CN116082494A - 重组人源ⅲ型胶原蛋白多肽、表达载体、表达菌株、及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽，所述蛋白多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该序列是从已知序列的天然人体III型胶原蛋白多肽中，选择了亲水性和稳定性都较强的多肽片段。组合后的序列的N端还具有一段序列，为酶切提供识别和切割的位点。SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列不仅具有强亲水性和稳定性，还能在表达后呈现出胶原蛋白多肽的超螺旋三级结构，这样该重组蛋白多肽应用于人体中时，更加能够有效发挥其所具有的生物学功能，更加稳定，同时不会造成免疫排斥。
Description
技术领域
本申请涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽、一种表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的菌株、以及表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的菌株的构建方法。
背景技术
胶原蛋白（collagen）是一种高分子蛋白质，是细胞外基质的主要成分，约占胶原纤维固体物的85%，占动物体内蛋白质总量的25-30%，广泛存在于动物的结缔组织中，对机体和脏器起着支撑、保护等重要作用。已发现的胶原蛋白有很多种，它们在动物体内发挥不同生理功能。
其中的III型胶原蛋白，由位于染色体2q31上的COL3A1基因编码，属于纤维状胶原蛋白超家族，并广泛存在于结缔组织中，如皮肤、肺、肝、肠和血管系统等。天然胶原蛋白不易溶于水，且在本领域中，大多数胶原蛋白产品是从哺乳动物或海鱼的组织器官中提取的。这种提取方法效率低、产生严重废物，并且从动物中提取到的胶原蛋白可能存在动物病毒等，难以满足当前的市场需求。
发明内容
本申请主要的目的是提供一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽，一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体，一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达菌株，以及一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体的构建方法，用于解决上述技术问题。
本申请提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽，所述蛋白多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
在一些实施例中，所述序列包括第一酶切位点；所述第一酶切位点能够被对应的酶识别并切割，从而得到分开的第一氨基酸序列部分和第二氨基酸序列部分；所述第二氨基酸序列部分的序列如SEQ ID NO. 2所示。
在一些实施例中，所述第一氨基酸序列部分的序列为：LEKR；所述对应的酶为Kex2酶。
本申请还提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体，包括：载体部分和目标核苷酸序列，其中，所述目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述目标核苷酸序列用于表达如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述目标核苷酸序列包括第一核苷酸序列部分和第二核苷酸序列部分；所述第二核苷酸序列部分用于表达如SEQ ID NO. 2所示的第二氨基酸序列部分。
本申请还提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达菌株，包括：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115；以及载体，所述载体上连接有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；其中，所述表达菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.25515，保藏日期：2022年8月10日。
本申请还提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体的构建方法，包括：获取如SEQ ID NO. 3所示的目标核苷酸序列；通过双酶切，将所述目标核苷酸序列连接至载体的两个酶切位点之间。
在一些实施例中，所述载体为用于在真核细胞中进行表达的载体；所述酶切位点为：EcoR I和Not I。
本发明从已知序列的天然人体III型胶原蛋白中选择了亲水性和稳定性都较强的多肽片段。除了从天然人体III型胶原蛋白中选择的片段之外，还在该选中的多肽片段的N端额外设计了一段序列，为酶切提供识别和切割的位点，从而得到如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。这样，SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列不仅具有强亲水性和稳定性，同时额外设计的多肽序列使重组的蛋白在分泌后，还能够被酶切割，从而使分泌的重组蛋白仅含有从天然人体III型胶原蛋白中选择出的亲水性和稳定性都较强的多肽片段，而不包含载体启动子后的任何多余氨基酸残基序列。此外，从天然人体III型胶原蛋白中选择的片段在表达后能够呈现出胶原蛋白的超螺旋三级结构，这样该重组蛋白应用于人体中时，更加能够有效发挥其所具有的生物学功能，更加稳定，同时不会造成免疫排斥，从而能够安全应用在生物医用材料、化妆品等领域。
附图说明
本申请将结合附图对实施方式进行说明。本申请的附图仅用于描述实施例，以展示为目的。在不偏离本申请原理的条件下，本领域技术人员能够轻松地通过以下描述根据所述步骤做出其他实施例。
图1是天然的人Ⅲ型胶原蛋白全序列所有氨基酸残基的疏水性分析结果；
图2是本申请实施例提供的一种重组人Ⅲ型胶原蛋白多肽的所有氨基酸残基的疏水性分析结果；
图3是本申请实施例提供的重组人Ⅲ型胶原蛋白多肽的三级结构示意图；
图4是本申请实施例提供的一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体的示意图；
图5是本申请实施例提供的一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体的构建方法的流程图；
图6是本申请实施例中确认表达载体线性化的琼脂糖电泳结果图；
图7是本申请实施例中确认表达载体转入至巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisGS115菌株中的基因组电泳结果图；
图8是本申请实施例中转化子小试表达重组人Ⅲ型胶原蛋白多肽的电泳结果图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本申请，而非对本申请的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本申请相关的部分而非全部结构。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
本申请实施例提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示。
具体的，如SEQ ID NO. 1所示的重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽，包括第一酶切位点。第一酶切位点能够被对应的酶识别并切割，从而得到分开的第一氨基酸序列部分和第二氨基酸序列。其中，第一氨基酸序列部分用于在重组蛋白多肽表达并被分泌至细胞外之后，提供酶切的识别位点，第二氨基酸序列部分则仅含有用于构成重组人源Ⅲ型胶原蛋白的、从天然Ⅲ型胶原蛋白的筛选出的蛋白多肽片段。
可以理解的是，当重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽被表达时，是将蛋白多肽对应的核苷酸序列连接至表达载体中（例如质粒的MCS位置）。在翻译表达的过程中，多肽有可能携带有属于载体的、位于启动子之后的一些氨基酸残基，而这些氨基酸残基并不属于需要被克隆的蛋白片段（例如，本申请中，不属于天然的人源Ⅲ型胶原蛋白）。但是在后续应用中（例如将该蛋白添加至化妆品或者医用材料等），为了保证重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的序列尽量与天然的人源Ⅲ型胶原蛋白的部分片段一致，需要将上述的属于载体的、位于启动子之后的一些氨基酸残基去除。因此，本申请的实施例中，设计了第一氨基酸序列部分，在重组蛋白多肽分泌至细胞外之后，该第一氨基酸序列部分能够提供酶切的识别位点，让对应的酶识别并切割，从而得到单独的第二氨基酸序列片段。
在本申请实施例中，第一氨基酸序列部分为LEKR，而第二氨基酸序列部分如SEQID NO. 2所示。其中，第一氨基酸序列部分LEKR能够被Kex2酶识别并切割。
进一步的，第二氨基酸序列部分仅含有从天然Ⅲ型胶原蛋白中，筛选出的一些蛋白片段，用于构成本申请中的重组蛋白多肽。筛选依据是天然人Ⅲ型胶原蛋白的各个多肽片段的亲水性。
如图1所示，图1是天然的人Ⅲ型胶原蛋白全序列所有氨基酸残基的疏水性分析结果。其中，天然的人Ⅲ型胶原蛋白的序列如SEQ ID NO. 4所示，疏水性评价的分值越低，则该多肽片段的亲水性越好。因此，本申请的实施例中，选择了疏水性评分低的多肽片段，构成了本发明的重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽中的第二氨基酸序列部分（即，如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列）。
进一步的，对得到重组的人Ⅲ型胶原蛋白多肽进行疏水性分析，结果如图2所示。本申请中的重组的人Ⅲ型胶原蛋白多肽中，所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明本申请的重组的人Ⅲ型胶原蛋白多肽的亲水性很好，至少优于天然的人Ⅲ型胶原蛋白。
进一步的，对SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列进行三级结构分析，结果如图3所示，该多肽具有胶原蛋白的超螺旋结构，说明该多肽的稳定性良好且具有生物学活性的潜能。因此，当应用于人体中时，更加能够发挥其生物学功能，且不易于引起免疫反应。
本申请实施例还提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体。如图4所示，该表达载体包括：载体部分和目标核苷酸序列。其中，目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，目标核苷酸序列用于表达如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
具体的，在一些实施例中，在确定了SEQ ID NO. 1的序列之后，可对该序列进行系统密码子优化，以得到能够被翻译成SEQ ID NO. 1的序列的核苷酸序列。例如，对mRNA的二级结构进行优化、根据需要去除限制性酶切位点、优化GC含量等，本申请不对具体的优化过程进行限制，只要能够得到如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，并且可被翻译得到如SEQID NO. 1所示的氨基酸序列即可。
与上述实施例中的如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列相对应的，本实施例中的如目标核苷酸序列（如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列）包括第一核苷酸序列部分和第二核苷酸序列部分。其中，第二核苷酸序列部分用于表达如SEQID NO. 2所示的第二氨基酸序列部分。而第一核苷酸序列部分用于表达第一氨基酸序列部分，例如，本申请中的第一核苷酸序列部分为：CTAGAAAAGAGA，用于表达第一氨基酸序列部分：LEKR。
进一步的，本实施例中的载体部分为具有多克隆位点的质粒，其中的多克隆位点能够被内切酶识别切割，以将目标核苷酸序列插入。本实施例中的载体部分为pPic9k质粒，并且在构建表达载体时，将pPic9k质粒中的
EcoRI和
NotI位点作为内切酶的识别切割位点。也就是说，目标核苷酸序列插入至pPic9k质粒的
EcoRI和
NotI位点之间。可以理解的是，也可采用其他的质粒表达系统，只要能够实现目标核苷酸序列（SEQ ID NO. 3）的表达即可。
本申请实施例还公开了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达菌株。该表达菌株包括：菌株，巴斯德毕赤酵母
PichiapastorisGS115；以及如上述实施例所述的表达载体。具体的，该表达菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.25515。
可以理解的是，本申请中，将巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris作为表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的菌株，是因为巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris是一种高效的表达系统，具有以下优势：
1）巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris含有AOX（醇氧化酶基因）启动子。表达过程中，利用甲醇即可严格地调控外源基因的表达。而同为真核表达系统的酿酒酵母，一般采用价格较高的半乳糖作为诱导剂。
2）巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris的表达水平高。外源基因既可在胞内表达，又可分泌型表达。并且，绝大多数外源基因在该酵母中比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中的表达水平高。
3）巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris的发酵工艺成熟，易放大。在本领域中，已经具有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l以上，表达重组蛋白多肽时，可成功放大到10000升。
4）巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris的培养成本低，产物易分离。其所用的发酵培养基中，碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，而培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。
5）巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris的外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失。
6）作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
本申请实施例还提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白的表达载体的构建方法，如图5所示，包括以下步骤。
S11，获取如SEQ ID NO. 3所示的目标核苷酸序列。
具体的，如上述实施例所述的，对天然的人Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列(SEQ No.4所示)进行疏水性分析，根据疏水性评价结果，筛选出疏水性评价分值低的多肽片段（亲水性高），筛选出的多肽片段作为如上所述的第二氨基酸序列部分。然后，设计如上所述的第一氨基酸序列部分，作为第二氨基酸序列部分的氮端。以此得到如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
然后，对如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列进行系统密码子优化，得到如SEQ IDNO. 3所示的目标核苷酸序列。本申请中，委托了生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，得到了该目标核苷酸序列。
S12，通过双酶切，将所述目标核苷酸序列连接至载体的两个酶切位点之间。
具体的，获得pPic9k质粒，利用可识别
EcoRI和
NotI的内切酶，切割pPic9k质粒，再将S11中得到的目标核苷酸序列连接至
EcoRI和
NotI位点之间，即可得到重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体。
本申请中，在得到重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体之后，还可将表达载体转入至菌株中，进行克隆的测序验证。例如，可将表达载体转入DH5α克隆菌株，挑取阳性克隆子测序验证。
进一步的，将该表达载体转入至宿主细胞中，以利用宿主细胞表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽。具体包括以下步骤：
S21，将表达载体线性化。
在获得上述表达载体之后，利用限制性内切酶切割该表达载体，使表达载体线性化。本申请不对限制性内切酶进行限制，只要该限制性内切酶不会将目标核苷酸序列切断即可。例如，本实施例中，采用了
SacI内切酶，对10μg表达载体进行切割，在37℃条件下消化3小时。具体的反应体系如下表1所示：
表1
SacΙ酶切线性化体系
| 成分 | 体积 |
| 10×CutSmart buffer | 40 μl |
| Sac Ι | 30 μl |
| pPic9K-SEQ ID NO. 3质粒 | 10 μg |
| ddH2O | Up to 500μl |
表达载体的线性化可通过琼脂糖凝胶电泳证实。例如，本实施例中，如图6所示，在消化3小时后，取5μl样本进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图5所示。其中，M为DNA标准品，1为表达载体酶切前的样本的电泳结果，2为表达载体被Sac I酶切后的样本的电泳结果，如图所示可确认表达载体已经完全线性化。
S22，浓缩S21步骤中得到的酶切产物。
a) 向S21步骤中的酶切反应体系中加入等体积的酚氯仿（酚氯仿取下层），混匀，在4℃条件下静置10分钟。
b) 静置后，混合物分层，取上层的水样，向其中加入500μl预冷无水乙醇，置于-20℃的冰箱，放置1小时。
c) 对水样和无水乙醇的混合物在4℃条件下离心20分钟，弃去上清，获得沉淀。
d) 向c)得到的沉淀中加入1ml的70%乙醇清洗，在4℃条件下离心20分钟，弃去上清，得到沉淀。
e) 重复一次d)操作。
f）将e）步骤得到的沉淀吹干，向吹干的沉淀中加入20μl的无菌ddH2O充分溶解待用。
S23，制备电转感受态细胞。
a）在酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（YPD）平板上划线巴斯德毕赤酵母
PichiapastorisGS115菌株，在30℃的恒温培养箱中培养划线平板两天，以得到分散的单菌落。
b) 挑取巴斯德毕赤酵母
PichiapastorisGS115菌株的单菌落，接种至含有10ml的YPD培养基中，在30℃、250rpm的条件下，过夜培养，使巴斯德毕赤酵母
PichiapastorisGS115在培养基中生长至饱和。
c) 取b）步骤中的300μl的培养物，接种至50ml的新鲜YPD培养基中，在28℃-30℃，250rpm的条件下，培养约十小时时，培养基的OD600值达到1.3-1.5。
d）将c）中的酵母培养物于4℃，1500g条件下，离心五分钟，弃上清液，得到菌体沉淀，用50ml预冷的无菌水悬浮菌体沉淀。
e）在4℃，1500g的条件下离心d）中悬浮的菌体5分钟，弃上清液，得到菌体沉淀，用25ml的冰预冷的无菌水重悬菌体沉淀。
f）4℃，1500g的条件下，离心e）中的重悬菌体5分钟，弃上清液后，得到菌体沉淀，用10ml的冰预冷的1mol/l的山梨醇溶液，重悬菌体沉淀。
g）4℃，1500g的条件下，离心f）中的重悬菌体5分钟，弃上清液后，到菌体沉淀，用800μl的冰预冷的1mol/l的山梨醇溶液重悬菌体沉淀。重悬后的菌体的终体积约为1ml，将其至于冰上，作为待转化的巴斯德毕赤酵母
PichiapastorisGS115感受态细胞。
S24，电转化感受态细胞。
a）取200μl的S23中制备好的待转化的GS115感受态细胞，向其中加入步骤S21中得到的线性化表达载体(大于5μg)。将二者混匀，加入电转杯，在冰上放置5分钟。进行电穿孔的电击条件为：电压：1500V；电阻：400Ω；电容：25μF；脉冲时间：10ms/次电击。
b) 向电击后的感受态细胞中迅速加入1ml的1M山梨醇，混匀并洗出，收容至1.5ml的EP管中。
c) 将b）中的菌液涂布于MD平板上，每100μl涂一块平板。
d）将c）中的涂布后的平板倒置于30℃的恒温培养箱中，培养至长出单菌落。
S25，筛选出成功转入了表达载体的阳性菌株。
a）用无菌牙签依次挑取S24步骤d）中的MD平板上的单菌落，分别影印于MM培养基平板和MD培养基平板上。影印平板倒置于30℃的恒温培养箱，培养2-3天。
b）观察MM培养基平板和MD培养基平板上的单菌落的生长差别。其中，甲醇利用快型转化细胞在MM培养基平板和MD培养基平板上均长势良好，而甲醇利用慢型细胞在MD培养基平板上长势良好，而在MM培养基平板上基本不生长。
c）配置含有G418不同浓度的YPD固体培养基，其中G418的浓度包括：0mg/ml、0.25mg/ml、0.50mg/ml、0.75mg/ml、1.00mg/ml、1.50mg/ml、2.00mg/ml、3.00mg/ml和4.00mg/ml。
d）用无菌牙签挑取甲醇利用快型转化细胞影印于不同G418浓度的YPD培养基平板上，将影印的平板倒置于30℃的恒温培养箱培养至长出单菌落。其中，不含G418的YPD平板上的转化细胞在培养2天时，可以长出较大的菌落，而在含有G418的YPD平板上的转化细胞则在培养4天-5天，甚至更久时，才能观察到明显的单菌落。
e）挑取5个在含有4.00mg/ml G418的YPD平板上长出的单菌落，将其接种于5ml的YPD液体培养基中，过夜培养。
f）收取e）中过夜培养后的菌体。一部分冻存备用，一部分用于抽取基因组，并以基因组为模板，利用5’AOX1引物和3’AOX1引物进行PCR，以鉴定是否成功转入了表达载体。
g）PCR产物进行电泳，结果如图7所示。其中，M为DNA标准品,1为没有进行转入步骤的GS115菌株的基因组PCR结果，2-6为进行了转入步骤的GS115菌株的基因组PCR结果，7为pPic9K-SEQ ID NO. 3表达载体的PCR结果，8为pPic9K空载体的PCR结果。如图所示，表明SEQ ID NO. 3基因成功插入了GS115菌株的基因组中。
本申请实施例中，在确认目标核苷酸序列（SEQ ID NO. 3所示的序列）被成功转入至巴斯德毕赤酵母
PichiapastorisGS115细胞后，还需确认该核苷酸序列在宿主细胞中的表达情况。因此，进行了小试表达的鉴定，具体包括以下步骤：
1）筛选出具有高拷贝数的转化子，将其接种至25ml的BMGY液体培养基中，在摇床中，以250 rpm，30℃的条件培养约24h-30h，使培养基的OD600值达到2-6。
2）于室温，3500 rpm的条件下，离心OD600值为2-6的培养基5min，弃上清，收集菌体。
3）采用适量的BMM液体培养基，重新悬浮2）中得到的菌体，使最终的菌体悬浮液的OD600值达到约1.0。从OD600值约为1.0的菌液中，取100ml加入至1L的锥形瓶中，放入摇床中继续培养，培养调键位：250 rpm，30℃，3天；同时，每24h向锥形瓶中添加甲醇，同时收集发酵液1ml。
4）取3）中的各个时间段收集的发酵液800μl，分别加入至1.5ml的离心管中，向各个离心管中加入200μl三氯乙酸，得到混合液，将混合液置于冰箱中，放置数小时。
5）在4℃，12000rpm的条件下，将4）中放置后的每个混合液离心5分钟，弃上清，得到沉淀，向每个沉淀中加入400μl丙酮淋，悬浮沉淀。然后在4℃，12000rpm的条件下，将悬浮沉淀离心5分钟，弃上清，保留沉淀，将沉淀至于60℃的烘箱中，干燥1小时。
6）对5）中的每个干燥品进行SDS-PAGE电泳，结果如图8所示。其中，M为蛋白标准品，1-3列分别为24h时收集的发酵液、48h时收集的发酵液、72h时收集的发酵液的电泳结果，箭头指向的条带经蛋白质谱分析为本申请上述实施例中的重组人III型胶原蛋白多肽。表明转化子可高水平、高纯度的表达如SEQ ID NO. 1所示的蛋白多肽。
本发明从已知序列的天然人体III型胶原蛋白中选择了亲水性和稳定性都较强的多肽片段。除了从天然人体III型胶原蛋白中选择的片段之外，还在选中的多肽片段的N端额外设计了一段序列，为酶切提供识别和切割的位点，从而得到如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。这样，SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列不仅具有强亲水性和稳定性，同时额外设计的多肽序列使重组的蛋白多肽在分泌后，还能够被酶切割，从而使分泌的重组蛋白多肽仅含有从天然人体III型胶原蛋白中选择出的亲水性和稳定性都较强的多肽片段，而不包含载体启动子后的任何多余氨基酸残基序列。此外，从天然人体III型胶原蛋白中选择的片段在表达后能够呈现出胶原蛋白的超螺旋三级结构，这样该重组蛋白多肽应用于人体中时，更加能够有效发挥其所具有的生物学功能，更加稳定，同时不会造成免疫排斥，从而能够安全应用在生物医用材料、化妆品等领域。
以上仅为本申请的较佳实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
序列表
SEQ ID NO. 1
LEKRGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLP
SEQ ID NO. 2
GMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLP
SEQ ID NO. 3
CTAGAAAAGAGAGGTATGAAGGGTCATAGAGGTTTTGATGGTAGAAACGGTGAAAAGGGTGAAACTGGTGCTCCCGGTTTGAAGGGTGAAAACGGTTTGCCAGGTGAAAACGGTGCACCTGGTCCAATGGGTCCTAGGGGTGCTCCAGGTGAAAGAGGTAGACCAGGTTTGCCATAA
SEQ ID NO. 4
MMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPQPPTAPTRPPNGQGPQGPKGDPGPPGIPGRNGDPGIPGQPGSPGSPGPPGICESCPTGPQNYSPQYDSYDVKSGVAVGGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGRPGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGQPGPPGPPGTAGFPGSPGAKGEVGPAGSPGSNGAPGQRGEPGPQGHAGAQGPPGPPGINGSPGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGAPGLRGGAGEPGKNGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGSPGEPGANGLPGAAGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGVPGGPGMRGMPGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGRPGPPGPSGPRGQPGVMGFPGPKGNDGAPGKNGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGPGGDKGDTGPPGPQGLQGLPGTGGPPGENGKPGEPGPKGDAGAPGAPGGKGDAGAPGERGPPGLAGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGAAGTPGLQGMPGERGGLGSPGPKGDKGEPGGPGADGVPGKDGPRGPTGPIGPPGPAGQPGDKGEGGAPGLPGIAGPRGSPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGERGSPGGPGAAGFPGARGLPGPPGSNGNPGPPGPSGSPGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYGDEPMDFKINTDEIMTSLKSVNGQIESLISPDGSRKNPARNCRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCNMETGETCISANPLNVPRKHWWTDSSAEKKHVWFGESMDGGFQFSYGNPELPEDVLDVHLAFLRLLSSRASQNITYHCKNSIAYMDQASGNVKKALKLMGSNEGEFKAEGNSKFTYTVLEDGCTKHTGEWSKTVFEYRTRKAVRLPIVDIAPYDIGGPDQEFGVDVGPVCFL
Claims (8)
1.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽，其特征在于，所述蛋白多肽的氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
2.如权利要求1所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽，其特征在于，
所述序列包括第一酶切位点；
所述第一酶切位点能够被对应的酶识别并切割，从而得到分开的第一氨基酸序列部分和第二氨基酸序列部分；
所述第二氨基酸序列部分的序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如权利要求2所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽，其特征在于，
所述第一氨基酸序列部分的序列为：LEKR；
所述对应的酶为Kex2酶。
4.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体，其特征在于，包括：载体部分和目标核苷酸序列，其中，所述目标核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述目标核苷酸序列用于表达如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体，其特征在于，
所述目标核苷酸序列包括第一核苷酸序列部分和第二核苷酸序列部分；
所述第二核苷酸序列部分用于表达如SEQ ID NO. 2所示的第二氨基酸序列部分。
6.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达菌株，其特征在于，包括：
巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115；以及
载体，所述载体上连接有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；
其中，所述表达菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.25515。
7.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白多肽的表达载体的构建方法，其特征在于，包括：
获取如SEQ ID NO. 3所示的目标核苷酸序列；
通过双酶切，将所述目标核苷酸序列连接至载体的两个酶切位点之间。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述载体为用于在真核细胞中进行表达的载体；所述酶切位点为：EcoR I和Not I。
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| CN116813749A (zh) * | 2023-06-13 | 2023-09-29 | 广州启点生物科技有限公司 | 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和应用 |
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2022
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| CN116813749B (zh) * | 2023-06-13 | 2024-01-30 | 广州启点生物科技有限公司 | 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和应用 |
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