CN113908261A

CN113908261A - 重组人源ⅲ型胶原蛋白在制备浅表性创伤修护材料中的应用

Info

Publication number: CN113908261A
Application number: CN202010654148.2A
Authority: CN
Inventors: 赵健烽; 徐鹏程; 余继刚; 高力虎; 冯丽萍; 黄建民
Original assignee: Jiangsu Jland Biotech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Jland Biotech Co ltd
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2022-01-11

Abstract

本发明公开了一种重组人源III型胶原蛋白在制备浅表性创伤修护材料中的应用。所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白含有498个氨基酸，理论分子量约54.5kd，构建的重组人源Ⅲ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白。本发明的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥。重组人III型胶原蛋白作为浅表性创伤修护材料使用时，结痂时间提前1～2天，伤口愈合时间明显缩短，伤处平整滑腻，提高了伤口愈合质量，且无明显疤痕，适用于护肤品、医疗器械等领域。

Description

重组人源Ⅲ型胶原蛋白在制备浅表性创伤修护材料中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源III型胶原蛋白在制备浅表性创伤修护材料中的应用。

背景技术

胶原(Collagen)作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白，结缔组织和几乎所有薄壁器官间隙组织中最主要的结构蛋白，起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用，在生物医用材料、护肤品等领域应用广泛。目前使用的胶原蛋白主要为天然胶原蛋白，其不易溶于水，且来源于牛、猪、鱼等动物，分子量大小不等，性质复杂，进一步加工困难，同时存在动物病毒隐患，限制了其进一步应用。近几年通过基因构建技术，利用生物反应器表达重组胶原蛋白来解决这些问题，已经取得良好进展。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种外源蛋白表达系统，既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统不具有的对外源蛋白的修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点。在过去的20年中已有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达，其中许多产品已被广泛应用于临床的诊断治疗和科研工作中。在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可实现细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，便于纯化。

浅表性创伤，例如疤痕，其本质是一种不具备正常皮肤组织结构及生理功能的，失去正常组织活力的、异常的、不健全的组织。疤痕不仅破坏了体表美，还可能妨碍相关组织或器官的生理功能，甚至导致畸形。现在市面上已有一些修复表面创伤的祛疤胶原蛋白材料，但是在速效及显效方面效果不佳。

发明内容

本发明提供一种重组人源III型胶原蛋白在制备浅表性创伤修护材料中的应用。本发明将重组人源胶原蛋白应用于浅表性创伤修护，克服了动物胶原蛋白的缺陷，具有无病毒隐患、无免疫原性和良好的水溶性以及生物相容性的优点。

本发明所述的重组人源III型胶原蛋白在制备浅表性创伤修护材料中的应用，所述的浅表性创伤修护材料可以是修护浅表性创伤的组合物，如与抑菌材料等复配制成修护浅表性创伤的药物组合物；或修护浅表性创伤的敷料等。

本发明所述的浅表性创伤包括疤痕等。

优选地，所述的浅表性创伤修护材料中，重组人源III型胶原蛋白的浓度为0.1％～0.5％(w/v，g/mL)，更优选为0.3％w/v。

本发明所述的重组人源III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

本发明所述的重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa，核苷酸序列如SEQNo.3所示。

本发明构建的重组人源III型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的核苷酸序列如SEQNo.4所示，通过将重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。

本发明构建的分泌表达重组人源III型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris JY0301，保藏编号为CGMCC No.16462，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0301通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。

本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因III型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本发明的重组人源III型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥。在浅表性创伤表面使用重组人III型胶原蛋白后，结痂时间提前1～2天，缩短了伤口愈合时间。自然结疤皮肤可能留有凹凸不平，还有伴色素沉着的现象，使用重组人III型胶原蛋白后，伤处较为平整滑腻，提高了伤口愈合质量，且无明显疤痕，创面总体尺寸和创面深度均有明显改善。本发明的重组人III型胶原蛋白作为浅表性创伤修护材料，适用于生物医用材料、化妆品等领域。

附图说明

图1为人Ⅲ型α链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。

图2为重组人源Ⅲ型胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。

图3为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的构建示意图。

图4为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的Sac I酶切琼脂糖凝胶电泳图。

图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。

图6为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。

图7为阳性克隆菌株的PCR凝胶电泳图。

图8为#3，#4，#5，#10阳性克隆菌株培养48和72小时的样品的蛋白表达分析图。

图9为#10阳性克隆菌株的蛋白表达的SDS-PAGE电泳图。

图10为各组水分改善率结果图。

图11为各组创面改善率结果图。

图12为各组纹理改善率结果图。

图13为B组使用前和使用15小时后的效果对比图。

图14为B组使用第1天、第3天、第15天和第20天的效果对比图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

1.蛋白序列选择

对人Ⅲ型α链胶原蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)进行疏水性分析，评价结果如图1所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。选择评分低的氨基酸片段，将这些片段整合成新的蛋白，即本发明的重组人源Ⅲ型胶原蛋白(SEQ No.2)。对重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析，结果如图2所示，该蛋白中所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该蛋白的亲水性很好。

2.质粒构建及线性化

将重组人源Ⅲ型胶原蛋白翻译成碱基序列(SEQ No.3)，采用基于PAS(PCR-basedAccurate Synthesis)的方法合成基因Ⅲα498aa，双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和NotI之间，图3为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的构建示意图。将获得的重组质粒ppic9K-Ⅲα498aa转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如SEQ No.4所示。SEQ No.4的100-105碱基处及1603-1610碱基处为酶切位点。

提取质粒20μg，使用Sac I酶切线性化，冻干浓缩待用。37℃消化3h。取5μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示。其中M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1为Sac I酶切；2为回收目的片段。

表1酶切线性化体系配制表

3.电转毕赤酵母细胞GS115

冰浴电转杯，将10μL线性化质粒加入到装有80μL毕赤酵母感受态细胞的1.5mL EP管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650μL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于MD平板上，30℃恒温培养3～4d。图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。

4.PCR鉴定阳性克隆菌株

待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μL YPD液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组DNA，如图6所示。M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1-10：各克隆菌株提取的基因组。使用载体上引物PCR鉴定，结果如图7所示，其中，M：DNA标准品，从下到上100，200，500，750，1000，2000bp；1-10：各克隆菌株的PCR扩增片段。

5.小试表达鉴定

诱导表达：取鉴定的阳性菌株(3#，4#，5#，10#)50μl接入装有10ml BMGY的锥形瓶中，30℃，220r/min过夜培养，摇至OD₆₀₀＝2～6(对数生长，大约16～18h)；室温离心5000r/min离心5min，收集细胞，去除上清，用10ml BMMY重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养基中取样1ml，并加甲醇至终浓度0.5％继续诱导；以下各时间点0，24，48，72，96h样品10000r/min离心2min收集上清液，置于-20℃待检测。

三氯乙酸沉淀法浓缩表达产物：

(1)在离心管中加入500μl培养液上清和1/9体积的100％的TCA，振荡混合，4℃沉淀过夜；

(2)12000r/min离心10min，沉淀为粘稠带黄褐色胶状物，弃上清，收集沉淀，另将EP管倒置于吸水纸上，37℃烘箱静置10～20min，使管壁无明显液体残留；

(3)加入200μl冷丙酮，振荡混匀，样品在室温下静置10min，洗去管壁和管底残留的TCA；

(4)12000r/min离心10min，弃上清，重复步骤(2)和(3)，重复2～3次；

(5)加入上样缓冲液30μl，37℃孵育1h，溶解沉淀；如果沉淀不溶解，可用100μl枪头吹打至沉淀溶解。

6.鉴定分析

Western Blotting检测：

(1)取样品上样10μl；

(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；

(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h，恒流250mA；

(4)电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min；

(5)将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h；

(6)用封闭液稀释一抗(Rabbit anti-His)，膜在一抗稀释液(稀释比例1:1000)中4℃过夜；

(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min；

(8)用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(羊抗兔)，膜在二抗稀释液(稀释比例1:5000)中37℃反应1h；

(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min；

(10)ECL显影，曝光。

将选择的3#，4#，5#，10#株阳性克隆的48和72小时的样品，进行Western Blot初步检测。检测结果如图8所示，其中M：蛋白标准品；1：GS115菌株培养72小时上清样品；2：3#阳性菌株培养48小时上清样品；3：3#阳性菌株培养72小时上清样品；4：4#阳性菌株培养48小时上清样品；5：4#阳性菌株培养72小时上清样品；6：5#阳性菌株培养48小时上清样品；7：5#阳性菌株培养72小时上清样品；8：10#阳性菌株培养48小时上清样品；9：10#阳性菌株培养72小时上清样品。

表达分析：

SDS-PAGE电泳检测：选取10#阳性菌进行表达情况分析结果如图9所示。其中，M：蛋白标准品；1：GS115菌株培养72小时上清；2：10#阳性菌株培养0小时上清；3：10#阳性菌株培养24小时上清；4：10#阳性菌株培养48小时上清；5：10#阳性菌株培养72小时上清；6：10#阳性菌株培养96小时上清。10#阳性菌株命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0301，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.16462。

本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因Ⅲ型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。实验证明该法生产的重组类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，由于其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，所以应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。本发明采用的是分泌型表达载体，成功实现了重组类人胶原蛋白的分泌型表达，表达产物分泌在上清液中，方便纯化，具有其他重组类人胶原蛋白生产所不具备的优势，便于规模化生产操作。由于载体电转入毕赤酵母之后，基因整合在毕赤酵母基因组上，所以重组菌的稳定性好，经过多次传代基因不容易发生流失并能保持高效表达的性状，能够很好的实现稳定生产，毕赤酵母生产方法为好氧发酵，菌体密度高，表达量还有很大的提升空间。

实施例2

选取120名志愿者，年龄15～45岁，一年以内的伤疤，随机分为3组，每组40人，确保有效人数为30人。采用相机拍照，用Antera3D皮肤测试仪(爱尔兰)进行分析表面创伤的总尺寸和深度，及皮肤的纹理。

使用前、使用后3天、15天、20天共4次使用仪器，每次对受试者进行水分、创面深度、创面总尺寸三项测试。

实验分别分为T组，B组和C组，以相同的配方同一批次的重组人源III型胶原蛋白冻干饼为基质，保证每瓶2mg。为保证实验的真实性，T组、C组为对照组，T组，重组人源III型胶原蛋白浓度为0.05％(w/v，g/mL，即0.5g/L)，C组，重组人III型胶原蛋白浓度为0.6％(w/v，g/mL，即6g/L)，B组为实验组，重组人源III型胶原蛋白浓度为0.3％(w/v，g/mL，即3g/L)。

数据统计分析方法：用SPSS软件对各个测量值进行描述性统计，包括数量、均值、标准差、最小值、最大值等。用Shapiro-wilk test(夏皮罗-威尔克检验)进行数据改善值正态分布的显著性检验，Sig(双侧)＞0.1，则呈正态分布，进行T检验，显著性差异水平α去0.5。弱Sig(双侧)＜0.1，则呈非正态分布，进行Wilcoxon检验，显著性差异水平α取0.5，显著性差异水平为P值<0.5，表示有统计学差异，P<0.1，统计学差异明显。

表2 T组0.05％重组人源III型胶原蛋白的检测结果

使用0.05％重组人源III型胶原蛋白冻干饼20天后，测试结果表明：

-水分：与使用前相比较，水分提升率为3.71％。

-创面：与使用前相比较，20天创面总体尺寸下降31.12％，创面深度下降23.61％。-纹理：各个时间点具有统计学意义。

表3 B组0.3％重组人源III型胶原蛋白的检测结果

使用0.3％重组人源III型胶原蛋白冻干饼20天后，测试结果表明：

-水分：与使用前相比较，产品20天保湿效果，水分提升率为5.72％。

-创面：与使用前相比较，15h创面就开始结痂；20天创面总体尺寸下降36.64％，创面深度下降29.33％。

-纹理：P值＜0.1，具有统计学意义。

重组人源III型胶原蛋白浓度为0.1％～0.5％时，其对疤痕的修复效果相近，本申请以0.3％重组人源III型胶原蛋白为代表实施例。

表4 C组0.6％重组人源III型胶原蛋白的检测结果

使用0.6％重组人源III型胶原蛋白冻干饼20天后，测试结果表明：

水分：水分在20天有变化，改善百分比为4.01％。

创面：创面总体尺寸和创面深度在第20天均有改善，创面总体尺寸改善率为32.43％，创面深度改善率为21.61％。

纹理：在第20天有改善，且改善率为13.27％，具有统计学意义。

综上所述，通过对水分、创面长度和深度及皮肤纹理进行分析，比较T组、B组和C组的测试结果可知，采用浓度为0.1％～0.5％的重组人源III型胶原蛋白冻干饼对皮肤创伤有较好的改善，创面总体尺寸改善36.64％，创面深度改善29.33％，并且皮肤较为平整滑腻，提高了伤口愈合质量，且无明显疤痕。

序列表

<110> 江苏江山聚源生物技术有限公司

<120> 重组人源Ⅲ型胶原蛋白在制备浅表性创伤修护材料中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1466

<212> PRT

<213> 人属(Homo sapiens)

<400> 1

Met Met Ser Phe Val Gln Lys Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

His Pro Thr Ile Ile Leu Ala Gln Gln Glu Ala Val Glu Gly Gly Cys

20 25 30

Ser His Leu Gly Gln Ser Tyr Ala Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu

35 40 45

Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp Ser Gly Ser Val Leu Cys Asp Asp

50 55 60

Ile Ile Cys Asp Asp Gln Glu Leu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Ile Pro

65 70 75 80

Phe Gly Glu Cys Cys Ala Val Cys Pro Gln Pro Pro Thr Ala Pro Thr

85 90 95

Arg Pro Pro Asn Gly Gln Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly

100 105 110

Pro Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asn Gly Asp Pro Gly Ile Pro Gly Gln

115 120 125

Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Glu Ser Cys

130 135 140

Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp Val

145 150 155 160

Lys Ser Gly Val Ala Val Gly Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Ser Gly His Pro Gly

180 185 190

Ser Pro Gly Ser Pro Gly Tyr Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Gln

195 200 205

Ala Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ile Gly Pro Ser

210 215 220

Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly

225 230 235 240

Glu Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ile Lys Gly Pro Ala Gly Ile

245 250 255

Pro Gly Phe Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Asp Gly Arg Asn

260 265 270

Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Gly

275 280 285

Leu Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Ala

290 295 300

Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Arg

305 310 315 320

Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly

325 330 335

Pro Pro Gly Thr Ala Gly Phe Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Glu

340 345 350

Val Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Ser Asn Gly Ala Pro Gly Gln Arg

355 360 365

Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly His Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly

370 375 380

Pro Pro Gly Ile Asn Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Pro

385 390 395 400

Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Met Gly Ala Arg Gly Pro Pro

405 410 415

Gly Pro Ala Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly

420 425 430

Glu Pro Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Glu

435 440 445

Arg Gly Glu Ala Gly Ile Pro Gly Val Pro Gly Ala Lys Gly Glu Asp

450 455 460

Gly Lys Asp Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly

465 470 475 480

Ala Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro

485 490 495

Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro

500 505 510

Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly

515 520 525

Val Pro Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro Gly Ser Pro Gly Gly

530 535 540

Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Ser

545 550 555 560

Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly

565 570 575

Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala Pro Gly Lys

580 585 590

Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro

595 600 605

Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly

610 615 620

Pro Gly Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu

625 630 635 640

Gln Gly Leu Pro Gly Thr Gly Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro

645 650 655

Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly

660 665 670

Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Leu

675 680 685

Ala Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu

690 695 700

Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly

705 710 715 720

Thr Pro Gly Leu Gln Arg Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Leu Gly Ser

725 730 735

Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly Ala Asp

740 745 750

Gly Val Pro Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly

755 760 765

Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly Asp Lys Gly Glu Gly Gly Ala

770 775 780

Pro Gly Leu Pro Gly Ile Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg

785 790 795 800

Gly Glu Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly

805 810 815

Gln Asn Gly Glu Pro Gly Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu

820 825 830

Lys Gly Glu Gly Gly Pro Pro Gly Val Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ser

835 840 845

Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly

850 855 860

Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Leu

865 870 875 880

Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser

885 890 895

Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Asn Thr Gly

900 905 910

Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Gln

915 920 925

Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro

930 935 940

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly

945 950 955 960

Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Val

965 970 975

Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly Leu Ser Gly Glu Arg

980 985 990

Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly

995 1000 1005

Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly Arg

1010 1015 1020

Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly Ser Pro

1025 1030 1035 1040

Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly

1045 1050 1055

Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro

1060 1065 1070

Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln

1075 1080 1085

Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly

1090 1095 1100

Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser

1105 1110 1115 1120

Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala

1125 1130 1135

Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly

1140 1145 1150

Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn

1155 1160 1165

Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro

1170 1175 1180

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Val

1185 1190 1195 1200

Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly Gly Glu Lys Ala Gly Gly Phe

1205 1210 1215

Ala Pro Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp

1220 1225 1230

Glu Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu

1235 1240 1245

Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg Asp

1250 1255 1260

Leu Lys Phe Cys His Pro Glu Leu Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Val Asp

1265 1270 1275 1280

Pro Asn Gln Gly Cys Lys Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met

1285 1290 1295

Glu Thr Gly Glu Thr Cys Ile Ser Ala Asn Pro Leu Asn Val Pro Arg

1300 1305 1310

Lys His Trp Trp Thr Asp Ser Ser Ala Glu Lys Lys His Val Trp Phe

1315 1320 1325

Gly Glu Ser Met Asp Gly Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Asn Pro Glu

1330 1335 1340

Leu Pro Glu Asp Val Leu Asp Val His Leu Ala Phe Leu Arg Leu Leu

1345 1350 1355 1360

Ser Ser Arg Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile

1365 1370 1375

Ala Tyr Met Asp Gln Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu

1380 1385 1390

Met Gly Ser Asn Glu Gly Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys Phe

1395 1400 1405

Thr Tyr Thr Val Leu Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu Trp

1410 1415 1420

Ser Lys Thr Val Phe Glu Tyr Arg Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu Pro

1425 1430 1435 1440

Ile Val Asp Ile Ala Pro Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu Phe

1445 1450 1455

Gly Val Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

1460 1465

<210> 2

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly

1 5 10 15

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Lys Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Ser

20 25 30

Pro Gly Ser Asn Gly Ala Pro Gly Gln Arg Gly Glu Pro Gly Pro Gln

35 40 45

Gly His Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ile Asn Gly

50 55 60

Ser Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Ala Ala Gly Glu Arg Gly Ala

65 70 75 80

Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys

85 90 95

Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly

100 105 110

Ala Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Met

115 120 125

Arg Gly Met Pro Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro

130 135 140

Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly

145 150 155 160

Pro Ser Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala

165 170 175

Pro Gly Lys Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln

180 185 190

Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly

195 200 205

Pro Thr Gly Pro Gly Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro

210 215 220

Gln Gly Thr Gly Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly Glu Pro

225 230 235 240

Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly

245 250 255

Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Gly Lys Gly Ala

260 265 270

Ala Gly Pro Pro Gly Leu Gln Arg Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Leu

275 280 285

Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly

290 295 300

Ala Asp Gly Val Pro Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro

305 310 315 320

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly Asp Lys Gly Glu Gly

325 330 335

Gly Ala Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly

340 345 350

Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu

355 360 365

Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro

370 375 380

Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly

385 390 395 400

Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp

405 410 415

Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys Gly His Arg

420 425 430

Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly

435 440 445

Gln Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Pro

450 455 460

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu

465 470 475 480

Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

485 490 495

Ala Pro

<210> 3

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtgctagag gtaacgatgg tgcaagaggt tctgatggtc aaccaggtcc acctggtcct 60

ccaggtgcta aaggtgaagt tggtccagct ggttctcctg gatctaatgg tgctccagga 120

caaagaggtg aacctggtcc acaaggtcat gctggtgctc aaggtccacc aggaccacca 180

ggcattaacg gttctccagg tggaaagggt gaaatgggtg ctgctggtga aagaggtgca 240

ccaggtttta gaggtcctgc tggtccaaat ggtattccag gtgaaaaagg tccagccggt 300

gaacgtggtg ctcctggtcc agcaggtcca agaggtgctg caggcgaacc aggtagagat 360

ggtgtaccag gtggtccagg tatgagaggt atgccaggat ctccaggcgg tcctggttca 420

gatggtaaac ccggacctcc aggatcacaa ggtgaatcag gtagacccgg tcctcctgga 480

ccttctggtc ctagaggaca acctggacct aagggaaatg atggtgcccc aggtaagaat 540

ggtgagcgtg gtggtcccgg cggtccaggt cctcaaggac ctcctggaaa aaatggtgaa 600

actggacctc aaggccctcc aggtcctacc ggtccaggtg gtgataaggg tgatactggc 660

ccaccaggac ctcaaggtac aggtggtcca ccaggtgaaa atggtaaacc aggtgaacca 720

ggtcctaagg gtgatgccgg cgctcctggt ggcaaaggtg acgctggcgc tccaggcgag 780

agaggacctc caggtcctga aggtggtaaa ggtgctgccg gtcctccagg attgcaaaga 840

atgccaggtg agagaggtgg tttgggttca ccaggtccaa aaggcgacaa aggtgaaccc 900

ggcggacccg gtgctgatgg tgttcctggt aaagatggac caagaggtcc aactggacca 960

attggcccac ctggtccagc cggacaacca ggtgacaaag gcgaaggtgg tgctcccggt 1020

gagcctggaa gagatggtaa tccaggatct gatggtttgc caggtcgtga tggttcccct 1080

ggcggaaaag gtgatagagg cgaaaatgga tccccaggcg caccaggcgc tcccggacat 1140

cccggaccac caggtccagt aggtcctgca ggtaaatctg gtgatagggg agaatctggt 1200

cctgccggta gtagaggtgc ccctggtcct cagggtccac gtggtgacaa aggtgagaca 1260

ggtgaaagag gcgctgctgg tattaagggt catagaggtt ttccaggtaa cccaggtgca 1320

cccggaagtc caggaccagc cggtcaacag ggccctcctg gtaaggacgg tacttctggt 1380

catcctggtc ctattggccc tccaggacca aggggtaata gaggtgaaag gggttctgaa 1440

ggttccccag gtcatccagg tcagcccggt ccaccaggac ctccaggtgc tcca 1494

<210> 4

<211> 1610

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acaaataacg ggttattgtt tataaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa 60

ggggtatctc tcgagaaaag agaggctgaa gcttacgtag aattcggtgc tagaggtaac 120

gatggtgcaa gaggttctga tggtcaacca ggtccacctg gtcctccagg tgctaaaggt 180

gaagttggtc cagctggttc tcctggatct aatggtgctc caggacaaag aggtgaacct 240

ggtccacaag gtcatgctgg tgctcaaggt ccaccaggac caccaggcat taacggttct 300

ccaggtggaa agggtgaaat gggtgctgct ggtgaaagag gtgcaccagg ttttagaggt 360

cctgctggtc caaatggtat tccaggtgaa aaaggtccag ccggtgaacg tggtgctcct 420

ggtccagcag gtccaagagg tgctgcaggc gaaccaggta gagatggtgt accaggtggt 480

ccaggtatga gaggtatgcc aggatctcca ggcggtcctg gttcagatgg taaacccgga 540

cctccaggat cacaaggtga atcaggtaga cccggtcctc ctggaccttc tggtcctaga 600

ggacaacctg gacctaaggg aaatgatggt gccccaggta agaatggtga gcgtggtggt 660

cccggcggtc caggtcctca aggacctcct ggaaaaaatg gtgaaactgg acctcaaggc 720

cctccaggtc ctaccggtcc aggtggtgat aagggtgata ctggcccacc aggacctcaa 780

ggtacaggtg gtccaccagg tgaaaatggt aaaccaggtg aaccaggtcc taagggtgat 840

gccggcgctc ctggtggcaa aggtgacgct ggcgctccag gcgagagagg acctccaggt 900

cctgaaggtg gtaaaggtgc tgccggtcct ccaggattgc aaagaatgcc aggtgagaga 960

ggtggtttgg gttcaccagg tccaaaaggc gacaaaggtg aacccggcgg acccggtgct 1020

gatggtgttc ctggtaaaga tggaccaaga ggtccaactg gaccaattgg cccacctggt 1080

ccagccggac aaccaggtga caaaggcgaa ggtggtgctc ccggtgagcc tggaagagat 1140

ggtaatccag gatctgatgg tttgccaggt cgtgatggtt cccctggcgg aaaaggtgat 1200

agaggcgaaa atggatcccc aggcgcacca ggcgctcccg gacatcccgg accaccaggt 1260

ccagtaggtc ctgcaggtaa atctggtgat aggggagaat ctggtcctgc cggtagtaga 1320

ggtgcccctg gtcctcaggg tccacgtggt gacaaaggtg agacaggtga aagaggcgct 1380

gctggtatta agggtcatag aggttttcca ggtaacccag gtgcacccgg aagtccagga 1440

ccagccggtc aacagggccc tcctggtaag gacggtactt ctggtcatcc tggtcctatt 1500

ggccctccag gaccaagggg taatagaggt gaaaggggtt ctgaaggttc cccaggtcat 1560

ccaggtcagc ccggtccacc aggacctcca ggtgctccat aagcggccgc 1610

Claims

1.重组人源III型胶原蛋白在制备浅表性创伤修护材料中的应用，其特征在于，所述的重组人源III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的浅表性创伤修护材料为修护浅表性创伤的组合物或修护浅表性创伤的敷料。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的浅表性创伤为疤痕。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，浅表性创伤修护材料中，所述的重组人源III型胶原蛋白的浓度为0.1％～0.5％w/v。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，浅表性创伤修护材料中，所述的重组人源III型胶原蛋白的浓度为0.3％w/v。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa，核苷酸序列如SEQ No.3所示。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重组人源III型胶原蛋白的表达质粒为ppic9K-Ⅲα498aa，核苷酸序列如SEQ No.4所示。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的重组人源III型胶原蛋白的表达质粒ppic9K-Ⅲα498aa通过将重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的重组人源III型胶原蛋白的表达菌株，为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0301，保藏编号为CGMCC No.16462。