JP6301906B2 - ５’ｔｏｐｕｔｒを含む人工核酸分子 - Google Patents

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Description

本発明は、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、任意で、３’ＵＴＲエレメント、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子に関する。本発明は、更に、好ましくは遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種の分野で使用するための、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントを含むベクター、前記人工核酸分子又は前記ベクターを含む医薬組成物、並びに前記人工核酸分子、前記ベクター、及び／又は前記医薬組成物を含むキットに関する。
遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種は、現代医学の最も有望且つ急速に発展している方法に属する。これらは、非常に広範囲に亘る疾患を治療するための非常に特異的且つ個人的な選択肢を提供することができる。具体的には、遺伝性の遺伝子疾患だけでなく、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患に加えて、炎症性疾患も、かかる治療アプローチの対象となり得る。また、これらアプローチによってかかる疾患の発症を（早期に）予防することも考えられる。
遺伝子治療の背後にある主な概念的理論は、特定の疾患の病態に関連している遺伝子発現の欠陥を適切に調節することである。遺伝子発現の病理学的変化は、重要な遺伝子産物、例えば、ホルモン等のシグナル伝達因子、ハウスキーピング因子、代謝酵素、構造タンパク質等の欠失又は過剰産生を引き起こす場合がある。遺伝子発現の変化は、転写及び／又は翻訳の誤制御によるだけではなく、特定のタンパク質をコードしているＯＲＦ内部の突然変異による場合もある。病理学的突然変異は、例えば、染色体の異常によって、又は点突然変異若しくはフレームシフト突然変異等のより特異的な突然変異によって引き起こされる場合があり、これらは全て、遺伝子産物の機能を限定したり、場合によっては、機能全てを失わせたりする。しかし、細胞の転写又は翻訳機構に関与しているタンパク質をコードしている遺伝子が突然変異によって影響を受ける場合、転写又は翻訳の誤制御が生じる場合もある。かかる突然変異は、制御機能を有する遺伝子の病理学的なアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを導く場合がある。かかる制御機能を発揮する遺伝子産物をコードしている遺伝子は、例えば、転写因子、シグナル受容体、メッセンジャータンパク質等であり得る。しかし、かかる制御タンパク質をコードしている遺伝子の機能が失われても、特定の状況下では、欠陥のある遺伝子産物の更に下流で作用する他の因子を人工的に導入することによって復帰させることができる。また、異常のある遺伝子自体を置換することを介して、遺伝子治療によってかかる遺伝子の欠陥を補償することもできる。
遺伝子ワクチン接種は、選択された抗原（例えば、細菌表面、ウイルス粒子、腫瘍抗原等の特徴的な成分）に対する所望の免疫応答を誘起する。一般的に、ワクチン接種は、現代医学の重要な偉業のうちの１つである。しかし、現在有効なワクチンを利用できる疾患は非常に少数でしかない。したがって、未だ毎年数百万の人々が、ワクチン接種によって予防することができない感染症に冒されている。
一般的に、ワクチンは、「第１」世代、「第２」世代、及び「第３」世代のワクチンに更に分類することができる。「第１世代」のワクチンは、典型的に、全生物ワクチンである。これは、ウイルス、細菌等の生病原体及び弱毒化病原体又は殺病原体に基づく。生病原体及び弱毒化病原体のワクチンの主な問題点は、生命に危険を及ぼすような変異体に戻ってしまうリスクがあることである。したがって、かかる病原体は、たとえ弱毒化されていても、本質的に予測不可能なリスクを有している場合がある。死病原体は、特異的免疫応答を発生させるのに望ましいほど有効ではない場合がある。これらリスクを最小限に抑えるために、「第２世代」のワクチンが開発された。これは、典型的に、病原体に由来する所定の抗原又は組み換えタンパク質成分からなるサブユニットワクチンである。
遺伝子ワクチン、即ち、遺伝子ワクチン接種用ワクチンは、通常、「第３世代」のワクチンとして理解される。これは、典型的に、インビボで病原体又は腫瘍抗原に特徴的なペプチド又はタンパク質（抗原）の断片を発現させる遺伝的に改変された核酸分子で構成される。遺伝子ワクチンは、患者に投与され、被感染能力を有する菌によって取り込まれたときに発現する。投与された核酸が発現することにより、コードされているタンパク質が産生される。これらタンパク質が患者の免疫系によって外来タンパク質であると認識された場合、免疫応答が誘発される。
上記から分かる通り、遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の両方法は、本質的に、核酸分子を患者に投与し、次いで、コードされている遺伝情報を転写及び／又は翻訳させることに基づいている。或いは、遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療は、治療を受ける患者から特定の身体細胞を単離し、次いで、かかる細胞をインビトロでトランスフェクトし、処理された細胞を前記患者に再投与することを含む方法を含んでいてもよい。
ＤＮＡ及びＲＮＡは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種を行う際に、投与するための核酸分子として用いることができる。ＤＮＡは、比較的安定で取り扱いが容易であることが知られている。しかし、ＤＮＡの使用には、投与されたＤＮＡ断片が患者のゲノムに不所望に挿入されて、欠陥の生じた遺伝子の機能が失われてしまう可能性があるというリスクがある。更なるリスクとして、抗ＤＮＡ抗体の不所望な産生が生じたことがある。別の問題点は、ＤＮＡを投与し、転写／翻訳させる際に得ることができる、コードされているペプチド又はタンパク質の発現レベルが限定的である点である。数ある理由の中でも、投与されるＤＮＡの発現レベルは、ＤＮＡ転写を制御する特定の転写因子の存在に依存する。かかる因子が存在しない場合、ＤＮＡ転写によって満足のいく量のＲＮＡが得られない。その結果、翻訳されるペプチド又はタンパク質のレベルが限定される。
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のためにＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いることによって、不所望のゲノムへの組み込み及び抗ＤＮＡ抗体の産生のリスクが最小限に抑えられるか又はなくなる。しかし、ＲＮＡは、遍在するＲＮＡｓｅによって容易に分解され得る比較的不安定な分子種であると考えられている。
インビボでは、ＲＮＡの分解は、ＲＮＡの半減期の制御に寄与している。この効果により真核生物の遺伝子発現の制御が微調整されていると考えられ、立証されている（非特許文献１）。したがって、各自然界に存在するｍＲＮＡは、前記ｍＲＮＡが由来する遺伝子に依存する個々の半減期を有している。このことは、前記遺伝子の発現レベルの制御に寄与している。不安定なＲＮＡは、異なる時点で一過的に遺伝子を発現させるために重要である。しかし、寿命の長いＲＮＡは、別個のタンパク質の蓄積又は遺伝子の連続的発現に関連している場合がある。インビボでは、ｍＲＮＡの半減期は、例えば、インスリン様成長因子Ｉ、アクチン、及びアルブミンのｍＲＮＡについて示されている通り、ホルモン処理等の環境要因にも依存している場合がある（非特許文献２）。
遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の場合、通常、安定なＲＮＡが望ましい。これは、ＲＮＡ配列によってコードされている産物がインビボで蓄積されることになっているという事実によるものである。他方、ＲＮＡは、好適な剤形に調製されたとき、保存の過程で、及び投与したときに、構造的且つ機能的に一体性を維持しなければならない。したがって、早期に分解又は崩壊するのを防ぐために、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の安定なＲＮＡ分子の提供がかなりの注目を集めた。
核酸分子のＧ／Ｃ含量がその安定性に影響を及ぼす場合があることが報告されている。したがって、多量のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）残基を含む核酸は、多量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有する核酸よりも機能的に安定であり得る。これに関連して、特許文献１は、翻訳領域の配列を改変することによって安定化したｍＲＮＡを含有する医薬組成物を提供している。かかる配列改変は、遺伝子コードの縮重を利用する。したがって、あまり好ましくない（ＲＮＡの安定性の観点であまり好ましくない）組み合わせのヌクレオチドを含有するコドンを、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに別のコドンに置換してよい。このＲＮＡの安定化方法は、所望のアミノ酸配列の余地を残してはならない各単一のＲＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列の提供によって限定される。また、このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に制限される。
ｍＲＮＡを安定化するための別の選択肢として、自然界に存在する真核生物のｍＲＮＡ分子は、特徴的な安定化エレメントを含有することが見出されている。例えば、真核生物のｍＲＮＡ分子は、５’末端（５’ＵＴＲ）及び／又は３’末端（３’ＵＴＲ）に所謂非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、更に５’−キャップ構造又は３’−ポリ（Ａ）テール等の他の構造的特徴を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、典型的に、ゲノムＤＮＡから転写されるので、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。５’−キャップ及び３’−ポリ（Ａ）テール（ポリ（Ａ）テール又はポリ（Ａ）配列とも呼ばれる）等の成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造的特徴は、通常、ｍＲＮＡのプロセシング中に転写（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
３’−ポリ（Ａ）テールは、典型的に、転写ｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドの単調な一続きの配列である。これは、最高約４００個のアデニンヌクレオチドを含み得る。かかる３’−ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性にとって重要な要素である可能性があることが見出されている。
また、α−グロビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、α−グロビンｍＲＮＡの周知の安定性にとって重要な因子であり得ることが示されている（非特許文献３）。α−グロビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、その存在がインビトロにおけるｍＲＮＡの安定性と相関している特定のリボ核タンパク質複合体（α−複合体）の形成に関与していることが明らかである（非特許文献４）。
ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす因子にかかわらず、投与された核酸分子が標的細胞又は組織によって有効に翻訳されることは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の核酸分子を用いる任意のアプローチにとって非常に重要である。安定性の制御とともに、大部分のｍＲＮＡの翻訳も、ＵＴＲ、５’−キャップ、及び３’−ポリ（Ａ）テール等の構造的特徴によって制御されている。これに関連して、ポリ（Ａ）テールの長さも同様に翻訳効率にとって重要な役割を果たしている可能性があることが報告されている。しかし、３’−エレメントの安定化は、翻訳を減少させる効果を有している可能性もある。
発現レベルに影響を及ぼす可能性のある更なる制御エレメントは、５’ＵＴＲに見出すことができる。例えば、特定のタンパク質、例えば、翻訳装置に属するタンパク質の合成は、転写レベルだけではなく、翻訳レベルでも制御され得ることが報告されている。例えば、所謂「ＴＯＰ遺伝子」によってコードされているタンパク質の翻訳は、翻訳抑制によってダウンレギュレートされ得る。本明細書では、用語「ＴＯＰ遺伝子」は、５’末端におけるＴＯＰ配列の存在と、殆どの場合、成長に関連する翻訳制御とを特徴とするｍＲＮＡに相当する遺伝子に関する（非特許文献５）。これに関連して、「５’末端オリゴピリミジン領域」とも呼ばれるＴＯＰ配列は、典型的に、キャップ部位におけるＣ残基と、それに続く最高１３個又は更により多くのピリミジンの不断配列とからなる（非特許文献６）。これらＴＯＰ配列は、翻訳機構の構成要素をコードしている多くのｍＲＮＡ中に存在し、且つ成長停止によるこれらＴＯＰ含有ｍＲＮＡの翻訳の選択的抑制の原因であることが報告されている（非特許文献７）。これらＴＯＰ配列は、翻訳制御タンパク質又は翻訳機構自体の結合を阻害するｃｉｓ制御エレメントとして機能すると考えられる。その結果、これら遺伝子の翻訳は、細胞の成長停止時に阻害される。より具体的には、細胞が飢餓に直面したとき又は１２−Ｏテトラデカノイル−１−ホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）等の幾つかの化学物質によって処理されたとき、通常ポリソームと結合しているＴＯＰ遺伝子のｍＲＮＡは、翻訳的に不活性である「サブポリソーム」へとその状態を変化させるが、一方、大部分の非ＴＯＰｍＲＮＡは、「ポリソーム」状態のままである（非特許文献８）。これに関連して、５’ＵＴＲの５’末端におけるオリゴピリミジン領域（ＴＯＰモチーフ）は、ＴＯＰ遺伝子の翻訳抑制に必要であることが示されている。哺乳類のリボソームタンパク質のｍＲＮＡの５’末端におけるオリゴピリミジン領域は、その翻訳調節に必要である（非特許文献９）。更に、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１０ａは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに存在するＴＯＰモチーフの下流に結合することによってリボソームタンパク質の翻訳を正に調節することが示されている。かかる翻訳の強化は、５’ＵＴＲにおけるＴＯＰモチーフの存在に依存していた。更に、このリボソームＴＯＰ遺伝子の翻訳制御は、ｍｉＲ−１０ａ又は幾つかの種類の腫瘍で高度に過剰発現し、癌の進行に関与していると報告されているそのヒトホモログであるｍｉＲ−１０ｂの存在に依存していた（非特許文献１０）。
国際公開第０２／０９８４４３号パンフレット
Ｆｒｉｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１−１２ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ＲＮＡ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ，ａｃｔｉｎ，ａｎｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．５２８７−５２９１，１９９１ Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ α−ｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ ｉｓ ａ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｖｅｎｔ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ３’−ｔｏ−５’ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｃａｐｐｉｎｇ，ＲＮＡ，８，ｐｐ．１５２６−１５３７，２００２ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｍＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １９，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ １９９９，ｐ．４５５２−４５６０ Ｉａｄｅｖａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅ，ｆ，ａｎｄ ｈ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３ ａｒｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ５’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｌｉｇｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ（ＴＯＰ）ｍＲＮＡｓ；ＲＮＡ，２００８，１４：１７３０−１７３６ Ａｖｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｍＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ａ ５’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ ａｒｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，ｐ．３８２２−３８３３ Ｍｅｙｕｈａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍＲＮＡｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ａｒｃｈｉｖｅ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６，ｐ．３６３−３８８ Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｌｉｇｏ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ（ＴＯＰ）ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８ Ｊｕｎ；３６（１１）：３７０７−１５．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ２４８．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｍａｙ １４ Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１ Ａｐｒ １５；８８（８）：３３１９−２３ Ｏｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１０ａ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ ５’ＵＴＲ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅｉｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００８ Ｍａｙ ２３；３０（４）：４６０−７１
本発明の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種に応用するのに好適であり得る核酸分子を提供することにある。具体的には、本発明の目的は、ｍＲＮＡ種等の人工核酸分子であって、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させ、好ましくは、翻訳効率の上昇を示す人工核酸分子を提供することにある。本発明の別の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用することができる優れたｍＲＮＡ種をコードする核酸分子を提供することにある。本発明の更なる目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用するための医薬組成物を提供することにある。要約すると、本発明の目的は、コスト効率が高く且つ簡単なアプローチによって関連技術の上記問題点を克服する改善された核酸種を提供することにある。
本発明の根底にある目的は、請求する発明主題によって解決される。
以下の図、配列、及び実施例は、本発明を更に説明することを意図する。これらは、本発明の発明主題を限定することを意図するものではない。
図１は、核酸分子ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４をコードしているキタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼのヌクレオチド配列を示す。この人工コンストラクトは、本発明の意味における５’ＵＴＲエレメントも３’ＵＴＲエレメントも含まない。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。 図２は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。３つの一点突然変異によってＴ７終結シグナルに加えてＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位が除去されているヒトアルブミンの３’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。アルブミンの３’ＵＴＲに下線を引く。 図３は、ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，３６８に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）の５’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’に挿入した。ｐＬｕｃ（ＧＣ）のコード領域をイタリック体で示す。ＲＰＬ３２の５’ＵＴＲに下線を引く。 図４は、ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，３６８に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図５は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、配列番号１，３６８に係るＴＯＰ遺伝子ＲＰＬ２３の５’ＵＴＲに由来するＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント、配列番号１，３７６に係るアルブミン３’ＵＴＲエレメント、及びＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長し、一方、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．１に要約する。 図６は、ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１２に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図７は、ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１３に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図８は、ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１４に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１遺伝子（ａｔｐ５ａ１）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図９は、ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１５に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図１０は、ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１６に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図１１は、ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１７に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図１２は、ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１８に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１（ＡＳＡＨ１）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図１３は、ｍＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１９に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないマウスリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ｍＲＰＬ２１）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図１４は、ｍＲＰＬ３５Ａ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４２０に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないマウスリボソームタンパク質ラージ３５ａ遺伝子（ｍＲＰＬ３５Ａ）の５’ＵＴＲ及び配列番号１，３７６に係るアルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを、それぞれ、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’及び３’に挿入した。 図１５は、ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１２に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）の５’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’に挿入した。 図１６は、ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１３に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）の５’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’に挿入した。 図１７は、ａｔｐ５ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１４に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１遺伝子（ａｔｐ５ａ１）の５’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’に挿入した。 図１８は、ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１５に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’に挿入した。 図１９は、ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１６に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）の５’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’に挿入した。 図２０は、ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１７に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）の５’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’に挿入した。 図２１は、ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４のヌクレオチド配列を示す。配列番号１，４１８に係る５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）の５’ＵＴＲを、図１に示すコンストラクトのＯＲＦの５’に挿入した。 図２２は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する様々なＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを強く増加させる。ＴＯＰ遺伝子であるＡＳＡＨ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＡＩＧ１、ＨＳＤ１７Ｂ４、ａｔｐ５ａ１、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ３５、及びＲＰＬ３２の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．２に要約する。 図２３は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ＲＰＬ３５ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント、アルブミン３’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＬ３５ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長し、一方、ＲＰＬ３５ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、ＲＰＬ３５ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。相乗作用を実施例５．３に要約する。 図２４は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ＲＰＬ２１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント、アルブミン３’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＬ２１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長し、一方、ＲＰＬ２１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、ＲＰＬ２１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。相乗作用を実施例５．３に要約する。 図２５は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ａｔｐ５ａ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント、アルブミン３’ＵＴＲエレメント、及びａｔｐ５ａ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長し、一方、ａｔｐ５ａ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、ａｔｐ５ａ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。相乗作用を実施例５．３に要約する。 図２６は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ＨＳＤ１７Ｂ４ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント、アルブミン３’ＵＴＲエレメント、及びＨＳＤ１７Ｂ４ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長し、一方、ＨＳＤ１７Ｂ４ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、ＨＳＤ１７Ｂ４ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。相乗作用を実施例５．３に要約する。 図２７は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ＡＩＧ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント、アルブミン３’ＵＴＲエレメント、及びＡＩＧ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長し、一方、ＡＩＧ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、ＡＩＧ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。相乗作用を実施例５．３に要約する。 図２８は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ＣＯＸ６Ｃ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント、アルブミン３’ＵＴＲエレメント、及びＣＯＸ６Ｃ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長し、一方、ＣＯＸ６Ｃ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、ＣＯＸ６Ｃ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。相乗作用を実施例５．３に要約する。 図２９は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ＡＳＡＨ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント、アルブミン３’ＵＴＲエレメント、及びＡＳＡＨ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果をグラフで表す。様々なｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長し、一方、ＡＳＡＨ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させる。驚くべきことに、ＡＳＡＨ１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させるので、相乗的に作用している。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。相乗作用を実施例５．３に要約する。 図３０は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するマウス遺伝子由来のＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントの効果をグラフで表す。マウス又はヒトのＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントを含有するｍＲＮＡをリポフェクションによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ヒトＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントと同様に、５’エレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、マウスＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントはルシフェラーゼレベルを強く増加させる。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＥＭ（相対光単位±標準誤差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．４に要約する。
明確に且つ読みやすくするために、以下の定義を提供する。これら定義について言及される任意の技術的特徴は、本発明の各実施形態及び全実施形態において読み取ることができる。これら実施形態に関連して更なる定義及び説明を具体的に提供する場合がある。
適応免疫応答：適応免疫応答は、典型的に、免疫系の抗原特異的応答であると理解される。抗原特異性により、特定の病原体又は病原体に感染している細胞に合わせた応答を生じさせることができる。これら病原体又は細胞に合わせた応答を開始させる能力は、通常、「記憶細胞」によって体内に維持されている。身体がある病原体に１回超感染した場合、これら特異的記憶細胞を用いて、前記病原体を速やかに除去する。これに関連して、適応免疫応答の第１の工程は、抗原提示細胞による抗原特異的免疫応答を誘導することができる抗原特異的なナイーブＴ細胞又は様々な免疫細胞の活性化である。これは、ナイーブＴ細胞が常に通過しているリンパ組織及び器官で生じる。抗原提示細胞として機能し得る３種の細胞は、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞である。これら細胞は、それぞれ、免疫応答の誘発において異なる機能を有する。樹状細胞は、食作用及びマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込むことができ、また、例えば外来抗原と接触することによって刺激されて、樹状細胞が成熟樹状細胞に分化する局所リンパ組織に遊走することができる。マクロファージは、細菌等の特定の抗原を摂取し、感染因子又は他の適切な刺激によって誘導されてＭＨＣ分子を発現させる。また、受容体を介して可溶性タンパク質抗原に結合し、内部に取り込むＢ細胞の独自の能力は、Ｔ細胞の誘導にとって重要であり得る。ＭＨＣ分子は、典型的に、抗原のＴ細胞への提示を担当する。ＭＨＣ分子における抗原の提示により、Ｔ細胞が活性化されて、前記Ｔ細胞の増殖及びアームドエフェクターＴ細胞への分化が誘導される。エフェクターＴ細胞の最も重要な機能は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって感染細胞を殺傷し、共に細胞媒介免疫を構成するＴｈ１細胞によってマクロファージを活性化させ、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１細胞の両方によってＢ細胞を活性化させて様々な分類の抗体を産生させ、それによって体液性免疫応答を駆動することである。Ｔ細胞は、抗原を直接認識したり結合したりはしないが、その代わり、例えば、他の細胞の表面上のＭＨＣ分子に結合している病原体由来のタンパク質抗原の短いペプチド断片（例えば、所謂エピトープ）を認識するＴ細胞受容体によって抗原を認識する。
適応免疫系：適応免疫系は、本質的に、病原体の成長を停止させる又は妨げることに専念している。適応免疫系は、典型的に、特定の病原体を認識及び記憶し（免疫を生じさせ）、前記病原体に遭遇したときにより強い攻撃を開始する能力を脊椎動物の免疫系に付与することによって適応免疫応答を制御する。前記系は、体細胞超変異（体細胞の突然変異が加速されるプロセス）及びＶ（Ｄ）Ｊ組み換え（抗原受容体遺伝子セグメントの不可逆的な遺伝子組み替え）により、高度に適応可能である。この機序により、少数の遺伝子が膨大な数の様々な抗原受容体を産生することができ、前記抗原受容体は、後に、個々のリンパ球で一意的に発現する。遺伝子の再配置により各細胞のＤＮＡが不可逆的に変化するので、かかる細胞の後代（子孫）は全て、長命特異的免疫にとって重要であるメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞を含む、同じ受容体特異性をコードしている遺伝子を受け継ぐ。
アジュバント／アジュバント成分：アジュバント又はアジュバント成分は、最も広い意味では、典型的に、薬物又はワクチン等の他の剤の効果を変化させ得る、例えば、強化し得る薬理学的及び／又は免疫学的剤である。アジュバント又はアジュバント成分は、広義で解釈すべきであり、広範囲に亘る物質を指す。典型的に、これら物質は、抗原の免疫原性を高めることができる。例えば、アジュバントは、自然免疫系によって認識され得、例えば、自然免疫応答を誘発することができる。「アジュバント」は、典型的に、適応免疫応答を誘発しない。したがって、「アジュバント」は、抗原として適切ではない。アジュバントの作用機序は、適応免疫応答を生じさせる抗原によって誘発される効果とは異なる。
抗原：本発明において、「抗原」は、典型的に、免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識され得る物質を指し、例えば、適応免疫応答の一部として抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞を形成することによって抗原特異的免疫応答を誘発することができる。典型的に、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチド又はタンパク質であってもよく、前記ペプチド又はタンパク質を含んでいてもよい。
人工核酸分子：人工核酸分子は、典型的に、自然界には存在しない核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であると理解してよい。言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子として理解してよい。かかる核酸分子は、その個々の配列（自然界には存在しない）及び／又は他の修飾（例えば、自然界には存在しないヌクレオチドの構造的修飾）から非天然であり得る。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子であってもよく、ＲＮＡ分子であってもよく、ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含むハイブリッド分子であってもよい。典型的に、人工核酸分子は、所望の人工ヌクレオチド配列（異種配列）に相当するように遺伝子改変方法によって設計及び／又は作製することができる。これに関連して、人工配列は、通常、自然界には存在し得ない配列である、即ち、少なくとも１つのヌクレオチドが野生型配列とは異なる。用語「野生型」とは、自然界に存在する配列であると理解してよい。更に、用語「人工核酸分子」の意味は、「１つの単一分子」には限定されず、典型的に、同一分子の集合体を含むと理解される。したがって、アリコートに含有される複数の同一分子を指す場合がある。
２シストロン性ＲＮＡ、多シストロン性ＲＮＡ：２シストロン性又は多シストロン性のＲＮＡは、典型的に２つ（２シストロン性）又はそれ以上（多シストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し得るＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである。これに関連して、オープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。
担体／高分子担体：本発明における担体は、典型的に、別の化合物（カーゴ）の輸送及び／又は複合体化を促進する化合物であってよい。高分子担体は、典型的に、高分子で形成される担体である。担体は、共有相互作用又は非共有相互作用によってカーゴに結合し得る。担体は、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を標的細胞に輸送することができる。担体は、幾つかの実施形態では、カチオン性成分であってよい。
カチオン性成分：用語「カチオン性成分」は、典型的に、典型的に１〜９のｐＨ値、好ましくは９以下（例えば、５〜９）、８以下（例えば、５〜８）、７以下（例えば、５〜７）のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ（例えば、７．３〜７．４）を有する正に帯電している帯電分子（カチオン）を指す。したがって、カチオン性成分は、任意の正に帯電している化合物又はポリマーであってよく、好ましくは、生理学的条件下で、特にインビボにおける生理学的条件下で正に帯電しているカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。「カチオン性のペプチド又はタンパク質」は、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択される、少なくとも１つの正に帯電しているアミノ酸、又は１超の正に帯電しているアミノ酸を含有していてよい。したがって、所与の条件下で１超の正電荷を呈する「ポリカチオン性」成分も、カチオン性成分の範囲内である。
５’−キャップ：５’−キャップは、一般的に成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する実体、典型的に修飾ヌクレオチド実体である。５’−キャップは、典型的に、修飾ヌクレオチド、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を介して５’末端に結合する。５’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’−キャップを有する核酸の５’末端のヌクレオチド、典型的に、ＲＮＡの５’末端である）である。５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、逆転デオキシ非塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆転ヌクレオチド部分、３’−３’−逆転非塩基部分、３’−２’−逆転ヌクレオチド部分、３’−２’−逆転非塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。
細胞免疫／細胞免疫応答：細胞免疫は、典型的に、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、及び抗原に応答する様々なサイトカインの放出を指す。より一般的な用語では、細胞免疫は、抗体に基づくのではなく、免疫系の細胞の活性化に基づく。典型的に、細胞免疫応答は、細胞（例えば、樹状細胞又は他の細胞等の特定の免疫細胞）においてアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化し、その表面上に外来抗原のエピトープを提示することを特徴とし得る。かかる細胞は、ウイルスに感染していてもよく、細胞内細菌に感染していてもよく、腫瘍抗原を提示する癌細胞であってもよい。更なる特徴は、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して病原体を破壊させたり、細胞を刺激して適応免疫応答及び自然免疫応答に関与している他の細胞の機能に影響を及ぼす様々なサイトカインを分泌させたりすることであり得る。
ＤＮＡ：ＤＮＡは、デオキシリボ核酸の一般的な略称である。ＤＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸のモノマーであり、これらは、単独で、糖部分（デオキシリボース）、塩基部分、及びリン酸部分で構成され、特徴的な骨格構造により重合する。前記骨格構造は、典型的に、第１のヌクレオチドの糖部分（即ち、デオキシリボース）と、隣接する第２のモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の順序、即ち、糖／リン酸骨格に結合している塩基の順序が、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖形態では、第１の鎖のヌクレオチドは、典型的に、例えばＡ／Ｔ塩基対合及びＧ／Ｃ塩基対合によって第２の鎖のヌクレオチドとハイブリダイズする。
エピトープ：エピトープ（「抗原決定基」とも呼ばれる）は、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープとに分けることができる。本発明におけるＴ細胞エピトープ又はタンパク質の一部は、好ましくは約６アミノ酸長〜約２０アミノ酸長又はそれ以上のアミノ酸長を有する断片、例えば、好ましくは約８アミノ酸長〜約１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長、９アミノ酸長、又は１０アミノ酸長（又は更には１１アミノ酸長又は１２アミノ酸長）を有するＭＨＣクラスＩ分子によって処理及び提示される断片、或いは、好ましくは約１３アミノ酸長以上、例えば、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、又はそれ以上のアミノ酸長を有するＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理及び提示される断片を含んでよく、これら断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択してよい。これら断片は、典型的に、ペプチド断片及びＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される。即ち、前記断片は、典型的に、そのネイティブな形態では認識されない。Ｂ細胞エピトープは、典型的に、好ましくは５アミノ酸〜１５アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸〜１２アミノ酸、更により好ましくは６アミノ酸〜９アミノ酸を有する、本明細書に定義する（ネイティブな）タンパク質又はペプチド抗原の外表面上に位置する断片であり、これは、即ちそのネイティブな形態で抗体によって認識され得る。
更に、タンパク質又はペプチドのかかるエピトープは、かかるタンパク質又はペプチドの本明細書に記載する変異体のいずれかから選択してよい。これに関連して、抗原決定基は、本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、三次元構造では結合する本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのセグメントで構成される高次構造エピトープ又は不連続エピトープであってもよく、単一ポリペプチド鎖で構成される連続エピトープ又は線状エピトープであってもよい。
配列の断片：配列の断片は、典型的に、例えば、核酸分子又はアミノ酸の配列の完全長配列のより短い部分であってよい。したがって、断片は、典型的に、完全長配列内の相当する一続きと同一である配列からなる。本発明における好ましい配列の断片は、前記断片が由来する分子における連続する一続きの実体に相当するヌクレオチド又はアミノ酸等の連続する一続きの実体からなり、前記断片が由来する分子全体（即ち、完全長分子）の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。
Ｇ／Ｃ改変：Ｇ／Ｃ改変核酸は、典型的に、好ましくは野生型配列よりも多数のグアノシン／シトシンヌクレオチドを含む改変野生型配列に基づく核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子であってよい。グアノシン又はシトシンヌクレオチドを含有するコドンでアデノシン又はチミジンヌクレオチドを含有するコドンを置換することによって、このように数を増加させることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡのコード領域におけるＧ／Ｃ含量を増加させる場合、遺伝コードの縮重を利用する。したがって、コドン置換は、コードされているアミノ酸残基は変化させず、核酸分子のＧ／Ｃ含量のみを増加させることが好ましい。
遺伝子治療：遺伝子治療は、典型的に、ペプチド又はタンパク質をコードしている核酸による患者の身体又は患者の身体の単離要素（例えば、単離組織／細胞）の治療を意味すると理解してよい。遺伝子治療は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を任意の投与経路によって患者に直接投与するか、又はインビトロで前記患者の単離細胞／組織に投与して、インビボ／エキソビボ又はインビトロで前記患者の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意でｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を前記患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含んでよい。
遺伝子ワクチン接種：遺伝子ワクチン接種は、典型的に、抗原若しくは免疫原をコードしている核酸分子又はその断片を投与することによるワクチン接種であると理解してよい。前記核酸分子は、被験体の身体又は被験体の単離細胞に投与してよい。身体の特定の細胞をトランスフェクトした際又は単離細胞をトランスフェクトした際、これら細胞は、前記抗原又は免疫原を発現し、次いで、免疫系に提示して、適応免疫応答、即ち、抗原特異的免疫応答を誘発し得る。したがって、遺伝子ワクチン接種は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を被験体、好ましくは患者、又は被験体、好ましくは患者の単離細胞に投与して、通常、インビボ又はインビトロで前記被験体の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意で、ｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を被験体、好ましくは患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含む。
異種配列：２つの配列は、典型的に、同一の遺伝子に由来していない場合、「異種」であると理解される。即ち、異種配列は、同一の生物に由来し得たとしても、天然で（自然界で）同一の核酸分子（例えば、同一のｍＲＮＡ等）中に存在することはない。
体液性免疫／体液性免疫応答：体液性免疫は、典型的に、抗体産生と、任意で抗体産生に付随する付属プロセスとを指す。体液性免疫応答は、典型的に、例えば、Ｔｈ２活性化及びサイトカイン産生、胚中心の形成及びアイソタイプの切り換え、親和性成熟及び記憶細胞の産生を特徴とし得る。また、体液性免疫は、典型的に、病原体及び毒素の中和、古典的補体活性化、並びに食作用及び病原体排除のオプソニンによる促進を含む抗体のエフェクター機能を指す場合もある。
免疫原：本発明において、免疫原は、典型的に、免疫応答を刺激することができる化合物であると理解してよい。好ましくは、免疫原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。特に好ましい実施形態では、本発明の意味における免疫原は、提供される核酸分子、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子の翻訳産物である。典型的に、免疫原は、少なくとも適応免疫応答を誘発する。
免疫賦活組成物：本発明において、免疫賦活組成物は、典型的に、免疫応答を誘導することができるか、又は免疫応答を誘導することができる成分が由来する少なくとも１つの成分を含有する組成物であると理解してよい。かかる免疫応答は、好ましくは、自然免疫応答又は適応免疫応答と自然免疫応答との組み合わせであってよい。本発明における免疫賦活組成物は、好ましくは、少なくとも１つの人工核酸分子、より好ましくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ分子）を含有する。ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分は、好適な担体と複合体化し得る。したがって、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ／担体複合体を含んでいてよい。更に、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分のアジュバント及び／又は好適なビヒクルを含んでいてよい。
免疫応答：免疫応答は、典型的に、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（所謂、特異的又は適応免疫応答）、自然免疫系の非特異的反応（所謂、非特異的又は自然免疫応答）、又はこれらの組み合わせであってよい。
免疫系：免疫系は、生物を感染から保護することができる。病原体が、生物の物理的障壁の通過に成功し、この生物に侵入した場合、自然免疫系系が、即座にではあるが非特異的に応答する。病原体がこの自然応答から逃れた場合、脊椎動物は、第２の保護層である適応免疫系を有している。ここで、免疫系は、感染中の応答に適応してその病原体認識を向上させる。その後、この向上した応答は、病原体が排除された後も免疫記憶の形態で保持され、この病原体に遭遇したときにはいつも適応免疫系がより速やかに且つより強力な攻撃を行うことが可能になる。これによれば、免疫系は、自然免疫系及び適応免疫系を含む。これら２つの部分はそれぞれ、典型的に、所謂体液性成分及び細胞性成分を含有する。
免疫賦活ＲＮＡ：本発明における免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）は、典型的に、自然免疫応答を誘導することができるＲＮＡであってよい。これは、通常、オープンリーディングフレームを有しないので、ペプチド抗原又は免疫原を提供しないが、例えば、特定の種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又は他の好適な受容体に結合することによって免疫応答を誘発する。しかし、無論、オープンリーディングフレームを有し且つペプチド／タンパク質をコードしているｍＲＮＡも自然免疫応答を誘導し得るので、免疫賦活ＲＮＡであり得る。
自然免疫系：非特異的免疫系としても知られている自然免疫系は、典型的に、非特異的に他の生物による感染からホストを守る細胞及び機構を含む。これは、自然免疫系の細胞は、包括的に病原体を認識し、応答することができるが、適応免疫系とは異なり、ホストに対して長期間免疫を付与することも、防御免疫を付与することもないことを意味する。自然免疫系は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、リポ多糖類等の他の補助物質、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４０リガンド、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、成長因子及びｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０のリガンド、マウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、又はＴＬＲ１３のリガンド、ＮＯＤ様受容体のリガンド、ＲＩＧ−Ｉ様受容体のリガンド、免疫賦活核酸、免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ、抗菌剤、又は抗ウイルス剤によって活性化され得る。本発明に係る医薬組成物は、１以上のかかる物質を含んでいてよい。典型的に、自然免疫系の応答は、サイトカインと呼ばれる特殊な化学メディエーターを含む化学因子の産生を介して感染部位に免疫細胞を動員し、補体カスケードを活性化し、特殊な白血球によって器官、組織、血液、及びリンパ中に存在する外来物質を同定及び除去し、適応免疫系を活性化し、及び／又は感染因子に対する物理的及び化学的な障壁として作用することを含む。
クローニングサイト：クローニングサイトは、典型的に、核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを含む核酸配列の挿入に好適である核酸分子のセグメントであると理解される。挿入は、例えば、制限酵素処理及びライゲーションによって当業者に公知の任意の分子生物学的方法によって実施してよい。クローニングサイトは、典型的に、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含む。これら１以上の制限酵素部位は、これら部位においてＤＮＡを切断する制限酵素によって認識され得る。１超の制限酵素部位を含むクローニングサイトは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）又はポリリンカーと呼ばれる場合もある。
核酸分子：核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子である。核酸分子という用語は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子を指す。好ましくは、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に用いられる。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか又はからなるポリマーである。また、用語「核酸分子」は、例えば、塩基が修飾されている、糖が修飾されている、又は骨格が修飾されているＤＮＡ又はＲＮＡの分子等の修飾核酸分子も含む。
オープンリーディングフレーム：本発明におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、典型的に、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得る幾つかのヌクレオチドトリプレットの配列であってよい。オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン、即ち、その５’末端における通常アミノ酸メチオニンをコードしている３つの連続するヌクレオチドの組み合わせ（ＡＴＧ又はＡＵＧ）と、その後に、通常３の倍数である長さのヌクレオチドを有する領域とを含む。ＯＲＦは、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終結する。典型的に、これは、オープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。したがって、本発明におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧ）で始まり、好ましくは、終止コドン（例えば、それぞれＴＡＡ、ＴＧＡ、若しくはＴＡＧ、又はＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ）で終結する、３で割り切れる多数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、単離することができたり、例えば、ベクター又はｍＲＮＡにおけるより長い核酸配列に組み込むことができたりする。また、オープンリーディングフレームは、「タンパク質コード領域」と呼ばれる場合もある。
ペプチド：ペプチド又はポリペプチドは、典型的に、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸モノマーのポリマーである。典型的に、５０個未満のモノマーユニットを含む。しかし、ペプチドという用語は、５０個超のモノマーユニットを有する分子を除外するものではない。また、典型的に５０個〜６００個のモノマーユニットを有する長いペプチドは、ポリペプチドとも呼ばれる。
薬学的に有効な量：本発明において薬学的に有効な量は、典型的に、免疫応答等の薬学的効果を誘導して、ペプチド又はタンパク質の病的レベルの発現を変化させるか又は例えば、病理学的状況の場合、欠損している遺伝子産物を置換するのに十分な量であると理解される。
タンパク質：タンパク質は、典型的に、１以上のペプチド又はタンパク質を含む。タンパク質は、典型的に、３次元形態に折り畳まれており、これは、タンパク質がその生物学的機能を発揮するのに必要である場合がある。
ポリ（Ａ）配列：ポリ（Ａ）テール又は３’−ポリ（Ａ）テールとも呼ばれるポリ（Ａ）配列は、典型的に、アデノシンヌクレオチドの配列、例えば、約４００個以下のアデノシンヌクレオチドの配列、約２０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは約５０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約５０個〜約３００個のアデノシンヌクレオチドの配列、更により好ましくは約５０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは約６０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列であると理解される。ポリ（Ａ）配列は、典型的に、ｍＲＮＡの３’末端に位置する。本発明において、ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡ内に位置してもよく、又は例えば、ベクターの転写によってＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を作製するためのテンプレートとして機能するベクター等のベクターにおける任意の他の核酸分子内に位置してもよい。
ポリアデニル化：ポリアデニル化は、典型的に、ＲＮＡ分子等の核酸分子、例えば、未成熟ｍＲＮＡにポリ（Ａ）配列を付加することであると理解される。ポリアデニル化は、所謂ポリアデニル化シグナルによって誘導され得る。このシグナルは、好ましくは、ポリアデニル化される核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の３’末端における一続きのヌクレオチド内に位置している。ポリアデニル化シグナルは、典型的に、アデニン及びウラシル／チミンヌクレオチドからなるヘキサマー、好ましくは、ヘキサマー配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくはヘキサマー配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的に、プレｍＲＮＡ（未成熟ｍＲＮＡとも呼ばれる）のプロセシング中に生じる。典型的に、ＲＮＡの成熟（プレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへ）は、ポリアデニル化工程を含む。
制限酵素部位：「制限酵素認識部位」とも呼ばれる制限酵素部位は、制限酵素によって認識されるヌクレオチド配列である。制限酵素部位は、典型的に短く、好ましくは、回文構造のヌクレオチド配列、例えば、４個〜８個のヌクレオチドを含む配列である。制限酵素部位は、好ましくは、制限酵素によって特異的に認識される。制限酵素は、典型的に、この部位において制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を切断する。二本鎖ＤＮＡ配列等の二本鎖ヌクレオチド配列では、制限酵素は、典型的に、ヌクレオチド配列の両方の鎖を切断する。
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ：ＲＮＡは、リボ核酸の一般的な略称である。ＲＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、所謂骨格に沿って互いに結合しているアデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、グアノシン一リン酸、及びシチジン一リン酸のモノマーである。骨格は、第１のモノマーの糖（即ち、リボース）と第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。特定の連続するモノマーをＲＮＡ配列と呼ぶ。通常、ＲＮＡは、例えば、細胞内部のＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞では、転写は、通常、核又はミトコンドリア内部で実施される。インビボでは、ＤＮＡの転写により、通常、所謂未成熟ＲＮＡが得られ、これは、所謂メッセンジャーＲＮＡ（通常、ｍＲＮＡと略される）にプロセシングされなければならない。例えば、真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’−キャッピング、ポリアデニル化、核又はミトコンドリアからのエクスポート等の様々な異なる転写後修飾を含む。これらプロセス全体をＲＮＡの成熟とも呼ぶ。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的に、成熟ｍＲＮＡは、５’−キャップ、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡは別として、転写及び／又は翻訳の制御に関与し得る幾つかの非コード型のＲＮＡが存在する。
核酸分子の配列：核酸分子の配列は、典型的に、そのヌクレオチドの特定の及び個々の順序、即ち、連続物であると理解される。タンパク質又はペプチドの配列は、典型的に、そのアミノ酸の順序、即ち、連続物であると理解される。
配列同一性：同じ長さ及び順序のヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合、２以上の配列は同一である。同一性の割合は、典型的に、２つの配列が同一である程度について説明する。即ち、典型的に、その配列位置においてレファレンス配列の同一ヌクレオチドと一致するヌクレオチドの割合について説明するものである。同一性の程度を決定する場合、比較する配列は、同じ長さ、即ち、比較する配列のうちの最長の配列の長さを有するとみなされる。これは、８ヌクレオチドからなる第１の配列が、前記第１の配列を含む１０ヌクレオチドからなる第２の配列と８０％同一であることを意味する。言い換えれば、本発明において、配列同一性は、好ましくは、同じ長さを有する２以上の配列において配列のうちの同一位置を有するヌクレオチドの割合に関する。ギャップは、アラインメントにおけるその実際の位置にかかわらず、通常、非同一位置であるとみなされる。
安定化核酸分子：安定化核酸分子は、例えば、環境因子又はエキソヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼによる分解等の酵素分解によって、修飾されていない核酸分子よりも崩壊又は分解に対して安定であるように修飾されている核酸分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡの分子である。好ましくは、本発明における安定化核酸分子は、細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において安定化される。また、安定化効果は、例えば、安定化核酸分子を含む医薬組成物の製造過程において、細胞外、例えば、バッファ溶液中でも発揮され得る。
トランスフェクション：用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分子等の核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを指す。本発明において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳類細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を含む。かかる方法は、例えば、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、導入は、非ウイルスである。
ワクチン：ワクチンは、典型的に、少なくとも１つの抗原、好ましくは免疫原を提供する予防的又は治療的材料であると理解される。抗原又は免疫原は、ワクチン接種に好適な任意の材料に由来してよい。例えば、抗原又は免疫原は、病原体（例えば、細菌若しくはウイルス粒子等）又は腫瘍若しくは癌性組織に由来してよい。抗原又は免疫原は、身体の適応免疫系を刺激して、適応免疫応答を提供する。
ベクター：用語「ベクター」は、核酸分子、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明におけるベクターは、オープンリーディングフレームを含む核酸配列等の所望の核酸配列を組み込む又は有するのに好適である。かかるベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクター等であってよい。ストレージベクターは、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を便利に保管することができるベクターである。したがって、このベクターは、例えば、所望のｍＲＮＡ配列又はその一部に相当する配列（例えば、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲに相当する配列）を含んでいてよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質等の発現産物を産生するために用いることができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列（例えば、ＲＮＡプロモーター配列）等のベクターの一続きの配列の転写に必要な配列を含んでいてよい。クローニングベクターは、典型的に、核酸配列をベクターに組み込むために用いることができるクローニングサイトを含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってよい。トランスファーベクターは、細胞又は生物に核酸分子を移入するのに好適なベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。本発明におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクターであってもＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ分子である。好ましくは、本発明におけるベクターは、クローニングサイト、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性因子）、及びベクターの増殖に好適な配列（例えば、複製起点）を含む。好ましくは、本願におけるベクターは、プラスミドベクターである。
ビヒクル：ビヒクルは、典型的に、化合物（例えば、薬学的に活性のある化合物）を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解される。例えば、薬学的に活性のある化合物を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容可能な液体であってよい。
３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）：３’ＵＴＲは、典型的に、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域（即ち、オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの部分である。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、アミノ酸配列に翻訳されない。３’ＵＴＲ配列は、一般的に、遺伝子発現プロセス中にそれぞれのｍＲＮＡに翻訳される遺伝子によってコードされている。ゲノム配列は、先ず、任意のイントロンを含む未成熟ｍＲＮＡに転写される。次いで、前記未成熟ｍＲＮＡは、成熟プロセスにおいて成熟ｍＲＮＡに更にプロセシングされる。この成熟プロセスは、５’キャッピング工程、未成熟ｍＲＮＡをスプライシングして、任意のイントロン及び３’末端の修飾（例えば、未成熟ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化）を除去する工程、及び任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる切断工程等を含む。本発明において、３’ＵＴＲは、タンパク質コード領域の終止コドンの３’側、好ましくはタンパク質コード領域の終止コドンの直ぐ３’側に位置し、且つポリ（Ａ）配列の５’側、好ましくはポリ（Ａ）配列の直ぐ５’側のヌクレオチドまで延在する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。用語「相当する」とは、３’ＵＴＲ配列が、３’ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明において、用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」、例えば、「アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相当する配列、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡである。用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」は、３’ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含む。
５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）：５’ＵＴＲは、典型的に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定の部分であると理解される。これは、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの５’側に位置する。典型的に、５’ＵＴＲは、転写開始点から始まり、オープンリーディングフレームの開始コドンの１つ前のヌクレオチドで終わる。５’ＵＴＲは、制御エレメントとも呼ばれる遺伝子発現を調節するエレメントを含んでいてよい。かかる制御エレメントは、例えば、リボソーム結合部位又は５’末端オリゴピリミジン領域であってよい。５’ＵＴＲは、例えば、５’−キャップの付加によって転写後修飾されてよい。本発明において、５’ＵＴＲは、５’キャップと開始コドンとの間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。好ましくは、５’ＵＴＲは、５’−キャップの３’側に位置するヌクレオチド、好ましくは５’キャップの直ぐ３’側に位置するヌクレオチドから、タンパク質コード領域の開始コドンの５’側に位置するヌクレオチド、好ましくはタンパク質コード領域の開始コドンの直ぐ５’側に位置するヌクレオチドまで延在する配列に相当する。成熟ｍＲＮＡの５’キャップの直ぐ３’側に位置するヌクレオチドは、典型的に、転写開始点に相当する。用語「相当する」とは、５’ＵＴＲ配列が、５’ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明において、用語「遺伝子の５’ＵＴＲ」、例えば、「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに相当する配列、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡである。用語「遺伝子の５’ＵＴＲ」は、５’ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含む。
５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）：５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）は、典型的に、特定の遺伝子の核酸分子の５’末端領域（例えば、特定のｍＲＮＡ分子の５’末端領域又は機能的実体、例えば、転写領域の５’末端領域）に位置する一続きのピリミジンヌクレオチドである。この配列は、シチジン（通常、転写開始点に相当する）で始まり、その後に、通常約３個〜約３０個の一続きのピリミジンヌクレオチド、より多くの場合、３個〜１５個の一続きのピリミジンヌクレオチドが続く。例えば、ＴＯＰは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、又は更により多くのヌクレオチドを含んでいてよい。一続きのピリミジン、延いては５’ＴＯＰは、ＴＯＰの下流に位置する最初のプリンヌクレオチドの１ヌクレオチド５’側で終わる。５’末端オリゴピリミジン領域を含有するメッセンジャーＲＮＡは、多くの場合、ＴＯＰｍＲＮＡと呼ばれる。したがって、かかるメッセンジャーＲＮＡを提供する遺伝子は、ＴＯＰ遺伝子と呼ばれる。ＴＯＰ配列は、例えば、ペプチド伸長因子及びリボソームタンパク質をコードしている遺伝子及びｍＲＮＡにおいて見出されている。
ＴＯＰモチーフ：本発明において、ＴＯＰモチーフは、上に定義した５’ＴＯＰに相当する核酸配列である。したがって、本発明におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、３ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長を有する一続きのピリミジンヌクレオチドである。好ましくは、ＴＯＰモチーフは、少なくとも３個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも４個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも５個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７個のピリミジンヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも８個のピリミジンヌクレオチドからなり、前記一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、その５’末端におけるシトシンヌクレオチドで始まる。ＴＯＰ遺伝子及びＴＯＰｍＲＮＡでは、ＴＯＰモチーフは、好ましくは、その５’末端における転写開始点で始まり、前記遺伝子又はｍＲＮＡにおける最初のプリン残基の１ヌクレオチド５’側で終わる。本発明におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、５’ＵＴＲを表す配列の５’末端、又は５’ＵＴＲをコードしている配列の５’末端に位置する。したがって、好ましくは、３個以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、この一続きのピリミジンヌクレオチドが、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係る人工核酸分子の５’ＵＴＲエレメント、又は本明細書に記載するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列等のそれぞれの配列の５’末端に位置している場合、本発明の意味において「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれる。言い換えれば、５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲエレメントの５’末端以外の５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲエレメント内のいずれかに位置する３個以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、好ましくは、「ＴＯＰモチーフ」とは呼ばない。
ＴＯＰ遺伝子：ＴＯＰ遺伝子は、典型的に、５’末端オリゴピリミジン領域の存在を特徴とする。更に、殆どのＴＯＰ遺伝子は、成長に関連する翻訳制御を特徴とする。しかし、組織特異的に翻訳制御するＴＯＰ遺伝子も知られている。上に定義した通り、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、ＴＯＰ遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの配列に相当し、好ましくは、５’キャップの３’側に位置するヌクレオチドから開始コドンの５’側に位置するヌクレオチドまで延在する。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、典型的に、開始コドンを含まず、好ましくは上流ＡＵＧ（ｕＡＵＧ）も上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）も含まない。本明細書では、上流ＡＵＧ及び上流オープンリーディングフレームは、典型的に、翻訳されるべきオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＵＧ）の５’側に存在するＡＵＧ及びオープンリーディングフレームであると理解される。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、一般的に、やや短い。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの長さは、２０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドで変動してよく、典型的に、約２００ヌクレオチド未満、好ましくは約１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは約１００ヌクレオチド未満である。本発明の意味における例示的なＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、配列番号１〜１，３６３、１，３９５、１，４２１、及び１，４２２に係る配列における５番目の位置のヌクレオチドから開始コドン（例えば、ＡＴＧ）の直ぐ５’側に位置するヌクレオチドまで延在する核酸配列である。
第１の態様では、本発明は、
ａ． ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ． 少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と
とを含む人工核酸分子に関する。
かかる人工核酸分子は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。人工核酸分子がＤＮＡである場合、それは、以下に更に記載する配列に相当する配列を有するＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを提供するために用いてよい。本発明の人工核酸分子は、オープンリーディングフレームによってコードされているタンパク質のタンパク質産生を増加及び／又は延長させることができるので、遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種において特に有用である。本発明の核酸分子が自然界には存在せず、人工キメラ組み替え核酸分子になるように、要素（ａ）と（ｂ）とが異種である場合が好ましい。
これに関連して、用語「５’ＵＴＲエレメント」は、好ましくは、人工ｍＲＮＡ等の人工核酸配列の５’ＵＴＲを表す核酸配列、又は人工核酸分子の５’ＵＴＲをコードしている核酸配列を指す。したがって、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ、好ましくは人工ｍＲＮＡの５’ＵＴＲであってもよく、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの転写テンプレートであってもよい。したがって、５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、好ましくは人工ｍＲＮＡ（例えば、遺伝子的に改変したベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲに相当する核酸配列である。好ましくは、本発明の意味における５’ＵＴＲエレメントは、５’ＵＴＲとして機能するか、又は５’ＵＴＲの機能を発揮するヌクレオチド配列をコードしている。また、用語「５’ＵＴＲエレメント」は、人工核酸配列、例えば、人工ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの断片若しくは一部、又は人工核酸分子の５’ＵＴＲの一部若しくは断片をコードしているものを指す場合もある。これは、本発明の意味における５’ＵＴＲエレメントが、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲに含まれていてもよく、人工核酸分子の５’ＵＴＲをコードしていてもよいことを意味する。
本発明によれば、５’ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。
用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列」は、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ配列又はその断片に基づく核酸配列を指す。この用語は、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ配列全体に相当する配列、即ち、完全長５’ＵＴＲ配列と、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ配列の断片に相当する配列とを含む。好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの断片は、ＴＯＰ遺伝子の完全長５’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに相当する連続する一続きのヌクレオチドであって、ＴＯＰ遺伝子の完全長５’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す連続する一続きのヌクレオチドからなる。本発明の意味におけるかかる断片は、好ましくは、本明細書に記載する機能的断片である。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの特に好ましい断片は、５’ＴＯＰモチーフ（典型的に、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの５’末端における３個〜３０個のピリミジンヌクレオチドの一続きのピリミジンに相当する）を有しないＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲである。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲを使用する本発明の上記好ましい実施形態については、（本発明の核酸分子に含まれる）５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフの最も３’末端のヌクレオチド後の最初のヌクレオチドで始まる。５’ＴＯＰモチーフがＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの５’末端部分に対応していない場合、本発明の核酸で使用される（ＴＯＰ遺伝子の）５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフの５’末端の上流に位置するヌクレオチド配列及び／又は５’ＴＯＰモチーフの３’末端の下流に位置するヌクレオチド配列からなっていてよい。別の実施形態では、例えば、改変（遮断）された５’ＴＯＰモチーフの配列が、それ以上制御機能を発揮することができないように、特に、翻訳を調節するためのエレメントとしての機能を発揮することができないように、５’ＴＯＰモチーフの単調な一続きのピリミジンヌクレオチドを遮断する１以上のプリンヌクレオチドを導入することによって、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの５’モチーフを機能不全にしてもよい。５’ＴＯＰモチーフを機能不全にする別の方法は、（５’ＴＯＰモチーフの末端及び／又は内部における）５’ＴＯＰモチーフ配列の１以上のピリミジンヌクレオチドを欠失させることである。
１つの実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、リボソームタンパク質（ｒｐ）ｍＲＮＡの５’ＵＴＲには由来しない。具体的には、哺乳類のｒｐ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、より具体的には、ｒｐＰ２（例えば、ラットのｒｐＰ２）、ｒｐＬ３２、ｒｐＬ３０、ｒｐＬ１３ａ（例えば、マウス移植抗原Ｐ１９８）、ｒｐＳ２０、ｒｐＳ６、ｒｐＬ１２、若しくはｒｐＳ１６のｍＲＮＡ、又は（例えば、アフリカツメガエル由来の）ｒｐＳ１９のｍＲＮＡには由来しない。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、ＥＦ１アルファ又は（ハムスター）ＥＦ２のｍＲＮＡの５’ＵＴＲには由来しない。これら上述のｒｐ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、特に、本発明の核酸のＯＲＦにおけるレポーター遺伝子に連結されている場合、用いられない。例えば、ｒｐＳ１６のｍＲＮＡの５’ＵＴＲを本発明の核酸に用いる場合、前記５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ配列（オリゴヌクレオチド（ＣＣＴＴＴＴＣＣ又はＣＣＵＵＵＵＣＣ）で構成される）を含有しないか、又は例えば、プリンヌクレオチドによりオリゴピリミジン配列が遮断されているか若しくは前記５’ＴＯＰモチーフの１以上のピリミジンヌクレオチドが欠失している機能不全変異体を含有する。したがって、機能不全変異体は、例えば、５’ＴＯＰモチーフ配列内に１以上のプリンヌクレオチドを含有していてよく、それによって、他の制御化合物（例えば、ｍｉＲＮＡ）との相互作用又は顆粒関連タンパク質ＴＩＡ−１及びＴＩＡＲとの相互作用が無効になり、５’ＴＯＰモチーフによって発揮される翻訳調節機能を有しなくなる。
用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ」は、好ましくは、自然界に存在するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲを指す。
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに関連して、用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体」及び「その変異体」は、自然界に存在するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、好ましくは、脊椎動物のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、好ましくは、哺乳類のＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体、より好ましくは、ヒトＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体を指す。かかる変異体は、ＴＯＰ遺伝子の修飾５’ＵＴＲであってもよい。例えば、変異体５’ＵＴＲは、その変異体が由来する自然界に存在する５’ＵＴＲに比べて１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び／又は置換を有してよい。好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する５’ＵＴＲと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、前記変異体は、本明細書に記載する機能的変異体である。
用語「ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列」は、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ配列の変異体又はその断片に基づく核酸配列を指す。この用語は、ＴＯＰ遺伝子の変異体５’ＵＴＲ配列全体に相当する配列（即ち、完全長変異体５’ＵＴＲ配列）と、ＴＯＰ遺伝子の変異体５’ＵＴＲ配列の断片に相当する配列とを含む。好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体の断片は、ＴＯＰ遺伝子の完全長変異体５’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに相当する連続する一続きのヌクレオチドであって、ＴＯＰ遺伝子の完全長変異体５’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す連続する一続きのヌクレオチドからなる。本発明の意味におけるかかる変異体の断片は、好ましくは、本明細書に記載する機能的断片である。
したがって、人工核酸分子の５’ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの断片若しくはＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体の断片を含んでいてもよく、又はこれらからなっていてもよい。或いは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ全体を含んでいてもよく、又はそれからなっていてもよい。或いは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体を含んでいてもよく、又はそれからなっていてもよい。
５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させるのに適している。
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントが、ＯＲＦによってコードされているタンパク質についてのタンパク質産生増加機能又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を発揮できるように、ＯＲＦと結合していることを意味する。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントとＯＲＦとは、５’→３’方向に結合する。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、以下の構造：５’−５’ＵＴＲエレメント−（任意の）リンカー−ＯＲＦ−３’を含む（リンカーは、存在していても存在していなくてもよい）を含む。例えば、リンカーは、例えば、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる１個〜５０個又は１個〜２０個の一続きのヌクレオチド等の１以上のヌクレオチドであってよい。
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントと少なくとも１つのオープンリーディングフレームとは、異種である。これに関連して、用語「異種」は、自然界（天然）では、オープンリーディングフレームと５’ＵＴＲエレメントとがこの組み合わせで存在しないことを意味する。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、オープンリーディングフレームとは異なる遺伝子に由来する。例えば、ＯＲＦは、例えば、５’ＵＴＲエレメントとは異なる遺伝子をコードしているか又は同じタンパク質であるが異なる種のタンパク質をコードしている、５’ＵＴＲエレメントとは異なる遺伝子に由来していてよい。例えば、ＯＲＦは、５’ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子によってコードされているタンパク質をコードしない。
好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメント、好ましくは人工核酸分子は、完全なＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰ配列も含まない。したがって、好ましくは、５’ＵＴＲエレメント、好ましくは人工核酸分子は、５’ＵＴＲエレメントの核酸配列が由来するＴＯＰ遺伝子の完全なＴＯＰモチーフを含まない。例えば、本発明に係る５’ＵＴＲエレメント又は人工核酸分子は、ＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上のピリミジン残基、好ましくは、ＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰの３’側に位置するＴＯＰモチーフのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のピリミジン残基を含んでいてよい。例えば、５’ＵＴＲエレメントは、その５’末端において、５’ＵＴＲエレメントの核酸配列が由来するＴＯＰ遺伝子のＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰの残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０等に相当するピリミジン残基で始まる核酸配列を含んでいてもよく、又は前記配列からなっていてもよい。
本発明に係る５’ＵＴＲエレメント、好ましくは人工核酸分子は、ＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰも含まないことが特に好ましい。例えば、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントの核酸配列は、その５’末端において、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで始まる。５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１は、ＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰの３’側の最初のプリン系ヌクレオチドである。したがって、５’末端オリゴピリミジン領域の下流の位置１は、５’から３’方向において５’末端オリゴピリミジン領域の３’末端に続く最初のヌクレオチドである。同様に、５’ＴＯＰの下流の位置２は、５’末端オリゴピリミジン領域の末端に続く２番目のヌクレオチドであり、位置３は、３番目のヌクレオチドである。
したがって、５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの転写開始点の５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、又は５０ヌクレオチド下流で始まる。
幾つかの実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントの核酸配列は、その３’末端において、それが由来する遺伝子又はｍＲＮＡの開始コドン（例えば、Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終結する。したがって、５’ＵＴＲエレメントは、タンパク質コード領域を全く含まない。したがって、好ましくは、本発明の人工核酸分子の唯一のタンパク質コード領域が、オープンリーディングフレームによって提供される。しかし、オープンリーディングフレームは、好ましくは、上記の通り、５’ＵＴＲエレメントが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来する。
５’ＵＴＲエレメントは、ヌクレオチド配列Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ等の開始コドンを含まないことが特に好ましい。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、任意の上流ＡＵＧ（又はＤＮＡ分子の場合、上流ＡＴＧ）を含まない。言い換えれば、幾つかの実施形態では、オープンリーディングフレームのＡＵＧ又はＡＴＧは、人工核酸分子の唯一の開始コドンであることが好ましい場合がある。
したがって、５’ＵＴＲエレメントは、オープンリーディングフレームを含まないことが好ましい。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、上流オープンリーディングフレームを全く含まない。
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列は、真核生物のＴＯＰ遺伝子、好ましくは植物又は動物のＴＯＰ遺伝子、より好ましくは脊索動物のＴＯＰ遺伝子、更により好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子、最も好ましくは哺乳類のＴＯＰ遺伝子、例えば、ヒト又はマウスのＴＯＰ遺伝子に由来する。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり（前記ＴＯＰ遺伝子は、植物又は動物のＴＯＰ遺伝子、より好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子、更により好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子、最も好ましくは哺乳類のＴＯＰ遺伝子、例えば、ヒト又はマウスのＴＯＰ遺伝子である）、任意で、ヌクレオチド配列Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇを含まず、且つ任意でオープンリーディングフレームを含まない５’ＵＴＲエレメントと；少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とを含み、任意で、前記５’ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰモチーフを含まず、任意で、前記５’ＵＴＲエレメントは、その５’末端において、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで始まり、更に任意でＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、その３’末端において、前記遺伝子又はｍＲＮＡが由来する開始コドン（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終結する。
例えば、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１、及び配列番号１，４２２；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１、及び配列番号１，４２２のホモログ；及びこれらの変異体からなる群より選択される核酸配列に由来する核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列を含むか又はからなる。「配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１、及び配列番号１，４２２のホモログ」という用語は、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１、及び配列番号１，４２２に係る配列に対して相同性を有する他の種、例えば、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）又はＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）以外の種の配列を指す。例えば、配列番号１は、ヒトアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）の５’ＵＴＲを含む配列に関する。本発明における配列番号１のホモログは、ヒト以外の種のアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）遺伝子又はｍＲＮＡ、例えば、ヒトアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）遺伝子以外の任意の脊椎動物、好ましくは任意の哺乳類のアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）遺伝子、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル等のアルファ２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）遺伝子に由来する任意のかかる配列である。
好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２のホモログ；及びこれらの変異体から選択される核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列の、ヌクレオチド位置５（即ち、前記配列における位置５に位置するヌクレオチド）から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に由来する核酸配列を含むか又はからなる。５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２のホモログ；及びこれらの変異体から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列の、５’−ＴＯＰの直ぐ３’側のヌクレオチド位置から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に由来することが特に好ましい。
好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列のヌクレオチド位置５から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列のヌクレオチド位置５から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、前記断片が由来する完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列の、５’ＴＯＰの直ぐ３’側のヌクレオチド位置から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置、（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２から選択される核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列の、５’ＴＯＰの直ぐ３’側のヌクレオチド位置から（前記配列の３’末端に位置する）開始コドンの直ぐ５’側のヌクレオチド位置（例えば、ＡＴＧ配列の直ぐ５’側のヌクレオチド位置）まで延在する核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、前記断片が由来する完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。
好ましくは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１又は配列番号１，４２２に係る配列の上に定義した断片及び変異体（例えば、少なくとも４０％の同一性を示す）は、本明細書に記載する機能的断片及び変異体である。
更に、本発明に係る人工核酸分子は、１超の上記５’ＵＴＲエレメントを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、１個、２個、３個、４個、又はそれ以上の５’ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、個々の前記５’ＵＴＲエレメントは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、上記の通り２つの本質的に同一の５’ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、例えば、２つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１及び配列番号１，４２２；配列番号１〜１，３６３、配列番号１，３９５、配列番号１，４２１及び配列番号１，４２２のホモログ；及びこれらの変異体からなる群より選択される核酸配列に由来する核酸配列、或いは対応するＲＮＡ配列、或いは上記の通りのこれらの機能的変異体、これらの機能的断片、又はこれらの機能的変異体断片を含むか又はからなる。
特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。特に好ましい５’ＵＴＲエレメントは、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＵＢＡ５２から選択されるリボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。脊椎動物のリボソームタンパク質、例えば、哺乳類のリボソームタンパク質（例えば、ヒト又はマウスのリボソームタンパク質）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列が特に好ましい。
例えば、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、若しくは１，３６０のいずれかに係る核酸配列；対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる。上記の通り、位置５から（前記配列の３’末端に位置する）ＡＴＧの直ぐ５’側のヌクレオチドまで延在する配列は、前記配列の５’ＵＴＲに相当する。
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、若しくは１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１７０、２３２、２４４、２５９、１，２８４、１，２８５、１，２８６、１，２８７、１，２８８、１，２８９、１，２９０、１，２９１、１，２９２、１，２９３、１，２９４、１，２９５、１，２９６、１，２９７、１，２９８、１，２９９、１，３００、１，３０１、１，３０２、１，３０３、１，３０４、１，３０５、１，３０６、１，３０７、１，３０８、１，３０９、１，３１０、１，３１１、１，３１２、１，３１３、１，３１４、１，３１５、１，３１６、１，３１７、１，３１８、１，３１９、１，３２０、１，３２１、１，３２２、１，３２３、１，３２４、１，３２５、１，３２６、１，３２７、１，３２８、１，３２９、１，３３０、１，３３１、１，３３２、１，３３３、１，３３４、１，３３５、１，３３６、１，３３７、１，３３８、１，３３９、１，３４０、１，３４１、１，３４２、１，３４３、１，３４４、１，３４６、１，３４７、１，３４８、１，３４９、１，３５０、１，３５１、１，３５２、１，３５３、１，３５４、１，３５５、１，３５６、１，３５７、１，３５８、１，３５９、若しくは１，３６０のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ；又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、（好ましくは５’ＴＯＰモチーフを有しない）完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はリボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，３５８、１，４２１、及び１，４２２のいずれかに係る核酸配列、対応するＲＮＡ配列、これらのホモログ、又は本明細書に記載するこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）を含むか又はからなる。
好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，３５８、１，４２１、及び１，４２２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列（好ましくは、５’ＴＯＰモチーフを有しない）に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６７、２５９、１，２８４〜１，３１８、１，３４４、１，３４６、１，３４８〜１，３５４、１，３５７、１，３５８、１，４２１、及び１，４２２のいずれかに係る核酸配列の５’ＵＴＲ、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを有しない完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。
特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、アンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、シトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、又はＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体；好ましくは、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、脊椎動物のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、脊椎動物のヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、脊椎動物のアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、脊椎動物のシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、又は脊椎動物のＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体；より好ましくは、哺乳類のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、哺乳類のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、哺乳類のヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、哺乳類のアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、哺乳類のシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、又は哺乳類のＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体；最も好ましくは、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ヒトのＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒトのヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、ヒトのアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、ヒトのシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、又はヒトのＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、前記５’ＵＴＲエレメントは、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
したがって、特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６８又は配列番号１，４１２〜１，４２０に係る核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる。或いは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６８又は配列番号１，４１２〜１，４２０に係る核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなる。好ましくは、前記断片は、上記の通りである、即ち、完全長５’ＵＴＲのうちの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。好ましくは、前記断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。好ましくは、前記断片は、本明細書に記載する機能的断片である。
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド以上、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上の長さを有する。しかし、人工核酸分子の５’ＵＴＲエレメントがやや短いことが好ましい場合がある。したがって、約２００ヌクレオチド未満、好ましくは１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは１００ヌクレオチド未満の長さを有していてよい。例えば、５’ＵＴＲは、約２５ヌクレオチド未満、約３０ヌクレオチド未満、約３５ヌクレオチド未満、約４０ヌクレオチド未満、約４５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、約５５ヌクレオチド未満、約６０ヌクレオチド未満、約６５ヌクレオチド未満、約７０ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、約８５ヌクレオチド未満、約９０ヌクレオチド未満、約９５ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約１０５ヌクレオチド未満、約１１０ヌクレオチド未満、約１１５ヌクレオチド未満、約１２０ヌクレオチド未満、約１２５ヌクレオチド未満、約１３０ヌクレオチド未満、約１３５ヌクレオチド未満、約１４０ヌクレオチド未満、約１４５ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１５５ヌクレオチド未満、約１６０ヌクレオチド未満、約１６５ヌクレオチド未満、約１７０ヌクレオチド未満、約１７５ヌクレオチド未満、約１８０ヌクレオチド未満、約１８５ヌクレオチド未満、約１９０ヌクレオチド未満、約１９５ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満の長さを有していてよい。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド〜約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約４１ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチド、約４６ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約５１ヌクレオチド〜約５５ヌクレオチド、約５６ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約６１ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド、約６６ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約７１ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約８１ヌクレオチド〜約８５ヌクレオチド、約８６ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約９１ヌクレオチド〜約９５ヌクレオチド、約９６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１０１ヌクレオチド〜約１０５ヌクレオチド、約１０６ヌクレオチド〜約１１０ヌクレオチド、約１１１ヌクレオチド〜約１１５ヌクレオチド、約１１６ヌクレオチド〜約１２０ヌクレオチド、約１２１ヌクレオチド〜約１２５ヌクレオチド、約１２６ヌクレオチド〜約１３０ヌクレオチド、約１３１ヌクレオチド〜約１３５ヌクレオチド、約１３６ヌクレオチド〜約１４０ヌクレオチド、約１４１ヌクレオチド〜約１４５ヌクレオチド、約１４６ヌクレオチド〜約１５０ヌクレオチド、約１５１ヌクレオチド〜約１５５ヌクレオチド、約１５６ヌクレオチド〜約１６０ヌクレオチド、約１６１ヌクレオチド〜約１６５ヌクレオチド、約１６６ヌクレオチド〜約１７０ヌクレオチド、約１７１ヌクレオチド〜約１７５ヌクレオチド、約１７６ヌクレオチド〜約１８０ヌクレオチド、約１８１ヌクレオチド〜約１８５ヌクレオチド、約１８６ヌクレオチド〜約１９０ヌクレオチド、約１９１ヌクレオチド〜約１９５ヌクレオチド、約１９６ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチド、又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有していてよい。例えば、５’ＵＴＲエレメントは、約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約４１ヌクレオチド、約４６ヌクレオチド、約５１ヌクレオチド、約５６ヌクレオチド、約６１ヌクレオチド、約６６ヌクレオチド、約７１ヌクレオチド、約８１ヌクレオチド、約８６ヌクレオチド、約９１ヌクレオチド、約９６ヌクレオチド、約１０１ヌクレオチド、約１０６ヌクレオチド、約１１１ヌクレオチド、約１１６ヌクレオチド、約１２１ヌクレオチド、約１２６ヌクレオチド、約１３１ヌクレオチド、約１３６ヌクレオチド、約１４１ヌクレオチド、約１４６ヌクレオチド、約１５１ヌクレオチド、約１５６ヌクレオチド、約１６１ヌクレオチド、約１６６ヌクレオチド、約１７１ヌクレオチド、約１７６ヌクレオチド、約１８１ヌクレオチド、約１８６ヌクレオチド、約１９１ヌクレオチド、又は約１９６ヌクレオチドの長さを有していてよい。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントは、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、又はそれ以上から約２００ヌクレオチド未満の長さを有していてよく、より好ましくは、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、又はそれ以上から約１５０ヌクレオチド未満の長さを有していてよく、最も好ましくは、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、又はそれ以上から約１００ヌクレオチド未満の長さを有していてよい。
好ましい５’ＵＴＲエレメントは、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｆ、ＥＩＦ３Ｈ、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＩＦ３ＥＩＰ、ＥＩＦ４Ａ２、ＰＡＢＰＣ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＰＴ１、ＴＵＢＢ１、ＵＢＡ５２、ＮＰＭ１、ＡＴＰ５Ｇ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＵＱＣＲＢ、又はこれらの変異体から選択されるＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する。
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４０、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ３、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｆ、ＥＩＦ３Ｈ、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＩＦ３ＥＩＰ、ＥＩＦ４Ａ２、ＰＡＢＰＣ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＴＰＴ１、ＴＵＢＢ１、ＵＢＡ５２、ＮＰＭ１、ＡＴＰ５Ｇ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＮＭＥ２、ＵＱＣＲＢ又はこれらの変異体から選択される脊椎動物のＴＯＰ遺伝子（例えば、ヒト等の哺乳類のＴＯＰ遺伝子）の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含み、好ましくは、前記５’ＵＴＲエレメントは、前記遺伝子のＴＯＰモチーフも５’ＴＯＰも含まず、任意で、前記５’ＵＴＲエレメントは、その５’末端において、５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に位置するヌクレオチドで始まり、更に、任意で、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、その３’末端において、それが由来する遺伝子の開始コドン（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に位置するヌクレオチドで終結する。
好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、
ｃ． 脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲに由来するか、又は脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント
を更に含む。
用語「３’ＵＴＲエレメント」は、３’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる核酸配列を指す。本発明の意味における３’ＵＴＲエレメントは、例えば、人工核酸分子がｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを表してもよく、或いは、転写されたときに転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲを表す核酸コンストラクト（例えば、ベクターコンストラクト）における配列を表してもよい。したがって、本発明の意味において、好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ（好ましくは、人工ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲであってもよく、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの転写テンプレートであってもよい。したがって、３’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、好ましくは人工ｍＲＮＡ（例えば、遺伝的に改変されているベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲに相当する核酸配列である。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲの機能を発揮するか、又は３’ＵＴＲの機能を発揮する配列をコードしている。用語「３’ＵＴＲエレメント」は、更に、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲの断片若しくは一部を指すか、又は人工核酸分子の３’ＵＴＲの一部若しくは断片をコードしているものを指す。これは、本発明の意味における３’ＵＴＲエレメントが、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ、又は人工核酸分子の３’ＵＴＲをコードしているものに含まれ得ることを意味する。
好ましくは、３’ＵＴＲエレメントと少なくとも１つのオープンリーディングフレームとは、異種である。例えば、人工核酸分子は、２つの異なる遺伝子に由来する少なくとも２つの配列部分：ＴＯＰ遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントと、所望のタンパク質産物をコードしている遺伝子に由来していてよいオープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲとからなっていてよい。より好ましくは、人工核酸分子は、３つの異なる遺伝子に由来する３つの配列部分：ＴＯＰ遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントと、所望の遺伝子産物をコードしている遺伝子に由来するオープンリーディングフレームと、半減期の延長されたｍＲＮＡに関する遺伝子に由来していてよい３’ＵＴＲエレメント（例えば、以下に定義及び説明する３’ＵＴＲエレメント）からなる。
好ましくは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、例えば、ＯＲＦの発現に対する安定化機能又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を発揮することができるように、３’ＵＴＲエレメントがＯＲＦに連結していることを意味する。好ましくは、ＯＲＦと３’ＵＴＲエレメントとは、５’→３’方向に連結する。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、以下の構造：５’−ＯＲＦ−（任意の）リンカー−３’ＵＴＲエレメント−３’（リンカーは、存在していても存在していなくてもよい）を含む。例えば、リンカーは、例えば、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる一続きの１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド等、１以上のヌクレオチドであってよい。
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、ＯＲＦの発現に対する安定化機能、ＯＲＦによってコードされているタンパク質のタンパク質産生増加機能、又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を好ましくは相加的に、より好ましくは相乗的に発揮することができるように、５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントがＯＲＦに連結していることを意味する。好ましくは、５’ＵＴＲエレメント、ＯＲＦ、及び３’ＵＴＲエレメントは、５’→３’方向に連結する。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、以下の構造：５’−５’ＵＴＲエレメント−（任意の）リンカー−ＯＲＦ−（任意の）リンカー−３’ＵＴＲエレメント−３’（リンカーは、存在していても存在していなくてもよい）を含む。例えば、リンカーは、例えば、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる一続きの１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド等、１以上のヌクレオチドであってよい。
特に好ましい実施形態では、５’ＵＴＲエレメントと３’ＵＴＲエレメントとは、異種であり、例えば、好ましくは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、同じ種の異なる遺伝子又は異なる種の異なる遺伝子に由来する。好ましくは、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲが由来するＴＯＰ遺伝子には由来しない。
好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、人工核酸分子のＯＲＦからのタンパク質産生に対して５’ＵＴＲエレメントと少なくとも相加的、好ましくは相乗的に機能を発揮することができるように選択される。好ましくは、前記タンパク質産生は、３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントによって少なくとも相加的、好ましくは相乗的に増加する。したがって、ＯＲＦによってコードされているタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ等のレポータータンパク質）のタンパク質量は、ＯＲＦの発現開始後、例えば、試験細胞又は試験細胞株のトランスフェクション後の特定の時点において、３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントのタンパク質産生増加効果が純粋に相加的である場合に予測される量と少なくとも同じであり、好ましくはそれよりも多い。相加効果、好ましくは相乗効果は、例えば、以下のアッセイによって求めることができる。例えば、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子をコードしているＯＲＦを含む４つの人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）、即ち、（ｉ）ＵＴＲエレメントを有しない（Ｅ０）、（ｉｉ）ＴＯＰ遺伝子又はその変異体の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントを含有する（Ｅ１）、（ｉｉｉ）試験３’ＵＴＲエレメントを含有する（Ｅ２）、及び（ｉｖ）５’ＵＴＲエレメント及び試験３’ＵＴＲエレメントの両方を含有する（Ｅ１Ｅ２）人工核酸分子を作製する。人工核酸分子に含有されるＯＲＦの発現は、例えば、試験細胞株、例えば、哺乳類細胞株（例えば、ＨＥＬＡ細胞）又は一次細胞（例えば、ＨＤＦ細胞）をトランスフェクトすることによって開始される。発現開始後の特定の時点、例えば、６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にサンプルを採取し、ＯＲＦによってコードされているタンパク質の種類に応じて、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はルシフェラーゼ試験によって、人工核酸分子に含有されているＯＲＦの発現によって産生されるタンパク質の量を測定する。３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントの効果が純粋に相加的である場合にコンストラクトＥ１Ｅ２によって得られる発現開始後の特定の時点におけるタンパク質の予測量（ＰＰＡ）は、以下の通り計算することができる：
ＰＰＡｘ＝（Ｅ１ｘ−Ｅ０ｘ）＋（Ｅ２ｘ−Ｅ０ｘ）＋Ｅ０ｘ
Ｅ０は、コンストラクトＥ０（ＵＴＲを有しない）について得られるタンパク質の量であり、Ｅ１は、コンストラクトＥ１について得られるタンパク質の量であり、Ｅ２は、コンストラクトＥ２について得られるタンパク質の量であり、ｘは、発現開始後の時点である。Ｅ１Ｅ２ｘ＝ＰＰＡｘである場合、タンパク質産生増加効果は、相加的であり、Ｅ１Ｅ２ｘ＞ＰＰＡｘである場合、本発明における意味で相乗的である。ここで、Ｅ１Ｅ２ｘは、時点ｘにおいてコンストラクトＥ１Ｅ２から得られるタンパク質の量である。好ましくは、Ｅ１Ｅ２は、発現開始の２４時間後、４８時間後、又は７２時間後等の発現開始後の所与の時点において、ＰＰＡの少なくとも１．０倍、より好ましくは少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．３倍、より好ましくは少なくとも１．５倍、更により好ましくは少なくとも１．７５倍である。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、（ａ．）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と；（ｃ．）少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントとを含み、前記３’ＵＴＲエレメント及び前記５’ＵＴＲエレメントが、少なくとも相加的に、好ましくは相乗的に作用して、ＯＲＦからのタンパク質産生を増加させ、好ましくは、ＯＲＦの発現開始後の所与の時点、例えば、（トランスフェクション後等）発現開始の２４時間後、好ましくは４８時間後にＥ１Ｅ２≧ＰＰＡであり、好ましくは、Ｅ１Ｅ２が、ＰＰＡの少なくとも１．０倍であり、より好ましくは、Ｅ１Ｅ２が、ＰＰＡの少なくとも１．１倍であり、より好ましくは、Ｅ１Ｅ２が、ＰＰＡの少なくとも１．３倍であり、更により好ましくは、Ｅ１Ｅ２が、ＰＰＡの少なくとも１．５倍である（Ｅ１Ｅ２及びＰＰＡは、上記の通りである）人工核酸分子を提供する。
更に、３’ＵＴＲエレメント及び５’ＵＴＲエレメントは、特定の期間内、例えば、発現開始後２４時間以内、４８時間以内、又は７２時間以内の人工核酸分子からの全タンパク質産生に対して少なくとも相加効果、好ましくは相乗効果を有することが好ましい。相加効果又は相乗効果は、効果が相加的である場合にＥ１Ｅ２について予測される経時的なタンパク質量の曲線下面積（ＡＵＣ）をＥ１Ｅ２について測定された実際のＡＵＣと比較することを除いて、上記の通り決定することができる。
好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、又は安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。したがって、好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子又は安定なｍＲＮＡを提供する遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する配列を含むか又はからなる。用語「安定なｍＲＮＡ」は、好ましくは、哺乳類細胞において、哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ分子の平均半減期よりも長い半減期を示すｍＲＮＡを指す。好ましくは、本願の意味における安定なｍＲＮＡは、好ましくはアクチノマイシンＤ等の転写阻害剤を用いて測定したとき、哺乳類細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞株）又は一次細胞（例えば、ＨＤＦ細胞）において、５時間超、好ましくは８時間超の半減期を示すｍＲＮＡを指す。
例えば、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＬＡ細胞又はＨＤＦ細胞）におけるｍＲＮＡの半減期は、例えば、アクチノマイシンＤ、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）又はα−アマニチン等の転写阻害剤の存在下で細胞を培養し、転写阻害後の様々な時点において前記細胞を回収し、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ等の当業者に周知の方法によって前記細胞サンプル中に存在するｍＲＮＡの量を測定することによって求めることができる。特定のｍＲＮＡの半減期は、転写阻害後の様々な時点で測定した前記特定のｍＲＮＡの量に基づいて計算することができる。或いは、哺乳類細胞におけるｍＲＮＡの半減期を求めるために、例えば、放射活性標識されたヌクレオチドを用いるパルスチェイス法又は誘導可能なプロモーターを含むコンストラクトを用いてもよい。
本発明の意味における安定なｍＲＮＡの安定性強化は、その３’ＵＴＲによって影響を受けることが特に好ましい。したがって、好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、好ましくはアクチノマイシンＤ等の転写阻害剤を用いて測定したとき、哺乳類細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞株）又は哺乳類一次細胞（例えば、ＨＤＦ細胞）において、５時間超、好ましくは８時間超の半減期を示す安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなり、前記安定なｍＲＮＡの安定性強化は、その３’ＵＴＲによって影響を受ける。安定性を強化する３’ＵＴＲの能力は、例えば、レポーターオープンリーディングフレーム（例えば、ルシフェラーゼをコードしているオープンリーディングフレーム）を用いることによって、本明細書に記載する通り試験することができる。或いは、試験用の安定なｍＲＮＡをコードしている人工コンストラクトであって、前記安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲが、短命ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（例えば、Ｍｙｃの３’ＵＴＲ）等のレファレンス３’ＵＴＲで置換されているコンストラクトを作製してよい。野生型の安定なｍＲＮＡ及び３’ＵＴＲが改変されているｍＲＮＡの安定性は、上記の通り決定することができる。３’ＵＴＲが改変されているｍＲＮＡが、野生型の安定なｍＲＮＡよりも短い半減期を示す場合、安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲによって安定性強化効果が発揮されたと結論付けてよい。
特に好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲ、又はアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）からなる群より選択される遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。特に好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子、より好ましくは哺乳類のアルブミン遺伝子、最も好ましくはヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。別の特に好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、α−グロビン遺伝子、好ましくは脊椎動物のα−グロビン遺伝子、より好ましくは哺乳類のα−グロビン遺伝子、最も好ましくはヒトのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる。例えば、３’ＵＴＲエレメントは、α−グロビン遺伝子、例えば、ヒトのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲの中央のα複合体結合部分を含んでいてもよく又はからなっていてもよい。
好ましくは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、脊椎動物のアルブミン遺伝子、脊椎動物のα−グロビン遺伝子、脊椎動物のβ−グロビン遺伝子、脊椎動物のチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、脊椎動物のリポキシゲナーゼ遺伝子、及び脊椎動物のコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、脊椎動物のコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲ、又はこれらの変異体、好ましくは、哺乳類のアルブミン遺伝子、哺乳類のα−グロビン遺伝子、哺乳類のβ−グロビン遺伝子、哺乳類のチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、哺乳類のリポキシゲナーゼ遺伝子、及び哺乳類のコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、哺乳類のコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲ、又はこれらの変異体、より好ましくは、ヒトのアルブミン遺伝子、ヒトのα−グロビン遺伝子、ヒトのβ−グロビン遺伝子、ヒトのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、ヒトのリポキシゲナーゼ遺伝子、及びヒトのコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、ヒトのコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲ、又はこれらの変異体、更により好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲには由来しない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子由来の３’ＵＴＲのポリ（Ａ）制限要素Ｂ（ＰＬＥＢ）を含まない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子由来の３’ＵＴＲのＰＬＥＢからなるものではない。
好ましくは、３’ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、異種であり、例えば、好ましくは、３’ＵＴＲエレメント及びＯＲＦは、同じ種の異なる遺伝子又は異なる種の異なる遺伝子に由来する。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがα−グロビン遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、α−グロビンタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがβ−グロビン遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、β−グロビンタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがアルブミン遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、アルブミンタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、チロシンヒドロキシラーゼタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがリポキシゲナーゼ遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、リポキシゲナーゼタンパク質をコードしない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントがコラーゲンアルファ遺伝子に由来する場合、ＯＲＦは、コラーゲンアルファタンパク質をコードしない。好ましくは、ＯＲＦは、アルブミンタンパク質、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ））、α−グロビンタンパク質、β−グロビンタンパク質、チロシンヒドロキシラーゼタンパク質、リポキシゲナーゼタンパク質、及びコラーゲンアルファタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードしない。更に、オープンリーディングフレームは、例えば、グロビンタンパク質（特に、β−グロビン）、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質（例えば、ＥＧＦＰ）、又はこれらの変異体（例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、又はＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する変異体）からなる群より選択されるレポータータンパク質をコードしない。
用語「［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列」とは、好ましくは、［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲ配列、又はその一部、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲ、好ましくは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその一部に基づく核酸配列を指す。この用語は、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）等の遺伝子、好ましくはアルブミン遺伝子の全３’ＵＴＲ配列に対応する配列（即ち、完全長３’ＵＴＲ配列）、及び３’ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。これに関連して、断片は、好ましくは、完全長３’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、完全長３’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる断片は、本発明の意味において、好ましくは本明細書に記載する機能的断片である。用語「［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲ」は、好ましくは、自然界に存在する遺伝子、例えば、自然界に存在するアルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）、好ましくは自然界に存在するアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲを指す。
３’ＵＴＲに関連する用語「［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲの変異体」及び「その変異体」は、自然界に存在する遺伝子、例えば、自然界に存在するアルブミン遺伝子、自然界に存在するα−グロビン遺伝子、自然界に存在するβ−グロビン遺伝子、自然界に存在するチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、自然界に存在するリポキシゲナーゼ遺伝子、又は自然界に存在するコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、自然界に存在するコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子、脊椎動物のα−グロビン遺伝子、脊椎動物のβ−グロビン遺伝子、脊椎動物のチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、脊椎動物のリポキシゲナーゼ遺伝子、及び脊椎動物のコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、脊椎動物のコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体、好ましくは、哺乳類のアルブミン遺伝子、哺乳類のα−グロビン遺伝子、哺乳類のβ−グロビン遺伝子、哺乳類のチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、哺乳類のリポキシゲナーゼ遺伝子、及び哺乳類のコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、哺乳類のコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体、より好ましくは、ヒトのアルブミン遺伝子、ヒトのα−グロビン遺伝子、ヒトのβ−グロビン遺伝子、ヒトのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、ヒトのリポキシゲナーゼ遺伝子、及びヒトのコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、ヒトのコラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体を指す。かかる変異体は、遺伝子の改変３’ＵＴＲであってよい。例えば、変異体３’ＵＴＲは、その変異体が由来する自然界に存在する３’ＵＴＲに比べて、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び／又は置換を示してよい。好ましくは、３’ＵＴＲの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する３’ＵＴＲと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、変異体は、本明細書に記載する機能的変異体である。
用語「［．．．］遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列」は、好ましくは、遺伝子の３’ＵＴＲ配列の変異体、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体、或いは上記これらの一部に基づく核酸配列を指す。この用語は、遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の全配列（即ち、遺伝子の完全長変異体３’ＵＴＲ配列）に対応する配列、及び遺伝子の変異体３’ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。これに関連して、断片は、好ましくは、完全長変異体３’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、完全長変異体３’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる変異体の断片は、本発明の意味において、好ましくは、本明細書に記載する変異体の機能的断片である。
本発明において、用語「機能的変異体」、「機能的断片」、及び「変異体の機能的断片」（「機能的変異体断片」とも呼ばれる）は、遺伝子の５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲの断片、５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲの変異体、又は５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲの変異体の断片が、前記変異体、前記断片、又は前記変異体の断片が由来する遺伝子の自然界に存在する５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの少なくとも１つの機能、好ましくは１超の機能を発揮することを意味する。かかる機能は、例えば、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）における、ｍＲＮＡの安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の延長、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の増加であってよい。本発明における変異体、断片、及び変異体の断片は、以下のうちの少なくともいずれかの機能を発揮することが特に好ましい：好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス５’ＵＴＲ及び／若しくはレファレンス３’ＵＴＲを含むか又は５’ＵＴＲ及び／若しくは３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡを安定化させる機能；好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス５’ＵＴＲ及び／若しくはレファレンス３’ＵＴＲを含むか又は５’ＵＴＲ及び／若しくは３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を安定化及び／又は延長する機能；並びに好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス５’ＵＴＲ及び／若しくはレファレンス３’ＵＴＲを含むか又は５’ＵＴＲ及び／若しくは３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる機能。レファレンス３’ＵＴＲは、例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲであってよい。更に、遺伝子の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片は、その変異体が由来する野生型の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲに比べて、かかる５’ＵＴＲの変異体及び／又はかかる３’ＵＴＲの変異体を含むｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じる効果を有しないことが好ましい。本発明において、遺伝子、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）の３’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」又は「変異体の機能的断片」の特に好ましい機能は、上記機能的断片、機能的変異体、又は変異体の機能的断片を有するｍＲＮＡの発現によるタンパク質産生の安定化及び／又は延長である。本発明における５’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」の特に好ましい機能は、タンパク質産生を増加させる機能である。
好ましくは、機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片によって発揮される１以上の機能の効率、例えば、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生安定化効率及び／又はタンパク質の産生増加効率は、前記変異体、前記断片、又は前記変異体断片が由来する自然界に存在する５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲによって発揮されるｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生安定化効率及び／又はタンパク質の産生増加効率の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
本発明に関連して、遺伝子、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、又はコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）又はその変異体の３’ＵＴＲの断片又は一部は、好ましくは、少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、かかる遺伝子の３’ＵＴＲの断片又は遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の断片は、上記機能的断片である。
本発明に関連して、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体の断片又は一部は、好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体の断片は、上記機能的断片である。
幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、遺伝子、例えば、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、若しくはコラーゲンアルファ遺伝子（例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子）、又はこれらの変異体の３’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」を含むか又はからなる。
幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」を含むか又はからなる。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡ（レファレンスｍＲＮＡ）と比べて人工核酸分子の安定性を上昇させる、例えば、本発明に係るｍＲＮＡの安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生の安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を延長する。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡの翻訳効率と比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率に悪影響を与えない。これに関連して、用語「それぞれのｍＲＮＡ」は、異なる３’ＵＴＲは別にして、レファレンスｍＲＮＡが、３’ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡと類似している、好ましくは同一であることを意味する。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、５’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス５’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する５’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡ（レファレンスｍＲＮＡ）と比べて、人工核酸分子の安定性を上昇させる、例えば、本発明に係るｍＲＮＡの安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、５’ＵＴＲエレメントを有しないか又はレファレンス５’ＵＴＲエレメント（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する５’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡ（レファレンスｍＲＮＡ）と比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。これに関連して、用語「それぞれのｍＲＮＡ」は、異なる５’ＵＴＲは別にして、レファレンスｍＲＮＡが、本発明の５’ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡと類似している、好ましくは同一であることを意味する。
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、相乗的に作用して、上記の通り、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる。
用語「ｍＲＮＡからのタンパク質産生を安定化及び／又は延長する」とは、好ましくは、（例えば、レファレンス３’ＵＴＲエレメントを含むか又は３’ＵＴＲエレメントを有しない）レファレンスｍＲＮＡからのタンパク質産生と比べて、ｍＲＮＡからのタンパク質産生が安定化及び／又は延長されることを意味する。
これに関連して、「安定したタンパク質発現」とは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、レファレンス３’ＵＴＲエレメントを含むか又は３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡ）と比べたとき、所定の期間、例えば、２４時間、より好ましくは４８時間、更により好ましくは７２時間に亘って本発明に係る人工核酸分子からより均一にタンパク質が産生されることを意味する。したがって、本発明に係る３’ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからの（例えば、哺乳類系における）タンパク質産生のレベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、上記レファレンスｍＲＮＡ）について観察される程度まで低下することはない。例えば、発現開始の６時間後、例えば、本発明に係る人工核酸分子を細胞（例えば、哺乳類細胞）にトランスフェクトした６時間後に観察される（ＯＲＦによってコードされている）タンパク質の量は、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質の量と同等であってよい。したがって、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察される、例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）等のＯＲＦによってコードされているタンパク質の量の、発現開始の６時間後、例えば、トランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質の量に対する比は、本発明に係る核酸分子の場合、好ましくは０．４超、好ましくは０．５超、より好ましくは０．６超、更により好ましくは０．７超、例えば、約０．４〜約４、好ましくは約０．６５〜約３、より好ましくは約０．７〜約２である。それぞれのレファレンス核酸分子（例えば、レファレンス３’ＵＴＲエレメントを含むか又は３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡ）の場合、前記比は、例えば、約０．０５〜約０．３であってよい。したがって、本発明は、発現開始の４８時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量の、発現開始の６時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量に対する比が、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、哺乳類細胞）において、好ましくは０．４超、好ましくは０．５超、好ましくは０．６超、更により好ましくは０．７超（例えば、約０．４〜約４、好ましくは約０．６５〜約３、より好ましくは約０．７〜約２）である、上記の通りＯＲＦと３’ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子を提供する。
本発明において、「タンパク質発現の増加」とは、レファレンス分子と比べて発現開始後のある時点におけるタンパク質発現が増加すること又は発現開始後特定の期間内における全タンパク質産生が増加することを指してよい。したがって、本発明に係る人工核酸分子の発現開始後（例えば、トランスフェクション後）、例えば、本発明に係るｍＲＮＡのトランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、又は７２時間後において観察されるタンパク質レベル、或いはある期間、例えば、２４時間、４８時間、又は７２時間の間に産生される全タンパク質は、好ましくは、レファレンス５’及び／若しくはレファレンス３’ＵＴＲを含むか又は５’ＵＴＲエレメント及び／若しくは３’ＵＴＲエレメントを有しないレファレンスｍＲＮＡ等のレファレンス核酸分子について、発現開始後（例えば、トランスフェクション後）の同時点で観察されるタンパク質レベルよりも高い、又は同期間内に産生される全タンパク質よりも多い。上記の通り、５’ＵＴＲエレメントの特に好ましい機能は、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させることである。好ましくは、発現開始後の所与の時点における、かかる５’ＵＴＲエレメントを有しないレファレンス核酸分子と比べた５’ＵＴＲエレメントによるタンパク質産生増加は、５’ＵＴＲエレメントを有しないレファレンス核酸分子について観察されるタンパク質産生の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、更により好ましくは少なくとも４倍、最も好ましくは少なくとも５倍である。所与の期間、例えば、発現開始後２４時間、４８時間、又は７２時間の期間内に産生される全タンパク質についても同じことが当てはまることが好ましい。
人工核酸分子の安定性上昇、タンパク質産生の安定性上昇、タンパク質産生の延長、及び／又はタンパク質産生の増加は、好ましくは、５’ＵＴＲエレメント及び／又は３’ＵＴＲエレメントを有しないそれぞれのレファレンス核酸分子（例えば、５’ＵＴＲエレメント及び／又は３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡ）、又はレファレンス５’ＵＴＲエレメント及び／又はレファレンス３’ＵＴＲエレメントを含むレファレンス核酸分子（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲ、或いはレファレンス遺伝子の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲ）と比較することによって求められる。
アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体、断片、及び／又は変異体断片のｍＲＮＡ及びタンパク質の少なくともいずれかの産生安定化効果及び効率、並びに／又はタンパク質産生増加効果及び効率に加えて、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、又は少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントのｍＲＮＡ及びタンパク質の少なくともいずれかの産生安定化効果及び効率、並びに／又はタンパク質産生増加効果及び効率は、当業者に公知であるこの目的に適した任意の方法によって求めることができる。例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）のコード配列を含み、３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲを含まない人工ｍＲＮＡ分子；ＴＯＰ遺伝子由来の５’ＵＴＲエレメント及び／又は上記遺伝子由来の３’ＵＴＲエレメントを含む人工ｍＲＮＡ分子；レファレンス遺伝子由来の５’ＵＴＲエレメント及び／又はレファレンス遺伝子由来の３’ＵＴＲ（即ち、レファレンス３’ＵＴＲエレメント又はレファレンス５’ＵＴＲエレメント、例えば、自然界においてＯＲＦと併存する５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）を含む人工ｍＲＮＡ分子；３’ＵＴＲとして、上記遺伝子の３’ＵＴＲの変異体を含む人工ｍＲＮＡ分子；３’ＵＴＲとして、上記遺伝子の３’ＵＴＲの断片を含む人工ｍＲＮＡ分子；又は３’ＵＴＲとして、上記遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の断片を含む人工ｍＲＮＡ分子；５’ＵＴＲとして、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体を含む人工ｍＲＮＡ分子；５’ＵＴＲとして、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの断片を含む人工ｍＲＮＡ分子；又は５’ＵＴＲとして、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体の断片を含む人工ｍＲＮＡ分子を作製してよい。かかるｍＲＮＡは、例えば、Ｔ７プロモーターとそれぞれのｍＲＮＡ配列をコードしている配列とを含むプラスミドベクター等、それぞれのベクターのインビトロ転写によって作製することができる。作製されるｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡをトランスフェクトするのに適した任意のトランスフェクション法によって細胞にトランスフェクトしてよい。例えば、ＨＥＬＡ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞にエレクトロポレーションし、トランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にサンプルを分析してよい。前記サンプルは、当業者に周知の方法によってｍＲＮＡ量及び／又はタンパク質量について分析してよい。例えば、サンプリング時点で細胞中に存在するレポーターｍＲＮＡの量は、定量ＰＣＲ法によって求めることができる。それぞれのｍＲＮＡによってコードされているレポータータンパク質の量は、例えば、用いられるレポータータンパク質に依存して、ＥＬＩＳＡアッセイ又はレポーターアッセイ（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）によって求めることができる。タンパク質発現の安定化及び／又はタンパク質発現の延長の効果は、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質レベルのトランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質レベルに対する比を求めることによって分析することができる。前記値が１に近付くにつれて、この期間内のタンパク質発現がより安定である。また、タンパク質レベルがより後の時点においてより高い場合、前記値が１を超える場合もある。かかる測定は、無論、７２時間以上の時点で実施してもよく、タンパク質発現の安定性を求めるために、トランスフェクションの７２時間後に観察されるタンパク質レベルとトランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質レベルとの比を求めてもよい。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、１，３９２、及び１，３９３から選択される核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなり、配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、１，３９２、及び１，３９３に係る配列の変異体は、好ましくは、上記機能的変異体である。
また、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、１，３９２、又は１，３９３に係る核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列の断片を含んでいてもよく又はからなっていてもよく、前記断片は、好ましくは、上記の機能的断片又は機能的変異体断片である。好ましくは、前記断片は、上記の通りである。即ち、前記断片が由来する完全長３’ＵＴＲの少なくとも２０％等を表す連続する一続きのヌクレオチドである。かかる断片は、好ましくは、少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。
例えば、かかる断片は、配列番号１，３７８〜１，３９０に係る核酸配列、例えば、
又は対応するＲＮＡ配列、又は前記核酸配列若しくは対応するＲＮＡ配列と少なくとも４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％同一である核酸配列を有し得る。したがって、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、上記核酸断片を含んでいてもよく又はからなっていてもよい。明らかなことであるが、配列番号１，３７８〜１，３９０に係る断片に含まれるチミジンヌクレオチドは、ウリジンヌクレオチドによって置換されてもよい。
好ましくは、前記変異体、断片、又は変異体断片は、配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、１，３９２、又は１，３９３に係る核酸配列の少なくとも１つの機能（例えば、本発明に係る人工核酸分子の安定化、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現の安定化及び／又は延長、タンパク質産生の増加の少なくともいずれか）を、配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、１，３９２、又は１，３９３に係る核酸配列によって示される安定化効率及び／又はタンパク質産生増加効率の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の効率で示す上記機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片である。好ましくは、変異体、断片、又は変異体断片は、５’ＵＴＲエレメントと相乗的に作用して人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる機能を示す機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片である。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ＵＴＲは、約５０ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、好ましくは約１００ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの長さを有し得る。
更に、本発明に係る人工核酸分子は、１超の上記３’ＵＴＲエレメントを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、１、２、３、４、又はそれ以上の３’ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、個々の３’ＵＴＲエレメントは、同一であっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、２つの本質的に同一の上記３’ＵＴＲエレメント（例えば、配列番号１，３６９又は１，３７６に係る核酸配列等、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ、又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる２つの３’ＵＴＲエレメント）、その機能的変異体、その機能的断片、又はその機能的変異体断片を含んでいてよい。
驚くべきことに、本発明者らは、上記ＴＯＰ遺伝子に由来する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子が、前記人工核酸分子からのタンパク質産生を強く強化するｍＲＮＡ分子を表し得るか又は提供し得ることを見出した。
本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡベクター）であってよく、改変ＲＮＡ分子又は改変ＤＮＡ分子であってもよい。それは、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖分子として、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するＤＮＡ分子として提供され得る。
本発明に係る人工核酸分子は、更に、５’−キャップを含んでいてよい。任意の５’−キャップは、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントの５’側に付加される。
好ましい実施形態では、人工核酸配列は、上記リボソームタンパク質をコードしている（例えば、リボソームラージタンパク質をコードしている）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントと、上記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントとを含む。
特に好ましい実施形態では、人工核酸配列は、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、アンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、若しくはＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体、好ましくは、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、脊椎動物のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、脊椎動物のヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、脊椎動物のアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、脊椎動物のシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、若しくは脊椎動物のＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体、より好ましくは、哺乳類のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、哺乳類のＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、哺乳類のヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、哺乳類のアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、哺乳類のシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）、若しくは哺乳類のＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体、最も好ましくは、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（ＲＰＬ３２）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（ＲＰＬ３５）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（ＲＰＬ２１）、ヒトのＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、ヒトのヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）、ヒトのアンドロゲン誘導１遺伝子（ＡＩＧ１）、ヒトのシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（ＣＯＸ６Ｃ）若しくはヒトのＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ＡＳＡＨ１）、又はこれらの変異体の５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントであって、好ましくは、前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない５’ＵＴＲエレメントと、上記アルブミン遺伝子に由来する核酸配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントとを含む。
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、配列番号１，３６８若しくは配列番号１，４１２〜１，４２０に係る核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントと、配列番号１，３６９、１，３７６、１，３７７、１，３９１、又は１，３９２に係る核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメント、例えば、配列番号１，３６８に係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる５’ＵＴＲエレメントと、配列番号１，３６９、１，３７６、１，３７７、１，３９１、又は１，３９２に係る核酸配列に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントとを含む。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを更に含む。好ましくは、任意のポリ（Ａ）配列は、ＯＲＦ又は少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントの３’側に位置し、好ましくは、ＯＲＦ又は３’ＵＴＲエレメントの３’末端に連結されている。直接連結されていてもよく、又は（例えば、１以上の制限酵素部位を含むか又はからなる１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、好ましくは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドのリンカーを介する等、２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等の一続きのヌクレオチドを介して）間接的に連結されていてもよい。
１つの実施形態では、任意のポリアデニル化シグナルは、３’ＵＴＲエレメント内に位置する。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎは、Ａ又はＵである）、好ましくはＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡを含む。かかるコンセンサス配列は、大部分の動物及び細菌の細胞系によって、例えば、ＣｓｔＦ、ＰＡＰ、ＰＡＢ２、ＣＦＩ及び／又はＣＦＩＩと協働する切断／ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）等のポリアデニル化因子によって認識され得る。ポリアデニル化シグナルは、好ましくは、３’ＵＴＲエレメントの３’末端の約５０ヌクレオチド未満上流、より好ましくは約３０ヌクレオチド未満上流、最も好ましくは約２５ヌクレオチド未満上流、例えば、２１ヌクレオチド上流に位置することが好ましい。
次いで、適切な転写系を用いることにより、ポリ（Ａ）配列を未成熟ＲＮＡに結合させる。例えば、本発明の人工核酸分子は、上記３’ＵＴＲエレメントとポリアデニル化シグナルとを含むＤＮＡ分子であってよく、このことにより、前記ＤＮＡ分子の転写時にＲＮＡがポリアデニル化され得る。したがって、得られるＲＮＡは、３’ＵＴＲエレメントとそれに続くポリ（Ａ）配列との組み合わせを含んでいてよい。
潜在的な転写系は、インビトロ転写系又は細胞転写系等である。したがって、本発明に係る人工核酸分子の転写、例えば、５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、３’ＵＴＲエレメントと、ポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子の転写により、５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、３’ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子を得ることができる。
また、本発明は、５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、任意の上記３’ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、上記５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、任意で配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、及び１，３９２のうちの任意の１つに係る核酸配列、又は配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、及び１，３９２のうちの任意の１つに係る核酸配列に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又はこれらの断片とを含む人工ＤＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。更に、本発明は、上記５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、任意で配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、及び１，３９２のうちの任意の１つに係る配列、又は配列番号１，３６９〜１，３７７、１，３９１、及び１，３９２のうちの任意の１つに対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又はこれらの断片に対応するＲＮＡ配列とを含む人工ＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
したがって、本発明は、翻訳効率に関して安定化及び最適化されているＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子のテンプレートとなり得る人工核酸分子を提供する。言い換えれば、人工核酸分子は、ｍＲＮＡの産生に用いることができるＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。得ることができるｍＲＮＡは、次いで、オープンリーディングフレームによってコードされている所望のペプチド又はタンパク質を産生するために翻訳され得る。人工核酸分子がＤＮＡである場合、例えば、インビトロ又はインビボでｍＲＮＡを継続して繰り返し産生するための二本鎖保管形態として用いてよい。
１つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列を更に含む。ポリ（Ａ）配列の長さは、変動してよい。例えば、ポリ（Ａ）配列は、約２０アデニンヌクレオチド〜約３００アデニンヌクレオチド、好ましくは約４０アデニンヌクレオチド〜約２００アデニンヌクレオチド、より好ましくは約５０アデニンヌクレオチド〜約１００アデニンヌクレオチド、例えば、約６０アデニンヌクレオチド、約７０アデニンヌクレオチド、約８０アデニンヌクレオチド、約９０アデニンヌクレオチド、又は約１００アデニンヌクレオチドの長さを有していてよい。
例えば、本発明に係る人工核酸分子は、以下のＤＮＡ配列に対応する核酸配列を含んでいてよい。
かかる配列の転写により、対応するＲＮＡ配列を含む人工核酸分子を得ることができる。
また、かかる人工ＲＮＡ分子は、必ずしもＤＮＡ親から転写されることなしに一般的な化学合成法によってインビトロで得ることもできる。
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、５’から３’方向に、上記５’ＵＴＲエレメントと、オープンリーディングフレームと、上記３’ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子である。
好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、ヒトアルブミンをコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、ヒトアルブミンの３’ＵＴＲと同一である。幾つかの更なる実施形態では、オープンリーディングフレームは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトアルブミンをコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、ヒトアルブミンの３’ＵＴＲと同一であることが好ましい。幾つかの更なる実施形態では、オープンリーディングフレームは、ヒトアルブミン又はその変異体をコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、配列番号１，３６９と同一の配列であることが好ましい。更に、幾つかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質、又はこれらの変異体（例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、又はＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する変異体）からなる群より選択されるレポータータンパク質をコードしないことが好ましい。
幾つかの実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、ヒストンステムループからなるものではないことが好ましく、好ましくは、ヒストンステムループを含まない。１つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ヒストンステムループを含まない。しかし、幾つかの実施形態では、人工核酸分子又は本発明に係る人工核酸分子の３’ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列に加えて、ヒストンステムループを含んでいてよい。本発明に係る人工核酸分子は、例えば、５’から３’方向に、５’ＵＴＲエレメントと、ＯＲＦと、３’ＵＴＲエレメントとを含んでいてよく、好ましくは、ポリアデニル化シグナル、任意のヒストンステムループ、及び任意のポリ（Ａ）配列を含む。また、前記人工核酸分子は、５’から３’方向に、上記５’ＵＴＲエレメントと、ＯＲＦと、３’ＵＴＲエレメントとを含んでいてよく、例えば、ポリアデニル化シグナル、ポリ（Ａ）配列、及び任意のヒストンステムループを含む。
本発明において、かかるヒストンステムループは、典型的に、ヒストン遺伝子に由来し、２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列の分子内塩基対合を含み、それによってステムループを形成する。ステムループは、一本鎖ＤＮＡ、又はより一般的にはＲＮＡにおいて形成され得る。また、その構造は、ヘアピン又はヘアピンループとして知られており、通常、連続配列内のステム及び（末端）ループからなり、前記ステムは、ステムループ構造のループを構築する一種のスペーサーとしての短い配列によって分断されている２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列によって形成される。前記２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列は、例えば、ステムループエレメント、ステム１及びステム２として定義することができる。ステムループは、これら２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列（例えば、ステムループエレメント、ステム１及びステム２）が互いに塩基対を形成するときに形成されて、連続配列におけるステムループエレメント、ステム１とステム２との間に位置する短い配列によって形成される不対ループを末端に含む二本鎖核酸配列を生じさせる。したがって、不対ループは、典型的に、これらステムループエレメントのいずれとも塩基対合することができない核酸の領域を表す。得られるロリポップ形構造は、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素である。したがって、ステムループ構造の形成は、得られるステム及びループ領域の安定性に依存し、第１の必要条件は、典型的に、折り重ねられて対合二本鎖を形成することができる配列の存在である。対合ステムループエレメントの安定性は、対合領域の長さ、含まれているミスマッチ又はバルジの数（特に、長い二本鎖では、少数のミスマッチは典型的に許容可能である）、及び塩基組成によって決定される。本発明では、最適なループ長は、３塩基〜１０塩基、より好ましくは３塩基〜８塩基、３塩基〜７塩基、３塩基〜６塩基、又は更により好ましくは４塩基〜５塩基、最も好ましくは４塩基である。
ヒストンステムループ配列の一例は、配列番号１，３９４に係る配列（ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ）又は対応するＲＮＡ配列である。
したがって、幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、（ａ．）本明細書に記載する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；（ｂ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレームと；例えば、配列番号１，３９４に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよく又はからなっていてもよい少なくとも１つのヒストンステムループであって、好ましくは、配列番号１，３９４に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が、保存されている、即ち、配列番号１，３９４の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチドと同一である少なくとも１つのヒストンステムループとを含む。
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、更なるエレメント（例えば、５’−キャップ、ポリ（Ｃ）配列、及び／又はＩＲＥＳモチーフ）を含む。５’−キャップは、転写後にＲＮＡの５’末端に付加してよい。更に、本発明の人工核酸分子は、特に核酸がｍＲＮＡの形態であるか又はｍＲＮＡをコードしている場合、少なくとも１０個のシチジン、好ましくは少なくとも２０個のシチジン、より好ましくは少なくとも３０個のシチジンの配列（所謂「ポリ（Ｃ）配列」）によって修飾されてよい。具体的には、本発明の核酸分子は、特に核酸が（ｍ）ＲＮＡの形態であるか又はｍＲＮＡをコードしている場合、典型的に約１０シチジンヌクレオチド〜約２００シチジンヌクレオチド、好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約１００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約７０シチジンヌクレオチド、又は更により好ましくは約２０シチジンヌクレオチド〜約５０シチジンヌクレオチド、又は更には２０シチジンヌクレオチド〜３０シチジンヌクレオチドのポリ（Ｃ）配列を含有していてよい。
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列又はＩＲＥＳモチーフは、例えば、人工核酸分子が２以上のペプチド又はタンパク質をコードしている場合、幾つかのオープンリーディングフレームを分離することができる。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡが２シストロン性又は多シストロン性のＲＮＡである場合、特に有用であり得る。
更に、人工核酸分子は、プロモーター含有配列等の更なる５’エレメントを含んでいてよい。プロモーターは、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係る人工ＤＮＡ分子の転写を駆動及び／又は制御することができる。
好ましい実施形態では、本発明は、５’から３’方向に、以下の構造のうちの少なくとも１つを含む人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡ分子を提供する：
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲエレメント−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列。
好ましくは、人工核酸分子、好ましくはオープンリーディングフレームは、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されている。したがって、本発明の人工核酸分子は、前記分子のＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を改変することによって熱力学的に安定化させることができる。好ましくは遺伝コードの縮重を用いることによって、相当する野生型配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量と比べて本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させてよい。したがって、核酸分子のコードされているアミノ酸配列は、好ましくは、特定の野生型配列のコードされているアミノ酸配列と比べて、Ｇ／Ｃ改変によって改変されないことが好ましい。したがって、翻訳されるアミノ酸配列を維持しながら含まれるＧ／Ｃヌクレオチドの量が増えるように、野生型コード配列と比べてコード配列又は核酸分子全体（例えば、ｍＲＮＡ）のコドンを変化させてよい。幾つかのコドンが１つの同じアミノ酸をコードしている（所謂、遺伝コードの縮重）という事実に関連して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（所謂、代替コドンの利用）。
本明細書に定義する本発明の核酸分子のコード領域によってコードされているアミノ酸によっては、その野生型コード領域に対して、核酸配列、例えばコード領域を様々に改変できる可能性がある。Ｇ又はＣヌクレオチドのみを含有するコドンによってコードされているアミノ酸の場合、コドンを改変する必要はない。したがって、Ｐｒｏ（ＣＣＣ又はＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ又はＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣ又はＧＣＧ）、及びＧｌｙ（ＧＧＣ又はＧＧＧ）のコドンは、ＡもＵ／Ｔも存在しないので、改変する必要がない。
対照的に、Ａ及び／又はＵ／Ｔヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードしているがＡ及び／又はＵ／Ｔを含有していない他のコドンで置換することによって改変してよい。その例は、以下の通りである：
Ｐｒｏのコドンは、ＣＣ（Ｕ／Ｔ）又はＣＣＡからＣＣＣ又はＣＣＧに改変してよい；
Ａｒｇのコドンは、ＣＧ（Ｕ／Ｔ）又はＣＧＡ又はＡＧＡ又はＡＧＧからＣＧＣ又はＣＧＧに改変してよい；
Ａｌａのコドンは、ＧＣ（Ｕ／Ｔ）又はＧＣＡからＧＣＣ又はＧＣＧに改変してよい；
Ｇｌｙのコドンは、ＧＧ（Ｕ／Ｔ）又はＧＧＡからＧＧＣ又はＧＧＧに改変してよい。
他の場合、Ａ又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドをコドンからなくすことはできないが、Ａ及び／又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドの含量が低いコドンを使用することによってＡ及び（Ｕ／Ｔ）含量を減少させることができる。その例は、以下の通りである：
Ｐｈｅのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｌｅｕのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ａ、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｇ、Ｃ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＣ（Ｕ／Ｔ）ＡからＣ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＣ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ｓｅｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｃ（Ｕ／Ｔ）又は（Ｕ／Ｔ）ＣＡ又はＡＧ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＣＣ、（Ｕ／Ｔ）ＣＧ又はＡＧＣに改変してよい；
Ｔｙｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ａ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＡＣに改変してよい；
Ｃｙｓのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｇ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＧＣに改変してよい；
Ｈｉｓのコドンは、ＣＡ（Ｕ／Ｔ）からＣＡＣに改変してよい；
Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに改変してよい；
Ｉｌｅのコドンは、Ａ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＡ（Ｕ／Ｔ）ＡからＡ（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｔｈｒのコドンは、ＡＣ（Ｕ／Ｔ）又はＡＣＡからＡＣＣ又はＡＣＧに改変してよい；
Ａｓｎのコドンは、ＡＡ（Ｕ／Ｔ）からＡＡＣに改変してよい；
Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに改変してよい；
Ｖａｌのコドンは、Ｇ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＧ（Ｕ／Ｔ）ＡからＧ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＧ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ａｓｐのコドンは、ＧＡ（Ｕ／Ｔ）からＧＡＣに改変してよい；
Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに改変してよい；
終止コドン（Ｕ／Ｔ）ＡＡは、（Ｕ／Ｔ）ＡＧ又は（Ｕ／Ｔ）ＧＡに改変してよい。
他方、Ｍｅｔ（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）及びＴｒｐ（（Ｕ／Ｔ）ＧＧ）のコドンの場合、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに配列を改変することはできない。
上記置換は、その特定の野生型オープンリーディングフレーム（即ち、オリジナル配列）と比べて、本明細書に定義する本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させるために個々に又は全ての可能な組み合わせで用いることができる。したがって、例えば、野生型配列に存在するＴｈｒの全てのコドンをＡＣＣ（又はＡＣＧ）に改変してもよい。
本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量は、野生型コード領域のＧ／Ｃ含量と比べて、少なくとも７％、好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増加させる。特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、又はその断片、変異体、若しくは誘導体のオープンリーディングフレームにおける置換可能なコドンのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は更には１００％を置換して、前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させる。
これに関連して、本明細書に定義する本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を、野生型オープンリーディングフレームと比べて最大限（即ち、置換可能なコドンの１００％）増加させることが特に好ましい。
更に、オープンリーディングフレームは、好ましくは、少なくとも部分的にコドンが最適化されている。コドンの最適化は、細胞内のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発生頻度が異なることによって翻訳効率が決定され得るという知見に基づいている。したがって、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域に所謂「レアコドン」が存在している場合、前記レアコドンに相当する改変核酸配列は、比較的「高頻度の」ｔＲＮＡをコードしているコドンが存在する場合よりも翻訳効率が低くなる確率が高い。
したがって、本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームは、好ましくは、細胞内で比較的レアなｔＲＮＡをコードしている野生型配列のうちの少なくとも１つのコドンが、細胞内で比較的高頻度で存在するｔＲＮＡをコードしており且つ前記比較的レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換されるように、相当する野生型コード領域に対して改変される。この改変により、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、高頻度で存在するｔＲＮＡを利用可能なコドンが、レアなｔＲＮＡに対応するコドンに置き換わることができるように改変される。言い換えれば、本発明によれば、この改変により、レアなｔＲＮＡをコードしている野生型オープンリーディングフレームの全てのコドンを、細胞内においてより高頻度で存在し且つ前記レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換してよい。どのｔＲＮＡが細胞内で比較的高頻度で存在するか、及び対照的にどのｔＲＮＡが比較的低頻度で存在するかは、当業者に公知である。例えば、Ａｋａｓｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２００１，１１（６）：６６０−６６６を参照されたい。したがって、好ましくは、オープンリーディングフレームは、好ましくは本発明に係る核酸分子が発現する系に関して、好ましくは本発明に係る核酸分子が翻訳される系に関して、コドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームのコドン使用頻度は、哺乳類のコドン使用頻度、より好ましくはヒトのコドン使用頻度に従ってコドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームは、コドンが最適化されており且つＧ／Ｃ含量が改変されている。
分解耐性、例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによるインビボ分解に対する耐性を更に改善するために、及び／又は本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生を更に改善するために、人工核酸分子は、骨格修飾、糖修飾、及び／又は塩基修飾、例えば、脂質修飾等の修飾を更に含んでいてよい。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の転写及び／又は翻訳は、前記修飾によって殆ど損なわれない。
本発明において用いることができるヌクレオチドアナログ／修飾は、例えば、２−アミノ−６−クロロプリンリボサイド−５’−トリホスフェート、２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２−チオシチジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスフェート、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、５−メチルウリジン−５’−トリホスフェート、６−アザシチジン−５’−トリホスフェート、６−アザウリジン−５’−トリホスフェート、６−クロロプリンリボサイド−５’−トリホスフェート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、８−アザアデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスフェート、ベンズイミダゾール−リボサイド−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、プソイドウリジン−５’−トリホスフェート、又はピューロマイシン−５’−トリホスフェート、キサントシン−５’−トリホスフェートから選択してよい。特に好ましくは、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、及びプソイドウリジン−５’−トリホスフェートからなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドである。
更に、脂質修飾人工核酸分子は、典型的に、人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つのリンカーと、このリンカーと共有結合している少なくとも１つの脂質とを含んでいてよい。或いは、脂質修飾人工核酸分子は、本明細書に定義する少なくとも１つの人工核酸分子と、好ましくはリンカーを介さずに前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つの好ましくは二官能性の脂質とを含んでいてよい。第３の選択肢によれば、脂質修飾人工核酸分子は、本明細書に定義する人工核酸分子と、前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つのリンカーと、このリンカーと共有結合している少なくとも１つの脂質と、更に、好ましくはリンカーを介さずに前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つの好ましくは二官能性の脂質とを含んでいてよい。
更なる態様では、本発明は、
ａ． ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又はＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
ｂ． 少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又はクローニングサイトと、
ｃ． 任意で、脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲ、又は脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと
を含むベクターを提供する。
少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、任意の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント、及び少なくとも１つのＯＲＦは、本発明に係る人工核酸分子について本明細書に記載する通りである。クローニングサイトは、オープンリーディングフレームを導入するのに好適な任意の配列又はオープンリーディングフレームを含む配列、例えば、１以上の制限酵素部位等であってよい。クローニングサイトを含むベクターは、好ましくは、５’ＵＴＲエレメントの３’側、好ましくは５’ＵＴＲエレメントの直ぐ３’側にオープンリーディングフレームを挿入するのに好適である。したがって、クローニングサイトを含むベクターは、好ましくは、オープンリーディングフレームをベクターに挿入するのに好適である。好ましくは、５’ＵＴＲエレメントと任意の３’ＵＴＲエレメントとの間、好ましくは、任意の３’ＵＴＲエレメントの５’側且つ５’ＵＴＲエレメントの３’側に挿入するのに好適である。好ましくは、クローニングサイト又はＯＲＦは、好ましくは３’ＵＴＲエレメントの５’末端に近接して、３’ＵＴＲエレメントの５’側に位置する。例えば、クローニングサイト又はＯＲＦは、３’ＵＴＲエレメントの５’末端に直接連結していてもよく、本発明に係る人工核酸分子について上記した通り一続きのヌクレオチド（例えば、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等）を介して連結していてもよい。好ましくは、クローニングサイト又はＯＲＦは、好ましくは５’ＵＴＲエレメントの３’末端に近接して、５’ＵＴＲエレメントの３’側に位置する。例えば、クローニングサイト又はＯＲＦは、５’ＵＴＲエレメントの３’末端に直接連結していてもよく、本発明に係る人工核酸分子について上記した通り一続きのヌクレオチド（例えば、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等）を介して連結していてもよい。
好ましくは、本発明に係るベクターは、例えば、任意でオープンリーディングフレーム又はオープンリーディングフレームを含む配列をベクターに挿入し、前記ベクターを転写することによって、本発明に係る人工核酸分子を作製するのに、好ましくは、本発明に係る人工ｍＲＮＡを作製するのに好適である。したがって、好ましくは、ベクターは、プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）等の転写に必要なエレメントを含む。好ましくは、ベクターは、真核生物、原核生物、ウイルス若しくはファージの転写系（例えば、真核細胞、原核細胞等）、又は真核生物、原核生物、ウイルス、若しくはファージのインビトロ転写系を用いる転写に好適である。したがって、例えば、ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ（例えば、真核生物、原核生物、ウイルス、又はファージのＲＮＡポリメラーゼ）によって認識されるプロモーター配列を含んでいてよい。好ましい実施形態では、ベクターは、ＳＰ６又はＴ７等のファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、好ましくはＴ７プロモーターを含む。好ましくは、ベクターは、ファージに基づくインビトロ転写系（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基づくインビトロ転写系等）を用いるインビトロ転写に好適である。
ベクターは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを更に含んでいてよい。
ベクターは、ＲＮＡベクターであってもよく、ＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡベクターである。ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクター等の当業者に公知の任意のベクターであってよい。好ましくは、ベクターは、プラスミドベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドベクターである。
好ましい実施形態では、本発明に係るベクターは、本発明に係る人工核酸分子を含む。
好ましくは、本発明に係るベクターは、配列番号１〜１，３６３、１，３９５、１，４２１、１，４２２、１，３６８、又は１，４１２〜１，４２０に係る配列、或いは配列番号１〜１，３６３、１，３９５、１，４２１、１，４２２、１，３６８、又は１，４１２〜１，４２０のいずれか１つに係る配列、又はこれらの断片、好ましくはこれらの機能的断片、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％；更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
好ましくは、本発明に係るベクター（例えば、ＤＮＡベクター）は、配列番号１，３６８〜１，３９２又は１，４１２〜１，４２０に係る配列、或いは配列番号１，３６８〜１，３９２又は１，４１２〜１，４２０のいずれか１つに係る配列、又はこれらの断片、好ましくはこれらの機能的断片、又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％；更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
好ましくは、ベクターは、環状分子である。好ましくは、ベクターは、二本鎖ＤＮＡ分子等の二本鎖分子である。かかる環状の、好ましくは二本鎖のＤＮＡ分子は、本発明の人工核酸分子の保管形態として便利に用いることができる。更に、細胞、例えば培養細胞のトランスフェクションに用いることができる。また、本発明に係る人工ＲＮＡ分子を得るためのインビトロ転写に用いることができる。
好ましくは、ベクター、好ましくは環状ベクターは、例えば、制限酵素で切断することによって線形にすることができる。好ましい実施形態では、ベクターは、ＯＲＦの直ぐ３’側、又は（存在する場合）３’ＵＴＲエレメントの直ぐ３’側、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルの直ぐ３’側、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の３’側、又は（存在する場合）ヒストンステムループの３’側に位置する制限酵素部位等の切断部位、好ましくは唯一の切断部位を含む。したがって、好ましくは、ベクターの線形化によって得られる生成物は、３’末端において、終止コドン、又は（存在する場合）３’ＵＴＲエレメントの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列の３’末端、又はポリアデニル化シグナルの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の３’末端、又は（存在する場合）ヒストンステムループの３’末端に加えて、任意で切断後の制限酵素部位の残りの幾つかの任意のヌクレオチドで終結する。
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターを含む細胞に関する。前記細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、脊椎動物細胞、例えば哺乳類細胞等の任意の細胞であってよい。前記細胞は、例えば、細菌細胞において本発明のベクターを複製するために用いることができる。更に、前記細胞は、本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターを転写するため、及び／又は本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターのオープンリーディングフレームを翻訳するために用いることができる。例えば、前記細胞は、組み換えタンパク質を産生するために用いることができる。
本発明に係る細胞は、例えば、標準的なトランスフェクション法等の標準的な核酸移入法によって得ることができる。例えば、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクション等によって細胞に移入してよい。
好ましくは、前記細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト被験体、家畜、実験動物（例えば、マウス又はラット）の細胞等である。好ましくは、前記細胞は、ヒトの細胞である。前記細胞は、確立されている細胞株の細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、ＨＥＬＡ、ＨＥＫ等の細胞であってもよく、一次細胞、例えば、ＨＤＦ細胞であってもよい。好ましくは、生物から単離された細胞である。好ましい実施形態では、前記細胞は、哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の単離細胞である。例えば、前記細胞は、好ましくは哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の免疫細胞（例えば、樹状細胞）、癌細胞若しくは腫瘍細胞、又は任意の体細胞等であってよい。
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、又は本発明に係る細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子ワクチン接種用のワクチンとして用いてよい。したがって、ＯＲＦは、ワクチン接種のために患者に投与される抗原をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、ワクチンである。更に、本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子治療に用いることができる。
好ましくは、医薬組成物は、更に、１以上の薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル、充填剤、及び／又は希釈剤を含んでいてよい。本発明では、薬学的に許容できるビヒクルは、典型的に、本発明の医薬組成物用の液体又は非液体の基剤を含む。１つの実施形態では、医薬組成物は、液体形態で提供される。これに関連して、前記ビヒクルは、好ましくは、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸、クエン酸等のバッファ溶液等の水に基づく。バッファは、特定のレファレンス媒体に対して高張、等張、又は低張であってよい。即ち、前記バッファは、特定のレファレンス媒体に対してより高い、同一の、又はより低い塩含量を有してよく、好ましくは、浸透圧又は他の濃度効果により哺乳類細胞を損傷させない濃度の前述の塩を用いてよい。レファレンス媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、又は他の体液等の「インビボ」法で用いられる液体であるか、或いは一般的なバッファ若しくは液体等の「インビトロ」法でレファレンス媒体として用いることができる液体である。かかる一般的なバッファ又は液体は、当業者に公知である。乳酸リンゲル液が、液体基剤として特に好ましい。
本発明の医薬組成物のために、患者に投与するのに適している１以上の相溶性の固体又は液体の充填剤又は希釈剤、或いは封入化合物を同様に用いてもよい。用語「相溶性」とは、本明細書で使用するとき、好ましくは、典型的な使用条件下で本発明の医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低減させる相互作用が生じないように、本発明の医薬組成物のこれら成分と本明細書に定義する本発明の核酸、ベクター、又は細胞とを混合できることを意味する。
本発明に係る医薬組成物は、任意で、１以上の更なる医薬活性成分を更に含んでいてよい。これに関連して医薬活性成分とは、特定の適応症又は疾患を治癒させる、寛解させる、又は予防する治療効果を示す化合物である。前記化合物としては、限定するものではないが、ペプチド又はタンパク質、核酸、（治療的に活性のある）低分子量の有機化合物又は無機化合物（分子量：５，０００未満、好ましくは１，０００未満）、糖類、抗原又は抗体、関連技術において既に知られている治療剤、抗原細胞、抗原細胞断片、細胞画分、細胞壁成分（例えば、多糖類）、（例えば、化学的に又は放射線照射により）改変、弱毒化、又は不活化された病原体（ウイルス、細菌等）等が挙げられる。
更に、本発明の医薬組成物は、人工核酸分子又はベクター用の担体を含んでいてよい。かかる担体は、医薬的に活性のある人工核酸分子又はベクターの生理学的に許容できる液体への溶解、輸送及び細胞内取り込みを媒介するのに好適であり得る。したがって、かかる担体は、本発明に係る人工核酸分子又はベクターのデポー製剤及び送達に好適であり得る成分であってよい。かかる成分は、例えば、トランスフェクション剤又は複合体化剤として機能し得るカチオン性又はポリカチオン性の担体又は化合物であってよい。
これに関連して、特に好ましいトランスフェクション剤又は複合体化剤は、カチオン性又はポリカチオン性の化合物であり、例えば、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン若しくはスペルミジン、又は他のカチオン性のペプチド又はタンパク質（例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチド又はアナログペプチドを含む）、ＨＳＶ ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リシンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特にショウジョウバエのアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、又はヒストン）が挙げられる。
更に、かかるカチオン性又はポリカチオン性の化合物又は担体は、好ましくは少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているカチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。好ましくは、カチオン性又はポリカチオン性の担体は、以下の合計式（Ｉ）を有するカチオン性ペプチドから選択される：
｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝；式（Ｉ）
（式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘは、３〜１００であり、ｌ、ｍ、ｎ、又はｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、及び９１〜１００から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％であり；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＯｒｎを除くネイティブ（即ち、自然界に存在する）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり；ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ｘａａの総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の９０％を超えない）。アミノ酸Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、及びＸａａはいずれも、ペプチドの任意の位置に位置してよい。これに関連して、７アミノ酸〜３０アミノ酸のカチオン性ペプチド又はタンパク質が特に好ましい。
更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質は、上に示す通り、式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝（式（Ｉ））に従って定義され、少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているとき、限定されるものではないが、部分式（Ｉａ）から選択してよい：
｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ’）ｘ（Ｃｙｓ）ｙ｝ 部分式（Ｉａ）
（式中、（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；及びｘは、本明細書に定義する通りであり、Ｘａａ’は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、又はＣｙｓを除くネイティブ（即ち、自然界に存在する）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり、ｙは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％である）。更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチドは、部分式（Ｉｂ）から選択してよい：
Ｃｙｓ１｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝Ｃｙｓ２ 部分式（Ｉｂ）
（式中、経験式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝（式（ＩＩＩ））は、本明細書に定義する通りであり、（半経験）式（ＩＩＩ）に係るアミノ酸配列のコアを形成し、Ｃｙｓ１及びＣｙｓ２は、（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘに近接するか又は末端に存在するシステインである）。
トランスフェクション剤又は複合体化剤として用いることができる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性多糖類（例えば、キトサン）、ポリブレン、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー（例えば、β−アミノ酸ポリマー又は逆ポリアミド等の修飾ポリアミノ酸；ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））等の修飾ポリエチレン；ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルメタクリレート））等の修飾アクリレート；ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等の修飾アミドアミン；ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）；ポリプロピルアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭ系デンドリマー等のデンドリマー；ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等のポリイミン；ポリアリルアミン；シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサン等の糖骨格系ポリマー；ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー等のシラン骨格系ポリマー）、１以上のカチオン性ブロック（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）と１以上の親水性又は疎水性のブロックとの組み合わせからなるブロックポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）等を含んでいてよい。
これに関連して、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターは、カチオン性又はポリカチオン性の化合物、好ましくはカチオン性のタンパク質又はペプチドと少なくとも部分的に複合体化することが特に好ましい。部分的にとは、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターの一部のみがカチオン性又はポリカチオン性の化合物と複合体化し、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターの残りは、複合体化していない（「遊離」）形態であることを意味する。好ましくは、複合体化核酸の遊離核酸に対する比は、約５：１（ｗ／ｗ）〜約１：１０（ｗ／ｗ）、より好ましくは約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：８（ｗ／ｗ）、更により好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：５（ｗ／ｗ）又は１：３（ｗ／ｗ）の範囲から選択され、最も好ましくは、複合体化核酸の遊離核酸に対する比は、約１：１（ｗ／ｗ）の比から選択される。
本発明に係る医薬組成物は、任意で、１以上のアジュバント、例えば、自然免疫系を刺激するため又は人工核酸分子若しくはベクターの細胞内取り込みを強化するためのアジュバントを更に含んでいてよい。これに関連して、アジュバントは、自然免疫系の免疫応答、即ち、非特異的免疫応答を開始させたり増加させたりするのに好適な任意の化合物として理解してよい。言い換えれば、投与したとき、本発明の医薬組成物は、好ましくは、任意で前記医薬組成物に含有されるアジュバントにより、自然免疫応答を誘発する。好ましくは、かかるアジュバントは、哺乳類において自然免疫応答の誘導を補助するアジュバントであってよい。かかるアジュバントは、免疫賦活性核酸（即ち、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体等に結合し得る核酸）、好ましくは、免疫賦活性ＲＮＡであってよい。
かかるアジュバント、好ましくはかかる免疫賦活性核酸は、医薬組成物の人工核酸分子、好ましくはワクチンによってコードされているペプチド又はタンパク質（即ち、抗原）に対する特異的免疫応答（即ち、適応免疫応答）を補助することができる自然免疫応答（即ち、非特異的免疫応答）を誘導することができる。
また、本発明の医薬組成物は、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対する（リガンドとしての）結合親和性に起因して、又はマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２若しくはＴＬＲ１３に対する（リガンドとしての）結合親和性に起因して免疫賦活性であることが知られている任意の更なる化合物を更に含有していてもよい。
本発明の医薬組成物に含まれ得る更なる添加剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等の乳化剤；例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤；着色剤；風味付与剤；医薬担体；打錠剤；安定剤；酸化防止剤；保存剤である。
本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、「安全且つ有効な量」の医薬組成物の成分、特に、本明細書に定義する本発明の核酸配列、ベクター、及び／又は細胞を含む。本明細書で使用するとき、「安全且つ有効な量」とは、本明細書に定義する疾患又は疾病の好ましい変化を著しく誘導するのに十分である量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、好ましくは、重篤な副作用を避け、且つ利益とリスクとの間の道理に適った関係を可能にする。これらの限度は、典型的に、道理に適った医学的判断の範囲内で決定される。
更なる態様では、本発明は、医薬として、例えば（遺伝子ワクチン接種における）ワクチンとして、又は遺伝子治療において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療作用又は効果を利用するか或いは特定のペプチド又はタンパク質の追加が必要である任意の医学的用途に特に好適である。したがって、本発明は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療作用又は効果によって治療することができるか、或いは特定のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の追加によって治療することができる疾患又は疾病の治療又は予防において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。例えば、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療によって、遺伝性疾患、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患、感染性疾患、慢性疾患等を治療又は予防するために用いることができる。
特に、５’ＵＴＲエレメントを任意で３’ＵＴＲエレメントと組み合わせるとＯＲＦからのタンパク質発現を増加させ、また、３’ＵＴＲエレメントが、本発明の核酸分子のＯＲＦを安定的に長期に亘って発現させるので、治療を受ける被験体において治療用のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が安定的に、長期に亘り及び／又は多量に存在することから利益を得るかかる治療的処置は、本発明に関連する医学的用途に特に好適である。したがって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物に特に好適な医学的用途は、例えば、感染症又は腫瘍に対するワクチン接種である。したがって、本発明は、被験体、好ましくは哺乳類の被験体、より好ましくはヒトの被験体のワクチン接種のための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。好ましいワクチン接種処理は、細菌、原生動物、又はウイルスによる感染症等の感染性疾患に対するワクチン接種、及び抗腫瘍ワクチン接種である。かかるワクチン接種処理は、予防的であってもよく、治療的であってもよい。
治療又は予防される疾患に応じてＯＲＦを選択してよい。例えば、オープンリーディングフレームは、遺伝性疾患に罹患している患者等、タンパク質が完全に欠失しているか又は機能が少なくとも部分的に喪失している患者に供給すべきタンパク質をコードしていてよい。更に、オープンリーディングフレームは、被験体の疾患又は症状に有益な影響を与えるペプチド又はタンパク質をコードしているＯＲＦから選択してよい。更に、オープンリーディングフレームは、天然のペプチド若しくはタンパク質の病的過剰産生をダウンレギュレートするか又は病的にタンパク質若しくはペプチドを発現する細胞を除去するペプチド又はタンパク質をコードしていてもよい。かかる欠失、機能喪失、又は過剰産生は、例えば、腫瘍及び新生物、自己免疫疾患、アレルギー、感染症、慢性疾患等に関連して生じる場合がある。更に、オープンリーディングフレームは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍抗原のエピトープ）をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍関連抗原のエピトープ）と、上記５’ＵＴＲエレメントと、任意で上記３’ＵＴＲエレメント及び／又はポリ（Ａ）配列等の更なる成分とを含むか又はからなるアミノ酸配列をコードしているＯＲＦを含む。
医学的用途に関連して、特に、ワクチン接種に関連して、ＤＮＡは、抗ＤＮＡ免疫応答を誘発するリスクを有し且つゲノムＤＮＡに挿入される傾向を有するので、本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであることが好ましい。しかし、幾つかの実施形態では、例えば、アデノウイルス送達ビヒクル等のウイルス送達ビヒクルを、例えば、遺伝子治療的処置において本発明に係る人工核酸分子又はベクターを送達するために用いる場合、人工核酸分子又はベクターがＤＮＡ分子であることが望ましい場合もある。
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、又は埋め込まれたレザーバを介して投与してよい。本明細書で使用するとき、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を含む。
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、非経口的に、例えば非経口注射によって投与され、より好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を介して投与される。皮内及び筋肉内への注射が特に好ましい。本発明の医薬組成物の滅菌注射用形態は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これら懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤とを用いて当技術分野において公知の技術に従って製剤され得る。
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない任意の経口的に許容できる剤形で経口投与してよい。
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば、皮膚又は任意の他のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む、局所塗布によって容易にアクセス可能な領域又は器官が治療標的に含まれる場合は特に、局所投与してもよい。これら領域又は器官のそれぞれについて、好適な局所製剤は容易に調製される。局所塗布については、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を、１以上の担体に懸濁又は溶解している好適な軟膏に製剤してよい。
１つの実施形態では、医薬としての使用は、哺乳類細胞のトランスフェクション、好ましくは哺乳類細胞のインビトロトランスフェクション、より好ましくは前記医薬により治療される被験体の単離細胞のインビトロトランスフェクションの工程を含む。前記使用が単離細胞のインビトロトランスフェクションを含む場合、医薬としての使用は、トランスフェクトされた細胞を患者に（再）投与することを更に含んでいてよい。医薬としての本発明の人工核酸分子又はベクターの使用は、トランスフェクションに成功した単離細胞を選択する工程を更に含んでいてよい。したがって、ベクターが選択マーカーを更に含むことが有益である場合がある。また、前記医薬としての使用は、単離細胞のインビトロトランスフェクションと、前記細胞からの発現産物（即ち、コードされているペプチド又はタンパク質）の精製とを含んでいてよい。この精製ペプチド又はタンパク質は、後に、それを必要としている被験体に投与してよい。
また、本発明は、上記疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含む方法を提供する。
更に、本発明は、疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターで細胞をトランスフェクトすることを含む方法を提供する。トランスフェクションは、インビトロで実施してもよく、インビボで実施してもよい。好ましい実施形態では、細胞のトランスフェクションは、インビボで実施され、トランスフェクトされた細胞は、それを必要としている被験体、好ましくはヒト被験体に投与される。好ましくは、インビトロでトランスフェクトされる細胞は、被験体、好ましくはヒト患者の単離細胞である。したがって、本発明は、被験体、好ましくはヒト患者から細胞を単離する工程と、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターで前記単離細胞をトランスフェクトする工程と、前記トランスフェクトされた細胞を前記被験体、好ましくは前記ヒト患者に投与する工程とを含む治療方法を提供する。
本発明に係る疾患を治療又は予防する方法は、好ましくは、上記ワクチン接種方法及び／又は遺伝子治療方法である。
上記の通り、５’ＵＴＲエレメント及び任意の３’ＵＴＲエレメントは、５’ＵＴＲエレメント及びＯＲＦを含む人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ又はベクター等）からのタンパク質産生を増加させることができる。したがって、更なる態様では、本発明は、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる方法であって、前記人工核酸分子（好ましくは、前記人工核酸分子内に含まれるＯＲＦ）と、（ｉ）ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又は上記ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲエレメント）、及び（ｉｉ）任意で、例えば、脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲに由来するか、又は上記脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントとを結合させる工程を含む方法に関する。
用語「人工核酸分子又はベクターと５’ＵＴＲエレメント、及び任意の３’ＵＴＲエレメントとを結合させる」とは、人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ又はベクター）と、５’ＵＴＲエレメント及び任意の３’ＵＴＲエレメントとを機能的に結合させるか又は機能的に組み合わせることを意味する。これは、人工核酸分子、好ましくは前記人工核酸分子内に含まれるＯＲＦと、５’ＵＴＲエレメントと、任意の３’ＵＴＲエレメントとを、５’ＵＴＲエレメント及び任意の３’ＵＴＲエレメントの機能（例えば、タンパク質産生を増加させる機能）が発揮されるように結合又はカップリングすることを意味する。典型的に、これは、オープンリーディングフレームが、５’ＵＴＲエレメントの３’側、好ましくは５’ＵＴＲエレメントと任意の３’ＵＴＲエレメントとの間に位置するように、５’ＵＴＲエレメント及び任意の３’ＵＴＲエレメントが人工核酸分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）又はベクターに組み込まれることを意味する。
更なる態様では、本発明は、人工核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）又はベクターからのタンパク質産生を増加させるための、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来するか又は上記ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲエレメント）、及び任意で、脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲに由来するか、上記脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントの使用を提供する。
本発明に係る使用は、好ましくは、上記の通り、人工核酸分子と、５’ＵＴＲエレメント及び任意の３’ＵＴＲエレメントとを結合させることを含む。
また、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる方法及び上記使用は、人工核酸分子を１以上の更なるエレメント（例えば、上記ポリアデニル化シグナル、ポリ（Ａ）配列、ポリ（Ｃ）配列、及び／又はヒストンステムループ）と結合させることを含んでいてよい。
また、本発明の医薬組成物の化合物及び成分は、互いに別々に製造及び取引してもよい。したがって、本発明は、更に、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、及び／又は本発明に係る医薬組成物を含むキット又はキットオブパーツに関する。好ましくは、かかるキット又はキットオブパーツは、更に、使用説明書；トランスフェクション用の細胞；アジュバント；医薬組成物の投与手段；人工核酸分子、ベクター、細胞、又は医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び／又は薬学的に許容できる溶液を含んでいてよい。
配列番号１〜１，３６３、１，３９５、１，４２１、及び１，４２２ ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲを含む配列
配列番号１，３６４ ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３６５ ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３６６ ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３６７ ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３６８ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’ＵＴＲ
配列番号１，３６９ ヒトアルブミン３’ＵＴＲ
配列番号１，３７０ ヒトヘモグロビン、アルファ１（ＨＢＡ１）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７１ ヒトヘモグロビン、アルファ２（ＨＢＡ２）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７２ ヒトヘモグロビン、ベータ（ＨＢＢ）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７３ ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７４ ヒトアラキドン酸１５−リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ１５）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７５ ヒトコラーゲンＩ型アルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７６ アルブミン７の３’ＵＴＲ
配列番号１，３７７ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ＋ポリ（Ａ）配列
配列番号１，３７８ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１
配列番号１，３７９ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片２
配列番号１，３８０ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片３
配列番号１，３８１ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片４
配列番号１，３８２ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片５
配列番号１，３８３ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片６
配列番号１，３８４ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片７
配列番号１，３８５ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片８
配列番号１，３８６ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片９
配列番号１，３８７ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１０
配列番号１，３８８ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１１
配列番号１，３８９ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１２
配列番号１，３９０ ヒトアルブミンの３’ＵＴＲ断片１３
配列番号１，３９１ アルブミン７の３’ＵＴＲ−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列−ＨＬ
配列番号１，３９２ アルブミン７の３’ＵＴＲ−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列
配列番号１，３９３ α−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲの中央のα複合体結合部分
配列番号１，３９４ ヒストンステムループ
配列番号１，３９６ ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３９７ ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３９８ ＡＴＰ５Ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３９９ ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４００ ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０１ ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０２ ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０３ ｍＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０４ ｍＲＰＬ３５Ａ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０５ ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０６ ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０７ ＡＴＰ５Ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０８ ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０９ ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４１０ ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４１１ ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４１２ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ３５（ＲＰＬ３５）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４１３ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトリボソームタンパク質ラージ２１（ＲＰＬ２１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４１４ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＡＴＰシンターゼ、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ１複合体アルファサブユニット１、心筋（ＡＴＰ５Ａ１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４１５ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４１６ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトアンドロゲン誘導１（ＡＩＧ１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４１７ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトシトクロームｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ（ＣＯＸ６Ｃ）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４１８ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないヒトＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１（ＡＳＡＨ１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４１９ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないマウスリボソームタンパク質ラージ２１（ｍＲＰＬ２１）の５’ＵＴＲ
配列番号１，４２０ ５’末端オリゴピリミジン領域を有しないマウスリボソームタンパク質ラージ３５Ａ（ｍＲＰＬ３５Ａ）の５’ＵＴＲ
１． ＤＮＡテンプレートの調製
Ｔ７プロモーターに続いて、キタアメリカホタルルシフェラーゼをコードしているＧＣリッチ配列（ｐｐＬｕｃ（ＧＣ））及びＡ６４ポリ（Ａ）配列を含むインビトロ転写用ベクターを構築した。インビトロ転写前にベクターを線形化するために用いられる制限酵素部位をポリ（Ａ）配列に続いて配置した。インビトロ転写によってこのベクターから得られたｍＲＮＡを「ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４」と命名する。
このベクターを、オープンリーディングフレームの５’側又は３’側に非翻訳領域（それぞれ、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）を含むように改変した。要約すると、以下のｍＲＮＡコード配列を含むベクターを作製した（ｍＲＮＡコード配列は、図１〜４及び６〜２１に示す）：
配列番号１，３６４（図１）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３６５（図２）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３６６（図３）：ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３６７（図４）：ＲＰＬ３２−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３９６（図６）：ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３９７（図７）：ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３９８（図８）：ＡＴＰ５Ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，３９９（図９）：ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４００（図１０）：ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０１（図１１）：ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０２（図１２）：ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０３（図１３）：ｍＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０４（図１４）：ｍＲＰＬ３５Ａ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０５（図１５）：ＲＰＬ３５−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０６（図１６）：ＲＰＬ２１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０７（図１７）：ＡＴＰ５Ａ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０８（図１８）：ＨＳＤ１７Ｂ４−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４０９（図１９）：ＡＩＧ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４１０（図２０）：ＣＯＸ６Ｃ−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
配列番号１，４１１（図２１）：ＡＳＡＨ１−ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４
２． インビトロ転写
実施例１に係るＤＮＡテンプレートを線形化し、Ｔ７−ポリメラーゼを用いてインビトロで転写させた。次いで、ＤＮＡテンプレートをＤＮａｓｅ処理によって分解した。過剰のＮ７−メチル−グアノシン−５’−トリホスフェートー５’−グアノシンを転写反応物に添加することによって、５’−キャップ構造を含むｍＲＮＡ転写産物を得た。このようにして得られたｍＲＮＡを精製し、水に再懸濁させた。
３． ｍＲＮＡリポフェクションによるルシフェラーゼ発現
１ウェル当たり５×１０４個の細胞という密度になるようにヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を２４ウェルプレートに播種した。次の日、細胞をｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄し、次いで、ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中リポフェクタミン２０００複合体化ｐｐＬｕｃコードｍＲＮＡ（１ウェル当たり５０ｎｇ）でトランスフェクトした。コントロールとして、ｐｐＬｕｃをコードしていないｍＲＮＡを別個にリポフェクトした。トランスフェクション効率を制御するために、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（ＲｒＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡをＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした（１ウェル当たりＲｒＬｕｃ ｍＲＮＡ２０ｎｇ）。トランスフェクション開始の９０分間後、ｏｐｔｉ−ＭＥＭを培地に交換した。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、７２時間後、培地を吸引し、リシスバッファ２００μＬ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（ＨＣｌ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）に細胞を溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−２０℃で保存した。
或いは、ＨＤＦを９６ウェルプレートに播種し、３日間後に１ウェル当たり１０４個の細胞の密度でトランスフェクトした。リポフェクション直前に、ｏｐｔｉ−ＭＥＭで細胞を洗浄した。リポフェクタミン２０００と複合体化している１ウェル当たり２５ｎｇのＰｐＬｕｃコードｍＲＮＡで細胞をリポフェクトした。トランスフェクション効率を制御するためにウミシイタケルシフェラーゼ（ＲｒＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡをＰｐＬｕｃ ｍＲＮＡと共にトランスフェクトした（１ウェル当たりＲｒＬｕｃ ｍＲＮＡ２．５ｎｇ）。トランスフェクション開始の９０分間後、ｏｐｔｉ−ＭＥＭを培地に交換した。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、７２時間後に培地を吸引し、リシスバッファ１００μＬ（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ）に細胞を溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−８０℃で保存した。
４． ルシフェラーゼ測定
ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴプレートリーダーによって相対光単位（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を測定した。ＰｐＬｕｃ活性は、溶解物５０μＬ及びルシフェリンバッファ２００μＬ（７５μＭ ルシフェリン、２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８（ＮａＯＨ）、１５ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ ＡＴＰ）を用いて、１５秒間の測定時間で測定した。ＲｒＬｕｃ活性は、溶解物５０μＬ及びセレンテラジンバッファ２００μＬ（５００ｍＭ ＮａＣｌに調整したリン酸緩衝生理食塩水中４０μＭセレンテラジン）を用いて、１５秒間の測定時間で測定した。
或いは、Ｈｉｄｅｘ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎプレートリーダーによって相対光単位（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を測定した。ＰｐＬｕｃ活性は、溶解物２０μＬ及びルシフェリンバッファ５０μＬ（Ｂｅｅｔｌｅ−Ｊｕｉｃｅ，ＰＪＫ ＧｍｂＨ）を用いて、２秒間の測定時間で測定した。ＲｒＬｕｃ活性は、溶解物２０μＬ及びセレンテラジンバッファ５０μＬ（Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｊｕｉｃｅ，ＰＪＫ ＧｍｂＨ）を用いて、２秒間の測定時間で測定した。
結果
５．１ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を相乗的に増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果について調べるために、様々なＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した：ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント及びアルブミン３’ＵＴＲエレメントのいずれも有しないｍＲＮＡ、又はＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント（ＲＰＬ３２）若しくはアルブミン３’ＵＴＲエレメント（アルブミン７）のいずれかを含むｍＲＮＡ、又はＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント及びアルブミン３’ＵＴＲエレメントの両方を含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡ又はコントロールｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。コトランスフェクトしたＲｒＬｕｃのシグナルによるトランスフェクション効率に対して、ＰｐＬｕｃシグナルを補正した（以下の表１及び図５を参照）。
ルシフェラーゼは、ＴＯＰ ５’ＵＴＲもアルブミン３’ＵＴＲも有しないｍＲＮＡ（ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４Ｎ６４）から明らかに発現していた。５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼ発現を延長させ、一方、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させた。しかし、驚くべきことに、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させた。同一のｍＲＮＡにおいてＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとを組み合わせたことによるルシフェラーゼレベルの増加の程度は、これらが相乗的に作用することを示す。
両エレメントを組み合わせたｍＲＮＡから得られたシグナルを、両エレメントを有しないｍＲＮＡから得られたシグナルとＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントによるシグナル増加とアルブミン３’ＵＴＲエレメントによるシグナル増加との合計で除することによって、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの相乗作用を定量した。この計算は、３つの時点で個別に実施し、また曲線下面積（ＡＵＣ）から計算した０時間〜７２時間に発現した全タンパク質についても実施した（以下の表２を参照）。
このようにして計算した相乗作用は、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント及びアルブミン３’ＵＴＲエレメントの効果が純粋に相加的である場合に予測されるよりも、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとを組み合わせたｍＲＮＡから得られるルシフェラーゼレベルの方がどれだけ高いかを示す。ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとを組み合わせたｍＲＮＡから得られるルシフェラーゼレベルは、これらの効果が純粋に相加的である場合よりも最大２倍高かった。この結果は、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせが、タンパク質発現を著しく相乗的に増加させることを確認するものである。
５．２ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントの効果について調べるために、様々なＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡを合成した。更に、ｍＲＮＡは、アルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを含んでいた。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表３及び図２２を参照）。
ルシフェラーゼは、５’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡから明らかに発現していた。しかし、驚くべきことに、全てのＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを強く増加させた。
５．３ ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を相乗的に増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせの効果について調べるために、様々なＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡを合成した：ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント及びアルブミン３’ＵＴＲエレメントのいずれも有しないｍＲＮＡ、アルブミン３’ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡ、様々なＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントのうちの１つを含むｍＲＮＡ、又は様々なＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントのうちの１つとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの両方を含むｍＲＮＡ。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（図２３〜３０を参照）。ルシフェラーゼは、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントもアルブミン３’ＵＴＲエレメントも有しないｍＲＮＡから明らかに発現していた。５’ＵＴＲも３’ＵＴＲも有しないｍＲＮＡに比べて、アルブミン３’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを延長させ、一方、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ルシフェラーゼレベルを増加させた。しかし、驚くべきことに、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせは、個々のエレメントのいずれかでみられたレベルを遥かに超えてルシフェラーゼレベルを更に強く増加させた。同一のｍＲＮＡにおいてＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとを組み合わせたことによるルシフェラーゼレベルの増加の程度は、これらが相乗的に作用することを示す。
両エレメントを組み合わせたｍＲＮＡから得られたシグナルを、両エレメントを有しないｍＲＮＡから得られたシグナルとＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントによるシグナル増加とアルブミン３’ＵＴＲエレメントによるシグナル増加との合計で除することによって、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの相乗作用を定量した。この計算は、曲線下面積（ＡＵＣ）から計算した０時間〜７２時間に発現した全タンパク質について実施した（以下の表４を参照）。
このようにして計算した相乗作用は、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメント及びアルブミン３’ＵＴＲエレメントの効果が純粋に相加的である場合に予測されるよりも、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとを組み合わせたｍＲＮＡから得られるルシフェラーゼレベルの方がどれだけ高いかを示す。ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとを組み合わせたｍＲＮＡから得られるルシフェラーゼレベルは、これらの効果が純粋に相加的である場合よりも最大３倍高かった。この結果は、ＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントとアルブミン３’ＵＴＲエレメントとの組み合わせが、タンパク質発現を著しく相乗的に増加させることを確認するものである。
５．４ マウス遺伝子由来のＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させる
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対するマウス遺伝子由来のＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントの効果について調べるために、２つの異なるマウスＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントを有するｍＲＮＡを合成した。更に、ｍＲＮＡは、アルブミン７の３’ＵＴＲエレメントを含んでいた。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にトランスフェクトした。比較のために、ヒトＲＰＬ３２のＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントを含有するｍＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表５及び図３０を参照）。
ルシフェラーゼは、５’ＵＴＲエレメントを有しないｍＲＮＡから明らかに発現していた。マウスＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントは、両方とも、ヒトＴＯＰ５’ＵＴＲエレメントと同様にルシフェラーゼレベルを強く増加させた。
配列

Claims (38)

  1. ａ． 少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
    ｂ． 少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
    ｃ． 少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと、
    を含み、
    前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６８若しくは１，４１２〜１，４２０に係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６８若しくは１，４１２〜１，４２０に係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなり、かつ、前記配列番号１，３６８若しくは１，４１２〜１，４２０に比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じるものではなく、
    前記５’ＵＴＲエレメントが、機能的５’ＴＯＰモチーフを含有せず、
    前記３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来するか又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり、
    前記３’ＵＴＲの変異体が、前記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲと少なくとも９５％同一であり、
    前記３’ＵＴＲエレメントが、前記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じるものではないことを特徴とする人工核酸分子。
  2. 前記３’ＵＴＲエレメントが、脊椎動物のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる請求項１に記載の人工核酸分子。
  3. 前記３’ＵＴＲエレメントが、少なくとも７５ヌクレオチドの長さを有する請求項１から２のいずれかに記載の人工核酸分子。
  4. ５’ＵＴＲエレメントとオープンリーディングフレームとが、異種である請求項１から３のいずれかに記載の人工核酸分子。
  5. ５’ＵＴＲエレメントが、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させるのに好適である請求項１から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
  6. ５’ＵＴＲエレメントが、その５’末端において、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲのＴＯＰモチーフの下流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで始まる請求項１から５のいずれかに記載の人工核酸分子。
  7. ５’ＵＴＲエレメントが、その３’末端において、前記５’ＵＴＲが由来する遺伝子又はｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの開始コドンの上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終わる請求項１から６のいずれかに記載の人工核酸分子。
  8. 前記３’ＵＴＲエレメントと前記５’ＵＴＲエレメントとが、少なくとも相加的に作用して、人工核酸分子からのタンパク質産生を増加させる請求項１から７のいずれかに記載の人工核酸分子。
  9. ｄ． ポリ（Ａ）配列及びポリアデニル化シグナルの少なくともいずれか
    を更に含む請求項１から８のいずれかに記載の人工核酸分子。
  10. ポリアデニル化シグナルが、３’ＵＴＲエレメント内に位置する請求項９に記載の人工核酸分子。
  11. ポリアデニル化シグナルが、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎは、Ａ又はＵである）を含む請求項９から１０のいずれかに記載の人工核酸分子。
  12. ポリアデニル化シグナルが、３’ＵＴＲの３’末端の５０ヌクレオチド未満上流に位置する請求項９から１１のいずれかに記載の人工核酸分子。
  13. ポリ（Ａ）配列が、２０アデニンヌクレオチド〜３００アデニンヌクレオチドの長さを有する請求項９から１２のいずれかに記載の人工核酸分子。
  14. 断片が、前記断片が由来する完全長配列の少なくとも９０％を表す、前記完全長配列における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる請求項１から１３のいずれかに記載の人工核酸分子。
  15. 前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６９及び１，３７６から選択される核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６９及び１，３７６から選択される核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなり、かつ、前記配列番号１，３６９及び１，３７６に比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じるものではない請求項１から１４のいずれかに記載の人工核酸分子。
  16. 断片が、前記断片が由来する完全長配列の少なくとも９０％を表す、前記完全長配列における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる請求項１５に記載の人工核酸分子。
  17. オープンリーディングフレームが、レポータータンパク質をコードしていない請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子。
  18. 前記レポータータンパク質が、ＧＦＰタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、グロビンタンパク質、ヒト成長ホルモン、又はヒトのアルブミンのいずれかである請求項１７に記載の人工核酸分子。
  19. ５’−キャップ構造、ポリ（Ｃ）配列、及び／又はＩＲＥＳモチーフを更に含む請求項１から１８のいずれかに記載の人工核酸分子。
  20. プロモーター含有配列を更に含む請求項１から１９のいずれかに記載の人工核酸分子。
  21. 人工核酸分子が、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されている請求項１から２０のいずれかに記載の人工核酸分子。
  22. オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量が、野生型オープンリーディングフレームに比べて増加している請求項１から２１のいずれかに記載の人工核酸分子。
  23. オープンリーディングフレームが、コドンが最適化されている領域を含む請求項１から２２のいずれかに記載の人工核酸分子。
  24. ＲＮＡの分子である請求項１から２３のいずれかに記載の人工核酸分子。
  25. ｍＲＮＡの分子である請求項１から２４のいずれかに記載の人工核酸分子。
  26. ａ． 少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’ＵＴＲエレメント）と、
    ｂ． 少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び少なくとも１つのクローニングサイトの少なくともいずれかと、
    ｃ． 少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと、
    を含み、
    前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６８若しくは１，４１２〜１，４２０に係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１，３６８若しくは１，４１２〜１，４２０に係る核酸配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなり、かつ、前記配列番号１，３６８若しくは１，４１２〜１，４２０に比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じるものではなく、
    前記５’ＵＴＲエレメントが、機能的５’ＴＯＰモチーフを含有せず、
    前記３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来するか又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり、
    前記３’ＵＴＲの変異体が、前記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲと少なくとも９５％同一であり、
    前記３’ＵＴＲエレメントが、前記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じるものではないことを特徴とするベクター。
  27. ５’ＵＴＲエレメントとオープンリーディングフレームとが、異種である請求項２６に記載のベクター。
  28. ＲＮＡベクター又はＤＮＡベクターである請求項２６から２７のいずれかに記載のベクター。
  29. プラスミドベクター又はウイルスベクターである請求項２６から２８のいずれかに記載のベクター。
  30. 請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子を含むか又はコードしている請求項２６から２９のいずれかに記載のベクター。
  31. 環状分子である請求項２６から３０のいずれかに記載のベクター。
  32. ５’→３’方向において、コード鎖のＯＲＦ、ポリ（Ａ）配列、又は３’ＵＴＲエレメントに続いて環状ベクター分子を線形化するための制限酵素部位が配置されている請求項３１に記載のベクター。
  33. 請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子又は請求項２６から３２のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
  34. 哺乳類細胞である請求項３３に記載の細胞。
  35. 請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項２６から３２のいずれかに記載のベクター、又は請求項３３から３４のいずれかに記載の細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
  36. １以上の薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤、及び１以上のアジュバントの少なくともいずれかを更に含む請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 医薬として使用するための請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項２６から３２のいずれかに記載のベクター、請求項３３から３４のいずれかに記載の細胞、又は請求項３５から３６のいずれかに記載の医薬組成物。
  38. ワクチンとして又は遺伝子治療において使用するための請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項２６から３２のいずれかに記載のベクター、請求項３３から３４のいずれかに記載の細胞、又は請求項３５から３６のいずれかに記載の医薬組成物。
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