RU2404246C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/вд-ЛИНКС1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/вд-ЛИНКС1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1 ЧЕЛОВЕКА - Google Patents

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/вд-ЛИНКС1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/вд-ЛИНКС1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1 ЧЕЛОВЕКА Download PDF

Info

Publication number
RU2404246C1
RU2404246C1 RU2009123238/10A RU2009123238A RU2404246C1 RU 2404246 C1 RU2404246 C1 RU 2404246C1 RU 2009123238/10 A RU2009123238/10 A RU 2009123238/10A RU 2009123238 A RU2009123238 A RU 2009123238A RU 2404246 C1 RU2404246 C1 RU 2404246C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
links
pet22b
protein
link1
properties
Prior art date
Application number
RU2009123238/10A
Other languages
English (en)
Inventor
Екатерина Назымовна Люкманова (RU)
Екатерина Назымовна Люкманова
Михаил Анатольевич Шулепко (RU)
Михаил Анатольевич Шулепко
Захар Олегович Шенкарев (RU)
Захар Олегович Шенкарев
Дмитрий Александрович Долгих (RU)
Дмитрий Александрович Долгих
Роман Владимирович Тихонов (RU)
Роман Владимирович Тихонов
Игорь Евгеньевич Кашеверов (RU)
Игорь Евгеньевич Кашеверов
Виктор Ионович Цетлин (RU)
Виктор Ионович Цетлин
Михаил Петрович Кирпичников (RU)
Михаил Петрович Кирпичников
Original Assignee
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН filed Critical Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Priority to RU2009123238/10A priority Critical patent/RU2404246C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2404246C1 publication Critical patent/RU2404246C1/ru

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению водорастворимого домена белка Линкс1 человека, и может быть использовано в медицине. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рЕТ22b(+)/вд-Линкс1, кодирующую белок, которая содержит NdeI/BamHI-фрагмент ДНК плазмиды рЕТ22b(+) и искусственную последовательность ДНК, кодирующую NdeI/BamHI фрагмент, включающий синтетический ген водорастворимого домена Линкс1 человека, содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: XhoI - 158, HindIII - 173, EcoRI - 192, BamHI - 198, Ndel - 430, BglII - 534, MluI - 1256, PstI - 4495. Получают штамм-продуцент белка путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой рЕТ22b(+)/вд-Линкс1. Изобретение позволяет получить белок со структурой и свойствами, идентичными структуре и свойствам природного водорастворимого домена белка Линкс 1 человека в достаточном количестве, измеряемом в миллиграммах, с уровнем экспрессии не ниже 10% от суммарного клеточного белка. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, конкретно к получению белка вд-Линкс1, который может быть использован в медицине в качестве лекарственного препарата.
Известны регуляторные белки семейства Lynx - эндогенные модуляторы работы никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), обнаруженные в центральной нервной системе мышей в 1999 г. [J.M.Miwa, I.Ibanez-Tallon, G.W.Crabtree, R.Sanchez, A.Sali, L.W.Role, N.Heintz (1999) Neuron 23(1):105-14]. Эти белки состоят из мембраноассоциированного домена (связанного с клеточной мембраной посредством гликофосфатидилинозитольного якоря) и водорастворимого домена (вдЛинкс), обладающего всеми характерными структурными особенностями нейротоксинов яда змей: он содержит остаток лейцина на N-конце молекулы и 10 остатков цистеинов, образующих токсин-подобную систему из пяти дисульфидных связей. Белки семейства Линкс обладают очень интересными с фармакологической точки зрения функционально-биологические свойствами. В отличие от альфа-нейротоксинов эти белки в присутствии агонистов (ацетилхолина или никотина) не блокируют, а наоборот, активируют канал нАХР [J.M.Miwa, T.R.Stevens, S.L.King, B.J.Caldarone, I.Ibanez-Tallon, C.Xiao, R.M.Fitzsimonds, C.Pavlides, H.A.Lester, M.R.Picciotto, N.Heintz. (2006) Neuron. 51(5):587-600].
В 2008 году был обнаружен еще один представитель семейства Линкс, Линкс 1 насекомых [Y.M.Choo, B.H.Lee, K.S.Lee, B.Y.Kim, J.Li, J.G.Kirn, J.H.Lee, H.D.Sohn, S.Y.Nah, B.R.Jin (2008) Mol Cell Neurosci. 38(2):224-35]. Присутствие этого белка было обнаружено в таких тканях, как ганглии, мозг, нижнечелюстная мышца, преджелудок, ножная мышца, эпидермис, что также указывает на определенную роль этого белка в функционировании нервной системы насекомых.
Известны способы получения вд-Линкс 1 мышей и насекомых, основанные на экспрессии в трансформированных клетках млекопитающих НЕК 293Т [J.M.Miwa, I.Ibanez-Tallon, G.W.Crabtree, R.Sanchez, A.Sali, L.W.Role, N.Heintz (1999) Neuron 23(1):105-14] и насекомых Sf9 [Y.M.Choo, B.H.Lee, K.S.Lee, B.Y.Kim, J.Li, J.G.Kim, J.H.Lee, H.D.Sohn, S.Y.Nah, B.R.Jin (2008) Mol Cell Neurosci. 38(2):224-35]. Недостатком этих методов является крайне низкий выход целевого продукта (50 мкг белка из 1 л среды).
Известен наиболее близкий к заявленному белок Линкс1 человека, выделенный из поджелудочной железы [Southan С., Simms M., Narjis S. (2000) EMBL/GenBank/DDBJ databases]. Однако этот белок не может быть использован в качестве лекарственного препарата.
Изобретение решает задачу получения рекомбинантного водорастворимого белка со свойствами Линкс1 человека, - вд-Линкс1.
Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ22b(+)/вд-Линкс1, кодирующей белок со свойствами Линкс 1 человека (5635 п.о.), и штамма бактерий Escherichia coli ВL21(DE3)/рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 - продуцента белка со свойствами Линкс1 человека, обеспечивающего синтез этого белка с уровнем экспрессии не ниже 10% суммарного клеточного белка.
Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ22b(+)/вд-Линкс1, кодирующая белок со структурой водорастворимого домена Линкс1 человека, характеризуется следующими признаками:
имеет молекулярную массу 5635 п.о.;
кодирует аминокислотную последовательность искусственного водорастворимого домена Линкс1 человека;
содержит: lac-промотор Е.coli, ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: XhoI - 158, HindIII - 173, EcoRI - 192, ВаmIII - 198, NdeI - 430, BglII - 534, MluI - 1256, PstI - 4495.
Экспрессия гена вд-Линкс1 человека в клетках Е.coli сопровождается накоплением искусственного нейромодулятора в бактериальной цитоплазме в виде нерастворимых телец включения. Для его выделения необходимо использование денатурирующих агентов.
Для получения штамма-продуцента полипептида со структурой водорастворимого домена Линкс1 человека компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) трансформируют рекомбинантной плазмидой рЕТ22b(+)/вд-Линкс1.
Полученный штамм Escherichia coli ВL21(DE3)/рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 1×3-5 мкм, подвижные.
Культуральные признаки. При росте на плотной среде LA колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный, диаметр колоний 1-3 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде LB характеризуется ровным помутнением с образованием легкого осадка.
Физико-биохимические признаки. Клетки растут при температуре 4-42°С при оптимуме рН 6,8-7,2. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы.
Штамм Е. coli ВL21(DE3)/рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 обеспечивает индуцибельный синтез белка со свойствами Линкс1 человека в количестве не менее 10% от суммарного клеточного белка.
Полученный рекомбинантный белок вд-Линкс1 может быть использован для лечения псориаза, онкологических заболеваний, болезни Альцгеймера, паркинсонизма, некоторых форм эпилепсии.
Изобретение иллюстрируют графические материалы:
На фиг.1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды рЕТ22b(+)/вд-Линкс1;
на фиг.2 - электрофореграмма лизатов клеток штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) (дорожка 2), штамма-продуцента Е.coli ВL21(DE3)/рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 (дорожка 3) в 13%-ном полиакриламидном геле, дорожка 1 - белковые маркеры молекулярной массы; стрелкой указан полипептид вд-Линкс1;
на фиг.3 - очистка рекомбинантного вдЛинкс 1 после ренатурации методом ВЭЖХ на колонке JupiterC4 (2×150, мм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 10% до 45% за 30 мин в присутствии 0,1%-ной ТФУ, скорость элюции - 0,3 мл/мин. Регистрация оптической плотности элюата при 210 нм;
на фиг.4 - спектр кругового дихроизма в воде рекомбинантного вд-Линкс1 после ренатурации.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1. Конструирование гена водорастворимого домена Линкс1 человека.
Ген вдЛинкс 1, фрагмент 1-73 Линкс-1 человека, содержащий на N-конце дополнительный остаток метионина, конструируют из 6 синтетических перекрывающихся олигонуклеотидов с использованием трехстадийной ПЦР. На первой стадии в результате последовательной амплификации праймеров 1 (SEQ №1) и 2 (SEQ №2), 3 (SEQ №3) и 4 (SEQ №4), 5 (SEQ №5) и 6 (SEQ №6) нарабатывают ПЦР фрагменты А, Б и В, соответственно. На второй стадии фрагменты А и Б аплифицируют с использованием праймеров 1 и 4 для получения ПЦР продукта, содержащего фрагмент Г. Фрагменты Б и В аплифицируют с использованием праймеров 3 и 6 для получения ПЦР продукта, содержащего фрагмент Д. На заключительной стадии фрагменты Г и Д аплифицируют с использованием праймеров 1 и 6 для получения фрагмента, содержащего ген вдЛинкс 1. Во всех ПЦР реакционная смесь в объеме 50 мкл содержит по 140 нг праймеров, по 10 нмоль каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и 1 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы в буфере для Pfu-полимеразы: 20 мМ Трис-HCl, 2 мМ MgSO4, 10 мМ КСl, 10 мМ (NH4)2SO4, 0.1 % тритон X-100, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 8.75. Цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК при 95°С (1 мин), отжиг при 52°С (1 мин) и элонгацию при 68°С (1 мин). Всего проводят 30 циклов реакции. Реакционную смесь наносят на агарозный гель для разделения электрофорезом и нужные фрагменты вырезают из геля скальпелем, затем ДНК выделяют из геля с помощью Wizard SV Gel Clean Up System (Promega).
Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной рЕТ22b(+)/вд-Линкс1.
50 нг ПЦР-фрагмента ДНК, содержащего ген вдЛинкс 1 (SEQ №7), обрабатывают последовательно рестриктазами NdeI и BamHI (Fermentas, Литва) и из полученного гидролизата выделяют в 2%-ном геле легкоплавкой агарозы фрагмент длиной 231 п.о., содержащий ген вдЛинкс 1.
2 мкг плазмидной ДНК pET22b(+) обрабатывают последовательно рестриктазами NdeI и ВаmHI и из полученного гидролизата выделяют в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы векторную ДНК длиной 5403 п.о.
Полученный фрагмент и векторную ДНК соединяют при помощи лигазной реакции в 10 мкл буфера для лигирования (Fermentas), содержащего 1 ед. Т4 ДНК-лигазы. 1 мкл реакционной смеси используют для трансформации 100 мкл компетентных клеток XL-1 Blue. 1/10 клеток, использованных для трансформации, высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют целевую плазмидную ДНК рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 и анализируют ее путем обработки набором эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI с последующим электрофоретическим анализом длин рестрикционных фрагментов в 2% полиакриламидном геле.
Окончательно структуру рекомбинантной ДНК рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 подтверждают определением нуклеотидной последовательности в области встроенного фрагмента, содержащего синтетический ген водорастворимого домена Линкс1 человека.
Пример 3. Получение и определение продуктивности штамма-продуцента белка со свойствами Линкс1 человека.
Рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 трансформируют компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen) и получают штамм-продуцент белка со свойствами Линкс1 человека. Клетки Е. coli ВL21(DE3)/рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 выращивают в 50 мл жидкой среды Terrific Brouth (ТВ), содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Культивирование проводят при 37°С с умеренным перемешиванием (250 об./мин) до достижения клеточной плотности в культуре, соответствующей величине поглощения при 600 нм 0.6. Далее клеточную культуру переносят в 1 л ТВ и продолжают выращивание в ферментере (Bioflow 3000, New Brunswick Scientific, США). Культивирование осуществляют при 37°С в условиях автоматического поддержания относительного содержания кислорода в системе не менее 30% от максимально достижимого. Регулируемыми параметрами являются обороты мешалки и скорость подачи воздуха. Экспрессию гена вд-Линкс1 индуцируют добавлением изопропилтио-β-D-галактопиранозида до конечной концентрации 0.025 мМ при клеточной плотности в культуре, соответствующей величине поглощения при 600 нм 1.0. После индукции культивирование клеток осуществляют в течение 18 часов.
Отбирают пробу 1 мл и центрифугируют 5 мин при скорости 6000 об/мин, после чего клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, инкубируют 10 мин в кипящей водяной бане, образцы объемом 5 мкл анализируют электрофорезом в 13% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Кумасси G-250 (фиг.2), сканируют и рассчитывают процентное содержание рекомбинантного белка в лизатах с использованием программы Scion Image (Scion Corp., США). По данным сканирования белок вд-Линкс1 составляет 10% от общего клеточного белка (фиг.2).
Пример 4. Выделение рекомбинантного белка со свойствами Линкс1 человека.
Клетки собирают центрифугированием (10000 g, 20 мин, 4°С) и ресуспендируют в холодном буфере 20 мМ Tris/HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, рН 8.0 в соотношении 10 мл буфера на 1 г осадка. Далее суспензию клеток дезинтегрируют ультразвуком (Branson Digital Sonifier, США) при выходной мощности 50 Вт и 4°С в течение 5 минут. Полученную взвесь центрифугируют при 36000 g в течение 20 мин. Образовавшийся осадок ресуспендируют в исходном буфере с добавлением 2 М мочевины. Суспензию переносят в охлажденный стакан, дезинтегрируют 10 секунд и центрифугируют в тех же условиях, что и ранее. Процедуру повторяют дважды. После отмывания 2 М мочевиной осадок два раза промывают исходным буфером, содержащим 1% Тритон Х-100, и затем два раза деионизованной водой (MilliQ, Millipore, США). Отмытые тельца включения хранят при - 20°С.
Отмытые тела включения ресуспендируют в 30 мМ Tris-HCl, рН 9.0, содержащем 8 М мочевину (Carl Roth, Германия), из расчета 10 мл буфера на 1 г тел включения. Суспензию дезинтегрируют при выходной мощности прибора 50 Вт и 4°С в течение 30 сек. Затем суспензию тел включения сульфируют добавлением 0,4 М сульфита натрия и 0,15 М тетратионата натрия. В таком виде тела оставляют на 10 часов при перемешивании и 25°С. Затем смесь центрифугируют при 36000 g 1 час и супернатант разводят в 10 раз 4 М мочевиной. После этого сульфированный вд-Линкс1 наносят на колонку с ДЕАП-Сферонит-ОН, предварительно уравновешенную 30 мМ Tris-HCl, рН 8.0 (буфер А). ВдЛинкс 1 элюируют буфером А, содержащим 300 мМ NaCl и 8 М мочевину.
Во фракцию белка, содержащую вд-Линкс1, добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 50 мМ и дополнительно чистят с помощью обратнофазной ВЭЖХ с помощью хроматографической колонки Jupiter C4, A300, 10×250 мм (Phenomenex, США) на приборе "Smartline" (Knauer, Германия). Элюцию вд-Линкс1 проводят градиентом ацетонитрила от 10% до 45% за 30 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты. Полученный препарат вд-Линкс1 с восстановленными дисульфидными связями лиофилизуют.
Пример 5. Ренатурация рекомбинантного белка вд-Линкс1 человека.
Лиофилизованный и восстановленный вдЛинкс 1 растворяют в буфере для ренатурации, содержащем 50 мМ Tris/HCl, 1.5 М мочевину, 0.5 М L-аргинин, 3 мМ восстановленного глутатиона и 0.3 мМ окисленного глутатиона, рН 11.0, до конечной концентрации белка 0.1 мг/мл. После растворения вд-Линкс1 рН раствора понижают до 9,5 и инкубируют при 4°С в течение 4 суток.
Раствор вд-Линкс1 концентрируют в 4 раза на концентрационной ячейке с размером пор мембраны 1 кДа (Millipore, США). Очистку ренатурированного вд-Линкс-1 проводят с помощью обратнофазной ВЭЖХ на колонке Jupiter C4, А300, 4,6×250 мм (Phenomenex, США). Элюцию вдЛинкс-1 проводят градиентом ацетонитрила от 20% до 45% за 30 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты (Фиг.3). Полученный препарат ренатурированного вдЛинкс 1 лиофилизуют.
Описываемый способ выделения позволяет получить 0.85 мг ренатурированного вд-Линкс1 из 1 г влажной биомассы, что соответствует 0.85 мг белка из 100 мг лиофилизированной биомассы.
Спектры, измеренные на времяпролетном масс-спектрометре UltraFlex TOF/TOF фирмы Bruker Daltonics (Германия), оснащенном источником ионизации MALDI, показали соответствие молекулярной массы рекомбинантного вд-Линкс1 расчетным данным, полученным для аминокислотной последовательности SEQ №8.
Пример 6. Получение спектра кругового дихроизма рекомбинантного вдЛинкс 1.
Спектр КД (фиг.4) измеряют с помощью спектрополяриметра J-810 (Jasco, Япония) в кювете с длиной оптического пути 0,01 см в диапазоне длин волн 190-250 нм с шагом 1 нм. Исследуют конформацию вд-Линкс1 в водном растворе (рН~4,0). Концентрация вд-Линкс 1 в воде составляет 0,09 мМ. Оценку содержания элементов вторичной структуры (см. табл.) проводят по программе CONTINLL [Provencher, S.W., Glocker, J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. //Biochemistry. - 1982. - Vol.20. - P.33-37].
Анализ полученного спектра показывает, что в водной среде вд-Линкс1 обладает упорядоченной структурой типа β-складок (таблица). Содержание β-структуры близко к структуре, наблюдаемой у структурных гомологов Линкс1, змеиных нейротоксинов.
Таблица
Данные о вторичной структуре рекомбинантного вд-Линкс1 человека, полученные с помощью кругового дихроизма.
Содержание α-структуры Содержание β-слоев Содержание β-поворотов Содержание неупорядоченной структуры
Вд-Линкс1 5,7% 39,4% 21,9% 33,0%
Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить белок со структурой и свойствами, идентичными структуре и свойствам природного водорастворимого домена Линкс1 человека, и при этом уровень его бактериального синтеза составляет не менее 10% от суммарного клеточного белка. Это позволяет получать в миллиграммовых количествах рекомбинантный вд-Линкс1, который может быть использован в медицине в качестве нейромодулятора для лечения заболеваний нервной системы, а также для лечения псориаза и онкологических заболеваний.

Claims (2)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ22b(+)/вд-Линкс1, кодирующая водорастворимый домен белка Линкс1 человека, имеющий 5635 п.о. с физической картой, приведенной на фиг.1, и состоящая из NdeI/BamHI - фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+) длиной 5403 п.о., содержащего 1ас-промотор Е. coli, ген bla β-лактамазы, фрагмент гена lacI Е. соli, участок ori инициации репликации и искусственную последовательность ДНК, кодирующую NdeI/BamHI фрагмент длиной 232 п.о., включающий синтетический ген водорастворимого домена Линкс1 человека с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: №7; содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: XhoI - 158, HindIII - 173, EcoRI - 192, BamHI - 198, NdeI - 430, BglII - 534, МluI - 1256, PstI - 4495.
2. Штамм бактерий Escherichia coli ВL.21(DЕ3)/рЕТ22b(+)/вд-Линкс1 - продуцент водорастворимого домена белка Линкс1 человека.
RU2009123238/10A 2009-06-18 2009-06-18 РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/вд-ЛИНКС1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/вд-ЛИНКС1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1 ЧЕЛОВЕКА RU2404246C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009123238/10A RU2404246C1 (ru) 2009-06-18 2009-06-18 РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/вд-ЛИНКС1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/вд-ЛИНКС1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1 ЧЕЛОВЕКА

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009123238/10A RU2404246C1 (ru) 2009-06-18 2009-06-18 РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/вд-ЛИНКС1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/вд-ЛИНКС1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1 ЧЕЛОВЕКА

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2404246C1 true RU2404246C1 (ru) 2010-11-20

Family

ID=44058441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009123238/10A RU2404246C1 (ru) 2009-06-18 2009-06-18 РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/вд-ЛИНКС1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/вд-ЛИНКС1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1 ЧЕЛОВЕКА

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2404246C1 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIWA J.M. et al.: «The prototoxin lynxl acts on nicotinic acetylcholine receptors to balance neuronal activity and survival in vivo», Neuron., 2006, v.7, №5, реферат. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2371219T3 (es) Producción de fgf18 en huéspedes procariotas.
CN110845603B (zh) 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途
ES2334127T3 (es) Produccion de il-21 en huespedes procariotas.
JPH068317B2 (ja) 新規ポリペプチド
KR102106773B1 (ko) 목적 단백질의 수용성 및 발현량 증가를 위한 융합 태그 및 이의 용도
KR100356140B1 (ko) 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법
US8080387B2 (en) Method for preparing soluble and active recombinant proteins usins PDI as a fusion partner
RU2453602C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pЕТ22b(+)/SLURP-1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/SLURP-1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-1 ЧЕЛОВЕКА
CN111423516B (zh) 一种蛋白及其在创口修复及抑菌中的应用
US7238513B2 (en) Nucleic acid sequences encoding Conus protein disulfide isomerase
US20050227920A1 (en) Methods for production of recombinant vascular endothelial cell growth inhibitor
RU2404246C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/вд-ЛИНКС1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/вд-ЛИНКС1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА СО СВОЙСТВАМИ ЛИНКС1 ЧЕЛОВЕКА
Wojtowicz-Krawiec et al. Use of Ubp1 protease analog to produce recombinant human growth hormone in Escherichia coli
KR102006101B1 (ko) 인간 섬유아세포 성장인자 21 재조합 단백질의 수용성 과발현 방법
RU2583307C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/slurp-2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-2, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3) pET22b(+)/slurp-2- ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-2 ЧЕЛОВЕКА
Song et al. High-efficiency production of bioactive recombinant human fibroblast growth factor 18 in Escherichia coli and its effects on hair follicle growth
RU2316590C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pE-His8-TrxL-Ar2, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД АРЕНИЦИН МОРСКОГО КОЛЬЧАТОГО ЧЕРВЯ Arenicola marina, И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО АРЕНИЦИН
CN114381471A (zh) 一种辅助蛋白在重组蛋白生产中的应用及融合表达系统
RU2399670C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pTrcIFdL, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД С АКТИВНОСТЬЮ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА С АКТИВНОСТЬЮ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА
RU2708556C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.COLI SG 20050/ p280_2GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида
RU2143492C1 (ru) Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека
RU2798545C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК pSMT3_HCRG21, кодирующая гибридный белок SMT3-HCRG21, штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 - продуцент анальгетического пептида HCRG21 и способ получения рекомбинантного анальгетического пептида HCRG21
RU2512527C2 (ru) ИСКУССТВЕННЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА, ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pJZZ-A, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА В Escherichia coli И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pJZZ-A-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА
Kaplan et al. High-Level Production of MMLV Reverse Transcriptase Enzyme in Escherichia coli
CN117466992B (zh) 一种纤连蛋白突变体及其制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20140619