CN114605516B - 具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20k衍生多肽、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用，通过同源序列比对获得了潜在功能片段cp20k‑p3(p:peptide)。研究表明，该多肽具备独特的自组装特性，并能够显著地促进小鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。通过丙氨酸扫描(Alanine Scanning)逐个替换cp20k‑p3中的半胱氨酸，获得了4个多肽突变体，比较发现二硫键的形成对于多肽的自组装形貌及生物矿化功能具有显著的影响。不仅为破解cp20k的生物功能提供了线索，同时也为骨组织工程提供了一种全新的功能材料。

Description

具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用，即具有自组装特性和生物矿化功能的cp20k-p3及其突变体、其制备方法和应用。
背景技术
在骨科临床工作中经常见到由于创伤、感染、骨坏死及肿瘤等多种疾病引起的骨缺损和骨折不愈合，由此导致了临床中对骨修复材料的巨大需求。骨移植是临床上主要的治疗手段，其中自体骨移植效果最好，但其来源极少又会给患者产生新的创伤；异体骨移植易产生免疫排斥、感染和传播疾病的风险；普通的人工合成材料活性低且易产生异物排斥。理想的骨修复材料应该具备良好的生物相容性和可降解性，具有骨传导性和骨诱导性，具有良好的空隙率，低免疫原性，易塑形但有一定的机械强度等。因此非常有必要发掘新替代材料和方法解决以上问题。
骨组织工程学作为一种新的方法是将具有骨诱导活性的细胞因子，如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)通过物理或化学方法引入到磷酸钙、聚乳酸等生物相容性好、可降解、具有一定力学强度的支架材料中，这种支架材料(复合材料)通过释放骨形态发生蛋白促进骨再生。当前国内诸多单位都采用了这种复合材料的方法，验证了生物支架结合生物因子的方法能够实现对骨损伤修复的促进作用。
目前，骨形态发生蛋白是唯一能够单独诱导异位成骨和单独促进骨缺损修复的生长因子，已确认的BMPs多达17种，主要分布于骨胶原纤维、骨膜、骨髓基质中，但含量非常少，且纯化困难，利用率很低。其中BMP-2是诱导成骨能力最强的之一，但天然的BMP-2数量有限，活性不稳定，远不能满足临床需求，而且其在混入载体后有许多的副作用，例如降低支架材料的力学性能、蛋白有效成分释放不稳定等。
藤壶作为一种强势的海洋污损生物，能够永久黏附于水下设施，其实现粘附的关键在于多组分的藤壶胶。按照分子量的大小，藤壶胶目前被分为cp100k、cp52k、cp68k、cp20k、cp19k、cp16k。其中cp20k(藤壶胶蛋白20K，cement protein 20k，简称cp20k)被认为是一种界面蛋白，可能起到粘附和生物矿化的双重作用。但由于其序列中含有较多的半胱氨酸而导致其在表达纯化过程中发生絮凝，难以对其生物功能进行确定及应用。目前已有对于藤壶的水下粘附机制的研究，例如中国专利申请号201510534230.0生物粘合剂及其制备方法和应用，其中生物粘合剂包括Trx-Balcp19k蛋白，其制备方法包括反转录、扩增、构建重组质粒、转化、诱导、亲和层析、透析等步骤，该发明的生物粘合剂粘附性能强、产量相对高、制备成本低，可应用于生理材料之间、非生理材料之间、生理材料和非生理材料之间的粘附。由于藤壶胶含有较多的半胱氨酸，难以从已经固化的蛋白胶中提取，且cp20k经大肠杆菌异源表达后容易形成分子间二硫键而发生大规模絮凝，不利于确定其发挥活性状态及具体的生物功能，极大地限制了相关研究工作的开展。例如，Mohanram及Akshita Kumar等人分别采用核磁共振技术及分子动力学模拟的方法研究了cp20k的空间结构及其于碳酸钙之间的分子相互作用，在理论层面对cp20k的功能进行了推测，但无法通过实验加以验证。
因此，通过研究cp20k衍生多肽的生物功能，进而进行具备优异组织相容性及促进成骨矿化能力的替代材料的研发，具有重要的应用价值。
发明内容
针对藤壶胶含有较多的半胱氨酸，难以从已经固化的蛋白胶中提取，且大肠杆菌异源表达后容易形成分子间二硫键而发生大规模絮凝，不利于确定其发挥活性状态及具体的生物功能的问题，本发明提供了具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用，即具有自组装特性和生物矿化功能的cp20k-p3、其制备方法和应用。首先采用序列比对，挖掘cp20k氨基酸序列中潜在的功能片段，通过缩短片段长度、减少半胱氨酸进而降低二硫键数量，并充分挖掘cp20k生物功能。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，包括如下步骤：
1)用DTT溶液处理cp20k样品，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4×Loading Buffer混合之后放入PCR扩增仪中加热，制样完成后使用电泳仪进行跑胶，然后取下胶片加入固定液固定、染色，倒掉染色液加入10％的乙酸溶液室温过夜脱色；
2)cp20k-p3野生型及其突变体的合成与鉴定：通过序列分析，将cp20k中含有的保守的重复序列和贻贝粘附蛋白mfp-2的结构域(Epidermal Growth Factor，简称EGF，即表皮生长因子)作比较，找到cp20k的重复序列与EGF结构域中在序列上的相似性序列，选取CNQKHPCWRRHGKKHGLHRKFHGNACNC，命名为cp20k-p3，采用丙氨酸扫描法将cp20k-p3中的半胱氨酸逐个突变成丙氨酸；
3)cp20k-p3野生型及其突变体的自组装特性检测：
取新鲜剥离的云母片，分别取步骤2)得到的cp20k-p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上，室温自然干燥后对其进行AFM观察拍摄；
分别取步骤2)得到的cp20k-p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量，光谱范围为190-260nm；之后在190-260nm的范围内进行圆二色谱测试，使用spectra manager软件对CD光谱数据进行平滑预处理，保存上传至http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk网站，波数范围选择190到240nm，进行拟合计算得到二级结构相对含量；
4)cp20k-p3野生型及其突变体的生物相容性及生物矿化功能检测：
CCK-8实验：接种mMSCs细胞悬液于96孔板中，在37℃细胞培养箱中培养24小时，之后将步骤2)得到的cp20k-p3野生型及其突变体与mMSCs共培养48小时后，每孔加入CCK8试剂培养1小时后，在450nm处测定吸光值，检测多肽对细胞的毒性，每个样品进行3次重复，使用Origin绘图软件处理数据；
茜素红染色实验：将mMSCs接种于6孔板中，在α-MEM培养基中进行培养72小时后，更换分化培养基，孵育7天，每3天更换一次分化培养基，之后使用pH4.2的茜素红-S染料在pH＝4.2条件下对细胞进行染色。
本发明中：
步骤1)的目的是采用DTT处理鉴定半胱氨酸的作用，由于cp20k中含有多达17个半胱氨酸残基，形成了复杂的分子间/分子内二硫键，可能是导致其在纯化、冻干、冷藏等过程中自动形成絮状沉淀原因，故需对此进行验证。
具体的，步骤1)是配制浓度为60mM的DTT溶液处理cp20k样品，取10ul一定浓度的cp20k悬浊液与10ul 60mM DTT进行混合，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4×Loading Buffer混合之后放入PCR扩增仪中70℃加热10min，制样完成后使用电泳仪进行跑胶，220V，120mA，10min，之后将电流调至80mA跑30min，取下胶片加入固定液固定5min，之后染色5小时，倒掉染色液加入10％的乙酸溶液室温过夜脱色。
步骤2)所述的cp20k-p3野生型及其突变体的合成与鉴定，是通过序列分析，cp20k中含有保守的重复序列，尤其是其中一段与贻贝粘附蛋白mfp-2的结构域(EGF)具有类似氨基酸组成，极有可能是其发挥生物功能的结构单元，EGF中含有保守的半胱氨酸，通过形成分子内二硫键，帮助mfp-2维持正确三级结构并结合Ca2+，cp20k的重复序列与EGF结构域中在序列上的相似性，意味着它们可能具备相近的生物功能--Ca2+结合与生物矿化，因此选取CNQKHPCWRRHGKKHGLHRKFHGNACNC，命名为cp20k-p3。
步骤2)所述的采用丙氨酸扫描法将cp20k-p3中的半胱氨酸逐个突变成丙氨酸，具体序列及命名如下：
所述的cp20k-p3野生型及突变体的氨基酸序列使用化学合成法进行合成，采用质谱检测法对合成的多肽进行鉴定，使用液相色谱法对多肽的纯度进行鉴定。
步骤3)所述的分别取步骤2)得到的cp20k-p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上，是分别取10ul上步骤得到的cp20k-p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上。
步骤3)所述的分别取步骤2)得到的cp20k-p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量，是分别取1mg/ml上步骤得到的cp20k-p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量。
步骤4)所述的CCK-8实验，是接种mMSCs细胞悬液于96孔板中，细胞密度为5×103/孔，在37℃细胞培养箱中培养24小时，之后将步骤2)得到的cp20k-p3野生型及其突变体与mMSCs共培养48小时后，每孔加入10ul CCK8试剂培养1小时后，在450nm处测定吸光值，检测多肽对细胞的毒性，每个样品进行3次重复，多肽浓度梯度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.9mg/ml、1.3mg/ml、1.8mg/ml，使用Origin绘图软件处理数据。
步骤4)所述的茜素红染色实验，是将mMSCs接种于6孔板中，细胞密度为105/孔，在α-MEM培养基中加入10％FBS和1％PS，培养72小时后，更换分化培养基，孵育7天，每3天更换一次分化培养基，之后使用pH4.2的茜素红-S染料在pH＝4.2条件下对细胞进行染色；所述的分化培养基是在α-MEM培养基的基础上加入终浓度100nmol/L的地塞米松、0.05mmol/LL-抗坏血酸-2-磷酸、10mmol/L的β-甘油磷酸盐。
本发明还涉及具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽，采用上述具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法得到。
上述具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽在骨组织工程作为功能材料的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，首先采用序列比对，挖掘cp20k氨基酸序列中潜在的功能片段，通过缩短片段长度、减少半胱氨酸以达到降低二硫键数量、防止样品絮凝的目的，以便充分验证cp20k生物功能。经本发明研究发现，cp20k衍生多肽cp20k-p3具备独特的自组装形貌，且能够显著地促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。此外，利用丙氨酸扫描法逐个突变cp20k-p3中的半胱氨酸获得了4个突变体，因此，通过对比发现半胱氨酸在cp20k-p3的自组装及促进生物矿化方面具备关键性作用。上述工作的完成，不仅为验证藤壶胶蛋白cp20k的生物矿化功能提供了可靠的实验数据，同时还为骨组织工程提供了一种全新的生物活性因子，对骨修复的临床治疗意义重大。
2、本发明所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽，在研究藤壶胶蛋白20K(cp20k)生物功能的过程中，通过同源序列比对获得了潜在功能片段cp20k-p3(p:peptide)。本发明研究表明，该多肽具备独特的自组装特性，并能够显著地促进小鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。通过丙氨酸扫描(Alanine Scanning)逐个替换cp20k-p3中的半胱氨酸，获得了4个多肽突变体，比较发现二硫键的形成对于多肽的自组装形貌及生物矿化功能具有显著的影响。本发明通过研究发现了cp20k序列当中一段具有独特自组装性能且能够促进成骨细胞的生物矿化的氨基酸序列，不仅为破解cp20k的生物功能提供了线索，同时也为骨组织工程提供了一种全新的功能材料。
附图说明
图1是实验例中Balcp20k的重复序列与EGF钙离子结构域的序列对比图(其中*标记相同的氨基酸残基，深色标记Balcp20k重复序列和EGF的保守半胱氨酸残基)；
图2是实验例中cp20k±DTT的SDS-PAGE图(泳道1为cp20k蛋白样品加盐酸，泳道2为cp20k蛋白样品加DTT)；
图3是实验例中cp20k-p3野生型及其突变体的AFM图；
图4是实验例中cp20k-p3野生型及其突变体的CD图；
图5是实验例中cp20k-p3野生型及其突变体的细胞活力图；
图6是实验例中cp20k-p3野生型及突变体的茜素红染色。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
实施例：
具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的其制备方法，包括如下步骤：
1)配制浓度为60mM的DTT溶液处理cp20k样品，取10ul一定浓度的cp20k悬浊液与10ul 60mM DTT进行混合，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4×Loading Buffer混合之后放入PCR扩增仪中70℃加热10min，制样完成后使用电泳仪进行跑胶，220V，120mA，10min，之后将电流调至80mA跑30min，取下胶片加入固定液固定5min，之后染色5小时，倒掉染色液加入10％的乙酸溶液室温过夜脱色；
2)cp20k-p3野生型及其突变体的合成与鉴定：通过序列分析，cp20k中含有保守的重复序列，尤其是其中一段与贻贝粘附蛋白mfp-2的结构域(EGF)具有类似氨基酸组成，极有可能是其发挥生物功能的结构单元，EGF中含有保守的半胱氨酸，通过形成分子内二硫键，帮助mfp-2维持正确三级结构并结合Ca2+，cp20k的重复序列与EGF结构域中在序列上的相似性，意味着它们可能具备相近的生物功能--Ca2+结合与生物矿化，因此选取CNQKHPCWRRHGKKHGLHRKFHGNACNC，命名为cp20k-p3。
步骤2)所述的采用丙氨酸扫描法将cp20k-p3中的半胱氨酸逐个突变成丙氨酸，具体序列及命名如下：
cp20k-p3-m1 ANQKHP CWRRH GKKHG LHRKFHGNACNC
cp20k-p3-m2 CNQKHP AWRRH GKKHG LHRKFHGNACNC
cp20k-p3-m3 CNQKHP CWRRH GKKHG LHRKFHGNAANC
cp20k-p3-m4 CNQKHP CWRRH GKKHG LHRKFHGNACNA
cp20k-p3野生型及突变体的氨基酸序列使用化学合成法进行合成，采用质谱检测法对合成的多肽进行鉴定，使用液相色谱法对多肽的纯度进行鉴定，多肽纯度均大于95％；
3)cp20k-p3野生型及其突变体的自组装特性检测：
取新鲜剥离的云母片，分别取10ul上步骤得到的cp20k-p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上，室温自然干燥后对其进行AFM观察拍摄；
分别取1mg/ml上步骤得到的cp20k-p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量，光谱范围为190-260nm；之后在190-260nm的范围内进行圆二色谱测试，使用spectramanager软件对CD光谱数据进行平滑预处理，保存上传至http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk网站，波数范围选择190到240nm，进行拟合计算得到二级结构相对含量；
4)cp20k-p3野生型及其突变体的生物相容性及生物矿化功能检测：
CCK-8实验：接种mMSCs细胞悬液于96孔板中，细胞密度为5×103/孔，在37℃细胞培养箱中培养24小时，之后将步骤2)得到的cp20k-p3野生型及其突变体与mMSCs共培养48小时后，每孔加入10ul CCK8试剂培养1小时后，在450nm处测定吸光值，检测多肽对细胞的毒性，每个样品进行3次重复，多肽浓度梯度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.9mg/ml、1.3mg/ml、1.8mg/ml，使用Origin绘图软件处理数据；
茜素红染色实验：将mMSCs接种于6孔板中，细胞密度为105/孔，在α-MEM培养基中加入10％FBS和1％PS，培养72小时后，更换分化培养基，孵育7天，每3天更换一次分化培养基，之后使用pH4.2的茜素红-S染料在pH＝4.2条件下对细胞进行染色；所述的分化培养基是在α-MEM培养基的基础上加入终浓度100nmol/L的地塞米松、0.05mmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸、10mmol/L的β-甘油磷酸盐。
实验例
1材料和方法
1.1材料
1.1.1多肽和细胞
多肽采用化学合成法合成，经质谱鉴定纯度＞95％。生物矿化功能验证所用细胞为小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells(mMSCs))。
1.1.2主要试剂
CCK8试剂盒，NuPAGETM10％Bis-Tris Gel小型蛋白质凝胶，NuPAGER LDS SampleBuffer[4×]，DTT(Dithiothreitol，二硫苏糖醇)，预染蛋白Marker，茜素红染料，盐酸，乙酸，。
1.2方法
1.2.1cp20k的DTT处理鉴定半胱氨酸的作用
由于cp20k中含有多达17个半胱氨酸残基，形成了复杂的分子间/分子内二硫键，导致其在纯化、冻干、冷藏等过程中自动形成絮状沉淀。为对此进行验证，配制浓度为60mM的DTT溶液处理cp20k样品。取10ul一定浓度的cp20k悬浊液与10ul 60mM DTT进行混合，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4×Loading Buffer混合之后放入PCR扩增仪中70℃加热10min，作为实验组。对照组为10ul的cp20k加10ul盐酸及4×Loading Buffer。制样完成后使用电泳仪进行跑胶(220V，120mA，10min)，之后将电流调至80mA跑30min，取下胶片加入固定液固定5min，之后染色5小时，倒掉染色液加入10％的乙酸溶液室温过夜脱色。
1.2.2cp20k-p3野生型及其突变体的合成与鉴定
通过序列分析，cp20k中含有保守的重复序列，尤其是其中一段与贻贝粘附蛋白mfp-2的结构域(Epidermal Growth Factor，简称EGF，表皮生长因子)具有类似氨基酸组成(图1)，极有可能是其发挥生物功能的结构单元。EGF中含有保守的半胱氨酸，通过形成分子内二硫键，帮助mfp-2维持正确三级结构并结合Ca2+，cp20k的重复序列与EGF结构域中在序列上的相似性，意味着它们可能具备相近的生物功能--Ca2+结合与生物矿化，因此选取CNQKHPCWRRHGKKHGLHRKFHGNACNC，命名为cp20k-p3。
图1Balcp20k的重复序列与EGF钙离子结构域的序列对比图(其中*标记相同的氨基酸残基，深色标记Balcp20k重复序列和EGF的保守半胱氨酸残基)。
由DTT处理cp20k的实验结果可知，半胱氨酸在该段序列中可能扮演着重要的作用。因此，采用丙氨酸扫描法将cp20k-p3中的半胱氨酸逐个突变成丙氨酸，具体序列及命名见表1。cp20k-p3野生型及突变体的氨基酸序列交由淘普生物技术有限公司使用化学合成法进行合成，采用质谱检测法对合成的多肽进行鉴定，使用液相色谱法对多肽的纯度进行鉴定，多肽纯度均大于95％。
表1氨基酸突变体的设计
cp20k-p3-m1 ANQKHP CWRRH GKKHG LHRKFHGNACNC
cp20k-p3-m2 CNQKHP AWRRH GKKHG LHRKFHGNACNC
cp20k-p3-m3 CNQKHP CWRRH GKKHG LHRKFHGNAANC
cp20k-p3-m4 CNQKHP CWRRH GKKHG LHRKFHGNACNA
1.2.3cp20k-p3野生型及其突变体的自组装特性研究
取新鲜剥离的云母片，分别取10ul cp20k-p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上，室温自然干燥后对其进行AFM观察拍摄；分别取1mg/ml的cp20k-p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量，光谱范围为190-260nm；之后在190-260nm的范围内进行圆二色谱测试，使用spectra manager软件对CD光谱数据进行平滑预处理，保存上传至http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk网站，波数范围选择190到240nm，进行拟合计算得到二级结构相对含量。
1.2.4生物相容性及生物矿化功能验证
CCK-8实验：接种mMSCs细胞悬液于96孔板中(5×103/孔)，在37℃细胞培养箱中培养24小时，之后将cp20k-p3野生型及其突变体与mMSCs共培养48小时后，每孔加入10ulCCK8试剂培养1小时后，在450nm处测定吸光值，检测多肽对细胞的毒性。每个样品进行3次重复，多肽浓度梯度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.9mg/ml、1.3mg/ml、1.8mg/ml，使用Origin绘图软件处理数据；
茜素红染色实验：将mMSCs接种于6孔板中，细胞密度为105/孔，在α-MEM培养基(加10％FBS、1％PS)中进行培养72小时后，更换分化培养基(在α-MEM培养基的基础上加入终浓度100nmol/L的地塞米松、0.05mmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸、10mmol/L的β-甘油磷酸盐)，孵育7天，每3天更换一次分化培养基，之后使用pH4.2的茜素红-S染料在pH＝4.2条件下对细胞进行染色。
2结果与分析
2.1SDS-PAGE鉴定
半胱氨酸之间可以形成二硫键，二硫键可维持蛋白质稳态，增加蛋白质折叠轨迹的复杂性，富含二硫键的蛋白质在氧化折叠过程中获得其生物活性，但也有可能造成蛋白质的错误折叠，从而影响蛋白质原有的生物功能。考虑到cp20k中含有多达17个半胱氨酸，且其全长蛋白经大肠杆菌异源表达后会自发形成絮状沉淀。为验证二硫键的形成与cp20k絮凝沉淀形成的关系，采用60mM DTT对其进行处理。
图2cp20k±DTT的SDS-PAGE图：泳道1为cp20k蛋白样品加盐酸，泳道2为cp20k蛋白样品加DTT(前期研究发现，异源表达的cp20k跑胶时由于内聚无法观察到蛋白条带，而加酸可以使团聚的cp20k变得蓬松，才能在电泳中进行分离)。
分析图2结果，无DTT处理的cp20k样品拖尾验证，且在泳道上方存在大量蛋白样品(疑似孔道堵塞)，而高浓度DTT处理后的cp20k样品泳道中出现了20、40、80Kd大小的条带。由此可知，cp20k分子间形成了大量的二硫键，高浓度的DTT处理破坏了部分二硫键，使得cp20k多聚体逐步解离形成了分子量更小的寡聚体。
2.2自组装形貌分析
用AFM对cp20k-p3-wt及其突变体在水中的自组装形貌进行了观察研究，结果发现cp20k-p3-wt样品中有大量麦穗状的结构，而突变体多为球状或短棒状(图3)。为了探究差异产生的原因，对cp20k-p3-wt及其突变体进行了圆二色谱CD检测(图4)。CD结果表明cp20k-p3-wt中含有大量的α-螺旋结构，其中包含17％的310-α-螺旋，而突变体则以β-折叠为主(表2)。
图3cp20k-p3野生型及其突变体的AFM图。
图4cp20k-p3野生型及其突变体的CD图。
图4中横坐标为波长，纵坐标为吸光度，α-螺旋在190nm处显示正峰，在222nm处显示负峰；β折叠在195nm处显示正峰；β转角在205nm显示正峰；无规卷曲在220nm处显示正峰；PP2在210-230之间显示正峰。
表2 cp20k-p3野生型及其突变体二级结构及其比例
其中1号样品为cp20k-p3-wt、2号样品为cp20k-p3-m1、3号样品为cp20k-p3-m2、4号样品为cp20k-p3-m3、5号样品为cp20k-p3-m4，NRMSD为归一化方根偏差，通常NRMSD低于0.15表示拟合可以接受。
α-螺旋作为蛋白质或多肽中最常见的二级结构，可以组成卷曲螺旋，形成一种独特的螺旋肽，多个螺旋肽捆绑形成超螺旋结构。这种独特结构往往由“七个重复”c-d-e-f-g-a-b其中a、d代表疏水性氨基酸。这些残基在螺旋上呈现疏水界面，并在两个或者更多这种螺旋单元结合时作为寡域。e、g代表带电氨基酸是形成螺线间静电作用的理想条件。b、c、f对螺旋结构影响较小，仅作为分子间连接的节点。另外还需要粘性末端使螺旋肽相连并按照一定的方向延伸形成超分子自组装体。而cp20k-p3-wt的序列为CNQKHP CWRRH GKKHG LHRKFHGNACNC。其中G-L-H-R-K-F-H就是经典的“七个重复”，两端的半胱氨酸残基作为粘性末端使螺旋肽沿着一定方向进行延伸形成超分子自组装结构，最终形成麦穗状结构，而突变体少了一个半胱氨酸，无法产生更多的粘性末端发生超分子自组装，仅能形成一定尺寸的小短棒或者小球。
2.3细胞毒性测试及促进成骨分化研究
采用CCK8试剂盒对cp20k-p3野生型及其突变体进行了细胞毒性/活性测试。结果表明，这些多肽均能促进小鼠骨髓间充质干细胞((Mouse bone marrow mesenchymal stemcells，mMSCs)的增殖(图5)。而二硫键对其分子内、分子间相互作用产生影响，这种影响一方面导致多肽自组装行为的差异，另一方面也导致了其生物活性的差异。茜素红染色结果表明，野生型的cp20k-p3诱导mMSCs产生的矿化结节最明显，促进生物矿化能力最强。(图6)。
图5cp20k-p3野生型及其突变体的细胞活力图。
由图5可知，无论是野生型还是突变体多肽对m-BMSCs的增殖均起到了促进作用，而且每一种多肽都有不同的最适浓度。其中cp20k-p3-wt的最适浓度为1.3mg/ml，cp20k-p3-m1的最适浓度为0.4mg/ml，cp20k-p3-m2的最适浓度为1.8mg/ml，cp20k-p3-m3的最适浓度为1.8mg/ml，cp20k-p3-m4的最适浓度为1.3mg/ml。
图6cp20k-p3野生型及突变体的茜素红染色。
茜素红可以和矿化结节结合生成红色物质，红色越深表明生成的矿化结节越多，该种多肽对成骨分化能力越显著。从图6A中可以发现cp20k-p3-wt与cp20k-p3-m3对成骨分化的促进作用较为显著，而从B中可发现cp20k-p3形成的矿化结节面积较大，而cp20k-p3-m3与cp20k-p3-m1形成的矿化结节较小且数量较多。经分析，产生这种差异的原因是野生型与突变体自组装形貌的差异，也就是二硫键对分子间作用力的影响。至此，我们通过cp20k全长序列里的一段多肽说明了半胱氨酸在其行使生物功能中的潜在作用，并且还找到了一种可以促进骨细胞分化、用于骨修复的潜在材料。
3讨论
生物体能够通过生物大分子调控结合矿物分子生成无机矿物，而发明人前期研究也表明cp20k与海水中的钙离子具有一定的亲和性，能够特异性地结合钙离子，具备较强的生物矿化功能。cp20k与Ca2+的相互作用及其在不同离子条件下的自组装行为特征，与藤壶的粘附功能及其钙质底盘的形成密切相关。发明人通过比对野生型和突变体发现，cp20k-p3片段中广泛存在的半胱氨酸及其形成的二硫键对多肽、蛋白质分子的自组装过程至关重要。对cp20k相关生物机理的研究，能够为防治藤壶污损提供理论支持，并指导水下胶、交联剂、支架材料的仿生设计。
cp20k-p3具备潜在的生物矿化能力，通过对比分析发现，野生型的生物矿化能力更强，形成的矿化结节更明显，这说明半胱氨酸在cp20k-p3的的自组装及生物矿化过程中起到了关键作用。因此，cp20k-p3可作为生物活性因子来培养成骨细胞，将其植入需要进行骨修复的部位，有望通过调节矿盐结晶以促进软骨形成，进而实现促进骨基质矿化、增强成骨细胞活性等临床功效，在骨修复领域具备广阔的应用前景。
4结论
4.1采用60mM DTT对cp20k全长蛋白进行处理后经SDS-PAGE鉴定，发现cp20k多聚体逐步解离为分子量更小的寡聚体，表明二硫键的存在可能会导致异源表达中蛋白质发生错误的折叠，进而使cp20k发生絮凝。
4.2cp20k-p3与其突变体表现出完全不同的自组装特性，cp20k-p3形成麦穗状结构，突变体形成短棒或微球状结构，经CD分析其二级结构差异巨大，说明半胱氨酸在其生物活性及自组装方面有重要作用。对于cp20k-p3而言，其氨基酸序列中的“abcde”序列决定了其a-helix的含量，及其麦穗装自组装形貌且野生型出现麦穗状的自组装行为机制为“七个重复”所致。
4.3细胞实验表明cp20k-p3及其突变体具备良好的生物安全性，且cp20k-p3衍生性具备最为显著的促进成骨细胞分化功能。由此可知半胱氨酸在cp20k自组装及生物矿化过程中的关键作用。该结果初步验证了cp20k潜在的生物矿化功能，为解析其在藤壶胶层中的功能提供了线索，同时也为骨组织工程提供了一种全新的、安全的功能材料，以及促进成骨细胞分化的功能，初步验证了其可能存在的生物矿化功能，且cp20k-p3-wt与cp20k-p3-m3的生物矿化能力更强。cp20k-p3的研究结果表明cp20k在医学工程中的应用具有巨大的潜能。
序列表
<110> 中国人民解放军国防科技大学
<120> 具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽、其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Asn Gln Lys His Pro Cys Trp Arg Arg His Gly Lys Lys His Gly
1 5 10 15
Leu His Arg Lys Phe His Gly Asn Ala Cys Asn Cys
20 25
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Asn Gln Lys His Pro Cys Trp Arg Arg His Gly Lys Lys His Gly
1 5 10 15
Leu His Arg Lys Phe His Gly Asn Ala Cys Asn Cys
20 25
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Asn Gln Lys His Pro Ala Trp Arg Arg His Gly Lys Lys His Gly
1 5 10 15
Leu His Arg Lys Phe His Gly Asn Ala Cys Asn Cys
20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Asn Gln Lys His Pro Cys Trp Arg Arg His Gly Lys Lys His Gly
1 5 10 15
Leu His Arg Lys Phe His Gly Asn Ala Ala Asn Cys
20 25
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Asn Gln Lys His Pro Cys Trp Arg Arg His Gly Lys Lys His Gly
1 5 10 15
Leu His Arg Lys Phe His Gly Asn Ala Cys Asn Ala
20 25

Claims (7)

1.具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）用DTT溶液处理cp20k样品，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4×LoadingBuffer混合之后放入PCR扩增仪中加热，制样完成后使用电泳仪进行跑胶，然后取下胶片加入固定液固定、染色，倒掉染色液加入10%的乙酸溶液室温过夜脱色；
2）cp20k-p3野生型及其突变体的合成与鉴定：通过序列分析，将cp20k中含有的保守的重复序列和贻贝粘附蛋白mfp-2的结构域作比较，找到cp20k的重复序列与EGF结构域中在序列上的相似性序列，选取CNQKHPCWRRHGKKHGLHRKFHGNACNC，命名为cp20k-p3，采用丙氨酸扫描法将cp20k-p3中的半胱氨酸逐个突变成丙氨酸，突变体具体序列及命名如下：
3）cp20k-p3野生型及其突变体的自组装特性检测：
取新鲜剥离的云母片，分别取步骤2）得到的cp20k-p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上，室温自然干燥后对其进行AFM观察拍摄；
分别取步骤2）得到的cp20k-p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量，光谱范围为190-260nm；之后在190-260nm的范围内进行圆二色谱测试，使用spectra manager软件对CD光谱数据进行平滑预处理，保存上传至http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk网站，波数范围选择190到240nm，进行拟合计算得到二级结构相对含量；
4）cp20k-p3野生型及其突变体的生物相容性及生物矿化功能检测：
CCK-8实验：接种mMSCs细胞悬液于96孔板中，在37℃细胞培养箱中培养24小时，之后将步骤2）得到的cp20k-p3野生型及其突变体与mMSCs共培养48小时后，每孔加入CCK8试剂培养1小时后，在450nm处测定吸光值，检测多肽对细胞的毒性，每个样品进行3次重复，使用Origin绘图软件处理数据；
茜素红染色实验：将mMSCs接种于6孔板中，在α-MEM培养基中进行培养72小时后，更换分化培养基，孵育7天，每3天更换一次分化培养基，之后使用pH4.2的茜素红-S染料在pH=4.2条件下对细胞进行染色。
2.权利要求1所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：步骤1）是配制浓度为60mM的DTT溶液处理cp20k样品，取10ul一定浓度的cp20k悬浊液与10ul 60mM DTT进行混合，使用移液枪吹打均匀，再添加相应体积的4×Loading Buffer混合之后放入PCR扩增仪中70℃加热10min，制样完成后使用电泳仪进行跑胶，220V，120mA，10min，之后将电流调至80mA跑30min，取下胶片加入固定液固定5min，之后染色5小时，倒掉染色液加入10%的乙酸溶液室温过夜脱色。
3.权利要求1所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述的cp20k-p3野生型及突变体的氨基酸序列使用化学合成法进行合成，采用质谱检测法对合成的多肽进行鉴定，使用液相色谱法对多肽的纯度进行鉴定。
4.权利要求1所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的分别取步骤2）得到的cp20k-p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上，是分别取10ul上步骤得到的cp20k-p3野生型及其突变体溶液滴加到云母片上。
5.权利要求1所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的分别取步骤2）得到的cp20k-p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量，是分别取1mg/ml上步骤得到的cp20k-p3野生型及其突变体多肽在液体池中进行CD测量。
6.权利要求1所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的CCK-8实验，是接种mMSCs细胞悬液于96孔板中，细胞密度为5×103/孔，在37℃细胞培养箱中培养24小时，之后将步骤2）得到的cp20k-p3野生型及其突变体与mMSCs共培养48小时后，每孔加入10ul CCK8试剂培养1小时后，在450nm处测定吸光值，检测多肽对细胞的毒性，每个样品进行3次重复，多肽浓度梯度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.9mg/ml、1.3mg/ml、1.8mg/ml，使用Origin绘图软件处理数据。
7.权利要求1所述的具有自组装特性和生物矿化功能的藤壶胶蛋白20K衍生多肽的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的茜素红染色实验，是将mMSCs接种于6孔板中，细胞密度为105/孔，在α-MEM培养基中加入10%FBS和1%PS，培养72小时后，更换分化培养基，孵育7天，每3天更换一次分化培养基，之后使用pH4.2的茜素红-S染料在pH=4.2条件下对细胞进行染色；所述的分化培养基是在α-MEM培养基的基础上加入终浓度100nmol/L的地塞米松、0.05mmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸、10mmol/L的β-甘油磷酸盐。
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