RU2583307C2

RU2583307C2 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/slurp-2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-2, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3) pET22b(+)/slurp-2- ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-2 ЧЕЛОВЕКА

Info

Publication number: RU2583307C2
Application number: RU2015109082/10A
Authority: RU
Inventors: Екатерина Назымовна Люкманова; Михаил Анатольевич Шулепко; Захар Олегович Шенкарев; Дмитрий Александрович Долгих; Михаил Петрович Кирпичников
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2015-03-16
Publication date: 2016-05-10
Also published as: RU2015109082A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантной продукции белков человека, и может быть использовано для получения белка SLURP-2 человека. Конструируют плазмидную ДНК pET22b(+)/slurp-2, кодирующую белок SLURP-2 человека 5616 п. о. с физической картой, представленной на фиг.1, которая состоит из NdeI/HindIII - фрагмента ДНК плазмиды pET22b(+) длиной 5382 п. о., содержащего lac-промотор Е. coli, ген bla β-лактамазы, фрагмент гена lacI Е. coli, участок ori инициации репликации и искусственную последовательность ДНК, кодирующую NdeI/HindIII фрагмент длиной 240 п. о., представляющий собой последовательность синтетического гена белка человека SLURP-2 с SEQ ID NO:7; и содержит уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: XhoI - 158, HindIII - 173, EcoRI - 192, BamHI - 198, NdeI - 430, BglII - 534, MluI - 1256, PstI - 4495. Полученной плазмидой трансформируют компетентные клетки E. coli BL21(DE3) с получением штамма бактерий E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)/slurp-2 - продуцента белка SLURP-2 человека. Изобретение позволяет повысить эффективность синтеза белка SLURP-2 в Escherichia coli. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 6 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, конкретно к получению человеческого белка SLURP-2, который может быть использован в медицине в качестве лекарственного препарата.

Регуляторные белки SLURP, относящиеся к семейству Ly-6/uPAR, являются эндогенными модуляторами работы никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), обнаруженными в плазме крови и моче человека [Adermann K, Wattler F, Wattler S, Heine G, Meyer M, Forssmann WG, Nehls M. (1999) Protein Sci. 8(4):810-9], а также в клетках кожи и слизистой ткани [Mastrangeli R, Donini S, Kelton CA, He C, Bressan A, Milazzo F, Ciolli V, Borrelli F, Martelli F, Biffoni M, Serlupi-Crescenzi O, Serani S, Micangeli E, El Tayar N, Vaccaro R, Renda T, Lisciani R, Rossi M, Papoian R. (2003) Eur J Dermatol. 13(6):560-70]. Эти белки влияют на рост, миграцию и дифференцировку клеток эпителия [Arredondo J., Chernyavsky A.I., Jolkovsky D.L., Webber R.J., Grando S.A. (2006) J Cell Physiol.. 208:238-245; Arredondo J., Chernyavsky A.I., Webber R.J., Grando S.A. (2005) J. Invest. Dermatol. 125: 1236-1241]. Показано, что белки семейства SLURP обладают ранозаживляющим действием на ротовой слизистой оболочке и коже [Chernyavsky AI, Kalantari-Dehaghi М, Phillips С, Marchenko S, Grando SA. (2012). Wound Repair Regen. 20:103-13].

Известен способ получения SLURP-2 человека, основанный на экспрессии в клетках Е. coli в виде гибридного белка с белком SUMO, имеющего суммарную молекулярную массу ~22 кДа [Arredondo J., Chernyavsky A.I., Jolkovsky D.L., Webber R.J., Grando S.A. (2006) J Cell Physiol. 208:238-245]. Недостатком этого метода является наличие значительной дополнительной аминокислотной последовательности белка SUMO, способной оказывать влияние на биологическую функцию и пространственную укладку молекулы SLURP-2 (согласно расчетам по аминокислотной последовательности молекулярная масса SLURP-2 составляет ~9 кДа). Другие примеры рекомбинантной продукции SLURP-2 в настоящее время в литературе отсутствуют.

Изобретение решает задачу получения рекомбинантного человеческого белка SLURP-2 в изолированном и структурированном виде.

Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pET22b(+)/slurp-2, кодирующей белок SLURP-2 человека (5616 п. о.), и штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/slurp-2 - продуцента белка SLURP-2 человека, обеспечивающего синтез этого белка с уровнем экспрессии не ниже 10% суммарного клеточного белка.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pET22b(+)/slurp-2, кодирующая белок SLURP-2 человека, характеризуется следующими признаками (Фиг. 1):

имеет молекулярную массу 5616 п. о.;

кодирует аминокислотную последовательность SLURP-2 человека;

содержит: lac-промотор Е. coli, ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pET22b(+)/slurp-2 клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: XhoI - 158, HindIII - 173, EcoRI - 192, BamHI - 198, NdeI - 430, BglII - 534, MluI - 1256, PstI - 4495.

Экспрессия гена slurp-2 человека в клетках Е. coli сопровождается накоплением искусственного нейромодулятора в бактериальной цитоплазме в виде нерастворимых телец включения. Для его выделения необходимо использование денатурирующих агентов.

Для получения штамма-продуцента полипептида со структурой SLURP-2 человека компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) трансформируют рекомбинантной плазмидой pET22b(+)/slurp-2.

Полученный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/slurp-2 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 1×3-5 мкм, подвижные.

Культуральные признаки. При росте на плотной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный, диаметр колоний 1-3 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде LB характеризуется ровным помутнением с образованием легкого осадка.

Физико-биохимические признаки. Клетки растут при температуре 4-42°С при оптимуме рН 6,8-7,2. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы.

Штамм Е. coli BL21(DE3)/pET22b(+)/slurp-2 обеспечивает индуцибельный синтез белка SLURP-2 человека в количестве не менее 10% от суммарного клеточного белка.

Полученный рекомбинантный белок SLURP-2 может быть использован для лечения воспалительных заболеваний кожи различного генеза, псориаза, онкологических заболеваний, некоторых форм эпилепсии.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.

На фиг. 1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pET22b(+)/slurp-2;

на фиг. 2 - анализ рекомбинантного препарата SLURP-2. (А-Б). Эффективность ренатурации SLURP-2 зависит от значения рН ренатурирующего буфера (А) и концентраций восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона (Б). Звездочкой обозначен пик, соответствующий очищенному препарату ренатурированного SLURP-2. (В). Электрофоретический анализ SLURP-2, полученного из телец включения, после ренатурации и очистки с помощью ВЭЖХ. (Г). Масс-спектрометрический анализ ренатурированного SLURP-2;

На фиг. 3 представлен 2D ¹H-¹⁵N HSQC ЯМР-спектр 0.5 мМ ¹³С-¹⁵N-меченого SLURP-2 (30°С, рН 5.0).

На фиг. 4 - влияние препарата SLURP-2 на пролиферацию клеток колоректальной аденокарциномы НТ-29 по данным WST-1 теста. Приведены данные трех независимых экспериментов. Полученные данные (число живых клеток в % от контроля) аппроксимированы уравнением Хилла (y=A1+(100%-A1)/(1+([SLURP]/EC₅₀)^nH). Рассчитанные параметры ЕС₅₀, nH и А1 составили 0.19±0.07 нМ, 0.5±0.1 и 63±2%.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Конструирование гена slurp-2 человека

Ген белка SLURP-2, содержащего на N-конце дополнительный остаток метионина, конструируют из 6 синтетических перекрывающихся олигонуклеотидов с использованием трехстадийной ПЦР. На первой стадии в результате последовательной амплификации праймеров 1 (SEQ №1) и 2 (SEQ №2), 3 (SEQ №3) и 4 (SEQ №4), 5 (SEQ №5) и 6 (SEQ №6) нарабатывают ПЦР фрагменты А, Б и В соответственно. На второй стадии фрагменты А и Б амплифицируют с использованием праймеров 1 и 4 для получения ПЦР продукта, содержащего фрагмент Г. Фрагменты Б и В амплифицируют с использованием праймеров 3 и 6 для получения ПЦР продукта, содержащего фрагмент Д. На заключительной стадии фрагменты Г и Д амплифицируют с использованием праймеров 1 и 6 для получения фрагмента, содержащего ген SLURP-2. Во всех ПЦР реакционная смесь в объеме 50 мкл содержит по 140 нг праймеров, по 10 нмоль каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и 1 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы в буфере для Pfu-полимеразы: 20 мМ Трис-HCl, 2 мМ MgSO₄, 10 мМ KCl, 10 мМ (NH₄)₂SO₄, 0.1% тритон X-100, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 8.75. Цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК при 95°С (1 мин), отжиг при 52°С (1 мин) и элонгацию при 68°С (1 мин). Всего проводят 30 циклов реакции. Реакционную смесь наносят на агарозный гель для разделения электрофорезом и нужные фрагменты вырезают из геля скальпелем, затем ДНК выделяют из геля с помощью Wizard SV Gel Clean Up System (Promega).

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pET22b(+)/slurp-2

50 нг ПЦР-фрагмента ДНК, содержащего ген slurp-2 (SEQ №7), обрабатывают последовательно рестриктазами NdeI и HindlII (Thermo Scientific) и из полученного гидролизата выделяют в 2%-ном геле легкоплавкой агарозы фрагмент длиной 240 п. о., содержащий ген SLURP-2, 2 мкг плазмидной ДНК pET22b(+) обрабатывают последовательно рестриктазами NdeI и HindIII и из полученного гидролизата выделяют в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы векторную ДНК длиной 5382 п. о.

Полученный фрагмент и векторную ДНК соединяют при помощи лигазной реакции в 10 мкл буфера для лигирования (Thermo Scientific), содержащего 1 ед. Т4 ДНК-лигазы. 1 мкл реакционной смеси используют для трансформации 100 мкл компетентных клеток XL-1 Blue. 1/10 клеток, использованных для трансформации, высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют целевую плазмидную ДНК pET22b(+)/slurp-2 и анализируют ее путем обработки набором эндонуклеаз рестрикции NdeI и HindIII с последующим электрофоретическим анализом длин рестрикционных фрагментов в 2% агарозном геле.

Окончательно структуру рекомбинантной ДНК pET22b(+)/slurp-2 подтверждают определением нуклеотидной последовательности в области встроенного фрагмента, содержащего синтетический ген slurp-2 человека.

Пример 3. Получение и определение продуктивности штамма-продуцента SLURP-2 человека

Рекомбинантной плазмидной ДНК pET22b(+)/slurp-2 трансформируют компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen). Для этого к 200 мкл компетентных клеток добавляют 20 нг плазмидной ДНК pET22b(+)/slurp-2, хорошо перемешивают и инкубируют во льду в течение 30 мин. Затем клетки подвергают тепловому шоку в течение 90 сек при 42°С, после чего вновь помещают в лед и инкубируют 4-5 мин. Затем к клеточной суспензии добавляют 300 мкл среды SOB и инкубируют клетки в течение 60 мин при 37°С и хорошей аэрации. Затем клетки высевают по 100 мкл на чашки Петри с питательной твердой средой, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). В результате получают штамм-продуцент SLURP-2 человека.

Собранные с чашек Петри колонии с клетками Е. coli BL21(DE3)/pET22b(+)/slurp-2 ресуспендируют в 50 мл жидкой среды Terrific Brouth (ТВ), содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Культивирование проводят при 37°С с умеренным перемешиванием (250 об/мин) до достижения клеточной плотности в культуре, соответствующей величине поглощения при 600 нм 0,6. Далее клеточную культуру переносят в 1 л ТВ и продолжают выращивание в ферментере (Bioflow 3000, New Brunswick Scientific, США). Культивирование осуществляют при 37°С в условиях автоматического поддержания относительного содержания кислорода в системе не менее 30% от максимально достижимого. Регулируемыми параметрами являются обороты мешалки и скорость подачи воздуха. Экспрессию гена SLURP-2 индуцируют добавлением изопропилтио-β-D-галактопиранозида до конечной концентрации 0.05 мМ при клеточной плотности в культуре, соответствующей величине поглощения при 600 нм 1.0. После индукции культивирование клеток осуществляют в течение 12 часов.

Отбирают пробу 1 мл и центрифугируют 5 мин при скорости 6000 об/мин, после чего клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, инкубируют 10 мин в кипящей водяной бане, образцы объемом 5 мкл анализируют электрофорезом в 13% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Кумасси G-250, сканируют и рассчитывают процентное содержание рекомбинантного белка в лизатах с использованием программы Scion Image (Scion Corp., США). По данным сканирования белок SLURP-2 составляет 10% от общего клеточного белка.

Пример 4. Выделение рекомбинантного белка SLURP-2 человека

Клетки собирают центрифугированием (10000 g, 20 мин, 4°С) и ресуспендируют в холодном буфере 20 мМ Tris/HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, рН 8.0 в соотношении 10 мл буфера на 1 г осадка. Далее суспензию клеток дезинтегрируют ультразвуком (Branson Digital Sonifier, США) при выходной мощности 50 Вт и 4°С в течение 5 минут. Полученную взвесь центрифугируют при 36000 g в течение 20 мин. Образовавшийся осадок ресуспендируют в исходном буфере с добавлением 2 М мочевины. Суспензию переносят в охлажденный стакан, дезинтегрируют 10 секунд и центрифугируют в тех же условиях, что и ранее. Процедуру повторяют дважды. После отмывания 2 М мочевиной осадок два раза промывают исходным буфером, содержащим 1% Тритон Х-100, и затем два раза деионизованной водой (MilliQ, Millipore, США). Отмытые тельца включения хранят при -70°С.

Отмытые тельца включения ресуспендируют в 30 мМ трис-глициновом буфере, рН 9.2, содержащем 8 М мочевину (Carl Roth, Германия), из расчета 10 мл буфера на 1 г телец включения. Суспензию дезинтегрируют при выходной мощности прибора 50 Вт и 4°С в течение 30 сек. Затем суспензию тел включения сульфируют добавлением 0,4 М сульфита натрия, цистина до концентрации 0.4 мМ и NiCl₂ до концентрации 5 мМ. В таком виде тельца оставляют на 18 часов в открытом стакане при перемешивании и 25°С. Затем смесь центрифугируют при 36000 g 1 час и супернатант разводят в 10 раз 2 М мочевиной. После этого сульфированный SLURP-2 наносят на колонку с ДЕАП-Сферонит-ОН, предварительно уравновешенную 30 мМ Tris-HCl, рН 8.0 (буфер A). SLURP-2 элюируют буфером А, содержащим 300 мМ NaCl и 8 М мочевину.

Во фракцию белка, содержащую SLURP-2, добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 50 мМ и дополнительно чистят с помощью обратнофазной ВЭЖХ с помощью хроматографической колонки Jupiter С4, А300, 10x250 мм (Phenomenex, США) на приборе "Smartline" (Knauer, Германия). Элюцию SLURP-2 проводят градиентом ацетонитрила от 10% до 45% за 30 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты. Полученный препарат SLURP-2 с восстановленными дисульфидными связями лиофилизуют.

Пример 5. Ренатурация рекомбинантного белка SLURP-2 человека

Лиофилизованный и восстановленный SLURP-2 растворяют в буфере для ренатурации, содержащем 50 мМ Tris/HCl, 2 М мочевину, 0.5 М L-аргинин, 2 мМ GSH и 2 мМ GSSG, рН 9.0, до конечной концентрации белка 0.1 мг/мл. Ренатурацию проводят при 4°С в течение 3 суток.

Раствор SLURP-2 концентрируют в 4 раза на концентрационной ячейке с размером пор мембраны 1 кДа (Millipore, США). Очистку ренатурированного SLURP-2 проводят с помощью обратнофазной ВЭЖХ на колонке Jupiter С4, А300, 4,6×250 мм (Phenomenex, США). Элюцию SLURP-2 проводят градиентом ацетонитрила от 20% до 45% за 30 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты (Фиг. 2). Полученный препарат ренатурированного SLURP-2 лиофилизуют.

Описываемый способ выделения позволяет получить 5 мг ренатурированного SLURP-2 из 1 г влажной биомассы, что соответствует 5 мг белка из 100 мг лиофилизированной биомассы.

Спектры, измеренные на времяпролетном масс-спектрометре UltraFlex TOF/TOF фирмы Bruker Daltonics (Германия), оснащенном источником ионизации MALDI, показали соответствие молекулярной массы рекомбинантного SLURP-2 расчетным данным, полученным для аминокислотной последовательности SEQ №8. Формирование дисульфидных связей было также подтверждено с помощью реактива Элмана.

Пример 5. Анализ пространтсвеной структуры SLURP-2 методами ЯМР-спектроскопии

Анализ корреляционного 2D ¹H-¹⁵N ЯМР-спектра рекомбинантного SLURP-2 (Фиг. 3) подтвердил гомогенность и чистоту полученного препарата. Значительная дисперсия ¹H^N сигналов основной цепи (от 7 до 9.7 м.д.) указала на наличие β-структурных регионов в белке, характерных для белков семейства Ly-6/uPAR. В ЯМР-спектре наблюдался один набор сигналов, что свидетельствует об отсутствии конформационной гетерогенности, обусловленной cis-trans изомеризацией пептидных связей Ххх-Pro.

Пример 6. Анализ антипролиферативной активности SLURP-2 на клетках аденокарциномы человека НТ-29

Инкубация клеток колоректальной аденокарциномы НТ-29 с рекомбинантным препаратом SLURP-2 в концентрации 1 мкМ в течение 48 часов приводила к значительному уменьшению количества клеток до 54±2% и 62±3% относительно контроля соответственно. Анализ морфологии ядер клеток с помощью флуоресцентной микроскопии показал, что SLURP-2 не вызывает апоптотической или некротической гибели клеток НТ-29. Таким образом, наблюдаемый эффект SLURP-2 связан с замедлением пролиферации клеток НТ-29.

Анализ с помощью WST-1 теста выявил, что SLURP-2 значительно ингибирует рост опухолевых клеток НТ-29. Анализ кривой доза-эффект показал, что ингибирующий эффект SLURP-2 зависит от концентрации белка (Фиг. 4). Полуэффективная концентрация (ЕС₅₀) для SLURP-2 составила ~0.2 нМ. Максимальный ингибирующий эффект достигался при концентрации белка ~1 мкМ.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить биологически активный белок со структурой, идентичной структуре природного SLURP-2 человека, и при этом уровень его бактериального синтеза составляет не менее 10% от суммарного клеточного белка. Это позволяет получать в миллиграммовых количествах рекомбинантный SLURP-2, который может быть использован в медицине в качестве нейромодулятора для лечения заболеваний нервной системы, а также для лечения повреждений кожи и слизистых оболочек, воспалительных заболеваний кожи, псориаза и онкологических заболеваний.

Claims

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pET22b(+)/slurp-2, кодирующая белок SLURP-2 человека 5616 п. о., состоящая из NdeI/HindIII - фрагмента ДНК плазмиды pET22b(+) длиной 5382 п. о., содержащего lac-промотор Е. coli, ген bla β-лактамазы, фрагмент гена lacI Е. coli, участок ori инициации репликации и искусственную последовательность ДНК, кодирующую NdeI/HindIII фрагмент длиной 240 п. о., представляющий собой последовательность синтетического гена белка человека SLURP-2 в виде SEQ №7; содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: XhoI - 158, HindIII - 173, EcoRI - 192, BamHI - 198, NdeI - 430, BglII - 534, MluI - 1256, PstI - 4495 (Фиг. 1).

2. Штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/slurp-2 - продуцент белка SLURP-2 человека, полученный путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET22b(+)/slurp-2, заявленной в п. 1.