CN117304306A - 一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用 - Google Patents
一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117304306A CN117304306A CN202311277358.4A CN202311277358A CN117304306A CN 117304306 A CN117304306 A CN 117304306A CN 202311277358 A CN202311277358 A CN 202311277358A CN 117304306 A CN117304306 A CN 117304306A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- recombinant
- collagen
- protein
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 63
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 claims description 4
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 abstract description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3,其氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示。还公开了其重组蛋白、编码基因、表达载体及制备方法,以及一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体及其重组蛋白突变体、编码基因、表达载体,及前述蛋白的应用。本发明的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3,其突变氨基酸序列具有稳固三螺旋结构,具有良好的生物活性,其生物活性接近人体Ⅲ型胶原蛋白。可以与其余蛋白复配成为组织工程产品、化妆品、保健品或药物的原材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用,属于蛋白表达技术领域。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质,其广泛分布在动物的皮肤、骨骼、肌腱、韧带和血管之中。人体中胶原蛋白含量占总蛋白的25%~30%,是一种重要的结构蛋白,起着保护机体、支撑器官的重要作用。
目前已发现胶原蛋白有28种类型,不同类型的胶原蛋白具有不同的功能。一般分为两大类:一类是成纤维胶原蛋白;另一类是非成纤维胶原蛋白;成纤维胶原蛋白包括I、II、Ⅲ、V、VI和XXVI型胶原蛋白,其余均属于非纤维胶原蛋白。人体中含量最多的是I型胶原蛋白,约占85%以上,I型胶原蛋白在骨、皮肤、腱和角膜中含量高,II型胶原蛋白主要存在于软骨、椎间盘和玻璃体中,Ⅲ型胶原蛋白主要存在于血管、新生皮肤和瘢痕组织中。
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织,提取胶原蛋白衍生物。用这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性,无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。所以,目前胶原蛋白通常在化妆品和保健品中使用,而无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。
由于胶原蛋白以动物组织为来源,提取的天然胶原蛋白是多种不同分子量的胶原蛋白组成的混合物,不溶于水,生物相容性较差;此外,提取的天然胶原蛋白来源于动物组织,对于动物源疾病或者人传染疾病有交叉感染的风险,同时无法与人体相容,会导致出现免疫排斥和过敏症状。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3。
本发明采用的技术方案:
一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3,其氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQIDNo.6或SEQ ID No.8所示;或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8中任一条具有95%以上的同源性,且细胞黏附活性与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6或SEQ ID No.8所示的蛋白基本相当。或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.8中任一条具有99%以上的同源性,且细胞黏附活性与SEQ ID No.2、SEQID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示的蛋白基本相当。
一种重组蛋白,由前述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3与纤维胶原蛋白通过接头连接而成,其中纤维胶原蛋白的序列如SEQ ID No.10所示。
前述的重组蛋白的编码基因。
前述的重组蛋白的表达载体。
前述的重组蛋白的表达宿主菌。
还公开了前述的重组蛋白的制备方法,其步骤包括:
(1)构建前述的表达载体,将其转化到表达宿主菌中;
(2)培养表达宿主菌,诱导重组蛋白表达;
(3)纯化表达产物,得到所需的重组蛋白。
本发明还公开了一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体,其氨基酸序列如SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示;或者与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9中任一条具有95%以上的同源性,且细胞黏附活性与SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示的蛋白基本相当。或者与SEQ IDNo.3、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9中任一条具有99%以上的同源性,且细胞黏附活性与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示的蛋白基本相当。
一种重组蛋白突变体,由前述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体与纤维胶原蛋白连接而成,其中纤维胶原蛋白的序列如SEQ ID No.10所示。
前述的重组蛋白突变体的编码基因。
前述的重组蛋白突变体的表达载体。
优选的,载体骨架为pET30a。
以及前述的重组蛋白突变体的表达宿主菌。
优选的,所述宿主菌为大肠杆菌。
以及前述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3、重组蛋白或者重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体、重组蛋白突变体在辅助细胞培养中的应用。可以将其添加到细胞培养基中,提高细胞贴壁率。
本发明的有益效果:
本发明的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3,其突变氨基酸序列具有稳固三螺旋结构,具有良好的生物活性,其生物活性接近人体Ⅲ型胶原蛋白。本发明所制备的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白Pro.C3的氨基酸序列源自天然胶原蛋白氨基酸序列,可以与其余蛋白复配成为组织工程产品、化妆品、保健品或药物的原材料。且可用原核系统来进行表达,表达体系简单,成本低,产量高。
附图说明
图1本发明的重组表达载体pET30a-3-2-a图谱。
图2本发明的重组表达载体pET30a-3-2-d图谱。
图3本发明的重组表达载体pET30a-3-2-e图谱。
图4本发明的重组表达载体pET30a-3-2-g图谱。
图5本发明的重组胶原蛋白诱导表达SDS-PAGE胶图:M是分子量Marker;第1泳道是DE3-pET30a-3-2-a诱导;第2泳道是DE3-pET30a-3-2-a不诱导;第3泳道是DE3-pET30a-3-2-d诱导;第4泳道是DE3-pET30a-3-2-d不诱导;第5泳道是DE3-pET30a-3-2-e诱导;第6泳道是DE3-pET30a-3-2-e不诱导;第7泳道是DE3-pET30a-3-2-g诱导;第8泳道是DE3-pET30a-3-2-g不诱导;第9泳道是DE3-pET30a-3-2-a诱导;第10泳道是DE3-pET30a-3-2-a不诱导;第11泳道是DE3-pET30a-3-2-a(TB)诱导;第12泳道是DE3-pET30a-3-2-a(TB)不诱导。
图6为商品化的人胶原蛋白与本发明的蛋白Pro.C3的细胞黏附活性检测结果。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是,应当理解的是,这些仅仅是示例性的,并不意图限制本发明,与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3系列质粒的制备
(1)基因设计及合成
SEQ ID No.1为人Ⅲ型胶原蛋白的全序列。本发明中,构建重组人源化Ⅲ型胶原蛋白纤维胶原蛋白-Linker-Pro.C3的表达载体,其中重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3分别为Pro.C3a、Pro.C3d、Pro.C3e、Pro.C3g,其相应的氨基酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.8,对应的编码基因序列为SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.29;纤维胶原蛋白对应的氨基酸序列为SEQ ID No.10,编码基因序列为SEQ IDNo.31,Linker的氨基酸序列为GSGGGS,如SEQ ID No.11所示,编码DNA序列如SEQIDNo.32所示。将前述重组纤维胶原蛋白-Linker-Pro.C3对应的编码基因委托北京六合华大基因科技有限公司合成。
(2)重组表达载体的构建
以上述合成的基因片段为模板,PCR扩增,并将目的基因片段和pET30a表达载体骨架通过Gibson-plasmid连接方式进行连接,得到相应的质粒,依次命名为pET30a-3-2-a、pET30a-3-2-d、pET30a-3-2-e、pET30a-3-2-g。其中pET30a-3-2-a表达的重组蛋白结构为纤维胶原蛋白-Linker-Pro.C3a,其余质粒依次类推。
引物设计:
引物名称 | 引物序列 |
pET30a-骨架-F | GATCCGGCTGCTAACAAAGCC(SEQ ID No.12) |
pET30a-骨架-R | CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGG(SEQ ID No.13) |
3-2-adeg-目的-F | AAGAAGGAGATATACATATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGAAAG(SEQ ID No.14) |
3-2-a-目的-R | GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGAC(SEQ ID No.15) |
3-2-d-目的-R | GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGT(SEQ ID No.16) |
3-2-e-目的-R | GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGA(SEQ ID No.17) |
3-2-g-目的-R | GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGA(SEQ ID No.18) |
PCR扩增:
体系成分 | 成分体积 |
引物F | 2.5μL |
引物R | 2.5μL |
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | 2μL |
委托华大基因合成的编码基因 | 25μL |
ddH2O | To 50μL |
配制完PCR体系后,混匀并离心,PCR扩增条件为:第一阶段98℃预变性30s;第二阶段98℃变性10s,50-72℃退火30s,72℃延伸30s/kb,32个循环次数;第三阶段72℃终延伸2min。使用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收上述载体及基因片段,按照产品说明书的操作步骤进行。
Gibson连接:
体系成分 | 成分体积 |
Gibson Assembly Master Mix(2X) | 5μL |
连接片段 | 0.2–1pmols*XμL |
dd H2O | (5-X)μL |
总体系 | 10μL |
将以上成分在冰上混匀之后置于37℃热浴60min,获得的连接产物储存在冰上或者-20℃,以便后续的感受态转化。
连接产物通过热激方法转化至宿主菌E.coliDH5α中,涂布与LB培养抗性平板,37℃保温过夜,随机挑取阳性克隆,进行LB液体培养基,37℃,220rpm培养过夜,采用质粒快速提取试剂盒提取质粒,构建成功的质粒pET30a-3-2-a、pET30a-3-2-d、pET30a-3-2-e、pET30a-3-2-g其图谱参见图1-4。
(3)工程菌的构建
将上述获得的重组表达质粒通过热激方式转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌,具体过程为:①取4μL的重组表达质粒于100μL的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,冰上静置30min;②将该混合物于42℃水浴锅中热激90s,然后迅速置于冰上静置2min;③向该混合物中加入700μL无抗性的LB液体培养基(10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/L氯化钠),37℃,220rpm条件下培养1h;④取200μL该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板(10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/L氯化钠,15g/L琼脂,100μg/mL氨苄青霉素)上;⑤将平板倒置培养于37℃恒温箱中,培养约16h,待长出清晰可见的菌落,得到对应的DE3-pET30a-3-2-a、DE3-pET30a-3-2-d、DE3-pET30a-3-2-e、DE3-pET30a-3-2-g工程菌。
实施例2:工程菌的诱导表达
将上述平板上的单菌落置于含有氨苄抗生素的LB液体培养基中,37℃,220rpm培养10小时,此为一级种子液,以1%的接种量接种到新的LB培养基中,37℃培养过夜,此为二级种子液,再以5%的接种量接种到新的LB培养基中,37℃培养2h,加入终浓度为0.5mMIPTG、18℃进行诱导表达,培养16小时。4000g、4℃离心20min收集菌体。
将菌体重悬在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,1mM EDTA,500mM NaCl,pH8.5)中,加入100X蛋白酶抑制剂PMSF,然后使用360W超声仪超声50min(超声5s间隙8s)破碎细胞后,取1mL破碎液在4℃和12000rpm下离心2min,取80μL上清,沉淀用200μL裂解缓冲液重悬,弃120μL重悬液,上清和沉淀都加入20μL 5X蛋白上样缓冲液,混合后在沸水浴中加热10min进行SDS-PAGE,结果如图5所示,在诱导的情况下,构建的工程菌都有蛋白表达。
实施例3:系列重组突变表达载体的构建
对上述获得的重组表达质粒pET30a-3-2-a使用定点突变的方式,设计5个突变位点,通过Snapgene软件设计Pro.C3a的第6/9/24/26/30位的氨基酸突变成脯氨酸(突变后的Pro.C3a对应的氨基酸序列为SEQ ID No.3,编码DNA序列为SEQ ID No.24),得到相应的质粒,命名为pET30a-3-2-a(TB),其表达的重组纤维胶原蛋白-linker-蛋白为Pro.C3a突变体,质粒通过热激方法转化至宿主菌E.coliDH5α中,涂布于LB培养抗性平板,37℃保温过夜。
同样,使用定点突变的方式,将重组表达质粒pET30a-3-2-d的Pro.C3d第17/19/20/22/37/41/68/70/71/73/74/92/94位的氨基酸突变成脯氨酸(对应的Pro.C3d突变体氨基酸序列为SEQ ID No.5,编码DNA序列为SEQ ID No.26);将重组表达质粒pET30a-3-2-e的Pro.C3e的第15/17/18/20/21/39/41位的氨基酸突变成脯氨酸(对应的Pro.C3e突变体氨基酸序列为SEQ ID No.7,编码DNA序列为SEQ ID No.28);将重组表达质粒pET30a-3-2-g的Pro.C3g的第159/161/162/176位的氨基酸突变成脯氨酸(对应的Pro.C3g突变体氨基酸序列为SEQ ID No.9,编码DNA序列为SEQ ID No.30),得到相应的重组质粒,分别命名为:pET30a-3-2-d(TB)、pET30a-3-2-e(TB)、pET30a-3-2-g(TB)。
引物设计:
3-2-a(TB)骨架-F:GATCCGGCTGCTAACAAAGCC(SEQ ID No.19)
3-2-a(TB)骨架-R:GTTATGAACCACAACGCCTTCCG(SEQ ID No.20)
3-2-a(TB)目的-F:
AAGGCGTTGTGGTTCATAACGGTCCACCAGGTCCACCG(SEQ ID No.21)
3-2-a(TB)目的-R:
GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGATGGTGGTGGTGGTGAC(SEQ ID No.22)。
在平板上挑取单克隆进行增殖,采用质粒快速提取试剂盒提取质粒,重组表达质粒通过热激方式转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,具体参照工程菌构建的实验操作,筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌DE3-pET30a-3-2-a(TB)。
实施例4:重组突变pET30a-3-2-a(TB)工程菌诱导表达
将上述平板上挑取单菌落按照实施例2工程菌的诱导表达的方法进行发酵表达,结果如图5所示,可以看出,重组突变pET30a-3-2-a(TB)工程菌的蛋白表达量明显高于原工程菌pET30a-3-2-a的表达量。
实施例5:表达产物的纯化
将实施例2和实施例4所得到的破碎液进行17000rpm 4℃离心20分钟,收集上清液,用清水洗涤Ni亲和柱柱材,用buffer 1(25mMTris,200mM NaCl,pH8.0)平衡柱材,上样,用含有20mM咪唑的洗涤缓冲液(20mM咪唑,25mM Tris,200mM NaCl,pH8.0)漂洗杂蛋白,用含有250mM咪唑的溶液(250mM咪唑,25mM Tris,200mM NaCl,pH8.0)洗脱目的蛋白;用含有1M咪唑的溶液洗涤柱材,再用水洗涤柱材,最后用20%乙醇填充柱材。
实施例6:重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的生物活性检测
胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-LikeProteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived fromNative Collagens,JBiochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下:
(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度,包括商品化的人Ⅲ型胶原蛋白(Sigma,C7774)、本发明提供的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白Pro.C3。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收,利用经验公式C(μg/mL)=144×(A215-A225)计算蛋白质浓度,注意需在A215<1.5的情况下检测。检测完蛋白浓度后,用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。
(2)向96孔板中加入100μL各浓度调整后的蛋白溶液和空白PBS溶液对照,室温静置60min。
(3)每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞,37℃孵育60min。
(4)每孔用PBS清洗4次。
(5)用LDH检测试剂盒(Roche,04744926001)检测每个孔在492nm的吸光度OD492nm。根据空白对照的数值,可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下:细胞贴壁率=(测试孔-空白孔)×100%/(阳性孔-空白孔)。
结果如图6所示,从图6可知,相比于商品化的人胶原蛋白,添加了本发明的重组人源化Ⅲ型Pro.C3胶原蛋白的孔OD492nm更大,意味着该孔细胞的贴壁率越高。证明本发明的蛋白Pro.C3具有比商品化的人胶原蛋白更高的生物活性,能在更短的时间内给细胞提供优质的外环境,帮助细胞贴壁。
Claims (10)
1.一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3,其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQIDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示;或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.8中任一条具有95%以上的同源性,且细胞黏附活性与SEQ IDNo.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示的蛋白基本相当。
2.一种重组蛋白,其特征在于由权利要求1所述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3与纤维胶原蛋白通过接头连接而成,其中纤维胶原蛋白的序列如SEQ ID No.10所示。
3.权利要求2所述的重组蛋白的编码基因。
4.权利要求2所述的重组蛋白的表达载体。
5.权利要求2所述的重组蛋白的制备方法,其特征在于其步骤包括:
(1)构建权利要求4所述的表达载体,将其转化到表达宿主菌中;
(2)培养表达宿主菌,诱导重组蛋白表达;
(3)纯化表达产物,得到权利要求2所述的重组蛋白。
6.一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体,其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.3、SEQID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示;或者与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQIDNo.7、SEQ ID No.9中任一条具有95%以上的同源性,且细胞黏附活性与SEQ IDNo.3、SEQID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示的蛋白基本相当。
7.一种重组蛋白突变体,其特征在于由权利要求6所述的重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3突变体与纤维胶原蛋白通过接头连接而成,其中纤维胶原蛋白的序列如SEQ ID No.10所示。
8.权利要求7所述的重组蛋白突变体的编码基因。
9.权利要求7所述的重组蛋白突变体的表达载体。
10.权利要求1、2、6、7中任一项所述的蛋白在辅助细胞培养中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311277358.4A CN117304306B (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311277358.4A CN117304306B (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117304306A true CN117304306A (zh) | 2023-12-29 |
CN117304306B CN117304306B (zh) | 2024-06-04 |
Family
ID=89273340
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311277358.4A Active CN117304306B (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117304306B (zh) |
Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102146135A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-10 | 陕西九州生物医药科技园发展有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白及其生产方法 |
CN104225684A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-24 | 厦门大学 | 一种重组胶原-mRNA复合材料及其制备方法 |
CN110194795A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-03 | 郭伟 | 一种重组人源胶原蛋白及其应用 |
CN111087463A (zh) * | 2019-12-28 | 2020-05-01 | 河北纳科生物科技有限公司 | 一种重组人源iii型胶原蛋白及其原核表达方法 |
CN112626074A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-04-09 | 肽源(广州)生物科技有限公司 | 一种含羟脯氨酸修饰化的重组人iii型胶原蛋白成熟肽及其制备方法与应用 |
CN115521372A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-12-27 | 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 | 一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用 |
CN115521371A (zh) * | 2022-05-20 | 2022-12-27 | 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 | 一种重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用 |
WO2023284900A2 (zh) * | 2021-07-15 | 2023-01-19 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 重组人胶原蛋白多肽及其应用 |
WO2023024552A1 (zh) * | 2021-08-23 | 2023-03-02 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
CN115991764A (zh) * | 2023-03-21 | 2023-04-21 | 杭州因智拓生物技术有限公司 | 羟脯氨酸修饰的重组iii型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 |
WO2023098523A1 (zh) * | 2021-12-03 | 2023-06-08 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 重组胶原蛋白、制备方法及其应用 |
CN116240187A (zh) * | 2023-04-06 | 2023-06-09 | 广州普言生物科技有限公司 | 脯氨酰羟化酶α1亚基突变体、编码基因及其在催化脯氨酸羟基化中的应用 |
CN116574172A (zh) * | 2023-06-07 | 2023-08-11 | 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司 | 重组人源化i型胶原蛋白及其制备方法 |
KR20230133672A (ko) * | 2022-03-11 | 2023-09-19 | 주식회사 에이바이오테크 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
CN116789804A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-09-22 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 |
-
2023
- 2023-09-28 CN CN202311277358.4A patent/CN117304306B/zh active Active
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102146135A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-10 | 陕西九州生物医药科技园发展有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白及其生产方法 |
CN104225684A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-24 | 厦门大学 | 一种重组胶原-mRNA复合材料及其制备方法 |
CN110194795A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-03 | 郭伟 | 一种重组人源胶原蛋白及其应用 |
CN111087463A (zh) * | 2019-12-28 | 2020-05-01 | 河北纳科生物科技有限公司 | 一种重组人源iii型胶原蛋白及其原核表达方法 |
CN112626074A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-04-09 | 肽源(广州)生物科技有限公司 | 一种含羟脯氨酸修饰化的重组人iii型胶原蛋白成熟肽及其制备方法与应用 |
WO2023284900A2 (zh) * | 2021-07-15 | 2023-01-19 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 重组人胶原蛋白多肽及其应用 |
WO2023024552A1 (zh) * | 2021-08-23 | 2023-03-02 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
WO2023098523A1 (zh) * | 2021-12-03 | 2023-06-08 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 重组胶原蛋白、制备方法及其应用 |
KR20230133672A (ko) * | 2022-03-11 | 2023-09-19 | 주식회사 에이바이오테크 | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 |
CN115521371A (zh) * | 2022-05-20 | 2022-12-27 | 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 | 一种重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用 |
CN115521372A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-12-27 | 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 | 一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用 |
CN115991764A (zh) * | 2023-03-21 | 2023-04-21 | 杭州因智拓生物技术有限公司 | 羟脯氨酸修饰的重组iii型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 |
CN116789804A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-09-22 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 |
CN116240187A (zh) * | 2023-04-06 | 2023-06-09 | 广州普言生物科技有限公司 | 脯氨酰羟化酶α1亚基突变体、编码基因及其在催化脯氨酸羟基化中的应用 |
CN116574172A (zh) * | 2023-06-07 | 2023-08-11 | 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司 | 重组人源化i型胶原蛋白及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117304306B (zh) | 2024-06-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2021083072A1 (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
CN115991764B (zh) | 羟脯氨酸修饰的重组iii型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
CN103122027B (zh) | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 | |
CN109575126B (zh) | 多肽、其生产方法和用途 | |
WO2003106494A1 (fr) | Proteine du type collagene humain et son procede de production | |
CN117756926B (zh) | 一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17及其制备方法和应用 | |
CN116813749B (zh) | 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
CN112980865A (zh) | 一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法 | |
CN117756925B (zh) | 一种重组弹性蛋白Pro.ELP及其制备方法和应用 | |
CN117025559A (zh) | 重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用 | |
CN116987175A (zh) | 重组胶原蛋白、重组表达菌株及应用 | |
CN112430589B (zh) | 高热稳定性的硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其应用 | |
CN113880941B (zh) | 重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用 | |
CN117304306B (zh) | 一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用 | |
CN112625141A (zh) | 一种番茄斑萎属病毒的蛋白标准物质及其应用 | |
CN115896082B (zh) | 褐藻酸裂解酶突变体及其应用 | |
CN111363028B (zh) | 重组人源ⅰ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法 | |
CN116554309A (zh) | 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
CN116355076A (zh) | 一种重组多肽及其制备方法和应用 | |
CN103509100B (zh) | 一种白细胞介素‑1受体拮抗剂突变体 | |
CN113481187B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用 | |
CN109628363B (zh) | 一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用 | |
CN108864273B (zh) | 一种模拟人源性抗菌肽及其制备方法 | |
CN112725315A (zh) | 一种壳聚糖酶及其突变体在制备壳寡糖中的应用 | |
CN101899460B (zh) | 一种制备降低食物过敏原反应的融合蛋白的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Country or region after: China Address after: Room 302, 3rd Floor, Building A8, No.12 Biotech Valley Avenue, Torch Development Zone, Zhongshan City, Guangdong Province, 528437 Applicant after: Guangdong Puyan Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 2308B, 23/F, No. 28 Longkou Heng Street, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510630 Applicant before: Guangzhou Puyan Biotechnology Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
CB02 | Change of applicant information | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |