CN111118018B - 猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法 - Google Patents

猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法 Download PDF

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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Abstract

本发明提供了一种猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的高效表达方法。涉及了猫血清白蛋白重组核苷酸序列(如SEQ ID NO：3所示)、含有该核苷酸序列的载体和含有前述载体的工程细胞。本发明基于猫血清白蛋白基因的天然序列，对其密码子进行优化，使其更适合于在酵母细胞中表达，将改造后的编码猫血清白蛋白的DNA序列克隆至毕赤酵母表达载体pPICK9中，转化毕赤酵母表达菌株GS115，经过G418加压筛选，得到高效表达猫血清白蛋白的克隆株，表达水平可达2g/L。本发明的方法表达的蛋白接近天然，表达效率高、操作过程简单，适宜于大规模工业化生产。

Description

猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猫血清白重组蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法。
背景技术
猫血清白蛋白（Feline serum albumin, FSA）是由584个氨基酸组成的单链蛋白质，分子质量为65.85 kDa。是血清中含量最高、功能较多的一种蛋白质。血浆胶体渗透压维持主要依靠血浆中白蛋白（血清白蛋白构成血浆胶体渗透压的75%~80%左右）。1 g白蛋白产生的渗透压相当于20 ml血浆或40 ml全血所得到的血流动力学效应。
猫白蛋白是由肝细胞合成的，当肝脏发生病变时，白蛋白的合成发生障碍，特别是发生肝硬化时，白蛋白的合成明显减少，导致疾病发生。白蛋白的生物学作用如下：
1、白蛋白可以增加血容量和维持血浆胶体的渗透压，主要用于调节组织与血管之间水分的动态平衡。
2、白蛋白的运输和解毒的作用，白蛋白能与体内许多难溶性的小分子结合形成易溶的物质，可以运输不同的物质，也可以把有毒的物质运输到解毒器官，有助于人体健康。
3、白蛋白对球蛋白起到一种胶体保护的稳定作用，当肝功能异常时，白蛋白的合成遭到障碍，使球蛋白失去胶体的保护而使稳定性下降，从而导致体内代谢失常。
4、白蛋白质也是一种营养物质，在氮代谢异常时，血浆白蛋白分解产生氨基酸，合成的组织蛋白，氧化分解成含氮物质。
临床用白蛋白的制备方法很多，主要采用盐析法、有机溶剂沉淀法和热激法提取。但猫血清自身的供应缺口、极其复杂的血清来源以及血液病毒经药传播的风险，都严重限制了FSA的产业化生产。相比其他表达系统而言，FSA在毕赤酵母中的表达量较高，生产成本较低，后期的分离纯化工艺也较为成熟，故成为最有希望实现药用FSA产业化的商品。此外，受猫血清原料影响，国内外并没有猫血清白蛋白相关产品上市。
发明内容
基于现有技术存在的问题，本发明的第一目的在于提供一种猫血清白蛋白重组蛋白，本发明的第二目的在于提供含有编码该猫血清白蛋白重组蛋白DNA序列的载体；本发明的第三目的在于提供含有上述载体的工程细胞；本发明的第四目的在于提供猫血清白蛋白重组蛋白在毕赤酵母中的表达方法，方法表达的蛋白接近天然，表达效率高、操作过程简单，适宜于大规模工业化生产。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种猫血清白蛋白重组蛋白，所述猫血清白蛋白重组蛋白包含如下氨基酸序列或与其具有85%以上同源性的氨基酸序列： SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
上述的猫血清白蛋白重组蛋白中，编码该猫血清白蛋白重组蛋白的DNA序列如SEQID NO：3所示。
本发明还提供一种载体，所述载体含有上述编码该猫血清白蛋白重组蛋白的DNA序列。
本发明还提供一种工程细胞，所述工程细胞含有上述的载体。
本发明还提供一种猫血清白蛋白重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达方法，包括以下步骤：
1、菌株、质粒和培养基：在DNA操作、克隆和测序过程中，使用本实验室保存的大肠杆菌JM109菌株，毕赤酵母GS115菌株（his4, 。究物2管理675Mut+, His-, aox1+, aox2+）和pPIC9K载体质粒，大肠杆菌重组子在LB固体培养基平板（含100 μg/ml氨苄青霉素）37℃过夜培养。使用含0.25~5mg/ml G418的MD平板进行His+转化子筛选，然后接着在含有不同浓度G418（0~5mg/ml）的YPD平板筛选含有多拷贝表达载体的重组子。毕赤酵母GS115菌株重组子在BMGY/BMMY培养基上培养，进行高拷贝重组子的筛选，然后将此重组子用于蛋白质大量表达纯化。
2、猫白蛋白基因表达载体的构建：
猫白蛋白基因（GenBank号：NM_001009961）的DNA编码序列（如SEQ ID NO：1所示）经过优化后，使用SnaB I和Not I酶切位点，将合成的基因克隆至酵母表达载体pPIC9K中，得到pPIC9K-fsa质粒，转化大肠杆菌JM109，37度培养过夜，然后挑挑选单个菌落接种于5ml含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养10~14h，于Ep管中收集5 ml菌液，13,000 r/min离心1~3 min后弃上清。将菌体沉淀加入250 μl 溶液I（加RNAse），并充分使其悬浮；加入250 μl溶液II（裂解液），温和地上下翻转混合6~10次，使菌体充分裂解，室温放置2 min直至溶液变得清亮。加入300 μl溶液III（中和液），立即轻柔地上下翻转6~10次，室温放置5 min，13,000 r/min离心15 min。将离心后的上清液转移到DNA结合管中，13,000 r/min离心1 min，弃去滤液，加入700 μl wash buffer，13,000 r/min离心1~3 min，重复漂洗一次后空柱13,000 r/min离心2 min，室温敞口放置5~10 min，除去残留的乙醇。最后用50 μl 50~70℃预热的无菌去离子水洗脱质粒DNA。然后将此质粒测定浓度，用于线性化实验。
载体线性化：
100 µl 体系中分别加入：
10×Buffer 10 µl
Vector 10 µg
Sal I 4 µl
ddH2O 至100 µl
37℃酶切过夜。第二天采用酚/氯仿/异丙醇的方法将线性化的质粒进行纯化。
a）配置酚/氯仿/异丙醇，配好后混匀。将100 µl酶切产物+100 µl的ddH2O+200 µl的酚/氯仿/异丙醇溶液，vortex后，13000 r/min离心10~20 min.
b）将上层液体吸出，加入10%（NaAc 3M），3倍体积无水乙醇，vortex后，-20℃放30min后，13000 r/min离心10~20 min。
c）底部见一白色沉淀，将上清吸掉。加1 ml 70%乙醇（冷），vortex后，13000 r/min离心10~20 min。
d）加1ml 70%乙醇（冷），vortex后，13000 r/min离心10~20 min，将上清吸掉。置于56℃金属浴使多余乙醇挥发（1~5min）。
e）加12 µl ddH2O溶解DNA，vortex后金属浴1~5min,吸1~2 µl稀释测浓度。
电转酵母GS11菌株多拷贝重组子筛选：
a）取80 µl GS115感受态+5 µl载体（vector）约7 µg混合后冰上放置5 min。
b）将其转到2 cm预冷的电转杯中，用电穿孔仪电转化，电转结束后将细胞中加入1ml 1~3M的Sorbital。
c）将其转入15 ml无菌BD管中，30℃孵育1~5小时后，1000 r/min离心5~10 min，随后将其涂在MD平板上，并28℃倒置培养48~72 h筛选His+转化子。用1~2 ml无菌水将每个MD平板长出的菌落吹起。将细胞悬液转移到无菌50 ml离心管中混匀。使用分光 光度计测细胞密度 (1 OD600 = 5×107细胞/ml)。之后在含有不同浓度G418（0.25~5.0 mg/ml）的YPD平板上28℃培养，需要2~5天长出菌落。
为了筛选高表达FSA的克隆，从MD平板上选取10个克隆以及含5.0 mg/ml G418的YPD平板上的所有克隆，在含有20 ml BMGY培养基的100 ml三角瓶中，28℃、230 r/min培养，当培养物OD600达到22~24（约18 h）时，将细胞重悬于含有20 ml BMGY培养基的100 ml三角瓶中，让其在同样条件下生长。每24 h往培养瓶中加入纯甲醇，浓度为1~5%（v/v），以维持诱导。对用空载体转化的毕赤酵母进行同样的处理，作为阴性对照。诱导96 h后，12000 g离心5 min收集培养物，用SDS-PAGE和Western blot分析上清，选择产蛋白最好的转化子用于后续的生产。
3、表达条件的优化：使用原始的培养条件（28℃诱导温度、pH 6.0、每24 h添加0.5%甲醇、生物量积累用BMGY/诱导用BMMY、在100 ml摇瓶中用20 ml培养基、230 r/min）,优化了摇瓶的大小对rFSA产量的影响。在此，我们选用单因素法，以便能够独立地控制每个参数。首先, 我们研究了温度（22、24、26、28、30℃）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）和甲醇浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、甲醇诱导时间（0、24、48、72、96、120、144 h）对选定克隆在诱导期蛋白表达量的影响。接着评估了在诱导期开始时添加氨基酸（1 g/LAla、His、Gly、Glu、Leu和Lys）、酪蛋白氨基酸（0.5%~2.0%）、油酸（0.01%~0.1%）、抗坏血酸（10 mmol/L）和EDTA（12 mmol/L）对表达量的影响。在诱导96 h后取样，测定OD600，然后，对所取样品12000 g 离心5 min，取上清进行SDS-PAGE分析。
4、样品分析：使用 UV/Vis分光光度计（Ultrospec 2100 pro, GE, USA）测量OD600，取10 ml培养物，12000 g、4℃离心10 min，用去离子水洗涤沉淀2次，称重。在变性条件下，在聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白浓度，使用Bradford Protein Assay，度受奖Kit（Thermo, USA）测定总蛋白浓度。
本发明的有益效果：
（1）将编码猫血清白蛋白的DNA序列经过优化后，可以在毕赤酵母GS115株中高效表达，在发酵罐中的表达量可达2g/L；
（2）目前，受猫血清原料影响，国内外并没有猫血清白蛋白相关产品上市，本发明所生产的猫血清白蛋白重组蛋白有效填补了猫血液制品的空白。
附图说明
图1为编码天然猫血清白蛋白的核苷酸序列；
图2为编码天然猫血清白蛋白的氨基酸序列；
图3为编码本发明猫血清白蛋白重组蛋白的核苷酸序列；
图4为编码本发明猫血清白蛋白重组蛋白的氨基酸序列；
图5为pPIC9K载体的图谱；
图6为线性化pPIC9K-fsa质粒图谱；
图7A和图7B为表达产物的SDS-PAGE鉴定图谱；
图8为表达产物的质谱鉴定图。
其中，图5中Comments for pPIC9K:
9276 nucleotides
5'AOX1 promoter fragment: bases 1-948
5'AOX1 primer site: bases 855-875
ɑ-Factor secretion signal(s): bases 949-1218
ɑ-Factor primer site: bases 1152-1172
Multiple Cloning Site: bases 1192-1241
3'AOX1 primer site: bases 1327-1347
3'AOX1 transcription
termination (TT): bases 1253-1586
HIS4 ORF: bases 4514-1980
Kanamycin resistance gene: bases 5743 4928
3'AOX1 fragment: bases 6122-6879
pBR322 origin: bases 796 1-7288
Amicllin resistance gene: bases 8966-8106。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。此外，本发明实施例中所采用的原料若无特殊说明均为市售获得。
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例：
1、猫血清白蛋白基因的合成：基于野生型猫血清白蛋白的基因序列（如SEQ IDNO：1所示和图1所示）、（氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示和图2所示），用密码子优化软件（http://www.jcat.de）对猫血清白蛋白的DNA编码序列进行优化获得本发明编码该猫血清白蛋白重组蛋白的DNA序列（如SEQ ID NO：3所示和图3所示），经由上海生工合成全序列。由其演绎的猫血清白蛋白重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示和图4所示。
2、重组质粒的构建与鉴定：将优化后的猫血清白重组蛋白的编码序列和毕赤酵母表达载体pPIC9K（如图5所示）分别用SnaB I和Not I酶切。
图5中，将编码猫血清白蛋白的DNA序列插入到SnaB I和Not I位点之间，在AOX1启动子的控制下表达，在N端与可被切割的酿酒酵母α因子分泌信号融合。5’ AOX1: 乙醇氧化酶1启动子区；α-factor：α因子分泌信号；3’ AOX1（TT）：乙醇氧化酶1转录终止区；HIS4：组氨酸基因；KanR2：卡那霉素抗性基因；SnaB I和Not I：插入子连接位点；Sal I：质粒线性化位点。
琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，经T4 DNA连接酶连接过夜，次日用连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布至含有Amp的LB平板上，37℃培养过夜。次日，从平板上挑取单菌落，扩增后提取重组质粒，经SnaB I和Not I双酶切鉴定，得到大小约1752bp的条带，经测序验证，表达质粒构建正确。
3、将携带pPIC9K-fsa质粒（如图6所示）的大肠杆菌接种于100ml LB培养基中，37℃培养过夜，次日，用质粒提取试剂盒提取质粒，用NanoDrop定量后，取大约100 µg质粒，用Sal I酶切过夜，用DNA提取试剂盒回收，得到线性化的pPIC9K-fsa质粒，-20℃保存备用。
4、取适量线性化的pPIC9K-fsa质粒，用电转仪转化GS115感受态细胞，用Sal I将pPIC9K-fsa质粒线性化，取7 μg线性化后的质粒(10 μl)，用电穿孔仪（Bio-Rad, CA, USA）电转化（25 μF, 200 Ω, 1.0 kV）毕赤酵母GS115（80 μl）感受态细胞。电穿孔后，将细胞与1 ml预冷的山梨醇（1 M）混合，28℃孵育2 h。随后将其涂在MD平板上，并28℃倒置培养48~72 h筛选His+转化子。
5、用1~2 ml无菌水将每个MD平板长出的菌落吹起。将细胞悬液转移到无菌50 ml离心管中混匀。使用分光光度计测细胞密度 (1 OD600 = 5×107细胞/ml)。之后在含有不同浓度G418（0.25~5.0 mg/ml）的YPD平板上28℃培养，需要2~5天长出菌落。
6、为了筛选高表达FSA的克隆，从MD平板上选取10个克隆以及含5.0 mg/ml G418的YPD平板上的所有克隆，在含有20 ml BMGY培养基的100 ml三角瓶中，28℃、230 r/min培养，当培养物OD600达到22~24（约18 h）时，将细胞重悬于含有20 ml BMGY培养基的100 ml三角瓶中，让其在同样条件下生长。每24 h往培养瓶中加入纯甲醇，浓度为1%（v/v），以维持诱导。对用空载体转化的毕赤酵母进行同样的处理，作为阴性对照。诱导96 h后，12000 g离心5 min收集培养物，用SDS-PAGE和Western blot分析上清，选择产蛋白最好的转化子用于后续的生产。
7、取诱导后的培养上清，进行SDS-PAGE，用考马氏亮蓝R-250染色，得到分子质量约66 kDa的条带（如图7A和图7B所示）。图7A中，1为蛋白Marker（自上至下依次为170、130、100、70、55、40、35、25、15、10kDa），2~8分别为1~7号克隆；图7B中，9为蛋白Marker（自上至下依次为170、130、100、70、55、40、35、25、15、10kDa），10~19分别为13~22号克隆。
8、从胶上切下目的条带，用6600质谱仪进行鉴定，经数据库搜索，证明目的条带为猫血清白蛋白（如图8所示）。
SEQUENCE LISTING
<110> 泰州博莱得利生物科技有限公司 北京博莱得利生物技术有限责任公司
<120> 猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的高效表达方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 1641
<212> DNA
<213> 猫
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gaagcacatc agagtgagat tgctcatcgg ttcaatgatt tgggagaaga acatttcaga 60
ggcctggtac tggttgcctt ttctcagtat ctccagcagt gtccatttga agatcatgta 120
aaattagtga atgaagtaac tgagttcgca aaaggatgtg tggctgacca gtcagcagcc 180
aactgtgaaa agtcacttca cgaactctta ggagataaac tgtgtacagt tgcctctctt 240
cgcgacaagt atggtgagat ggctgattgc tgtgagaaaa aagaacctga gagaaacgaa 300
tgcttcctgc agcacaaaga tgacaatccc ggcttcggtc agctggtgac cccagaggct 360
gatgccatgt gcactgcctt ccacgaaaat gaacagaggt tcctgggcaa atacttatat 420
gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccagaac tcctttacta tgccgaagaa 480
tacaaaggag tttttacaga atgctgcgaa gctgcagata aagctgcctg cctgacacca 540
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gaggaacaac tgaaaactgt c 1641
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<211> 584
<212> PRT
<213> 猫
<400> 2
Glu Ala His Gln Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu His Phe Arg Gly Leu Val Leu Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Gly Cys Val Ala Asp Gln Ser Ala Ala Asn Cys Glu Lys
50 55 60
Ser Leu His Glu Leu Leu Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu
65 70 75 80
Arg Asp Lys Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe
100 105 110
Gly Gln Leu Val Thr Pro Glu Ala Asp Ala Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Glu Asn Glu Gln Arg Phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Glu
145 150 155 160
Tyr Lys Gly Val Phe Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Thr Pro Lys Val Asp Ala Leu Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Ile Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Ala Lys
225 230 235 240
Ile His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gly Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ser Glu Val Glu Arg Asp Glu Leu Pro Ala Asp Leu Pro Pro
290 295 300
Leu Ala Val Asp Phe Val Glu Asp Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg
325 330 335
Arg His Pro Glu Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu
340 345 350
Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Thr Asp Asp Pro Pro Ala
355 360 365
Cys Tyr Ala His Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
His Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Thr His Pro Glu Ala Glu Arg Leu Ser Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Gln Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Ser Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Leu Cys Thr Leu Pro Glu Ala Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala
545 550 555 560
Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Ala
580
<210> 3
<211> 1752
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 经过密码子优化后的猫血清白蛋白DNA编码序列
<400> 3
gaagctcacc aatctgaaat cgctcacaga ttcaacgact tgggtgaaga acacttcaga 60
ggtttggttt tggttgcttt ctctcaatac ttgcaacaat gtccattcga agaccacgtt 120
aagttggtta acgaagttac tgaattcgct aagggttgtg ttgctgacca atctgctgct 180
aactgtgaaa agtctttgca cgaattgttg ggtgacaagt tgtgtactgt tgcttctttg 240
agagacaagt acggtgaaat ggctgactgt tgtgaaaaga aggaaccaga aagaaacgaa 300
tgtttcttgc aacacaagga cgacaaccca ggtttcggtc aattggttac tccagaagct 360
gacgctatgt gtactgcttt ccacgaaaac gaacaaagat tcttgggtaa gtacttgtac 420
gaaatcgcta gaagacaccc atacttctac gctccagaat tgttgtacta cgctgaagaa 480
tacaagggtg ttttcactga atgttgtgaa gctgctgaca aggctgcttg tttgactcca 540
aaggttgacg ctttgagaga aaaggttttg gcttcttctg ctaaggaaag attgaagtgt 600
gcttctttgc aaaagttcgg tgaaagagct ttcaaggctt ggtctgttgc tagattgtct 660
caaaagttcc caaaggctga attcgctgaa atctctaagt tggttactga cttggctaag 720
atccacaagg aatgttgtca cggtgacttg ttggaatgtg ctgacgacag agctgacttg 780
gctaagtaca tctgtgaaaa ccaagactct atctctacta agttgaagga atgttgtggt 840
aagccagttt tggaaaagtc tcactgtatc tctgaagttg aaagagacga attgccagct 900
gacttgccac cattggctgt tgacttcgtt gaagacaagg aagtttgtaa gaactaccaa 960
gaagctaagg acgttttctt gggtactttc ttgtacgaat actctagaag acacccagaa 1020
tactctgttt ctttgttgtt gagattggct aaggaatacg aagctacttt ggaaaagtgt 1080
tgtgctactg acgacccacc agcttgttac gctcacgttt tcgacgaatt caagccattg 1140
gttgaagaac cacacaactt ggttaagact aactgtgaat tgttcgaaaa gttgggtgaa 1200
tacggtttcc aaaacgcttt gttggttaga tacactaaga aggttccaca agtttctact 1260
ccaactttgg ttgaagtttc tagatctttg ggtaaggttg gttctaagtg ttgtactcac 1320
ccagaagctg aaagattgtc ttgtgctgaa gactacttgt ctgttgtttt gaacagattg 1380
tgtgttttgc acgaaaagac tccagtttct gaaagagtta ctaagtgttg tactgaatct 1440
ttggttaaca gaagaccatg tttctctgct ttgcaagttg acgaaactta cgttccaaag 1500
gaattctctg ctgaaacttt cactttccac gctgacttgt gtactttgcc agaagctgaa 1560
aagcaaatca agaagcaatc tgctttggtt gaattgttga agcacaagcc aaaggctact 1620
gaagaacaat tgaagactgt tatgggtgac ttcggttctt tcgttgacaa gtgttgtgct 1680
gctgaagaca aggaagcttg tttcgctgaa gaaggtccaa agttggttgc tgctgctcaa 1740
gctgctttgg ct 1752
<210> 4
<211> 584
<212> PRT
<213> 猫
<400> 4
Glu Ala His Gln Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu His Phe Arg Gly Leu Val Leu Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Gly Cys Val Ala Asp Gln Ser Ala Ala Asn Cys Glu Lys
50 55 60
Ser Leu His Glu Leu Leu Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu
65 70 75 80
Arg Asp Lys Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe
100 105 110
Gly Gln Leu Val Thr Pro Glu Ala Asp Ala Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Glu Asn Glu Gln Arg Phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Glu
145 150 155 160
Tyr Lys Gly Val Phe Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Thr Pro Lys Val Asp Ala Leu Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Ile Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Ala Lys
225 230 235 240
Ile His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gly Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ser Glu Val Glu Arg Asp Glu Leu Pro Ala Asp Leu Pro Pro
290 295 300
Leu Ala Val Asp Phe Val Glu Asp Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg
325 330 335
Arg His Pro Glu Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu
340 345 350
Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Thr Asp Asp Pro Pro Ala
355 360 365
Cys Tyr Ala His Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
His Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Thr His Pro Glu Ala Glu Arg Leu Ser Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Gln Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Ser Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Leu Cys Thr Leu Pro Glu Ala Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala
545 550 555 560
Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Ala
580

Claims (1)

1.一种猫血清白蛋白重组蛋白在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将编码猫血清白蛋白重组蛋白的DNA序列和毕赤酵母表达载体pPIC9K分别用SnaBI和Not I酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收，经T4 DNA连接酶连接过夜，次日用连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布至含有Amp的LB平板上，37℃培养过夜；次日，从平板上挑取单菌落，扩增后提取重组质粒；
其中，编码猫血清白蛋白重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：3所示；
（2）将携带重组质粒pPIC9K-fsa的大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用NanoDrop定量后，用Sal I酶切过夜，用DNA提取试剂盒回收，得到线性化的pPIC9K-fsa质粒，-20℃保存备用；
（3）取线性化的pPIC9K-fsa质粒，用电转仪转化GS115感受态细胞，取7~10μg线性化后的质粒，用电穿孔仪电转化毕赤酵母GS115感受态细胞；用电穿孔仪电转化后，将细胞与1~3ml预冷的山梨醇混合，28℃孵育1~3h；随后将其涂在MD平板上，于28℃倒置培养48~72h，筛选His+转化子；
（4）用1~2ml无菌水将每个MD平板长出的菌落吹起；将细胞悬液转移到无菌50 ml离心管中混匀，使用分光光度计测细胞密度，之后在含有不同浓度G418的YPD平板上25~30℃培养2~5天；
（5）筛选高表达FSA的克隆，从MD平板上选取10个克隆以及含5.0 mg/ml G418的YPD平板上的所有克隆，在含有20 ml BMGY培养基的100 ml三角瓶中，28℃、230 r/min培养，当培养物OD600达到22~24时，将细胞重悬于含有20 ml BMGY培养基的100 ml三角瓶中，让其在同样条件下生长，每24 h往培养瓶中加入纯甲醇，以维持诱导，对用空载体转化的毕赤酵母进行同样的处理，作为阴性对照；诱导72~96 h后，12000 g离心5 min收集培养物，用SDS-PAGE和Western blot分析上清，选择产蛋白最好的转化子，用于后续生产；
编码猫血清白蛋白重组蛋白的DNA序列是通过优化野生型猫血清白蛋白的基因序列获得，所述野生型猫血清白蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示；
所述预冷的山梨醇浓度为1~3M；所述纯甲醇浓度为1~5%（v/v）；
所述MD平板的成分包括20~30g/L的葡萄糖、2~4g/L不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源、300~500μg/L的生物素和10~30g/L的琼脂；
所述不同浓度G418的浓度范围为0.25~5.0 mg/ml；
所述YPD平板的成分包括5~15g/L的酵母提取物、20~30g/L的胰蛋白胨、20~30g/L的葡萄糖和15~30g/L的琼脂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718951A (zh) * 2020-06-24 2020-09-29 宁波毓昌生物技术有限公司 重组新型冠状病毒covid-19 s蛋白、其制备方法及应用
CN114686487B (zh) * 2021-11-08 2023-12-22 泰州博莱得利生物科技有限公司 一种猫犬白细胞介素11（il-11）在毕赤酵母中的高效表达方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1235981A (zh) * 1998-05-15 1999-11-24 中国科学院上海生物化学研究所 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化
CN102317315A (zh) * 2009-02-11 2012-01-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体和缀合物
CN104311671A (zh) * 2013-11-14 2015-01-28 长春西诺生物科技有限公司 猫长效融合干扰素及其制备方法与应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007044418A2 (en) * 2005-10-06 2007-04-19 Moscatello David K Cell culture media, kits and methods of use
KR20140139101A (ko) * 2012-03-27 2014-12-04 큐어백 게엠바하 5''top utr을 포함하는 인공 핵산 분자
DK2831241T3 (da) * 2012-03-27 2017-11-06 Curevac Ag Kunstige nukleinsyremolekyler til forbedret protein- eller peptidekspression.
EP3443001A4 (en) * 2016-04-11 2020-04-29 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1235981A (zh) * 1998-05-15 1999-11-24 中国科学院上海生物化学研究所 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化
CN102317315A (zh) * 2009-02-11 2012-01-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体和缀合物
CN104311671A (zh) * 2013-11-14 2015-01-28 长春西诺生物科技有限公司 猫长效融合干扰素及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chain A, Serum albumin，PDB: 5YXE_A;Yokomaku,K. et al.,;《Genbank》;20180514;第1-3页 *
Core-shell protein cluster comprising haemoglobin and recombinant feline serum albumin as an artificial O2 carrier for cats;Kyoko Yokomaku et al.,;《Journal of Materials Chemistry B》;20181231;摘要，第2页左栏第1段，第6页左栏第3-5段 *
猫过敏原白蛋白的克隆表达 、纯化和免疫学特性鉴定;许卓谦等;《免疫学杂志》;20070731;第23卷(第4期);第456-458，461页 *

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