CN117304306A - 一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3，其氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示。还公开了其重组蛋白、编码基因、表达载体及制备方法，以及一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体及其重组蛋白突变体、编码基因、表达载体，及前述蛋白的应用。本发明的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3，其突变氨基酸序列具有稳固三螺旋结构，具有良好的生物活性，其生物活性接近人体Ⅲ型胶原蛋白。可以与其余蛋白复配成为组织工程产品、化妆品、保健品或药物的原材料。

Description

一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用，属于蛋白表达技术领域。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，其广泛分布在动物的皮肤、骨骼、肌腱、韧带和血管之中。人体中胶原蛋白含量占总蛋白的25％～30％，是一种重要的结构蛋白，起着保护机体、支撑器官的重要作用。
目前已发现胶原蛋白有28种类型，不同类型的胶原蛋白具有不同的功能。一般分为两大类：一类是成纤维胶原蛋白；另一类是非成纤维胶原蛋白；成纤维胶原蛋白包括I、II、Ⅲ、V、VI和XXVI型胶原蛋白，其余均属于非纤维胶原蛋白。人体中含量最多的是I型胶原蛋白，约占85％以上，I型胶原蛋白在骨、皮肤、腱和角膜中含量高，II型胶原蛋白主要存在于软骨、椎间盘和玻璃体中，Ⅲ型胶原蛋白主要存在于血管、新生皮肤和瘢痕组织中。
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。用这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。所以，目前胶原蛋白通常在化妆品和保健品中使用，而无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。
由于胶原蛋白以动物组织为来源，提取的天然胶原蛋白是多种不同分子量的胶原蛋白组成的混合物，不溶于水，生物相容性较差；此外，提取的天然胶原蛋白来源于动物组织，对于动物源疾病或者人传染疾病有交叉感染的风险，同时无法与人体相容，会导致出现免疫排斥和过敏症状。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3。
本发明采用的技术方案：
一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3，其氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQIDNo.6或SEQ ID No.8所示；或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8中任一条具有95％以上的同源性，且细胞黏附活性与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6或SEQ ID No.8所示的蛋白基本相当。或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.8中任一条具有99％以上的同源性，且细胞黏附活性与SEQ ID No.2、SEQID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示的蛋白基本相当。
一种重组蛋白，由前述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3与纤维胶原蛋白通过接头连接而成，其中纤维胶原蛋白的序列如SEQ ID No.10所示。
前述的重组蛋白的编码基因。
前述的重组蛋白的表达载体。
前述的重组蛋白的表达宿主菌。
还公开了前述的重组蛋白的制备方法，其步骤包括：
(1)构建前述的表达载体，将其转化到表达宿主菌中；
(2)培养表达宿主菌，诱导重组蛋白表达；
(3)纯化表达产物，得到所需的重组蛋白。
本发明还公开了一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示；或者与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9中任一条具有95％以上的同源性，且细胞黏附活性与SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示的蛋白基本相当。或者与SEQ IDNo.3、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9中任一条具有99％以上的同源性，且细胞黏附活性与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示的蛋白基本相当。
一种重组蛋白突变体，由前述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体与纤维胶原蛋白连接而成，其中纤维胶原蛋白的序列如SEQ ID No.10所示。
前述的重组蛋白突变体的编码基因。
前述的重组蛋白突变体的表达载体。
优选的，载体骨架为pET30a。
以及前述的重组蛋白突变体的表达宿主菌。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌。
以及前述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3、重组蛋白或者重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体、重组蛋白突变体在辅助细胞培养中的应用。可以将其添加到细胞培养基中，提高细胞贴壁率。
本发明的有益效果：
本发明的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3，其突变氨基酸序列具有稳固三螺旋结构，具有良好的生物活性，其生物活性接近人体Ⅲ型胶原蛋白。本发明所制备的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白Pro.C3的氨基酸序列源自天然胶原蛋白氨基酸序列，可以与其余蛋白复配成为组织工程产品、化妆品、保健品或药物的原材料。且可用原核系统来进行表达，表达体系简单，成本低，产量高。
附图说明
图1本发明的重组表达载体pET30a-3-2-a图谱。
图2本发明的重组表达载体pET30a-3-2-d图谱。
图3本发明的重组表达载体pET30a-3-2-e图谱。
图4本发明的重组表达载体pET30a-3-2-g图谱。
图5本发明的重组胶原蛋白诱导表达SDS-PAGE胶图：M是分子量Marker；第1泳道是DE3-pET30a-3-2-a诱导；第2泳道是DE3-pET30a-3-2-a不诱导；第3泳道是DE3-pET30a-3-2-d诱导；第4泳道是DE3-pET30a-3-2-d不诱导；第5泳道是DE3-pET30a-3-2-e诱导；第6泳道是DE3-pET30a-3-2-e不诱导；第7泳道是DE3-pET30a-3-2-g诱导；第8泳道是DE3-pET30a-3-2-g不诱导；第9泳道是DE3-pET30a-3-2-a诱导；第10泳道是DE3-pET30a-3-2-a不诱导；第11泳道是DE3-pET30a-3-2-a(TB)诱导；第12泳道是DE3-pET30a-3-2-a(TB)不诱导。
图6为商品化的人胶原蛋白与本发明的蛋白Pro.C3的细胞黏附活性检测结果。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3系列质粒的制备
(1)基因设计及合成
SEQ ID No.1为人Ⅲ型胶原蛋白的全序列。本发明中，构建重组人源化Ⅲ型胶原蛋白纤维胶原蛋白-Linker-Pro.C3的表达载体，其中重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3分别为Pro.C3a、Pro.C3d、Pro.C3e、Pro.C3g，其相应的氨基酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.8，对应的编码基因序列为SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.29；纤维胶原蛋白对应的氨基酸序列为SEQ ID No.10，编码基因序列为SEQ IDNo.31，Linker的氨基酸序列为GSGGGS，如SEQ ID No.11所示，编码DNA序列如SEQIDNo.32所示。将前述重组纤维胶原蛋白-Linker-Pro.C3对应的编码基因委托北京六合华大基因科技有限公司合成。
(2)重组表达载体的构建
以上述合成的基因片段为模板，PCR扩增，并将目的基因片段和pET30a表达载体骨架通过Gibson-plasmid连接方式进行连接，得到相应的质粒，依次命名为pET30a-3-2-a、pET30a-3-2-d、pET30a-3-2-e、pET30a-3-2-g。其中pET30a-3-2-a表达的重组蛋白结构为纤维胶原蛋白-Linker-Pro.C3a，其余质粒依次类推。
引物设计：
引物名称 引物序列
pET30a-骨架-F GATCCGGCTGCTAACAAAGCC(SEQ ID No.12)
pET30a-骨架-R CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGG(SEQ ID No.13)
3-2-adeg-目的-F AAGAAGGAGATATACATATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGAAAG(SEQ ID No.14)
3-2-a-目的-R GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGAC(SEQ ID No.15)
3-2-d-目的-R GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGT(SEQ ID No.16)
3-2-e-目的-R GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGA(SEQ ID No.17)
3-2-g-目的-R GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGA(SEQ ID No.18)
PCR扩增：
体系成分 成分体积
引物F 2.5μL
引物R 2.5μL
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix 2μL
委托华大基因合成的编码基因 25μL
ddH2O To 50μL
配制完PCR体系后，混匀并离心，PCR扩增条件为：第一阶段98℃预变性30s；第二阶段98℃变性10s，50-72℃退火30s，72℃延伸30s/kb，32个循环次数；第三阶段72℃终延伸2min。使用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收上述载体及基因片段，按照产品说明书的操作步骤进行。
Gibson连接：
体系成分 成分体积
Gibson Assembly Master Mix(2X) 5μL
连接片段 0.2–1pmols*XμL
dd H2O (5-X)μL
总体系 10μL
将以上成分在冰上混匀之后置于37℃热浴60min，获得的连接产物储存在冰上或者-20℃，以便后续的感受态转化。
连接产物通过热激方法转化至宿主菌E.coliDH5α中，涂布与LB培养抗性平板，37℃保温过夜，随机挑取阳性克隆，进行LB液体培养基，37℃，220rpm培养过夜，采用质粒快速提取试剂盒提取质粒，构建成功的质粒pET30a-3-2-a、pET30a-3-2-d、pET30a-3-2-e、pET30a-3-2-g其图谱参见图1-4。
(3)工程菌的构建
将上述获得的重组表达质粒通过热激方式转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌，具体过程为：①取4μL的重组表达质粒于100μL的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min；②将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min；③向该混合物中加入700μL无抗性的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)，37℃，220rpm条件下培养1h；④取200μL该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/mL氨苄青霉素)上；⑤将平板倒置培养于37℃恒温箱中，培养约16h，待长出清晰可见的菌落，得到对应的DE3-pET30a-3-2-a、DE3-pET30a-3-2-d、DE3-pET30a-3-2-e、DE3-pET30a-3-2-g工程菌。
实施例2：工程菌的诱导表达
将上述平板上的单菌落置于含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养10小时，此为一级种子液，以1％的接种量接种到新的LB培养基中，37℃培养过夜，此为二级种子液，再以5％的接种量接种到新的LB培养基中，37℃培养2h，加入终浓度为0.5mMIPTG、18℃进行诱导表达，培养16小时。4000g、4℃离心20min收集菌体。
将菌体重悬在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,1mM EDTA,500mM NaCl,pH8.5)中，加入100X蛋白酶抑制剂PMSF，然后使用360W超声仪超声50min(超声5s间隙8s)破碎细胞后，取1mL破碎液在4℃和12000rpm下离心2min，取80μL上清，沉淀用200μL裂解缓冲液重悬，弃120μL重悬液，上清和沉淀都加入20μL 5X蛋白上样缓冲液，混合后在沸水浴中加热10min进行SDS-PAGE，结果如图5所示，在诱导的情况下，构建的工程菌都有蛋白表达。
实施例3：系列重组突变表达载体的构建
对上述获得的重组表达质粒pET30a-3-2-a使用定点突变的方式，设计5个突变位点，通过Snapgene软件设计Pro.C3a的第6/9/24/26/30位的氨基酸突变成脯氨酸(突变后的Pro.C3a对应的氨基酸序列为SEQ ID No.3，编码DNA序列为SEQ ID No.24)，得到相应的质粒，命名为pET30a-3-2-a(TB)，其表达的重组纤维胶原蛋白-linker-蛋白为Pro.C3a突变体，质粒通过热激方法转化至宿主菌E.coliDH5α中，涂布于LB培养抗性平板，37℃保温过夜。
同样，使用定点突变的方式，将重组表达质粒pET30a-3-2-d的Pro.C3d第17/19/20/22/37/41/68/70/71/73/74/92/94位的氨基酸突变成脯氨酸(对应的Pro.C3d突变体氨基酸序列为SEQ ID No.5，编码DNA序列为SEQ ID No.26)；将重组表达质粒pET30a-3-2-e的Pro.C3e的第15/17/18/20/21/39/41位的氨基酸突变成脯氨酸(对应的Pro.C3e突变体氨基酸序列为SEQ ID No.7，编码DNA序列为SEQ ID No.28)；将重组表达质粒pET30a-3-2-g的Pro.C3g的第159/161/162/176位的氨基酸突变成脯氨酸(对应的Pro.C3g突变体氨基酸序列为SEQ ID No.9，编码DNA序列为SEQ ID No.30)，得到相应的重组质粒，分别命名为：pET30a-3-2-d(TB)、pET30a-3-2-e(TB)、pET30a-3-2-g(TB)。
引物设计：
3-2-a(TB)骨架-F：GATCCGGCTGCTAACAAAGCC(SEQ ID No.19)
3-2-a(TB)骨架-R：GTTATGAACCACAACGCCTTCCG(SEQ ID No.20)
3-2-a(TB)目的-F：
AAGGCGTTGTGGTTCATAACGGTCCACCAGGTCCACCG(SEQ ID No.21)
3-2-a(TB)目的-R：
GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGAC(SEQ ID No.22)。
在平板上挑取单克隆进行增殖，采用质粒快速提取试剂盒提取质粒，重组表达质粒通过热激方式转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，具体参照工程菌构建的实验操作，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌DE3-pET30a-3-2-a(TB)。
实施例4：重组突变pET30a-3-2-a(TB)工程菌诱导表达
将上述平板上挑取单菌落按照实施例2工程菌的诱导表达的方法进行发酵表达，结果如图5所示，可以看出，重组突变pET30a-3-2-a(TB)工程菌的蛋白表达量明显高于原工程菌pET30a-3-2-a的表达量。
实施例5：表达产物的纯化
将实施例2和实施例4所得到的破碎液进行17000rpm 4℃离心20分钟，收集上清液，用清水洗涤Ni亲和柱柱材，用buffer 1(25mMTris，200mM NaCl，pH8.0)平衡柱材，上样，用含有20mM咪唑的洗涤缓冲液(20mM咪唑，25mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)漂洗杂蛋白，用含有250mM咪唑的溶液(250mM咪唑，25mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)洗脱目的蛋白；用含有1M咪唑的溶液洗涤柱材，再用水洗涤柱材，最后用20％乙醇填充柱材。
实施例6：重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性检测
胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-LikeProteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived fromNative Collagens,JBiochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：
(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括商品化的人Ⅲ型胶原蛋白(Sigma，C7774)、本发明提供的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白Pro.C3。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)＝144×(A215-A225)计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。
(2)向96孔板中加入100μL各浓度调整后的蛋白溶液和空白PBS溶液对照，室温静置60min。
(3)每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞，37℃孵育60min。
(4)每孔用PBS清洗4次。
(5)用LDH检测试剂盒(Roche，04744926001)检测每个孔在492nm的吸光度OD492nm。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下：细胞贴壁率＝(测试孔-空白孔)×100％/(阳性孔-空白孔)。
结果如图6所示，从图6可知，相比于商品化的人胶原蛋白，添加了本发明的重组人源化Ⅲ型Pro.C3胶原蛋白的孔OD492nm更大，意味着该孔细胞的贴壁率越高。证明本发明的蛋白Pro.C3具有比商品化的人胶原蛋白更高的生物活性，能在更短的时间内给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。

Claims (10)

1.一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQIDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示；或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.8中任一条具有95％以上的同源性，且细胞黏附活性与SEQ IDNo.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示的蛋白基本相当。
2.一种重组蛋白，其特征在于由权利要求1所述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3与纤维胶原蛋白通过接头连接而成，其中纤维胶原蛋白的序列如SEQ ID No.10所示。
3.权利要求2所述的重组蛋白的编码基因。
4.权利要求2所述的重组蛋白的表达载体。
5.权利要求2所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)构建权利要求4所述的表达载体，将其转化到表达宿主菌中；
(2)培养表达宿主菌，诱导重组蛋白表达；
(3)纯化表达产物，得到权利要求2所述的重组蛋白。
6.一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.3、SEQID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示；或者与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQIDNo.7、SEQ ID No.9中任一条具有95％以上的同源性，且细胞黏附活性与SEQ IDNo.3、SEQID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示的蛋白基本相当。
7.一种重组蛋白突变体，其特征在于由权利要求6所述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体与纤维胶原蛋白通过接头连接而成，其中纤维胶原蛋白的序列如SEQ ID No.10所示。
8.权利要求7所述的重组蛋白突变体的编码基因。
9.权利要求7所述的重组蛋白突变体的表达载体。
10.权利要求1、2、6、7中任一项所述的蛋白在辅助细胞培养中的应用。
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