CN117924522A - 一种重组抗菌多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组抗菌多肽及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明通过空间结构模拟和Average RMSF计算得到的一种空间结构稳定，活性位点较好的暴露在外侧的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，以该氨基酸序列为基础单元，串联重复6次获得全长302个氨基酸，主体部分由6段完全相同的人乳铁蛋白肽组成，氨基端带有HIS标签，羧基端连接FLAG标签的重组抗菌多肽。本发明通过毕赤酵母表达系统，于胞外获得多肽。该多肽两端都设计有特异性亲和纯化标签，有利于全长多肽的检测和纯化，同时极大提高了抗菌活性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组抗菌多肽及其制备方法和应用。
背景技术
自青霉素发现以来，抗生素开始在全球广泛应用，人类逐渐进入控制和治疗微生物感染性疾病的时代。然而各种抗生素的滥用导致致病菌快速进化，造成耐药菌的大量出现，但是抗生素的研发却跟不上耐药菌进化速度。具有多种生物学功能的抗菌肽被发现具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生抗药性、作用机理独特，热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用，在蛋白质分子四级结构和物理化学性质方面显示出多样性等多重优势。
来源于人乳铁蛋白的抗菌肽称为乳铁蛋白肽H（lactoferricin human,Lfcin-H），是由乳铁蛋白N端48个氨基酸组成的一条连续肽链。具有抗菌、抗炎、抗氧化美白等功效，可广泛应用于医学、美容、化妆品、保健品等领域中。
乳铁蛋白肽作为乳铁蛋白水解得到的产物产量低、工艺复杂、成本昂贵、人工合成乳铁蛋白肽及其衍生物费用更高，无法大规模生产，成为制约其广泛应用的重要制约因素。目前利用工程菌株产乳铁蛋白肽有较多报道，乳铁蛋白肽抗菌活性和抗病毒能力较乳铁蛋白弱，为了充分开发其潜在价值，亟需提高其抗菌活性和抗病毒能力。乳铁蛋白肽因其抗菌能力，对工程菌有杀伤作用。在表达的同时会大量杀伤宿主细胞，宿主蛋白大量释放，导致提纯困难，限制了其广泛应用。此外，由于杂蛋白较多，跑蛋白胶鉴定困难，而利用生物质谱技术研究乳铁蛋白肽的类型和含量，该方法只能检测其是乳铁蛋白肽，但不能确认其是否为全长片段，因此对于长片段肽链的全长性检测困难，进一步限制了其应用。
发明内容
基于上述技术问题，本发明旨在提供一种重组抗菌多肽及其制备方法和应用。为此本发明先通过空间结构模拟和Average RMSF计算得到的一种空间结构稳定，活性位点较好的暴露在外侧的一种新的抗菌多肽，该重组抗菌多肽其抗菌性高于人乳铁蛋白肽；同时连接有亲和标签易于检测鉴定和提纯。
本发明提供了一种重组抗菌多肽，全长302个氨基酸，由6段完全相同的人乳铁蛋白肽串联而成，单个乳铁蛋白肽氨基酸序列如其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
GRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQA。
进一步的，所述串联重复次数为大于或等于1的正整数，优选的，所述串联重复次数1-6次；更优选的，所述串联重复次数为6次，重复串联序列氨基端连接6His标签，羧基端为FLAG标签。其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：
HHHHHHGRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAGRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAGRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAGRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAGRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAGRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQADYKDDDDK
本发明还提供了一种经过人为优化设计的表达所述重组多肽的基因序列。所述基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：
CATCACCATCATCACCACGGCCGACGACGGAGCGTGCAGTGGTGCGCCGTAAGTCAGCCGGAAGCTACGAAATGCTTCCAGTGGCAACGTAATATGCGAAAAGTGCGAGGACCCCCCGTTTCATGTATAAAGCGCGATTCACCTATTCAATGCATACAAGCTGGTCGAAGACGTAGCGTTCAATGGTGTGCGGTCTCCCAACCAGAGGCCACTAAATGCTTCCAATGGCAGCGGAACATGCGTAAGGTCCGCGGGCCTCCGGTTTCGTGTATAAAACGTGACTCGCCAATTCAATGTATTCAGGCGGGAAGGCGGCGCAGTGTTCAGTGGTGCGCAGTTTCCCAGCCGGAAGCAACAAAGTGCTTTCAGTGGCAAAGAAACATGAGGAAGGTCCGCGGCCCGCCAGTAAGCTGTATCAAGAGGGACTCGCCAATTCAGTGCATCCAAGCAGGTAGGCGGAGATCGGTACAGTGGTGTGCAGTCTCTCAACCTGAGGCTACTAAGTGTTTCCAGTGGCAACGTAACATGCGAAAGGTACGTGGGCCACCCGTGAGTTGCATCAAGCGCGATAGTCCCATCCAGTGTATTCAGGCGGGTCGGAGGCGCAGCGTTCAATGGTGTGCCGTGTCTCAGCCGGAGGCAACCAAATGTTTTCAGTGGCAACGGAATATGCGGAAAGTCAGAGGCCCTCCCGTGTCTTGTATTAAGAGGGACTCACCTATACAGTGCATCCAAGCTGGACGTAGAAGATCCGTACAATGGTGTGCCGTGTCCCAGCCGGAAGCCACGAAATGCTTTCAATGGCAACGCAATATGCGAAAAGTCAGGGGGCCTCCAGTATCTTGCATAAAAAGAGATTCACCCATACAGTGCATCCAAGCGGACTACAAGGATGACGATGACAAA。
本发明还提供了一种包含上述多核酸的重组载体，所述载体包括pPIC9K。
本发明还提供了一种包含上述的重组载体、或表达所述重组多肽的重组工程菌。
进一步的，所述重组工程菌的宿主菌优选毕赤酵母。
根据本发明的实施例，所述重组工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC NO.29184；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日；分类命名为：巴斯德毕赤酵母 Komagataella phaffii。
本发明还提供了一种生产上述的重组多肽的重组工程菌方法，所述方法包括以下步骤：
（1）设计重组多肽序列，优化编码DNA序列；
进一步的，所述重组多肽全长302个氨基酸，由6段完全相同的人乳铁蛋白肽串联而成，氨基端连接6His标签，羧基端为FLAG标签。
进一步的，所述串联重复次数为大于或等于1的正整数，优选的，所述串联重复次数1-6次；更优选的，所述串联重复次数为6次，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
进一步的，所述重组多肽经优化后的编码DNA序列如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
（2）重组表达载体构建：
将步骤（1）中所述的DNA序列克隆于表达载体pPIC9K上，得到重组表达载体。
（3）将制备得到重组表达载体线性化后导入至毕赤酵母中，经筛选获得阳性克隆，得到重组的毕赤酵母菌种。
进一步的，构建的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种样本送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：CGMCC NO.29184；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日。分类命名为：巴斯德毕赤酵母 Komagataella phaffii。
本发明还提供了一种生产上述的重组多肽冻干海绵的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）用5L罐高密度培养上述重组毕赤酵母菌种，诱导表达重组多肽；
（2）对步骤（1）所获得的发酵液进行固液分离，然后使用6His标签层析填料进行亲和层析，再使用FLAG标签层析填料进行亲和层析。经两步层析获得含有高纯度重组多肽的层析洗脱液。两个层析步骤可调换顺序。
优选地，所述步骤(2)中分离纯化为先采用6His标签的层析填料吸附重组多肽，再用FLAG标签的层析填料吸附重组多肽。
（3）对含有高纯度重组多肽的层析洗脱液进行超滤使得超滤浓缩液电导率＜1000us/ms；
（4）对超滤浓缩液进行冻干，最终获得重组多肽冻干海绵。
本发明还提供一种高纯度重组多肽在化妆品或保健品中的用途。
具体地，所述重组多肽应用于护肤品，所述护肤品各组分的质量分数为：根据上述所述的重组多肽0.1％-0.5％；保湿剂1％-10％；透明质酸钠0.1％-0.5％；氯化钠0.9％；其余为纯化水。
当所述重组多肽应用于保健品时，所述保健品各组分的质量分数为：重组多肽1%~10%；胶原蛋白1%~10%；透明质酸钠0.1%~0.5%；柠檬酸0.1%~10%；甘油0.1%~10%；其余为纯水。
本发明的有益效果：（1）本发明先通过空间结构模拟和Average RMSF计算得到的一种空间结构稳定，活性位点较好的暴露在外侧的重组多肽，该重组多肽是由人乳铁蛋白肽重复串联6次构成，拥有更优的生物学活性，极大提高了抗菌活性；
（2）本发明的重组多肽在其两端携带有双特异性标签，可通过亲和纯化获得高纯度全长多肽，亦可以通过夹心法ELISA检验鉴定其在产品中的状态和含量；
（3）本发明的重组多肽携带有N端的6His标签和C端的FLAG标签，利用其双特异性亲和纯化标签，纯化步骤简单，产物纯度高；
（4）相较于利用大肠杆菌为宿主细胞，本发明利用毕赤酵母为工程菌株，重组多肽无内毒素隐患。
附图说明
图1为重组多肽空间结构和分子动力学模拟图。
图2为MD模拟结果。
图3为诱导80h后胞外表达重组多肽上清液经WB检测结果，左图为HIS标签抗体WB结果，右图为FLAG标签抗体WB结果。
图4为冻干重组多肽在PAGE胶中的电泳检测结果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规分子生物学实验方法完成，实施例中所涉及密码子优化、PCR、酶切、连接等过程都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。
实施例1
氨基酸序列设计，基因序列的优化与合成
通过对多组乳铁蛋白肽通过生物计算进行结构模拟和分子动力学模拟，筛选出一种多肽。以人乳铁蛋白肽(Lfcin-H)为基础，由6段完全相同的Lfcin-H单体串联而成，氨基端连接6His标签，羧基端为FLAG标签。其空间结构和分子动力学模拟如图1所示，从图中可以看出在整个动力学过程中大部分结构变化不大，主要的波动来自于1-100号残基，可以看到结束构象相对于初始构象两个α-螺旋区域明显靠近，且β折叠转变成了无规则卷曲，分析结束构象可知产生了新的相互作用，且最后能够稳定的存在。同时，6段重复序列的活性位点均很好的裸露在外，而非包在空间结构内。
MD模拟结果如图2所示，RMSD的平均值为3.57 Å，可以看到在120ns后动力学模拟趋于稳定，稳定后的RMSD值约为2.8Å。进一步说明设计的多肽空间结构较为稳定。
人乳铁蛋白肽(Lfcin-H)的氨基酸序列参考Uniprot数据库P02788(https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02788/entry)序列中第20–67部分(PRO_0000422770)，为重组人乳铁蛋白肽单体，是目前研究最多的乳铁蛋白肽，序列如SEQ ID NO：1所示；
需表达的多肽的全长为302个氨基酸，由6段完全相同的Lfcin-H单体串联而成，氨基端连接6His标签，羧基端为FLAG标签，理论分子量为35.25KDa。该重组多肽氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
以氨基酸序列SEQ ID NO：2为基础，针对毕赤酵母密码子偏好性、DNA序列的GC含量、mRNA二级结构、CpG岛、重复序列、PolyA位点、RNA不稳定区域等多种参数进行优化。人为设计优化后密码子适应指数(CodonAdaptation Index)从0.58提高至0.60，GC含量降低至53.53％，去除限制性内切酶Not I酶切位点。优化后的基因序列见SEQ ID NO.3；
（2）优化后的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成，并构建于表达载体pPIC9K(赛默飞世尔科技（中国）有限公司)之上，克隆位置为α-factor secretionsignal/ cleavage site 1203（查找序列为AAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGA）与Not I酶切位点之间。将构建好的质粒热激转化进入感受态大肠杆菌DH5α（购自Invitrogen公司），在含有Amp的LB抗性平板筛选阳性克隆，利用通用引物5’AOX1、3’AOX1进行菌落PCR验证，有大小为1369bp的片段的为阳性克隆。以质粒提取试剂盒（购自生工生物工程（上海）股份有限公司）抽提质粒，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。将提取的质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，验证正确，得到构建的重组表达载体质粒。
（3）将上述得到的重组表达载体质粒用限制性内切酶SacI(购自大连Takara公司)37°C酶切消化，使其线性化，反应体系如下:
SacI 1μl
10xL Buffer 2μl
重组表达载体质粒 1μg
ddH2O up to 20μl
然后跑1％琼脂糖凝胶电泳，检测重组表达载体质粒是否完全切开，待完全切开后，再使用PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程（上海)股份有限公司）回收线性化质粒。
挑取酵母SMD1168单菌落，接种至含有10mL的YPD液体培养基的100ml三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养过夜，至OD600值长到1~2间；将培养液1500×g，4℃离心5min，用10ml冰预冷的1M山梨醇重悬菌体，重复2次；用60μl冰预冷的ddH2O重悬菌体，得到体积约为100μl的毕赤酵母SMD1168感受态细胞。
将0.2cm的电转杯置于冰上预冷10min；取线性化的质粒10μL加入新鲜制备的毕赤酵母SMD1168感受态细胞中，轻轻吸打混匀，转至0.2cm冰预冷的电转杯中，继续于冰上预冷5min；电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，时长5～10mSec，电击两次；电击结束，迅速加入1ml冰预冷的1M的山梨醇溶液，轻轻吹打混匀，并转至1.5mL离心管中；取200μL转化产物涂布到MD平板上，于30℃培养箱中倒置培养2-3天，直至有较大单菌落出现。
取2ml无菌ddH2O加入到长有单菌落的MD平板上，轻轻挂下菌落，并转移到无菌离心管中。用无菌ddH2O稀释菌悬液，测定OD600值，计算以105个细胞涂布于含有0.5mg/mLG418的YPD平板上，于30℃培养箱中倒置培养2～3天后至单菌落出现。
从0.5mg/mL G418的YPD平板上挑单菌落至装有200μL YPD培养基的96孔板中，混匀后于30℃培养箱中静置培养48h；吸打混匀每孔菌液，取10μL转接至另一块装有200μLYPD培养基的96孔板中，于30℃培养24h后再重复一次此操作，使得孔板中菌体密度保持相对一致，从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有2.0mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上，置于30℃培养箱中培养2~5天。若一个菌落能同时在2.0mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上生长，说明该菌落含有多拷贝的目的基因，即有多个重组片段进入了酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选可得到的高拷贝、可高效表达重组多肽的酵母工程菌种。
构建的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种样本送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：CGMCC NO.29184；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日。分类命名为：巴斯德毕赤酵母 Komagataella phaffii。
实施例2
（1）5L罐高密度发酵
YPD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L；
BSM基础培养基：85% H3PO4，26.7ml/L CaSO4 ·2H2O 0.93g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40g/L，PMT1 4.0ml/L （PTM1：Invitrogen公司提供的标准配方，用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存。）；
补料培养基：50%W/V甘油，每升加12mL PTM1微量元素；
诱导培养基：100%甲醇，每升加入12mL PTM1微量元素。
可高效表达重组多肽的酵母工程菌种接入含200ml种子培养基YPD的1L摇瓶，220rpm、30℃，培养18-20h，至OD600=2~10。5L发酵罐（保兴生物）装3L的BSM基础培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4 L/min，温度30℃，用浓氨水配制好的碱液调pH，设置pH为6.0。将制备好的200ml种子液接入罐内（火焰圈接种），然后点击溶氧电极校百，校百后开始发酵。待生长溶氧第一次掉至30%，采用溶氧串级转速功能，保持20%；等待甘油耗完，溶氧反弹、溶氧大于60%（此时OD600值约40），取消溶氧串级转速，调高搅拌650rpm，流加补料培养基，速度为40ml/h，待流加200ml的补料培养基后停止补甘油，溶氧反弹至70%以上后，流加诱导培养基进行诱导，补料速度为7ml/h恒速补料。诱导80h，菌浓增长幅度不明显即放罐。
固液分离，提纯精制
发酵培养结束后，4℃下5000rpm离心30min，收集上清。上清液分别用HIS标签抗体和FLAG标签抗体（购自南京金斯瑞生物科技有限公司），利用蛋白印迹 （WB）检测，结果如图3所示。
如图3所示：两张图为同一样品经不同二抗孵育得到的WB结果，左图为HIS标签抗体WB结果，右图为FLAG标签抗体WB结果。图中可见，在分子量35KDa位置上均出现了显影，符合预期。重组多肽正确表达在胞外上清液中。
HIS标签亲和纯化：
平衡缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，用NaOH 调pH 为8.0；
洗涤缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，用NaOH 调pH 为8.0；
洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，用NaOH 调pH 为8.0；
以平衡缓冲液平衡Ni-NTA Agarose Resin色谱柱（购自Yeasen公司）5个柱体积；将上清液上柱，流速为10倍柱体积/小时。用10倍柱体积的洗涤缓冲液冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。
FLAG标签亲和纯化：
平衡缓冲液：10mM Na3PO4，150mM NaCl；
洗涤缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，3g Tris加纯水至800ml，用盐酸调pH至7.4，定容至1L；
洗脱缓冲液：0.1M 甘氨酸，用盐酸调pH至3.5。
以平衡缓冲液平衡Anti-Flag亲和纯化凝胶色谱柱（购自苏州纳微）5个柱体积；取上述洗脱液透析除盐后上柱；用15倍柱体积的洗涤缓冲液清洗，以去除非特异结合的蛋白；用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。
对含有高纯度重组多肽的层析洗脱液进行超滤使得超滤浓缩液电导率＜1000us/ms。所制得的浓缩液经真空冷冻干燥制得重组多肽。对冻干重组多肽进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示。
如图4所示：冻干重组多肽在PAGE胶中的电泳结果（为南京金斯瑞Bis-tris12%预制胶）。在分子量35KDa处出现单一条带，无明显杂带。经两步亲和纯化可得到纯度较高的重组多肽。
实施例3
重组多肽抗菌活性检测
重组多肽活性检测：将重组多肽冻干海绵和重组人乳铁蛋白肽单体冻干品（样品由江苏创健医疗科技股份有限公司提供）按2mg/ml稀释成水溶液，按QB/T 2738-2012 《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》进行抑菌率检测试验（挪亚检测技术有限公司）。结果如表1所示。
表1. 重组多肽冻干海绵和重组人乳铁蛋白肽单体冻干品抑菌率检测
从表1可以得出2mg/mL重组人乳铁蛋白肽单体冻干品对白色念珠菌和鼠伤寒沙门氏菌的平均抑菌率为31.81%和52.00%，而2mg/mL重组多肽冻干海绵对白色念珠菌和鼠伤寒沙门氏菌的平均抑菌率高达89.89%和89.99%，此种多肽设计方法极大提高了抗菌活性。
重组多肽细胞毒性检测
将冻干重组多肽按1mg/ml稀释成水溶液，做细胞毒性试验。按照 GB/T 16886.5-2017 的方法要求，使用体外培养哺乳动物 L-929 细胞，测试重组多肽的潜在细胞毒性作用。
全程在超净台内操作，保证无菌操作过程。L-929细胞在 MEM 培养基（含 10%FBS、1%青链霉素）中于 37℃、5% CO2条件下培养，将生长至对数生长期的细胞用0.25%的胰蛋白酶（含 EDTA）消化，消化后将细胞悬浮液离心（1000 rpm，5 分钟），弃去上清，用 MEM培养基重悬细胞，计数得到 1×10 5个/ml 细胞悬液。将细胞悬液以每孔100μl接种于96孔板中，并在细胞培养箱（37℃，5% CO2，>90%湿度)中培养，镜下观察细胞形态。待孵育 24 小时后，细胞贴壁生长至70%左右，弃去96孔板内原培养基，在96孔板相应孔内各加入100μl浸提液（终浓度为100%，75%，50%和25%），空白对照样品，阴性对照样品和阳性对照样品。将 96孔板置于细胞培养箱（37 ℃，5% CO2，>90%湿度)中培养 24小时，每组设置六个复孔。培养24小时后取出96孔板，在显微镜下观察细胞形态，然后去除液体，每孔加入50μlMTT（终浓度为1mg/ml），置37℃，5% CO2培养箱中培养。2小时后去除上清，每孔加入100μl异丙醇溶解结晶，在酶标仪上测定570nm波长下的吸光度值，计算其细胞毒性。若细胞活力＜空白组的70%，说明样品具有潜在的细胞毒性。结果如表2所示。
表2. MTT结果
结果显示，空白对照组和阴性对照组（高密度聚乙烯）中细胞在整个试验过程中形态完好正常，没有显示细胞毒性反应。阳性对照组（ZDEC）中显示严重的细胞毒性反应。测试样品 100%浓度浸提液在孵育细胞 24 小时后细胞形态基本完好，细胞活力值为 83.6%。各组数据均符合验收标准，且细胞活力均在70%以上，本次试验结果有效。在1mg/ml浓度下重组多肽对 L-929 细胞没有潜在的细胞毒性。
实施例4
重组多肽在化妆品中应用，所述重组多肽应用于护肤品，所述护肤品各组分的质量分数为：重组多肽0.1％；保湿剂2％；透明质酸钠0.5％；氯化钠0.9％；其余为纯化水。
实施例5
重组多肽在保健品中应用，所述保健品各组分的质量分数为：重组多肽5%；胶原蛋白1%；透明质酸钠0.5%；柠檬酸1%；甘油0.5%；其余为纯水。
Claims (10)
1.重组抗菌多肽，其特征在于，所述重组抗菌多肽以如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的人乳铁蛋白肽为基础单元串联重复而成，所述串联重复次数为6次。
2.根据权利要求1所述的重组抗菌多肽，其特征在于，所述重组抗菌多肽的氨基端连接6His标签，羧基端连接FLAG标签，所述重组抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的重组抗菌多肽。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
5.重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求3或4所述的多核苷酸序列。
6.重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包含权利要求3或4所述的多核苷酸序列，或权利要求5所述的重组载体。
7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌的宿主细胞为毕赤酵母菌；所述重组工程菌是将权利要求5所述的重组载体线性化后导入至毕赤酵母中，经筛选获得阳性克隆即为重组的表达重组抗菌多肽的毕赤酵母工程菌种。
8.根据权利要求7所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC NO.29184；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日；分类命名为： Komagataellaphaffii。
9.一种重组抗菌多肽冻干海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）高密度发酵培养权利要求8所述的重组工程菌，添加甲醇诱导表达重组多肽，得发酵液；
（2）对步骤（1）所获得的发酵液进行固液分离，使用6His标签层析填料进行亲和层析，再使用FLAG标签层析填料进行亲和层析；获得含有高纯度重组多肽的层析洗脱液；
（3）对含有高纯度重组多肽的层析洗脱液进行超滤使得超滤浓缩液电导率＜1000uS/ms；
（4）对超滤浓缩液进行冻干，获得重组抗菌多肽冻干海绵。
10.一种如权利要求1所述的重组抗菌多肽或权利要求9所述方法制备的重组抗菌多肽冻干海绵在化妆品或保健品中的应用。
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