/Gnas.1;Ndufa4.1/COX6B1.1;Ndufa4.1/Gnas.1;Ndufa4.1/Ndufa1.1;Nosip.1/Ndufa1.1;Rpl31.1/Gnas.1;TUBB4B.1/RPS9.1;及びUbqln2.1/RPS9.1の群から選択されるUTR組合せとの組合せを含む。
a.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
b.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
c.ATP5A1遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
d.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
e.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSSLC7A3MB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
f.RPL32遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びALB遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
g.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
h.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
i.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
j.NOSIP遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
k.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
l.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
m.ATP5A1遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
n.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCOX6B1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
n.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
o.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
p.NOSIP遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
q.RPL31遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
r.TUBB4B遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
s.UBQLN2遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
t.MP68遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
u.MP68遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメントを含み得る。
CRISPR関連タンパク質
本発明に係る人工核酸は、CRISPR関連タンパク質をコードする少なくとも1つのコード配列を含む。
本明細書に例示される各CRISPR関連タンパク質(Cas9、Cpf1など)はまた、好ましくはそのホモログも包含する。タンパク質に言及するとき、用語「ホモログ」は、「オルソログ」(又は「オルソロガスタンパク質」)及びパラログ(又は「パラロガスタンパク質」)を包含する。この文脈において、「オルソログ」は、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子によってコードされるタンパク質である。オルソログは、しばしば進化の過程で同じ機能を保持する。したがって、一対のオルソログを比較すると、機能を喪失している場合もあれば、獲得している場合もある。しかし、本発明の文脈において、オルソロガスCRISPR関連タンパク質は、好ましくは、目的のDNA配列と特異的に相互作用する(即ち、「機能的」である)適切なガイドRNAと会合する能力を保持する。「パラログ」は、ゲノム中の遺伝子重複を介して産生される遺伝子である。パラログは通常、新しい機能を進化させるか、又は最終的にシュード遺伝子になることがある。本発明の文脈において、パラロガスCRISPR関連タンパク質は、上で定義されるように、好ましくは機能的である。
本明細書に例示される各CRISPR関連タンパク質(Cas9、Cpf1など)はまた、好ましくはその変異体も包含する。
本明細書に例示される各CRISPR関連タンパク質(例えば、Cas9、Cpf1)はまた、好ましくはそれらの断片も包含する。
本明細書に例示される各CRISPR関連タンパク質(例えば、Cas9、Cpf1)はまた、好ましくはそれらの誘導体も包含する。
幾つかの実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAは、シグナルペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む。前記核酸配列は、好ましくは本発明の人工核酸分子のコード領域(CRISPR関連タンパク質をコードする)内に位置する。したがって、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAは、少なくとも1つのシグナルペプチドを含む、本明細書に定義されるCRISPR関連タンパク質又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード領域を好ましくは含むことができる。
本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAは、好ましくは少なくとも1つの核局在化配列(NLS)をコードする核酸配列を更に含み得る。前記核酸配列は、好ましくは本発明の人工核酸分子の(CRISPR関連タンパク質をコードする)コード領域内に位置する。したがって、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAは、少なくとも1つの核局在化配列(NLS)を含む、本明細書に定義されるCRISPR関連タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード領域を好ましくは含むことができる。
幾つかの実施形態において、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAは、タンパク質又はペプチドのタグをコードする少なくとも1つの核酸配列を更に含む。前記核酸配列は、好ましくは本発明の人工核酸分子のコード領域(CRISPR関連タンパク質をコードする)内に位置する。したがって、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAは、少なくとも1つのタンパク質又はペプチドのタグを含む、本明細書に定義されるCRISPR関連タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード領域を含むことが好ましい。
「Cas9」は、ストレプトコッカスピオゲネス血清型M1 cas9遺伝子(NCBI参照配列:NC_002737.2、「SPy1046」;S.ピオゲネス)、即ち、spCas9又はそのホモログ、変異体、若しくは断片によってコードされ得るRNAガイドII型CRISPR−CasDNAエンドヌクレアーゼを意味する。Cas9は、好ましくはガイドRNA(gRNA)によって動員されて、部位特異的に、DNAの二重らせんの各鎖に1つずつである2つの異なるエンドヌクレアーゼドメイン(HNH及びRuvC/RNase H様ドメイン)を用いて標的DNA配列を切断する。RuvC及びHNHは協働して、二本鎖切断(DSB)を生じ、別々に一本鎖切断を生じさせることができる(米国特許出願公開第2014−0068797号明細書及びJinek M., et al. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816−21)。Cas9は、好ましくは、標的DNA配列に並置されたプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を特異的に認識(好ましくはそれに結合)することができる。PAMは、典型的には、標的DNAの3’に位置し、いずれも3ヌクレオチド配列NGGを含み得る又はからなり得る。典型的には、Cas9のC末端近傍に位置するPAM相互作用ドメイン(PIドメイン)によって認識される。
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、本明細書に定義されるCas9タンパク質をコードする核酸配列を含む又はからなるコード配列を含むことができ、前記核酸配列は、配列番号412;3474〜3887;2314〜2327;4634〜4647;5794〜5807;6954〜6967;8114〜8127;413〜425;3490〜3503;3506〜3519;3522〜3535;3538〜3551;3554〜3567;3570〜3583;3586〜3599;3602〜3615;3618〜3631;3634〜3647;3650〜3663;3666〜3679;3682〜3695;9514〜9527;9626〜9639;9738〜9751;9850〜9863;9962〜9975;10074〜10087;10186〜10199;10298〜10311;2330〜2343;2346〜2359;2362〜2375;2378〜2391;2394〜2407;2410〜2423;2426〜2439;2442〜2455;2458〜2471;2474〜2487;2490〜2503;2506〜2519;2522〜2535;9498〜9511;9610〜9623;9722〜9735;9834〜9847;9946〜9959;10058〜10071;10170〜10183〜10282〜10295;4650〜4663;4666〜4679;4682〜4695;4698〜4711;4714〜4727;4730〜4743;4746〜4759;4762〜4775;4778〜4791;4794〜4807;4810〜4823;4826〜4839;4842〜4855;9530〜9543;9642〜9655;9754〜9767;9866 〜9879;9978〜9991;10090〜10103;10202〜10215;10314〜10327;5810〜5823;5826〜5839;5842〜5855;5858〜5871;5874〜5887;5890〜5903;5906〜5919;5922〜5935;5938〜5951;5954〜5967;5970〜5983;5986〜5999;6002〜6015;9546〜9559;9658〜9671;9770〜9783;9882〜9895;9994〜10007;10106〜10119;10218〜10231;10330〜10343;6970〜6983;6986〜6999;7002〜7015;7018〜7031;7034〜7047;7050〜7063;7066〜7079;7082〜7095;7098〜7111;7114〜7127;7130〜7143;7146〜7159;7162〜7175;9562〜9575;9674〜9687;9786〜9799;9898〜9911;10010〜10023;10122〜10135;10234〜10247;10346〜10359;8130〜8143;8146〜8159;8162〜8175;8178〜8191;8194〜8207;8210〜8223;8226〜8239;8242〜8255;8258〜8271;8274〜8287;8290〜8302;8306〜8319;8322〜8335;9578〜9591;9690〜9703;9802〜9815;9914〜9927;10026〜10039;10138〜10151;10250〜10263;10362〜10375;9290〜9303;9306〜9319;9322〜9335;9338〜9351;9354〜9367;9370〜9383;9386〜9399;9402〜9415;9418〜9431;9434〜9447;9450〜9463;9466〜9479;9482〜9495;9594〜9607;9706〜9719;9818〜9831;9930〜9943;10042〜10055;10154〜10167;10266〜10279;10378〜10391;27;996〜1009;2156〜2169;3316〜3329;4476〜4489;5636〜5649;6796〜6809;7956〜7969;1010〜1913;2170〜3073;3330〜4233;4490〜5393;5650〜6553;6810〜7713;7970〜8873のいずれか、又はその(機能的)ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列で定義される。
「Cpf1」(「Prevotella及びFrancisella 1由来のCRISPR」)又は「Cas12」は、推定クラス2タイプV CRISPR−Casシステム(Zetsche et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759−771)に属するRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼ、及びそのホモログ、変異体、断片、及び誘導体を意味する。Cpf1をコードする遺伝子は、フランシセラ ツラレンシス亜種ノビシダ(U112株)cpf1遺伝子(NCBI参照配列:NZ_CP009633.1、「AW25_RS03035」)又はそのホモログ、変異体、又は断片を含む。配列分析に基づき、Cpf1は、1つだけの検出可能なRuvCエンドヌクレアーゼドメインと、第2の推定新規ヌクレアーゼ(NUC)ドメインを含む(Zetsche et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759−771, Gao et al. Cell Res. 2016 Aug;26(8):901−13)。
幾つかのCpf1タンパク質が、当技術分野において知られており、本発明の文脈においてCRISPR関連タンパク質として想定される。好適なCpf1タンパク質は、以下の表3に列挙されている。そこでは、各行は、データベースアクセッション番号によって同定されるCpf1タンパク質に対応する(第1列、「A」、「Acc.No.」)。表2の第2列(「B」)は、本明細書に提供されるそれぞれのアミノ酸配列に対応する配列番号を示す。好ましいCpf1タンパク質は、配列番号1346〜1347;10576〜10577;及び1348〜1361として配列表に示される。本発明の好ましい実施形態である対応する最適化されたmRNA配列は、配列番号10552;3458〜3459;3460〜3473 2298〜2299;4618〜4619;5778〜5779;6938〜6939;8098〜8099;9258〜9259;2300〜2313;4620〜4633;5780〜5793;6940〜6953;8100〜8113;及び9260〜9273として配列表に示される。
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、本明細書に定義されるCpf1タンパク質をコードする核酸配列(ここで、前記核酸配列は、配列番号3488〜3489;10396;2328〜2329;10395;4648〜4649;10397;5808〜5809;10398;6968〜6969;10399;8128〜8129;10400;9274〜9287;3504〜3505;3520〜3521;3536〜3537;3552〜3553;3568〜3669;3584〜3585;3600〜3601;3616〜3617;3632〜3633;3648〜3649;3664〜3665;3680〜3681;3696〜3697;9528〜9529;9640〜9641;9752〜9753;9864〜9865;9976〜9977;10088〜10089;10200〜10201;10312〜10313;10403;10410;10417;10424;10431;10438;10445;10452;10459;10466;10473;10480;10487;10494;10501;10508;10515;10522;10529;10536;10543;2344〜2345;2360〜2361;2376〜2377;2392〜2393;2408〜2409;2424〜2425;2440〜2441;2456〜2457;2472〜2473;2489〜2490;2504〜2505;2520〜2521;2536〜2537;9512〜9513;9624〜9625;9736〜9737;9848〜9849;9960〜9961;10072〜10073;10184〜10185;10296〜10297;10402;10409;10416;10423;10430;10437;10444;10451;10458;10465;10472;10479;10486;10493;10500;10507;10514;10521;10528;10535;10542;4664〜4665;4680〜4681;4696〜4697;4712〜4713;4728〜4729;4744〜4745;4760〜4761;4776〜4777;4792〜4793;4808〜4809;4824〜4825;4840〜4841;4856〜4857;9544〜9545;9656〜9657;9768〜9769;9880〜9881;9992〜9993;10104〜10105;10216〜10217;10328〜10329;10404;10411;10418;10425;10432;10439;10446;10453;10460;10467;10474;10481;10488;10495;10502;10509;10516;10523;10530;10537;10544;5824〜5825;5840〜5841;5856〜5857;5872〜5873;5888〜5889;5904〜5905;5920〜5921;5936〜5937;5952〜5953;5968〜5969;5984〜5985;6000〜6001;6016〜6017;9560〜9561;9672〜9673;9784〜9785;9896〜9897;10008〜10009;10120〜10121;10232〜10233;10344〜10345;10405;10412;10419;10426;10433;10440;10447;10454;10461;10468;10475;10482;10489;10496;10503;10510;10517;10524;10531;10538;10545;7033;7048〜7049;7064〜7065;7080〜7081;7096〜7097;7112〜7113;7128〜7129;7144〜7145;7160〜7161;7176〜7177;9576〜9577;9688〜9689;9800〜9801;9912〜9913;10024〜10025;10136〜10137;10248〜10249;10360〜10361;10406;10413;10420;10427;10434;10441;10448;10455;10462;10469;10476;10483;10490;10497;10504;10511;10518;10525;10532;10539;10546;8144〜8145;8160〜8160;8176〜8177;8192〜8193;8208〜8209;8224〜8225;8240〜8241;8256〜8257;8272〜8273;8288〜8289;8304〜8305;8320〜8321;8336〜8337;9592〜9593;9704〜9705;9816〜9817;9928〜9929;10040〜10041;10152〜10153;10264〜10265;10376〜10377;10407;10414;10421;10428;10435;10442;10449;10456;10463;10470;10477;10484;10491;10498;10505;10512;10519;10526;10533;10540;10547;9288〜9289;10401;10553;10582〜10583;10579〜10580;10585〜10586;10588〜10589;10591〜10592;10594〜10595;10597〜10598;10554〜10574;10601;10602;10615;10616;10629;10630;10643;10644;10657;10658;10671;10672;10685;10686;10699;10700;10713;10714;10727;10728;10741;10742;10755;10756;10769;10770;10783;10784;10797;10798;10811;10812;10825;10826;10839;10840;10853;10854;10867;10868;10881;10882;10603;10604;10617;10618;10631;10632;10645;10646;10659;10660;10673;10674;10687;10688;10701;10702;10715;10716;10729;10730;10743;10744;10757;10758;10771;10772;10785;10786;10799;10800;10813;10814;10827;10828;10841;10842;10855;10856;10869;10870;10883;10884;10605;10606;10619;10620;10633;10634;10647;10648;10661;10662;10675;10676;10689;10690;10703;10704;10717;10718;10731;10732;10745;10746;10759;10760;10773;10774;10787;10788;10801;10802;10815;10816;10829;10830;10843;10844;10857;10858;10871;10872;10885;10886;10607;10608;10621;10622;10635;10636;10649;10650;10663;10664;10677;10678;10691;10692;10705;10706;10719;10720;10733;10734;10747;10748;10761;10762;10775;10776;10789;10790;10803;10804;10817;10818;10831;10832;10845;10846;10859;10860;10873;10874;10887;10888;10609;10610;10623;10624;10637;10638;10651;10652;10665;10666;10679;10680;10693;10694;10707;10708;10721;10722;10735;10736;10749;10750;10763;10764;10777;10778;10791;10792;10805;10806;10819;10820;10833;10834;10847;10848;10861;10862;10875;10876;10889;10890;10611;10612;10625;10626;10639;10640;10653;10654;10667;10668;10681;10682;10695;10696;10709;10710;10723;10724;10737;10738;10751;10752;10765;10766;10779;10780;10793;10794;10807;10808;10821;10822;10835;10836;10849;10850;10863;10864;10877;10878;10891;10892;9304〜9305;9320〜9321;9336〜9337;9352〜9353;9368〜9369;9384〜9385;9400〜9401;9416〜9417;9432〜9433;9448〜9449;9464〜9465;9480〜9481;9496〜9497;9608〜9609;9720〜9721;9832〜9833;9944〜9945;10056〜10057;10168〜10169;10280〜10281;10392〜10393;10408;10415;10422;10429;10436;10443;10450;10457;10464;10471;10478;10485;10492;10499;10506;10513;10520;10527;10534;10541;10548のいずれかで定義される);又はその(機能的)ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなるコード配列を含み得る。
831;10832;10845;10846;10859;10860;10873;10874;10887;10888;10609;10610;10623;10624;10637;10638;10651;10652;10665;10666;10679;10680;10693;10694;10707;10708;10721;10722;10735;10736;10749;10750;10763;10764;10777;10778;10791;10792;10805;10806;10819;10820;10833;10834;10847;10848;10861;10862;10875;10876;10889;10890;10611;10612;10625;10626;10639;10640;10653;10654;10667;10668;10681;10682;10695;10696;10709;10710;10723;10724;10737;10738;10751;10752;10765;10766;10779;10780;10793;10794;10807;10808;10821;10822;10835;10836;10849;10850;10863;10864;10877;10878;10891;10892;2298〜2299;3458〜3459;4618〜4619;5778〜5779;6938〜6939;8098〜8099;9258〜9259;10552;2300〜2313;3460〜3473;4620〜4633;5780〜5793;6940〜6953;8100〜8113;9260〜9273;2314〜2327;3474〜3887;4634〜4647;5794〜5807;6954〜6967;8114〜8127;9274〜9287;2328〜2329;10395;3488〜3489;10396;4648〜4649;10397;5808〜5809;10398;6968〜6969;10399;8128〜8129;10400;9288〜9289;10401;10553;2344〜2345;2360〜2361;2376〜2377;2392〜2393;2408〜2409;2424〜2425;2440〜2441;2456〜2457;2472〜2473;2489〜2490;2504〜2505;2520〜2521;2536〜2537;9512〜9513;9624〜9625;9736〜9737;9848〜9849;9960〜9961;10072〜10073;10184〜10185;10296〜10297;10402;10409;10416;10423;10430;10437;10444;10451;10458;10465;10472;10479;10486;10493;10500;10507;10514;10521;10528;10535;10542;3504〜3505;3520〜3521;3536〜3537;3552〜3553;3568〜3669;3584〜3585;3600〜3601;3616〜3617;3632〜3633;3648〜3649;3664〜3665;3680〜3681;3696〜3697;9528〜9529;9640〜9641;9752〜9753;9864〜9865;9976〜9977;10088〜10089;10200〜10201;10312〜10313;10403;10410;10417;10424;10431;10438;10445;10452;10459;10466;10473;10480;10487;10494;10501;10508;10515;10522;10529;10536;10543;4664〜4665;4680〜4681;4696〜4697;4712〜4713;4728〜4729;4744〜4745;4760〜4761;4776〜4777;4792〜4793;4808〜4809;4824〜4825;4840〜4841;4856〜4857;9544〜9545;9656〜9657;9768〜9769;9880〜9881;9992〜9993;10104〜10105;10216〜10217;10328〜10329;10404;10411;10418;10425;10432;10439;10446;10453;10460;10467;10474;10481;10488;10495;10502;10509;10516;10523;10530;10537;10544;5824〜5825;5840〜5841;5856〜5857;5872〜5873;5888〜5889;5904〜5905;5920〜5921;5936〜5937;5952〜5953;5968〜5969;5984〜5985;6000〜6001;6016〜6017;9560〜9561;9672〜9673;9784〜9785;9896〜9897;10008〜10009;10120〜10121;10232〜10233;10344〜10345;10405;10412;10419;10426;10433;10440;10447;10454;10461;10468;10475;10482;10489;10496;10503;10510;10517;10524;10531;10538;10545;6984〜6985;7000〜7001;1016〜7017;7032〜7033;7048〜7049;7064〜7065;7080〜7081;7096〜7097;7112〜7113;7128〜7129;7144〜7145;7160〜7161;7176〜7177;9576〜9577;9688〜9689;9800〜9801;9912〜9913;10024〜10025;10136〜10137;10248〜10249;10360〜10361;10406;10413;10420;10427;10434;10441;10448;10455;10462;10469;10476;10483;10490;10497;10504;10511;10518;10525;10532;10539;10546;8144〜8145;8160〜8160;8176〜8177;8192〜8193;8208〜8209;8224〜8225;8240〜8241;8256〜8257;8272〜8273;8288〜8289;8304〜8305;8320〜8321;8336〜8337;9592〜9593;9704〜9705;9816〜9817;9928〜9929;10040〜10041;10152〜10153;10264〜10265;10376〜10377;10407;10414;10421;10428;10435;10442;10449;10456;10463;10470;10477;10484;10491;10498;10505;10512;10519;10526;10533;10540;10547;9304〜9305;9320〜9321;9336〜9337;9352〜9353;9368〜9369;9384〜9385;9400〜9401;9416〜9417;9432〜9433;9448〜9449;9464〜9465;9480〜9481;9496〜9497;9608〜9609;9720〜9721;9832〜9833;9944〜9945;10056〜10057;10168〜10169;10280〜10281;10392〜10393;10408;10415;10422;10429;10436;10443;10450;10457;10464;10471;10478;10485;10492;10499;10506;10513;10520;10527;10534;10541;10548;10554〜10574;10594〜10595;10582〜10583;10585〜10586;10588〜10589;10591〜10592;10594〜10595;10597〜10598;10599;10600;10613;10614;10627;10628;10641;10642;10655;10656;10669;10670;10683;10684;10697;10698;10711;10712;10725;10726;10739;10740;10753;10754;10767;10768;10781;10782;10795;10796;10809;10810;10823;10824;10837;10838;10851;10852;10865;10866;10879;10880;10601;10602;10615;10616;10629;10630;10643;10644;10657;10658;10671;10672;10685;10686;10699;10700;10713;10714;10727;10728;10741;10742;10755;10756;10769;10770;10783;10784;10797;10798;10811;10812;10825;10826;10839;10840;10853;10854;10867;10868;10881;10882;10603;10604;10617;10618;10631;10632;10645;10646;10659;10660;10673;10674;10687;10688;10701;10702;10715;
10716;10729;10730;10743;10744;10757;10758;10771;10772;10785;10786;10799;10800;10813;10814;10827;10828;10841;10842;10855;10856;10869;10870;10883;10884;10605;10606;10619;10620;10633;10634;10647;10648;10661;10662;10675;10676;10689;10690;10703;10704;10717;10718;10731;10732;10745;10746;10759;10760;10773;10774;10787;10788;10801;10802;10815;10816;10829;10830;10843;10844;10857;10858;10871;10872;10885;10886;10607;10608;10621;10622;10635;10636;10649;10650;10663;10664;10677;10678;10691;10692;10705;10706;10719;10720;10733;10734;10747;10748;10761;10762;10775;10776;10789;10790;10803;10804;10817;10818;10831;10832;10845;10846;10859;10860;10873;10874;10887;10888;10609;10610;10623;10624;10637;10638;10651;10652;10665;10666;10679;10680;10693;10694;10707;10708;10721;10722;10735;10736;10749;10750;10763;10764;10777;10778;10791;10792;10805;10806;10819;10820;10833;10834;10847;10848;10861;10862;10875;10876;10889;10890;10611;10612;10625;10626;10639;10640;10653;10654;10667;10668;10681;10682;10695;10696;10709;10710;10723;10724;10737;10738;10751;10752;10765;10766;10779;10780;10793;10794;10807;10808;10821;10822;10835;10836;10849;10850;10863;10864;10877;10878;10891;10892に係る核酸配列、又はその(機能的)ホモログ、断片、変異体、若しくは誘導体を含む又はからなり得る。
アミノ酸配列
幾つかのCas13、CasX、及びCasYタンパク質は、当技術分野で知られており、本発明の文脈におけるCRISPR関連タンパク質として想定される。好適なCas13、CasX、及びCasYタンパク質は、配列番号10893〜10925;10926〜10998(Cas13、即ち、WP15770004、WP18451595、WP21744063、WP21746774、ERK53440、WP31473346、CVRQ01000008、CRZ35554、WP22785443、WP36091002、WP12985477、WP13443710、ETD76934、WP38617242、WP2664492、WP4343973、WP44065294、ADAR2DD、WP47447901、ERI81700、WP34542281、WP13997271、WP41989581、WP47431796、WP14084666、WP60381855、WP14165541、WP63744070、WP65213424、WP45968377、EHO06562、WP6261414、EKB06014、WP58700060、WP13446107、WP44218239、WP12458151、ERJ81987、ERJ65637、WP21665475、WP61156637、WP23846767、ERJ87335、WP5873511、WP39445055、WP52912312、WP53444417、WP12458414、WP39417390、EOA10535、WP61156470、WP13816155、WP5874195、WP39437199、WP39419792、WP39431778、WP46201018、WP39442171、WP39426176、WP39418912、WP39434803、WP39428968、WP25000926、EFU31981、WP4343581、WP36884929、BAU18623、AFJ07523、WP14708441、WP36860899、WP61868553、KJJ86756、EGQ18444、EKY00089、WP36929175、WP7412163、WP44072147、WP42518169、WP44074780、WP15024765、WP49354263、WP4919755、WP64970887、WP61710138);11002;11003(CasX、即ち、OGP07438、OHB99618);及び11004〜11010(CasY、即ち、OJI08769、OGY82221、OJI06454、APG80656、OJI07455、OJI09436、PIP58309)で示される。
また、未培養微生物由来の新しいCRISPR−Casシステム、即ち、ARMAN Cas9、即ち、ナノ古細菌ARMAN−1(Candidatus Micrarchaeum acidiphilum ARMAN−1)及びARMAN−4(Candidatus Parvarchaeum acidiphilum ARMAN−4)の使用も、参照により本明細書に援用されるPMID 28005056、20421484、及び17185602を参照することにより、本発明の教示の範囲内に含まれる。
本明細書で述べるように、機能的CRISPR−Casシステムは、典型的には、CRISPR関連タンパク質と会合し、これを相補的標的DNA配列に動員するガイドRNA(「gRNA」)の存在を必要とする。ガイドRNAの構造と特性は通常、特定のCRISPR関連タンパク質の選択に依存する。
本発明の人工核酸分子は、好ましくはRNAであり得る。「RNA」という用語は、前記分子を形成するために結合されたヌクレオチドの特定の連続(即ち、それらのRNA配列)によって特徴付けられるリボ核酸分子を意味すると理解される。したがって、用語「RNA」は、それぞれの文脈において当業者によって容易に理解されるように、RNA分子又はRNA配列を意味するために使用され得る。例えば、本発明の文脈で使用される「RNA」という用語は、好ましくはRNA分子を意味する(前記分子は、特に、その特定のRNA配列によって特徴付けられる)。配列修飾の文脈における「RNA」という用語は、修飾されたRNA配列に関連すると理解されるが、典型的には結果として生じるRNA分子(RNA配列に関して修飾されている)も含む。好ましい実施形態において、RNAは、mRNA、ウイルスRNA、又はレプリコンRNA、好ましくはmRNAであり得る。
本発明の幾つかの実施形態によれば、人工核酸分子、好ましくはRNAは、好ましくは本明細書に定義される、モノ−、ビ−、又はマルチシストロン性であり得る。ビ−又はマルチシストロン性RNAは、典型的には、2つ(ビシストロン性)又はそれ以上(マルチシストロン性)のオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。この文脈におけるオープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。ビシストロン性又はマルチシストロン性人工核酸分子、好ましくはRNA中のコード配列は、好ましくは、本明細書に定義される、異なるタンパク質をコードする。ビ−又はマルチシストロン性人工核酸分子、好ましくはRNAは、例えば、本明細書に定義される少なくとも2、3、4、5、6個以上の(好ましくは異なる)タンパク質(又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体)をコードすることができる。「2つ以上のタンパク質をコードする」という用語は、ビシストロン性又はマルチシストロン性人工核酸分子、好ましくはRNAが、例えば、少なくとも2、3、4、5、6個以上の(好ましくは異なる)タンパク質(又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体)をコードすることができることを意味し得るが、これに限定されない。
本明細書に定義される人工核酸分子、好ましくはRNA又は任意の他の核酸(例えば、ベクター)は、修飾核酸の形態で提供されてもよい。本発明の文脈において想定される好適な核酸修飾を以下に記載する。「本明細書に定義される任意の他の核酸」という表現は、通常はそうではないが、gRNAを意味することがある。
本明細書で使用される「修飾」という用語は、骨格修飾並びに糖修飾又は塩基修飾を含む化学修飾を意味し得る。
(化学的に)修飾された核酸、特に本発明に係る人工核酸分子は、糖修飾、即ちそれらの糖部分で修飾されたヌクレオシド/ヌクレオチドを含み得る。
(化学的に)修飾された核酸、特に本発明に係る人工核酸分子は、骨格修飾、即ちそれらの骨格部分で修飾されたヌクレオシド/ヌクレオチドを含み得る。
(化学的に)修飾された核酸、特に本発明に係る人工核酸分子は、塩基修飾、即ちそれらの核酸塩基部分で修飾されたヌクレオシド/ヌクレオチドを含み得る。
更なる実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、少なくとも1つの脂質修飾を含む。
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA、好ましくはmRNA、又は本明細書に定義される任意の他の核酸は、「配列修飾」される、即ち、下記のような少なくとも1つの配列修飾を含む。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、そのような配列修飾は、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAの安定性を増加させる及び/又は発現を増強させることができる。
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA、より好ましくはmRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、そのグアノシン/シトシン(G/C)含量を変更する、好ましくは少なくとも1つのコード配列のG/C含量を変更することによって、修飾され、したがって安定化されることができる。換言すれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)及び好ましくはその配列をG/C修飾することができる。
したがって、Pro(CCC又はCCG)、Arg(CGC又はCGG)、Ala(GCC又はGCG)、及びGly(GGC又はGGG)のコドンは、A又はUが存在しないので変更を必要としない。対照的に、A及び/又はUヌクレオチドを含むコドンは、同じアミノ酸をコードするがA及び/又はUを含まない他のコドンの置換によって変更することができる。これらの例として、Proのコドンは、CCU又はCCAからCCC又はCCGに変更でき;Argのコドンは、CGU又はCGA又はAGA又はAGGからCGC又はCGGに変更でき;Alaのコドンは、GCU又はGCAからGCC又はGCGに変更でき;Glyのコドンは、GGU又はGGAからGGC又はGGGに変更できる。他の場合では、A又はUヌクレオチドをコドンから排除することはできないが、A及び/又はUヌクレオチドの含量がより少ないコドンを使用することによってA及びUの含量を減少させることが可能である。これらの例として、Pheのコドンは、UUUからUUCに変更でき、Leuのコドンは、UUA、UUG、CUU又はCUAからCUC又はCUGに変更でき、Serのコドンは、UCU又はUCA又はAGUからUCC、UCG又はAGCに変更でき、Tyrのコドンは、UAUからUACに変更でき、Cysのコドンは、UGUからUGCに変更でき、Hisのコドンは、CAUからCACに変更でき、Glnのコドンは、CAAからCAGに変更でき、Ileのコドンは、AUU又はAUAからAUCに変更でき、Thrのコドンは、ACU又はACAからACC又はACGに変更でき、Asnのコドンは、AAUからAACに変更でき、Lysのコドンは、AAAからAAGに変更でき、Valのコドンは、GUU又はGUAからGUC又はGUGに変更でき、Aspのコドンは、GAUからGACに変更でき、Gluのコドンは、GAAからGAGに変更でき、終止コドンUAAは、UAG又はUGAに変更できる。一方、Met(AUG)及びTrp(UGG)のコドンの場合には、配列修飾の可能性はない。本発明の人工核酸配列、好ましくはRNA配列(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)のG/C含量を、その特定の野生型核酸配列(即ち、元の配列)に比較して増大させるために、上に挙げた置換を個別に又は全ての可能な組合せで使用することができる。したがって、例えば、野生型配列中に存在するThrの全てのコドンを、ACC(又はACG)に変更することができる。しかしながら、例えば、前記置換可能性の以下のような組合せを使用することが好ましい。
元の配列(野生型RNA)中のThrをコードする全てのコドンのACC(又はACG)への置換、及び
Serを元来コードする全てコドンのUCC(又はUCG又はAGC)への置換;元の配列中のIleをコードする全てのコドンのAUCへの置換、及び
Lysを元来コードする全てのコドンのAAGへの置換、及び
Tyrを元来コードする全てコドンのUACへの置換;元の配列中のValをコードする全てのコドンのGUC(又はGUG)への置換、及び
Gluを元来コードする全てのコドンのGAGへの置換、及び
Alaを元来コードする全てのコドンのGCC(又はGCG)への置換、及び
Argを元来コードする全てのコドンのCGC(又はCGG)への置換;元の配列中のValをコードする全てコドンのGUC(又はGUG)への置換、及び
Gluを元来コードする全てのコドンのGAGへの置換、及び
Alaを元来コードする全てのコドンのGCC(又はGCG)への置換、及び
Glyを元来コードする全てのコドンのGGC(又はGGG)への置換、及び
Asnを元来コードする全てのコドンのAACへの置換;元の配列中のValをコードする全てのコドンのGUC(又はGUG)への置換、及び
Pheを元来コードする全てのコドンのUUCへの置換、及び
Cysを元来コードする全てのコドンのUGCへの置換、及び
Leuを元来コードする全てのコドンのCUG(又はCUC)への置換、及び
Glnを元来コードする全てのコドンのCAGへの置換、及び
Proを元来コードする全てのコドンのCCC(又はCCG)への置換、などである。
本発明の更なる好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)のリボソーム結合部位の環境におけるA/U含量は、そのそれぞれの野生型核酸、好ましくはRNA(又は前記他の核酸、特にRNA)のリボソーム結合部位の環境におけるA/U含量に比較して増加する。
本発明の更なる実施形態によれば、本発明人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、潜在的な不安定化配列エレメントに関して改変され得る。特に、前記人工核酸分子、好ましくはRNA(又は前記他の核酸、特にRNA)のコード配列及び/又は5’及び/又は3’非翻訳領域は、それぞれの野生型核酸、好ましくはRNA(又は前記他の野生型核酸)と比較して、不安定化配列エレメントを含まないように改変することができ、改変人工核酸分子、好ましくはRNA(又は前記他の核酸、特にRNA)のコードされたアミノ酸配列は、そのそれぞれの野生型核酸、好ましくはRNA(又は前記他の野生型核酸)と比較して改変されていないことが好ましい。
本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)の更なる好ましい修飾は、同じアミノ酸をコードするコドンが典型的には異なる頻度で存在するという知見に基づく。更に好ましい実施形態によれば、修飾された人工核酸分子、好ましくはRNA(又は他の核酸、特にRNA)において、コード配列を、それぞれの野生型核酸、好ましくはRNA(又は他の野生型核酸)の対応する領域に比較して、同じアミノ酸をコードするコドンの頻度が、例えば、表4に示されるように、ヒトのコドンの使用にしたがう当該コドンの天然に存在する頻度に対応するように修飾される。
前述したように、本発明によれば、細胞内において比較的稀なtRNAをコードする野生型配列の全てのコドンを、細胞内において比較的高頻度であり、且ついずれも前記比較的稀なtRNAと同一のアミノ酸を運搬するtRNAをコードするコドンと交換されることが好ましい。
したがって、最も高頻度のコドンが各コードアミノ酸に対して使用されることが特に好ましい(表4を参照のこと、最も高頻度のコドンはアスタリスクで示されている)。そのような最適化手順は、コドン適合度指数(CAI)を上昇させ、最終的にCAIを最大にする。本発明の文脈において、上昇又は最大化されたCAIを有する配列は、典型的には「コドン最適化」配列及び/又はCAI上昇及び/又は最大化配列と称される。好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、少なくとも1つのコード配列を含み、前記コード配列は、本明細書に記載されるようにコドン最適化される。より好ましくは、少なくとも1つのコード配列のコドン適合度指数(CAI)は、少なくとも0.5、少なくとも0.8、少なくとも0.9、又は少なくとも0.95である。最も好ましくは、少なくとも1つのコード配列のコドン適合度指数(CAI)は1である。
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、前記人工核酸分子、好ましくはRNA(又は他の核酸、特にRNA)、特にその少なくとも1つのコード配列におけるシトシン(C)含量を変更する、好ましくは増加させることによって改変される。
CysをコードするコドンUGUは、同じアミノ酸をコードするコドンUGCで交換することができる、及び/又は
AspをコードするコドンGAUは、同じアミノ酸をコードするコドンGACで交換することができる、及び/又は
PheをコードするUUUは、同じアミノ酸をコードするコドンUUCで交換することができる、及び/又は
GlyをコードするコドンGGG、GGA、GGUのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンGGCで交換することができる、及び/又は
HisをコードするコドンCAUは、同じアミノ酸をコードするコドンCACで交換することができる、及び/又は
IleをコードするコドンAUA、AUUのいずれも、コドンAUCで交換することができる、及び/又は
LeuをコードするコドンUUG、UUA、CUG、CUA、CUUのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンCUCで交換することができる、及び/又は
AsnをコードするコドンAAUは、同じアミノ酸をコードするコドンAACで交換することができる、及び/又は
ProをコードするコドンCCG、CCA、CCUのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンCCCで交換することができる、及び/又は
ArgをコードするコドンAGG、AGA、CGG、CGA、CGUのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンCGCで交換することができる、及び/又は
SerをコードするコドンAGU、AGC、UCG、UCA、UCUのいずれかも、同じアミノ酸をコードするコドンUCCで交換することができる、及び/又は
ThrをコードするコドンACG、ACA、ACUのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンACCで交換することができる、及び/又は
ValをコードするコドンGUG、GUA、GUUのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンGUCで交換することができる、及び/又は
TyrをコードするコドンUAUは、同じアミノ酸をコードするコドンUACで交換することができる。
Lysをコードする比較的稀なコドンAAAは、同じアミノ酸をコードする比較的高頻度のコドンAAGで交換することができ、及び/又は
Glnをコードする比較的稀なコドンCAAは、同じアミノ酸をコードする比較的高頻度のコドンCAGで交換することができる。
前記配列修飾は、一般に、本明細書に記載される任意の核酸配列に適用することができ、本明細書に定義されるCRISPR関連タンパク質をコードする核酸配列、及び任意にNLS又は他のペプチド若しくはタンパク質部分、ドメイン、又はタグを含む又はからなるコード配列に適用することが特に想定される。修飾(化学修飾、脂質修飾、及び配列修飾を含む)は、適切である又は必要である場合には、組み合わせられた修飾が互いに干渉しない限り、好ましくはコードされたCRISPR関連タンパク質(及びNLS、シグナル配列、タンパク質/ペプチドタグ)が、好ましくは上で定義される、その所望の生物学的機能性又は特性を保持する限り、任意の組合せで組み合わせることができる。
本発明の更なる好ましい実施形態によれば、本明細書に定義される改変人工核酸分子、好ましくはRNA(又は任意の他の核酸、特にRNA)は、いわゆる「5’キャップ」構造の付加によって修飾することができ、これにより、本明細書に記載されるように、前記人工核酸分子、好ましくはRNA(又は前記他の核酸、特にRNA)が安定化する。
更なる好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、ポリ(A)配列を含む。
更なる好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、3’末端に、典型的には約10〜200個のシトシンヌクレオチド、好ましくは約10〜100個のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約20〜70個のシトシンヌクレオチド、更により好ましくは約20〜60個、更には10〜40個のシトシンヌクレオチドのポリ(C)テールを含む。
幾つかの好ましい実施形態においては、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、ヒストンステムループ(HSL)配列/構造を含む。そのようなヒストンステムループ配列は、その開示が参照により本明細書に援用されるWO2012/019780に開示されるヒストンステムループ配列から選択されることが好ましい。
式(I)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
ステム1又はステム2の境界エレメントN1−6は、1〜6個、好ましくは2〜6個、より好ましくは2〜5個、更により好ましくは3〜5個、最も好ましくは4〜5個、又は5個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
ステム1[N0−2GN3−5]は、エレメントステム2に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ5〜7個のヌクレオチドの連続配列であり、
N0−2は、0〜2個、好ましくは0〜1個、より好ましくは1個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
N3−5は、3〜5個、好ましくは4〜5個、より好ましくは4個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Gは、グアノシン又はその類似体であり、任意に、シチジン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム2におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列[N0−4(U/T)N0−4]は、エレメントステム1とステム2との間に位置し、且つ3〜5個のヌクレオチド、より好ましくは4個のヌクレオチドの連続配列であり、
各N0−4は、互いに独立して、0〜4個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
U/Tは、ウリジン又は任意にチミジンを表し、
ステム2[N3−5CN0−2]は、エレメントステム1に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ5〜7個のヌクレオチドの連続配列であり、
N3−5は、3〜5個、好ましくは4〜5個、より好ましくは4個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
N0−2は、0〜2個、好ましくは0〜1個、より好ましくは1個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、若しくはCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Cは、シチジン又はその類似体であり、任意に、グアノシン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム1におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム1及びステム2は、互いに塩基対合して逆相補的配列を形成することができる(前記塩基対合は、例えば、ヌクレオチドAとU/T若しくはGとCとのワトソン−クリック塩基対合、又は非ワトソン−クリック塩基対合(例えば、ゆらぎ塩基対合、逆ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、逆フーグスティーン塩基対合)によってステム1とステム2との間で生じ得る)か、或いは、互いに塩基対合して部分的に逆相補的な配列を形成することができる(一方のステムにおける1以上の塩基が、他方のステムの逆相補的な配列において相補的塩基を有しないことに基づいて、ステム1とステム2との間で不完全な塩基対合が生じ得る)。
式(Ia)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
更なる実施形態では、非コード部分、即ち、miRNA部分は、本発明の配列と組み合わされる。非コード部分は、以下のリストに開示される1以上からの核酸配列から選択できる:
5’−UTR;
3’−UTR;
miRNA部分;
キャップ;
ポリ(C)配列;
ヒストンステムループ配列;
ポリ(A)配列又はポリアデニル化シグナル;
IRES部分;
ヘアピン部分;
RNA結合タンパク質のための部分;
3’−5’分解を防ぐ部分;
RNA崩壊速度を調節する部分。
本明細書に定義される少なくとも1つのコード配列を含む本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAは、本明細書に記載される少なくとも1つの5’UTR及び少なくとも1つの3’UTR、並びに任意に、少なくとも1つのヒストンステムループを含む。
5’−コード配列−ヒストンステムループ−ポリ(A)/(C)配列−3’;又は
5’−コード配列−ポリ(A)/(C)配列−ヒストンステムループ−3’;又は
5’−コード配列−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−3’;又は
5’−コード配列−ポリアデニル化シグナル−ヒストンステムループ−3’;又は
5’−コード配列−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリ(A)/(C)配列−3’;又は
5’−コード配列−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−3’;又は
5’−コード配列−安定化配列−ポリ(A)/(C)配列−ヒストンステムループ−3’;又は
5’−コード配列−安定化配列−ポリ(A)/(C)配列−ポリ(A)/(C)配列−ヒストンステムループ−3’;など。
a)5’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN又はCap1;
b)本明細書に定義される5’−UTRに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号1;3;5;7;9;11;13;15;17;19;又は21に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む5’−UTRエレメント;
c)本明細書に定義される少なくとも1つのコード配列;
d)本明細書に定義される3’−UTRに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号23;25;27;29;31;33又は35に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む5’−UTRエレメント;
e)任意に、ポリ(A)テール、好ましくは10〜1000、10〜500、10〜300、10〜200、10〜100、40〜80、又は50〜70個のアデノシンヌクレオチドからなる;
f)任意に、ポリ(C)テール、好ましくは10〜200、10〜100、20〜70、20〜60、又は10〜40個のシトシンヌクレオチドからなる;及び
g)任意に、ヒストンステムループ。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号413;2330〜2345;3490〜3505;4650〜4665;5810〜5825;6970〜6985;8130〜8145;9290〜9305;10402〜10408;10554;10599〜10612に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号414;2346〜2361;3506〜3521;4666〜4681;5826〜5841;6986〜7001;8146〜8161;9306〜9321;10409〜10415;10555;10613〜10626に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ATP5A1遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号415;2362〜2377;3522〜3537;4682〜4697;5842〜5857;7002〜7017;8162〜8177;9322〜9337;10416〜10422;10556;10627〜10640に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号416;2378〜2393;3538〜3553;4698〜4713;5858〜5873;7018〜7033;8178〜8193;9338〜9353;10423〜10429;10557;10641〜10654に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号417;2394〜2409;3554〜3569;4714〜4729;5874〜5889;7034〜7049;8194〜8209;9354〜9369;10430〜10436;10558;10655〜10668に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、RPL32遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びALB遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号418;2410〜2425;3570〜3585;4730〜4745;5890〜5905;7050〜7065;8210〜8225;9370〜9385;10437〜10443;10559;10669〜10682に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号420;2442〜2457;3602〜3617;4762〜4777;5922〜5937;7082〜7097;8242〜8257;9402〜9417;10451〜10457;10561;10697〜10710に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号421;2458〜2473;3618〜3633;4778〜4793;5938〜5953;7098〜7113;8258〜8273;9418〜9433;10458〜10464;10562;10711〜10724に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号422;2474〜2489;3634〜3649;4794〜4809;5954〜5969;7114〜7129;8274〜8289;9434〜9449;10465〜10471;10563;10725〜10738に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、NOSIP遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号423;2490〜2505;3650〜3665;4810〜4825;5970〜5985;7130〜7145;8290〜8305;9459〜9450;10472〜10478;10564;10739〜10752に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号424;2506〜2521;3666〜3681;4826〜4841;5986〜6001;7146〜7161;8306〜8321;9466〜9481;10479〜10485;10565;10753〜10766に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する3’UTRエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号425;2522〜2537;3682〜3697;4842〜4857;6002〜6017;7162〜7177;8322〜8337;9482〜9497;10486〜10492;10566;10767〜10780に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、更には97%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
ATP5A1/Gnas.1(配列番号9498〜9609;10493〜10499;10567;10781〜10794);
Ndufa4.1/COX6B1.1(配列番号9610〜9721;10500〜10506;10568;10795〜10808);
Ndufa4.1/Gnas.1(配列番号9722〜9833;10507〜10513;10569;10809〜10822);
Ndufa4.1/Ndufa1.1(配列番号9834〜9945;10514〜10520;10570;10823〜10836);
Nosip.1/Ndufa1.1(配列番号9946〜10057;10521〜10527;10571;10837〜10850);
Rpl31.1/Gnas.1(配列番号10058〜10169;10528〜10534;10572;10851〜10864);
TUBB4B.1/RPS9.1(配列番号10170〜10281;10535〜10541;10573;10865〜10878);
Ubqln2.1/RPS9.1(配列番号10282〜10393;10542〜10548;10574;10879〜10892)。
他の好ましい実施形態では、本発明の構築物の3’末端は、A64−C30−HSL−N5;A64−HSL−N5;A64−N5;A64−N5;A64−C5−N5;A64−C5−N5;A64−C10−N5;A64−C10−N5;A64−C15−N5;A40−HSL−A50−N5;HSL−N5;A64−HSL−NR;A64−N5;及びA64−C15−N5からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に記載される任意の他の核酸)は、複合体化形態、即ち、1以上の(ポリ)カチオン性化合物、好ましくは(ポリ)カチオンポリマー、(ポリ)カチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、プロタミン、(ポリ)カチオン性多糖類及び/又は(ポリ)カチオン性脂質などと複合体化又は会合されて提供される。この文脈においては、用語「複合体化された」又は「会合された」は、少なくとも1つの人工核酸分子、好ましくはRNA(又は前記他の核酸)と前記化合物の1以上との、共有結合を介さない、より大きな複合体又はアセンブリへの本質的に安定な組合せを意味する。
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNAは、脂質(特に、カチオン性及び/又は中性脂質)と複合体化又は会合し、1以上のリポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、又はナノリポソームを形成する。
幾つかの好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される他の核酸、特にRNA)は、脂質(特にカチオン性及び/又は中性脂質)と複合体化又は会合し、1以上の脂質ナノ粒子を形成する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、本明細書に記載されるCRISPR関連タンパク質をコードする少なくとも1つの人工核酸分子、及び更に本明細書に記載の少なくとも1つのgRNAを含む。
LNPは、脂質ナノ粒子を形成するのに適した任意のカチオン性脂質を含み得る。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理学的pHで正味の正電荷を帯びている。
非カチオン性脂質は、中性脂質、アニオン性脂質、又は両親媒性脂質であり得る。存在する場合、中性脂質は、生理学的pHで非帯電又は中性双性イオン形態のいずれかで存在する任意の数の脂質種であり得る。そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが含まれる。本明細書に記載の粒子における使用のための中性脂質の選択は、一般に、例えば、LNPサイズ及び血流中でのLNPの安定性を考慮することによって導かれる。好ましくは、中性脂質は、2つのアシル基を有する脂質(例えば、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミン)である。
ステロールは、好ましくはコレステロールである。
ステロールは、LNPの約10モル%〜約60モル%又は約25モル%〜約40モル%の割合で存在することができる。幾つか実施形態では、ステロールは、LNP中に存在する全脂質の約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、又は約60モル%の割合で存在する。他の実施形態においては、LNPは、ステロールをモル基準で、約5%〜約50%、例えば、(LNP中の脂質の総モル(100%)に基づく)モル基準で、約15%〜約45%、約20%〜約40%、約48%、約40%、約38.5%、約35%、約34.4%、約31.5%、又は約31%を含む。
凝集低減剤は、凝集を低減することができる脂質であることができる。
そのような脂質の例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質、モノシアロガングリオシドGml、及びポリアミドオリゴマー(PAO)、例えば、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第6,320,017号明細書に記載されているものなどが挙げられる。PEG、Gml、又はATTAのような、処方中の凝集を防ぐ、帯電していない親水性の立体障壁部分を有する他の化合物も脂質に結合することができる。ATTA−脂質は、例えば、米国特許第6,320,017号明細書に記載されており、PEG−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第5,820,873号明細書、第5,534,499号明細書、及び第5,885,613号明細書に記載されている(これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
LNPの組成は、特に、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質飽和度、PEG化の性質、全成分の比率、及びそのサイズなどの生物物理学的パラメータによって影響され得る。Sempleらによる1例では(Semple et al. Nature Biotech. 2010 28: 172−176;その全体を参照により本明細書に援用する)、LNP組成物は、57.1%のカチオン性脂質、7.1%のジパルミトイルホスファチジルコリン、34.3%のコレステロール、及び1.4%のPEG−c−DMAから構成された(Basha et al. Mol Ther. 2011 19:2186−2200;その全体を参照により本明細書に援用する)。
幾つか実施形態では、LNPは、約50nm〜約300nmのメジアン径サイズを有し、例えば、約50nm〜約250nm、例えば、約50nm〜約200nmのメジアン径サイズを有する。
LNPは、上記のものに加えて、1以上の脂質及び/又は他の成分を更に含み得る。
幾つか実施形態では、本発明の組合せの人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸)は、リポソームとして製剤化される。
幾つか実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸)は、リポプレックス、即ち、核酸の層の間に挟まれたカチオン性脂質二重層として製剤化される。
幾つか実施形態では、人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸)は、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(DOPC)ベースのナノリポソームなどの中性脂質ベースのナノリポソームとして製剤化される(Adv Drug Deliv Rev. 2014 Feb;66: 110−116.)。
幾つか実施形態では、人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸)は、エマルジョンとして製剤化される。別の実施形態では、前記人工核酸分子、好ましくはRNAは、カチオン性水中油型エマルジョンに製剤化され、エマルジョン粒子は、オイルコアとカチオン性脂質を含み、カチオン性脂質は、核酸と相互作用し、該分子をエマルジョン粒子に固定することができる(国際公開第2012006380号を参照;その全体を参照により本明細書に援用する)。幾つか実施形態では、前記人工核酸分子、好ましくはRNAは、親水性相が分散している連続疎水性相を含む油中水型エマルジョンに製剤化される。非限定的な例として、エマルジョンは、国際公開第201087791号に記載される方法によって製造することができ、その内容の全体を参照により本明細書に援用する。
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸)は、カチオン性又はポリカチオン性化合物(「(ポリ)カチオン性化合物」)及び/又はポリマー担体と複合体化又は会合する。
本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸)のエピトープコードRNAの複合体化又は会合のための特に好ましい剤である(ポリ)カチオン性化合物としては、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン、又はスペルミジン、又は他のカチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ−L−リジン(PLL)、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド(CPP)(HIV結合ペプチドを含む)、HIV−1 Tat(HIV)、Tat由来ペプチド、ペネトラチン、VP22由来又は類似体ペプチド、HSV VP22(単純ヘルペス)、MAP、KALA、又はタンパク質導入ドメイン(PTD)、PpT620、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、MPG−ペプチド、Pep−1、L−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド(特に、ショウジョウバエアンテナペディア)、pAntp、pIsl、FGF、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−2、Bac715−24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT由来ペプチド、SAP、又はヒストンが挙げられる。
(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x
(式(III))
式中、l+m+n+o+x=8〜15であり、l、m、n又はoは、互いに独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される任意の数であるが、但し、Arg、Lys、His及びOrnの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも50%を表し;Xaaは、Arg、Lys、His又はOrnを除くネイティブの(=天然)又は非ネイティブのアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であってよく;xは、0、1、2、3又は4から選択される任意の数であってよいが、但し、Xaaの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の50%を超えない)を有する以下のタンパク質又はペプチドから選択してよい。この状況において特に好ましいカチオン性ペプチドは、例えば、Arg7、Arg8、Arg9、H3R9、R9H3、H3R9H3、YSSR9SSY、(RKH)4、及びY(RKH)2Rなどである。この文脈において、国際公開第2009/030481号の開示を参照により本明細書に援用する。
本発明の組合せ、(医薬)組成物、又はワクチンのエピトープコードRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)の複合体化又は会合のための更なる好ましい(ポリ)カチオン性化合物としては、カチオン性多糖類、例えば、キトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン(PEI)などが挙げられる。
本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸)の複合体化又は会合のための更なる好ましい(ポリ)カチオン性化合物としては、例えば、DOTMA:[1−(2,3−シオレイルオキシ)プロピル)]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド、DMRIE、ジ−C14−アミジン、DOTIM、SAINT、DC−Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE:ジオレイルホスファチジルエタノール−アミン、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS:ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、DIMRI:ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、DOTAP:ジオレオイルオキシ−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン、DC−6−14:O,O−ジテトラデカノイル−N−(アルファ−トリメチルアンモニオアセチル)ジエタノールアミンクロリド、CLIP1:rac−[(2,3)−ジオクタデシルオキシプロピル)(2−ヒドロキシエチル)]−ジメチルアンモニウムクロリド、CLIP6:rac−[2(2,3−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウム、CLIP9:rac−[2(2,3−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ)エチル]−トリメチルアンモニウム、又はオリゴフェクタミンなどのカチオン性脂質が挙げられる。
本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸)のエピトープコードRNAの複合体化又は会合のための更なる好ましい(ポリ)カチオン性化合物としては、(ポリ)カチオン性ポリマー、例えば、変性ポリアミノ酸(例えば、ベータ−アミノ酸−ポリマー又は逆ポリアミドなど)、変性ポリエチレン(例えば、PVP(ポリ(N−エチル−4−ビニルピリジニウムブロミド))など、変性アクリラート(例えば、pDMAEMA(ポリ(ジメチルアミノエチルメチルアクリラート))など、変性アミドアミン(例えば、pAMAM(ポリ(アミドアミン))など、変性ポリベータアミノエステル(PBAE)(例えば、ジアミン末端変性1,4−ブタンジオールジアクリラート−co−5−アミノ−1−ペンタノールポリマーなど、デンドリマー(例えば、ポリプロピレンアミンデンドリマー又はpAMAMベースデンドリマーなど)、ポリイミン(例えば、PEI:ポリ(エチレンイミン)、ポリ(プロピレンイミン))など、ポリアリルアミン、糖骨格ベースポリマー(例えば、シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサンなど)、シラン骨格系ポリマー(例えば、PMOXA−PDMSコポリマー)など、又は1以上のカチオン性ブロック(例えば、前記したカチオン性ポリマーから選択される)と1以上の親水性又は疎水性ブロック(例えば、ポリエチレングリコール)との組合せからなるブロックポリマーが挙げられる。
好ましい実施形態によれば、本発明の組合せ、(医薬)組成物、又はワクチンのエピトープコードRNA(又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にRNA)は、ポリマー担体と複合体化又は会合する。
L−P1−S−[S−P2−S]n−S−P3−L 式(IV)
式中
P1及びP3は、互いに異なるか又は同一であり、直鎖状又は分枝状の親水性ポリマー鎖を表し、各々のP1及びP3は、成分P2との縮合により、或いは、(AA)、(AA)x又は[(AA)x]z(そのような成分がP1及びP2又はP3及びP2の間のリンカーとして使用される場合)、及び/又は更なる成分(例えば、(AA)、(AA)x、[(AA)x]z又はL)との縮合によりジスルフィド結合を形成可能な、少なくとも1つの−SH部分を提示し、前記直鎖状又は分枝状の親水性ポリマー鎖は、互いに独立して、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ−N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ−2−(メタクリロイルオキシ)エチルホスホリルコリン、ポリ(ヒドロキシアルキルL−アスパラギン)、ポリ(2−(メタクリロイルオキシ)エチルホスホリルコリン)、ヒドロキシエチルデンプン、又はポリ(ヒドロキシアルキルL−グルタミン)から選択され、ここで、前記親水性ポリマー鎖は、約1kDa〜約100kDa、好ましくは約2kDa〜約25kDa、より好ましくは約2kDa〜約10kDa、例えば約5kDa〜約25kDa又は5kDa〜約10kDaの分子量を示し、
P2は、例えば、ジスルフィド架橋カチオン性成分によって形成されるポリマー担体について上で定義される、好ましくは約3〜100アミノ酸長を有し、より好ましくは約3〜約50アミノ酸長を有し、更により好ましくは約3〜約25アミノ酸長、例えば約3〜10アミノ酸長、5〜15アミノ酸長、10〜20アミノ酸長又は15〜25アミノ酸長、より好ましくは約5〜20アミノ酸長、及び更により好ましくは約10〜約20アミノ酸長を有する(ポリ)カチオン性のペプチド又はタンパク質である、又は、
P2は、例えば、ジスルフィド架橋カチオン性成分によって形成されるポリマー担体について上で定義される、典型的には、約1kDa〜約20kDa、更に好ましくは約1.5kDa〜約10kDaの分子量を含む約0.5kDa〜約30kDaの分子量を有する、又は、約10kDa〜約50kDa、更に好ましくは約10kDa〜約30kDaの分子量を含む約0.5kDa〜約100kDaの分子量を有する(ポリ)カチオン性のペプチド又はタンパク質であり、
各P2は、更なる成分P2、又は成分P1及び/又は成分P3と、或いは代替的に更なる成分(例えば、(AA)、(AA)x、又は[(AA)x]z)との縮合によりジスルフィド結合を形成可能な少なくとも2つの−SH部分を提示し、
−S−S−は、(可逆の)ジスルフィド結合(読み易くするために括弧は省略されている)であり、ここで、Sは、好ましくは、硫黄、又は(可逆の)ジスルフィド結合を形成した−SH担持部分を表す。前記(可逆の)ジスルフィド結合は、好ましくは、成分P1及びP2、P2及びP2、又はP2及びP3、或いは任意に本明細書で定義する更なる成分(例えば、L、(AA)、(AA)x、[(AA)x]zなど)のいずれかの−SH部分の縮合により形成され、前記−SH部分は、これらの成分の構造の一部であるか、又は以下で定義する修飾によって付加されてもよく、
Lは、存在してもしなくてもよい任意のリガンドであり、互いに独立して、RGD、トランスフェリン、葉酸、シグナルペプチド又はシグナル配列、局在化シグナル又は局在化配列、核酸局在化シグナル又は核酸局在化配列(NLS)、抗体、細胞透過性ペプチド(例えば、TAT、又はKALA)、受容体のリガンド(例えば、サイトカイン、ホルモン、成長因子など)、低分子(例えば、マンノース、ガラクトース、又は合成リガンドなどの炭水化物)、低分子アゴニスト、受容体の阻害剤又はアンタゴニスト(例えば、RGDペプチド模倣薬類似体)、又は本明細書に定義する任意の更なるタンパク質から選択することができ、
nは、典型的には、例えば、約4〜9、4〜10、3〜20、4〜20、5〜20又は10〜20の範囲、約3〜15、4〜15、5〜15又は10〜15の範囲、或いは約6〜11又は7〜10の範囲を含む、約1〜50の範囲、好ましくは約1、2又は3〜30の範囲、より好ましくは約1、2、3、4又は5〜25の範囲、約1、2、3、4又は5〜20の範囲、約1、2、3、4又は5〜15の範囲、又は約1、2、3、4又は5〜10の範囲から選択される整数である。最も好ましくは、nは、約1、2、3、4又は5〜10の範囲、より好ましくは約1、2、3又は4〜9の範囲、約1、2、3又は4〜8の範囲、又は約1、2又は3〜7の範囲である。
本発明の幾つかの実施形態では、人工核酸分子、好ましくはRNA(又は前記他の核酸)は、(ポリ)カチオン性化合物又はポリマー担体と、任意に、核酸の(ポリ)カチオン性化合物及び/又はポリマー担体に対する重量比として約6:1(w/w)〜約0.25:1(w/w)、より好ましくは約5:1(w/w)〜約0.5:1(w/w)、更により好ましくは約4:1(w/w)〜約1:1(w/w)又は約3:1(w/w)〜約1:1(w/w)、最も好ましくは約3:1(w/w)〜約2:1(w/w)の範囲から選択される重量比で、又は任意に、核酸の(ポリ)カチオン性化合物及び/又はポリマー担体に対する窒素/ホスファート(N/P)比として約0.1〜10の範囲、好ましくは約0.3〜4又は0.3〜1、最も好ましくは約0.5〜1又は0.7〜1の範囲、更に最も好ましくは約0.3〜0.9又は0.5〜0.9の範囲で会合又は複合体化される。より好ましくは、少なくとも1つの人工核酸分子、好ましくはRNAの1以上のポリカチオンに対するN/P比は、約0.1〜10の範囲であり、約0.3〜4、約0.5〜2、約0.7〜2、及び約0.7〜1.5の範囲を含む。
幾つかの実施形態では、(ポリ)カチオン性化合物、担体、リポソーム、又はLNPは、異なる臓器及び/又は細胞型に到達するための標的化送達用に製剤化することができる。非限定的な例として、(ポリ)カチオン性化合物、担体、リポソーム、又はLNPは、肝臓への標的化送達のために処方され得る。標的化送達に使用される(ポリ)カチオン化合物、担体、リポソーム、又はLNPは、本明細書に記載される(ポリ)カチオン性化合物、担体、リポソーム、又はLNPを含み得るが、これらに限定されない。本発明のRNAは、担体又は標的化基に共有結合されるコンジュゲート(例えば、治療用タンパク質又はその断片若しくは変異体)をコードしてもよい。
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはRNAと、少なくとも1つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物を提供する。本発明に係る組成物は、好ましくは医薬組成物として提供される。
好ましくは、本発明に係る(医薬)組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を含む。「薬学的に許容される」という用語は、1以上の活性剤(ここでは、人工核酸分子、好ましくはRNA)と適合性があり、それらの医薬活性に干渉しない及び/又は実質的に低下させない化合物又は剤を意味する。薬学的に許容される担体は、治療される被験体への投与のためにそれらを適切なものとするために十分に高い純度及び十分に低い毒性を有することが好ましい。
薬学的に許容される賦形剤は、種々の機能的役割を示すことができ、限定するものではないが、希釈剤、フィラー、増量剤、担体、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、滑剤、コーティング剤、溶媒及び共溶媒、緩衝剤、保存剤、補助剤、酸化防止剤、湿潤剤、消泡剤、増粘剤、甘味剤、香味剤、及び保湿剤が挙げられる。
適切な薬学的に許容される担体は、典型的には、(医薬)組成物の処方に基づいて選択される。
一般に、局所投与用の(医薬)組成物は、クリーム、軟膏、ゲル、ペースト、又は散剤として処方することができる。経口投与用の(医薬)組成物は、錠剤、カプセル剤、液剤、散剤として、又は持続放出形式で処方することができる。しかし、好ましい実施形態によれば、本発明の(医薬)組成物は、特に皮内又は筋肉内注射を介して非経口的に投与され、したがって、本明細書の他の箇所で記載されるように非経口投与用に液体形態又は凍結乾燥形態で処方される。非経口製剤は、典型的にはバイアル、IVバッグ、アンプル、カートリッジ、又はプレフィルドシリンジに保管され、注射剤、吸入剤、又はエアロゾルとして投与することができるが、注射剤が好ましい。
更なる好ましい実施形態では、(医薬)組成物は、凍結乾燥形態で提供される。好ましくは、凍結乾燥(医薬)組成物は、投与前に、有利には水性担体に基づく、適切な緩衝液中で再構成される。これは、例えば、リンゲルラクタート溶液(これが好ましい)、リンゲル溶液、リン酸緩衝溶液である。幾つかの実施形態では、本発明に係る(医薬)組成物は、少なくとも2、3、4、5、6、又はそれ以上の人工核酸分子、好ましくはRNA、好ましくはmRNAを含み、これらは、前記人工核酸分子、好ましくはRNAの各々の個々の投与が可能となるように、(任意に、少なくとも1つの更なる添加剤と共に)凍結乾燥形態で別々に提供され、それらの使用前に適切な緩衝液(例えば、リンゲルラクタート溶液)中で別々に再構成されることが好ましい。
更に好ましい実施形態では、(医薬)組成物は、食塩水又は脂質ベース製剤の形態で提供される。脂質ベース製剤は、「複合体化」と題されたセクションに記載されるリポソーム、リポプレックス、ナノリポソーム、及び脂質ナノ粒子を含み得る。
更なる態様では、本発明は、人工核酸分子、好ましくはRNA、及び/又は(医薬)組成物を含むキット又はキットオブパーツに関する。キットは、少なくとも1つのgRNA(又はそれを提供するベクター)を更に含み得る。
本明細書に定義される人工核酸分子、好ましくはRNA、又は(医薬)組成物、若しくはキットオブパーツは、ヒト及び獣医学の医学的目的のために、好ましくはヒトの医学的目的のために使用され得る。
本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA、又は(医薬)組成物、若しくは、キットオブパーツは、例えば、全身的又は局所的に投与することができる。
本発明の(医薬)組成物又はキットオブパーツの各成分、即ち少なくとも1つの人工核酸分子、好ましくはRNA、及び任意に、少なくとも1つの他の核酸(例えば、gRNA又はそれを提供するベクター)を、それを必要としする対象に、1日間に数回、1日間に1回、1日間おきに、1週間に1回、又は1ヶ月間に1回投与することができ、順次又は同時に投与することができる。前記成分は、それを必要とする被験体に、上に定義される異なる投与経路を介して投与することができる。
本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA、(医薬)組成物、又はキットは、好ましくは安全且つ治療的に有効な量で投与される。
CRISPR技術は、遺伝子の機能的ノックアウト又はノックイン、遺伝子編集、又は転写活性化又は阻害を含む様々な目的に使用することができる。したがって、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはRNA、(医薬)組成物、又はキットは、様々な疾患を治療するために使用することができる。人工核酸分子の少なくとも1つのコード配列によってコードされるCRISPR関連タンパク質の発現による治療が有効な疾患、障害、又は状態における遺伝子治療における使用が特に想定される。
好ましい実施形態では、人工核酸、好ましくはRNA、(医薬)組成物、又はキットは、癌の治療又は予防に使用される。
本発明の組合せ、医薬組成物、又はキットは、感染症を治療するために使用され得る。「感染」又は「感染症」という用語は、通常は体内に存在しない細菌、ウイルス、寄生虫などの微生物の侵入及び増殖に関する。感染は、症状を引き起こさず無症状である場合もあれば、症状を引き起こして臨床的に明らかとなる場合もある。感染は、局所に留まる場合もあれば、血液又はリンパ系を介して広がり、全身性になる場合もある。この文脈における感染症は、好ましくは、ウイルス性、細菌性、真菌性、又は原虫性の感染症を含む。
本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA、(医薬)組成物、ワクチン、又はキットオブパーツはまた、組合せ療法において使用され得る。本明細書に定義される疾患及び障害を治療又は予防するために有用な任意の他の療法は、本明細書に開示される使用及び方法と組み合わせることができる。
更なる態様において、本発明は、したがって、前記人工核酸分子、(医薬)組成物、又はキットでの治療が有効な癌、感染症、又は他の任意の疾患の別の治療を支援するための本発明の人工核酸分子、好ましくはRNA、(医薬)組成物、又はキットオブパーツの使用にも関する。
前記に鑑みて、本発明は、以下の項目によって特徴付けられ得る。
1.a.少なくとも1つのCRISPR関連タンパク質をコードする少なくとも1つのコード領域と;
b.ATP5A1、RPL32、HSD17B4、SLC7A3、NOSIP、ASAH1、RPL31、TUBB4B、UBQLN2、MP68、及びNDUFA4からなる群から選択される遺伝子の5’非翻訳領域(5’UTR)に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメントと;
c.GNAS、CASP1、PSMB3、ALB、COX6B1、NDUFA1、及びRPS9からなる群から選択される遺伝子の3’非翻訳領域(3’UTR)に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント
とを含むことを特徴とする人工核酸分子。
2.前記遺伝子のそれぞれが、天然に存在するDNA配列、並びにそのホモログ、変異体、断片、及び対応するRNA配列を含む項目1に記載の人工核酸分子。
3.a.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
b.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
c.ATP5A1遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
d.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
e.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
f.RPL32遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びALB遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
g.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
h.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
i.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
j.NOSIP遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
k.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
l.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
m.ATP5A1遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
n.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCOX6B1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
n.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
o.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
p.NOSIP遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
q.RPL31遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
r.TUBB4B遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
s.UBQLN2遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
t.MP68遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
u.MP68遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメントを含む項目1から2のいずれかに記載の人工核酸分子。
4.d、e、g、又はlに係るUTRエレメントを含む項目3に記載の人工核酸分子。
5.−HSD17B4遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号1に係るDNA配列、又は配列番号1に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号2に係るRNA配列、又は配列番号2に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−RPL32遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号21に係るDNA配列、又は配列番号21に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号22に係るRNA配列、又は配列番号22に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−NDUFA4遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号9に係るDNA配列、又は配列番号9に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号10に係るRNA配列、又は配列番号10に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−SLC7A3遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号15に係るDNA配列、又は配列番号15に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号16に係るRNA配列、又は配列番号16に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−NOSIP遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号11に係るDNA配列、又は配列番号11に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号12に係るRNA配列、又は配列番号12に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−ATP5A1遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号5に係るDNA配列、又は配列番号5に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号6に係るRNA配列、又は配列番号6に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−ASAH1遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号3に係るDNA配列、又は配列番号3に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号4に係るRNA配列、又は配列番号4に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−Mp68遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号7に係るDNA配列、又は配列番号7に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号8に係るRNA配列、又は配列番号8に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−Rpl31遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号13に係るDNA配列、又は配列番号13に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号14に係るRNA配列、又は配列番号14に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−TUBB4B遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号17に係るDNA配列、又は配列番号17に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号18に係るRNA配列、又は配列番号18に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−Ubqln2遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号19に係るDNA配列、又は配列番号19に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号20に係るRNA配列、又は配列番号20に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−GNAS遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号29に係るDNA配列、又は配列番号29に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号30に係るRNA配列、又は配列番号30に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−CASP1遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号25に係るDNA配列、又は配列番号25に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号26に係るRNA配列、又は配列番号26に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−PSMB3遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号23に係るDNA配列、又は配列番号23に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号24に係るRNA配列、又は配列番号24に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−ALB遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号35に係るDNA配列、又は配列番号35に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号36に係るRNA配列、又は配列番号36に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−RPS9遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号33に係るDNA配列、又は配列番号33に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号34に係るRNA配列、又は配列番号34に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−COX6B1遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号27に係るDNA配列、又は配列番号27に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号28に係るRNA配列、又は配列番号28に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;又は
−Ndufa1遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントは、配列番号31に係るDNA配列、又は配列番号31に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号32に係るRNA配列、又は配列番号32に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなる項目1から4のいずれかに記載の人工核酸分子。
6.CRISPR関連タンパク質が、CRISPR関連野生型タンパク質、そのホモログ、変異体、断片、及び誘導体を含む項目1から5のいずれかに記載の人工核酸分子。
7.前記CRISPR関連タンパク質が、Cas9、Cpf1(Cas12)、C2c1、C2c3、Cas13、CasX、又はCasYから選択される項目1から6のいずれかに記載の人工核酸分子。
8.配列番号428〜441;10999〜11001;442〜1345のいずれかに係るアミノ酸配列、又は配列番号428〜441;10999〜11001;442〜1345のいずれかに係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの変異体又は断片を含む又はからなるCRISPR関連タンパク質をコードする核酸配列を含む項目1から7のいずれかに記載の人工核酸分子。
9.前記CRISPR関連タンパク質誘導体が、KRAB、CSD、WRPW、VP64、p65AD、及びMxiから任意に選択される少なくとも1つの更なるエフェクタードメインを含む項目8に記載の人工核酸分子。
10.核局在化シグナル(NLS)をコードする少なくとも1つの核酸配列を更に含み、前記核局在化シグナルが、任意に、配列番号426;427;10575;381;382;384;11957;11958〜11964に係るアミノ酸配列、又は配列番号426;427;10575;381;382;384;11957;11958〜11964に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるNLS、及び配列番号426;427;10575;381;382;384;11957;11958〜11964に係るアミノ酸配列、又は配列番号426;427;10575;381;382;384;11957;11958〜11964に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるNLS、又は配列番号12021〜14274に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するNLSから選択される項目1から9のいずれかに記載の人工核酸分子。
11.タンパク質又はペプチドタグをコードする少なくとも1つの核酸配列を更に含む項目1から10のいずれかに記載の人工核酸分子。
12.前記人工核酸分子の少なくとも1つのコード領域が、配列番号411;2540〜2553;11117〜11119;11355〜11357;2554〜3457;1380〜1393;3700〜3713;4860〜4873;6020〜6033;7180〜7193;8340〜8353;11237〜11239;11473〜11475;11591〜11593;11709〜11711;11827〜11829;11945〜11947;1394〜2297;3714〜4617;4874〜5777;6034〜6937;7194〜8097;8354〜9257;412;3474〜3887 2314〜2327;4634〜4647;5794〜5807;6954〜6967;8114〜8127;413〜425;3490〜3503;3506〜3519;3522〜3535;3538〜3551;3554〜3567;3570〜3583;3586〜3599;3602〜3615;3618〜3631;3634〜3647;3650〜3663;3666〜3679;3682〜3695;9514〜9527;9626〜9639;9738〜9751;9850〜9863;9962〜9975,10074〜10087;10186〜10199;10298〜10311;2330〜2343;2346〜2359;2362〜2375;2378〜2391;2394〜2407;2410〜2423;2426〜2439;2442〜2455;2458〜2471;2474〜2487;2490〜2503;2506〜2519;2522〜2535;9498〜9511;9610〜9623;9722〜9735;9834〜9847;9946〜9959;10058〜10071;10170〜10183〜10282〜10295;4650〜4663;4666〜4679;4682〜4695;4698〜4711;4714〜4727;4730〜4743;4746〜4759;4762〜4775;4778〜4791;4794〜4807;4810〜4823;4826〜4839;4842〜4855;9530〜9543;9642〜9655;9754〜9767;9866〜9879;9978〜9991;10090〜10103;10202〜10215;10314〜10327;5810〜5823;5826〜5839;5842〜5855;5858〜5871;5874〜5887;5890〜5903;5906〜5919;5922〜5935;5938〜5951;5954〜5967;5970〜5983,5986〜5999;6002〜6015;9546〜9559;9658〜9671;9770〜9783;9882〜9895;9994〜10007;10106〜10119;10218〜10231;10330〜10343;6970〜6983;6986〜6999;7002〜7015;7018〜7031;7034〜7047;7050〜7063;7066〜7079;7082〜7095;7098〜7111;7114〜7127;7130〜7143;7146〜7159;7162〜7175;9562〜9575;9674〜9687;9786〜9799;9898〜9911;10010〜10023;10122〜10135;10234〜10247;10346〜10359;8130〜8143;8146〜8159;8162〜8175;8178〜8191;8194〜8207;8210〜8223;8226〜8239;8242〜8255;8258〜8271;8274〜8287;8290〜8302;8306〜8319;8322〜8335;9578〜9591;9690〜9703;9802〜9815;9914〜9927;10026〜10039;10138〜10151;10250〜10263;10362〜10375;9290〜9303;9306〜9319;9322〜9335;9338〜9351;9354〜9367;9370〜9383;9386〜9399;9402〜9415;9418〜9431;9434〜9447;9450〜9463;9466〜9479;9482〜9495;9594〜9607;9706〜9719;9818〜9831;9930〜9943;10042〜10055;10154〜10167;10266〜10279;10378〜10391のいずれかに係る核酸配列;又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる項目1から11のいずれか記載の人工核酸分子。
13.配列番号10552;3458〜3459;3460〜3473;2298〜2299;4618〜4619;5778〜5779;6938〜6939;8098〜8099;9258〜9259;2300〜2313;4620〜4633;5780〜5793;6940〜6953;8100〜8113;9260〜9273;3488〜3489;10396;2328〜2329;10395;4648〜4649;10397;5808〜5809;10398;6968〜6969;10399;8128〜8129;10400;9274〜9287;3504〜3505;3520〜3521;3536〜3537;3552〜3553;3568〜3669;3584〜3585;3600〜3601;3616〜3617;3632〜3633;3648〜3649;3664〜3665;3680〜3681;3696〜3697;9528〜9529;9640〜9641;9752〜9753;9864〜9865;9976〜9977;10088〜10089;10200〜10201;10312〜10313;10403;10410;10417;10424;10431;10438;10445;10452;10459;10466;10473;10480;10487;10494;10501;10508;10515;10522;10529;10536;10543;2344〜2345;2360〜2361;2376〜2377;2392〜2393;2408〜2409;2424〜2425;2440〜2441;2456〜2457;2472〜2473;2489〜2490;2504〜2505;2520〜2521;2536〜2537;9512〜9513;9624〜9625;9736〜9737;9848〜9849;9960〜9961;10072〜10073;10184〜10185;10296〜10297;10402;10409;10416;10423;10430;10437;10444;10451;10458;10465;10472;10479;10486;10493;10500;10507;10514;10521;10528;10535;10542;4664〜4665;4680〜4681;4696〜4697;4712〜4713;4728〜4729;4744〜4745;4760〜4761;4776〜4777;4792〜4793;4808〜4809;4824〜4825;4840〜4841;4856〜4857;9544〜9545;9656〜9657;9768〜9769;9880〜9881;9992〜9993;10104〜10105;10216〜10217;10328〜10329;10404;10411;10418;10425;10432;10439;10446;10453;10460;10467;10474;10481;10488;10495;10502;10509;10516;10523;10530;10537;10544;5824〜5825;5840〜5841;5856〜5857;5872〜5873;5888〜5889;5904〜5905;5920〜5921;5936〜5937;5952〜5953;5968〜5969;5984〜5985;6000〜6001;6016〜6017;9560〜9561;9672〜9673;9784〜9785;9896〜9897;10008〜10009;10120〜10121;10232〜10233;10344〜10345;10405;10412;10419;10426;10433;10440;10447;10454;10461;10468;10475;10482;10489;10496;10503;10510;10517;10524;10531;10538;10545;7033;7048〜7049;7064〜7065;7080〜7081;7096〜7097;7112〜7113;7128〜7129;7144〜7145;7160〜7161;7176〜7177;9576〜9577;9688〜9689;9800〜9801;9912〜9913;10024〜10025;10136〜10137;10248〜10249;10360〜10361;10406;10413;10420;10427;10434;10441;10448;10455;10462;10469;10476;10483;10490;10497;10504;10511;10518;10525;10532;10539;10546;8144〜8145;8160〜8160;8176〜8177;8192〜8193;8208〜8209;8224〜8225;8240〜8241;8256〜8257;8272〜8273;8288〜8289;8304〜8305;8320〜8321;8336〜8337;9592〜9593;9704〜9705;9816〜9817;9928〜9929;10040〜10041;10152〜10153;10264〜10265;10376〜10377;10407;10414;10421;10428;10435;10442;10449;10456;10463;10470;10477;10484;10491;10498;10505;10512;10519;10526;10533;10540;10547;9288〜9289;10401;10553;10582〜10583;10579〜10580;10585〜10586;10588〜10589;10591〜10592;10594〜10595;10597〜10598;10554〜10574;10601;10602;10615;10616;10629;10630;10643;10644;10657;10658;10671;10672;10685;10686;10699;10700;10713;10714;10727;10728;10741;10742;10755;10756;10769;10770;10783;10784;10797;10798;10811;10812;10825;10826;10839;10840;10853;10854;10867;10868;10881;10882;10603;10604;10617;10618;10631;10632;10645;10646;10659;10660;10673;10674;10687;10688;10701;10702;10715;10716;10729;10730;10743;10744;10757;10758;10771;10772;10785;10786;10799;10800;10813;10814;10827;10828;10841;10842;10855;10856;10869;10870;10883;10884;10605;10606;10619;10620;10633;10634;10647;10648;10661;10662;10675;10676;10689;10690;10703;10704;10717;10718;10731;10732;10745;10746;10759;10760;10773;10774;10787;10788;10801;10802;10815;10816;10829;10830;10843;10844;10857;10858;10871;10872;10885;10886;10607;10608;10621;10622;10635;10636;10649;10650;10663;10664;10677;10678;10691;10692;10705;10706;10719;10720;10733;10734;10747;10748;10761;10762;10775;10776;10789;10790;10803;10804;10817;10818;10831;10832;10845;10846;10859;10860;10873;10874;10887;10888;10609;10610;10623;10624;10637;10638;10651;10652;10665;10666;10679;10680;10693;10694;10707;10708;10721;10722;10735;10736;10749;10750;10763;10764;10777;10778;10791;10792;10805;10806;10819;10820;10833;10834;10847;10848;10861;10862;10875;10876;10889;10890;10611;10612;10625;10626;10639;10640;10653;10654;10667;10668;10681;10682;10695;10696;10709;10710;10723;10724;10737;10738;10751;10752;10765;10766;10779;10780;10793;10794;10807;10808;10821;10822;10835;10836;10849;10850;10863;10864;10877;10878;10891;10892;9304〜9305;9320〜9321;9336〜9337;9352〜9353;9368〜9369;9384〜9385;9400〜9401;9416〜9417;9432〜9433;9448〜9449;9464〜9465;9480〜9481;9496〜9497;9608〜9609;9720〜9721;9832〜9833;9944〜9945;10056〜10057;10168〜10169;10280〜10281;10392〜10393;10408;10415;10422;10429;10436;10443;10450;10457;10464;10471;10478;10485;10492;10499;10506;10513;10520;10527;10534;10541;10548のいずれかに係る核酸配列、又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する核酸配列を含む項目1から12のいずれか記載の人工核酸分子。
14.配列番号11011〜11042;11249〜1128011131〜11162;11367〜11398;11485〜11516;11603〜11634;11721〜11752;11839〜11870;11044〜11116;11282〜11354;11164〜11236;11400〜11472;11518〜11590;11636〜11708;11754〜11826;11872〜11944;11011〜11042;11249〜11280;11044〜11116;11282〜11354;11131〜11162;11367〜11398;11485〜11516;11603〜11634;11721〜11752;11839〜11870;11164〜11236;11400〜11472;11518〜11590;11636〜11708;11754〜11826;11872〜11944;11120〜11122;11240;11241;11358;11359;11476;11477;11594;11595;11712;11713;11830;11831;11948;11949;11123〜11130;11360〜11366;11242〜11248;11478〜11484;11596〜11602;11714〜11720;11832〜11838;11950〜11956のいずれかに係る核酸配列、又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する核酸配列を含む項目1から13のいずれか記載の人工核酸分子。
15.RNAである項目1から14のいずれか記載の人工核酸分子。
16.モノ−、ビ−、又はマルチシストロン性である項目15に記載のRNA。
17.mRNA、ウイルスRNA、又はレプリコンRNAである項目14から15のいずれかに記載のRNA。
18.修飾された核酸、好ましくは安定化された核酸である項目1から17のいずれかに記載の人工核酸。
19.−前記人工核酸の少なくとも1つのコード領域のG/C含量が、対応する野生型核酸の対応するコード配列のG/C含量と比較して増加している、及び/又は
−前記人工核酸の少なくとも1つのコード領域のC含量が、対応する野生型核酸の対応するコード配列のC含量と比較して増加している、及び/又は
−前記人工核酸の少なくとも1つのコード領域中のコドンが、ヒトのコドン使用に適合されており、コドン適合度指数(CAI)が、好ましくは、前記人工核酸の少なくとも1つのコード配列において増加又は最大化されている、
−前記人工核酸によってコードされるアミノ酸配列が、好ましくは、対応する野生型人工核酸によってコードされるアミノ酸配列と比較して変化しない、
項目1から18のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
20.5’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN又はCap1を含む項目1から19のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
21.少なくとも1つのヒストンステムループを含む項目1から20のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
22.前記少なくとも1つのヒストンステムループが、以下の式(I)又は(II)に係る核酸配列を含む項目21に記載の人工核酸、好ましくはRNA:
式(I)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
ステム1又はステム2の境界エレメントN1−6は、1〜6個、好ましくは2〜6個、より好ましくは2〜5個、更により好ましくは3〜5個、最も好ましくは4〜5個、又は5個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
ステム1[N0−2GN3−5]は、エレメントステム2に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ5〜7個のヌクレオチドの連続配列であり、
N0−2は、0〜2個、好ましくは0〜1個、より好ましくは1個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
N3−5は、3〜5個、好ましくは4〜5個、より好ましくは4個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Gは、グアノシン又はその類似体であり、任意に、シチジン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム2におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列[N0−4(U/T)N0−4]は、エレメントステム1とステム2との間に位置し、且つ3〜5個のヌクレオチド、より好ましくは4個のヌクレオチドの連続配列であり、
各N0−4は、互いに独立して、0〜4個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
U/Tは、ウリジン又は任意にチミジンを表し、
ステム2[N3−5CN0−2]は、エレメントステム1に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ5〜7個のヌクレオチドの連続配列であり、
N3−5は、3〜5個、好ましくは4〜5個、より好ましくは4個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
N0−2は、0〜2個、好ましくは0〜1個、より好ましくは1個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、若しくはCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Cは、シチジン又はその類似体であり、任意に、グアノシン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム1におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム1及びステム2が、互いに塩基対合でき、
逆相補的配列を形成して、塩基対合がステム1とステム2との間で生じ得る、又は
部分的に逆相補的な配列を形成して、不完全な塩基対合がステム1とステム2との間で生じ得る。
24.前記少なくとも1つのヒストンステムループが、以下の式(Ia)又は(IIa)に係る核酸配列を含む項目19から20のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA:
式(Ia)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
26.任意に、ポリ(C)配列を含み、前記ポリ(C)配列が、好ましくは10〜200、10〜100、20〜70、20〜60、又は10〜40個のシトシンヌクレオチドを含む項目1から25のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
27.以下のエレメントを、好ましくは5’から3’方向に含む項目1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA:
a)5’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN又はCap1;
b)本明細書に定義される5’−UTRに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号1;3;5;7;9;11;13;15;17;19;又は21に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む5’−UTRエレメント;
c)本明細書に定義される少なくとも1つのコード配列;
d)本明細書に定義される3’−UTRに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号15;17;19;21;29;31;33又は35に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む5’−UTRエレメント;
e)任意に、ポリ(A)テール、好ましくは10〜1000、10〜500、10〜300、10〜200、10〜100、40〜80、又は50〜70個のアデノシンヌクレオチドからなる;
f)任意に、ポリ(C)テール、好ましくは10〜200、10〜100、20〜70、20〜60、又は10〜40個のシトシンヌクレオチドからなる;及び
g)任意に、ヒストンステムループ(HSL)。
28.項目1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNAと、薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
29.前記人工核酸分子、好ましくはRNAが、1以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性又はポリカチオンポリマー、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、プロタミン、カチオン性又はポリカチオン性多糖類、及び/又はカチオン性又はポリカチオン性脂質と複合体化される項目28に記載の組成物。
30.前記人工核酸分子、好ましくはRNAの、前記1以上カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質に対するN/P比が、約0.3〜4、約0.5〜2、約0.7〜2、及び約0.7〜1.5の範囲を含む約0.1〜10の範囲である項目29に記載の組成物。
31.前記人工核酸分子、好ましくはRNAが、1以上の脂質と複合体を形成し、それによってリポソーム、脂質ナノ粒子、及び/又はリポプレックスを形成する項目28から30のいずれかに記載の組成物。
32.少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸を更に含み、前記gRNAが、対象の標的DNA配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントにCRISPR関連タンパク質を標的化することができる項目28から31のいずれかに記載の組成物。
33.項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、又は項目28から32のいずれかに記載の組成物、及び任意に液体ビヒクル及び/又は任意に前記人工核酸分子又は前記組成物の投与及び用量に関する情報を含む技術的指示を含むことを特徴とするキット、好ましくはキットオブパーツ。
34.リンゲルラクタート溶液を一部として含む項目33に記載のキット。
35.ガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸を更に含み、前記gRNAが、対象の標的DNA配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントにCRISPR関連タンパク質を標的化することができる項目33から34のいずれかに記載のキット。
36.医薬として使用するための、項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、項目28から32のいずれかに記載の組成物、又は項目33から35に記載のキット。
37.遺伝子治療において使用するための、項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、項目28から32のいずれかに記載の組成物、又は項目33から35に記載のキット。
38.(a)前記人工核酸分子、好ましくはRNA、前記組成物、又は前記キット、及び(b)ガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記sgRNAが、CRISPR関連タンパク質を目的遺伝子、又はそれに機能可能に連結された調節エレメントに標的化することができる、目的遺伝子の発現を調節する方法における使用のための項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、項目28から32のいずれかに記載の組成物、又は項目33から35に記載のキット。
39.医薬として使用するための、又は前記少なくとも1つのコード配列によってコードされるCRISPR関連タンパク質の発現による治療が有効な疾患、障害、又は状態における遺伝子治療における使用のための、項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、項目28から32のいずれかに記載の組成物、又は項目33から35に記載のキット。
40.医薬として使用するための、又は目的遺伝子をノックイン、ノックアウト、又は操作する又は目的遺伝子の発現を調節することが有効である疾患、障害、又は状態の遺伝子治療において使用するための、項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、項目28から32のいずれかに記載の組成物、又は項目33から35に記載のキット。
41.前記疾患、障害、又は状態が、遺伝病、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び感染症から選択される項目40に記載の使用のための人工核酸分子、好ましくはRNA、組成物、又はキット。
42.前記コードされたCRISPR関連タンパク質の発現を、任意に遺伝子治療において、上昇させるための、項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、項目28から32のいずれかに記載の組成物、又は項目33から35に記載のキットの使用。
43.前記コードされたCRISPR関連タンパク質によって標的化される目的遺伝子の発現を調節するための、項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、項目28から32のいずれかに記載の組成物、又は項目33から35のいずれかに記載のキットの使用。
44.a)項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNAを提供する工程と;
b)CRISPR関連タンパク質を目的の標的DNA配列、又はそれに機能可能に連結された調節エレメントを標的にすることができるガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸を提供する工程と;
c)目的遺伝子の発現効率を調節するのに適した条件下で、細胞、組織、又は生物を、前記人工核酸分子、好ましくはRNA、及び、前記gRNA又はそれをコードする核酸に接触させる工程とを含む目的遺伝子の発現を調節することを特徴とする方法。
45.障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする被験体に、項目1から27のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、項目28から32のいずれかに記載の組成物、又は項目33から35のいずれかに記載のキットの有効量と、CRISPR関連タンパク質を目的の標的DNA配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントに標的化することができるガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸とを投与することを含むことを特徴とする方法。
46.前記障害が、前記コードされたCRISPR関連タンパク質の発現による治療が有効な、好ましくは前記CRISPR関連タンパク質が標的とする目的遺伝子の発現の調節による治療が有効な疾患、障害、又は状態である項目45に記載の方法。
47.前記障害が、目的遺伝子をノックイン、ノックアウト、若しくは操作する、又は目的遺伝子の発現を変化させることが有効である疾患、障害、又は状態である項目45から46のいずれかに記載の方法。
48.CRISPR関連タンパク質をコードするコード領域を含む人工核酸分子、好ましくはRNAの発現効率を上昇させるための方法であって、
(a)前記コード領域を、ATP5A1、RPL32、HSD17B4、SLC7A3、NOSIP、又はNDUFA4からなる群から選択される遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、又は変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメントと会合させることと;
(b)前記コード領域を、GNAS、CASP1、PSMB3、ALB、又はRPS9からなる群から選択される遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、又は変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメントと会合させることと;
(c)項目1から47のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNAを得ることとを含むことを特徴とする方法。
以下に、本発明の様々な実施形態及び態様を説明する具体例を提示する。しかし、本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるように与えられるものである。しかし、本発明は、例示される実施形態によって範囲が限定されるものではなく、前記実施形態は、本発明の1つの態様を説明することのみを意図し、機能的に等価な方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な変形例は、前述の記載、添付図面、及び以下の実施例から当業者に容易に明らかになる。全てのかかる変形例は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
細胞を、96ウェルプレート(Nunc Microplate Black w / Clear Optical Bottom; Thermo Fisher)中、Helaは、10,000細胞/ウェルの密度で、Hek293TとHEPG2は、20,000細胞/ウェルで、互換性のある完全細胞培地(200μl)に播種した。細胞を37℃、5%CO2で24時間維持した。トランスフェクション当日、完全培地を50μlの無血清Opti−MEM培地(Thermo Fisher)で交換した。各mRNA、即ち、配列番号14274(RPL32/ALB7.1)、配列番号14275(HSD17B4/CASP1.1)、配列番号14276(SLC7A3.1/PSMB3.1)、配列番号14277(SLC7A3.1/CASP1.1)、配列番号14278(NOSIP.1/PSMB3.1)、配列番号14279(NDUFA4.1/RPS9.1)、配列番号14280(NDUFA4.1/PSMB3.1)、配列番号14281(HSD17B4/PSMB3.1)、及び配列番号14282(HSD17B4/RPS9.1)の100ngを、Opti−MEMの50μl中、リポフェクタミン3000をmRNA:リポフェクタミン3000の比が1:1.5で用いて、リポ複合体化した。次いで、リポ複合体化mRNAを対応する96ウェルプレートに添加した。トランスフェクションの3時間後、前記完全培地を100μlの完全細胞培地で交換した。インセルウェスタンを行う前に、細胞を37℃、5%CO2で24時間更に維持した。
Hela細胞を12ウェルプレート(Nunc; Thermo Fisher)に、完全細胞培地(RPMI;10%ウシ胎児血清;1%ペニシリン/ストレプトマイシン及び1%L−グルタミン;Lonza)中のHelaが最終密度200,000細胞/ウェルで播種した。細胞を37℃、5%CO2で24時間維持した。トランスフェクション当日、完全培地を750μlの無血清Opti−MEM培地(Thermo Fisher)で交換した。本発明のUTRの組合せ(図の凡例を参照)を含むCas9コードmRNA、即ち、配列番号14274(RPL32/ALB7.1)、配列番号14275(HSD17B4/CASP1.1)、配列番号14276(SLC7A3.1/PSMB3.1)、配列番号14277(SLC7A3.1/CASP1.1)、配列番号14278(NOSIP.1/PSMB3.1)、配列番号14279(NDUFA4.1/RPS9.1)、配列番号14280(NDUFA4.1/PSMB3.1)、配列番号14281(HSD17B4/PSMB3.1)、及び配列番号14282(HSD17B4/RPS9.1)の1μgを、Opti−MEM 250μl中リポフェクタミン3000をmRNA:リポフェクタミン3000の比が1:1.5で用いてリポ複合体化した。次に、リポ複合体化mRNAを各ウェルに添加した。トランスフェクションの3時間後、完全培地を1mlの完全細胞培地で交換した。タンパク質抽出を行う前に、細胞を37℃、5%CO2で24時間更に維持した。
細胞を、完全細胞培地(RPMI200μl、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%L−グルタミン、Lonza)で、Helaの密度50,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種した。細胞を、37℃、5%CO2で24時間維持した。トランスフェクション当日、spCas9mRNA(配列番号14274=RPL32/ALB7.1、配列番号14281=HSD17B4/PSMB3.1の100ng(各mRNAは、1回、追加の酵素的ポリアデニル化なしで、1回、追加の酵素的ポリアデニル化ありで;参照として市販のCas9コードRNA TriLink BioTechnologies、LLC、Cat.No.L−6125を使用)を、TransIT(登録商標)mRNAトランスフェクション(Mirus Bio)を使用して、ヒトペプチジルプロリルイソメラーゼB(PPIB、即ち、シクロフィリンB;Dharmacon;SO−2544646G)に対するcrRNA(25nM)と、tracrRNA(25nM;Dharmacon;U−002000−20)の混合物でリポ複合体化した。ネガティブコントロールとして、トランスフェクション混合物ではspCas9mRNA又はガイドRNA、或いはその両方を除いた。最終体積10μlを96ウェルプレートの培地に添加した。トランスフェクションの3時間後、完全培地を100μlの完全細胞培地で交換した。細胞抽出を行う前に、細胞を更に37℃、5%CO2で24時間維持した。
1)変性工程:98℃で3分間;
2)タッチダウンPCRサイクル反応10×(変性98℃で10秒間;タッチダウンアニーリング72℃〜1℃/サイクルで15秒間、伸長72℃で30秒間);
3)通常のPCRサイクル反応25x(変性98℃で10秒間;アニーリング62℃で15秒間;伸長72℃で30秒間);
4)72℃で10分間最終延長。
次いで、PCRサンプルを95℃で10分間加熱し、室温で15分間超ゆっくりと冷却した。
細胞を、96ウェルプレート(Nunc Microplate Black w / Clear Optical Bottom; Thermo Fisher)中、Helaは、10,000細胞/ウェルの密度で、HepG2とHek293Tは、20,000細胞/ウェルで、前に使用した互換性のある完全細胞培地(200μl)に播種した。細胞を、37℃、5%CO2で24時間維持した。トランスフェクション当日、mRNA、即ち、配列番号10549(RPL32/ALB7)、配列番号14289(Mp68/Gnas.1)、配列番号14290(Ndufa4.1/PSMB3.1)、配列番号14291(HSD17B4/Gnas.1)、配列番号14292(HSD17B4/PSMB3.1)、及び配列番号14293(Ndufa4.1/Alb7)(HeLa及びHek293T細胞のトランスフェクション用)の100ng、及びmRNA、即ち、同一配列番号(HepG2)の500ngを、Opti−MEM50μl中のリポフェクタミンメッセンジャーマックスをmRNA:リポフェクタミンメッセンジャーマックスの比が1:1.5で使用して、リポ複合体化した。次いで、リポ複合体化mRNAを対応する96ウェルプレートに添加した。インセルウェスタンを行う前に、細胞を37℃、5%CO2で24時間更に維持した。
Claims (47)
- a.少なくとも1つのCRISPR関連タンパク質をコードする少なくとも1つのコード領域と;
b.SLC7A3、ATP5A1、RPL32、HSD17B4、NOSIP、ASAH1、RPL31、TUBB4B、UBQLN2、MP68、及びNDUFA4からなる群から選択される遺伝子の5’非翻訳領域(5’UTR)に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメントと;
c.GNAS、CASP1、PSMB3、ALB、COX6B1、NDUFA1、及びRPS9からなる群から選択される遺伝子の3’非翻訳領域(3’UTR)に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメントとを含むことを特徴とする人工核酸分子。 - 前記遺伝子のそれぞれが、天然に存在するDNA配列、並びにそのホモログ、変異体、断片、及び対応するRNA配列を含む請求項1に記載の人工核酸分子。
- a.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
b.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
c.ATP5A1遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
d.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
e.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
f.RPL32遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びALB遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
g.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
h.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCASP1遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
i.SLC7A3遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
j.NOSIP遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びPSMB3遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
k.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
l.HSD17B4遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
m.ATP5A1遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
n.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びCOX6B1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
n.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
o.NDUFA4遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
p.NOSIP遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
q.RPL31遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
r.TUBB4B遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
s.UBQLN2遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びRPS9遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
t.MP68遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びGNAS遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメント;又は
u.MP68遺伝子の5’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメント、及びNDUFA1遺伝子の3’UTR、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメントを含む請求項1から2のいずれかに記載の人工核酸分子。 - d、e、g、又はlに係るUTRエレメントを含む請求項3に記載の人工核酸分子。
- −HSD17B4遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号1に係るDNA配列、又は配列番号1に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号2に係るRNA配列、又は配列番号2に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−RPL32遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号21に係るDNA配列、又は配列番号21に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号22に係るRNA配列、又は配列番号22に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−NDUFA4遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号9に係るDNA配列、又は配列番号9に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号10に係るRNA配列、又は配列番号10に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−SLC7A3遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号15に係るDNA配列、又は配列番号15に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号16に係るRNA配列、又は配列番号16に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−NOSIP遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号11に係るDNA配列、又は配列番号11に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号12に係るRNA配列、又は配列番号12に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−ATP5A1遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号5に係るDNA配列、又は配列番号5に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号6に係るRNA配列、又は配列番号6に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−ASAH1遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号3に係るDNA配列、又は配列番号3に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号4に係るRNA配列、又は配列番号4に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−Mp68遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号7に係るDNA配列、又は配列番号7に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号8に係るRNA配列、又は配列番号8に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−Rpl31遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号13に係るDNA配列、又は配列番号13に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号14に係るRNA配列、又は配列番号14に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−TUBB4B遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号17に係るDNA配列、又は配列番号17に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号18に係るRNA配列、又は配列番号18に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−Ubqln2遺伝子に由来する前記5’UTRエレメントが、配列番号19に係るDNA配列、又は配列番号19に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号20に係るRNA配列、又は配列番号20に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−GNAS遺伝子に由来する前記3’UTRエレメントが、配列番号29に係るDNA配列、又は配列番号29に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号30に係るRNA配列、又は配列番号30に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−CASP1遺伝子に由来する前記3’UTRエレメントが、配列番号25に係るDNA配列、又は配列番号25に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号26に係るRNA配列、又は配列番号26に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−PSMB3遺伝子に由来する前記3’UTRエレメントが、配列番号23に係るDNA配列、又は配列番号23に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号24に係るRNA配列、又は配列番号24に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−ALB遺伝子に由来する前記3’UTRエレメントが、配列番号35に係るDNA配列、又は配列番号35に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号36に係るRNA配列、又は配列番号36に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−RPS9遺伝子に由来する前記3’UTRエレメントが、配列番号33に係るDNA配列、又は配列番号33に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号34に係るRNA配列、又は配列番号34に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;
−COX6B1遺伝子に由来する前記3’UTRエレメントが、配列番号27に係るDNA配列、又は配列番号27に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号28に係るRNA配列、又は配列番号28に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり;又は
−Ndufa1遺伝子に由来する前記3’UTRエレメントが、配列番号31に係るDNA配列、又は配列番号31に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するDNA配列、又はその断片若しくは変異体;又は配列番号32に係るRNA配列、又は配列番号32に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するRNA配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなる請求項1から4のいずれかに記載の人工核酸分子。 - 前記CRISPR関連タンパク質が、CRISPR関連野生型タンパク質、そのホモログ、変異体、断片、及び誘導体を含む請求項1から5のいずれかに記載の人工核酸分子。
- 前記CRISPR関連タンパク質が、Cas9、Cpf1(Cas12)、C2c1、C2c3、Cas13、CasX、又はCasYから選択される請求項1から6のいずれかに記載の人工核酸分子。
- 配列番号428〜441;10999〜11001;442〜1345のいずれかに係るアミノ酸配列、又は配列番号428〜441;10999〜11001;442〜1345のいずれかに係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの変異体又は断片を含む又はからなるCRISPR関連タンパク質をコードする核酸配列を含む請求項1から7のいずれかに記載の人工核酸分子。
- 前記CRISPR関連タンパク質誘導体が、少なくとも1つの更なるエフェクタードメインを含み、前記少なくとも1つの更なるエフェクタードメインが、任意に、KRAB、CSD、WRPW、VP64、p65AD、及びMxiから選択される請求項8に記載の人工核酸分子。
- 核局在化シグナル(NLS)をコードする少なくとも1つの核酸配列を更に含み、前記核局在化シグナルが、任意に、配列番号426;427;10575;381;382;384;11957;11958〜11964に係るアミノ酸配列、又は配列番号426;427;10575;381;382;384;11957;11958〜11964に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるNLS、及び配列番号426;427;10575;381;382;384;11957;11958〜11964に係るアミノ酸配列、又は配列番号426;427;10575;381;382;384;11957;11958〜11964に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるNLS、又は配列番号12021〜14274に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するNLSから選択される請求項1から9のいずれかに記載の人工核酸分子。
- タンパク質又はペプチドタグをコードする少なくとも1つの核酸配列を更に含む請求項1から10のいずれかに記載の人工核酸分子。
- 前記人工核酸分子の少なくとも1つのコード領域が、配列番号411;2540〜2553;11117〜11119;11355〜11357;2554〜3457;1380〜1393;3700〜3713;4860〜4873;6020〜6033;7180〜7193;8340〜8353;11237〜11239;11473〜11475;11591〜11593;11709〜11711;11827〜11829;11945〜11947;1394〜2297;3714〜4617;4874〜5777;6034〜6937;7194〜8097;8354〜9257;412;3474〜3887 2314〜2327;4634〜4647;5794〜5807;6954〜6967;8114〜8127;413〜425;3490〜3503;3506〜3519;3522〜3535;3538〜3551;3554〜3567;3570〜3583;3586〜3599;3602〜3615;3618〜3631;3634〜3647;3650〜3663;3666〜3679;3682〜3695;9514〜9527;9626〜9639;9738〜9751;9850〜9863;9962〜9975,10074〜10087;10186〜10199;10298〜10311;2330〜2343;2346〜2359;2362〜2375;2378〜2391;2394〜2407;2410〜2423;2426〜2439;2442〜2455;2458〜2471;2474〜2487;2490〜2503;2506〜2519;2522〜2535;9498〜9511;9610〜9623;9722〜9735;9834〜9847;9946〜9959;10058〜10071;10170〜10183〜10282〜10295;4650〜4663;4666〜4679;4682〜4695;4698〜4711;4714〜4727;4730〜4743;4746〜4759;4762〜4775;4778〜4791;4794〜4807;4810〜4823;4826〜4839;4842〜4855;9530〜9543;9642〜9655;9754〜9767;9866〜9879;9978〜9991;10090〜10103;10202〜10215;10314〜10327;5810〜5823;5826〜5839;5842〜5855;5858〜5871;5874〜5887;5890〜5903;5906〜5919;5922〜5935;5938〜5951;5954〜5967;5970〜5983,5986〜5999;6002〜6015;9546〜9559;9658〜9671;9770〜9783;9882〜9895;9994〜10007;10106〜10119;10218〜10231;10330〜10343;6970〜6983;6986〜6999;7002〜7015;7018〜7031;7034〜7047;7050〜7063;7066〜7079;7082〜7095;7098〜7111;7114〜7127;7130〜7143;7146〜7159;7162〜7175;9562〜9575;9674〜9687;9786〜9799;9898〜9911;10010〜10023;10122〜10135;10234〜10247;10346〜10359;8130〜8143;8146〜8159;8162〜8175;8178〜8191;8194〜8207;8210〜8223;8226〜8239;8242〜8255;8258〜8271;8274〜8287;8290〜8302;8306〜8319;8322〜8335;9578〜9591;9690〜9703;9802〜9815;9914〜9927;10026〜10039;10138〜10151;10250〜10263;10362〜10375;9290〜9303;9306〜9319;9322〜9335;9338〜9351;9354〜9367;9370〜9383;9386〜9399;9402〜9415;9418〜9431;9434〜9447;9450〜9463;9466〜9479;9482〜9495;9594〜9607;9706〜9719;9818〜9831;9930〜9943;10042〜10055;10154〜10167;10266〜10279;10378〜10391のいずれかに係る核酸配列;又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる請求項1から11のいずれか記載の人工核酸分子。
- 配列番号10552;3458〜3459;3460〜3473;2298〜2299;4618〜4619;5778〜5779;6938〜6939;8098〜8099;9258〜9259;2300〜2313;4620〜4633;5780〜5793;6940〜6953;8100〜8113;9260〜9273;3488〜3489;10396;2328〜2329;10395;4648〜4649;10397;5808〜5809;10398;6968〜6969;10399;8128〜8129;10400;9274〜9287;3504〜3505;3520〜3521;3536〜3537;3552〜3553;3568〜3669;3584〜3585;3600〜3601;3616〜3617;3632〜3633;3648〜3649;3664〜3665;3680〜3681;3696〜3697;9528〜9529;9640〜9641;9752〜9753;9864〜9865;9976〜9977;10088〜10089;10200〜10201;10312〜10313;10403;10410;10417;10424;10431;10438;10445;10452;10459;10466;10473;10480;10487;10494;10501;10508;10515;10522;10529;10536;10543;2344〜2345;2360〜2361;2376〜2377;2392〜2393;2408〜2409;2424〜2425;2440〜2441;2456〜2457;2472〜2473;2489〜2490;2504〜2505;2520〜2521;2536〜2537;9512〜9513;9624〜9625;9736〜9737;9848〜9849;9960〜9961;10072〜10073;10184〜10185;10296〜10297;10402;10409;10416;10423;10430;10437;10444;10451;10458;10465;10472;10479;10486;10493;10500;10507;10514;10521;10528;10535;10542;4664〜4665;4680〜4681;4696〜4697;4712〜4713;4728〜4729;4744〜4745;4760〜4761;4776〜4777;4792〜4793;4808〜4809;4824〜4825;4840〜4841;4856〜4857;9544〜9545;9656〜9657;9768〜9769;9880〜9881;9992〜9993;10104〜10105;10216〜10217;10328〜10329;10404;10411;10418;10425;10432;10439;10446;10453;10460;10467;10474;10481;10488;10495;10502;10509;10516;10523;10530;10537;10544;5824〜5825;5840〜5841;5856〜5857;5872〜5873;5888〜5889;5904〜5905;5920〜5921;5936〜5937;5952〜5953;5968〜5969;5984〜5985;6000〜6001;6016〜6017;9560〜9561;9672〜9673;9784〜9785;9896〜9897;10008〜10009;10120〜10121;10232〜10233;10344〜10345;10405;10412;10419;10426;10433;10440;10447;10454;10461;10468;10475;10482;10489;10496;10503;10510;10517;10524;10531;10538;10545;7033;7048〜7049;7064〜7065;7080〜7081;7096〜7097;7112〜7113;7128〜7129;7144〜7145;7160〜7161;7176〜7177;9576〜9577;9688〜9689;9800〜9801;9912〜9913;10024〜10025;10136〜10137;10248〜10249;10360〜10361;10406;10413;10420;10427;10434;10441;10448;10455;10462;10469;10476;10483;10490;10497;10504;10511;10518;10525;10532;10539;10546;8144〜8145;8160〜8160;8176〜8177;8192〜8193;8208〜8209;8224〜8225;8240〜8241;8256〜8257;8272〜8273;8288〜8289;8304〜8305;8320〜8321;8336〜8337;9592〜9593;9704〜9705;9816〜9817;9928〜9929;10040〜10041;10152〜10153;10264〜10265;10376〜10377;10407;10414;10421;10428;10435;10442;10449;10456;10463;10470;10477;10484;10491;10498;10505;10512;10519;10526;10533;10540;10547;9288〜9289;10401;10553;10582〜10583;10579〜10580;10585〜10586;10588〜10589;10591〜10592;10594〜10595;10597〜10598;10554〜10574;10601;10602;10615;10616;10629;10630;10643;10644;10657;10658;10671;10672;10685;10686;10699;10700;10713;10714;10727;10728;10741;10742;10755;10756;10769;10770;10783;10784;10797;10798;10811;10812;10825;10826;10839;10840;10853;10854;10867;10868;10881;10882;10603;10604;10617;10618;10631;10632;10645;10646;10659;10660;10673;10674;10687;10688;10701;10702;10715;10716;10729;10730;10743;10744;10757;10758;10771;10772;10785;10786;10799;10800;10813;10814;10827;10828;10841;10842;10855;10856;10869;10870;10883;10884;10605;10606;10619;10620;10633;10634;10647;10648;10661;10662;10675;10676;10689;10690;10703;10704;10717;10718;10731;10732;10745;10746;10759;10760;10773;10774;10787;10788;10801;10802;10815;10816;10829;10830;10843;10844;10857;10858;10871;10872;10885;10886;10607;10608;10621;10622;10635;10636;10649;10650;10663;10664;10677;10678;10691;10692;10705;10706;10719;10720;10733;10734;10747;10748;10761;10762;10775;10776;10789;10790;10803;10804;10817;10818;10831;10832;10845;10846;10859;10860;10873;10874;10887;10888;10609;10610;10623;10624;10637;10638;10651;10652;10665;10666;10679;10680;10693;10694;10707;10708;10721;10722;10735;10736;10749;10750;10763;10764;10777;10778;10791;10792;10805;10806;10819;10820;10833;10834;10847;10848;10861;10862;10875;10876;10889;10890;10611;10612;10625;10626;10639;10640;10653;10654;10667;10668;10681;10682;10695;10696;10709;10710;10723;10724;10737;10738;10751;10752;10765;10766;10779;10780;10793;10794;10807;10808;10821;10822;10835;10836;10849;10850;10863;10864;10877;10878;10891;10892;9304〜9305;9320〜9321;9336〜9337;9352〜9353;9368〜9369;9384〜9385;9400〜9401;9416〜9417;9432〜9433;9448〜9449;9464〜9465;9480〜9481;9496〜9497;9608〜9609;9720〜9721;9832〜9833;9944〜9945;10056〜10057;10168〜10169;10280〜10281;10392〜10393;10408;10415;10422;10429;10436;10443;10450;10457;10464;10471;10478;10485;10492;10499;10506;10513;10520;10527;10534;10541;10548のいずれかに係る核酸配列、又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項1から12のいずれか記載の人工核酸分子。
- 配列番号11011〜11042;11249〜1128011131〜11162;11367〜11398;11485〜11516;11603〜11634;11721〜11752;11839〜11870;11044〜11116;11282〜11354;11164〜11236;11400〜11472;11518〜11590;11636〜11708;11754〜11826;11872〜11944;11011〜11042;11249〜11280;11044〜11116;11282〜11354;11131〜11162;11367〜11398;11485〜11516;11603〜11634;11721〜11752;11839〜11870;11164〜11236;11400〜11472;11518〜11590;11636〜11708;11754〜11826;11872〜11944;11120〜11122;11240;11241;11358;11359;11476;11477;11594;11595;11712;11713;11830;11831;11948;11949;11123〜11130;11360〜11366 11242〜11248;11478〜11484;11596〜11602;11714〜11720;11832〜11838;11950〜11956のいずれかに係る核酸配列、又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項1から13のいずれか記載の人工核酸分子。
- RNAである請求項1から14のいずれか記載の人工核酸分子。
- モノ−、ビ−、又はマルチシストロン性である請求項15に記載のRNA。
- mRNA、ウイルスRNA、又はレプリコンRNAである請求項14から15のいずれかに記載のRNA。
- 修飾された核酸、好ましくは安定化された核酸である請求項1から17のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
- −前記人工核酸の少なくとも1つのコード領域のG/C含量が、対応する野生型核酸の対応するコード配列のG/C含量と比較して増加している、及び/又は
−前記人工核酸の少なくとも1つのコード領域のC含量が、対応する野生型核酸の対応するコード配列のC含量と比較して増加している、及び/又は
−前記人工核酸の少なくとも1つのコード領域中のコドンが、ヒトのコドン使用に適合されており、コドン適合度指数(CAI)が、好ましくは、前記人工核酸の少なくとも1つのコード配列において増加又は最大化されている、
−前記人工核酸によってコードされるアミノ酸配列が、好ましくは、対応する野生型人工核酸によってコードされるアミノ酸配列と比較して変化しない、
請求項1から18のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。 - 5’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN又はCap1を含む請求項1から19のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
- 少なくとも1つのヒストンステムループを含む請求項1から20のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
- 前記少なくとも1つのヒストンステムループが、以下の式(I)又は(II)に係る核酸配列を含む請求項21に記載の人工核酸、好ましくはRNA:
式(I)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
ステム1又はステム2の境界エレメントN1−6は、1〜6個、好ましくは2〜6個、より好ましくは2〜5個、更により好ましくは3〜5個、最も好ましくは4〜5個、又は5個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
ステム1[N0−2GN3−5]は、エレメントステム2に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ5〜7個のヌクレオチドの連続配列であり、
N0−2は、0〜2個、好ましくは0〜1個、より好ましくは1個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
N3−5は、3〜5個、好ましくは4〜5個、より好ましくは4個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Gは、グアノシン又はその類似体であり、任意に、シチジン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム2におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列[N0−4(U/T)N0−4]は、エレメントステム1とステム2との間に位置し、且つ3〜5個のヌクレオチド、より好ましくは4個のヌクレオチドの連続配列であり、
各N0−4は、互いに独立して、0〜4個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
U/Tは、ウリジン又は任意にチミジンを表し、
ステム2[N3−5CN0−2]は、エレメントステム1に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ5〜7個のヌクレオチドの連続配列であり、
N3−5は、3〜5個、好ましくは4〜5個、より好ましくは4個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、及びCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
N0−2は、0〜2個、好ましくは0〜1個、より好ましくは1個のNの連続配列であり、各Nは、互いに独立して、A、U、T、G、若しくはCから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Cは、シチジン又はその類似体であり、任意に、グアノシン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム1におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム1及びステム2が、互いに塩基対合でき、
逆相補的配列を形成して、塩基対合がステム1とステム2との間で生じ得る、又は
部分的に逆相補的な配列を形成して、不完全な塩基対合がステム1とステム2との間で生じ得る。 - 前記少なくとも1つのヒストンステムループが、以下の式(Ia)又は(IIa)に係る核酸配列を含む請求項21から22のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA:
式(Ia)(ステム境界エレメントを含まないステムループ配列):
- 任意に、ポリ(A)配列を含み、前記ポリ(A)配列が、好ましくは10〜200、10〜100、40〜80、又は50〜70個のアデノシンヌクレオチドを含む請求項1から23のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
- 任意に、ポリ(C)配列を含み、前記ポリ(C)配列が、好ましくは10〜200、10〜100、20〜70、20〜60、又は10〜40個のシトシンヌクレオチドを含む請求項1から24のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはRNA。
- 以下のエレメントを、好ましくは5’から3’方向に含む請求項1から25のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA:
a)5’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN又はCap1;
b)請求項1から5のいずれかに定義される5’−UTRに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号1;3;5;7;9;11;13;15;17;19;又は21に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む5’−UTRエレメント;
c)請求項7から13のいずれかに定義される少なくとも1つのコード配列;
d)請求項1から5のいずれかに定義される3’−UTRに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号15;17;19;21;29;31;33又は35に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む5’−UTRエレメント;
e)任意に、ポリ(A)テール、好ましくは10〜1000、10〜500、10〜300、10〜200、10〜100、40〜80、又は50〜70個のアデノシンヌクレオチドからなる;
f)任意に、ポリ(C)テール、好ましくは10〜200、10〜100、20〜70、20〜60、又は10〜40個のシトシンヌクレオチドからなる;及び
g)任意に、ヒストンステムループ(HSL)。 - 請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNAと、薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
- 前記人工核酸分子、好ましくはRNAが、1以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性又はポリカチオンポリマー、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、プロタミン、カチオン性又はポリカチオン性多糖類、及び/又はカチオン性又はポリカチオン性脂質と複合体化される請求項27に記載の組成物。
- 前記人工核酸分子、好ましくはRNAの、前記1以上カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質に対するN/P比が、約0.3〜4、約0.5〜2、約0.7〜2、及び約0.7〜1.5の範囲を含む約0.1〜10の範囲である請求項28に記載の組成物。
- 前記人工核酸分子、好ましくはRNAが、1以上の脂質と複合体を形成し、それによってリポソーム、脂質ナノ粒子、及び/又はリポプレックスを形成する請求項27から29のいずれかに記載の組成物。
- 少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸を更に含み、前記gRNAが、対象の標的DNA配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントにCRISPR関連タンパク質を標的化することができる請求項27から30のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、又は請求項27から31のいずれかに記載の組成物、及び任意に液体ビヒクル及び/又は任意に前記人工核酸分子又は前記組成物の投与及び用量に関する情報を含む技術的指示を含むことを特徴とするキット、好ましくはキットオブパーツ。
- リンゲルラクタート溶液を一部として含む請求項32に記載のキット。
- ガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸を更に含み、前記gRNAが、対象の標的DNA配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントにCRISPR関連タンパク質を標的化することができる請求項32から33のいずれかに記載のキット。
- 医薬として使用するための、請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、請求項27から31のいずれかに記載の組成物、又は請求項32から34に記載のキット。
- 遺伝子治療において使用するための、請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、請求項27から31のいずれかに記載の組成物、又は請求項32から34に記載のキット。
- (a)前記人工核酸分子、好ましくはRNA、前記組成物、又は前記キット、及び(b)ガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記sgRNAが、CRISPR関連タンパク質を目的遺伝子、又はそれに機能可能に連結された調節エレメントに標的化することができる、目的遺伝子の発現を調節する方法における使用のための請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、請求項27から31のいずれかに記載の組成物、又は請求項32から34に記載のキット。
- 医薬として使用するための、又は前記少なくとも1つのコード配列によってコードされるCRISPR関連タンパク質の発現による治療が有効な疾患、障害、又は状態における遺伝子治療における使用のための、請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、請求項27から31のいずれかに記載の組成物、又は請求項32から34に記載のキット。
- 医薬として使用するための、又は目的遺伝子をノックイン、ノックアウト、又は操作する又は目的遺伝子の発現を調節することが有効である疾患、障害、又は状態の遺伝子治療において使用するための、請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、請求項27から31のいずれかに記載の組成物、又は請求項32から34に記載のキット。
- 前記疾患、障害、又は状態が、遺伝病、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び感染症から選択される請求項39に記載の使用のための人工核酸分子、好ましくはRNA、組成物、又はキット。
- 前記コードされたCRISPR関連タンパク質の発現を、任意に遺伝子治療において、上昇させるための、請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、請求項27から31のいずれかに記載の組成物、又は請求項32から34に記載のキットの使用。
- 前記コードされたCRISPR関連タンパク質によって標的化される目的遺伝子の発現を調節するための、請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、請求項27から31のいずれかに記載の組成物、又は請求項32から34に記載のキットの使用。
- a)請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNAを提供する工程と;
b)CRISPR関連タンパク質を目的の標的DNA配列、又はそれに機能可能に連結された調節エレメントを標的にすることができるガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸を提供する工程と;
c)目的遺伝子の発現効率を調節するのに適した条件下で、細胞、組織、又は生物を、前記人工核酸分子、好ましくはRNA、及び、前記gRNA又はそれをコードする核酸に接触させる工程とを含む目的遺伝子の発現を調節することを特徴とする方法。 - 障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする被験体に、請求項1から26のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNA、請求項27から31のいずれかに記載の組成物、又は請求項32から34に記載のキットの有効量と、CRISPR関連タンパク質を目的の標的DNA配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントに標的化することができるガイドRNA(gRNA)又はそれをコードする核酸とを投与することを含むことを特徴とする方法。
- 前記障害が、前記コードされたCRISPR関連タンパク質の発現による治療が有効な、好ましくは前記CRISPR関連タンパク質が標的とする目的遺伝子の発現の調節による治療が有効な疾患、障害、又は状態である請求項44に記載の方法。
- 前記障害が、目的遺伝子をノックイン、ノックアウト、若しくは操作する、又は目的遺伝子の発現を変化させることが有効である疾患、障害、又は状態である請求項44から45のいずれかに記載の方法。
- CRISPR関連タンパク質をコードするコード領域を含む人工核酸分子、好ましくはRNAの発現効率を上昇させるための方法であって、
(a)前記コード領域を、ATP5A1、RPL32、HSD17B4、SLC7A3、NOSIP、又はNDUFA4からなる群から選択される遺伝子の5’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、又は変異体に由来する少なくとも1つの5’UTRエレメントと会合させることと;
(b)前記コード領域を、GNAS、CASP1、PSMB3、ALB、又はRPS9からなる群から選択される遺伝子の3’UTR、又はその対応するRNA配列、ホモログ、断片、又は変異体に由来する少なくとも1つの3’UTRエレメントと会合させることと;
(c)請求項1から46のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはRNAを得ることとを含むことを特徴とする方法。
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