CN111116757A - 带有半乳糖结合凝集素ew29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

带有半乳糖结合凝集素ew29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法 Download PDF

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张爽
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Abstract

本发明公开了带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。本发明将铁蛋白与EW29标签、TEV蛋白酶切位点相连，得到EW29标签/TEV蛋白酶识别位点/铁蛋白重组序列，诱导、亲和纯化后即得融合蛋白。电镜结果显示，该融合蛋白形成了20～25 nm的蛋白笼纳米颗粒。本发明构建的EW29/铁蛋白载体，可以作为一种新型的促溶、纯化、包封平台，可将不同的目的蛋白串联到铁蛋白中，从而提高目的蛋白的可溶性和敏感性。

Description

带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼 纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
通过DNA重组技术，融合蛋白已经很容易在原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（酵母和哺乳动物细胞）进行高效表达，其产物在生物和医学上得到了广泛应用，也促进了其快速发展。与真核表达系统相比，大肠杆菌由于易操作、廉价和产量高等优点，仍然是目前生产重组蛋白的主要宿主。但是，当大肠杆菌细菌系统表达重组蛋白时，有许多本身难以克服的缺点：1、重组蛋白往往以无活性的包涵体形式出现；2、缺乏真核细胞翻译后修饰（糖基化、磷酸化和乙酰化等）机制，得到的重组蛋白虽然在一级氨基酸序列正确，但在高级结构和构象上与天然蛋白相差较大，无活性或活性极差；3、宿主细胞（大肠杆菌）自身蛋白成为热原，难以除去，存在安全性，这些问题限制了原核表达的重组蛋白在实际中的进一步应用。鉴于此，选择更有效的亲和促溶性标签以期获得纯度高、可溶性好，活性强的重组蛋白至关重要。
来自蚯蚓（Lumbricus terrestris）半乳糖结合凝集素EW29 C-末端的半乳糖结合结构域，其分子量为14.5kDa，可以和亲和层析的常用介质琼脂糖的半乳糖残基可逆结合，是一个高效的亲和标签。同时，EW29蛋白本身有很好的可溶性，和其它外源蛋白融合表达时，可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性（Yabe R, Suzuki R, Kuno A, Fujimoto Z,Jigami Y and Hirabayashi J (2007) Tailoring a novel sialic acidbinding lectinfrom a ricin-B chain-like galactosebinding protein by natural evolution-mimicry. J Biochem 141, 389–399.）。原核表达系统因其操作简单，价格低廉，在基因工程、蛋白工程等领域的研发和应用越来越受到重视。对于亲和标签，常选择6×His，但是常规His亲和标签纯化过程中引入咪唑分子，含有毒性作用，蛋白脱盐后仍可能有咪唑残留影响，对动物机体造成损伤；通常为了增加目的蛋白的可溶性，还需要另外串联促溶标签。
铁蛋白(Ferritin)几乎存在于藻类、细菌、高等植物和动物等所有生物体，是生物体生命所必需的。蛋白壳是由24个亚基以高度对称性方式组成的内空心结构，空心直径约为8nm，外直径约为12nm。研究发现铁蛋白在体外可以自组装，形成套袖样的蛋白笼纳米颗粒；同时，铁蛋白纳米笼可以将外源小分子蛋白装入其纳米笼内，从而有效降低小分子抗原的降解，提高抗原的有效浓度，还可以有效协助靶细胞对相应抗原的摄取、加工，显著增强抗原蛋白的抗原稳定性和免疫原性。因此，铁蛋白独特的结构及理化性质使其可以作为一种新型的抗原递呈纳米运送平台。
发明内容
本发明利用半乳糖结合凝集素EW29作为亲和促溶标签，高效可溶性表达和纯化带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，该融合蛋白经过自组装可形成蛋白笼纳米颗粒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，包括EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段，所述TEV蛋白酶识别位点位于EW29标签的C端，所述铁蛋白片段位于TEV蛋白酶识别位点的C端，EW29标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；该带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封的蛋白笼纳米颗粒。
优选的，所述TEV蛋白酶识别位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，表达所述EW29标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，表达所述TEV蛋白酶识别位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，表达所述铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明第二方面提供带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒。
本发明第三方面提供上述融合蛋白笼纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段的核苷酸序列串联，形成EW29标签/TEV蛋白酶识别位点/铁蛋白重组序列；
步骤2：将重组序列连接至pET21b中，构建重组载体；
步骤3：将重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，经过诱导表达和亲和层析纯化，得到目的蛋白带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白；纯化的目的蛋白进行自组装形成蛋白笼纳米颗粒。
本发明第四方面提供一种重组载体，所述的重组载体包含有如上述任一项所述的核苷酸序列。
本发明第五方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有上述的重组载体。
本发明第六方面，提供上述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、上述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒、上述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法在制备疫苗、抗原、蛋白分子等生物工程领域中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明将EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段连接，得到了完全可溶性表达的铁蛋白；同时，琼脂糖可逆结合的EW29蛋白的引入，为后期蛋白纯化提供便利，具体表现在EW29蛋白可以和琼脂糖可逆结合，为亲和层析纯化目的蛋白奠定了基础，规避了常规His亲和标签纯化过程中咪唑溶液含有毒性作用的影响。本发明在含有5mM乳糖的缓冲液条件下通过洗脱得到了目的蛋白。铁蛋白在表达时可以自组装成颗粒均一、20nm左右的铁蛋白纳米笼颗粒。
2、本发明表达的可溶性的EW29/AfFtn纳米颗粒，为半乳糖结合凝集素EW29作为亲和促溶标签和铁蛋白包裹其他目的蛋白的研发奠定基础。
附图说明
图1 为本发明重组载体构建示意图。
图2为本发明重组蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达SDS-PAGE分析图。M.Marker；1、8、18.诱导前全菌；2.pH6.0破碎后总蛋白；3.pH6.0破碎后上清；
4.pH6.0破碎后沉淀；5.pH7.0破碎后总蛋白；6.pH7.0破碎后上清；7.pH7.0破碎后沉淀；9.pH8.0破碎后总蛋白；10.pH8.0破碎后上清；11.pH8.0破碎后沉淀；12.pH9.0破碎后总蛋白；13.pH9.0破碎后上清；14.pH9.0破碎后沉淀；15.pH10.0破碎后总蛋白；16.pH10.0破碎后上清；17.pH10.0破碎后沉淀；19.pH11.0破碎后总蛋白；20.pH11.0破碎后上清；21.pH11.0破碎后沉淀；22.pH12.0破碎后总蛋白；23.pH12.0破碎后上清；24.pH12.0破碎后沉淀；25.pH13.0破碎后总蛋白；26.pH13.0破碎后上清；27.pH13.0破碎后沉淀。
图3为本发明重组蛋白纯化SDS-PAGE分析图。A. M.Marker；1.诱导前全菌；2.诱导后全菌；3.破碎后上清；4.破碎后沉淀；5.滤液；6.洗杂5 mM乳糖；7.洗杂10 mM乳糖；8.洗杂20 mM乳糖；9.洗杂50 mM乳糖；10.洗杂100 mM乳糖；11.洗杂200 mM乳糖。
图4为本发明透射电子显微镜观察EW29/AfFtn纳米颗粒物理表征图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
实施例1
1、材料和方法
重组质粒pET21b-EW29-AfFtn由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；PrestainedProtein MarkerⅠ购自上海鼎国生物技术有限公司。
如图1所示，重组质粒pET21b-EW29-AfFtn中，重组序列EW29/TEV酶识别位点/AfFtn位于质粒pET21b的T7启动子下游的Nde
Figure 210964DEST_PATH_IMAGE001
酶和Xho
Figure 596946DEST_PATH_IMAGE001
酶切位点之间，是由EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段的核苷酸序列串联形成。其中EW29标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，TEV蛋白酶识别位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，该铁蛋白（AfFtn）基因片段是从古生球菌(Archaeoglobusfulgidus）中分离得到。
上述EW29标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；TEV蛋白酶识别位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
1.1、重组蛋白的诱导表达及不同pH值条件的可溶性鉴定
将重组质粒pET21b-EW29-AfFtn转化至E.coliBL21 (DE3)感受态细胞。在含氨苄青霉素100 mg/L的LB固态培养基上挑取含重组质粒的单个菌落，接种于含100 mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜。将得到的菌液按体积比1:100接种于含100mg/L氨苄青霉素的100 ml LB液体培养基中，37 ℃、220r/min振荡培养至对数中期(OD600达0. 6～0.8)进行诱导表达，SDS-PAGE检测蛋白的表达。
本实施例对不同浓度梯度的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactisid -e，IPTG) (0.5、1.0 mmol/L)，诱导时间（4h、6h）和诱导温度（37℃和25℃）进行优化组合，最终选定诱导剂IPTG诱导终浓度为0.5 mmol/L，25 ℃、140 r/min 诱导表达6 h为最佳诱导表达条件。
蛋白质的诱导表达纯化有3个重要因素：温度、诱导时间及诱导剂浓度，温度太高易形成包涵体，IPTG本身对细菌有毒性，所以浓度不宜太高。设置了37℃和25℃两个不同的诱导温度，通过分析发现，诱导温度25℃比37℃更能提高EW29/ TEV酶识别位点/AfFtn的可溶性和表达水平，原因与大肠杆菌自身合成的热休克蛋白有关，低温条件下，其他蛋白对ATP的消耗减少，以便于更多的ATP被热休克蛋白利用，热休克蛋白可以促进蛋白正确折叠，降解错误折叠的蛋白。另外，诱导剂的浓度对重组蛋白的表达没有显著差异，鉴于IPTG本身具有一定的毒性，不易被细菌代谢且易污染表达的目的蛋白，所以本实施例选用终浓度为0.5 mmol/L IPTG进行诱导。
次日诱导结束后，吸取1 ml菌液，离心去上清，加PBS重悬，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水煮10 min。剩余的菌液离心收集沉淀，分别用10 ml不同pH为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的PBS重悬菌体，加溶菌酶(1 g/L) 冰浴30 min后，低温超声波破碎菌体(超声时间5 s，间歇10s，120次)。分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，检测重组蛋白的表达。
SDS-PAGE检测结果显示，诱导后的全菌和上清样品在35.42kDa处有与预期大小一致的蛋白条带，如图2A～2C所示。重组蛋白在pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0均有很高的表达量，但在pH8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0有可溶性表达，在pH9.0呈现完全可溶性表达。
普通外源基因转入大肠杆菌后一般为包涵体表达，包涵体对于蛋白的进一步应用是不利的。EW29蛋白本身有很好的可溶性，和其它外源蛋白融合表达时，可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性。为了探索不同pH条件下融合蛋白的可溶性，通过筛选，成功得到了高可溶性的EW29/AfFtn纳米颗粒重组蛋白。通过对比发现：pH8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0均有可溶性表达，选择pH9.0条件进行蛋白纯化及电镜检测。
1.2、重组蛋白亲和纯化
以IPTG诱导终浓度为0.5 mmol/L，25 ℃、140 r/min 诱导筛选的菌株进行诱导表达，诱导6 h后收集菌体，在pH为9.0条件下低温进行超声破碎。
破碎后低温离心30min，取100 μL上清制备SDS-PAGE电泳样品。剩余的上清液加到预处理好的琼脂糖介质中，4℃ 200r/min结合3 h，将上清-琼脂糖介质混合物用5倍体积的Tris-HCl（pH=9.0）洗3次，洗去非特异性杂带，然后用含有不同浓度的乳糖（5mM、10mM、20mM、50mM、100mM和200mM）Tris-HCl洗脱靶蛋白，收集不同浓度的洗脱液。吸取100 μL每个浓度的洗脱液，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水煮10 min，-20℃保存。得到的蛋白通过透析去除乳糖，浓缩后用BCA蛋白定量测定试剂盒测重组蛋白的浓度。
EW29蛋白C-末端的半乳糖结合结构域，可以和亲和层析介质琼脂糖的半乳糖残基可逆结合，在一定浓度的乳糖下，可以洗脱含EW29的目的蛋白。分别用含5，10，20，50，100，200mmol/L乳糖的缓冲液梯度洗脱，收集各自洗脱液，用SDS-PAGE电泳检测纯化效果，如图3所示。结果显示，在含5 mmol/L乳糖的缓冲液条件下洗脱，目的蛋白可以高纯度被洗脱出来。
1.3、电镜检测铁蛋白纳米笼颗粒的形成
纯化的融合蛋白，在pH值为9.0条件透射电镜观察铁蛋白纳米笼形成情况：取10µL浓缩后的纯化蛋白滴到铜网上，静置10min，用滤纸从铜网的一边吸取液体；然后再滴加10µL 1%磷钨酸染色液，静置2min，再用滤纸从铜网的一边吸取染色液；用镊子夹取铜网放入玻璃平皿中，让铜网上的液体自然晾干；将制备好的铜网固定在样品握持杆的样品台上，插入到样品室内，抽真空后，在观察窗找到合适的视野，进行观察和分析纯化的融合蛋白是否形成纳米颗粒。
如图4所示，重组蛋白形成了20 nm左右的蛋白笼纳米颗粒。
本实施例构建的EW29/ TEV酶识别位点/AfFtn原核表达载体可使重组蛋白在E.coli中大量且廉价表达，便于分离纯化，避免了对包涵体变性复性处理，为纯化保持EW29/ TEV酶识别位点/AfFtn活性提供保证。EW29蛋白可以和琼脂糖可逆结合，为亲和层析纯化目的蛋白奠定了基础，在含有5mM乳糖的缓冲液条件下通过洗脱得到了高纯度的目的蛋白。透射电镜检测显示，目的蛋白形成了颗粒均一、20nm左右的铁蛋白纳米颗粒。
本实施例构建的EW29/ TEV酶识别位点/ AfFtn载体，可以作为一种新型的促溶、纯化、包封平台，可将不同的目的蛋白串联到铁蛋白（AfFtn）中，从而提高目的蛋白的可溶性和敏感性。
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南农业大学
<120> 带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制
备方法
<130> 无
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 138
<212> PRT
<213> Lumbricus terrestris
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Asn Gly Lys Val Leu Asp Ile Glu Gly Gln Asn Pro Ala Pro Gly Ser
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Lys Ile Ile Thr Trp Asp Gln Lys Lys Gly Pro Thr Ala Val Asn Gln
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Leu Trp Tyr Thr Asp Gln Gln Gly Val Ile Arg Ser Lys Leu Asn Asp
50 55 60
Phe Ala Ile Asp Ala Ser His Glu Gln Ile Glu Thr Gln Pro Phe Asp
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Pro Asn Asn Pro Lys Arg Ala Trp Ile Val Ser Gly Asn Thr Ile Ala
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Gln Leu Ser Asp Arg Asp Ile Val Leu Asp Ile Ile Lys Ser Asp Lys
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Gln Lys Phe Ile Ile Glu Ser Glu Ala Ser
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gaactgagcc tgcgtcaatt taccccgccg gcggaagagg aaaaataact cgag 534

Claims (9)

1.带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，包括EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段，所述TEV蛋白酶识别位点位于EW29标签的C端，所述铁蛋白片段位于TEV蛋白酶识别位点的C端，EW29标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；该带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封的蛋白笼纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，所述TEV蛋白酶识别位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，表达所述EW29标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求2所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白，其特征在于，表达所述TEV蛋白酶识别位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，表达所述铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.权利要求1～4任一项所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒。
6.权利要求5所述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将EW29标签、TEV蛋白酶识别位点和铁蛋白片段的核苷酸序列串联，形成EW29标签/TEV蛋白酶识别位点/铁蛋白重组序列；
步骤2：将重组序列连接至pET21b中，构建重组载体；
步骤3：将重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，经过诱导表达和亲和层析纯化，得到目的蛋白带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白；纯化的目的蛋白进行自组装形成蛋白笼纳米颗粒。
7.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体包含有如权利要求3～4任一项所述的核苷酸序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含有权利要求7所述的重组载体。
9.权利要求1～4所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白、权利要求5所述的带有半乳糖结合凝集素EW29标签的铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒、权利要求6所述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法在制备疫苗中的应用。
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