CN110194795A - 一种重组人源胶原蛋白及其应用 - Google Patents

一种重组人源胶原蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组人源胶原蛋白及其应用，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明重组人源胶原蛋白具有非常好的亲水性和稳定性，其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100％相同，表达蛋白量可占菌体总蛋白的25％左右，可达到每毫菌液沉淀含有0.25毫克目的蛋白，生产成本非常低，周期短。制备的胶原蛋白应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。

Description

一种重组人源胶原蛋白及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种重组人源胶原蛋白及其应用。
(二)背景技术
年轻健康的皮肤是美丽的标准，是这个时代的消费者接受的必要性，导致研究和获得替代品的增加，将皮肤纹理改善到所需的光滑和年轻的外表。这些市场需求和解决方案都集中在一个共同的目标上，即增强胶原蛋白生产以及在护肤品中的使用。胶原蛋白是人体最丰富的蛋白质之一。已经证明胶原蛋白水解物具有显著生物活性，如抗氧化特性，抗高血压活性，降脂活性，以及修复受损皮肤性质。胶原蛋白在皮肤中具有双重作用：提供弹性蛋白和胶原蛋白形成的构建模块，充当配体或结合成纤维细胞受体刺激合成分泌透明质酸。
胶原蛋白是右旋三螺旋结构，由重复氨基酸三联体序列组成：甘氨酸-X-Y，其中X通常是脯氨酸，Y通常是羟脯氨酸。在多肽链的每第三个位置存在小氨基酸甘氨酸允许沿着胶原分子中心轴紧密堆积三螺旋。非螺旋状，球状区域存在于胶原蛋白分子的任何一端，在用适当的蛋白酶切割之前防止原纤维形成。导致其作为支架材料受欢迎的特性包括其相对低的毒性，基质金属蛋白酶的自然降解，易于交联和功能化以及物种之间存在的氨基酸序列的同源性。
动物提取胶原蛋白在生物材料领域普遍应用于药物输送和组织工程。从皮肤伤口愈合，到骨支架，到胶原蛋白水凝胶，由于它们的注射性质和原位自组装，也被用于了包括心肌，椎间椎间盘，真皮替代物，和再生软骨，但在临床应用中还有许多问题存在。主要障碍是所用胶原的来源，来源于动物或人体的胶原蛋白主要缺点是可能传播疾病，过敏反应，病原体污染。此外，还存在批次之间的差异以及文化原因增加了对动物来源胶原的使用限制。
重组蛋白质生产领域，利用表达允许形成重组体的系统人体胶原蛋白在一致，高效，安全方式。重组胶原蛋白已经开发出来了不同表达系统的数量，包括酵母，家蚕，哺乳动物细胞，转基因动物和细菌系统。重组胶原蛋白已用于骨骼，眼和皮肤。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种重组人源胶原蛋白及其应用，选取了人源三型蛋白保守区域的一段序列并将其重复8次，将设计得到的序列重组构建原核表达载体pET22b中，经过诱导表达，最终得到了能够在大肠杆菌中高效表达的，可溶于水的，具有天然人源胶原蛋白同样活性的重组人源胶原蛋白，能够有效缓解胶原蛋白市场对高品质人源胶原蛋白的需求。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种重组人源胶原蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明选取人类三型胶原保守区域肽段(SEQ ID NO.2所示)GERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPT，将该段序列重复8次并进行了密码子的优化，委托上海派森诺生物科技有限公司进行全基因合成，将其构建到pET22b的表达载体中，构建成功的质粒提取出来后转化到BL21-DE3-PLySs感受态细胞中，挑取单克隆并对其扩大培养；经过诱导表达目的蛋白，然后对表达产物进行收集和纯化，得到高纯度的可溶于水的重组胶原蛋白。对其活性进行检测，结果显示具有达到甚至超过人体天然蛋白的生物学活性，是目前报道过的最优化的胶原蛋白设计方案，可以在人体中行使天然蛋白的功能，达到真正的产品应用的目的。
本发明还提供一种所述重组人源胶原蛋白编码基因构建的重组载体，以及重组载体构建的重组基因工程菌。
进一步，所述重组载体是将SEQ ID NO.1所示基因构建到质粒pET22b中，获得重组载体。
进一步，所述重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示基因构建到质粒pET22b中，转化大肠杆菌BL21-DE3-PLySs感受态细胞，挑取阳性克隆，获得重组基因工程菌。
本发明还提供一种所述重组人源胶原蛋白在生产胶原蛋白中的应用，所述的应用是将含重组人源胶原蛋白编码基因的工程菌经诱导培养后分离纯化获得胶原蛋白，具体所述应用为：(1)将含重组人源胶原蛋白编码基因的工程菌接种至LB培养基中，37℃培养过夜，按照体积比1:100转接LB培养基，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃培养6-8小时，5000×g离心5分钟，收集菌体沉淀；(2)用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀后重悬菌体沉淀，可选择性加入含终浓度1-5mg/ml溶菌酶的Triton X-100溶液帮助裂解细胞，在冰浴下超声破菌(280W、2s超声，5s间歇，全长15min，保护温度25℃)，12000rpm离心20min，收集上清液；所述溶菌酶的Triton X-100溶液加入量以重悬所用PBS缓冲液体积为10ml/40ml；(3)用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱，然后将亲和柱和上清液分别在室温或冰上轻摇30min，上柱，用含有15mM咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白(优选洗脱1柱体积)，柱上就剩下了纯的重组人源胶原蛋白RHIIIC8，在柱上加入Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将RHIIIC8蛋白从柱上释放出来，用PBS溶液洗脱(优选1/2柱体积)，收集洗脱液，所得产物透析过夜(透析袋，RC膜，14KD，扁平宽度44mm(生工F600112))，冻干(每5mg蛋白依次加入不同体积浓度(10％，5％，3％，2％，1％)的甘露醇水溶液0.5ml，每个浓度在-40℃预冻10min，最后-35℃冻干)，获得纯化的重组人源胶原蛋白。所述蛋白酶加入量以柱子体积计为1μL/5mL。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
(1)本发明所选择序列完全来自于人的III型胶原蛋白保守区域，并对序列进行了不影响氨基酸序列前提下的密码子优化；采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，20小时即可完成一轮发酵，生产成本非常低，周期短，我们选用了BL21-DE3-PLySs表达菌种，能够降低细菌的内源蛋白表达并进一步提高了目的蛋白的纯度和产量，表达蛋白量可占菌体总蛋白的25％左右，可达到每毫菌液沉淀含有0.25毫克目的蛋白。
(2)通过序列分析和实验筛选，本发明方法制备的重组人源胶原蛋白具有非常好的亲水性和稳定性(室温保存30天活性没有明显下降)，其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100％相同，应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。
(3)本发明产品经过活性检测，具有达到甚至超过人体天然蛋白的生物学活性，是目前报道过的最优化的胶原蛋白设计方案，可以在人体中行使天然蛋白的功能，达到真正的产品应用的目的。
(四)附图说明
图1为本发明pET22b-RHIIIC8载体构建的质粒图谱。
图2为本发明RHIIIC8与人源胶原蛋白氨基酸比对结果。
图3为本发明RHIIIC8蛋白纯化后的电泳图。
图4为本发明RHIIIC8蛋白与人源胶原蛋白相对照的生物活性检测结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述LB液体培养基组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值7.5。LB平板培养基是在LB液体培养基中添加15g/L琼脂。
本发明所述室温是指25-30℃。
实施例1、RHIIIC8基因表达载体的构建及表达
1、类人源胶原蛋白RHIIIC8基因的获取
选取人类三型胶原保守区域肽段GERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPT(SEQ IDNO.2)，将该段序列重复8次并进行了密码子的优化，委托上海派森诺生物科技有限公司进行全基因合成，基因两端加入Xba I和Sal I酶切位点，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，记为基因RHIIIC8。
atgggagaacgaggcggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggtaagaatggtgaaaccggacctcagggacctccaggacctactggtgagcgaggtggtccaggtggccctggcccacaaggcccacccggaaagaacggtgagactggtccacaaggtcctccaggtccaaccggcgaacgaggaggacctggaggacctggtcctcagggtccgcctgggaagaatggtgaaacaggaccgcagggacctcctggacctacgggtgagcgaggtggtccaggcggtcctggccctcaaggacctccaggcaagaacggtgagactggccctcaaggaccaccaggtccaactggcgaacgaggcggccctggaggacctggcccacagggtccgcctggaaagaatggtgaaactggacctcagggtcctccaggacctactggtgaacgaggtggacctggtggacctggcccacaaggtccaccaggcaagaacggtgagacaggccctcagggacctccaggtcctactggagagcgaggaggcccaggaggccctggccctcagggacctcctggtaagaatggtgaaaccggaccacaagggccaccaggacctactggcgagcgaggtggtcctggcggtcctggccctcagggtccaccaggaaagaacggtgagacgggtcctcagggacctccagggccaaca。
基因RHIIIC8编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
MGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPT。
2、重组表达载体pET22b-RHIIIC8的构建
将SEQ ID NO.1所示基因单克隆接种至5ml LB培养基中，37℃扩大培养过夜后，提取带有目的基因的质粒，利用Xba I和Sal I进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因，并与相应酶切处理过的pET22b表达载体(含有His标签)37℃共孵育2h(图1)，加入T4 DNA连接酶，25℃连接4小时，转化大肠杆菌DH5α，用含0.1mg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选挑出白斑克隆，利用PCR的方法鉴定阳性克隆正确，挑取阳性克隆进行测序，确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，成功构建重组表达载体pET22b-RHIIIC8。将正确的克隆接种至5mlLB培养基中，37℃扩大培养过夜，利用康为质粒提取试剂盒提取质粒，获得质粒pET22b-RHIIIC8。
3、重组人源胶原蛋白的诱导和表达
将步骤2质粒pET22b-RHIIIC8转化大肠杆菌BL21-DE3-PLySs(购自唯地生物EC1003S)，用含0.1mg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选出单克隆，在5ml LB培养基中37℃培养过夜，按照体积比1:100转接至LB培养基，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃培养6-8小时，5000×g离心5分钟，收集菌体沉淀，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
4、重组人源胶原蛋白RHIIIC8的纯化
取5g步骤3的菌体沉淀用PBS缓冲液洗涤，用40ml PBS缓冲液重悬菌体沉淀，加入10ml含终浓度5mg/ml溶菌酶的Triton X-100溶液帮助裂解细菌，超声破菌(280W、2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度25℃)，12000rpm离心20min，收集上清液，该上清液中即含有大量的重组人源胶原蛋白RHIIIC8。
用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱(Ni-NTA预装重力柱，5ml(生工C600793))，然后将亲和柱和上清液分别在室温或冰上轻摇30min，上柱，用5ml含有15mM咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的重组人源胶原蛋白RHIIIC8，在柱上加入1μL具有His标签的Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将RHIIIC8蛋白从柱上释放出来，用2.5ml PBS溶液洗脱，收集洗脱液并透析过夜(透析袋，RC膜，14KD，扁平宽度44mm(生工F600112))，冻干(按每5mg蛋白依次加入不同体积浓度(10％，5％，3％，2％，1％)的甘露醇水溶液0.5ml，每个浓度在-40℃预冻10min，最后-35℃冻干)，获得纯化的重组人源胶原蛋白RHIIIC8。取一部分纯化样品进行PAGE胶电泳，来检测蛋白质大小及纯度(图2)，蛋白质大小接近23KDa，在接近28KDa marker下方有一条单一的清晰的目地蛋白条带。
5、重组人源胶原蛋白RHIIIC8活性检测
利用BCA法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天P0006)测定蛋白质浓度。BCA方法的原理：在碱性条件下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处有最大的光吸收值并于蛋白质浓度成正比。该测定法实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。
(1)BCA工作液：BCA试剂A与BCA试剂B按体积比50:1配制BCA工作液，充分混匀。
(2)样品检测
将步骤4制备的纯化重组人源胶原蛋白RHIIIC8用PBS制备成0.5mg/ml的样品，取20μL样品到96孔板的样品孔中，各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30分钟。测定A562，根据蛋白浓度＝(A562值-0.16)/0.712计算出样品中蛋白浓度为10mg/ml。
(3)细胞的贴壁率
3T3细胞的培养：鼠纤维原细胞3T3(购自继和生物JH-M2003)接种至含10％FBS的DMEM培养基，37℃培养5～6h或过夜后，观察细胞贴壁情况。每两天换一次培养液，培养至细胞长到70～80％，即为3T3细胞。
将步骤4制备的纯化重组人源胶原蛋白RHIIIC8和人源胶原蛋白标准品(购自生工A001654)分别用PBS配制成0.5mg/ml蛋白溶液。
向96孔板中加入100μL0.5mg/ml的重组人源胶原蛋白RHIIIC8溶液和人源胶原蛋白标准品溶液分别作为待测细胞和对照细胞，以PBS为空白对照，室温静置60min。每孔中加入上述105个3T3细胞，37℃孵育60min。每孔用PBS清洗4次。用细胞粘附检测试剂盒(贝博BB-48120)检测OD450nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁程度。细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。以人胶原蛋白标准品的贴壁率为1，可以测算出RHIIIC8样品的相对细胞黏附活性(图4)，相比于人源胶原蛋白40％的细胞粘附效率，RHIIIC8的细胞粘附效率可以达到90％。
细胞粘附率％＝((待测细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD))x100
序列表
<110> 郭伟
<120> 一种重组人源胶原蛋白及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
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aca 723
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Met Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro
1 5 10 15
Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly
20 25 30
Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Lys
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Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Glu Arg
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Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Glu Arg Gly Gly
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Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Glu Thr
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Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly
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195 200 205
Gly Pro Thr Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly
210 215 220
Pro Pro Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro
225 230 235 240
Thr

Claims (10)

1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
2.一种权利要求1所述重组人源胶原蛋白编码基因，其特征在于所述蛋白编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.一种权利要求2所述重组人源胶原蛋白编码基因构建的重组载体。
4.一种权利要求3所述重组载体构建的重组基因工程菌。
5.如权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示基因构建到质粒pET22b中，转化大肠杆菌BL21-DE3-PLySs感受态细胞，挑取阳性克隆，获得重组基因工程菌。
6.一种权利要求1所述重组人源胶原蛋白在生产胶原蛋白中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：(1)将含重组人源胶原蛋白编码基因的工程菌接种至LB培养基中，37℃培养过夜，按照体积比1:100转接LB培养基，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃培养6-8小时，5000×g离心5分钟，收集菌体沉淀；(2)用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀后重悬菌体沉淀，在冰浴下超声破菌，12000rpm离心20min，收集上清液；(3)用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱，然后将亲和柱和上清液分别在室温或冰上轻摇30min，上柱，用含有15mM咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白，在柱上加入PPase蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，用PBS溶液洗脱，收集洗脱液，所得产物透析过夜，冻干，获得纯化的重组人源胶原蛋白。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于步骤(2)菌体沉淀重悬后加入含终浓度1-5mg/ml溶菌酶的Triton X-100溶液裂解细胞，然后再进行超声破菌。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于步骤(2)超声破菌条件为：280W、2s超声，5s间歇，全长15min，保护温度25℃。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于步骤(3)所述透析采用截留分子量为14KD的透析袋，所述冻干条件为：按每5mg蛋白依次加入体积浓度10％，5％，3％，2％，1％的甘露醇水溶液0.5ml，每个浓度在-40℃预冻10min，最后-35℃冻干。
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