CN112626074A

CN112626074A - 一种含羟脯氨酸修饰化的重组人iii型胶原蛋白成熟肽及其制备方法与应用

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Publication number: CN112626074A
Application number: CN202110029993.5A
Authority: CN
Inventors: 黄亚东; 张齐; 肖巧学; 杨艳; 周帅印; 赵文; 谢伟权
Original assignee: Taiyuan Guangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Jiyuan Biotechnology Co ltd; Taiyuan Guangzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2041-01-11
Also published as: CN112626074B

Abstract

本发明涉及生物基因工程重组技术领域，特别涉及一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽及其制备方法与应用。本发明提供了一种编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因，并将脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA‑P4HA2‑P4HB2与上述编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的核苷酸序列连接得到重组载体转入酵母表达系统中，得到可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母，利用该酵母表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽，该重组人III型胶原蛋白成熟肽分子量大，表达水平高，更接近天然胶原蛋白，表现出了良好的生物学活性。

Description

一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程重组技术领域，特别涉及一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽及其制备方法与应用。

背景技术

胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，约占总蛋白的30％。人类肌腱、软骨以及皮肤中超过一半的细胞外基质蛋白均由胶原蛋白组成。胶原蛋白对细胞起着保护、营养、运输等作用。人体皮肤中的胶原蛋白主要以I型与III型为主，其中III型胶原蛋白含量会随着年龄增长逐渐减少，与皮肤衰老关系密切。

胶原蛋白亚基的分子量一般在120kDa左右，远大于一般的生物活性蛋白的亚基，氨基酸序列中含有大量的Gly-X-Y(X、Y代表氨基酸，其中Y多为脯氨酸)重复，并且，存在一定比例的羟脯氨酸。羟脯氨酸对维持胶原蛋白的三股螺旋结构以及生物特性有着重要的作用。目前，市售胶原的获取方法主要有两种，一种来源于动物组织提取胶原，另一种是依靠基因工程技术通过生物发酵法获取的重组胶原蛋白或其结构类似物。二者的特点如表1。

表1重组人源胶原蛋白与动物提取胶原蛋白的特点比较

对比项目	动物组织提取胶原蛋白	重组胶原蛋白及其类似物
			生产过程	猪牛等来源动物组织水解	生物发酵法生产
组成成分	各种结构混杂，杂质多	结构清晰，杂质少
			病毒风险	各种动物源病毒，风险高	不含动物源成分，安全
排异过敏反应	有	低
			水溶性	低	高
生物活性	低	高

对于依靠基因工程技术通过生物发酵法获取的重组胶原蛋白或其类似物来说，由于应用领域差异以及技术限制等因素，在表达产物长度与表达水平上都存在巨大差异。中国专利CN111363029A公开了一种通过毕赤酵母表达重组人III型胶原蛋白成熟肽的方法，获得的重组蛋白仅有498个氨基酸，分子量为54.5kDa，并以此为基础，成功开发出来多种医疗器械产品。中国专利CN103725623A宣称获取了含有1069个氨基酸的III型胶原成熟肽，并实现了分泌表达，但未提供任何证据，连基本的电泳图都没有，除此以外，脯氨酸等也缺乏后修饰，与天然胶原存在一定的差距。随着越来越多的重组胶原被开发为具有生物活性的组织工程材料，更大的分子量和更接近天然结构无疑会具有更大的优势。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于一种编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因。

本发明的另一目的在于提供一种与上述重组人III型胶原蛋白成熟肽相关的生物材料。

本发明的再一目的在于提供一种重组载体，该载体是将脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2与编码上述重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的核苷酸序列连接得到，其中，脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2以pPICZaA为骨架，引入毕赤酵母邻氨基苯甲酸合成酶(Anthrailate synthase)基因，并通过串联表达方式在多克隆位点分别引入脯氨酸羟化酶基因(P4HA2和P4HB2基因)，避免同源臂重合，同时可对重组人III型胶原蛋白成熟肽进行后修饰。

本发明的第四个目的在于提供一种可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母。

本发明的第五个目的在于提供一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的制备方法。

本发明的第六个目的在于提供上述制备方法制备得到的含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽。

本发明的第七个目的在于提供上述含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因，为如下B1)、B2)或B3)所示的基因：

A1)核苷酸序列是序列表中序列15(SEQ ID No.15)或序列17(SEQ ID No.17)的cDNA分子或DNA分子；

A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的cDNA分子或基因组DNA分子；

A3)在严格条件下与A1)限定的核苷酸序列杂交，且编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的cDNA分子或基因组DNA分子；

一种与重组人III型胶原蛋白成熟肽相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)含有上述编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的表达盒；

B2)含有上述编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有上述编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有上述编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的转基因细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因细胞系；

一种重组载体，是将脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2与上述编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的核苷酸序列连接得到；

所述的脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2，通过如下方法制得：

(1)以pPICZaA为骨架，通过BglII和BamH I酶切位点引入毕赤酵母邻氨基苯甲酸合成酶(Anthrailate synthase)基因，得到pPZSaA载体；

(2)以pPZSaA载体为骨架，通过串联表达方式在多克隆位点分别引入P4HA2和P4HB2基因，得到pPZAStA-P4HA2-P4HB2；

一种可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母，是将上述重组载体转入酵母中得到；

所述的酵母优选为毕赤酵母；

所述的可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母优选为Pichia pastoris HQC-119，于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5栋，保藏编号为GDMCC No.61338；

一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的制备方法，包含如下步骤：

将上述可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母诱导表达后，离心收集上清，上清通过硫酸铵分级沉淀和阳离子交换层析纯化，得到含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽；

一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽，通过上述制备方法制备得到；

所述的含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽在制备生物修复产品中的应用；

所述的生物修复产品可以为冻干粉、生物海绵和敷料等中的至少一种；

本发明为避免同源臂重合，在载体中引入毕赤酵母邻氨基苯甲酸合成酶(Anthrailate synthase)基因，然后通过串联表达方式，在酵母中引入脯氨酸羟化酶基因，得到脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2；该载体可以对重组人III型胶原蛋白成熟肽进行羟脯氨酸修饰化；本发明进一步对人III型胶原基因进行优化，分别扩增不同长度的人III型胶原片段，结合脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2，借助酵母表达系统，得到不同长度的人III型胶原片段；通过比较，选取具有高活性和高表达量的重组人III型胶原蛋白用于生产和应用其中，该重组人III型胶原蛋白成熟肽开发成冻干粉或胶原贴敷料，两者都表现出了良好的应用性能。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的重组人III型胶原成熟肽具有分泌表达、分子量大、表达水平高等优点，其中，分子量超过80kDa，表达水平达到18g/L。

(2)本发明提供的重组人III型胶原成熟肽脯氨酸得以羟基化，更接近天然胶原蛋白。

(3)本发明提供的重组人III型胶原成熟肽表现出了良好的生物学活性。

(4)本发明解决了大分子重组人源III型胶原蛋白成熟肽分泌表达以及脯氨酸羟基化问题，提升了产品性能，扩大了其应用范围。

附图说明

图1是采用BamHI与BglII双酶切验证pPZSaA-P4HA2-P4HB2的电泳图。

图2是pPZASa-P4HA2-P4HB2的物理图谱图。

图3是COL3A1全长及不同长度表达产物的示意图。

图4是pPIC9K-COL3A1的物理图谱图。

图5是重组人III型胶原成熟肽发酵上清和纯化原液的SDS-PAGE图，其中，A：重组人III型胶原成熟肽发酵上清(上样量为2μL)，B：重组人III型胶原成熟肽纯化原液。

图6是重组人III型胶原成熟肽的鉴定结果图。

图7是重组人III型胶原成熟肽的羟脯氨酸含量定性检测图，其中，特征峰如箭头所示。

图8是重组人III型胶原成熟肽促细胞增殖曲线图。

图9是重组人III型胶原成熟肽促细胞迁移效果图。

图10是重组人III型胶原成熟肽促成纤维细胞划痕修复图，其中，A：空白对照，B：50ng/mL重组人III型胶原成熟肽。

图11是重组人III型胶原成熟肽制备的冻干粉和粘性展示图，其中，A：猪皮提取胶原冻干粉和重组重组人III型胶原成熟肽冻干粉，1-2：猪皮提取胶原冻干粉，3-4：重组重组人III型胶原成熟肽冻干粉，B：重组人III型胶原成熟肽的粘性展示。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1含有脯氨酸羟化酶基因的毕赤酵母表达系统构建

以pPICZaA(购于Invitrogen公司)为骨架，引入毕赤酵母邻氨基苯甲酸合成酶(Anthrailate synthase)基因，得到pPZSaA载体；然后以pPZSaA载体为骨架，在多克隆位点分别引入P4HA2与P4HB2基因，得到pPZSaA-P4HA2与pPZSaA-P4HB2，再通过BamHI/BglII酶切位点将二者的阅读框串联在一起，得到脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2，最后转化至毕赤酵母SMD1168中，由此得到含有脯氨酸羟化酶基因的毕赤酵母。详细步骤如下：

一、pPZSaA载体的制备

(1)利用酵母基因组纯化试剂盒(购于TAKARA公司，商品号9082)提取毕赤酵母基因组，步骤如下：1)取含有1～2×10⁸个酵母菌的过夜培养液至microtube中，12,000rpm离心1分钟；2)用微量移液器除去上清(应尽量除净液体)；3)向沉淀中加入500μL的GenTLEYeast Solution A，轻微振荡并充分悬浮沉淀，于37℃温浴1小时，期间轻轻振荡离心管数次；4)加入100μL的GenTLE Yeast Solution B，轻微振荡混匀后于70℃加热10分钟；5)加入200μL的GenTLE Yeast Solution C，轻微振荡混匀后，冰上冷却5分钟；6)12,000rpm，4℃离心5分钟；7)小心将上清移入新的microtube中(切勿吸取沉淀)，加入上清液1/2体积的异丙醇(约400μL)，上下颠倒离心管充分混匀；8)12,000rpm，4℃离心5分钟，弃上清；9)向沉淀中加入500μL预冷的70％(v/v)乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀，12,000rpm，4℃离心5分钟；10)用微量移液器移弃上清(应尽量除净上清液)。室温下自然干燥DNA沉淀至无乙醇气味；11)加入适量的TE Buffer溶解基因组DNA；

(2)以提取的毕赤酵母基因组为模板，根据PICHIAGENOME查找邻氨基苯甲酸合成酶公布基因序列(gs115_chr2:285975..287756)，设计引物AS-F1/AS-R1扩增邻氨基苯甲酸合成酶表达框，上下游分别引入BglII与BamHI酶切位点。毕赤酵母邻氨基苯甲酸合成酶核苷酸序列及引物AS-F1/AS-R1序列如下所示：

TGGCCAAACGGTTTCTCAATTACTATATACTACTAACCATTTACCTGTAGCGTATTTCTTTTCCCTCTTCGCGAAAGCTCAAGGGCATCTTCTTGACTCATGAAAAATATCTGGATTTCTTCTGACAGATCATCACCCTTGAGCCCAACTCTCTAGCCTATGAGTGTAAGTGATAGTCATCTTGCAACAGATTATTTTGGAACGCAACTAACAAAGCAGATACACCCTTCAGCAGAATCCTTTCTGGATATTGTGAAGAATGATCGCCAAAGTCACAGTCCTGAGACAGTTCCTAATCTTTACCCCATTTACAAGTTCATCCAATCAGACTTCTTAACGCCTCATCTGGCTTATATCAAGCTTACCAACAGTTCAGAAACTCCCAGTCCAAGTTTCTTGCTTGAAAGTGCGAAGAATGGTGACACCGTTGACAGGTACACCTTTATGGGACATTCCCCCAGAAAAATAATCAAGACTGGGCCTTTAGAGGGTGCTGAAGTTGACCCCTTGGTGCTTCTGGAAAAAGAACTGAAGGGCACCAGACAAGCGCAACTTCCTGGTATTCCTCGTCTAAGTGGTGGTGCCATAGGATACATCTCGTACGATTGTATTAAGTACTTTGAACCAAAAACTGAAAGAAAACTGAAAGATGTTTTGCAACTTCCGGAAGCAGCTTTGATGTTGTTCGACACGATCGTGGCTTTTGACAATGTTTATCAAAGATTCCAGGTAATTGGAAACGTTTCTCTATCCGTTGATGACTCGGACGAAGCTATTCTTGAGAAATATTATAAGACAAGAGAAGAAGTGGAAAAGATCAGTAAAGTGGTATTTGACAATAAAACTGTTCCCTACTATGAACAGAAAGATATTATTCAAGGCCAAACGTTCACCTCTAATATTGGTCAGGAAGGGTATGAAAACCATGTTCGCAAGCTGAAAGAACATATTCTGAAAGGAGACATCTTCCAAGCTGTTCCCTCTCAAAGGGTAGCCAGGCCGACCTCATTGCACCCTTTCAACATCTATCGTCATTTGAGAACTGTCAATCCTTCTCCATACATGTTCTATATTGACTATCTAGACTTCCAAGTTGTTGGTGCTTCACCTGAATTACTAGTTAAATCCGACAACAACAACAAAATCATCACACATCCTATTGCTGGAACTCTTCCCAGAGGTAAAACTATCGAAGAGGACGACAATTATGCTAAGCAATTGAAGTCGTCTTTGAAAGACAGGGCCGAGCACGTCATGCTGGTAGATTTGGCCAGAAATGATATTAACCGTGTGTGTGAGCCCACCAGTACCACGGTTGATCGTTTATTGACTGTGGAGAGATTTTCTCATGTGATGCATCTTGTGTCAGAAGTCAGTGGAACATTGAGACCAAACAAGACTCGCTTCGATGCTTTCAGATCCATTTTCCCAGCAGGAACCGTCTCCGGTGCTCCGAAGGTAAGAGCAATGCAACTCATAGGAGAATTGGAAGGAGAAAAGAGAGGTGTTTATGCGGGGGCCGTAGGACACTGGTCGTACGATGGAAAATCGATGGACACATGTATTGCCTTAAGAACAATGGTCGTCAAGGACGGTGTCGCTTACCTTCAAGCCGGAGGTGGAATTGTCTACGATTCTGACCCCTATGACGAGTACATCGAAACCATGAACAAAATGAGATCCAACAATAACACCATCTTGGAGGCTGAGAAAATCTGGACCGATAGGTTGGCCAGAGACGAGAATCAAAGTGAATCCGAAGAAAACGATCAATGA

引物AS-F1：5’-TTAGGATCCTGGCCAAACGGTTTCTCAATTAC-3’；

引物AS-R1：5’-CGCAGATCTCAAACCATAAATTCCTACTTACGTCCTCCGTTCATTGATCGTTTTC-3’；(画横线部分为酶切位点)

(3)以步骤(1)提取的毕赤酵母基因组为模板，进行PCR扩增，其中，PCR反应体系(50μL)如下：10×buffer 5μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物AS-F1(50μM)1μL，引物AS-R1(50μM)1μL，Taq扩增酶0.5μL，模板0.1ng，最后用ddH₂O补齐至50μL；扩增程序为：95℃，30s变性；56℃，30s退火，72℃延伸2min，整个反应30个循环。扩增结束后，将PCR产物进行核酸电泳，分析条带大小，实际值与理论值相符后，将产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行核苷酸测序，比对无误后进行下一步操作。

(4)对PCR产物进行回收(TAKARA DNA片段回收试剂盒，操作步骤同说明书)，并采用限制性内切酶BglII与BamHI进行双酶切，37℃反应1h，酶切体系如下：限制性内切酶缓冲液5μL，限制性内切酶1 1μL，限制性内切酶21μL，质粒/DNA片段100μg，ddH₂O补齐至50μL；

(5)对酶切产物进行割胶回收(TAKARA胶回收试剂盒，操作步骤同说明书)，采用T4DNA连接酶与BamHI线性化载体pPICZaA进行连接，16℃反应30min，连接体系如下：T4DNA连接酶6μL，插入片段4μL，载体片段2μL；

(6)取连接产物3μL加入TOP10感受态(市购)，42℃热激90S；加入800μL新鲜LB培养基孵育1h，然后涂布于抗性LB固体平板(含25μg/mL博来霉素)，37℃过夜培养。挑取转化子进行扩培，然后抽提质粒，先后进行酶切以及测序验证，由此得到TOP10/pPZSaA。

二、脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2的制备

(1)依据NCBI(美国国家生物信息中心，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的人脯氨酸羟化酶亚基对应的成熟肽序列(GenBank:AAQ89329.1；GenBank:AAC13652.1)，结合毕赤酵母蛋白质二硫键异构酶PDI前导肽序列(MQFNWNIKTVASILSALTLAQA)以及内质网锚定序列(HDEL)，进行优化设计，委托金斯瑞生物科技股份有限公司分别合成P4HA2与P4HB2基因，对应的氨基酸和核苷酸序列如下所示：

P4HA2氨基酸序列：

MQFNWNIKTVASILSALTLAQAEFFTSIGHMTDLIYAEKELVQSLKEYILVEEAKLSKIKSWANKMEALTSKSAADAEGYLAHPVNAYKLVKRLNTDWPALEDLVLQDSAAGFIANLSVQRQFFPTDEDEIGAAKALMRLQDTYRLDPGTISRGELPGTKYQAMLSVDDCFGMGRSAYNEGDYYHTVLWMEQVLKQLDAGEEATTTKSQVLDYLSYAVFQLGDLHRALELTRRLLSLDPSHERAGGNLRYFEQLLEEEREKTLTNQTEAELATPEGIYERPVDYLPERDVYESLCRGEGVKLTPRRQKRLFCRYHHGNRAPQLLIAPFKEEDEWDSPHIVRYYDVMSDEEIERIKEIAKPKLARATVRDPKTGVLTVASYRVSKSSWLEEDDDPVVARVNRRMQHITGLTVKTAELLQVANYGVGGQYEPHFDFSRRPFDSGLKTEGNRLATFLNYMSDVEAGGATVFPDLGAAIWPKKGTAVFWYNLLRSGEGDYRTRHAACPVLVGCKWVSNKWFHERGQEFLRPCGSHDEL

P4HA2核苷酸序列：

ATGCAATTCAACTGGAACATCAAGACTGTTGCTTCTATCTTGTCTGCTTTGACTTTGGCTCAAGCTGAATTCTTCACTTCTATCGGTCACATGACTGACTTGATCTACGCTGAAAAGGAATTGGTTCAATCTTTGAAGGAATACATCTTGGTTGAAGAAGCTAAGTTGTCTAAGATCAAGTCTTGGGCTAACAAGATGGAAGCTTTGACTTCTAAGTCTGCTGCTGACGCTGAAGGTTACTTGGCTCACCCAGTTAACGCTTACAAGTTGGTTAAGAGATTGAACACTGACTGGCCAGCTTTGGAAGACTTGGTTTTGCAAGACTCTGCTGCTGGTTTCATCGCTAACTTGTCTGTTCAAAGACAATTCTTCCCAACTGACGAAGACGAAATCGGTGCTGCTAAGGCTTTGATGAGATTGCAAGACACTTACAGATTGGACCCAGGTACTATCTCTAGAGGTGAATTGCCAGGTACTAAGTACCAAGCTATGTTGAGTGTTGACGACTGCTTCGGCATGGGTAGATCGGCTTACAACGAAGGTGACTACTACCACACTGTTTTGTGGATGGAACAAGTTTTGAAGCAATTGGACGCTGGTGAAGAAGCTACTACTACTAAGTCTCAAGTTTTGGACTACTTGTCTTACGCTGTTTTCCAATTGGGTGACTTGCACAGAGCTTTGGAATTGACTAGAAGATTGTTGTCTTTGGACCCATCTCACGAAAGAGCTGGTGGTAACTTGAGATACTTCGAACAATTGTTGGAAGAAGAAAGAGAAAAGACTTTGACTAACCAAACTGAAGCTGAATTGGCTACTCCAGAAGGTATCTACGAAAGACCAGTTGACTACTTGCCAGAAAGAGACGTTTACGAATCTTTGTGTAGAGGTGAAGGTGTTAAGTTGACTCCAAGAAGACAAAAGAGATTGTTCTGTAGATACCACCACGGTAACAGAGCTCCACAATTGTTGATCGCTCCATTCAAGGAAGAAGACGAATGGGACTCTCCACACATCGTTAGATACTACGACGTTATGTCTGACGAAGAAATCGAAAGAATCAAGGAAATCGCTAAGCCAAAGTTGGCTAGAGCTACTGTTAGAGACCCAAAGACTGGTGTTTTGACTGTTGCTTCTTACAGAGTTTCTAAGTCTTCTTGGTTGGAAGAAGACGACGACCCAGTTGTTGCTAGAGTTAACAGAAGAATGCAACACATCACTGGTTTGACTGTTAAGACTGCTGAATTGTTGCAAGTTGCTAACTACGGTGTTGGTGGTCAATACGAACCACACTTCGACTTCTCTAGAAGACCATTCGACTCTGGTTTGAAGACTGAAGGTAACAGATTGGCTACTTTCTTGAACTACATGTCTGACGTTGAAGCTGGTGGTGCTACTGTTTTCCCAGACTTGGGTGCTGCTATCTGGCCAAAGAAGGGTACTGCTGTTTTCTGGTACAACTTGTTGAGATCGGGTGAAGGTGACTACAGAACTAGACACGCTGCTTGCCCAGTCCTCGTTGGTTGTAAGTGGGTTTCTAACAAGTGGTTCCACGAAAGAGGTCAAGAATTCTTGAGACCATGTGGTTCTCACGACGAATTG

P4HB2氨基酸序列：

MQFNWNIKTVASILSALTLAQADAPEEEDHVLVLRKSNFAEALAAHKYLLVEFYAPWCGHCKALAPEYAKAAGKLKAEGSEIRLAKVDATEESDLAQQYGVRGYPTIKFFRNGDTASPKEYTAGREADDIVNWLKKRTGPAATTLPDGAAAESLVESSEVAVIGFFKDVESDSAKQFLQAAEAIDDIPFGITSNSDVFSKYQLDKDGVVLFKKFDEGRNNFEGEVTKENLLDFIKHNQLPLVIEFTEQTAPKIFGGEIKTHILLFLPKSVSDYDGKLSNFKTAAESFKGKILFIFIDSDHTDNQRILEFFGLKKEECPAVRLITLEEEMTKYKPESEELTAERITEFCHRFLEGKIKPHLMSQELPEDWDKQPVKVLVGKNFEDVAFDEKKNVFVEFYAPWCGHCKQLAPIWDKLGETYKDHENIVIAKMDSTANEVEAVKVHSFPTLKFFPASADRTVIDYNGERTLDGFKKFLESGGQDGAGDDDDLEDLEEAEEPDMEEDDDQKAVHDEL

P4HB2核苷酸序列：

ATGCAATTCAACTGGAACATCAAGACTGTTGCTTCTATCTTGTCTGCTTTGACTTTGGCTCAAGCTGACGCTCCAGAAGAAGAAGACCACGTTTTGGTTTTGAGAAAGTCTAACTTTGCGGAAGCTCTCGCTGCTCACAAGTACTTGTTGGTTGAATTCTACGCTCCATGGTGTGGTCACTGTAAGGCTTTGGCTCCAGAATACGCTAAGGCTGCTGGTAAGTTGAAGGCTGAAGGTTCTGAAATCAGATTGGCTAAGGTTGACGCTACTGAAGAATCTGACTTGGCTCAACAATACGGTGTTAGAGGTTACCCAACTATCAAGTTCTTCAGAAACGGTGACACTGCTTCTCCAAAGGAATACACTGCTGGTAGAGAAGCTGACGACATCGTTAACTGGTTGAAGAAGAGAACTGGTCCAGCTGCTACTACTTTGCCAGACGGTGCTGCTGCTGAATCTTTGGTTGAATCTTCTGAAGTTGCTGTTATCGGTTTCTTCAAGGACGTTGAATCTGACTCTGCTAAGCAATTCTTGCAAGCTGCTGAAGCTATCGACGACATCCCATTCGGTATCACTTCTAACTCTGACGTTTTCTCTAAGTACCAATTGGACAAGGACGGTGTTGTTTTGTTCAAGAAGTTCGACGAAGGTAGAAACAACTTCGAAGGTGAAGTTACTAAGGAAAACTTGTTGGACTTCATCAAGCACAACCAATTGCCATTGGTTATCGAATTCACTGAACAAACTGCTCCAAAGATATTCGGTGGTGAAATCAAGACTCACATCTTGTTGTTCTTGCCAAAGTCTGTTTCTGACTACGACGGTAAGTTGTCTAACTTCAAGACTGCTGCTGAATCTTTCAAGGGTAAGATCCTCTTCATCTTCATCGACTCTGACCACACTGACAACCAAAGAATACTCGAATTCTTCGGACTCAAGAAGGAAGAGTGTCCAGCTGTTAGATTGATCACTTTGGAAGAAGAAATGACTAAGTACAAGCCAGAATCTGAAGAATTGACTGCTGAAAGAATCACTGAATTCTGTCACAGATTCTTGGAAGGTAAGATCAAGCCACACTTGATGTCTCAAGAATTGCCAGAAGACTGGGACAAGCAACCAGTTAAGGTTTTGGTTGGTAAGAACTTCGAAGACGTTGCTTTCGACGAAAAGAAGAACGTTTTCGTTGAATTCTACGCTCCATGGTGTGGTCACTGTAAGCAATTGGCTCCAATCTGGGACAAGTTGGGTGAAACTTACAAGGACCACGAAAACATCGTTATCGCTAAGATGGACTCTACTGCTAACGAAGTTGAAGCTGTTAAGGTTCACTCTTTCCCAACTTTGAAGTTCTTCCCAGCTTCTGCTGACAGAACTGTTATCGACTACAACGGTGAAAGAACTTTGGACGGTTTCAAGAAGTTCTTGGAATCTGGTGGTCAAGACGGTGCTGGTGACGACGACGACTTGGAAGACTTGGAAGAAGCTGAAGAACCAGACATGGAAGAAGACGACGACCAAAAGGCTGTTCACGACGAATTG

(2)采用PCR扩增的方法分别在P4HA2与P4HB2基因上下游引入BstBI与NotI酶切位点(PCR扩增方法同步骤一、(3)，扩增引物如下)，然后采用限制性内切酶BstBI与NotI分别酶切相应的产物片段与载体pPZSaA(步骤一所构建)，酶切反应程序为：37℃反应1h；胶回收后采用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化TOP10，挑选转化子进行扩培，然后抽提质粒，进行酶切验证，由此分别得到TOP10/pPZSaA-P4HA2与TOP10/pPZSaA-P4HB2。

引物P4HA2-F：5’-TCTTCGAAACGATGCAATTCAACTGGAAC-3’；

引物P4HA2-R：5’-TGGCGGCCGCTCATTACAATTCGTCGTGAGAACC-3’；

引物P4HB2-F：5’-TCTTCGAAACGATGCAATTCAACTGGAACATC-3’；

引物P4HB2-R：5’-TGGCGGCCGCTCATTACAATTCGTCGTGAACAGC-3’(画横线部分为酶切位点)；

(3)分别抽提pPZSaA-P4HA2与pPZSaA-P4HB2质粒，然后采用BamHI酶切pPZSaA-P4HA2，获得带有粘性末端的线性化载体pPZSaA-P4HA2；同时，采用BamHI与BglII双酶切pPZSaA-P4HB2，获得带有相同粘性末端含有P4HB2的片段，将二者采用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化TOP10。挑选转化子进行扩培，然后抽提质粒，采用BamHI与BglII进行双酶切验证。酶切片段与理论相符(如图1，箭头所示为正确连接)，即为得到连接正确的TOP10/pPZSaA-P4HA2-P4HB2其中，图2是pPZASa-P4HA2-P4HB2的物理图谱图。

三、含有脯氨酸羟化酶基因的毕赤酵母表达系统的制备

(1)抽提pPZSaA-P4HA2-P4HB2质粒，加入4μL限制性内切酶SpeI进行线性化(同步骤一、(4))，然后加入酶切体系0.7倍体积的异丙醇，混匀后12000-14000rpm 4℃离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。加入1毫升常温体积分数为70％的乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤，12000-14000rpm4℃离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。5000-10000rpm 4℃离心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免触及沉淀。肉眼观察无明显液体后(通常在1分钟内即可完成干燥)，加入20μL超纯水溶解DNA。

(2)将回收得到的线性化质粒加入40μL毕赤酵母SMD1168感受态(SMD1168菌种购买于Invitrogen公司，感受态制备方法同文献Cregg J.M.,Russell K.A.(1998)Transformation in Pichia Protocols.Methods in Molecular Biology,vol103.HumanaPress)中，转移至预冷的0.2CM电击杯中，1800v电击0.2S，迅速放置冰上，加入1mL含有1M山梨醇的YPD，28℃静置孵育1h，后涂布于YPD(含有100μg/mL博来霉素)固体平板中，28℃培养2-3天，挑选转化子进行菌落PCR鉴定，根据目的基因的不同，分别设计相应的上下游验证引物，引物如下所示：

引物F-P4HA2：5’-ATGCAATTCAACTGGAACATCAAGAC-3’；

引物R-P4HB2：5’-CAATTCGTCGTGAACAGCCTTTTG-3’；

(3)在PCR小管中加入25μL菌体裂解液(0.1M NaOH)，挑取不同的转化子，放入PCR小管中吹打后取出；然后将PCR小管在60℃变性15min，2000g离心1min，取3μL上清液作为PCR反应的模板。PCR反应体系及反应程序同步骤一、(3)。

(4)将PCR产物进行核酸电泳，分析条带大小，实际值与理论值相符合的即获得目标菌株SMD1168/pPZSaA-P4HA2-P4HB2，即为含有脯氨酸羟化酶基因的毕赤酵母表达系统。

实施例2不同长度人III型胶原蛋白在具有脯氨酸羟化酶基因的毕赤酵母中的表达

(1)将实施例1制得的含有脯氨酸羟化酶基因的毕赤酵母表达系统制备成感受态细胞(方法同实施例1)，得到毕赤酵母SMD1168/pPZSaA-P4HA2-P4HB2感受态；

(2)依据蛋白质资源数据库UniProt(网址https://www.uniprot.org/)公布的人III型胶原蛋白成熟肽序列(P02461-1)，结合毕赤酵母密码子偏好性进行优化设计，委托上海捷瑞生物科技有限公司分别合成Col3A1基因，对应的氨基酸序列以及核苷酸序列分别如下所示：

COL3A1氨基酸序列：

QQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPQPPTAPTRPPNGQGPQGPKGDPGPPGIPGRNGDPGIPGQPGSPGSPGPPGICESCPTGPQNYSPQYDSYDVKSGVAVGGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGRPGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGQPGPPGPPGTAGFPGSPGAKGEVGPAGSPGSNGAPGQRGEPGPQGHAGAQGPPGPPGINGSPGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGAPGLRGGAGEPGKNGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGSPGEPGANGLPGAAGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGVPGGPGMRGMPGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGRPGPPGPSGPRGQPGVMGFPGPKGNDGAPGKNGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGPGGDKGDTGPPGPQGLQGLPGTGGPPGENGKPGEPGPKGDAGAPGAPGGKGDAGAPGERGPPGLAGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGAAGTPGLQGMPGERGGLGSPGPKGDKGEPGGPGADGVPGKDGPRGPTGPIGPPGPAGQPGDKGEGGAPGLPGIAGPRGSPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGERGSPGGPGAAGFPGARGLPGPPGSNGNPGPPGPSGSPGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYGDEPMDFKINTDEIMTSLKSVNGQIESLISPDGSRKNPARNCRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCNMETGETCISANPLNVPRKHWWTDSSAEKKHVWFGESMDGGFQFSYGNPELPEDVLDVQLAFLRLLSSRASQNITYHCKNSIAYMDQASGNVKKALKLMGSNEGEFKAEGNSKFTYTVLEDGCTKHTGEWSKTVFEYRTRKAVRLPIVDIAPYDIGGPDQEFGVDVGPVCFL*(1443a.a.)

优化后的COL3A1核苷酸序列：

CAACAAGAAGCTGTTGAGGGTGGTTGTTCTCATTTGGGTCAATCTTATGCTGATAGAGATGTTTGGAAGCCAGAACCTTGTCAAATTTGTGTTTGTGATTCTGGTTCTGTTTTGTGTGATGATATCATCTGTGATGATCAAGAGTTGGATTGTCCAAACCCTGAAATTCCATTCGGAGAGTGTTGTGCTGTTTGTCCTCAACCACCTACTGCTCCAACTAGACCACCTAACGGTCAAGGTCCACAAGGTCCTAAGGGAGATCCAGGTCCACCTGGTATTCCAGGTAGAAATGGAGATCCAGGTATTCCTGGACAACCAGGTTCTCCTGGTTCTCCTGGTCCACCTGGAATCTGTGAATCTTGTCCTACTGGTCCACAAAATTACTCTCCACAATACGATTCTTATGATGTTAAATCTGGTGTTGCTGTTGGTGGTTTGGCTGGTTATCCAGGTCCTGCAGGTCCACCTGGTCCACCTGGTCCACCTGGGACTTCCGGTCATCCTGGTTCTCCAGGTTCTCCTGGTTACCAAGGTCCACCTGGAGAACCTGGTCAAGCTGGTCCATCCGGTCCACCTGGTCCACCTGGAGCCATTGGTCCATCTGGTCCTGCTGGTAAAGATGGTGAATCTGGTAGACCAGGTAGACCAGGAGAGAGAGGTTTGCCTGGTCCACCTGGTATTAAGGGTCCTGCTGGTATTCCAGGTTTTCCTGGTATGAAAGGTCACAGAGGTTTCGATGGTAGAAACGGTGAAAAGGGAGAGACTGGTGCTCCAGGTTTGAAAGGTGAAAACGGTTTGCCTGGAGAGAATGGTGCTCCAGGTCCTATGGGTCCTAGAGGTGCTCCAGGTGAAAGAGGTAGACCAGGTTTGCCTGGTGCTGCTGGTGCTAGAGGTAACGATGGTGCTAGAGGTTCTGATGGTCAGCCAGGTCCACCTGGTCCACCTGGCACTGCTGGTTTTCCAGGTTCTCCTGGTGCTAAGGGTGAAGTTGGTCCTGCTGGTTCTCCAGGTTCTAACGGTGCTCCAGGTCAAAGAGGTGAGCCAGGTCCTCAAGGTCACGCTGGTGCTCAAGGTCCACCTGGTCCACCTGGTATTAATGGTTCTCCAGGTGGTAAAGGTGAAATGGGACCAGCTGGTATTCCAGGTGCTCCTGGTTTGATGGGTGCTAGAGGTCCACCTGGTCCAGCTGGTGCTAACGGTGCTCCTGGTTTGAGAGGTGGTGCTGGTGAACCAGGTAAAAACGGTGCTAAAGGAGAGCCAGGTCCTAGAGGTGAAAGAGGTGAGGCTGGTATTCCAGGTGTCCCAGGTGCTAAGGGTGAAGATGGTAAAGATGGTTCTCCAGGAGAGCCTGGTGCTAACGGTTTGCCAGGTGCTGCTGGTGAAAGAGGTGCTCCTGGTTTTAGAGGTCCAGCTGGTCCTAATGGTATTCCTGGTGAAAAGGGTCCAGCTGGAGAGAGAGGTGCTCCAGGACCAGCTGGTCCAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTAGAGATGGTGTTCCAGGTGGTCCTGGTATGCGTGGTATGCCAGGTTCTCCTGGTGGTCCAGGTTCTGATGGTAAACCAGGTCCACCTGGTTCTCAAGGAGAGTCTGGTAGACCAGGTCCACCTGGACCATCTGGTCCAAGAGGTCAACCAGGTGTTATGGGTTTCCCAGGTCCTAAGGGTAACGATGGTGCTCCAGGTAAAAATGGTGAAAGAGGTGGTCCTGGTGGTCCTGGTCCTCAAGGTCCACCTGGTAAAAACGGAGAGACTGGTCCACAAGGTCCACCTGGACCTACTGGTCCAGGTGGAGATAAAGGAGATACAGGTCCACCTGGACCTCAAGGTTTGCAAGGTTTGCCTGGTACTGGTGGTCCACCTGGAGAAAATGGTAAACCAGGAGAGCCAGGTCCTAAAGGAGATGCTGGTGCTCCTGGTGCTCCAGGTGGTAAAGGAGATGCCGGTGCTCCAGGAGAGAGAGGTCCACCTGGTTTGGCCGGTGCTCCAGGACTTAGAGGTGGTGCTGGTCCACCTGGACCAGAGGGTGGTAAAGGTGCCGCCGGTCCACCTGGTCCACCTGGGGCTGCTGGTACTCCTGGTTTGCAGGGTATGCCAGGTGAAAGAGGTGGTTTGGGTTCTCCAGGTCCTAAGGGAGATAAAGGAGAGCCTGGTGGTCCAGGTGCTGATGGTGTTCCTGGTAAAGATGGTCCTAGAGGTCCAACTGGTCCTATCGGTCCACCTGGTCCTGCTGGTCAACCAGGAGATAAAGGTGAAGGTGGTGCTCCAGGTTTGCCTGGTATTGCTGGTCCTAGAGGTTCTCCAGGTGAAAGAGGTGAGACTGGTCCACCTGGTCCAGCCGGTTTTCCAGGTGCTCCTGGTCAAAACGGTGAACCAGGTGGTAAAGGAGAGAGAGGTGCTCCTGGTGAAAAAGGAGAGGGTGGTCCACCTGGTGTTGCCGGTCCACCTGGTGGTTCTGGACCAGCAGGTCCACCTGGACCACAAGGTGTTAAGGGTGAAAGAGGTTCTCCAGGTGGTCCTGGTGCTGCTGGTTTCCCTGGTGCTAGAGGTTTGCCCGGTCCACCTGGTTCTAACGGTAACCCAGGTCCACCTGGTCCTTCTGGTTCTCCTGGTAAAGACGGTCCACCTGGACCTGCTGGTAACACTGGTGCTCCAGGTTCTCCTGGTGTTTCTGGTCCAAAGGGAGATGCCGGTCAACCTGGTGAAAAAGGTTCTCCAGGTGCTCAAGGTCCACCTGGTGCTCCAGGTCCATTGGGTATTGCTGGTATTACTGGTGCTAGAGGTTTGGCTGGTCCACCTGGTATGCCAGGACCTAGAGGTTCTCCTGGTCCTCAGGGAGTTAAGGGTGAATCTGGTAAACCAGGTGCTAATGGTTTGTCTGGAGAAAGAGGTCCACCTGGTCCTCAAGGTTTGCCAGGTTTGGCTGGTACCGCCGGAGAGCCTGGTAGAGATGGTAACCCAGGTTCTGATGGTTTGCCTGGTAGAGACGGTTCTCCAGGTGGTAAAGGAGATAGAGGTGAGAATGGTTCTCCAGGTGCTCCTGGTGCTCCAGGGCACCCAGGTCCACCTGGACCTGTTGGTCCTGCTGGTAAATCCGGAGATAGAGGTGAATCTGGTCCAGCTGGTCCTGCTGGTGCTCCAGGTCCTGCTGGTTCTAGAGGTGCTCCAGGACCTCAGGGTCCAAGAGGAGATAAGGGTGAAACTGGAGAGAGAGGTGCTGCTGGTATTAAAGGTCACAGAGGTTTTCCAGGTAACCCAGGTGCTCCAGGTTCTCCTGGGCCTGCTGGTCAACAAGGTGCTATTGGTTCTCCTGGACCTGCTGGTCCTAGAGGTCCAGTTGGTCCTTCTGGTCCACCTGGTAAAGATGGTACTTCTGGTCATCCAGGACCAATTGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTAATAGAGGTGAAAGAGGTTCTGAGGGTTCTCCAGGTCACCCAGGACAGCCTGGTCCACCTGGTCCACCTGGTGCTCCAGGGCCTTGTTGTGGTGGTGTTGGTGCTGCTGCTATTGCTGGTATTGGTGGTGAAAAGGCTGGTGGTTTTGCTCCTTACTATGGAGATGAACCAATGGATTTCAAGATTAACACTGATGAGATCATGACTTCTTTGAAGTCTGTTAACGGTCAAATCGAGTCTTTGATTTCTCCAGATGGTTCTAGAAAGAACCCTGCTAGAAACTGTAGAGATTTGAAGTTCTGTCATCCAGAATTGAAGTCTGGAGAGTACTGGGTTGATCCAAACCAAGGTTGTAAGTTGGATGCTATTAAAGTTTTCTGTAACATGGAAACTGGAGAGACTTGTATTTCTGCTAACCCTTTGAATGTTCCAAGAAAGCATTGGTGGACTGATTCTTCTGCTGAAAAGAAACACGTTTGGTTTGGAGAGTCTATGGATGGTGGTTTTCAATTCTCTTATGGTAACCCTGAATTGCCAGAGGATGTTTTGGATGTTCAATTGGCTTTCTTGAGATTGTTGTCTTCTAGAGCTTCTCAAAACATCACTTACCATTGTAAGAACTCTATCGCTTACATGGATCAAGCTTCTGGTAACGTTAAGAAAGCTTTGAAGTTGATGGGTTCTAACGAAGGAGAGTTTAAGGCTGAGGGTAACTCTAAATTCACTTACACTGTTTTGGAGGATGGTTGTACTAAGCACACTGGTGAATGGTCTAAAACTGTTTTCGAGTACAGAACTAGAAAAGCTGTTAGATTGCCTATTGTTGATATTGCTCCATATGATATTGGTGGTCCTGATCAAGAATTTGGTGTTGATGTTGGTCCAGTTTGTTTCTTGTAA

(3)以合成的Col3A1基因为模板，设计以下引物分别扩增不同长度片段(图3)，分别在上下游引入XhoI与NotI酶切位点，PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行核苷酸测序，无误后进行下一步操作，同时，以未优化前Col3A1基因中的7M片段作为对照。

表2引物及序列

PCR产物回收后(TAKARA片段回收试剂盒，操作步骤同说明书)，通过XhoI与NotI酶切，然后采用胶回收(TAKARA胶回收试剂盒，操作步骤同说明书))；同时将pPIC9k(购于Invitrogen公司)采用BamHI-XhoI与BamHI-NotI双酶切，胶回收载体骨架(BamHI-NotI酶切长片段)与信号肽片段(BamHI-XhoI小片段)。将获得的三个片段进行连接，连接体系如下：T4 DNA连接酶6.5μL，插入片段2μL，信号肽片段3μL，载体片段1.5μL；连接产物转化TOP10(同实施例1步骤一、(6))，挑选转化子进行扩培，然后抽提质粒，进行酶切验证，酶切片段与理论相符的即为得到连接正确的载体。其中9C片段对应的物理图谱如图4所示。

分别抽提质粒，采用SacI线性化，将回收得到的线性化质粒加入到40μL毕赤酵母SMD1168/pPZSaA-P4HA2-P4HB2感受态中，转移至预冷的0.2CM电击杯中，1800v电击0.2S，迅速放置冰上，加入1mL1M山梨醇，涂布于MD平板(葡萄糖2％，酵母无氨基氮源1.34％，琼脂1.5％，生物素0.0002％，v/m)，28℃培养2-3天，挑选转化子进行菌落PCR鉴定(同实施例1步骤三(3)，引物同扩增上下游引物)。

挑选阳性转化子接种于YPG(甘油浓度为1％，m/v)培养基中，培养24h后，每隔12h加入0.5％(m/v)，甲醇进行诱导，诱导72h取上清进行SDS-PAGE。

结合电泳结果进行分析，设计的7个片段，能有效分泌重组人III型胶原蛋白成熟肽且表达量最大的片段为7M，即SMD1168/pPZSaA-P4HA2-P4HB2,pPIC9k-COL3a1(428..1172)(该菌种命名为Pichia pastoris HQC-119，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61338)，且表达水平远远高于其他同拷贝数转化子，同优化前的序列相比，表达水平提到了20倍以上，后续以此为特征菌株进行本发明描述。

其中，图5A是SMD1168/pPZSaA-P4HA2-P4HB2,pPIC9k-COL3a1(428..1172)不同诱导时间(0～72h)的发酵上清SDS-PAGE图。

表3相同拷贝数下不同转化子表达水平

表达产物名称	对应氨基酸序列	核苷酸序列来源	表达结果
				3C	793..1443	优化后	表达水平低于1g/L
4C	1033..1443	优化后	表达水平低于1g/L
				5C	1171..1443	优化后	表达水平低于1g/L
6N	1..622	优化后	表达水平低于1g/L
				7M	428..1172	优化后	表达水平达到18g/L
8M	220..1182	优化后	表达水平低于1g/L
				9C	1..1443	优化后	胞内表达
7M优化前	428..1172	优化前	表达水平低于1g/L

重组III型胶原蛋白成熟肽特征氨基酸序列(7M片段)：

EAGIPGVPGAKGEDGKDGSPGEPGANGLPGAAGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGVPGGPGMRGMPGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGRPGPPGPSGPRGQPGVMGFPGPKGNDGAPGKNGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGPGGDKGDTGPPGPQGLQGLPGTGGPPGENGKPGEPGPKGDAGAPGAPGGKGDAGAPGERGPPGLAGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGAAGTPGLQGMPGERGGLGSPGPKGDKGEPGGPGADGVPGKDGPRGPTGPIGPPGPAGQPGDKGEGGAPGLPGIAGPRGSPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGERGSPGGPGAAGFPGARGLPGPPGSNGNPGPPGPSGSPGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGP*

重组III型胶原蛋白成熟肽特征氨基酸序列(7M片段)对应的核苷酸序列：

GAGGCTGGTATTCCAGGTGTCCCAGGTGCTAAGGGTGAAGATGGTAAAGATGGTTCTCCAGGAGAGCCTGGTGCTAACGGTTTGCCAGGTGCTGCTGGTGAAAGAGGTGCTCCTGGTTTTAGAGGTCCAGCTGGTCCTAATGGTATTCCTGGTGAAAAGGGTCCAGCTGGAGAGAGAGGTGCTCCAGGACCAGCTGGTCCAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTAGAGATGGTGTTCCAGGTGGTCCTGGTATGCGTGGTATGCCAGGTTCTCCTGGTGGTCCAGGTTCTGATGGTAAACCAGGTCCACCTGGTTCTCAAGGAGAGTCTGGTAGACCAGGTCCACCTGGACCATCTGGTCCAAGAGGTCAACCAGGTGTTATGGGTTTCCCAGGTCCTAAGGGTAACGATGGTGCTCCAGGTAAAAATGGTGAAAGAGGTGGTCCTGGTGGTCCTGGTCCTCAAGGTCCACCTGGTAAAAACGGAGAGACTGGTCCACAAGGTCCACCTGGACCTACTGGTCCAGGTGGAGATAAAGGAGATACAGGTCCACCTGGACCTCAAGGTTTGCAAGGTTTGCCTGGTACTGGTGGTCCACCTGGAGAAAATGGTAAACCAGGAGAGCCAGGTCCTAAAGGAGATGCTGGTGCTCCTGGTGCTCCAGGTGGTAAAGGAGATGCCGGTGCTCCAGGAGAGAGAGGTCCACCTGGTTTGGCCGGTGCTCCAGGACTTAGAGGTGGTGCTGGTCCACCTGGACCAGAGGGTGGTAAAGGTGCCGCCGGTCCACCTGGTCCACCTGGGGCTGCTGGTACTCCTGGTTTGCAGGGTATGCCAGGTGAAAGAGGTGGTTTGGGTTCTCCAGGTCCTAAGGGAGATAAAGGAGAGCCTGGTGGTCCAGGTGCTGATGGTGTTCCTGGTAAAGATGGTCCTAGAGGTCCAACTGGTCCTATCGGTCCACCTGGTCCTGCTGGTCAACCAGGAGATAAAGGTGAAGGTGGTGCTCCAGGTTTGCCTGGTATTGCTGGTCCTAGAGGTTCTCCAGGTGAAAGAGGTGAGACTGGTCCACCTGGTCCAGCCGGTTTTCCAGGTGCTCCTGGTCAAAACGGTGAACCAGGTGGTAAAGGAGAGAGAGGTGCTCCTGGTGAAAAAGGAGAGGGTGGTCCACCTGGTGTTGCCGGTCCACCTGGTGGTTCTGGACCAGCAGGTCCACCTGGACCACAAGGTGTTAAGGGTGAAAGAGGTTCTCCAGGTGGTCCTGGTGCTGCTGGTTTCCCTGGTGCTAGAGGTTTGCCCGGTCCACCTGGTTCTAACGGTAACCCAGGTCCACCTGGTCCTTCTGGTTCTCCTGGTAAAGACGGTCCACCTGGACCTGCTGGTAACACTGGTGCTCCAGGTTCTCCTGGTGTTTCTGGTCCAAAGGGAGATGCCGGTCAACCTGGTGAAAAAGGTTCTCCAGGTGCTCAAGGTCCACCTGGTGCTCCAGGTCCATTGGGTATTGCTGGTATTACTGGTGCTAGAGGTTTGGCTGGTCCACCTGGTATGCCAGGACCTAGAGGTTCTCCTGGTCCTCAGGGAGTTAAGGGTGAATCTGGTAAACCAGGTGCTAATGGTTTGTCTGGAGAAAGAGGTCCACCTGGTCCTCAAGGTTTGCCAGGTTTGGCTGGTACCGCCGGAGAGCCTGGTAGAGATGGTAACCCAGGTTCTGATGGTTTGCCTGGTAGAGACGGTTCTCCAGGTGGTAAAGGAGATAGAGGTGAGAATGGTTCTCCAGGTGCTCCTGGTGCTCCAGGGCACCCAGGTCCACCTGGACCTGTTGGTCCTGCTGGTAAATCCGGAGATAGAGGTGAATCTGGTCCAGCTGGTCCTGCTGGTGCTCCAGGTCCTGCTGGTTCTAGAGGTGCTCCAGGACCTCAGGGTCCAAGAGGAGATAAGGGTGAAACTGGAGAGAGAGGTGCTGCTGGTATTAAAGGTCACAGAGGTTTTCCAGGTAACCCAGGTGCTCCAGGTTCTCCTGGGCCTGCTGGTCAACAAGGTGCTATTGGTTCTCCTGGACCTGCTGGTCCTAGAGGTCCAGTTGGTCCTTCTGGTCCACCTGGTAAAGATGGTACTTCTGGTCATCCAGGACCAATTGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTAATAGAGGTGAAAGAGGTTCTGAGGGTTCTCCAGGTCACCCAGGACAGCCTGGTCCACCTGGTCCACCTGGTGCTCCAGGGCCTTAA

重组III型胶原蛋白成熟肽特征氨基酸序列(7M片段)优化前的核苷酸序列：

GAGGCTGGTATTCCAGGTGTTCCAGGAGCTAAAGGCGAAGATGGCAAGGATGGATCACCTGGAGAACCTGGTGCAAATGGGCTTCCAGGAGCTGCAGGAGAAAGGGGTGCCCCTGGGTTCCGAGGACCTGCTGGACCAAATGGCATCCCAGGAGAAAAGGGTCCTGCTGGAGAGCGTGGTGCTCCAGGCCCTGCAGGGCCCAGAGGAGCTGCTGGAGAACCTGGCAGAGATGGCGTCCCTGGAGGTCCAGGAATGAGGGGCATGCCCGGAAGTCCAGGAGGACCAGGAAGTGATGGGAAACCAGGGCCTCCCGGAAGTCAAGGAGAAAGTGGTCGACCAGGTCCTCCTGGGCCATCTGGTCCCCGAGGTCAGCCTGGTGTCATGGGCTTCCCCGGTCCTAAAGGAAATGATGGTGCTCCTGGTAAGAATGGAGAACGAGGTGGCCCTGGAGGACCTGGCCCTCAGGGTCCTCCTGGAAAGAATGGTGAAACTGGACCTCAGGGACCCCCAGGGCCTACTGGGCCTGGTGGTGACAAAGGAGACACAGGACCCCCTGGTCCACAAGGATTACAAGGCTTGCCTGGTACAGGTGGTCCTCCAGGAGAAAATGGAAAACCTGGGGAACCAGGTCCAAAGGGTGATGCCGGTGCACCTGGAGCTCCAGGAGGCAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTGGTGAACGTGGACCTCCTGGATTGGCAGGGGCCCCAGGACTTAGAGGTGGAGCTGGTCCCCCTGGTCCCGAAGGAGGAAAGGGTGCTGCTGGTCCTCCTGGGCCACCTGGTGCTGCTGGTACTCCTGGTCTGCAAGGAATGCCTGGAGAAAGAGGAGGTCTTGGAAGTCCTGGTCCAAAGGGTGACAAGGGTGAACCAGGCGGTCCAGGTGCTGATGGTGTCCCAGGGAAAGATGGCCCAAGGGGTCCTACTGGTCCTATTGGTCCTCCTGGCCCAGCTGGCCAGCCTGGAGATAAGGGTGAAGGTGGTGCCCCCGGACTTCCAGGTATAGCTGGACCTCGTGGTAGCCCTGGTGAGAGAGGTGAAACTGGCCCTCCAGGACCTGCTGGTTTCCCTGGTGCTCCTGGACAGAATGGTGAACCTGGTGGTAAAGGAGAAAGAGGGGCTCCGGGTGAGAAAGGTGAAGGAGGCCCTCCTGGAGTTGCAGGACCCCCTGGAGGTTCTGGACCTGCTGGTCCTCCTGGTCCCCAAGGTGTCAAAGGTGAACGTGGCAGTCCTGGTGGACCTGGTGCTGCTGGCTTCCCTGGTGCTCGTGGTCTTCCTGGTCCTCCTGGTAGTAATGGTAACCCAGGACCCCCAGGTCCCAGCGGTTCTCCAGGCAAGGATGGGCCCCCAGGTCCTGCGGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCCCTGGAGTGTCTGGACCAAAAGGTGATGCTGGCCAACCAGGAGAGAAGGGATCGCCTGGTGCCCAGGGCCCACCAGGAGCTCCAGGCCCACTTGGGATTGCTGGGATCACTGGAGCACGGGGTCTTGCAGGACCACCAGGCATGCCAGGTCCTAGGGGAAGCCCTGGCCCTCAGGGTGTCAAGGGTGAAAGTGGGAAACCAGGAGCTAACGGTCTCAGTGGAGAACGTGGTCCCCCTGGACCCCAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCTGGTGAACCTGGAAGAGATGGAAACCCTGGATCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGATGGATCTCCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAAATGGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGTCATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGTGGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCCTGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCTCAAGGCCCACGTGGTGACAAAGGTGAAACAGGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAAAGGACATCGAGGATTCCCTGGTAATCCAGGTGCCCCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAGGGTGCAATCGGCAGTCCAGGACCTGCAGGCCCCAGAGGACCTGTTGGACCCAGTGGACCTCCTGGCAAAGATGGAACCAGTGGACATCCAGGTCCCATTGGACCACCAGGGCCTCGAGGTAACAGAGGTGAAAGAGGATCTGAGGGCTCCCCAGGCCACCCAGGGCAACCAGGCCCTCCTGGACCTCCTGGTGCCCCTGGTCCT(终止密码子为TAA)

实施例3重组人III型胶原生产过程

(1)取保藏于-80℃的菌种SMD1168/pPZSaA-P4HA2-P4HB2,pPIC9k-COL3a1(428..1172)进行活化，用接种环蘸取菌液在YPD固体平板上划线；30℃培养2天，挑单菌落于YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养约24h，至OD₆₀₀达到5-40范围，此即为一级种子液，种子液可根据培养体积的大小进行调整。

(2)将上述制备好的种子液按无菌接种方式接种至50L发酵罐中(起始发酵BSM培养基为30L，条件为：温度为28℃，溶氧不低于20％，通过流加25％氨水控制pH为5.5±0.5。待甘油耗尽后，继续补加质量体积比为50％的灭菌甘油(每升质量体积比为50％的灭菌甘油添加12mL微量元素)；待湿重升至200g/L后，开始补加甲醇(每升甲醇添加12mL微量元素)进行诱导，至诱导结束。其中，发酵培养基配方如下：

BSM培养基(按每升基础培养基添加4.3mL微量元素)：

基础培养基：85％磷酸27mL/L，硫酸钙1g/L，硫酸钾18g/L，七水硫酸镁15g/L，氢氧化钾4g/L，甘油40g/L(高温灭菌)；

微量元素：五水硫酸铜6.0g/L，碘化钠0.008g/L,一水硫酸锰3.0g/L,二水合钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，氯化锌20.0g/L，七水合硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，浓硫酸5mL/L(过滤除菌)；

(3)诱导72小时后，结束培养，将发酵液4000g离心10min，收集上清。将含有重组人III型胶原成熟肽发酵液上清加入硫酸铵进行分级沉淀，首先加入8％-15％饱和硫酸铵进行沉淀，20000rpm离心20min收集上清；然后再往上清中继续添加10％-35％饱和硫酸铵进行二次沉淀，20000rpm离心20min收集沉淀，将沉淀溶解于pH＝5.5,20mM磷酸缓冲液中，再过0.45μm滤膜去除颗粒，然后通过SP FastFlow阳离子交换柱(GE公司)进行下一步纯化，过程如下：首先采用pH＝5.5,20mM磷酸盐缓冲液进行平衡，然后采用0.2M NaCl进行洗杂，洗脱条件为0.5M NaCl，最后再过分子筛G25(GE公司)，得到溶解于20mM pH5.5磷酸缓冲液的重组人III型胶原成熟肽原液(图5B)。

实施例4重组人III型胶原成熟肽鉴定

将实施例3制得的重组人III型胶原成熟肽原液送至上海中科新生命生物科技有限公司进行鉴定分析，鉴定方法为胰蛋白酶酶解联合液质联用(QE)，步骤如下：

1)样品酶解：将样品经过还原和烷基化处理后，加入Trypsin(质量比1:50)，在37℃条件下酶解20小时。酶解产物脱盐后冻干，复溶于0.1％甲酸溶液中，-20℃保存待用。

2)液质联用：液相设备为Easy-nLC 1000(Thermo Fisher)，A液为0.1％甲酸的水溶液，B液为0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡后，样品由自动进样器上样至Trap柱。质谱设备为Q Exactive(Thermo Fisher)，设置0.5H梯度。

3)质谱数据采集：多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)。

4)数据分析：质谱测试原始文件(raw file)用Mascot2.2软件检索相应的数据库,最后得到鉴定的蛋白质结果。

比对结果表明：本发明表达的蛋白与人III型胶原蛋白成熟肽的氨基酸序列一致(图6)。

同时，实施例3制得的重组人III型胶原成熟肽原液中脯氨酸含量测定方法参考《中华人民共和国国标GB5009.124-2016》。委托华南农业大学测试中心进行检测，结果显示检出羟脯氨酸，证实脯氨酸羟化酶具有生物学活性(图7)。

实施例5重组人III型胶原成熟肽促细胞增殖活性检测

将处于对数生长期的3T3细胞(购买于赛默飞公司)用含有10％FBS的1640培养基(Gibco公司，美国)常规培养至80％～90％，然后用0.25％胰蛋白酶(m/v)消化，并以2.0×10⁵个/mL的细胞数目接种于96孔板，培养24h后，换无血清1640培养基培养；培养24h后将培养基吸出后分别加入浓度为7500、2500、833、278、92.6、30.9、10.3、3.4ng/mL的实施例3制得的重组人III型胶原成熟肽(所有样品均用PBS稀释)，每个浓度设3个孔计算误差。给药后放入二氧化碳培养箱培养24h，然后加入10μL MTT(0.5mg/mL)，37℃培养箱中孵育4h；吸出孔中溶液并加入100μL DMSO，振荡后于570/630nm波长下检测吸光值。

结果表明，重组人III型胶原成熟肽有较好的促细胞增殖活性(图8)。

实施例6重组人III型胶原成熟肽细胞划痕试验

1)标准品溶液配制

取重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)标准品冻干粉(购于中国标准物质研究院)，按照说明书复溶后，其活性是9800IU/mL，对应的浓度是1mg/mL，分装后，-80℃保存。测试时取一支9800IU/mL标准品用无血清培养基稀释100倍，然后在离心管中，做4倍系列稀释，共3个稀释度(分别是1.56IU/mL、6.25IU/mL、25IU/mL)，每个浓度做2个复孔，以上操作均在无菌条件下进行。

2)样品溶液配制

用无血清培养基SFM(购置于Gibico公司)将猪皮提取胶原(购于德国GELITA公司)和实施例3制得的重组人III型胶原成熟肽稀释至50ng/mL，每个浓度做2个复孔，以上操作均在无菌条件下进行。

3)操作过程

①先用Maker笔在12孔板背后，用直尺比划参考线，横穿过孔中心，每孔至少穿过2条线。

②胰酶消化处于对数期的NIH3T3细胞(购买于赛默飞公司)，10％FBS的培养基(购置于Gibico公司)重悬，以10万/mL，1mL/孔接种细胞至12孔板中。

③第二天观察长至90％后，吸弃12孔板中的上清，残留100-200μL培养基，用200μL枪头比着直尺，尽量垂直于背后的参考线划痕。用PBS洗涤细胞1-2次，去除脱落下的细胞，镜下观察没有漂浮的细胞即为洗涤干净。

④加入配置好的样品及标准品，900μL/孔，做好标记。放入37℃，5％CO₂培养箱培养；按0，24，48小时选取位置拍照(每组拍摄的不同时间点要求是同一位置)，可根据实际情况调整拍摄时间。

⑤用ImageJ软件处理图片，结果以迁移率表示。计算公式如下：

结果表明，50ng/mL重组人III型胶原成熟肽具有良好的促细胞迁移活性(备注：基于实验结果)(图9、图10)。

实施例7重组人III型胶原冻干粉的制备及粘度测试

1)将对照(猪皮提取胶原，购于德国GELITA公司)溶解于50mM pH3.0酸缓冲液中，配置成浓度为2mg/mL溶液，无菌过滤后，装入西林瓶中；

2)将溶于PB的实施例3制得的重组人III型胶原成熟肽(浓度为2mg/mL)过滤除菌后，装入西林瓶中；

3)将上述两种含不同来源胶原的西林瓶放入冻干机板层，关闭机门；

4)预冻阶段：预冻温度-35℃～-50℃，预冻时间2～4小时；

5)升华干燥阶段：在-10℃升华干燥4小时，继续在10℃升华干燥3小时，压力控制为0.25±0.03mbar；

6)解吸干燥阶段：将温度升至30℃，保温2小时，将压力调至0.05～0.01mbar，保温4小时，分别得到重组人III型胶原成熟肽冻干粉以及动物胶原对照冻干粉。

7)准确称取一定量上述冻干粉，加入无菌水进行溶解，控制二者的浓度均为4mg/mL，然后采用RS600型HAAKE旋转流变仪对溶液粘度特性进行分析，25℃下保温30min后进行测定，转速控制为32rpm。

结果显示，本发明制得的重组人III型胶原成熟肽冻干粉能形成多孔海绵状，能耐受一定的机械力(图11A)，而对照冻干粉疏松易碎。同时，4mg/mL的重组人III型胶原成熟肽粘度达到60mPa.S，而对照猪皮提取胶原的粘度只有20mPa.S，重组人III型胶原成熟肽粘度明显优于猪皮提取胶原(图11B)。

实施例8重组人III型胶原胶原贴敷料的制备

采用20mM磷酸盐缓冲液调整实施例3制得的重组人III型胶原成熟肽原液的浓度及粘度，浓度调整为2.5mg/ml(浓度范围可以定为0.5～5.0mg/ml)；

在无菌条件下，将上述胶原成品液采用全自动灌封机灌装入已灭菌的装有非织造布的复合铝箔袋中，并热压封口，即可得到无菌胶原贴敷料。

上述方法制备的无菌胶原贴敷料可应用于多种创面的修复，如烧烫伤创面或激光术后恢复等方面。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 肽源（广州）生物科技有限公司

<120> 一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽及其制备方法与应用

<130> 1

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1776

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 毕赤酵母邻氨基苯甲酸合成酶核苷酸序列

<400> 1

tggccaaacg gtttctcaat tactatatac tactaaccat ttacctgtag cgtatttctt 60

ttccctcttc gcgaaagctc aagggcatct tcttgactca tgaaaaatat ctggatttct 120

tctgacagat catcaccctt gagcccaact ctctagccta tgagtgtaag tgatagtcat 180

cttgcaacag attattttgg aacgcaacta acaaagcaga tacacccttc agcagaatcc 240

tttctggata ttgtgaagaa tgatcgccaa agtcacagtc ctgagacagt tcctaatctt 300

taccccattt acaagttcat ccaatcagac ttcttaacgc ctcatctggc ttatatcaag 360

cttaccaaca gttcagaaac tcccagtcca agtttcttgc ttgaaagtgc gaagaatggt 420

gacaccgttg acaggtacac ctttatggga cattccccca gaaaaataat caagactggg 480

cctttagagg gtgctgaagt tgaccccttg gtgcttctgg aaaaagaact gaagggcacc 540

agacaagcgc aacttcctgg tattcctcgt ctaagtggtg gtgccatagg atacatctcg 600

tacgattgta ttaagtactt tgaaccaaaa actgaaagaa aactgaaaga tgttttgcaa 660

cttccggaag cagctttgat gttgttcgac acgatcgtgg cttttgacaa tgtttatcaa 720

agattccagg taattggaaa cgtttctcta tccgttgatg actcggacga agctattctt 780

gagaaatatt ataagacaag agaagaagtg gaaaagatca gtaaagtggt atttgacaat 840

aaaactgttc cctactatga acagaaagat attattcaag gccaaacgtt cacctctaat 900

attggtcagg aagggtatga aaaccatgtt cgcaagctga aagaacatat tctgaaagga 960

gacatcttcc aagctgttcc ctctcaaagg gtagccaggc cgacctcatt gcaccctttc 1020

aacatctatc gtcatttgag aactgtcaat ccttctccat acatgttcta tattgactat 1080

ctagacttcc aagttgttgg tgcttcacct gaattactag ttaaatccga caacaacaac 1140

aaaatcatca cacatcctat tgctggaact cttcccagag gtaaaactat cgaagaggac 1200

gacaattatg ctaagcaatt gaagtcgtct ttgaaagaca gggccgagca cgtcatgctg 1260

gtagatttgg ccagaaatga tattaaccgt gtgtgtgagc ccaccagtac cacggttgat 1320

cgtttattga ctgtggagag attttctcat gtgatgcatc ttgtgtcaga agtcagtgga 1380

acattgagac caaacaagac tcgcttcgat gctttcagat ccattttccc agcaggaacc 1440

gtctccggtg ctccgaaggt aagagcaatg caactcatag gagaattgga aggagaaaag 1500

agaggtgttt atgcgggggc cgtaggacac tggtcgtacg atggaaaatc gatggacaca 1560

tgtattgcct taagaacaat ggtcgtcaag gacggtgtcg cttaccttca agccggaggt 1620

ggaattgtct acgattctga cccctatgac gagtacatcg aaaccatgaa caaaatgaga 1680

tccaacaata acaccatctt ggaggctgag aaaatctgga ccgataggtt ggccagagac 1740

gagaatcaaa gtgaatccga agaaaacgat caatga 1776

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物AS-F1

<400> 2

ttaggatcct ggccaaacgg tttctcaatt ac 32

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物AS-R1

<400> 3

cgcagatctc aaaccataaa ttcctactta cgtcctccgt tcattgatcg ttttc 55

<210> 4

<211> 534

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P4HA2氨基酸序列

<400> 4

Met Gln Phe Asn Trp Asn Ile Lys Thr Val Ala Ser Ile Leu Ser Ala

1 5 10 15

Leu Thr Leu Ala Gln Ala Glu Phe Phe Thr Ser Ile Gly His Met Thr

20 25 30

Asp Leu Ile Tyr Ala Glu Lys Glu Leu Val Gln Ser Leu Lys Glu Tyr

35 40 45

Ile Leu Val Glu Glu Ala Lys Leu Ser Lys Ile Lys Ser Trp Ala Asn

50 55 60

Lys Met Glu Ala Leu Thr Ser Lys Ser Ala Ala Asp Ala Glu Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Ala His Pro Val Asn Ala Tyr Lys Leu Val Lys Arg Leu Asn Thr

85 90 95

Asp Trp Pro Ala Leu Glu Asp Leu Val Leu Gln Asp Ser Ala Ala Gly

100 105 110

Phe Ile Ala Asn Leu Ser Val Gln Arg Gln Phe Phe Pro Thr Asp Glu

115 120 125

Asp Glu Ile Gly Ala Ala Lys Ala Leu Met Arg Leu Gln Asp Thr Tyr

130 135 140

Arg Leu Asp Pro Gly Thr Ile Ser Arg Gly Glu Leu Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Tyr Gln Ala Met Leu Ser Val Asp Asp Cys Phe Gly Met Gly Arg Ser

165 170 175

Ala Tyr Asn Glu Gly Asp Tyr Tyr His Thr Val Leu Trp Met Glu Gln

180 185 190

Val Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Glu Glu Ala Thr Thr Thr Lys Ser

195 200 205

Gln Val Leu Asp Tyr Leu Ser Tyr Ala Val Phe Gln Leu Gly Asp Leu

210 215 220

His Arg Ala Leu Glu Leu Thr Arg Arg Leu Leu Ser Leu Asp Pro Ser

225 230 235 240

His Glu Arg Ala Gly Gly Asn Leu Arg Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Glu

245 250 255

Glu Glu Arg Glu Lys Thr Leu Thr Asn Gln Thr Glu Ala Glu Leu Ala

260 265 270

Thr Pro Glu Gly Ile Tyr Glu Arg Pro Val Asp Tyr Leu Pro Glu Arg

275 280 285

Asp Val Tyr Glu Ser Leu Cys Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Thr Pro

290 295 300

Arg Arg Gln Lys Arg Leu Phe Cys Arg Tyr His His Gly Asn Arg Ala

305 310 315 320

Pro Gln Leu Leu Ile Ala Pro Phe Lys Glu Glu Asp Glu Trp Asp Ser

325 330 335

Pro His Ile Val Arg Tyr Tyr Asp Val Met Ser Asp Glu Glu Ile Glu

340 345 350

Arg Ile Lys Glu Ile Ala Lys Pro Lys Leu Ala Arg Ala Thr Val Arg

355 360 365

Asp Pro Lys Thr Gly Val Leu Thr Val Ala Ser Tyr Arg Val Ser Lys

370 375 380

Ser Ser Trp Leu Glu Glu Asp Asp Asp Pro Val Val Ala Arg Val Asn

385 390 395 400

Arg Arg Met Gln His Ile Thr Gly Leu Thr Val Lys Thr Ala Glu Leu

405 410 415

Leu Gln Val Ala Asn Tyr Gly Val Gly Gly Gln Tyr Glu Pro His Phe

420 425 430

Asp Phe Ser Arg Arg Pro Phe Asp Ser Gly Leu Lys Thr Glu Gly Asn

435 440 445

Arg Leu Ala Thr Phe Leu Asn Tyr Met Ser Asp Val Glu Ala Gly Gly

450 455 460

Ala Thr Val Phe Pro Asp Leu Gly Ala Ala Ile Trp Pro Lys Lys Gly

465 470 475 480

Thr Ala Val Phe Trp Tyr Asn Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gly Asp Tyr

485 490 495

Arg Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Val Gly Cys Lys Trp Val

500 505 510

Ser Asn Lys Trp Phe His Glu Arg Gly Gln Glu Phe Leu Arg Pro Cys

515 520 525

Gly Ser His Asp Glu Leu

530

<210> 5

<211> 1602

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P4HA2核苷酸序列

<400> 5

atgcaattca actggaacat caagactgtt gcttctatct tgtctgcttt gactttggct 60

caagctgaat tcttcacttc tatcggtcac atgactgact tgatctacgc tgaaaaggaa 120

ttggttcaat ctttgaagga atacatcttg gttgaagaag ctaagttgtc taagatcaag 180

tcttgggcta acaagatgga agctttgact tctaagtctg ctgctgacgc tgaaggttac 240

ttggctcacc cagttaacgc ttacaagttg gttaagagat tgaacactga ctggccagct 300

ttggaagact tggttttgca agactctgct gctggtttca tcgctaactt gtctgttcaa 360

agacaattct tcccaactga cgaagacgaa atcggtgctg ctaaggcttt gatgagattg 420

caagacactt acagattgga cccaggtact atctctagag gtgaattgcc aggtactaag 480

taccaagcta tgttgagtgt tgacgactgc ttcggcatgg gtagatcggc ttacaacgaa 540

ggtgactact accacactgt tttgtggatg gaacaagttt tgaagcaatt ggacgctggt 600

gaagaagcta ctactactaa gtctcaagtt ttggactact tgtcttacgc tgttttccaa 660

ttgggtgact tgcacagagc tttggaattg actagaagat tgttgtcttt ggacccatct 720

cacgaaagag ctggtggtaa cttgagatac ttcgaacaat tgttggaaga agaaagagaa 780

aagactttga ctaaccaaac tgaagctgaa ttggctactc cagaaggtat ctacgaaaga 840

ccagttgact acttgccaga aagagacgtt tacgaatctt tgtgtagagg tgaaggtgtt 900

aagttgactc caagaagaca aaagagattg ttctgtagat accaccacgg taacagagct 960

ccacaattgt tgatcgctcc attcaaggaa gaagacgaat gggactctcc acacatcgtt 1020

agatactacg acgttatgtc tgacgaagaa atcgaaagaa tcaaggaaat cgctaagcca 1080

aagttggcta gagctactgt tagagaccca aagactggtg ttttgactgt tgcttcttac 1140

agagtttcta agtcttcttg gttggaagaa gacgacgacc cagttgttgc tagagttaac 1200

agaagaatgc aacacatcac tggtttgact gttaagactg ctgaattgtt gcaagttgct 1260

aactacggtg ttggtggtca atacgaacca cacttcgact tctctagaag accattcgac 1320

tctggtttga agactgaagg taacagattg gctactttct tgaactacat gtctgacgtt 1380

gaagctggtg gtgctactgt tttcccagac ttgggtgctg ctatctggcc aaagaagggt 1440

actgctgttt tctggtacaa cttgttgaga tcgggtgaag gtgactacag aactagacac 1500

gctgcttgcc cagtcctcgt tggttgtaag tgggtttcta acaagtggtt ccacgaaaga 1560

ggtcaagaat tcttgagacc atgtggttct cacgacgaat tg 1602

<210> 6

<211> 513

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> P4HB2氨基酸序列

<400> 6

Met Gln Phe Asn Trp Asn Ile Lys Thr Val Ala Ser Ile Leu Ser Ala

1 5 10 15

Leu Thr Leu Ala Gln Ala Asp Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu

20 25 30

Val Leu Arg Lys Ser Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr

35 40 45

Leu Leu Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu

50 55 60

Ala Pro Glu Tyr Ala Lys Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser

65 70 75 80

Glu Ile Arg Leu Ala Lys Val Asp Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala

85 90 95

Gln Gln Tyr Gly Val Arg Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn

100 105 110

Gly Asp Thr Ala Ser Pro Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp

115 120 125

Asp Ile Val Asn Trp Leu Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr

130 135 140

Leu Pro Asp Gly Ala Ala Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val

145 150 155 160

Ala Val Ile Gly Phe Phe Lys Asp Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln

165 170 175

Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr

180 185 190

Ser Asn Ser Asp Val Phe Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val

195 200 205

Val Leu Phe Lys Lys Phe Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu

210 215 220

Val Thr Lys Glu Asn Leu Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro

225 230 235 240

Leu Val Ile Glu Phe Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly

245 250 255

Glu Ile Lys Thr His Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp

260 265 270

Tyr Asp Gly Lys Leu Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys

275 280 285

Gly Lys Ile Leu Phe Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln

290 295 300

Arg Ile Leu Glu Phe Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val

305 310 315 320

Arg Leu Ile Thr Leu Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser

325 330 335

Glu Glu Leu Thr Ala Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu

340 345 350

Glu Gly Lys Ile Lys Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp

355 360 365

Trp Asp Lys Gln Pro Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp

370 375 380

Val Ala Phe Asp Glu Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro

385 390 395 400

Trp Cys Gly His Cys Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly

405 410 415

Glu Thr Tyr Lys Asp His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser

420 425 430

Thr Ala Asn Glu Val Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu

435 440 445

Lys Phe Phe Pro Ala Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly

450 455 460

Glu Arg Thr Leu Asp Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln

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Asp Gly Ala Gly Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu

485 490 495

Glu Pro Asp Met Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val His Asp Glu

500 505 510

Leu

<210> 7

<211> 1539

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P4HB2核苷酸序列

<400> 7

atgcaattca actggaacat caagactgtt gcttctatct tgtctgcttt gactttggct 60

caagctgacg ctccagaaga agaagaccac gttttggttt tgagaaagtc taactttgcg 120

gaagctctcg ctgctcacaa gtacttgttg gttgaattct acgctccatg gtgtggtcac 180

tgtaaggctt tggctccaga atacgctaag gctgctggta agttgaaggc tgaaggttct 240

gaaatcagat tggctaaggt tgacgctact gaagaatctg acttggctca acaatacggt 300

gttagaggtt acccaactat caagttcttc agaaacggtg acactgcttc tccaaaggaa 360

tacactgctg gtagagaagc tgacgacatc gttaactggt tgaagaagag aactggtcca 420

gctgctacta ctttgccaga cggtgctgct gctgaatctt tggttgaatc ttctgaagtt 480

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gctgaagcta tcgacgacat cccattcggt atcacttcta actctgacgt tttctctaag 600

taccaattgg acaaggacgg tgttgttttg ttcaagaagt tcgacgaagg tagaaacaac 660

ttcgaaggtg aagttactaa ggaaaacttg ttggacttca tcaagcacaa ccaattgcca 720

ttggttatcg aattcactga acaaactgct ccaaagatat tcggtggtga aatcaagact 780

cacatcttgt tgttcttgcc aaagtctgtt tctgactacg acggtaagtt gtctaacttc 840

aagactgctg ctgaatcttt caagggtaag atcctcttca tcttcatcga ctctgaccac 900

actgacaacc aaagaatact cgaattcttc ggactcaaga aggaagagtg tccagctgtt 960

agattgatca ctttggaaga agaaatgact aagtacaagc cagaatctga agaattgact 1020

gctgaaagaa tcactgaatt ctgtcacaga ttcttggaag gtaagatcaa gccacacttg 1080

atgtctcaag aattgccaga agactgggac aagcaaccag ttaaggtttt ggttggtaag 1140

aacttcgaag acgttgcttt cgacgaaaag aagaacgttt tcgttgaatt ctacgctcca 1200

tggtgtggtc actgtaagca attggctcca atctgggaca agttgggtga aacttacaag 1260

gaccacgaaa acatcgttat cgctaagatg gactctactg ctaacgaagt tgaagctgtt 1320

aaggttcact ctttcccaac tttgaagttc ttcccagctt ctgctgacag aactgttatc 1380

gactacaacg gtgaaagaac tttggacggt ttcaagaagt tcttggaatc tggtggtcaa 1440

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gaagaagacg acgaccaaaa ggctgttcac gacgaattg 1539

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P4HA2-F

<400> 8

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P4HA2-R

<400> 9

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<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P4HB2-F

<400> 10

tcttcgaaac gatgcaattc aactggaaca tc 32

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P4HB2-R

<400> 11

tggcggccgc tcattacaat tcgtcgtgaa cagc 34

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F-P4HA2

<400> 12

atgcaattca actggaacat caagac 26

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R-P4HB2

<400> 13

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<210> 14

<211> 1443

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> COL3A1氨基酸序列

<400> 14

Gln Gln Glu Ala Val Glu Gly Gly Cys Ser His Leu Gly Gln Ser Tyr

1 5 10 15

Ala Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys

20 25 30

Asp Ser Gly Ser Val Leu Cys Asp Asp Ile Ile Cys Asp Asp Gln Glu

35 40 45

Leu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Ile Pro Phe Gly Glu Cys Cys Ala Val

50 55 60

Cys Pro Gln Pro Pro Thr Ala Pro Thr Arg Pro Pro Asn Gly Gln Gly

65 70 75 80

Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Arg

85 90 95

Asn Gly Asp Pro Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro

100 105 110

Gly Pro Pro Gly Ile Cys Glu Ser Cys Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr

115 120 125

Ser Pro Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp Val Lys Ser Gly Val Ala Val Gly

130 135 140

Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

145 150 155 160

Pro Pro Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Tyr

165 170 175

Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Gln Ala Gly Pro Ser Gly Pro Pro

180 185 190

Gly Pro Pro Gly Ala Ile Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly

195 200 205

Glu Ser Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Pro

210 215 220

Pro Gly Ile Lys Gly Pro Ala Gly Ile Pro Gly Phe Pro Gly Met Lys

225 230 235 240

Gly His Arg Gly Phe Asp Gly Arg Asn Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly

245 250 255

Ala Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Gly Leu Pro Gly Glu Asn Gly Ala

260 265 270

Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro

275 280 285

Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly

290 295 300

Ser Asp Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Ala Gly Phe

305 310 315 320

Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Ser Pro

325 330 335

Gly Ser Asn Gly Ala Pro Gly Gln Arg Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly

340 345 350

His Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ile Asn Gly Ser

355 360 365

Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Pro Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro

370 375 380

Gly Leu Met Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Asn Gly

385 390 395 400

Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly Glu Pro Gly Lys Asn Gly Ala

405 410 415

Lys Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Glu Ala Gly Ile Pro

420 425 430

Gly Val Pro Gly Ala Lys Gly Glu Asp Gly Lys Asp Gly Ser Pro Gly

435 440 445

Glu Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Glu Arg Gly Ala

450 455 460

Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys

465 470 475 480

Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly

485 490 495

Ala Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Met

500 505 510

Arg Gly Met Pro Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro

515 520 525

Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly

530 535 540

Pro Ser Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro

545 550 555 560

Lys Gly Asn Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro

565 570 575

Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly

580 585 590

Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Gly Gly Asp Lys Gly Asp

595 600 605

Thr Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Thr Gly

610 615 620

Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly

625 630 635 640

Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala

645 650 655

Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gly Leu Arg

660 665 670

Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly

675 680 685

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly Thr Pro Gly Leu Gln Gly Met

690 695 700

Pro Gly Glu Arg Gly Gly Leu Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys

705 710 715 720

Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly Ala Asp Gly Val Pro Gly Lys Asp Gly

725 730 735

Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln

740 745 750

Pro Gly Asp Lys Gly Glu Gly Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Ile Ala

755 760 765

Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg Gly Glu Thr Gly Pro Pro Gly

770 775 780

Pro Ala Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Gln Asn Gly Glu Pro Gly Gly

785 790 795 800

Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Lys Gly Glu Gly Gly Pro Pro

805 810 815

Gly Val Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly

820 825 830

Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ala

835 840 845

Ala Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn

850 855 860

Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly

865 870 875 880

Pro Pro Gly Pro Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val

885 890 895

Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro

900 905 910

Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly

915 920 925

Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro

930 935 940

Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro

945 950 955 960

Gly Ala Asn Gly Leu Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly

965 970 975

Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn

980 985 990

Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys

995 1000 1005

Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro

1010 1015 1020

Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser

1025 1030 1035

Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala Pro

1040 1045 1050

Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg

1055 1060 1065

Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys

1070 1075 1080

Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro

1085 1090 1095

Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala

1100 1105 1110

Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Asp

1115 1120 1125

Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg

1130 1135 1140

Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro

1145 1150 1155

Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys

1160 1165 1170

Cys Gly Gly Val Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly Gly Glu

1175 1180 1185

Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Met Asp

1190 1195 1200

Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val

1205 1210 1215

Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys

1220 1225 1230

Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg Asp Leu Lys Phe Cys His Pro Glu

1235 1240 1245

Leu Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys Lys

1250 1255 1260

Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr

1265 1270 1275

Cys Ile Ser Ala Asn Pro Leu Asn Val Pro Arg Lys His Trp Trp

1280 1285 1290

Thr Asp Ser Ser Ala Glu Lys Lys His Val Trp Phe Gly Glu Ser

1295 1300 1305

Met Asp Gly Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Asn Pro Glu Leu Pro

1310 1315 1320

Glu Asp Val Leu Asp Val Gln Leu Ala Phe Leu Arg Leu Leu Ser

1325 1330 1335

Ser Arg Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile

1340 1345 1350

Ala Tyr Met Asp Gln Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys

1355 1360 1365

Leu Met Gly Ser Asn Glu Gly Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser

1370 1375 1380

Lys Phe Thr Tyr Thr Val Leu Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr

1385 1390 1395

Gly Glu Trp Ser Lys Thr Val Phe Glu Tyr Arg Thr Arg Lys Ala

1400 1405 1410

Val Arg Leu Pro Ile Val Asp Ile Ala Pro Tyr Asp Ile Gly Gly

1415 1420 1425

Pro Asp Gln Glu Phe Gly Val Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

1430 1435 1440

<210> 15

<211> 4332

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 优化后的COL3A1核苷酸序列

<400> 15

caacaagaag ctgttgaggg tggttgttct catttgggtc aatcttatgc tgatagagat 60

gtttggaagc cagaaccttg tcaaatttgt gtttgtgatt ctggttctgt tttgtgtgat 120

gatatcatct gtgatgatca agagttggat tgtccaaacc ctgaaattcc attcggagag 180

tgttgtgctg tttgtcctca accacctact gctccaacta gaccacctaa cggtcaaggt 240

ccacaaggtc ctaagggaga tccaggtcca cctggtattc caggtagaaa tggagatcca 300

ggtattcctg gacaaccagg ttctcctggt tctcctggtc cacctggaat ctgtgaatct 360

tgtcctactg gtccacaaaa ttactctcca caatacgatt cttatgatgt taaatctggt 420

gttgctgttg gtggtttggc tggttatcca ggtcctgcag gtccacctgg tccacctggt 480

ccacctggga cttccggtca tcctggttct ccaggttctc ctggttacca aggtccacct 540

ggagaacctg gtcaagctgg tccatccggt ccacctggtc cacctggagc cattggtcca 600

tctggtcctg ctggtaaaga tggtgaatct ggtagaccag gtagaccagg agagagaggt 660

ttgcctggtc cacctggtat taagggtcct gctggtattc caggttttcc tggtatgaaa 720

ggtcacagag gtttcgatgg tagaaacggt gaaaagggag agactggtgc tccaggtttg 780

aaaggtgaaa acggtttgcc tggagagaat ggtgctccag gtcctatggg tcctagaggt 840

gctccaggtg aaagaggtag accaggtttg cctggtgctg ctggtgctag aggtaacgat 900

ggtgctagag gttctgatgg tcagccaggt ccacctggtc cacctggcac tgctggtttt 960

ccaggttctc ctggtgctaa gggtgaagtt ggtcctgctg gttctccagg ttctaacggt 1020

gctccaggtc aaagaggtga gccaggtcct caaggtcacg ctggtgctca aggtccacct 1080

ggtccacctg gtattaatgg ttctccaggt ggtaaaggtg aaatgggacc agctggtatt 1140

ccaggtgctc ctggtttgat gggtgctaga ggtccacctg gtccagctgg tgctaacggt 1200

gctcctggtt tgagaggtgg tgctggtgaa ccaggtaaaa acggtgctaa aggagagcca 1260

ggtcctagag gtgaaagagg tgaggctggt attccaggtg tcccaggtgc taagggtgaa 1320

gatggtaaag atggttctcc aggagagcct ggtgctaacg gtttgccagg tgctgctggt 1380

gaaagaggtg ctcctggttt tagaggtcca gctggtccta atggtattcc tggtgaaaag 1440

ggtccagctg gagagagagg tgctccagga ccagctggtc caagaggtgc tgctggtgaa 1500

cctggtagag atggtgttcc aggtggtcct ggtatgcgtg gtatgccagg ttctcctggt 1560

ggtccaggtt ctgatggtaa accaggtcca cctggttctc aaggagagtc tggtagacca 1620

ggtccacctg gaccatctgg tccaagaggt caaccaggtg ttatgggttt cccaggtcct 1680

aagggtaacg atggtgctcc aggtaaaaat ggtgaaagag gtggtcctgg tggtcctggt 1740

cctcaaggtc cacctggtaa aaacggagag actggtccac aaggtccacc tggacctact 1800

ggtccaggtg gagataaagg agatacaggt ccacctggac ctcaaggttt gcaaggtttg 1860

cctggtactg gtggtccacc tggagaaaat ggtaaaccag gagagccagg tcctaaagga 1920

gatgctggtg ctcctggtgc tccaggtggt aaaggagatg ccggtgctcc aggagagaga 1980

ggtccacctg gtttggccgg tgctccagga cttagaggtg gtgctggtcc acctggacca 2040

gagggtggta aaggtgccgc cggtccacct ggtccacctg gggctgctgg tactcctggt 2100

ttgcagggta tgccaggtga aagaggtggt ttgggttctc caggtcctaa gggagataaa 2160

ggagagcctg gtggtccagg tgctgatggt gttcctggta aagatggtcc tagaggtcca 2220

actggtccta tcggtccacc tggtcctgct ggtcaaccag gagataaagg tgaaggtggt 2280

gctccaggtt tgcctggtat tgctggtcct agaggttctc caggtgaaag aggtgagact 2340

ggtccacctg gtccagccgg ttttccaggt gctcctggtc aaaacggtga accaggtggt 2400

aaaggagaga gaggtgctcc tggtgaaaaa ggagagggtg gtccacctgg tgttgccggt 2460

ccacctggtg gttctggacc agcaggtcca cctggaccac aaggtgttaa gggtgaaaga 2520

ggttctccag gtggtcctgg tgctgctggt ttccctggtg ctagaggttt gcccggtcca 2580

cctggttcta acggtaaccc aggtccacct ggtccttctg gttctcctgg taaagacggt 2640

ccacctggac ctgctggtaa cactggtgct ccaggttctc ctggtgtttc tggtccaaag 2700

ggagatgccg gtcaacctgg tgaaaaaggt tctccaggtg ctcaaggtcc acctggtgct 2760

ccaggtccat tgggtattgc tggtattact ggtgctagag gtttggctgg tccacctggt 2820

atgccaggac ctagaggttc tcctggtcct cagggagtta agggtgaatc tggtaaacca 2880

ggtgctaatg gtttgtctgg agaaagaggt ccacctggtc ctcaaggttt gccaggtttg 2940

gctggtaccg ccggagagcc tggtagagat ggtaacccag gttctgatgg tttgcctggt 3000

agagacggtt ctccaggtgg taaaggagat agaggtgaga atggttctcc aggtgctcct 3060

ggtgctccag ggcacccagg tccacctgga cctgttggtc ctgctggtaa atccggagat 3120

agaggtgaat ctggtccagc tggtcctgct ggtgctccag gtcctgctgg ttctagaggt 3180

gctccaggac ctcagggtcc aagaggagat aagggtgaaa ctggagagag aggtgctgct 3240

ggtattaaag gtcacagagg ttttccaggt aacccaggtg ctccaggttc tcctgggcct 3300

gctggtcaac aaggtgctat tggttctcct ggacctgctg gtcctagagg tccagttggt 3360

ccttctggtc cacctggtaa agatggtact tctggtcatc caggaccaat tggtccacct 3420

ggtccaagag gtaatagagg tgaaagaggt tctgagggtt ctccaggtca cccaggacag 3480

cctggtccac ctggtccacc tggtgctcca gggccttgtt gtggtggtgt tggtgctgct 3540

gctattgctg gtattggtgg tgaaaaggct ggtggttttg ctccttacta tggagatgaa 3600

ccaatggatt tcaagattaa cactgatgag atcatgactt ctttgaagtc tgttaacggt 3660

caaatcgagt ctttgatttc tccagatggt tctagaaaga accctgctag aaactgtaga 3720

gatttgaagt tctgtcatcc agaattgaag tctggagagt actgggttga tccaaaccaa 3780

ggttgtaagt tggatgctat taaagttttc tgtaacatgg aaactggaga gacttgtatt 3840

tctgctaacc ctttgaatgt tccaagaaag cattggtgga ctgattcttc tgctgaaaag 3900

aaacacgttt ggtttggaga gtctatggat ggtggttttc aattctctta tggtaaccct 3960

gaattgccag aggatgtttt ggatgttcaa ttggctttct tgagattgtt gtcttctaga 4020

gcttctcaaa acatcactta ccattgtaag aactctatcg cttacatgga tcaagcttct 4080

ggtaacgtta agaaagcttt gaagttgatg ggttctaacg aaggagagtt taaggctgag 4140

ggtaactcta aattcactta cactgttttg gaggatggtt gtactaagca cactggtgaa 4200

tggtctaaaa ctgttttcga gtacagaact agaaaagctg ttagattgcc tattgttgat 4260

attgctccat atgatattgg tggtcctgat caagaatttg gtgttgatgt tggtccagtt 4320

tgtttcttgt aa 4332

<210> 16

<211> 745

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 重组III型胶原蛋白成熟肽特征氨基酸序列（7M片段）

<400> 16

Glu Ala Gly Ile Pro Gly Val Pro Gly Ala Lys Gly Glu Asp Gly Lys

1 5 10 15

Asp Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly Ala Ala

20 25 30

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly

35 40 45

Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro

50 55 60

Ala Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Val Pro

65 70 75 80

Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly

85 90 95

Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Ser Gly Arg

100 105 110

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly Val Met

115 120 125

Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asn Gly

130 135 140

Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Lys

145 150 155 160

Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Gly

165 170 175

Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Gln Gly

180 185 190

Leu Pro Gly Thr Gly Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly Glu

195 200 205

Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Gly Lys

210 215 220

Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly

225 230 235 240

Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Gly

245 250 255

Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly Thr Pro

260 265 270

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Leu Gly Ser Pro Gly

275 280 285

Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly Ala Asp Gly Val

290 295 300

Pro Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro

305 310 315 320

Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly Asp Lys Gly Glu Gly Gly Ala Pro Gly

325 330 335

Leu Pro Gly Ile Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg Gly Glu

340 345 350

Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Gln Asn

355 360 365

Gly Glu Pro Gly Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Lys Gly

370 375 380

Glu Gly Gly Pro Pro Gly Val Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ser Gly Pro

385 390 395 400

Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly Ser Pro

405 410 415

Gly Gly Pro Gly Ala Ala Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly

420 425 430

Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser

435 440 445

Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro

450 455 460

Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly

465 470 475 480

Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro

485 490 495

Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro

500 505 510

Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly

515 520 525

Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly Leu Ser Gly Glu Arg Gly Pro

530 535 540

Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly Glu Pro

545 550 555 560

Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly

565 570 575

Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Ala

580 585 590

Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala

595 600 605

Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly

610 615 620

Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro

625 630 635 640

Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys

645 650 655

Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly

660 665 670

Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro

675 680 685

Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Thr Ser

690 695 700

Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn Arg Gly

705 710 715 720

Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro Gly Pro

725 730 735

Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro

740 745

<210> 17

<211> 2238

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 重组III型胶原蛋白成熟肽特征氨基酸序列（7M片段）对应的核苷酸序列

<400> 17

gaggctggta ttccaggtgt cccaggtgct aagggtgaag atggtaaaga tggttctcca 60

ggagagcctg gtgctaacgg tttgccaggt gctgctggtg aaagaggtgc tcctggtttt 120

agaggtccag ctggtcctaa tggtattcct ggtgaaaagg gtccagctgg agagagaggt 180

gctccaggac cagctggtcc aagaggtgct gctggtgaac ctggtagaga tggtgttcca 240

ggtggtcctg gtatgcgtgg tatgccaggt tctcctggtg gtccaggttc tgatggtaaa 300

ccaggtccac ctggttctca aggagagtct ggtagaccag gtccacctgg accatctggt 360

ccaagaggtc aaccaggtgt tatgggtttc ccaggtccta agggtaacga tggtgctcca 420

ggtaaaaatg gtgaaagagg tggtcctggt ggtcctggtc ctcaaggtcc acctggtaaa 480

aacggagaga ctggtccaca aggtccacct ggacctactg gtccaggtgg agataaagga 540

gatacaggtc cacctggacc tcaaggtttg caaggtttgc ctggtactgg tggtccacct 600

ggagaaaatg gtaaaccagg agagccaggt cctaaaggag atgctggtgc tcctggtgct 660

ccaggtggta aaggagatgc cggtgctcca ggagagagag gtccacctgg tttggccggt 720

gctccaggac ttagaggtgg tgctggtcca cctggaccag agggtggtaa aggtgccgcc 780

ggtccacctg gtccacctgg ggctgctggt actcctggtt tgcagggtat gccaggtgaa 840

agaggtggtt tgggttctcc aggtcctaag ggagataaag gagagcctgg tggtccaggt 900

gctgatggtg ttcctggtaa agatggtcct agaggtccaa ctggtcctat cggtccacct 960

ggtcctgctg gtcaaccagg agataaaggt gaaggtggtg ctccaggttt gcctggtatt 1020

gctggtccta gaggttctcc aggtgaaaga ggtgagactg gtccacctgg tccagccggt 1080

tttccaggtg ctcctggtca aaacggtgaa ccaggtggta aaggagagag aggtgctcct 1140

ggtgaaaaag gagagggtgg tccacctggt gttgccggtc cacctggtgg ttctggacca 1200

gcaggtccac ctggaccaca aggtgttaag ggtgaaagag gttctccagg tggtcctggt 1260

gctgctggtt tccctggtgc tagaggtttg cccggtccac ctggttctaa cggtaaccca 1320

ggtccacctg gtccttctgg ttctcctggt aaagacggtc cacctggacc tgctggtaac 1380

actggtgctc caggttctcc tggtgtttct ggtccaaagg gagatgccgg tcaacctggt 1440

gaaaaaggtt ctccaggtgc tcaaggtcca cctggtgctc caggtccatt gggtattgct 1500

ggtattactg gtgctagagg tttggctggt ccacctggta tgccaggacc tagaggttct 1560

cctggtcctc agggagttaa gggtgaatct ggtaaaccag gtgctaatgg tttgtctgga 1620

gaaagaggtc cacctggtcc tcaaggtttg ccaggtttgg ctggtaccgc cggagagcct 1680

ggtagagatg gtaacccagg ttctgatggt ttgcctggta gagacggttc tccaggtggt 1740

aaaggagata gaggtgagaa tggttctcca ggtgctcctg gtgctccagg gcacccaggt 1800

ccacctggac ctgttggtcc tgctggtaaa tccggagata gaggtgaatc tggtccagct 1860

ggtcctgctg gtgctccagg tcctgctggt tctagaggtg ctccaggacc tcagggtcca 1920

agaggagata agggtgaaac tggagagaga ggtgctgctg gtattaaagg tcacagaggt 1980

tttccaggta acccaggtgc tccaggttct cctgggcctg ctggtcaaca aggtgctatt 2040

ggttctcctg gacctgctgg tcctagaggt ccagttggtc cttctggtcc acctggtaaa 2100

gatggtactt ctggtcatcc aggaccaatt ggtccacctg gtccaagagg taatagaggt 2160

gaaagaggtt ctgagggttc tccaggtcac ccaggacagc ctggtccacc tggtccacct 2220

ggtgctccag ggccttaa 2238

<210> 18

<211> 2235

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 重组III型胶原蛋白成熟肽特征氨基酸序列（7M片段）优化前的核苷酸序列

<400> 18

gaggctggta ttccaggtgt tccaggagct aaaggcgaag atggcaagga tggatcacct 60

ggagaacctg gtgcaaatgg gcttccagga gctgcaggag aaaggggtgc ccctgggttc 120

cgaggacctg ctggaccaaa tggcatccca ggagaaaagg gtcctgctgg agagcgtggt 180

gctccaggcc ctgcagggcc cagaggagct gctggagaac ctggcagaga tggcgtccct 240

ggaggtccag gaatgagggg catgcccgga agtccaggag gaccaggaag tgatgggaaa 300

ccagggcctc ccggaagtca aggagaaagt ggtcgaccag gtcctcctgg gccatctggt 360

ccccgaggtc agcctggtgt catgggcttc cccggtccta aaggaaatga tggtgctcct 420

ggtaagaatg gagaacgagg tggccctgga ggacctggcc ctcagggtcc tcctggaaag 480

aatggtgaaa ctggacctca gggaccccca gggcctactg ggcctggtgg tgacaaagga 540

gacacaggac cccctggtcc acaaggatta caaggcttgc ctggtacagg tggtcctcca 600

ggagaaaatg gaaaacctgg ggaaccaggt ccaaagggtg atgccggtgc acctggagct 660

ccaggaggca agggtgatgc tggtgcccct ggtgaacgtg gacctcctgg attggcaggg 720

gccccaggac ttagaggtgg agctggtccc cctggtcccg aaggaggaaa gggtgctgct 780

ggtcctcctg ggccacctgg tgctgctggt actcctggtc tgcaaggaat gcctggagaa 840

agaggaggtc ttggaagtcc tggtccaaag ggtgacaagg gtgaaccagg cggtccaggt 900

gctgatggtg tcccagggaa agatggccca aggggtccta ctggtcctat tggtcctcct 960

ggcccagctg gccagcctgg agataagggt gaaggtggtg cccccggact tccaggtata 1020

gctggacctc gtggtagccc tggtgagaga ggtgaaactg gccctccagg acctgctggt 1080

ttccctggtg ctcctggaca gaatggtgaa cctggtggta aaggagaaag aggggctccg 1140

ggtgagaaag gtgaaggagg ccctcctgga gttgcaggac cccctggagg ttctggacct 1200

gctggtcctc ctggtcccca aggtgtcaaa ggtgaacgtg gcagtcctgg tggacctggt 1260

gctgctggct tccctggtgc tcgtggtctt cctggtcctc ctggtagtaa tggtaaccca 1320

ggacccccag gtcccagcgg ttctccaggc aaggatgggc ccccaggtcc tgcgggtaac 1380

actggtgctc ctggcagccc tggagtgtct ggaccaaaag gtgatgctgg ccaaccagga 1440

gagaagggat cgcctggtgc ccagggccca ccaggagctc caggcccact tgggattgct 1500

gggatcactg gagcacgggg tcttgcagga ccaccaggca tgccaggtcc taggggaagc 1560

cctggccctc agggtgtcaa gggtgaaagt gggaaaccag gagctaacgg tctcagtgga 1620

gaacgtggtc cccctggacc ccagggtctt cctggtctgg ctggtacagc tggtgaacct 1680

ggaagagatg gaaaccctgg atcagatggt cttccaggcc gagatggatc tcctggtggc 1740

aagggtgatc gtggtgaaaa tggctctcct ggtgcccctg gcgctcctgg tcatccaggc 1800

ccacctggtc ctgtcggtcc agctggaaag agtggtgaca gaggagaaag tggccctgct 1860

ggccctgctg gtgctcccgg tcctgctggt tcccgaggtg ctcctggtcc tcaaggccca 1920

cgtggtgaca aaggtgaaac aggtgaacgt ggagctgctg gcatcaaagg acatcgagga 1980

ttccctggta atccaggtgc cccaggttct ccaggccctg ctggtcagca gggtgcaatc 2040

ggcagtccag gacctgcagg ccccagagga cctgttggac ccagtggacc tcctggcaaa 2100

gatggaacca gtggacatcc aggtcccatt ggaccaccag ggcctcgagg taacagaggt 2160

gaaagaggat ctgagggctc cccaggccac ccagggcaac caggccctcc tggacctcct 2220

ggtgcccctg gtcct 2235

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F-5C

<400> 19

ccgctcgaga aaagaggtca aaacggtgaa ccagg 35

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> R-345C

<400> 20

ataagaatgc ggccgctcat tacaag 26

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F-4C

<400> 21

ccgctcgaga aaagaggtcc tgctggtaaa tccgg 35

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F-3C

<400> 22

ccgctcgaga aaagagggcc ttgttgtggt gg 32

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F-6N

<400> 23

ccgctcgaga aaagacaacaagaagc tgttgagggt gg 38

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> R-6N

<400> 24

ataagaatgc ggccgcatta accaggcaaa ccttgc 36

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F-7M

<400> 25

ccgctcgaga aaagagaggc tggtattcca ggtg 34

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> R-7M

<400> 26

ataagaatgc ggccgcttaa ggccctggag c 31

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F-8M

<400> 27

ccgctcgaga aaagaggttt gcctggtcca cc 32

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> R-8M

<400> 28

ataagaatgc ggccgcttaa atagcagcag caccaac 37

Claims

1.一种编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因，其特征在于为如下B1)、B2)或B3)所示的基因：

A1)核苷酸序列是序列表中序列15或序列17的cDNA分子或DNA分子；

A3)在严格条件下与A1)限定的核苷酸序列杂交，且编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的cDNA分子或基因组DNA分子。

2.一种与重组人III型胶原蛋白成熟肽相关的生物材料，其特征在于为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)含有权利要求1所述的编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的表达盒；

B2)含有权利要求1所述的编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有权利要求1所述的编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有权利要求1所述的编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的转基因细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因细胞系。

3.一种重组载体，其特征在于是将脯氨酸羟化酶表达载体pPZAStA-P4HA2-P4HB2与上述编码重组人III型胶原蛋白成熟肽的基因的核苷酸序列连接得到；

(1)以pPICZaA为骨架，通过BglII和BamH I酶切位点引入毕赤酵母邻氨基苯甲酸合成酶基因，得到pPZSaA载体；

(2)以pPZSaA载体为骨架，通过串联表达方式在多克隆位点分别引入P4HA2和P4HB2基因，得到pPZAStA-P4HA2-P4HB2。

4.一种可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母，其特征在于是将权利要求3所述的重组载体转入酵母中得到。

5.根据权利要求4所述的可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母，其特征在于：

所述的酵母为毕赤酵母。

6.根据权利要求4或5所述的可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母，其特征在于为Pichia pastoris HQC-119，于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5栋，保藏编号为GDMCCNo.61338。

7.一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

将权利要求4～6任一项所述的可表达含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽的酵母诱导表达后，离心收集上清，上清通过硫酸铵分级沉淀和阳离子交换层析纯化，得到含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽。

8.一种含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽，其特征在于通过权利要求7所述的制备方法制备得到。

9.权利要求8所述的含羟脯氨酸修饰化的重组人III型胶原蛋白成熟肽在制备生物修复产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述的生物修复产品为冻干粉、生物海绵和敷料中的至少一种。