ES2334127T3

ES2334127T3 - Produccion de il-21 en huespedes procariotas.

Info

Publication number: ES2334127T3
Application number: ES03810068T
Authority: ES
Inventors: Chung Chang; Bruce L. Zamost; Douglas C. Covert; Hong Y. Liu; Karen S. De Jongh; Jeffrey D. Meyer; Susan D. Holderman
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2010-03-05
Anticipated expiration: 2023-12-12
Also published as: EP1573006A2; RU2354703C2; DK1573006T3; NO20053385L; CA2507817C; BR0317243A; US7767199B2; EP1573006B1; MXPA05006117A; PL377291A1; DE60330044D1; AU2003302250B2; US20060134754A1; IL168697A; JP4664684B2; EP1573006A4; US20070048263A1; AU2003302250A1; JP2006509525A; IL198074A0

Abstract

Vector de expresión para producir la proteína IL-21 que comprende los siguientes elementos unidos operativamente: (a) un origen de replicación procariota; (b) un elemento de ADN de inicio de la transcripción; (c) una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 27; y (d) un terminador de la transcripción.

Description

Producción de IL-21 en huéspedes procariotas.

La mayor disponibilidad e identificación de genes de genomas humanos u otros genomas ha conducido a una mayor necesidad por una expresión eficaz y la purificación de proteínas recombinantes. La expresión de proteínas en bacterias es de lejos la estrategia más ampliamente utilizada para la producción de genes clonados. Por muchas razones, se prefiere la expresión en bacterias para la expresión en células eucariotas. Por ejemplo, las bacterias son mucho más fáciles de desarrollar que las células eucariotas. Más específicamente, la disponibilidad de una gran abundancia de herramientas genéticas moleculares sofisticadas y miles de mutantes hacen que E. coli, como huésped de expresión, sea extremadamente útil para la producción de proteínas. Sin embargo, la producción a nivel elevado de proteínas funcionales en E. coli, especialmente aquellas de origen eucariota, ha sido menudo difícil.

IL-21 (previamente denominado ligando Zalfa 11) es un miembro de la familia de citoquinas de IL-2 que también incluye IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 e IL-15. Se ha observado que las proteínas en esta familia presentan efectos anticancerígenos y antivirales. IL-21 es producida por células T auxiliares, que son reguladores clave de inmunidad. En base a los patrones de expresión de su receptor afín y la administración de la proteína, se ha observado que IL-21 activa las células T asesinas CD8+ y células T asesinas (NK) naturales, dos clases de linfocitos que erradican tumores y células viralmente infectadas. La IL-21 también estimula clases seleccionadas de células B (Parrish et al., 408: 57-63, 2000).

La IL-21 recombinante se ha producido en células procariotas, en particular E. coli. La proteína bacteriana producida resultante no está glicosilada, y se produce en un estado agregado. La producción de IL-21 de E. coli requiere que las proteínas agregadas se solubilicen a partir de los cuerpos de inclusión insolubles y se renaturalicen o replieguen. Sin la renaturalización, la actividad específica de la proteína recombinante se reducirá significativamente.

A pesar de los avances en la expresión de proteínas recombinantes en huéspedes bacterianos, existe la necesidad de métodos mejorados para la producción de proteínas IL-21 recombinantes purificadas y biológicamente activas en sistemas procariotas que dan lugar a rendimientos superiores para la protección de proteínas. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes tras hacer referencia a la siguientes descripción detallada.

El documento US 6,307,024 describe moléculas de polinucleótidos y polipéptidos del ligando zalfa 11, y métodos y usos relacionados.

Kane J. F., Current Opinion in Biotechnology, Vol. 6, No. 5, October 1995, páginas 494-500, describen los efectos de agrupaciones de codones raros sobre la expresión de nivel elevado de proteínas heterólogas en E. coli.

Weir M. P. et al., Biochemical Journal, Vol. 245, No. 1, 1 July 1987, páginas 85-91, describen la purificación y renaturalización de IL-2 recombinante humana.

Asano R. et al., FEBS Letters, Vol. 528, No 1-3, 25 September 2002, páginas 70-76, describen la actividad antitumoral de IL-21 preparada mediante un procedimiento de repliegue a partir de cuerpos de inclusión expresados en E. coli.

La presente invención proporciona un vector de expresión para producir la proteína IL-21 que comprende los siguientes elementos unidos operativamente.

(a): un origen de replicación procariota;

(b): un elemento de ADN de inicio de la transcripción;

(c): una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 27; y

(d): un terminador de la transcripción.

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La presente invención también proporciona un método para producir proteínas IL-21, tal como se define las reivindicaciones.

En un aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión para producir proteínas IL-21 que comprende los elementos unidos operativamente de un origen de replicación procariota, un elemento de ADN de inicio de la transcripción, y una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEC ID no. 27 y un terminador de la transcripción. En otro aspecto, el vector de expresión es el vector pTAP337. En realizaciones adicionales que proporcionan el vector de expresión pueden incluir un marcador seleccionable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células huésped procariotas transformadas con los vectores de expresión descritos como que comprenden la SEC ID no. 27 o el vector pTAP337. En otras realizaciones, la cepa huésped es la cepa de E. coli W3110 o la cepa zGOLD1, depositadas con la American Type Culture Collection en Manassas, VA.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos (tal como se define en las reivindicaciones) para producir las proteínas IL-21 en condiciones en las que se expresa la proteína IL-21. En una realización, el método comprende cultivar una célula huésped que expresa IL-21 después de transformarse con pTAP337. El método comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende la SEC ID No. 27. El método también comprende recuperar células huésped del medio de crecimiento y, a continuación, aislar la proteína IL-21 de las células huésped.

En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos (tal como se define en las reivindicaciones) para producir IL-21 que comprende las etapas descritas anteriormente, en un proceso de fermentación por alimentación discontinua o un proceso de fermentación por lotes.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos (tal como se define en las reivindicaciones) para producir proteína IL-21 que comprende cultivar una célula huésped tal como se describe anteriormente en un matraz de agitación hasta una DO600 de 5 a 20 en un medio de crecimiento, inocular un recipiente de fermentación con un 1 a 12% v/v de medio del matraz de agitación que contiene células huésped, cultivar las células huésped en un medio de crecimiento a un pH de 6,2 a 7,2, donde se introduce una solución de alimentación en el recipiente de fermentación antes del tiempo de fermentación transcurrido (EFT) de 15 horas, la adición de un agente de inducción al recipiente de fermentación al EFT de 20 a 30 horas, y recoger las células huésped al EFT de 48 a 56 horas. En una realización, el agente de inducción es tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) a 0,5 a 2 mM. En otra realización, la solución de alimentación comprende un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste en glicerol y glucosa y la alimentación es de 5 a 15 gramos de carbohidrato por hora. En otra realización, el glicerol en la solución de alimentación es del 40 al 70% v/v de glicerol o la glucosa es del 40 al 70% p/v de glucosa. En realizaciones adicionales, el glicerol es aproximadamente del 70% v/v o la glucosa es aproximadamente del 60% p/v.

En un aspecto, la presente invención proporciona métodos de producción de L- 21 que comprende el sembrado en una matraz con un inóculo que comprende una célula huésped W3110 de E. coli que comprende un vector de expresión tal como se define en las reivindicaciones (por ejemplo, la célula huésped W3110 de E. coli que comprende el vector pTAP337), en el que se expresa un polipéptido IL-21 y con un medio de crecimiento que comprende aproximadamente glicerol 5 g/l, el cultivo del inóculo en un medio de crecimiento durante 16 a 20 horas a aproximadamente 30ºC, la transferencia del inóculo cultivado en el medio de crecimiento a un fermentador por lotes a una concentración de 0,5 a 5% v/v de inóculo, la fermentación de la fermentación por lotes a aproximadamente a 37ºC y aproximadamente pH 6,8 con aproximadamente glicerol al 2%, la introducción de una alimentación de glucosa a un EFT de aproximadamente 8 horas de aproximadamente 9,5 g glucosa/litro/hora y la continuación hasta el final del desarrollo de la fermentación, la adición de IPTG a un EFT de aproximadamente 24 horas hasta una concentración final de 0,5 a 2 mM, la fermentación a aproximadamente 28 horas de IPTG, la recogida del caldo de fermentación del fermentador, la adición de un volumen igual de agua al caldo de fermentación, y la homogenización y la centrifugación para recoger un residuo celular o emulsión celular que comprende el material proteico IL-21.

En una realización, dicha proteína IL-21 comprende una secuencia de residuos de aminoácidos tal como se muestra en la SEC ID No. 28; y dicha etapa de aislamiento comprende además separar la proteína IL-21 insoluble en agua del residuo o emulsión celular, disolver el material IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico, diluir el disolvente caotrópico y replegar la proteína IL-21; y aislar la proteína IL-21, donde la proteína IL-21 aislada es capaz de ser biológicamente activa. En una realización de la presente invención, la proteína IL-21 aislada tiene por lo menos un 90% de pureza. En otra realización, la proteína IL-21 aislada tiene por lo menos un 90% de pureza y tiene un nivel de endotoxina de menos de 10 unidades de endotoxina por mg de proteína IL-21.

En una realización, el método comprende separar de un caldo de fermentación un residuo celular o emulsión celular que comprende material proteico IL-21 insoluble en agua, homogeneizar el residuo celular o emulsión celular para recoger los cuerpos de inclusión, disolver el material proteico IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende una sal de guanidina, diluir el disolvente caotrópico mediante la adición de un tampón de repliegue que comprende sales de arginina y una mezcla de componentes reductores y oxidantes, aislar la proteína IL-21 mediante la extracción de proteínas no plegadas y agregadas por filtración, y purificar la proteína IL-21 replegada en una columna de intercambio catiónico, donde la IL-21 aislada y purificada es capaz de ser biológicamente activa.

En una realización, el método comprende separar de un caldo de fermentación un residuo celular o emulsión celular que comprende material IL-21 insoluble en agua, homogeneizar el residuo celular o la emulsión celular para recoger cuerpos de inclusión, disolver el material proteico IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende una sal de guanidina, diluir el disolvente caotrópico mediante la adición de un tampón de repliegue que comprende sales de arginina y una mezcla de componentes reductores y oxidantes, aislar la proteína IL-21 mediante la extracción de proteínas no plegadas y agregadas por filtración, purificar la proteína IL-21 replegada en una columna de intercambio catiónico, y purificar el eluato de IL-21 en una columna de interacción hidrofóbica, donde la proteína IL-21 aislada y purificada es capaz de ser biológicamente activa.

En una realización, el método comprende separar de un caldo de fermentación un residuo celular o emulsión celular que comprende el material proteico IL-21 insoluble en agua, homogeneizar el residuo celular o la emulsión celular para recoger cuerpos de inclusión, disolver el material proteico IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende aproximadamente 6M de clorhidrato de guanidina, 40 mM de ditriotreitol (DTT) durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente, replegar los cuerpos de inclusión disueltos en una solución mediante la dilución en tampón de repliegue que comprende aproximadamente 2 mM de DTT, 4 mM de la pareja de oxidación-reducción de cistina por lo menos 20 veces, ajustar el pH a aproximadamente 5,5 con ácido acético aproximadamente al 20% y permitir que la solución reacciones durante por lo menos cinco horas, diluir la solución con aproximadamente 1 + 1,4 volúmenes de acetato 25 mM, pH 5,5, filtrar la solución, cargar la solución en una columna de resina Tosohaas SP-550C equilibrada hasta pH 5,5, utilizando tampón de acetato de sodio, lavar la columna de resina con cloruro sódico de aproximadamente 0,4 M, lavar la columna de resina con cloruro sódico de aproximadamente 0,75 M para eluir la proteína IL-21 unida, añadir sulfato de amonio hasta una concentración de aproximadamente 1,5 M para eluir y filtrar la solución de eluato, cargar la solución de eluato en una columna Tosohaas butil 650-M equilibrada con sulfato de amonio 1,5 M, cloruro sódico 0,05 M en tampón de acetato de sodio, diluir el eluato en una columna SP Sepharose HP equilibrada con tampón de acetato de sodio, lavar la columna con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna de 0,3 a 0,7 M de cloruro sódico, concentrar la proteína IL-21 e intercambiar el tampón por el tampón de formulación utilizando ultrafilitración de flujo tangencial. En otras realizaciones, los métodos anteriores para aislar la proteína IL-21 insoluble comprenden medir la actividad biológica utilizando un ensayo de unión a receptor de IL-21.

La presente memoria describe una composición que comprende una proteína IL-21 que comprende un polipéptido tal como se muestra en los residuos de aminoácidos 2-163 de la SEC ID NO: 28 a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml de proteína IL-21 en aproximadamente 10 mM de histidina, manitol al 4,7% a pH 5,3.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una ilustración del plásmido de expresión pTAP337, que contiene la secuencia de nucleótidos optimizada en los codones para IL-21. La designación del ligando zalfa11 humano es IL-21. El plásmido se ha depositado con la American Type Culture Collection en Manassas, VA. bajo la Designación del Depósito de Patente PTA-4853.

Descripción de la invención

Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la invención.

Tal como se utiliza aquí, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquier ligación, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos naturales (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos naturales (por ejemplo, formas \alpha-enantioméricas de nucleótidos naturales), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden presentar alteraciones en los grupos azúcar y/o en los grupos de bases pirimidina o purina. Las modificaciones en los azúcares incluyen, por ejemplo, la sustitución de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azida, o los azúcares se pueden funcionalizar como éteres o ésteres. Además, el grupo azúcar completo se puede sustituir por estructuras estéricamente y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocílicos. Entre los ejemplos de modificaciones en un grupo base se incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos conocidos. Los monómeros de ácidos nucleicos pueden estar unidos por enlaces fosfodiéster o análogos de dichas uniones. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, y similares. El término "molécula de ácido nucleico" también incluye los denominados "ácidos nucleicos de péptidos", que comprenden bases de ácidos nucleicos naturales o modificadas unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena única o doble cadena.

El término "complemento de una molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácidos nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y una orientación inversa en comparación con la secuencia de nucleótidos de referencia.

Un "potenciador" es un tipo de elemento regulador que puede incrementar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador en relación con el punto de inicio de la transcripción.

"ADN heterólogo" se refiere a una molécula de ADN, o una población de moléculas de ADN, que no existe de forma natural en una célula huésped determinada. Las moléculas de ADN heterólogo a una célula huésped particular puede contener ADN derivado de especies de célula huésped (es decir, ADN endógeno) siempre que el ADN huésped se combine con ADN no huésped (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no huésped que codifica un polipéptido unido operativamente a un segmento de ADN huésped que comprende un promotor de la transcripción se considera que es una molécula de ADN heteróloga. En cambio, una molécula de ADN heterólogo puede comprenden un gen endógeno unido operativamente con un promotor exógeno. Como otro ejemplo, una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula de tipo salvaje se considera que es ADN heterólogo si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo salvaje.

El término "contigua" indica que una molécula de ácido nucleico que tiene un tramo contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otra molécula de ácido nucleico. Las secuencias contiguas se dice que "solapan" un tramo determinado de una molécula de ácido nucleico en su totalidad o a lo largo de un tramo parcial de la molécula de ácido nucleico.

"AND complementario (ADNc)" es una molécula de AND de cadena uncial que se forma a partir de un molde de ARNm mediante la enzima transcriptasa inversa. Habitualmente, se utiliza un cebador complementario a partes de ARNm para el inicio de la transcripción inversa. Los expertos en la materia también utilizan el término "ADNc" para referirse a una molécula de ADN de doble cadena que consiste en dicha molécula de ADN de cadena única y su cadena de ADN complementaria. El término "ADNc" también se refiere a un clon de una molécula de ADNc sintetizada a partir de un molde de ARN.

Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que ha sido separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico asilada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que ha sido aislada de una muestra particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.

"ADN lineal" indica moléculas de ADN no circulares con los extremos 5' y 3' libres. El ADN lineal se puede preparar a partir de moléculas de ADN circular cerradas, tales como plásmidos, mediante digestión enzimática o rotura física.

Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Habitualmente, un promotor se localiza en la región no codificante 5' de un gen, próxima al sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de la secuencia en los promotores que actúan en el inicio de la transcripción están a menudo caracterizados por secuencias de nucleótidos de consenso. Estos promotores incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, promotores inducibles por IPTG, promotores de bacteriófago T7 y bacteriófago \lambdap_{L}. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Un promotor habitual tendrá tres componentes, que consisten en secuencias consenso a -35 y -10 con una secuencia entre 16 y 19 nucleótidos entre ellas (Lisset, S. y Margalit, H., Nucleic Acids Res. 21: 1512, 1993). Los promotores de este tipo incluyen los promotores lac, trp, trp-lac (tac) y trp-lac (trc). Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. En cambio, la velocidad de transcripción está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También son conocidos los promotores represibles.

Un "promotor mínimo" contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función del promotor, incluyendo el inicio de la transcripción. Mediante esta definición, un promotor mínimo puede tener o no actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden aumentar la actividad o conferir actividad específica de tejido.

Un "elemento regulador" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor mínimo. Por ejemplo, un elemento regulador eucariota puede contener una secuencia de nucleótidos que se une con factores celulares que permiten la transcripción exclusivamente o preferiblemente en células, tejidos u orgánulos concretos. Estos tipos de elementos reguladores están normalmente asociados con genes que se expresan de una manera "específica de célula", "específica de tejido" o "específica de orgánulo". Los promotores bacterianos tiene elementos reguladores que se unen y modulan la actividad del promotor mínimo, tal como secuencias operadoras que se unen a moléculas activadoras o represoras.

Un "vector de clonación" es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmico o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse de manera autónoma en una célula huésped. Los vectores de clonación contienen habitualmente uno o un numero pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de una manera determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, así como secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen habitualmente gene que proporcionan resistencia a antibiótico.

Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula huésped. Habitualmente, un vector de expresión comprende un promotor transcripcional, un gen, un origen de replicación, un marcador seleccionable, y un terminador de la transcripción. La expresión génica se sitúa habitualmente bajo el control de un promotor, y se dice que dicho gen está "unido operativamente" al promotor. De forma similar, un elemento regulador y un promotor mínimo están unidos operativamente si el elemento regulador modula la actividad del promotor mínimo. Un vector de expresión también puede conocerse como una construcción de
expresión.

Un "huésped recombinante" es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como un vector de clonación o un vector de expresión.

El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción de ARNm en uno o más polipéptidos.

El término "secuencia señal secretora" indica una secuencia de ADN que codifica un péptido (un "péptido secretor") que, como componente de un polipéptido más grande, dirige el polipéptido más grande mediante un mecanismo secretor de la célula en la que se sintetiza. El polipéptido más grande se divide habitualmente para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a través del mecanismo secretor.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, tanto si se producen de forma natural como sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos se refieren habitualmente como "péptidos".

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidrato. Se pueden añadir a la proteína carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos. Las proteínas se definen en la presente invención en términos de sus estructuras en el esqueleto de aminoácidos; los sustituyentes, tales como grupos carbohidrato y grupos no peptídicos, en general no se especifican, pero, sin embargo, pueden estar presentes.

Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN no huésped es un péptido o polipéptido "heterólogo".

Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteináceas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Habitualmente, un preparado de polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, es decir, por lo menos aproximadamente un 80% de pureza, por lo menos aproximadamente un 90% de pureza, por lo menos aproximadamente un 95% de pureza, más de un 95% de pureza, o más de un 99% de pureza. Una manera de mostrar que un preparado de proteínas concreto contiene un polipéptido aislado es mediante la aparición de una única banda tras la electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico (SDS)-poliacrilamida del preparado de proteínas y la tinción con a Azul Brillante Coomassie del gel. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas glicosiladas de forma alternativa o derivadas.

Los términos "amino terminal" o "N-terminal" y "carboxi terminal" o "C- terminal" se utilizan en la presente invención para indicar posiciones en los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se utilizan en referencia a una secuencia o parte concreta de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia situada carboxi terminal con respecto a una secuencia de referencia en un polipéptido se localiza de forma próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no necesariamente en el carboxi terminal del polipéptido completo.

Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de por lo menos dos genes.

El término "etiqueta de afinidad" se utiliza en la presente invención para indicar un segmento de polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, se puede utilizar como etiqueta de afinidad cualquier péptido o proteína para el que se dispone un anticuerpo u otro agente de unión específica. Las etiquetas de afinidad incluyen un tramo de polihistidinas, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3 (1991)), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67: 31 (1988)), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988)), péptido de unión a estreptavidina, u otro epítopo o dominio de unión antigénico. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95 (1991). Las moléculas de ADN que codifican las etiquetas de afinidad están disponibles en suministradores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

El término "isotónico" se utiliza en la presente invención por su significado convencional, que es una tonicidad igual a la de la sangre, equivalente a una solución al 0,9% de NaCl. Una "cantidad isotónica" se una sal es aquella cantidad requerida para hacer que una solución sea isotónica o para producir una solución isotónica tras la reconstitución de un preparado liofilizado.

Las concentraciones se especifican en la presente invención en unidades de molaridad o % p/v de composiciones líquidas. Cuando la composición está en forma de un polvo liofilizado, las concentraciones de los componentes respectivos serán tales con el fin de proporcionar la concentración especificada en la reconstitución del polvo.

Debido a la imprecisión de métodos analíticos estándar, los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros se entienden que son valores aproximados. Cuando dicho valor se expresa como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, el valor indicado de X se entenderá que es preciso en un \pm10%.

Expresión de IL-21 recombinante

La presente invención proporciona vectores de expresión y métodos para producir proteína IL-21 recombinante a partir de un huésped procariota. IL-21 se denominó previamente como el ligando zalfa11 y está descrito completamente en la patente de Estados Unidos 6.307.024 habitualmente asignada. En particular, los vectores de expresión y métodos de la presente invención comprenden un sistema de expresión de E. coli para la producción a gran escala de IL-21 utilizando la secuencia codificante de IL-21 con cambios específicos en nucleótidos con el fin de optimizar codones y la estructura secundaria de ARNm para la traducción en E. coli. Utilizando los vectores de expresión y los métodos de la presente invención, el gen de IL-21 se produjo en E. coli asta un nivel superior a 1 g/L en fermentación de alimentación discontinua. Los presentes inventores observaron que el uso de la cepa UT5600 deficiente en la proteasa OmpT de E. coli como huésped de producción superó los problemas de estabilidad con IL-21met. IL-21met es la secuencia codificante de IL-21 con un codón que codifica una Met N-terminal añadida en el extremo 5' de la secuencia de polinucleótidos. Utilizando los vectores de expresión descritos en la presente invención se mejoró significativamente el rendimiento de proteína recombinante recuperada de la bacteria. El uso de esta cepa huésped de producción produjo por encima de 50 mg/L de cuerpos de inclusión de IL-21met a partir del cultivo del matraz agitador. En otra realización, para facilitar el desarrollo de la fermentación de alimentación discontinua de densidad celular elevada, se seleccionó otra cepa de E. coli, W3110, como huésped para la producción a gran escala de IL-21. Esta célula huésped no es patogénica y puede crecer hasta una densidad celular elevada en un medio de fermentación mínimamente definido. La productividad de IL-21met en la cepa W3110 de E. coli fue comparable con la obtenida en la cepa UT5600 de E. coli cuando se produjo en las fermentaciones en el matraz agitador y por lotes.

La presente invención también proporciona métodos para recuperar la proteína IL-21 recombinante a partir de un huésped procariota cuando la proteína IL-21 es expresada por el huésped y se encuentra en la célula huésped como un cuerpo de inclusión insoluble no glicosilado. Cuando se lisa la célula procariota para aislar los cuerpos de inclusión (también denominados cuerpos refráctiles), los cuerpos de inclusión son agregados de IL-21. Por lo tanto, los cuerpos de inclusión deben estar no asociados y disueltos para aislar la proteína IL-21 y, en general, esto requiere el uso de un disolvente caotrópico desnaturalizante, dando lugar a una recuperación de un polipéptido que se debe replegar para tener una actividad biológica significativa. Una vez se repliega la proteína IL-21, la proteína debe capturarse y purificarse. De este modo, la presente invención proporciona métodos para aislar la proteína IL-21 insoluble de células procariotas, disolviendo el material proteico IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico, diluyendo el disolvente caotrópico de manera que la proteína IL-21 se repliega y se aísla. La presente invención también incluye métodos para capturar la IL-21 renaturalizada del tampón de repliegue diluido utilizando cromatografía de intercambio catiónico, y purificando la proteína IL-21 replegada utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica. Se consigue una mayor purificación utilizando un intercambio aniónico en los ensayos de unión que utilizan un receptor de IL-21 y similares.

El gen de IL-21 humano codifica un polipéptido de 162 aminoácidos. La secuencia de longitud completa incluye un péptido señal de 29 aminoácidos, tal como se muestras en las SEC ID Nos. 1 y 2, y una proteína madura de 133 aminoácidos que comprende del residuo 30 (Gln) al residuo 162 (Ser). La secuencia de IL-21 expresada utilizando un sistema de expresión eucariota tiene una Met N-terminal, y las secuencias de nucleótidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos se muestran en las SEC ID Nos. 27 y 28. La secuencia de nucleótidos de SEC ID No. 27 muestra una secuencia optimizada en los codones que se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

La producción de IL-21 humano recombinante que utilizaba un sistema de expresión mamífero produjo aproximadamente 20 mg/L de proteína. Por lo tanto, se deseaba un sistema de expresión más rentable para la producción a gran escala a de IL-21. Se observó que el sistema de E. coli era una mejor alternativa para la producción a gran escala. Está presente un potencial sitio de glicosilación unido a Asn, aunque no ocupado, en la proteína expresada en una línea de células CHO utilizando un sistema de expresión de mamíferos o en células de insectos utilizando un sistema de expresión de baculovirus. Esta característica estructural hace que IL-21 sea un buen candidato para una expresión procariota. La expresión en E. coli ofrece numerosas ventajas sobre otros sistemas de expresión, particularmente bajos costes de desarrollo y altos rendimientos de producción.

La IL-21 recombinante con un residuo N-terminal (Il-21met) expresada en E. coli se aisló como cuerpos de inclusión insolubles después de la rotura celular. Este material se plegó incorrectamente y no poseía la actividad biológica deseada. En la mayoría de los casos, los cuerpos de inclusión necesitaban ser solubilizados en un disolvente caotrópico desnaturalizante y la proteína se replegaba mediante dilución del agente caotrópico seguido de purificación. Las proteínas varían mucho con respecto a su medio de repliegue óptimo. Los factores que pueden afectar a la recuperación de material correctamente plegado y biológicamente activo incluyen: concentración de proteína inicial, estado oxidativo, pH, excipientes, sales, detergentes, temperatura, modo de adición de tampón de repliegue y similares. Se ha expresado una proteína con una similitud de secuencia y estructura con IL-21, IL-2, en el sistema de E. coli y se replegó satisfactoriamente (Weir et al., J. Biochem. 245: 85, 1987.) ALDESLEUKIN®, una muteína recombinante de IL-2 humana, se ha expresado como cuerpos de inclusión en el sistema de E. coli y se ha replegado in vitro.

El examen de los codones utilizados en el ADNc de IL-21 humano indicaba que contenían un exceso de los codones menos utilizados frecuentemente en E. coli. Los genes con un contenido elevado en codones raramente utilizados tienden a expresarse a un nivel bajo en E. coli (Kane, Curr Opin Biotechnol. 6 (5): 494-500, 1995). Un problema adicional referido a la expresión de IL-21 humano en E. coli fue la aparición de cuatro sitios potenciales de división de OmpT localizados en la secuencia de IL-21. OmpT es una endopeptidasa que divide específicamente entre dos residuos básicos consecutivos y la enzima es activa bajo condiciones desnaturalizantes, tales como urea 8M y guanidina-HCl 6 M (White et al., J Biol Chem. 270 (22): 12990-4, 1995; Dekker et al., Biochemistry, 40 (6): 1694-701, 2001). Esto aumenta los problemas sobre la estabilidad de IL-21 en un extracto celular de E. coli debido a la actividad proteolítica de OmpT.

Diversos laboratorios han demostrado que el nivel de expresión de proteínas cuyos genes contienen codones raros pueden mejorar espectacularmente cuando se aumenta el nivel de ciertos ARNts raros en el huésped (Zdanovsky et al., Appl Environ Microbiol. 66 (8): 3166-73, 2000; Calderone et al., J Mol Biol. 262 (4): 407-12; Kleber-Janke et al., Protein Expr Purif. 19 (3): 419-24, 2000; You et al,. Biotechniques. 27 (5): 950-4, 1999.) El plásmido pRARE codifica genes para ARNts que son raros en E. coli (argU, argW, leuW, proL, ileX y glyT) con sus promotores nativos (Novy et al., InNovations, 12: 2-3, 2001). La coexpresión con pRARE aumentaba la producción de IL-21met en E. coli en aproximadamente 5-10 veces. La coexpresión con pRARE también disminuyó el nivel de IL-21met truncada en lisados celulares de E. coli, sugiriendo que resintetizar el gen de IL-21met con codones más apropiados sería beneficioso.

La presente invención proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia codificante de IL-21 con codones optimizados para la traducción en E. coli. El gen sintético que codifica IL-21met se obtuvo mediante PCR de solapamiento. El producto PCR final se introdujo en un vector de expresión para la expresión bajo el control del promotor Tac. Sin embargo, la expresión fue baja. Un examen de la estructura secundaria del ADNc de IL-21met reveló una estructura de horquilla excepcionalmente estable. Se sospechó que este bucle en horquilla era el elemento estructural que evitaba la expresión eficaz de la secuencia totalmente optimizada. Cuando se eliminó la estructura en horquilla mediante la sustitución de las primeras ochenta bases de la secuencia optimizada por la secuencia mostrada en la SEC ID No. 1. El IL-21 híbrido se muestra en la SEC ID No. 27 y el gen resultante se expresó en E. coli a niveles elevados. Los niveles de expresión con la nueva construcción de expresión aumentaron hasta aproximadamente un 20% de la proteína celular total o 100 mg/L.

Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína deseada en células procariotas comprende habitualmente

(1) elementos de ADN procariota que codifican un origen bacteriano para el mantenimiento del vector de expresión en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN que controlan el inicio de la transcripción, tales como un promotor; (3) elementos de ADN que controlan el proceso de los transcritos, tales como un terminador de la transcripción, y (4) un gen que codifica un marcador seleccionable, tal como resistencia a antibiótico. La célula huésped procariota produce IL-21 tras la introducción de un vector de expresión y la adición de un inductor adecuado. Por consiguiente, la presente invención contempla vectores de expresión que comprenden un promotor, la secuencia de nucleótidos optimizada de IL-21, y una secuencia terminadora. La secuencia de nucleótidos de IL-21 optimizada de ejemplo se muestra en la SEC ID NO: 27. En otra realización, el vector de expresión comprende además un marcador seleccionable. En una realización, el marcador seleccionable es resistencia a kanamicina.

Los vectores de expresión también pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifican un péptido etiqueta para ayudar en la purificación de la proteína deseada. Los péptidos etiqueta que son útiles para aislar polipéptidos recombinantes incluyen, por ejemplo, etiquetas de poliHistidina (que tienen una afinidad por resina quelante de níquel), etiquetas c-myc, proteína de unión a calmodulina (aislada con cromatografía de unión a calmodulina), sustancia P, la etiqueta RYIRs (que se une con anticuerpos anti-RYIRS), la etiqueta Glu-Glu, y la etiqueta FLAG (que se une con anticuerpos anti-FLAG). Véase, por ejemplo, Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996), y Zheng et al., Gene 186: 55 (1997). Las moléculas de ácido nucleico que codifican péptidos etiqueta están disponibles, por ejemplo, en Sigma- Aldrich Corporation (St. Louis, MO).

Un experto en la material estará familiarizado con un gran número de técnicas molecular para la preparación del vector de expresión. Por ejemplo, el polinucleótido de IL-21 se puede preparar mediante la síntesis de moléculas de ácido nucleico utilizando oligonucleótidos largos como cebadores mutuos y las secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 8-8 a 8-9). Las técnicas establecidas que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar moléculas de ADN de por lo menso dos kilobases de longitud (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993), Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), y Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)).

Otro método para construir sistemas de expresión utiliza la recombinación homóloga con un sistema de levadura. Véase la patente de Estados Unidos No. 6.207.442, Construcción de Plásmidos mediante Recombinación Homóloga. El sistema proporciona un plásmido aceptor universal que se puede utilizar para clonar un ADN que codifica cualquier polipéptido de interés, incluyendo fusiones de polipéptidos. El sistema proporciona métodos para preparar moléculas de ADN circular de doble cadena que comprende una región que codifica una proteína de interés. Se combinan uno o más fragmentos de ADN dadores que codifican la proteína de interés, es decir, IL-21, con un plásmido aceptor, un primer enlazador de ADN, y un segundo enlazador de ADN en una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae mediante lo cual se une el fragmento de ADN dador al plásmido aceptor por recombinación homóloga del ADN dador, el plásmido aceptor y los enlazadores para formar el plásmido circular cerrado.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden sintetizar también con "máquinas de genes" utilizando protocolos, tales como el método de fosforamidita. Si se sintetizan químicamente, se requiere ADN de doble cadena para una aplicación, tal como la síntesis de un gen o un fragmento de gen, a continuación cada cadena complementaria se produce por separado. La producción de genes cortos (60 a 80 pares de bases) es técnicamente sencilla y se puede realizar mediante la síntesis de cadenas complementarias y, a continuación, su hibridación. Para la producción de genes más largos (>300 pares de bases), sin embargo, se requieren estrategias especiales, ya que la eficacia de acoplamiento de cada ciclo durante la síntesis de ADN químico es rara vez del 100%. Para superar este problema, se ensamblan genes sintéticos (doble cadena) en forma modular a partir de fragmentos de cadena única que tienen una longitud de 20 a 100 nucleótidos. Para revisiones sobre la síntesis de polinucleótidos, véase, por ejemplo, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Application of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984), y Climie et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 633 (1990).

Ejemplos de técnicas alternativas que se pueden utilizar para preparar el gen de IL-21 y el vector de expresión incluyen, digestión y ligación con endonucleasas de restricción, y reacción en cadena de la polimerasa, todo ello conocido en la técnica.

Existen una gran variedad de genes marcadores seleccionables (véase, por ejemplo, Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 537 (1990)). Es habitual que los vectores de expresión comprendan marcadores de selección, tales como resistencia a tetraciclina, resistencia a ampicilina, resistencia a kanamicina, resistencia a neomicina, o resistencia a cloramfenicol. Un marcador seleccionable permitirá la selección y/o detección de células que han sido transformadas con el vector de expresión de las células que no han sido transformadas. Un vector de expresión puede portar más de uno de dichos genes de resistencia a antibióticos. Un ejemplo de marcador seleccionable sin resistencia a antibiótico utiliza el sistema hok/sok del plásmido R1. El gen hok codifica la proteína Hok tóxica de 52 aminoácidos y el gen sok codifica un ARN antisentido, que es complementario a la secuencia líder de ARNm de hok. Este marcador seleccionable es conocido por un experto en la material y se describe en más detalle por Gerdes, K. et al., Genetic Engineering 19: 49-61, 1997.

La presente invención comprende una gran variedad de células huésped recombinantes adecuadas e incluyen, pero sin limitación, organismos huésped procariotas gram negativos. Las cepas adecuadas de E. coli incluirán W3110, cepas derivadas de K12, MM294, TG-1, JM-107, BL21, y UT5600. Otras cepas adecuadas incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DHSIF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647, K12 de E. coli, K12 RV308 de E. coli, K12 C600 de E. coli, HB101 de E. coli, K12 C600 R.sub.k- M.sub.k- de E. coli, K12 RR1 de E. coli (véase, por ejemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Otros huéspedes procariotas gram negativos pueden incluir Serratia, Pseudomonas, Caulobacter. Los huéspedes procariotas pueden incluir organismos gram positivos, tales como Bacillus, por ejemplo, B. subtilis y B. thuringienesis, y B. thuringienesis var. israelensis, así como Streptomyces, por ejemplo, S. lividans, S. ambofaciens, S. fradiae, y S. griseofuscus. Las cepas adecuadas de Bacillus subtilus incluyen BR151, YB886, MI119, MI120, y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)). Las técnicas estándar para propagar vectores en huéspedes procariotas son conocidas para los expertos en la material (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)). Para una visión general de cepas deficientes en proteasas en procariotas, véase, Meerman et al., Biotechnology 12: 1107-1110, 1994. La presente invención se ejemplifica utilizando la cepa W3110, que se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) como
ATCC # 27325.

Las técnicas para manipular las moléculas de ADN clonadas e introducir el ADN exógeno en un conjunto de células huésped se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. Las células huésped transformadas o transfectadas se cultivan según los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células huésped elegidas. En la técnica se conocen un conjunto de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, y, en general, incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes, tales como factores de crecimiento o suero, según se requiera. El medio de crecimiento se seleccionará en general para células que contienen el ADN añadido de forma exógena mediante, por ejemplo, la selección de fármacos o la deficiencia en un nutriente esencial que está complementado por el marcador seleccionable transportado en el vector de expresión o contransfectado en la célula huésped. Los cultivos líquidos se proporcionan con suficiente aeración mediante medios convencionales, tales como agitación de matraces pequeños o burbujeo de los fermentadores. Las células transformadas se pueden seleccionar y propagar para proporciona células huésped recombinantes que expresan el gen de interés. IL-21 se puede expresar en E. coli utilizando el sistema de fusión (proteína de unión a maltosa) (New England Biolabs (NEB; Beverly, MA)). En este sistema, el ADNc de IL-21 se une al extremo 3' del gen de malE para formar una proteína de fusión MBP-IL-21. La expresión de la proteína de fusión está dirigida por el promotor tac y está "desconectada" hasta que se induce el promotor mediante la adición de 1 mmol de IPTG (b-tiogalactosilpiranósido de isopropilo). Las construcciones se pueden construir como fusiones en el marco con MBP según el Sitio de Clonación Múltiple (MCS) del vector pMAL-c2 (NEB) y según las especificaciones del fabricante.

Fermentación

En una realización de la presente invención se puede utilizar una fermentación por lotes, particularmente cuando se requiere una producción a gran escala de IL-21 utilizando el sistema de expresión de la presente invención. En general, la fermentación por lotes comprende una primera etapa de preparación de un matraz de siembra mediante el crecimiento de cepas de E. coli que expresan IL-21 en un medio adecuado en el cultivo del matraz de agitación para permitir el crecimiento hasta una densidad óptica (DO) de 5 a 20 a 600 nm. Un medio adecuado contendría nitrógeno de una fuente o fuentes, tales como sulfato de amonio, fosfato de amonio, cloruro de amonio, extracto de levadura, proteínas animales hidrolizadas, proteínas vegetales hidrolizadas o caseínas hidrolizadas. El fosfato su suministrará a partir de fosfato potásico, fosfato amónico, ácido fosfórico o fosfato sódico. Otros componentes serían cloruro de magnesio o sulfato de magnesio, sulfato férrico o cloruro férrico y otros elementos traza. El medio de crecimiento se puede suplementar con carbohidratos, tales como fructosa, glucosa, galactosa, lactosa y glicerol, para mejorar el crecimiento. En ciertas realizaciones, las adiciones de carbohidratos serían glicerol o glucosa añadidos de 1 a 20 g/L medio. En ciertas realizaciones, el glicerol o la glucosa son 5- 10 g/L. El crecimiento se inicia inoculando un matraz de agitación (matraz desviador de 500 ml a 2000 ml) que contiene un medio de crecimiento preferido con E. coli, de un medio agar que contiene antibiótico, por ejemplo kanamicina a 10-50 \mug/ml, en la concentración apropiada o a partir de un cultivo madre congelado. El crecimiento en los matraces de agitación se produce a una temperatura entre 28 y 40ºC. En ciertas realizaciones, los matraces de agitación se desarrollan a una temperatura de 30 a 37ºC. Los matraces se incuban con una agitación fijada a 200 a 300 rpm.

Los recipientes de fermentación se preparan con un medio de crecimiento adecuado y se esterilizan. El pH del medio se ajusta a un pH de 6,5 a 7,5. En ciertas realizaciones, el pH es de 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 ó 7,2. Los recipientes se fijan a los niveles de aeración y agitación más adecuados y se inoculan a partir del cultivo en el matraz de siembra de la primera etapa que se ha desarrollado de 10 a 20 horas y tiene una DO de 5 a 20 a 600 nm. El nivel de inoculación se encuentra entre el 1% y el 12% volumen/volumen (v/v). En ciertas realizaciones, el nivel de inoculación es al 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ó 10% v/v. El nivel de oxígeno disuelto se mantiene por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación, el incremento de la velocidad de aeración, el burbujeo en oxígeno o varias combinaciones. El cultivo crece hasta que la DO 600 alcanza de 2 a 20 unidades DO a 600 nm. A continuación, se añade tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) al cultivo hasta una concentración de 0,1 a 2,0 mM. El IPTG induce al promotor tac a expresar la IL-21. Alternativamente, se puede añadir lactosa en una solución al 30% a 10 g/l a las 24 horas para la inducción. A continuación, el cultivo se deja crecer durante un tiempo adicional entre 2 y 8 horas. En ciertas realizaciones, el cultivo crece durante 3-4 horas.

En otra realización, se utiliza un cultivo de alimentación discontinua para generar un alto rendimiento de proteína IL-21. Las cepas de E. coli productoras de IL-21 crecen en un medio adecuado en el cultivo del matraz de agitación para permitir el crecimiento hasta una DO de 5 a 20 a 600 nm. Un medio adecuado contendría nitrógeno de una fuente o fuentes, tales como sulfato de amonio, fosfato de amonio, cloruro de amonio, extracto de levadura, proteínas animales hidrolizadas, proteínas vegetales hidrolizadas o caseínas hidrolizadas. El fosfato su suministrará a partir de fosfato potásico, fosfato amónico, ácido fosfórico o fosfato sódico. Otros componentes serían cloruro de magnesio o sulfato de magnesio, sulfato férrico o cloruro férrico y otros elementos traza. El medio de crecimiento se puede suplementar con carbohidratos, tales como fructosa, glucosa, galactosa, lactosa y glicerol, para mejorar el crecimiento. En ciertas realizaciones, las adiciones de carbohidratos serían glicerol o glucosa añadidos de 1 a 20 g/L medio. En ciertas realizaciones, el glicerol o la glucosa son 5-10 g/L. El crecimiento se inicia inoculando un matraz de agitación (matraz desviador de 500 ml a 2000 ml) que contiene un medio de crecimiento preferido con E. coli, de un medio agar que contiene antibiótico, por ejemplo kanamicina a 10-50 \mug/ml, en la concentración apropiada o a partir de un cultivo madre congelado. El crecimiento en los matraces de agitación se produce a una temperatura entre 28 y 40ºC. En ciertas realizaciones, la temperatura de crecimiento es de 30 a 37ºC. Los matraces se incuban con una agitación fijada a 200 a 300 rpm.

Se prepara un recipiente para la segunda fase con un medio de crecimiento adecuado y se esteriliza. Un medio adecuado sería, por ejemplo, Super Broth II (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ), APS-Super Broth, Luria Broth, o ZSM (véase, Tablas 1-4) y kanamicina. El medio de crecimiento se puede suplementar con carbohidratos para mejorar el crecimiento. Ciertas realizaciones proporcionan adiciones de carbohidratos que añaden glicerol o glucosa de 1 a 40 g/L medio. En una realización, el glicerol o glucosa es 5- 10 g/L. El pH del medio se ajusta a un pH de 6,5 a 7,5. En ciertas realizaciones, el pH es 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 ó 7.2. Los recipientes se fijan a los niveles de aeración y agitación más adecuados. Se inicia el crecimiento inoculando el recipiente a partir del cultivo en el matraz de siembra de la primera etapa que se ha desarrollado de 10 a 20 horas y tiene una DO de 5 a 20 a 600 nm. El nivel de inoculación se encuentra entre el 1% y el 12% v/v. En ciertas realizaciones, el nivel de inoculación es al 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ó 10% v/v. El nivel de oxígeno disuelto se mantiene por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación, el incremento de la velocidad de aeración, el burbujeo en oxígeno o varias combinaciones de los mismos.

Los recipientes de fermentación se preparan con un medio de crecimiento adecuado (tal como se ha descrito anteriormente) y se esterilizan. El pH del medio se ajusta a un pH entre 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 ó 7,2. En una realización, el medio se ajusta a pH 6,8. El medio de crecimiento se puede suplementar con carbohidratos para mejorar el crecimiento. En algunas realizaciones, las adiciones de carbohidratos serían glicerol o glucosa añadidos de 5 a 40 g/L medio con ciertas realizaciones con glicerol o glucosa a 15-20 g/L. Los recipientes se fijan a los niveles de aeración y agitación más adecuados y se inoculan a partir del cultivo en el matraz de siembra de la primera etapa que se ha desarrollado de 10 a 20 horas y tiene una DO de 5 a 20 a 600 nm. El nivel de inoculación se encuentra entre el 1% y el 12% v/v. En ciertas realizaciones, el nivel de inoculación es al 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ó 10% v/v. El nivel de oxígeno disuelto se mantiene por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación, el incremento de la velocidad de aeración, el burbujeo en oxígeno o varias combinaciones de los mismos.

Se introduce una solución de carbohidratos en el fermentador a una velocidad predeterminada empezando al inicio del desarrollo de la fermentación, pero, en general, después de un tiempo de fermentación transcurrido (EFT) de 6 horas y no más allá de un EFT de 12 horas. Se continúa con la alimentación hasta el final de la fermentación. La solución de alimentación puede ser glicerol preparado al 40-70% v/v o glucosa preparada al 40-70% peso/volumen (p/v). En ciertas realizaciones, se preparan glicerol o glucosa al 70% v/v en glicerol y 60% p/v en glucosa. Las velocidades de alimentación pueden variar entre 5-15 gramos de glucosa o glicerol por litro por hora. En una realización, la velocidad de alimentación es 8, 9 ó 10 g/L/h. En un EFT de 20 a 30 horas, por ejemplo 24 horas, se añade IPTG al cultivo hasta una concentración de 0,5 a 2 mM. Alternativamente, se puede añadir lactosa en una solución al 30% a 10 g/l a las 24 horas para la inducción. A un EFT de 48 a 56 horas, se recoge la fermentación. Alternativamente, se añaden 0,5 a 2 mmol/L adicionales de IPTG al cultivo del fermentador. A continuación, se recoge la fermentación a un EFT de 52 a 56 horas.

Al final del desarrollo de la fermentación, se ajusta la temperatura de forma descendente desde 4º a 20ºC, y el pH se mantiene o se ajusta de 5,0 a 9,0. En ciertas realizaciones, el intervalo es 6,0 a 8,0 unidades de pH. El caldo de fermentación se recoge mediante la sobre-despresurización del recipiente y la recogida del caldo a través de la salida de muestras. Alternativamente, el caldo se puede bombear a través de una de las salidas de muestras. El caldo de fermentación puede contener de 10%- 30% p/v de sólidos.

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Recuperación de IL-21

Después de la fermentación, las células se recogen mediante centrifugación, se resuspenden en tampón de homogeneización y se homogenizan, por ejemplo, en un homogenizador APV-Gaulin (Invensys APV, Tonawanda, Nueva York) u otro tipo de dispositivo de destrucción celular, tal como molinos de bolas y sonicadores. Alternativamente, las células se toman directamente del fermentador y se homogenizan en un homogenizador APV-Gaulin. Alternativamente, el caldo de fermentación se puede diluir con agua o tampón antes de la homogenización.

En una realización, las células se homogenizan directamente en el caldo de fermentación. Por ejemplo, se enfrían un homogeneizador APV-Gaulin 1000 o APV- Gaulin 2000 hasta 4º-15ºC durante por lo menos 30 minutos. Se pasa el caldo de fermentación a través del homogeneizador y se recoge la suspensión celular. La presión del homogeneizador debe fijarse desde 6000 a 14.000 psi para la destrucción celular máxima. En una realización, la presión se fija para 10.000 psi. La suspensión se pasa a través del homogeneizador entre 1-5 veces, por ejemplo, para 3 pases. En otra realización, el caldo se diluye con un volumen igual de agua antes de la homogenización. La cantidad de ADN se puede disminuir mediante la adición de PEI, espermina o benzonasa durante o después de la etapa de homogenización.

El homogenato se centrifuga y se obtiene el residuo que contiene los cuerpos de inclusión después de decantar el sobrenadante. El residuo con los cuerpos de inclusión se lava en agua o tampones Tris con o sin niveles variantes de los siguientes compuestos: cloruro sódico, urea, Triton X-100, cloruro de zinc, lauril sulfato sódico, sacarosa.

En otra realización, las células se recogen mediante la transferencia del caldo de fermentación a las botellas de centrífuga y la centrifugación a 2-8ºC durante 20-60 minutos. Por ejemplo, se puede utilizar una centrífuga Beckman J6MI con rotor KompSpin KAJ7.100 rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) a 7500 x G para recoger las células. También se pueden utilizar una centrífuga Beckman Avanti JHC con un rotor de ángulo fijo Beckman JLA-8.1
(8.000-15.800 x G) o un rotor Aries JS 5.0 Swinging Bucket con botellas de 2,25 L a 7500 X G. También se puede utilizar una centrífuga continua, tal como las suministradas por Carr Separations, Inc. (Franklin, MA) o Westfalia Separator, Inc. (Northvale, NJ).

El caldo de cultivo o sobrenadante se elimina de las botellas de centrífuga. Los residuos celulares se resuspenden en tampón de homogenización (100 mM Tris, 5 mM ZnCl_{2}, pH 7,5) a 10-30% p/v de sólidos. El caldo de fermentación se pasa a través del homogenizador APV-Gaulin y se recoge la suspensión celular. La presión de homogenizador debe fijarse a 6000-14.000 psi para la destrucción celular máxima. En una realización, la presión es 10.000 psi. La suspensión se pasa a través del homogeneizador para 1-5 pases, por ejemplo, para 3 pases.

Adicionalmente, los métodos de recuperación de IL-21 pueden comprender una etapa adicional de precipitación, lavado y resolubilización del IL-21. Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizan en guanidina 6 M o urea 8 M, se diluyen 6-10 veces en agua o tampón, se incuban 30 minutos, y se centrifugan o filtran. Alternativamente, se pueden utilizar ultrafiltración o macrofiltración para lavar los cuerpos de inclusión después de la homogenización. El precipitado resultante se lava en urea 2-6 M y contiene la proteína IL-21. A continuación, se lava el precipitado con agua antes de la solubilización. Se pueden añadir Al^{3+} o Fe^{3+} o polímeros aniónicos y catiónicos o agentes, tales como espermina, PEI y benzonasa, para precipitar debris celular, proteínas solubles, ADN, ARN y carbohidratos.

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Solubilización de cuerpos de inclusión

El preparado de cuerpos de inclusión lavados se puede solubilizar utilizando clorhidrato de guanidina (5-8 M), tiocianato de guanidina (5-6 M), o urea (7-8 M) que contienen un agente reductor, tal como beta mercaptoetanol
(10-100 mM), o ditiotreitol (5-50 mM). Las soluciones se pueden preparar en Tris, fosfato, HEPES u otros tampones apropiados. Los cuerpos de inclusión también se pueden solubilizar con urea (2-4 M) que contiene lauril sulfato sódico (0,1-2%). Los cuerpos de inclusión de 1 litro de caldo de fermentación se puede solubilizar utilizando 50 - 200 ml de las soluciones descritas. El método proporciona solubilizar los residuos de los cuerpos de inclusión de 1 litro de caldo de fermentación en 150 ml de GuHCl 6 M preparado en Tris 100 mM, pH 8,0, que contiene 40 mM de DTT. En otra realización, se mezcla una emulsión de cuerpos de inclusión con 50-100 ml de GuHCl 8 M. La emulsión se resuspende mezclando con una espátula seguido de la homogenización con un homogenizador Omni EZ (Omni International, Warrenton, VA) o mezclando con un dispositivo mecánico. La suspensión se mezcla durante 30 - 120 minutos, a 3-37ºC. En una realización, la suspensión se mezcla a 15-25ºC, para finalizar el proceso de solubilización. A continuación, la muestra se centrífuga a 7.500 - 16.000 x G a 4ºC durante 10-30 minutos utilizando una centrífuga adecuada. La muestra de sobrenadante que contiene el IL-21 solubilizado se decanta y se retiene.

La concentración de la IL-21 en la fracción solubilizada se determina mediante HPLC de fase inversa. Se utiliza una columna Jupiter C5 (Phenomenex, Torrance, CA) con acetonitrilo/ácido trifluoroacético como fase móvil. Se diluye un patrón de IL-21 en un tampón que contiene guanidina/DTT/Tris y se inyectan cantidades diferentes en la columna. El área bajo el pico de IL-21 se utiliza para construir una curva de patrones. La muestra de IL-21 solubilizada se microfuga para eliminar las partículas antes de la inyección en la columna de HPLC. La determinación del área bajo el pico de IL-21 permite la cuantificación de la concentración de IL-21 a partir de la curva de patrones.

Adicionalmente, la IL-21 solubilizada se puede purificar en esta etapa utilizando una filtración de flujo tangencial, HPLC de fase inversa o cromatografía de afinidad de metal inmovilizado.

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Repliegue

En un aspecto de la presente invención, en el proceso para recuperar IL-1 purificada a partir de cepas huésped de E. coli transformadas en las que se expresa IL-21 como cuerpos de inclusión refráctiles, las células se rompen y se recuperan los cuerpos de inclusión mediante centrifugación.

A continuación, los cuerpos de inclusión se solubilizan y desnaturalizan en clorhidrato de guanidina 6 M que contiene un agente reductor. A continuación, la IL-21 reducida se oxida en una etapa de renaturalización controlada. Esta etapa implica la dilución en un tampón de repliegue que contiene clorhidrato de arginina, sales y un sistema de retirada de óxido. El sistema de retirada de óxido se utiliza para iniciar la unión de puentes disulfuro de la molécula de IL-21 y se basa en mezclas de moléculas reducidas y oxidadas, tales como cisteína y cistina, DTT y cistina, glutatión reducido y glutatión oxidado y DTT y glutatión oxidado. La proporción de glutatión reducido con respecto a glutatión oxidado puede variar desde 1:1 a 6:1 con un intervalo de concentraciones de 0,5 y 8 mM. En una realización, la concentración óptima es glutatión reducida 4 mM: glutatión oxidado 2 mM. La proporción de cisteína con respecto a cistina puede variar desde 2:1 a 1:1 con un intervalo de concentraciones de 4 mM a 1mM de cualquiera de los reactivos. En una realización, la concentración óptima es 4 mM de cisteína, con 2 mM de cistina. El repliegue óptimo también se puede conseguir utilizando 4 mM de cistina y 2 mM de DTT que forman 4 mM de cisteína y 2 mM de cistina. El repliegue también se puede realizar mediante sulfitolisis en presencia de reactivos, tales como sulfito de sodio y tetrationato de sodio. La IL-21 renaturalizada se captura del tampón de repliegue diluido utilizando la cromatografía de intercambio catiónico y se purifica utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento.

El soluto que contiene IL-21 se añade rápidamente (1-5 minutos) o lentamente (0,5-5 horas) al tampón de repliegue mediante mezclado. El tampón de repliegue contiene arginina (0,5 a 1,25 M), PEG y sales. Se puede incluir también glicerol, guanidina HCl, urea, EDTA, inhibidores de proteasas y chaperones, alcohol, detergentes, glicerol y sulfato de cobre. La IL-21 se puede añadir en una adición, en múltiples adiciones, o se suministra con el tiempo. La IL-21 se añade a la mezcla de repliegue hasta una concentración final de 0,05 a 1,2 mg/ml. El intervalo de temperaturas es de 4-30ºC. El pH es de 7,3 a 8,5. El recipiente que contiene la mezcla de repliegue se deja abierto a la atmósfera o se puede burbujear con aire o nitrógeno durante la renaturalización. El repliegue se deja que tenga lugar de 1 a 26
horas.

El repliegue también se puede realizar en presencia de EDTA para disminuir la oxidación de metionina o en una columna de exclusión de tamaño, o utilizando un filtración de flujo tangencial, o electrodiálisis.

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Depuración y concentración de IL-21 replegada

La IL-21 replegada se ajusta hasta un pH 5,5 y, a continuación, se pasa a través de un filtro de 1,2 \mum para depuración y eliminación de proteína insoluble. La solución filtrada se concentra 10-30 veces utilizando filtración de flujo tangencial en un sistema de placa y marco o con un cartucho de fibra hueca. A continuación, el concentrado se diluye 3-10 veces con tampón o agua para permitir la precipitación de proteínas no plegadas y agregadas. A continuación, se pasa la solución a través de un filtro para la depuración y eliminación de proteínas insolubles.

Alternativamente, la IL-21 replegada se diluye de 2 a 10 veces en agua o acetato de sodio 25 mM, pH 5,5. Se forma un precipitado o floculante y, después de aproximadamente 30 minutos a 5 cinco horas, se eliminan mediante filtración. Para eliminar el floculante se puede utilizar un filtro nominal de 1,2 \mum seguido de un filtro nominal de 0,45 \mum, o un filtro de profundidad con un potencial zeta positivo. Sería posible utilizar otros filtros, tales como un filtro de densidad graduada. También es posible utilizar centrifugación o microfiltración para eliminar el floculante.

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Captura de IL-21

En otro aspecto de la presente invención, después de que se repliegue y se concentre IL-21, los métodos de la presente invención comprenden la captura de la proteína IL-21 replegada en tampón diluido o una columna de intercambio catiónico y la purificación de proteína IL-21 utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento.

La etapa de captura se diseña para capturar la IL-21 plegada diluida y para llevar a cabo la purificación inicial. Con el fin de que IL-21 se una a la columna, se lleva a cabo en primer lugar una dilución. La IL-21 diluida y depurada se captura en una columna de intercambio catiónico a pH 5,5. Habitualmente, se utiliza SP Sepharose XL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) o TOYOPEARL SP 550C (Tosoh Biosep, Montgomery, PA). El tampón de equilibrio es acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 0,2 a 0,45 M, pH 5,5, y la IL-21 unida se eluye con un gradiente creciente de sales. La IL-21 se eluye de la SP Sepharose XL con cloruro sódico aproximadamente 0,6 M y de la TOYOPEARL SP 550C con cloruro sódico aproximadamente 0,8 M.

También se puede utilizar cromatografía de lecho expandido para la captura de IL-21 después del replegado. En este caso, la etapa de dilución se lleva a cabo en línea a la vez que se carga la IL-21 en la columna. La Streamline SP XL (Amersham Biosciences) se equilibra con acetato de sodio 25 mM, 0,2 M de NaCl, pH 5,5. A continuación, la IL-21 se carga en modo de flujo ascendente en la resina Streamline SP XL equilibrada, que se mantiene en dos veces la altura del lecho establecido, diluyendo 1:3 en línea con agua. Después del lavado en los modos de flujo ascendente y flujo descendente, la IL-21 se eluye en modo de flujo descendente con una etapa de NaCl 0,6 M o un gradiente de NaCl.

Los métodos de la presente invención proporcionan el uso de muchas resinas de intercambio catiónico diferentes para esta etapa, incluyendo intercambiadores catiónicos débiles, tales como carboximetilo, diferentes tipos de soportes, tales como agarosa o celulosa, y tamaños de partículas diferentes. Los métodos de la presente invención también pueden proporcionar el uso de las columnas a diferentes pH en el intervalo de 5,0 a 7,0, y con diferentes tampones y sales. Alternativamente, para capturar la IL-21 replegada se pueden utilizar otros métodos cromatográficos, tales como interacción hidrofóbica, intercambio aniónico y quelatos metálicos.

Purificación

En un aspecto de la presente invención, existe una purificación intermedia de la proteína IL-21. Esta etapa se diseña para conseguir una mayor purificación de la IL-21 utilizando la cromatografía de interacción hidrofóbica. Habitualmente se utilizan en esta etapa resinas Butyl Sepharose FF (Amersham Biosciences) o TOYOPEARL butyl 650M (Tosoh Biosep). La resina se equilibra con acetato de sodio 25 mM, NaCl 50 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,5 M, pH 5,5. La IL-21 que se ha purificado mediante cromatografía de intercambio catiónico se ajusta a (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,5 M y, a continuación, se pasa a través de un filtro nominal de 0,45 \mum. La IL-21 ajustada y filtrada se carga a a continuación en la resina equilibrada, que a continuación se lava con el tampón de equilibrio para eliminar la proteína no unida. La IL-21 se eluye con un gradiente hasta acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 50 mM, pH 5,5. La IL-21 se eluye de la columna a (NH_{4})_{2}SO_{4} de aproximadamente 0,75 M a 0,3 M.

Otras resinas de cromatografía de interacción hidrofóbica que se pueden utilizar para esta etapa incluyen, por ejemplo, aquellas sustituidas con fenilo o hexilo, diferentes tipos de soportes sólidos, tales como agarosa o celulosa, y tamaños de partículas diferentes. La presente invención también proporciona el uso de las columnas a diferentes pH en el intervalo de 5,0 a 9,0 y con diferentes tampones y sales. La presente invención también proporciona el uso de la columna, de manera que no se una la IL-21.

La IL-21 se purifica adicionalmente mediante cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento. Habitualmente, la IL-21 se diluye hasta una conductividad de 30 ms/cm, se ajusta el pH a 6,0 con fosfato dibásico 0,5 M y se carga en una columna de Sepharose SP HP (Amersham Biosciences). La columna se equilibra con fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 0,3 M, pH 6,0. Se lava con tampón de equilibrio y, a continuación, se eluye la Il-21 con un gradiente de cloruro de sodio. La presente invención también proporciona el uso de otras resinas de intercambio catiónico de alto rendimiento. Las columnas se pueden utilizar a diferentes valores de pH en el intervalo de 5,0 a 7,5 con diferentes tampones, tales como fosfato. El material de carga se puede diluir con agua o tampón hasta valores de conductividad en el intervalo de 5 a 35 ms/cm.

Los métodos para purificar IL-21 puede comprender concentrar y llevar a cabo un intercambio en tampón de la proteína. Esta etapa se diseña para concentrar el eluato de la columna de intercambio catiónico de alto rendimiento y se intercambia en el tampón de formulación. El conjunto de eluatos finales de la columna se concentra aproximadamente 10 veces utilizando una membrana de placa y marco para la filtración de flujo tangencial de corte de peso molecular de 5 kDa, se diafiltra frente a solución salina tamponada con fosfato, pH 6,0, o frente a histidina 10 mM, manitol 4,72% (p/v), pH 5,0, 5,1, 5,2 ó 5,3, a continuación se concentra una segunda vez para aumentar más la concentración de
IL-21.

Se pueden utilizar otras membranas, tales como una membrana de placa y marco de corte de peso molecular de 3 kDa u 8 kDa o un sistema de fibra hueca de corte de pedo molecular de 10 kDa para conseguir esta etapa de ultrafiltración/diafiltración. La pureza de la IL-21 tras la cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento es de por lo menos un 95%, y habitualmente superior a un 98%, mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico y poliacrilamida. El nivel de endotoxina en la preparación de IL-21 tras la captura por cromatografía de intercambio catiónico, la purificación por cromatografía de interacción hidrofóbica, y el intercambio de tampones, es generalmente inferior a 10 unidades de endotoxina por mg de proteína IL-21, y habitualmente inferior a 2 unidades de endotoxina por mg de proteína IL-21. El nivel de endotoxina tras la cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento es generalmente inferior a 1 unidad de endotoxina por mg de IL-21.

El análisis del material producido utilizando Streamline SP XL y butyl Sepharose FF (sin la concentración de 20 veces previa a la cromatografía de intercambio catiónico) mostró que los agregados eran inferiores al 0,2% mediante HPLC de exclusión de tamaño, la heterogeneidad de la carga mediante HPLC de intercambio catiónico es de aproximadamente el 10% y la medición de la pureza mediante HPLC de fase inversa es de aproximadamente el 90%. El análisis del material producido utilizando Toyopearl SP 550C, Toyopearl butyl 650 M y Separose SP HP mostró que los agregados son inferiores al 2% mediante HPLC de exclusión de tamaño, pureza mediante HPLC de fase inversa es de aproximadamente el 90% y la medición de la heterogeneidad de la carga mediante HPLC de intercambio catiónico es de aproximadamente del 4%.

Se puede desear una purificación adicional de IL-21 para eliminar las impurezas y contaminantes restantes. Por ejemplo, se puede utilizar una columna de intercambio aniónico para reducir el nivel de endotoxina. La IL-21 se diluye hasta un nivel de conductividad inferior a 10 mS/cm y el pH se ajusta a 8,0. Se aplica a una columna Q Sepharose FF (Amersham Biosciences) que ha sido equilibrada a Tris 20 mM, pH 8,0. La IL-21 se pasa a través de la columna y tiene una reducción en la endotoxina de aproximadamente el 80% en comparación con la carga. También se pueden utilizar membranas Mustang Q o Mustang E (Pall, Port Washington, NY) para reducir los niveles de endotoxina ente pH 5,0 y 9,0.

Otras etapas de purificación que potencialmente se podrían utilizar para purificar adicionalmente IL-21 incluyen cromatografía con quelatos metálicos, cromatografía de intercambio aniónico, o cromatografía de interacción hidrofóbica en una columna de fenilo. También es posible llevar a cabo una purificación antes del repliegue de la IL-21 utilizando, por ejemplo, HPLC de fase inversa, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de quelatos metálicos. De este modo, la presente invención también proporciona métodos que comprenden las etapas adicionales de purificación descritas en la presente invención.

Caracterización de IL-21 purificada

BaF3 es una línea celular prelinfoide dependiente de la interleuquina-3 (IL-3) derivada de médula ósea murina (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). Las células BaF3 que expresan el receptor de IL-21 de longitud completa se han construido tal como se describe por complete en la Patente de Estados Unidos No. 6.307.024. Se puede utilizar esta línea celular que es dependiente del mecanismo unido al receptor de IL-21 para la supervivencia y el cultivo de la línea celular en ausencia de otros factores de crecimiento para analizar la IL-21 biológicamente activa. La proliferación de las células BaF3/IL-21R se puede evaluar mediante la utilización de varias diluciones de proteína IL-21 purificada que se añaden a las células y la comparación del crecimiento de las células tratadas con el crecimiento de las células desarrolladas en ausencia de proteína IL-21.

Los ensayos que miden la proliferación o diferenciación celular son conocidos en la técnica. Por ejemplo, entre lo ensayos que miden la proliferación se incluyen, ensayos tales como quimiosensibilidad a un colorante rojo neutro (Cavanaugh et al., Investigation) New Drugs 8: 347-354, 1990), incorporación de nucleótidos radiomarcados (Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989), la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en el AND de las células proliferantes (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985), y el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5: 69-84, 1995; y Scudiero et al., Cancer Res. 48: 4827- 4833, 1988).

Entre los ensayos que miden la diferenciación se incluyen, por ejemplo, la medición de marcadores de la superficie celular asociada con la expresión específica de etapa de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989). La IL-21 producida mediante los métodos descritos en la presente invención es capaz de estimular la proliferación de células BaF3/IL-21Rs.

La IL-21 purificada se puede caracterizar mediante un conjunto de métodos físicos. De manera óptima, el análisis de aminoácidos indica que la composición de aminoácidos de todos los residuos se encuentra en el 10% de los valores esperados. La secuenciación N-terminal muestra una única secuencia que empieza con metionina y que corresponde con la secuencia prevista a partir del vector de expresión de IL-21. El análisis de la masa total utilizando espectrometría de masas muestra un valor que se encuentra en el 0,01% de la masa prevista de IL-21 (15593.84 Da). La digestión con endoproteinasa Lys C seguido de cromatografía líquida-espectrometría de masas se puede utilizar para generar un mapa peptídico en el que todos los picos corresponden en masa a los péptidos trípticos previstos en IL-21, y en el que se identifican todos los péptidos trípticos previstos de IL-21. El mapeo peptídico también indica puentes disulfuro en concordancia con lo previsto para una proteína que es miembro de la familia de IL-2, así como en ausencia de oxidación de metionina.

Formulación

El pH se seleccionó para minimizar la degradación observada mediante SE- HPLC (formación de dímero soluble, pérdida de contenido), CIE-HPLC (desamidación aparente) y RP-HPLc (oxidación y degradación mediante mecanismos aún por identificar). En ciertas realizaciones, el intervalo de pH es 5,0-5,6 utilizando un tampón de histidina en base a la capacidad del tampón, estabilidad y compatibilidad de la administración parenteral. Alternativamente, se pueden utilizar tampones de citrato o succinato. En una realización, se seleccionó manitol como ajustador de la tonicidad (solución isotónica) en base a la estabilidad, y la compatibilidad con la liofilización. En otras realizaciones, se puede utilizar sorbitol o glicina. Se puede utilizar NaCl, peo puede ser menos estable. Se pueden utilizar trehalosa o sacarosa, pero se pueden hidrolizar potencialmente bajo estas condiciones ligeramente ácidas. Sin embargo, las formulaciones pueden incluir de 1 mg/ml a 100 mg/ml de IL-21 en la formulación. En una realización, la proteína IL-21 se formula en una concentración de 10 mg/mL de IL-21 en histidina 10 mM, manitol al 4,7% p/v, pH 5,3. El producto se almacenó congelado a -20C. La determinación de si un producto en solución es viable depende de los límites específicos que se estimen aceptables, y los expertos en la materia definirán los límites para maximizar la recuperación de producto, minimizar la agregación, minimizar la heterogeneidad de la carga, minimizar las impurezas y mantener la actividad biológica aceptable. Cuando se establecieron los límites de menos del 3% de dímero (peso molecular elevado), más del 90% de pureza mediante CIE y RP-HPLC y más del 90% de marcaje del contenido, un producto en solución refrigerado era estable y se consideró una alternativa razonable. Las dosis de IL-21 entre 0,1 y 3 mg/kg no superarán en general los 30 ml para la administración por bolo IV.

Se puede preparar también un producto liofilizado y se encontraría dentro del alcance de la presente invención. También se pueden incluir otros excipientes en las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, entre los excipientes aceptables se incluyen disacáridos, tales como trehalosa y sacarosa a 0,5% hasta 10% como estabilizantes; polietilenglicol a 0,001% hasta 0,1% como estabilizante o agente humectante; tensoactivos, tales como tween 20, tween 80 o triton-X-100 a 0,001% hasta 0,1% como estabilizante o agente humectante; u otros agentes de relleno, tales como glicina, hidroxietil almidón en el intervalo de 0,5% a 5%.

Los estudios de estabilidad se pueden realizar bajo condiciones aceleradas, tales como un almacenamiento a temperatura elevada de 25ºC a 45ºC o agitación. Por ejemplo, se realizaron ciclos de congelación-descongelación, mostrándose que la formulación de IL-21 era estable a concentraciones de 20 mg/ml. En una realización, se utiliza el pH de 5,25 para reducir las velocidades de degradación. Sin embargo, un intervalo de pH óptimo para el producto liofilizado es de 4,75 a 7,5, con productos no liofilizados en el intervalo de pH de 5 a 5,6.

En las composiciones de la presente invención también se pueden incluir uno o más conservantes, particularmente en las composiciones empaquetadas para un uso múltiple. Los conservantes que se pueden utilizar en la presente invención incluyen los utilizados habitualmente en preparaciones farmacéuticas, tales como metilparaben, propilparaben, bencil alcohol, m-cresol, mercuritiosalicilato de etilo, fenol, timerosal y similares.

Las composiciones de IL-21 destinadas al uso farmacéutico serán estériles y libres de pirógenos y se fabricarán y envasarán según los procedimientos farmacéuticos aceptados. Las composiciones se pueden envasar en cantidades de dosificación unitaria o múltiple. Las composiciones se envasarán habitualmente en viales de vidrio sellados con tapones recubiertos de politetrafluoroetileno y con un etiquetado adecuado. Las composiciones liofilizadas se pueden envasar como un kit que incluye una cantidad apropiada de un diluyente adecuado, tal como agua para inyección (WFI) o dextrosa al 5% en WFI.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión pTAP237

El plásmido pTAP237 se generó mediante la inserción de un enlazador generado por PCR en el sitio SmaI de pTAP186 mediante recombinación homóloga. El plásmido pTAP186 se derivó de los plásmidos pRS316 (un vector lanzadera de Saccharomyces cerevisiae) y pMAL-c2, un plásmido de expresión de E. coli derivado de pKK223-3 y que comprende el promotor tac y el terminador rrnB. El plásmido pTAP186 contiene un gen de resistencia a kanamicina en el que el sitio SmaI ha sido destruido y tiene los sitios NotI y SfiI que flanquean las secuencias ARS-CEN6 y URA3 de levadura, facilitando su eliminación del plásmido mediante digestión con NotI. El enlazador generado por PCR sustituyó la secuencia acopladora de expresión en pTAP186 con la secuencia RBS II sintética. Se preparó a partir de 100 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos zc29.740 y zc29.741, tal como se muestra en las SEC ID NOS: 3 y 4, respectivamente, y aproximadamente 5 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos zc29.736 y zc29.738, tal como se muestran en las SEC ID NOS: 5 y 6, respectivamente. Estos oligonucleótidos se combinaron mediante PCR durante diez ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 30 segundos, seguido de inmersión a 4ºC. Los productos resultantes de la PCR se concentraron mediante precipitación con dos veces el volumen de etanol al 100%. El residuo se resuspendió en 10 \muL de agua a utilizar para recombinarse en el vector receptor pTAP186 digerido con SmaI para producir la construcción que contenía la secuencia RBS II sintética. Se mezclaron juntos aproximadamente 1 \mug del enlazador generado por PCR y 100 ng de pTAP186 digerido con SmaI y se transformaron en células de levadura competentes (S. cerevisiae). A continuación, se puso la levadura en placas -URA D y se dejó a temperatura ambiente durante aproximadamente 72 horas. A continuación, los transformantes Ura+ de una única placa se resuspendieron en 1 ml de H_{2}O y se giraron brevemente para obtener residuos de células de levadura. El residuo celular se resuspendió en 0,5 ml de tampón de lisis. El ADN se recuperó y se transformó en E. coli MC1061. Los clones se cribaron mediante PCR de colonias tal como se ha descrito anteriormente utilizando 20 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos zc29.740 y zc29.741, tal como se muestra en las SEC ID NOS: 3 y 4, respectivamente. Los clones que expresaban la banda de tamaño correcta en un gel de agarosa se sometieron al análisis de secuencia. El plásmido correcto se designó como pTAP237.

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Ejemplo 2 Construcción de pTAP252

La secuencia codificante de IL-21 humana (tal como se muestra en la SEC ID No. 1) se generó mediante amplificación por PCR utilizando un conjunto de bibliotecas de ADNc de CD3+ como molde y cebadores de oligonucleótidos zc29.084 y zc22.127 (SEC ID NOS: 7 y 8, respectivamente). Para optimizar el proceso de traducción en E. coli, el cebador zc29.084 (SEC ID NO: 7) añadió un codón de iniciación ATG en el extremo 5' de la secuencia codificante de IL-21. La secuencia génica resultante codificaba la IL-21 madura con una metionina extra en el extremo N- terminal (IL-21met). El producto PCR final se insertó en el vector de expresión pTAP237 (descrito en el Ejemplo 1) mediante recombinación homóloga de levadura (Raymond et al., Biotechniques. 26 (1): 134-8,140-1,1999; Patente de Estados Unidos 6.027.442). La construcción de expresión, pTAP252, se extrajo de la levadura y se transformó en E. coli MC1061 competente. Los clones resistentes a kanamicina se identificaron mediante PCR de colonia. Un clon positivo se verificó mediante secuenciación y posteriormente se transformó en las cepas huésped de producción E104 o UT5600.

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Ejemplo 3 Optimización de Codón

La inducción de la expresión de IL-21met humana de pTAP252 produjo aproximadamente 2-5% de la proteína celular total en la cepa E104 de E. coli. El examen de los codones utilizados en la secuencia codificante de IL-21 indicó que contenía un exceso de los codones utilizados menos frecuentemente en E. coli con un calor de CAI igual a 0,181. El CAI es una medida estadística de la tendencia a codones sinónimos y se puede utilizar para predecir el nivel de producción de proteína (Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15 (3): 1281-95, 1987). Los genes que codifican proteínas altamente expresadas tienden a tener valores de CAI elevados (> 0,6), mientras que proteínas codificadas por genes con valores de CAI bajos (< 0,2) se expresan en general de manera ineficaz. Esto sugirió una razón para la escasa producción de IL-21 en E. coli. Adicionalmente, los codones raros se agrupan en la segunda mitad del mensaje que conducen a una mayor probabilidad de pérdida transcripcional, terminación prematura de la traducción y una incorporación defectuosa de aminoácidos (Kane JF. Curr. Opin. Biotechnol. 6 (5): 494-500, 1995).

Se ha observado que el nivel de expresión de proteínas cuyos genes contienen codones raros puede aumentar espectacularmente cuando se aumenta el nivel de ciertos ARNts raros en el huésped (Zdanovsky et al., ibid., 2000; Calderone et al., ibid., 1996; Kleber-Janke et al., ibid, 2000; You et al,. ibid, 1999). El plásmido pRARE transporta genes que codifican los ARNts para diversos codones que son raramente utilizados en E. coli (argU, argW, leuW, proL, ileX y glyT). Los genes se encuentran bajo el control de sus promotores nativos (Novy, ibid.). La coexpresión con pRARE aumentó la producción de IL-21met en E. coli en aproximadamente 5-10 veces. La coexpresión con pRARE también disminuyó el nivel de IL-21met truncado en el lisado de E. coli. Estos datos sugieren que la resíntesis del gen que codifica para IL-21met con el uso de codones más apropiados proporciona un vector mejorado para la expresión de grandes cantidades de It-21.

La secuencia codificante de IL-21met optimizada en los codones se construyó a partir de dieciséis oligonucleótidos solapantes: zc22.913 (SEC ID NO: 9), zc22.914 (SEC ID NO: 10), zc22.915 (SEC ID NO: 11), zc22.916 (SEC ID NO: 12), zc22.961 (SEC ID NO: 13), zc22962 (SEC ID NO: 14), zc22.963 (SEC ID NO: 15), zc22.964 (SEC ID NO: 16), zc22.965 (SEC ID NO-:17), zc22.966 (SEC ID NO: 18), zc22.968 (SEC ID NO: 20), zc22.969 (SEC ID NO: 21), zc22.967 (SEC ID NO: 19), zc22.970 (SEC ID NO: 22), zc22.971 (SEC ID NO: 23), y zc22.972 (SEC ID NO: 24). La extensión de los cebadores de estos oligonucleótidos solapantes mediante amplificación por PCR produjo un gen de IL-21met de longitud completa con codones optimizados para la expresión en E. coli. El producto final de la PCR se insertó en el vector de expresión pTAP168 mediante recombinación homóloga de la levadura. La construcción de expresión se extrajo de levadura y se transformó en E. coli MC1061 competente. Los clones resistentes a kanamicina se identificaron mediante PCR de colonias. Un clon positivo se verificó mediante secuenciación y posteriormente se transformó en las cepas huésped de producción E104 o UT5600. El vector de expresión con la secuencia de IL-21met optimizada se denominó pTAP196. El producto final de PCR se introdujo en el vector pTAP168 para la expresión bajo el control del promotor Tac. Sin embargo, la expresión fue muy baja y el producto sólo se pudo detectar mediante análisis Western utilizando anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-21 como sonda.

El examen de la estructura secundaria del mensaje de IL-21met reveló una estructura en orquilla excepcionalmente estable en la región entre las bases 36 y 64 (SEC ID No. 1). Se sospechó que este elemento estructural evitaba una traducción eficaz del mensaje de IL-21met. Por lo tanto, se generó una secuencia codificante de IL-21met híbrida mediante PCR solapante. Se generó un fragmento que contiene las primeras ochenta bases de la secuencia de IL-21met no optimizada mediante amplificación por PCR utilizando pTAP252 como molde y los cebadores de oligonucleótidos zc29.740 (SEC ID NO: 3) y zc40.133 (SEC ID NO: 25). La región optimizada de IL-21met de las bases 81 a 405 (SEC ID NO: 27) se generó mediante amplificación por PCR utilizando pTAP196 como molde y cebadores de oligonucleótidos zc22.971 (SEC ID NO: 23) y zc40.107 (SEC ID NO: 26). Estos dos productos de PCR se combinaron y amplificaron utilizando los cebadores de oligonucleótidos zc22.971 (SEC ID NO: 23) y zc29.740 (SEC ID NO: 3) para generar IL-21met de longitud completa mediante PCR solapante.. El producto final de PCR se insertó en el vector de expresión pTAP237 mediante recombinación homóloga de levadura. La construcción de expresión se extrajo de la levadura y se transformó en E. coli MC1061 competente. Los clones resistentes a kanamicina se identificaron mediante PCR de colonias. Se verificó un clon positivo mediante secuenciación y posteriormente se transformó en las cepas huésped de producción E104 o UT5600. El vector de expresión con la secuencia codificante de IL-21met híbrida se denominó pTAP337.

Una vez se eliminó la estructura de orquilla mediante la sustitución de las primeras ochenta bases de la secuencia optimizada con los primeros ochenta nucleótidos de la secuencia IL-21met no optimizada (mostrada en la SEC ID No. 1), el gen resultante se expresó muy bien en E. coli. Los niveles de expresión con la nueva construcción aumentó alrededor de un 20% de la proteína celular total.

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Ejemplo 4 Expresión de IL-21met

Se inoculó E. coli en 100 mL de medio Superbroth II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) que contenía Antiespuma 289 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) al 0,01% y kanamicina 30 \mug/ml, se cultivó durante la noche a 37ºC. Se añadieron 10 mL de inóculo a 500 mL del mismo medio en un matraz de cultivo de 2 L que se agitó a 275 rpm a 37ºC hasta que el cultivo alcanzó una DO600 de 4. A continuación, se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM y se continuó la agitación durante otras 2,5 horas. Las células se centrifugaron a 4.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Los residuos celulares se congelaron a -80ºC para su uso posteriormente.

La expresión de IL-21met se realizó a mayor escala en un cultivo de 25 mL a 37ºC. Se recogió un ml de cultivo 2 horas después de la inducción con IPTG. Las células de E. coli se resuspendieron en un volumen igual de Reactivo de Extracción de Proteínas BugBuster® (Novagen, Madison, WI) a 4ºC y se incubaron durante 20 minutos. Las fracciones solubles e insolubles se separaron mediante centrifugación a 16.000 x g durante 10 min a 4ºC.

La IL-21met recombinante se acumuló como cuerpos de inclusión insolubles. El rendimiento de la recuperación de IL-21met de la mayoría de cepas de E. coli se consideró bajo. Aproximadamente del 80 al 90% de IL-21met en los cuerpos de inclusión se perdió en 20 minutos después de la lisis celular y la incubación a 4ºC. El lisado de las bacterias con urea 8 M no aumentó la recuperación. Sin embargo, la inclusión de inhibidores de proteasa, tal como ZnCl_{2} 5 mM y benzamidina 0,5 mM, en el tampón de lisis celular, evitó la pérdida de IL-21met de la cepa E104 (W3110 arabinosa). Esto indicaba que una proteasa bacteriana capaz de dividir la IL-21met bajo condiciones desnaturalizantes era copurificante con los cuerpos de inclusión. Se observó que IL-21met era estable lisados celulares de la cepa UT5600, pero no en los lisados celulares de E104. Esto sugirió que la proteasa estaba presente en E104 pero no en UT5600. La comparación de los genotipos de estas cepas reveló que OmpT, que divide entre residuos dibásicos, estaba presente en E104, pero no en UT5600. OmpT es estable al calor y activo incluso bajo condiciones desnaturalizantes (White et al., ibid. 1995). El examen de la secuencia de aminoácidos de IL-21 indicó que contenía por lo menos cuatro sitios potenciales de división por OmpT. La IL-21met también demostró una excelente estabilidad en BL21, otra cepa de E. coli deficiente en OmpT. Estos datos sugirieron que la actividad proteasa de OmpT era crítica para la estabilidad y recuperación de IL-21. El uso de la cepa de E. coli UT5600 como huésped de producción mejora significativamente la recuperación de Il-21met. Los rendimientos globales de IL-21met aumentaron de 2 mg/L a 50-100 mg/L con la combinación de la mejora de construcción y cepa huésped.

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Ejemplo 5 Caracterización de IL-21

Para el análisis Western, se separaron las muestras de proteínas en un gel al 4-20% de MES-SDS NuPAGE (Invitrogen) bajo condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen) a 30 V durante 1 hora. La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5% en tampón TTBS (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 160 mM, Tween 20 al 0,1%). Se añadió anticuerpo policlonal específico para IL-21 humana en tampón TTBS con leche desnatada al 5% y se incubó durante 1 hora. Después del lavado con TTBS, se sondó el "blot" con IgG de cabra anti-conejo conjugado con HRP (Bio-Rad) durante 1 hora. El "blot" se lavó posteriormente tres veces con TTBS antes de la detección quimioluminiscente con reactivo ECL de Pierce.

Ejemplo 6 Análisis de estabilidad de plásmidos

Se inoculó E. coli en 25 ml de medio Superbroth II (Becton Dickinson) que contiene Antifoam 289 al 0,01% (Sigma) y 30 \mug/ml de kanamicina, y se cultivó durante toda la noche a 37ºC. Se añadieron 25 \muL de inóculo a 25 mL del mismo medio sin kanamicina en un matraz de cultivo de 25 mL que se agitó a 275 rpm a 37ºC. Se recogieron 100 \muL de cultivo en cuatro puntos de tiempo diferentes (cuando el cultivo alcanzó los valores de DO600 de 2, 4, 6 y 8). Las muestras se diluyeron y pusieron en placas agar LB son ningún aditivo. Después de incubación durante toda la noche a 37ºC, 100 colonias de E. coli pusieron por réplicas en placas sobre la placa de agar LB y una placa de agar LB que contiene 30 \mug/ml de kanamicina. Después de incubación durante toda la noche a 37ºC, se contó y comparó el número de colonias que se formaban en cada placa. El número de colonias que crecieron en LB más kanamicina con respecto al número que crecieron en la placa sin antibiótico reflejaba el porcentaje de células que aún albergaban el vector de expresión.

Cuando los clones de W3110 que transportaban el vector de expresión pTAP337 se cultivaron durante 12 horas en un medio que no contenía kanamicina, más del 90% retuvieron el plásmido. Los clones que transportaban el vector de expresión sin el gen de IL-21 mostraron una retención similar del plásmido. Estos datos demuestran que el vector de expresión pTAP337 que transportaba IL-21 es estable en W3110.

Las cepas de E. coli, TG1 y MM294, no se seleccionaron como el huésped de producción debido a la baja productividad de IL-21 y la importante inestabilidad del plásmido. Los resultados más esperanzadores provinieron de los estudios que utilizaban la cepa de E. coli W3110 (ATCC #27325) para producir IL-21. La productividad de W3110 era comparable con la de UT5600. Los estudios de estabilidad del plásmido demostraron que el vector de expresión, pTAP337, se mantuvo también en W3110. UT5600 es una cepa auxotrófica es más difícil de desarrollar a gran escala. Estas consideraciones condujeron a la selección de W3110 como la cepa huésped preferida para la producción de
IL-21.

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Ejemplo 7 Fermentación por lotes

Se preparó un matraz de siembra de la primera etapa (matraz desviador de 500 ml con 100 ml de medio) con Difco APS Super Broth (Difco Laboratories, Detroit, MI), suplementado con glicerol a 5 g/L y kanamicina a 25 ug/ml. El crecimiento se inició inoculando el matraz de agitación con un bucle lleno de W3110 de E. coli que contenía el vector de expresión pTAP337 (EE410) de una placa de agar de 24 horas (agar Luria (Difco Laboratories) que contenía kanamicina 25 \mug/ml). El crecimiento en el matraz de agitación fue a una temperatura de 30ºC. El matraz se incubó con agitación fijada a 250 rpm.

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 3,0 L de Difco APS Super Broth y se esterilizó. El medio de crecimiento se suplementó con glicerol a 10 g/L y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 7,2. La aeración del recipiente se fijó a 1 vvm y la agitación se fijó a 350 rpm. La temperatura se fijó a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo del matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una densidad óptica (DO) de 16 a 600 nm. La inoculación fue del 5% v/v. El oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación.

El cultivo creció hasta que la DO600 alcanzó el valor de 2,5 (aproximadamente 2,5 horas). Se añadió tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) al cultivo hasta una concentración de 1,0 mM. A continuación, se dejó que el cultivo creciera durante 3 horas adicionales.

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Ejemplo 8 A. Fermentación de alimentación discontinua

Se preparó un matraz de siembra de la primera etapa (matraz desviador de 500 ml con 100 ml de medio) con Difco APS Super Broth (Difco Laboratories, Detroit, MI), suplementado con glicerol a 5 g/L y kanamicina a 25 ug/ml. El crecimiento se inició inoculando el matraz de agitación con un bucle lleno de W3110 de E. coli que contenía el vector de expresión pTAP337 (descrito anteriormente) de una placa de agar de 24 horas (agar Luria que contenía kanamicina 25 \mug/ml). El matraz de agitación se incubó a 30ºC con agitación fijada a 250 rpm.

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 3,0 L de medio de crecimiento ZymoM y se esterilizó. El medio de crecimiento se suplementó con glicerol a 20 g/L y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,4. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 32ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo del matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación.

Se introdujo una solución de carbohidratos en el fermentador a un EFT de 10 horas. Se continuó la alimentación hasta el final de la fermentación. La solución de alimentación era glicerol preparado al 70% v/v. La velocidad de alimentación fue 6 gramos de glicerol por litro por hora en base al volumen de partida inicial. A un EFT de 24 horas, se añadió IPTG al cultivo hasta una concentración de 2 mM. A un EFT de 48 horas, se recogió la fermentación.

En un proceso de alimentación discontinua alternativo, se preparó un matraz de siembra de la primera etapa (matraz desviador de 500 ml con 100 ml de medio) con ZSM, suplementado con glucosa a 20 g/L y kanamicina a 25 \mug/ml. El crecimiento se inició inoculando el matraz de agitación con 300 \mul de W3110 de E. coli congelado en glicerol al 20% y que contenía el vector de expresión pTAP337. El cultivo se incubó a 30ºC con agitación a 250 rpm.

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 3,0 L de medio de crecimiento ZymoM y se esterilizó. El medio de crecimiento se suplementó con glicerol a 20 g/L y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,8. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo del matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el nivel de oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación.

Se introdujo una solución de carbohidratos en el fermentador empezando a un EFT de 10 horas. Se continuó la alimentación hasta el final de la fermentación. La solución de alimentación era glucosa preparada al 60% v/v y la velocidad de alimentación fue 9,5 gramos de glucosa por litro por hora en base al volumen de partida inicial. A un EFT de 24 horas, se añadió IPTG al cultivo hasta una concentración de 2 mM. A un EFT de 48 horas, se añadió 2 mmol/l de IPTG al cultivo llevando la concentración de IPTG a 4 mM. La fermentación se recogió a las 56 horas.

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TABLA 1

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1

TABLA 2

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2

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TABLA 3

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3

TABLA 4

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5

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B. Fermentación de alimentación discontinua con medio PCOL22

Se preparó un matraz de siembra de la primera etapa (matraz desviado de 500 ml con 100 ml de medio) con medio ZSM, suplementado con glucosa a 20 g/L y kanamicina a 25 ug/ml. El crecimiento se inició inoculando el matraz con 300 \mul de material de un vial congelado descongelado que contenía la cepa de producción EE410 (W3110 de E. coli que contenía el vector de expresión pTAP337). El matraz de agitación se incubó a 32ºC con agitación fijada a 250 rpm.

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 2,7 L de medio PCOL22 y se esterilizó. Después de enfriarse, el medio de crecimiento se suplementó con glucosa a 20 g/L, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,8 con hidróxido amónico 5 N. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo de EE410 en el matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación. El pH se controló a 6,8 mediante la adición de NH_{4}OH 5 N.

Se introdujo una solución de glucosa (60% p/v) en el fermentador empezando a un EFT de 8 horas. Se mantuvo a lo largo de la fermentación una velocidad de alimentación constante de 9,5 g de glucosa/L de volumen de partida por hora. A un EFT de 24 horas, se añadió IPTG al cultivo hasta una concentración de 0,5 mM. La fermentación se recogió a un EFT de 48 horas.

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C. Fermentación por alimentación discontinua con medio PCOL22 menos kanamicina

Se preparó un matraz de siembra de la primera etapa (matraz desviador de 500 ml con 100 ml de medio) con medio ZSM, suplementado con glucosa a 20 g/L y kanamicina a 25 \mug/ml. El crecimiento se inició inoculando el matraz con 300 \mul de material de un vial congelado descongelado que contenía la cepa de producción EE410 (W3110 de E. coli que contenía el vector de expresión pTAP337). El matraz de agitación se incubó a 32ºC con agitación fijada a 250 rpm.

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 2,7 L de medio PCOL22 y se esterilizó. Después de enfriarse, el medio de crecimiento se suplementó con glucosa a 20 g/L, sulfato de magnesio y cloruro de calcio. No se añadió kanamicina. El pH del medio se ajustó a 6,8 con hidróxido amónico 5 N. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo de EE410 en el matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación. El pH se controló a 6,8 mediante la adición de NH_{4}OH 5 N.

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D. Fermentación por alimentación discontinua con medio PCOL22-L

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 2,7 L de medio PCOL22- L y se esterilizó. El medio contenía ácido cítrico y un tercio menos de sales para evitar la precipitación. Después de enfriarse, el medio de crecimiento se suplementó con glucosa a 20 g/L, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,8 con hidróxido amónico 5 N. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo de EE410 en el matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 nm de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación. El pH se controló a 6,8 mediante la adición de NH_{4}OH 5 N.

Se introdujo una solución de glucosa (60% p/v) menos sulfato de magnesio en el fermentador empezando a un EFT de 8 horas. Se mantuvo a lo largo de la fermentación una velocidad de alimentación constante de 9,5 g de glucosa/L de volumen de partida por hora. A un EFT de 24 horas, se añadió IPTG al cultivo hasta una concentración de 0,5 mM. La fermentación se recogió a un EFT de 48 horas.

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E. Fermentación por alimentación discontinua con medio PCOL12-L

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 2,7 L de medio PCOL22- L y se esterilizó. El medio contenía un cuarto menos de sales para evitar la precipitación. Después de enfriarse, el medio de crecimiento se suplementó con glucosa a 20 g/L, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,8 con hidróxido amónico 5 N. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo de EE410 en el matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 nm de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación. El pH se controló a 6,8 mediante la adición de NH_{4}OH 5 N.

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F. Fermentación por alimentación discontinua con medio PCOL12-R

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 2,7 L de medio PCOL22- R y se esterilizó. El medio contenía mayores niveles de extracto de levadura y glucosa para incrementar el crecimiento de la cepa huésped antes de iniciar la alimentación de glucosa. Después de enfriarse, el medio de crecimiento se suplementó con glucosa a 40 g/L, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,8 con hidróxido amónico 5 N. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo de EE410 en el matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 nm de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación.

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G. Fermentación por alimentación discontinua en un recipiente de 20 L

En un proceso por alimentación discontinua alternativo, se preparó un recipiente de siembra de la primera etapa (6 L) con 3,0 L de medio ZSM suplementado con glucosa a 20 g/L y kanamicina a 25 \mug/ml. El crecimiento se inició inoculando el recipiente con 3,0 ml de material de un vial congelado descongelado que contenía la cepa de producción EE410 (W3110 de E. coli que contenía el vector de expresión pTAP337). La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 32ºC.

Se preparó un recipiente de fermentación de 20 L con 10,8 L de medio PCOL22 y se esterilizó. Después de enfriarse, el medio de crecimiento se suplementó con glucosa a 20 g/L, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,8 con hidróxido amónico 5 N. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo de EE410 en el matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 nm de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación. El pH de cultivo se controló a 6,8 mediante la adición de hidróxido amónico 5 N.

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H. Fermentación por alimentación discontinua con una siembra de dos etapas

Se preparó un recipiente de siembra de la segunda etapa (6 L) con 3,0 L de medio ZSM, suplementado con glucosa a 20 g/L y kanamicina a 25 \mug/ml. El crecimiento se inició inoculando el recipiente con 100 ml de material del matraz de siempre de la primera etapa que contenía la cepa de producción EE410 (W3110 de E. coli que contenía el vector de expresión pTAP337). La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 32ºC.

Se preparó un recipiente de fermentación de 20 L con 10,8 L de medio PCOL22 y se esterilizó. Después de enfriarse, el medio de crecimiento se suplementó con glucosa a 20 g/L, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,8 con hidróxido amónico 5 N. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir del recipiente de siembra de la segunda etapa que se había desarrollado durante 12 horas hasta una DO600 nm de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación. El pH de cultivo se controló a 6,8 mediante la adición de hidróxido amónico 5 N.

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I. Fermentación por alimentación discontinua con ZGOLD1

La construcción del vector de expresión zGOLD1 se describe en el ejemplo 19. Se preparó un matraz de siembra de la primera etapa (matraz desviador de 500 ml con 100 ml de medio) con medio ZSM, suplementado con glucosa a 20 g/L y kanamicina a 25 \mug/ml. El crecimiento se inició inoculando el matraz con 300 \mul de material de un vial congelado descongelado que contenía la cepa de producción W3110 ompT - (ZGOLD1) que contenía el vector de expresión pTAP337. El matraz de agitación se incubó a 32ºC con agitación fijada a 250 rpm.

Se preparó un recipiente de fermentación de 6 L con 2,7 L de medio PCOL22 y se esterilizó. Después de enfriarse, el medio de crecimiento se suplementó con glucosa a 20 g/L, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y kanamicina a 25 \mug/ml. El pH del medio se ajustó a 6,8 con hidróxido amónico 5 N. La aeración se fijó a 1 vvm, la agitación se fijó a 350 rpm y la temperatura a 37ºC. El fermentador se inoculó a partir de un cultivo de EE410 del matraz de siembra de la primera etapa que se había desarrollado durante 16 horas hasta una DO600 nm de 16. La inoculación fue del 5% v/v y el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20% de saturación mediante el incremento de la velocidad de agitación. El pH de cultivo se controló a 6,8 mediante la adición de hidróxido amónico 5 N.

Medio de producción PCOL22 TABLA 5

6

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Medio de producción PCOL12-L TABLA 6

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60% de glucosa para la alimentación discontinua utilizando los medios PCOL22-L y PCOL 12 L.

TABLA 7

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PCOL12-R TABLA 8

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PCOL12-L TABLA 8

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Ejemplo 9 Recuperación de IL-21 A. Destrucción de células recogidas

El residuo de E. coli recogido se produjo mediante fermentación por alimentación discontinua y contenía aproximadamente 5-6 g/L de IL-21met en forma de cuerpos de inclusión. El caldo de fermentación (1 L) se recogió en partículas residuales mediante centrifugación a 8000 x g durante 30 minutos. El residuo se resuspendió en 850 ml de tampón de rotura (Tris 100 mM, pH 7,2, ZnCl_{2} 5 mM) y se enfrió en hielo. El caldo se pasó a través del homogeneizador APV tres veces a 10.000 psi. A continuación, el caldo se centrifugó a 8000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó procurando retener las partículas sueltas. El residuo se lavó dos veces mediante resuspensión en 800 ml de agua DI y centrifugación a 8000 x g durante 40 minutos. El sobrenadante se descartó procurando retener las partículas sueltas. El residuo de los cuerpos de inclusión se almacenó a -80ºC o se replegó sin congelarse.

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B. Destrucción directa de caldo recogido

El caldo de E. coli recogido se produjo mediante fermentación por alimentación discontinua y contenía aproximadamente 6-7 g/L de Il-21met en forma de cuerpo de inclusión. El caldo de fermentación (0,5 L) se diluyó hasta 1,0 L con agua desionizada y se pasó a través del homogeneizador APV tres veces a 10.000 psi. A continuación, el caldo se centrifugó a 15.000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó procurando retener las partículas sueltas. El residuo se resuspendió en 500 ml de agua DI y se centrifugó a 15.000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó procurando retener las partículas sueltas. La etapa de lavado se repitió y el residuo de los cuerpos de inclusión se almacenó a -80ºC o se replegó sin congelarse.

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C. Solublización y precipitación

1. La solubilización se consiguió mediante la suspensión de l residuo de cuerpos de inclusión lavados en 200 mL de Tris 100 mM, clorhidrato de guanidina 6M, ZnCl_{2} 5 mM, pH 7,2 a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, la suspensión se centrifugó a 12000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se mantuvo a 4ºC. El sobrenandante se diluyó 1:8 (v/v) en Tris 100 mM, ZnCl_{2} 5 mM, pH 7,2. La suspensión se centrifugó a 12000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó. El residuo se resuspendió en 200 ml de Tris 100 mM, urea 8 M, pH 7,2. La suspensión se centrifugó a 12000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó. El procedimiento de lavado se repitió dos veces más. La resolubilización se consiguió mediante la suspensión del residuo lavado en 200 mL de Tris 100 mM, clorhidrato de guanidina 6M, DDT 10 mM, pH 7,2. La suspensión se centrifugó a 12000 g durante 30 minutos. La concentración de proteínas en el sobrenadante medida por un ensayo de proteínas HPLC fue 10 mg/mL. A continuación, la muestra de IL-21 se guardó a 4ºC.

2. La solubilización de IL-21 se consiguió mediante la suspensión del residuo de cuerpos de inclusión lavados en clorhidrato de guanidina 6 M, ditiotreitol (DTT) 40 mM preparado en Tris 100 Mm, pH 8,0 (GDT40). Se utilizaron aproximadamente 150 ml de GDT40 por litro de caldo de fermentación original. La solubilización tuvo lugar a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, la suspensión se centrifugó. El sobrenadante de los cuerpos de inclusión disueltos se replegó mediante dilución (20-30 X) en un tampón de repliegue que contiene una pareja de oxidación-reducción arginina más DTT/ cistina 0,75 M. Se dejó que tuviera lugar el repliegue durante 5-16 horas después de lo cual, el pH de la mezcla se ajustó hasta pH 5,5 y se filtró antes de pasar a la purificación.

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D. Destrucción directa de caldo recogido de ZGOLD1

El caldo ZGOLD1 de E. coli recogido se produjo mediante fermentación por alimentación discontinua en medio PCOL22 (descrito anteriormente) y contenía aproximadamente 9-10 g/L de Il-21met en forma de cuerpos de inclusión. El caldo de fermentación (0,5 L) se diluyó a 1,0 L con agua desionizada y se pasó a través del homogeneizador APV tres veces a 10.000 psi. A continuación, el caldo se centrifugó a 15.000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó procurando retener las partículas sueltas. El residuo se resuspendió en 500 ml de agua DI y se centrifugó a 15.000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó procurando retener las partículas sueltas. El residuo se resuspendió en 500 ml de agua DI y se centrifugó a 15.000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó procurando retener las partículas sueltas. El residuo de cuerpos de inclusión se almacenó a -80ºC o se replegó sin congelarse.

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Ejemplo 10 A. Solubilización de cuerpos de inclusión lavados

La solubilización se consiguió mediante la suspensión del residuo de cuerpos de inclusión lavados en 150 mL de Tris 100 mM, clorhidrato de guanidina 6M, ditiotreitol 20 mM, pH 7,5 a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, la suspensión se centrifugó a 12000 g durante 30 minutos. La concentración de proteínas en el sobrenadante medida por un ensayo de proteínas HPLC fue 21 mg/mL. A continuación, la muestra de IL-21 se almacenó a 4ºC.

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B. Solublización de cuerpos de inclusión de ZGOLD1 lavados

La solubilización se consiguió mediante la suspensión del residuo de cuerpos de inclusión lavados de 1 litro de caldo de fermentación en 150 mL de Tris 100 mM, clorhidrato de guanidina 6M, ditiotreitol 40 mM, pH 8,0 a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, la suspensión se centrifugó a 15.000 g durante 30 minutos. La concentración de proteínas en el sobrenadante medida por un ensayo de proteínas HPLC fue 29 mg/mL. A continuación, la muestra de IL-21 se almacenó a 4ºC.

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C. Depuración de cuerpos de inclusión solubilizados

Se utilizó una resina de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) para depurar los residuos de cuerpos de inclusión de IL-21 solubilizados. En un ejemplo, los residuos de cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron durante 1 hora a temperatura ambiente en guanidina HCl 6 M que contenía imidazol 10 mM, pH 7,5, se cargaron columnas His-trap de 1,0 ml (Amersham Biosciences) con 0,5 ml de NiSO_{4} 0,1M. Después de cargarse y lavar con agua, se utilizaron 5,0 ml de tampón de unión que consistía en GuHCl 6M, imidazol 20 mM, NaCl 0,5 M, y fosfato 20 mM para equilibrar la columna.

Se aplicó la muestra de soluto (1,0 ml) a la columna y la columna se lavó con 5,0 ml del tampón de unión. La IL-21 se eluyó mediante la aplicación de 2,5 ml de tampón de elución (GuHCl 6 M, Imidazol 0,5 M, NaCl 0,5 M, y fosfato 20 mM) a la columna. Se repitió la etapa de elución y las muestras se analizaron por la pureza y la depuración utilizando geles de SDS-Page.

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Ejemplo 11 Repliegue A. Renaturalización con GSH y GSSG

Se determinó que la concentración de IL-21 en la fracción solubilizada mediante HPLC de fase inversa fue de 21 mg/ml. La determinación del volumen de tampón de repliegue se basó en la cantidad de soluto y la concentración de Il-21 presente en el soluto. El tampón de repliegue (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, KCl 0,5 mM, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM, PEG3350 al 0,05% (p/v), L-Arginina 1,1 M, GSH 2 mM, GSSG 1 mM, pH 7,5) se enfrió hasta temperatura ambiente (21ºC). Se disolvieron GSH y GSSG inmediatamente antes de su uso.

El soluto que contenía IL-21 (175 ml) se añadió lentamente (1,5 horas) al tampón de repliegue (11 L) con mezclado. Se añadió IL-21 a la mezcla de repliegue hasta una concentración final de 0,30 mg/ml. El intervalo de temperaturas fue entre 20 y 22ºC. El recipiente que contenía la mezcla de repliegue se dejó abierto a la atmósfera. Se dejó que el repliegue tuviera lugar durante 16 horas. Se determinó que la concentración de IL-21 replegada era de 0,165 mg/ml, que representa un rendimiento de renaturalización del 55%.

B. Renaturalización con DTT y GSSG

Se determinó que la concentración de IL-21 en la fracción solubilizada mediante HPLC de fase inversa fue de 15,02 mg/ml. La determinación del volumen de tampón de repliegue se basó en la cantidad de soluto y la concentración de IL-21 presente en el soluto. El tampón de repliegue (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, KCl 0,5 mM, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM, PEG3350 al 0,05% (p/v), L-Arginina 1,1 M, DTT 2 mM, GSSG 4 mM, pH 7,5) se enfrió hasta temperatura ambiente (21ºC). Se disolvieron DTT y GSSG inmediatamente antes de su uso.

El soluto que contenía IL-21 (88 ml) se añadió lentamente (1,0 horas) al tampón de repliegue (1,0 L) con mezclado. Se añadió IL-21 a la mezcla de repliegue hasta una concentración final de 0,50 mg/ml. El intervalo de temperaturas fue entre 20 y 22ºC. El recipiente que contenía la mezcla de repliegue se dejó abierto a la atmósfera. Se dejó que el repliegue tuviera lugar durante 16 horas. Se determinó que la concentración de IL-21 replegada era de 0,27 mg/ml, que representa un rendimiento de renaturalización del 59,5%.

C. Renaturalización con cisteína y dihidroclorhidrato de cistina

Se determinó que la concentración de IL-21 en la fracción solubilizada mediante HPLC de fase inversa fue de 18,6 mg/ml. La determinación del volumen de tampón de repliegue se basó en la cantidad de soluto y la concentración de IL-21 presente en el soluto. El tampón de repliegue (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, KCl 0,5 mM, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM, PEG3350 al 0,05% (p/v), L-Arginina 1,0 M, cisteína 4 mM, cistina HCl 2 mM, pH 7,5) se enfrió hasta tempe-
ratura ambiente (21ºC). Se disolvieron la cisteína y el dihidroclorhidrato de cistina inmediatamente antes de su uso.

El soluto que contenía IL-21 (20,5 ml) se añadió lentamente (0,5 horas) al tampón de repliegue (0,78 L) con mezclado. Se añadió IL-21 a la mezcla de repliegue hasta una concentración final de 0,49 mg/ml. El intervalo de temperaturas fue entre 20 y 22ºC. El recipiente que contenía la mezcla de repliegue se dejó abierto a la atmósfera. Se dejó que el repliegue tuviera lugar durante 21 horas. Se determinó que la concentración de IL-21 replegada era de 0,29 mg/ml, que representa un rendimiento de renaturalización del 58%.

D. Renaturalización con DTT y dihidroclorhidrato de cistina

Se determinó que la concentración de IL-21 en la fracción solubilizada mediante HPLC de fase inversa fue de 18,6 mg/ml. La determinación del volumen de tampón de repliegue se basó en la cantidad de soluto y la concentración de IL-21 presente en el soluto. El tampón de repliegue (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, KCl 0,5 mM, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM, PEG3350 al 0,05% (p/v), L-Arginina 1,1 M, DTT 2 mM, dihidroclorhidrato de cistina 4 mM, pH 7,5) se enfrió hasta temperatura ambiente (21ºC). Se disolvieron la DTT y GSSG inmediatamente antes de su uso.

El soluto que contenía IL-21 (20,5 ml) se añadió lentamente (0,5 horas) al tampón de repliegue (0,78 L) con mezclado. Se añadió IL-21 a la mezcla de repliegue hasta una concentración final de 0,49 mg/ml. El intervalo de temperaturas fue entre 20 y 22ºC. El recipiente que contenía la mezcla de repliegue se dejó abierto a la atmósfera. Se dejó que el repliegue tuviera lugar durante 16 horas. Se determinó que la concentración de IL-21 replegada era de 0,28 mg/ml, que representa un rendimiento de renaturalización del 58%.

E. Repliegue con pulsos de tiempo

El repliegue con pulsos de tiempo proporciona un método para replegar IL-21met humana hasta una concentración final de 0,3-0,9 mg/mL. En el repliegue discontinuo, la concentración final de proteína IL-21 en el tampón de repliegue se optimizó entre 0,2 y 0,2 mg/ml. Se requirió una concentración elevada de arginina (1 M) y el rendimiento de la etapa de repliegue fue del 40% al 50%. Aunque es satisfactorio según el criterio convencional del repliegue de proteínas, sería altamente deseable replegar IL-21met a una concentración incluso más elevada.

La preparación de cuerpos de inclusión solubilizados fue tal como se describió en el Ejemplo 4 con la excepción de que la concentración final de proteína fue de 15 mg/ml. Se consiguió una dilución 1:50 del soluto utilizando tampón de repliegue tal como se ha descrito. A continuación se agitó la solución durante 3 horas a temperatura ambiente. Se tomó una muestra al final del periodo de tres horas y se centrifugó. El sobrenadante se sometió a análisis HPLC. A continuación, el proceso se repitió cuatro veces más.

El porcentaje de rendimiento de la IL-21met replegada correctamente permaneció constante durante las primeras tres repeticiones, pero disminuyó después de la cuarta repetición. La concentración final de proteína más elevada conseguida sin afectar al rendimiento fue de 0,9 mg/ml. La concentración de proteína elevada (superior a 0,3 mg/ml) durante la etapa inicial del repliegue (inferior a 3 horas) dio lugar a un rendimiento menor debido a la agregación. Una vez se completó el repliegue (superior a 3 horas), se puede iniciar la adición de la reserva de repliegue sin afectar al rendimiento. La concentración máxima de clorhidrato de guanidina en el tampón de repliegue final fue de 0,3 a 0,6 M.

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F. Repliegue con DTT y cistina en concentraciones menores de arginina

Se determinó que la concentración de IL-21 en la fracción solubilizada mediante HPLC de fase inversa fue de 14,53 mg/ml. El tampón de repliegue (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, KCl 0,5 mM, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM, PEG3350 al 0,05% (p/v), L-Arginina 0,75 M, DTT 2 mM, cistina 4 mM, pH 8,0) se enfrió hasta 21ºC. La cistina se disolvió en NaOH 0,25 M hasta una concentración de 80 mM y se añadió junto con DTT inmediatamente antes de su uso.

El soluto que contenía IL-21 (96 ml) se añadió lentamente (1,0 horas) al tampón de repliegue (1,0 L) con mezclado. Se añadió IL-21 a la mezcla de repliegue hasta una concentración final de 0,61 mg/ml. El intervalo de temperaturas fue entre 14 y 16ºC. El recipiente que contenía la mezcla de repliegue se dejó abierto a la atmósfera. Se dejó que el repliegue tuviera lugar durante 16 horas. Se determinó que la concentración de IL-21 replegada era de 0,40 mg/ml, y representa un rendimiento de renaturalización del 66%.

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G. Repliegue volumétrico con DTT y cistina

El repliegue volumétrico se basa en el volumen del soluto IL-21 y no en la concentración de IL-21 en el soluto. Se determinó que la concentración de IL-21 en la fracción solubilizada mediante HPLC de fase inversa fue de 26,1 mg/ml. El tampón de repliegue (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, KCl 0,5 mM, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM, PEG3350 al 0,05% (p/v), L-Arginina 0,75 M, DTT 2 mM, cistina 4 mM, pH 8,0) se enfrió hasta 15ºC. La cistina se disolvió en NaOH 0,25 M hasta una concentración de 80 mM y se añadió junto con DTT inmediatamente antes de su uso.

El soluto que contenía IL-21 (935 ml) se añadió lentamente (2,0 horas) al tampón de repliegue (28,0 L) con mezclado. Se añadió IL-21 a la mezcla de repliegue hasta una concentración final de 0,83 mg/ml. El intervalo de temperaturas fue entre 14 y 16ºC. El recipiente que contenía la mezcla de repliegue se dejó abierto a la atmósfera. Se dejó que el repliegue tuviera lugar durante 16 horas. Se determinó que la concentración de IL-21 replegada era de 0,51 mg/ml, y representa un rendimiento de renaturalización del 61%.

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H. Repliegue volumétrico de WIB de ZGOLD1

Se determinó que la concentración de IL-21 en la fracción solubilizada mediante HPLC de fase inversa fue de 29,9 mg/ml. El tampón de repliegue (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, KCl 0,5 mM, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 2 mM, PEG3350 al 0,05% (p/v), L-Arginina 0,75 M, DTT 2 mM, cistina 4 mM, pH 8,0) se enfrió hasta 15ºC. La cistina se disolvió en NaOH 0,25 M hasta una concentración de 80 mM y se añadió junto con DTT inmediatamente antes de su uso.

El soluto que contenía IL-21 (935 ml) se añadió lentamente (2,0 horas) al tampón de repliegue (27,3 L) con mezclado. Se añadió IL-21 a la mezcla de repliegue hasta una concentración final de 0,96 mg/ml. El intervalo de temperaturas fue entre 14 y 16ºC. El recipiente que contenía la mezcla de repliegue se dejó abierto a la atmósfera. Se dejó que el repliegue tuviera lugar durante 16 horas. Se determinó que la concentración de IL-21 replegada era de 0,60 mg/ml, y representa un rendimiento de renaturalización del 62,3%.

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Ejemplo 12 A. Depuración de IL-21 replegada

Esta etapa es para detener la reacción de repliegue y para eliminar partículas de la solución de IL-21 replegada. La IL-21 replegada se ajusta habitualmente a pH 5,5 y a continuación se pasa a través de un filtro nominal de 1,2 \mum. En algunos casos, el pH no se ajusta antes de la filtración y en otros casos se puede utilizar un filtro de diferente tamaño (0,45-2,0 \mum) u otro tipo de filtro. Es posible eliminar las partículas mediante centrifugación utilizando una centrífuga continua Carr powerfuge (Carr Separations, Inc., Franklin, MA) o mediante centrifugación en botellas.

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Después del repliegue, la conductividad de la solución tampón necesita reducirse para cargarse en la resina de captura SP550 C. La solución turbia también necesita filtrarse para eliminar la IL-21 no plegada y las proteínas de E. coli precipitadas. En un ejemplo, se diluyeron 29,5 L de tampón de repliegue que contenía la IL-21 replegada con 1,4 partes (42,0 L) de tampón acetato 25 mM, pH 5,5. Se dejó precipitar la solución a temperatura ambiente durante 4 horas. A continuación, la solución se filtró a través de un filtro de profundidad Cuno Zeta plus de 1,2 a 0,8 \mum.

B. Dilución y depuración de IL-21 replegada

Esta etapa es para detener la reacción de repliegue, diluir el material replegado para permitir la unión a la cromatografía de intercambio catiónico y para eliminar las partículas de la solución de IL-21 replegada. La IL-21 replegada se ajusta habitualmente a pH 5,5 y, a continuación, se diluye 1,4 veces con acetato de sodio 25 mM, pH 5,5. Esta solución se deja estabilizar durante aproximadamente cuatro horas a temperatura ambiente con el objetivo de aumentar la separación física de las proteínas solubles e insolubles presentes en la solución de repliegue diluida. La solución de repliegue estabilizada y diluida mayoritariamente carente de partículas se pasa a continuación a través de un filtro de profundidad de 1,2 a 0,8 \mum (Cuno Zeta Plus A30M03).

Ejemplo 13 Concentración de IL-21 replegada depurada

La IL-21 replegada depurada se concentra de 10 a 30 veces mediante filtración de flujo tangencial. El aparato y las membranas de filtración de flujo tangencial (placa de corte de peso molecular de 5 kDa de Millipore Pellicon Biomax (Millipore, Bedford, MA) y el sistema de placa y marco o sistema de fibra hueca de corte de peso molecular de 10 kDa de Amersham Biosciences) se sanitizan utilizando NaOH 0,5 M y se enjuagan con agua. Para la IL-21 replegada de 1 L de caldo de fermentación se utilizan de 0,2 m^{2} a 0,3 m^{2} de área de membrana con una velocidad de flujo cruzado de aproximadamente 48 L/h y una presión transmembrana de 20 psi a 30 psi.

Ejemplo 14 Captura de IL-21 replegada A. Intercambio catiónico utilizando la resina TOYOPEARL SP 550 C

Después de la concentración, se captura IL-21 en una columna de intercambio catiónico. En un ejemplo, la IL-21 concentrada se diluye 3 veces con agua o acetato sódico 25 mM, pH 5,5. Se forma un precipitado que se elimina mediante filtración después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Se utiliza un filtro Millipore de 1,2 \mum Polysep II (Millipore) o una membrana Cuno Zeta Plus A30MO3 de 1,2-0,8 \mum (Cuno, Meriden, CN). La IL-21 filtrada se carga en una columna de resina TOYOPEARL_SP550C (Tosoh Biosep) equilibrada con tampón de equilibrio (acetato de sodio 25 mM, NaCl 0,2 M, pH 5,5). La columna se carga a una capacidad de 6-10 g IL-21 por resina L, la altura del lecho es de 15 cm, se controla la absorbancia UV a 280 nm y 215 nm y se utiliza una velocidad de flujo de 150 cm/h. Tras la carga, la columna se lava con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia UV vuelve a la línea base. A continuación, la columna se lava con 4 volúmenes de columna de tampón de equilibrio al 50%, tampón de elución al 50% (acetato de sodio 25 mM, NaCl 1,0 M, pH 5,5). La IL-21 se eluye de la columna con tampón de equilibrio al 25%, tampón de elución al 75%. Alternativamente, tras la carga de IL-21 en la columna y el lavado con el tampón de equilibrio, la IL-21 se eluye de la columna con un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna desde tampón de equilibrio al 100% hasta tampón de elución al 100%.

Alternativamente, después del ajuste del pH, la dilución, etapa de mantenimiento y filtración utilizando filtración por profundidad, la IL-21 se captura en una cromatografía de intercambio catiónico. La solución filtrada se carga en una columna de resina TOYOPEARL SP 550 C (Tosoh Biosep) y se equilibra en condiciones de tampón de equilibrio (acetato de sodio 25 mM, pH 5,5, NaCl 0,4 M). La columna se carga a una capacidad de 6 a 15 g de IL-21 por resina L. Se controla la absorbancia UV a 280 nm y 215 nm, y se utiliza una velocidad de flujo de 150 cm/h. Tras la carga, la columna se lava con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia UV vuelve a la línea base. La IL-21 se eluye de la columna utilizando un gradiente en etapas hasta una tampón de elución al 100% (acetato de sodio 25 mM, pH 5,5, NaCl 0,75 M).

B. Cromatografía de intercambio catiónico utilizando una resina SP Sepharose XL

La Il-21 se diluye 10 veces con acetato de sodio 25 mM, pH 5,5. Se forma un precipitado que se elimina mediante filtración después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Se filtra con un filtro Millipore de 1,2 \mum Polypro XL (Millipore) y después con un filtro Whatman Polycap 75 AS de 0,45 \mum (Maidstone, Kent, UK). La IL-21 filtrada se carga en una columna de resina SP Sepharose XL de Amersham Biosciences equilibrada con tampón de equilibrio (acetato de sodio 25 mM, NaCl 0,2 M, pH 5,5). La columna se carga a una capacidad de 3-6 g de IL-21 por resina L, la altura del lecho es de 15 cm, se controla la absorbancia UV a 280 nm y 215 nm y se utiliza una velocidad de flujo de 150 cm/h. Tras la carga, la columna se lava con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia UV vuelve a la línea base. A continuación, la columna se lava con 4 volúmenes de columna de tampón de equilibrio al 25%, tampón de elución al 75% (acetato de sodio 25 mM, NaCl 1,0 M, pH 5,5). La IL-21 se eluye de la columna con tampón de equilibrio al 50%, tampón de elución al 50%.

C. Cromatografía de intercambio catiónico utilizando la resina Streamline SP XL

En otro ejemplo, IL-21 no se concentra mediante filtración de flujo tangencial antes de la captura mediante cromatografía de intercambio catiónico. Tras el repliegue, el pH se ajusta a 5,5 y el material se filtra a través de un filtro de corte nominal de 1,2 \mum. Se equilibra una columna Streamline de Amersham Biosciences empaquetada con Streamline SP XL de Amersham Biosciences con tampón de equilibrio (acetato de sodio 25 mM, NaCl 0,2 M, pH 5,5). Tras el equilibrio, la IL-21 replegada, filtrada y ajustada al pH, se carga en la columna utilizando una dilución en línea, es decir, se cargan un 30% de IL-21 replegada, filtrada y ajustada al pH y un 70% de agua utilizando el sistema de cromatografía para generar la proporción correcta. La IL-21 se carga en la columna en una dirección de flujo ascendente utilizando una velocidad de flujo que provoca una expansión doble de la resina en comparación con la altura del lecho en reposo. Una vez se había cargado la IL-21 replegada, filtrada y ajustada al pH, se sustituye por tampón de equilibrio. A continuación, se continúa el bombeo en la columna con 30% de tampón del equilibrio y 70% de agua hasta que la conductividad registrada en la entrada de la columna era inferior a 10 mS/cm. A continuación, la columna se lava con tampón de equilibrio en modo de flujo ascendente con una expansión doble de la altura del lecho en reposo hasta que la absorbancia UV a 280 nm vuelve a la línea base. A continuación, el flujo se detiene se deja reposar el lecho de la resina. Se baja el émbolo de la columna Streamline hasta la altura del lecho en reposo y se lava la columna con tampón de equilibrio en modo de flujo descendente para 2 volúmenes de columna a una velocidad de flujo de 150 cm/h. A continuación, se eluye la IL-21 con un 50% de tampón de elución (acetato de sodio 25 mM, NaCl 1,0 M, pH 5,5) y un 50% de tampón de equilibrio en el modo de flujo descendente a 150 cm/h.

Ejemplo 15 Purificación intermedia de IL-21 mediante cromatografía de interacción hidrofóbica A. Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) utilizando resina de butil Sepharose

La IL-21 se ajusta a sulfato de amonio 1,5 M mediante la adición de 198 g de sulfato de amonio sólido por litro de solución de IL-21. La solución se agita hasta que se disuelve el sulfato de amonio y, a continuación, se elimina el material sólido mediante filtración a través de un filtro de corte nominal de 0,45 \mum. En un ejemplo, se equilibra una columna de 15 cm de alto de butil Sepharose 4 FF de Amersham Biosciences con tampón de equilibrio (acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 5,5). La solución de IL-21 filtrada ajustada se carga en la columna a una capacidad de 1,0-2,5 g de IL-21 por resina L a una velocidad de flujo de 150 cm/h. Se controla la absorbancia UV a 280 nm y 215 nm. Tras la carga, la columna se lava con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia UV vuelve a la línea base. La IL-21 se eluye de la columna con un 50% de tampón de equilibrio y un 50% de tampón de elución (acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 50 mM, pH 5,5). Alternativamente, tras la carga de IL-21 en la columna y el lavado con tampón de equilibrio, la IL-21 se eluye de la columna con un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna desde tampón de equilibrio al 100% hasta tampón de elución al 100%.

B. HIC utilizando una resina TOYOPEARL 650M

En otro ejemplo, se utiliza una resina diferente, Tosoh Biosep TOYOPEARL butil 650 M, para purificar la IL-21. El método es el mismo que el utilizado para la resina butil Sepharose FF con las siguientes excepciones: el eluato de intercambio catiónico se ajusta a (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,5 M utilizando una solución madre de (NH_{4})_{2}SO_{4} 3,5 M; la solución de IL-21 filtrada y ajustada se carga en la columna a una capacidad de 10-12 g de IL-21 por resina L; después de la carga, la columna se lava con tampón de equilibrio hasta que la absorbancia UV vuelve a la línea base; La IL-21 se eluye de la columna con tampón de elución al 100% (acetato de sodio 25 mM, pH 5,5, NaCl 0,05 M, (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,15 M).

Ejemplo 16 A. Concentración e intercambio de tampón de IL-21 purificada por solución salina tamponada con fosfato

Después de la purificación, IL-21 se somete a ultrafiltración y diafiltración para concentrarla e intercambiarla en un tampón adecuado para el almacenamiento. Se sanitizan un aparato y las membranas de filtración de flujo tangencial (sistemas de placa y marco de corte por peso molecular de 5 kDa de Millipore Pellicon Biomax) utilizando NaOH 0,5 M y se enjuagan con agua. Para la IL-21 purificada de 1 L de caldo de fermentación, se utilizan 0,1 m^{2} o menos de área de membrana con una velocidad de flujo cruzada de aproximadamente 20-25 L/h y una presión transmembrana de 10 psi a 15 psi. La IL-21 se concentra hasta aproximadamente 15- 20 mg/mL y, a continuación, se diafiltra contra aproximadamente 5-10 diavolúmenes de solución salina tamponada con fosfato, pH 6,0. La IL-21 concentrada intercambiada de tampón se almacena a -80ºC.

B. Concentración e intercambio de tampón de IL-21 purificada por tampón de histidina/manitol

Después de la purificación mediante SP HP Sepharose, la IL-21 se somete a ultrafiltración y diafiltración para concentrarla e intercambiarla en un tampón adecuado para el almacenamiento. Se sanitizan un aparato y las membranas de filtración de flujo tangencial (sistemas de placa y marco de corte por peso molecular de 5 kDa de Millipore Pellicon Biomax) utilizando NaOH 0,5 M y se enjuagan con agua. Para la IL-21 purificada de 1 L de caldo de fermentación, se utilizan 0,1 m^{2} o menos de área de membrana con una velocidad de flujo cruzada de aproximadamente 30 L/h y una presión transmembrana de 25. La IL-21 se concentra hasta aproximadamente 10- 15 mg/mL y, a continuación, se diafiltra contra aproximadamente 5-10 diavolúmenes de histidina 10 mM, manitol al 4,725 (p/v), pH 5,0-5,3. La solución resultante se filtra de forma estéril.

Ejemplo 17 Purificación adicional de IL-21 A. Cromatografía de intercambio catiónico utilizando una resina SP HP Sepharose para purificación adicional

La purificación adicional utilizando SP HP Sepharose se realiza para mejorar adicionalmente la pureza global. El eluato de TOYOPEARL butil 650M se diluye hasta 30 mS/cm con agua, y, a continuación se ajusta a un pH 6,0 utilizando una solución madre de fosfato sódico dibásico. A continuación, la solución ajustada se filtra utilizando un filtro de 0,22 \mum. El material filtrado se carga en la columna a 10- 15 g de IL-21 por resina L en una columna equilibrada con fosfato 50 mM, pH 6,0, NaCl 0,3 M. Se utiliza UV 280 nm y UV 215 nm para controlar la cromatografía. Después de la carga, la columna se lava con tampón de equilibrio hasta que el UV alcanza la línea base. La IL-21 se eluye de la columna utilizando un gradiente de 10 volúmenes de columna hasta un 1005 de tampón de elución (fosfato 50 mM, pH 6,0, NaCl 0,7 M).

B. Cromatografía de intercambio aniónico

La IL-21 se pasa a través de una columna de intercambio aniónico para eliminar endotoxinas. Se equilibra una columna de Q Sepharose FF de Amersham Biosciences con tampón de equilibrio (Tris 20 mM, pH 8,0). La solución de IL-21 se ajusta hasta una conductividad inferior a 10 mS/cm con tampón de equilibrio. La solución de IL-21 ajustada se carga en la columna a una velocidad de flujo de 150 cm/h. La IL-2 no se une a la columna y se recoge en el flujo continuo. En otros ejemplos, se pueden utilizar una resina DEAE Sepharose FF de Amersham Biosciences o membranas Pall Mustang Q en lugar de Q Sepharose FF para purificar la IL-21. En otros ejemplos, se han observado valores de pH en el intervalo de 5,0 a 9,0 que dan lugar a una IL-21 que pasa a través del medio de intercambio aniónico.

C. Cromatografía de interacción hidrofóbica

En otros ejemplos, se ha utilizado la cromatografía de interacción hidrofóbica para purificar IL-21 utilizando condiciones diferentes de las descritas anteriormente con la resina de butilo. Se pueden utilizar como resina en ambos modos de unión y flujo continuo fenil Sepharose FF high sub de Amersham Biosciences, Fenil Sepharose HP de Amersham Biosciences y butil Sepahrose 4 FF de Amersham Biosciences. Para unirse a IL-21, las columnas se equilibran a acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 5,5. La IL-21 se ajusta a sulfato de amonio 1,5 M mediante la adición de sulfato de amonio sólido y agitación hasta que se disuelve. La solución de IL-21 ajustada se carga en la columna equilibrada a una velocidad de flujo de 150 cm/h. Se controla la absorbancia UV a 280 nm y 215 nm. Después del lavado, la IL-21 se eluye de la columna con un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna desde tampón de equilibrio al 100% hasta tampón de elución al 100% (acetato de sodio 25 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5). En el modo de flujo continuo, la solución que contiene IL-21 se ajusta a 1,0 M o menos de sulfato de amonio, y se carga en una columna equilibrada con acetato de sodio 25 mM,. NaCl 50 mM, sulfato de amonio 1,0 M, pH 5,5. Se recoge el flujo continuo.

En otros ejemplos, se ha utilizado la cromatografía de interacción hidrofóbica para purificar IL-21 utilizando sulfato de sodio como sal en lugar de sulfato de amonio. Se pueden utilizar como resina fenil Sepharose FF high sub de Amersham Biosciences, Fenil Sepharose HP de Amersham Biosciences y butil Sepahrose 4 FF de Amersham Biosciences. Las columnas se equilibran a acetato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 50 mM, sulfato de sodio 1,5 M, pH 5,5. La IL-21 se ajusta a sulfato de sodio 1,5 M mediante la adición de sulfato de sodio sólido y agitación hasta que se disuelve. La solución de IL-21 ajustada se carga en la columna equilibrada a una velocidad de flujo de 150 cm/h. Se controla la absorbancia UV a 280 nm y 215 nm. Después del lavado, la IL-21 se eluye de la columna con un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna desde tampón de equilibrio al 100% hasta tampón de elución al 100% (acetato de sodio 25 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5).

En otro ejemplo, se realizó HIC FPLC de flujo continuo en un sistema BIOCAD 700E FPLC (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) equipado con una columna de Butil Sepharose 4 FF (Amersham Biosciences). La columna se condicionó con NaOAc 25 mM, NaCl 600 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, pH 5,5. Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido al eluato de intercambio catiónico hasta una concentración final de 1 M. La solución se cargó en la columna y se recogió la IL-21 en el flujo continuo.

D. IMAC utilizando Sepharose quelante de metales

Se utilice Sepharose quelante de Amesham biosciences (Amersham) para purificar adicionalmente IL-21. El eluato de CIE de IL-21 capturada se carga en una columna cargada con iones cobre, zinc o níquel, a continuación se equilibra con acetato de sodio 25 mM, pH 5,5; NaCl 0,8 M. Se utiliza UV 280 nm y UV 215 nm para controlar la cromatografía. A continuación, la columna se lava con tampón de equilibrio hasta la línea base y se eluye utilizando un gradiente de 10 volúmenes de columna hasta el 100% de tampón de elución (acetato de sodio 25 mM, pH 5,5; NaCl 0,8 M, imidazol 0,5 M).

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Ejemplo 18 A. Análisis por HPLC de fase inversa de la IL-21 solubilizada en tampón de acetonitrilo

El método descrito aquí se utiliza para cuantificar IL-21 en muestras de cuerpos de inclusión solubilizados y muestras purificadas. Se utiliza una columna Jupiter C5 de 4,6 x 50 mm (300 \ring{A}, 5 \mum, Phenomenex) en un sistema de HPLC de Agilent Technologies de la serie 1100 con automuestreador termostatizado y un compartimento de la columna termostatizada. Se coloca un filtro de columna de 0,2 \mum antes de la columna. La fase móvil a es TFA al 0,1% en agua de grado HPLC y la fase móvil B es TFA al 0,1% en acetonitrilo.

La tabla del gradiente de elución/tiempo para muestras purificadas es la siguiente:

TABLA 10

12

La tabla del gradiente de elución/tiempo para muestras de cuerpos de inclusión solubilizados es la siguiente:

TABLA 11

13

La columna se equilibra a las condiciones iniciales de la tabla de gradiente de elución/tiempo hasta que se consigue una línea base estable.

Los parámetros del método son los siguientes:

1. Velocidad de flujo: 1 ml/min.

2. Tiempo del proceso total: 20 minutos.

3. Temperatura de la columna: 40ºC.

4. Temperatura del automuestreador: 8ºC.

5. Presión máxima de columna: 240 bar.

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6. Velocidad de extracción del inyector: 100 \muL/minuto.

7. Velocidad de expulsión del inyector: 100 \muL/minuto.

8. Longitud de onda de la recogida de datos con detector de sistema de diodos: Señal A: 280 nm, amplitud de banda de 25 nm.

9. Longitud de onda de la monitorización de datos con detector de sistema de diodos: Señal B: 215 nm, amplitud de banda de 10 nm.

10. Longitud de onda de referencia de datos con detector de sistema de diodos: Señal A: 350 nm, amplitud de banda de 25 nm; Señal B: 350 nm, amplitud de banda de 25 nm.

11. Autoequilibrio del detector del sistema de diodos: Modo Prerun/Postrun.

12. Tiempo de respuesta de la amplitud de pico: > 0,1 min.

13. Amplitud de rendija: 4 nm.

14. Función de lavado de la aguja: programado para reducir la carga de guanidina en la aguja y el asiento de la válvula de aguja.

Para la cuantificación de IL-21 no plegada, se diluye el patrón de referencia de IL-21 hasta 0,5 mg/mL con Tris 50 mM, pH 7,5, guanidina HCl 6 M, DTT 10 mM y se calienta a 40ºC durante 20 minutos. El patrón de referencia diluido se inyecta en la columna por lo menos cinco niveles entre 10 \mug y 50 \mug (por ejemplo, inyecciones de 10, 20, 30, 40 y 50 \mug). Las muestras de IL-21 solubilizada se giran en una micrófuga y se diluyen 1:10 en Tris 50 mM, pH 7,5, guanidina HCl 6 M, antes de la inyección de 25 \mul de muestra.

Para la cuantificación de IL-21 plegada, se diluye el patrón de referencia de IL-21 hasta 1,0 mg/ml con solución salina tamponada con fosfato, pH 6,0. Las muestras de IL-21 plegada se inyectan al HPLC sin ningún tratamiento. Después de la cromatografía, se integra el área bajos los picos de IL-21. Se construye una curva estándar y se lee la concentración de IL-21 en las muestras de la curva estándar.

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B. RP-HPLC basado en metanol para la cuantificación de IL-21

También se puede utilizar un método de RP-HPLC basado en metanol de quince minutos para evaluar los preparados de IL-21 que varían desde cuerpos de inclusión solubilizados hasta el producto final.

Los parámetros del métodos para el análisis mediante RP-HPLC basado en metanol de IL-21 son los siguientes:

Columna: Zorbax 300Sb-CN (4,6 x 50 mm), 3,5 micras

Fase móvil A: TFA al 0,154%, agua grado HPLC

Fase móvil B: TFA al 0,154%, metanol

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Tabla de grado de elución/tiempo TABLA 12

14

Tiempo del proceso total: 15 minutos.

Temperatura de la columna: 40ºC.

Temperatura del automuestreador: 5ºC.

Velocidad de extracción del inyector: 90 \muL/minuto.

Velocidad de expulsión del inyector: 90 \muL/minuto.

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Longitud de onda de la monitorización de datos con detector de sistema de diodos:

Señal A: 280 nm, amplitud de banda de 8 nm

Señal B: 215 nm, amplitud de banda de 8 nm.

Señal C: 280 nm, amplitud de banda de 6 nm.

(Longitud de onda de referencia apagada)

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Longitud de onda de la recogida de datos con detector de sistema de diodos:

Señal A: 280 nm, amplitud de banda de 8 nm

Longitudes de onda de referencia de datos con detector de sistema de diodos: Señales A y B 360 nm, amplitud de banda de 16 nm.

Autoequilibrio del detector del sistema de diodos: Modo Prerun/Postrun

Tiempo de respuesta de la amplitud de pico: > 0,1 min

Amplitud de rendija: 4 nm.

Margen para la absorbancia negativa: 100 mAu

Intervalo de la cantidad de carga de la curva estándar: 1-20 \mug

Volumen mínimo de inyección: 5 \muL

Volumen máximo de inyección: 100 \muL

Límite de la presión: 350 bar

Presión en el proceso normal: 130-200 bar

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Ejemplo 19 Cepa deficiente de OmpT para expresar IL-21 A. Construcción de una nueva cepa huésped para la producción de IL-21

El proceso actual para la producción de IL-21 incluye la expresión en la cepa de E. coli W3110 [F-mcrA mcrB 1N (rrnD- rrnE)1 \lambda-]. Aunque W3110 es un huésped robusto para la producción de IL-21, no es ideal para el proceso "downstream". Tras la lisis celular, la IL-21 se divide en la lisina 74 (tal como se muestra en la SEC ID No. 28) por la proteasa OmpT presente en la membrana exterior. Se sabe que esta proteasa divide otras proteínas heterólogas recombinantes, incluyendo FGF-18. La proteólisis de IL-21 no tiene lugar en cepas que carecen de OmpT, tal como BL21 [F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm lon]. Aunque la actividad de OmpT se puede minimizar durante la lisis celular con la adición de ZnSO_{4} o CuSO_{4}, el esquema de purificación se tuvo que diseñar para eliminar la IL-21 truncada del producto final. En un esfuerzo por centralizar el proceso hacia la producción de IL-21, se eliminó la proteasa OmpT de W3110 para crear una nueva cepa de producción. La construcción esta nueva cepa huésped de E. coli se describe a continuación.

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B. Construcción del plásmido pCHAN1 para la expresión del operón de recombinasa Red

Se utilizó una estrategia basada en recombinación homóloga para eliminar la proteasa OmpT de W3110. Con el fin de eliminar de manera eficaz los genes del cromosoma de E. coli mediante recombinación homóloga, ciertos enzimas con actividad recombinasa deben estar presentes en las células. Para llevar a cabo esto, se construyó un plásmido que albergaba el operón de recombinasa Red del bacteriófago \lambda Se sintetizó un fragmento que contenía los genes de recombinasa Red del ADN del bacteriófago \lambda (New England Biolab) mediante PCR utilizando los cebadores específicos de recombinación ZC43,586 (SEC ID NO: 29) y ZC43,587 (SEC ID NO: 30). La reacción contenía 100 pmol de cada uno de los cebadores ZC43,586 y ZC43,587, 10 \mul de 10X tampón PCR (Boehringer Mannheim), 1 \mul Pwo Polimerasa (Boehringer Mannheim), 10 \mul de una mezcla de nucleótidos trifosfato 0,25 mM (Perkin Elmer), y dH_{2}O en un volumen final de 100 \mul. La reacción de PCR consistía en un único ciclo de 5 minutos a 94ºC, seguido de 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC. Al último de los 30 ciclos le siguió una extensión de 5 minutos a 72ºC y la reacción concluyó con el mantenimiento durante toda la noche a 4ºC. El fragmento de 1964 pares de bases (bp) resultante contenía el operón de recombinasa Red (Sec ID No. 31). La secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEC ID No. 31 codifica para tres genes, Gam(\gamma), tal como se muestra a partir de los nucleótidos 41-454, Bet(\beta),
tal como se muestra en los nucleótidos 463-1245, y Exo tal como se muestra a partir de los nucleótidos 1245-1922.

Se incorporó el operón de la recombinasa Red en un plásmido mediante recombinación homóloga en levadura. Las células de levadura competentes (100 \mul de S. cerevisiae SF838-9Da) se combinaron con 100 ng de pTAP399 digerido con SmaI (depositado en la American Type Culture Collection en Manassas, VA. (no designado en el momento de la solicitud)), vector aceptor y 1 \mug del fragmento de PCR del anterior. La mezcla de levadura/ADN se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2 cm y se pulsó en un condensador de 25 \muF, \Omega infinita y 9,75 kV (5 kv/cm). A continuación, se añadió la mezcla de transformación a 1 ml de sorbitol 1,2 M y se incubó a 30ºC durante 1 hora. Las células se pusieron en placas en alícuotas de 500 \mul en dos placas URA DS (dextrosa al 2%, sorbitol al 2%) y se incubaron a 30ºC durante 2 días. Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ de las placas se suspendieron en 2 ml de H_{2}O y se agruparon como residuo celular mediante centrifugación. El residuo celular se resuspendió en 1 ml de tampón de lisis Qiagen P1 (Qiagen) y se transfirió a un tubo nuevo que contenía 1 ml de partículas de zirconio/sílica de 0,5 mm (Biospec Products Inc.). Las células se lisaron, las muestras se dejaron reposar, se transfirieron 250 \mul de lisado a un tubo nuevo, y se aisló el ADN plasmídico utilizando el kit Qiagen Spin Miniprep según las instrucciones del fabricante.

Las células DH10B de E. coli electrocompetentes (Invitrogen) se transformaron con 1 \mul del preparado de ADN de levadura. Las células se pulsaron en cubetas de 0,1 cm a 2,0 kV, 25 \muF y 100 Q. Tras la electroporación, se añadieron 250 \muL de SOC (Bacto Tryptone al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, gSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM) a cada muestra. Las células se dejaron recuperarse a 37ºC durante 2 horas. La muestra completa de 250 \mul se puso en una alícuota en una placa LB (caldo LB (Lennox), Bacto Agar al 1,8% (Difco)), que contenía 25 mg/L de kanamicina (Sigma). Las placas se incubaron a 37ºC durante la noche. Los clones individuales que albergaban el operón de recombinasa Red se identificaron mediante digestión por restricción para verificar la presencia del inserto. Los insertos de clones positivos se sometieron a análisis de secuencia. El plásmido que contenía el inserto correcto se designó como pCHAN1.

A continuación, se eliminó la secuencia de levadura del esqueleto del vector de pCHAN1. Se incubaron 3,0 \mul del ADN plasmídico durante toda la noche con 24,3 \muL de H_{2}O, 2,7 \muL de tampón H (roche) y 2,0 \muL de NotI (New England Biolabs) a 37ºC. Se mezclaron 5 \mul del digesto de toda la noche con 1 \mul de 6x colorante de muestra de ADN (25% Ficoll Tipo 400 (Sigma), 0,25% Azul de Bromofenol (EM Science), 0,25% Xileno Cianol (Kodak Biomedicals Inc.)), y 4 \mul de esta solución en un gel de agarosa al 1% (Em Sicence) para verificar la digestión completa. Para recircularizar el plásmido, se mezclaron 14 \mul del digesto de NotI de toda la noche con 4 \mul de 5x tampón de ligación (Invitrogen) y 2 \mul de ligasa (Invitrogen). La ligación se incubó durante toda la noche a 25ºC.

El pCHAN1 religado se transformó en W3110. Las células de W3110 electrocompetentes (50 \muL) se transformaron con 1 \muL de ADN de pCHAN1 utilizando el protocolo de electroporación para E. coli descrito anteriormente. Después de la recuperación, la mezcla de transformación completa de 250 \muL se puso en una alícuota en una placa LB que contenía 25 mg/l de kanamicina. Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche y diez de los clones resultantes se recogieron para el análisis posterior. Se desarrollaron a 37ºC durante toda la noche en 2,0 ml de Superbroth II (Becton Dickinson) que contenía 25 \mug/ml kanamicina. Al día siguiente, se utilizó 1,0 ml del digesto de toda la noche para confirmar la presencia de pCHAN1. Se utilizó el kit de Qiagen Spin Miniprep para fabricar el ADN plasmídico siguiendo las instrucciones del fabricante. La identidad del plásmido se confirmó mediante digestos de restricción utilizando EcoRI (Gibco BRL) y NotI (New England Biolabs). Se seleccionó el aislado #3 para la posterior experimentación y se denominó EE670.

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Generación de un fragmento de tetraciclina para la sustitución de genes en W3110

El gen de tetraciclina se escogió como marcador adecuado para la recombinación homóloga en el locus de OmpT, haciendo que el gen de OmpT sea inactivo. Se generó el fragmentopromotor de tetraciclina:tetraciclina (tet^{P}::tet) mediante PCR a partir del ADN de pBR322 (New England Biolabs) utilizando los cebadores específicos de recombinación ZG45,112 (SEC ID NO: 32) y ZG45,171 (SEC ID NO: 33). La mezcla de reacción contenía 100 pmol de cada uno de los cebadores, ZG45,112 y ZG45,171, 10 \mul de 10X de tampón PCR (Boehringer Mannheim), 1 \mul de Pwo Polimerasa (Boehringer Mannheim), 10 \mul de una mezcla de nucleótido trifosfato 0,25 mM (Perkin Elmer), y dH_{2}O en un volumen final de 100 \mul. Las condiciones para la reacción de PCR fueron 1 ciclo a los 2 minutos a 94ºC, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 2 minutos a 72ºC. A continuación, se hizo una extensión de 7 minutos a 72ºC y un mantenimiento a 4ºC durante toda la noche. El fragmento de 1590 bp resultante transporta tet^{p}::tet (SEC ID No. 34).

La reacción de PCR se cargó en un gel preparativo de agarosa al 1% para purificar el fragmento tet^{p}::tet. El fragmento tet^{p}::tet se cortó del gel y se colocó en un tubo eppendorf de 0,5 ml con un pequeño agujero en el fondo que se recubrió con hilo filtrante de acuario (Finny Products, Inc., Cincinnati, OH). El tubo se insertó en un tubo eppendorf de 1,5 ml y se giró en una centrífuga encima de la mesa a 14.000 rpm durante 10 minutos a 25ºC. El líquido en la base del tubo de 1,5 ml se mezcló con un 10% (v/v) de NaOAc 3 M y 2 volúmenes de etanol al 100%. La mezcla se incubó a -20ºC durante 10 minutos y se centrífugo durante 10 minutos a 4ºC en una centrífuga encima de la mesa para precipitar el fragmento de PCR. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el residuo celular en 50 \mul de H_{2}O. El fragmento tet^{p}::tet estaba a una concentración de trabajo de 50 ng/\mul.

El fragmento de PCR se ligó en el vector pCR4.0-BLUNT TOPO® (Invitrogen) para usarse como control positivo para los experimentos de sustitución de genes. La ligación se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Las células DH10B de E. coli (Invitrogen) se transformaron con 2 \muL del fragmento de ADN de tet^{p}::tet utilizando el protocolo de electroporación para E. coli descrito anteriormente. Tras la recuperación, la mezcla de transformación de 250 \muL completa se puso en una placa LB que contenía 100 mg/L de Ampicilina (Sigma). Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche.

Se recogieron diez clones para el análisis posterior. Se desarrollaron toda la noche en 2,0 ml de Superbroth II (Becton Dickinson) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina a 37ºC. Al día siguiente, se utilizó 1,0 ml del cultivo de toda la noche para confirmar la presencia de ADN plasmídico Se utilizó el kit de Qiagen Spin Miniprep para fabricar ADN plasmídico siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se sometió al análisis de restricción utilizando SalI (New England Biolabs) y PstI (New England Biolabs) para verificar la identidad del plásmido y la orientación del inserto. El aislado #1 se recogió para la experimentación posterior. El plásmido se denominó pSDH185 y el clon, EE686.

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Sustitución de genes en W3110: Eliminación del gen de OmpT

Se desarrolló un cultivo de 500 ml de W3110/pCHAN1 a 37ºC en medio SOB [triptona 20 g/L, extracto de levadura 5 g/L, NaCl 0,5 g/L, 10 ml/L de KCl 250 mM, 5 ml/L de MgCl_{2} 2 M, pH 7,0] hasta una DO600 de 0,6. El cultivo se dividió en cuatro cultivos de 125 ml. Un cultivo se dejó como control no inducido, mientras que los otros tres se indujeron con IPTG 1 mM durante 15 minutos, 30 minutos o 60 minutos. Al final de sus incubaciones respectivas, se produjeron células competentes a partir de los cuatro cultivos de la siguiente manera. Las células se agruparon mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos. Se extrajeron los sobrenadantes y cada residuo celular se resuspendió en 62,5 ml de H_{2}O enfriada con hielo. Los cultivos se agruparon de nuevo, se extrajo el sobrenadantes y cada residuo celular se resuspendió en 31,25 ml de glicerol al 105 frío. A continuación, los cultivos se centrifugaron a 8000 rpm durante 5minutos. Los residuos celulares se extrajeron correctamente y se resuspendieron en glicerol al 10% residual.

Los cuatro cultivos se dividieron en seis alícuotas de 50 \muL que se transformaron de las siguientes maneras: 1) sin ADN, control negativo, 2) 1 \muL (1 \mug/\muL) (New England Biolabs) de control positivo de pBR322, 3) 1 \muL (1 \mug/\muL) de control positivo de pTAP279, 4) 1 \mul de control positivo de pSDH185, 5) 2 \mul (50 ng/\mul) de fragmento tet^{p}::tet, y 6) 4 \mul (50 ng/\mul) de fragmento tet^{p}::tet. Las células se transformaron mediante electroporación tal como se ha descrito anteriormente para E. coli. Las mezclas de transformación completa se pusieron en placas LB que contenían tetraciclina 10 mg/L (Sigma), excepto de los controles de pTAP279 que se pusieron en placas LB que contenían 35 mg/L de cloramfenicol (Sigma). Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche. Además, se pusieron en placas LB diluciones 10^{-6} y 10^{-7} (en H_{2}O de cada uno de los cuatro cultivos) para evaluar la eficacia global del proceso de recombinación mediante la determinación del número de células.

El día siguiente se sacaron las placas de control del incubador y se evaluaron. Las muestras transformadas con los fragmentos de tet^{p}::tet se dejaron incubar durante 24 horas adicionales antes del ensayo. Se identificaron veintiséis de los cloanes más grandes para un análisis posterior.

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Caracterización de clones deficientes de ompT

Cada uno de los 26 clones seleccionados se desarrolló durante toda la noche a 37ºC en 1 ml de LB con 5 \mug/ml de tetraciclina. El día siguiente se generó ADN genómico de los 26 clones utilizando el Kit de aislamiento de ADN Genomic Prep (Amersham Pharmacia) según las instrucciones del fabricante.

El ADN genómico de cada clon se diluyó 1:100 en dH_{2}O para usarse como molde para análisis PCR. Cada muestra diluida se analizó utilizando tres grupos diferentes de cebadores de PCR (tres reacciones de PCR por clon). Las reacciones contenían 100 pmol cada uno del grupo de cebadores #1: ZG45,357 (SEC ID NO: 35) y ZG45,350 (SEC ID NO: 36), o el grupo de cebadores #2: ZG45,353 (SEC ID NO: 37) y ZG45,355 (SEC ID NO: 38), o el grupo de cebadores #3: ZG45,354 (SEC ID NO: 39) y ZG45,359 (SEC ID NO: 40). El resto del volumen final de 100 \muL se completó con 10 \muL de 10X tampón PCR (Boehringer Mannheim), 1 \mul Pwo Polimerasa (Boehringer Mannheim), 10 \mul de mezcla de nucleótido trifosfato 0,25 mM (Perkin Elmer) y dH_{2}O. Las condiciones de reacción fueron: 1 ciclo durante 5 minutos a 94ºC, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 2 minutos a 72ºc. El PCR concluyó con una extensión de 7 minutos a 72ºC y un mantenimiento durante toda la noche a 4ºC. Si el gen de OmpT en W3110 se sustituía de manera satisfactoria con el gen de tetraciclina, el grupo de cebadores #1 debería amplificar una banda de 1584 bp (SEC ID NO: 41), el grupo de cebadores #2 debería amplificar una banda de 1190 bp (SEC ID NO: 42). Los resultados demostraron que 25 de los 26 clones cribados eran clones ompT-. W3110 ompT- #1 y # 3 y se seleccionaron para un análisis posterior.

Para confirmar la pérdida de actividad proteolítica, se incubó la IL-21 con lisados celulares de las cepas de ompT recién derivadas y la W3110 parental. El lisado de la cepa de ompT, BL21, se incluyó como control positivo. Las células se inocularon en Superbroth II y se desarrollaron durante toda la noche a 37ºc. Se agruparon cuatro alícuotas de 1 ml de cada cultivo de toda la noche a temperatura ambiente y las células se lisaron utilizando BugBuster® (Novagen) según las instrucciones del fabricante. Se incubaron los lisados celulares a 25ºC durante 4 horas con: 1) 0.332 mg/ml de IL-21, o 2) 0,332 mg/ml de IL-21 en presencia de ZnCl_{2} 5 mM. Cada muestra se mezcló con un volumen igual de 4x tampón de muestra NuPAGE (invitrogen) que contenía \beta- mercaptoetanol al 2% (sigma). Las muestras reducidas calentaron durante 5 minutos a 100ºCy se cargaron 10 \muL en un gel de poliacrilamida NuPAGe al 10% (invitrogen). Se realizó la electroforesis a 130 V bajo condiciones desnaturalizantes (SDSPAGE) utilizando 1x tampón de desarrollo MES (Invitrogen). Los geles se tiñeron con Simply Blue Safestain (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los resultados indicaron que la proteasa OmpT se inactivó a través de la sustitución de genes. La IL-21 estaba completamente intacta después de una incubación de 4 horas en lisados de BL21, W3110 ompT- #1 y W3110 ompT- #3, pero se degradaba completamente en un lisado de W3110 parental. La actividad de la OmpT proteasa fue inhibida por zinc. En incubaciones que contenían ZnCl_{2} 5 mM, la IL-21 permanecía intacta, apoyando que la OmpT era responsable de la degradación. Las cepas W3110 ompT- recién construidas se denominaron ZGOLD1 (W3110 ompT- #1; (depositada en la American Type Culture Collection en Manassas, VA. (no designado en el momento de la solicitud))) y ZGOLD3 (W3110 ompT- #3).

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Caracterización de ZGOLD1 y ZGOLD3

ZGOLD1 y ZGOLD3 se desarrollaron al lado de W3110 parental para la evaluación del crecimiento. Los cultivos de las tres cepas se desarrollaron a 37ºC en LB hasta una DO600 de 1,0. Se midió la densidad celular cada hora para evaluar el crecimiento. Se pusieron en placas con kanamicina (véase anteriormente) diluciones (10^{-6}, 10^{-7} y 10^{-8} en H_{2}O) de cada cultivo para determinar el número de células. Los resultados indican que el crecimiento de las cepas de ZGOLD es equivalente al de la cepa parental W3110.

Para evaluar la eficacia de la transformación, las células se recogieron y se hicieron competentes para la transformación tal como se ha descrito anteriormente. Las alícuotas de cada cepa se transformaron con: 1) 1 \mul pTAP337 (plásmido de expresión de IL-21; ATCC No. PA-4853), o 2) sin ADN (control negativo). Se llevó a cabo la electroporación tal como se ha descrito anteriormente. Tras la recuperación, se puso la mezcla de transformación en una placa LB que contenía 25 mg/L de kanamicina y se incubó durante toda la noche a 37ºC. Los datos indican que la eficacia de transformación de W3110 no estaba afectada por la eliminación de opmT.

Diez clones de cada cepa ZGOLD transformados con el vector de expresión de IL-21 se seleccionaron para evaluar la producción de proteínas. Los clones se desarrollaron a 37ºC durante toda la noche en Superbroth II (que contenía 25 \mug/ml de kanamicina). Los cultivos de toda la noche se utilizaron para inocular agitadores de placa rodante (roller drums) que contenían Superbroth II con 25 \mug/ml de kanamicina. Las células se desarrollaron a 37ºC. Se desarrolló un segundo cultivo de uno de los clones y sirvió como control no inducido. Cuando la DO600 de cada cultivo fue de 1,5-2,0, se indujeron con IPTG 1 mM (ICN Biomedicals Inc.). La incubación de los cultivos continuó durante otras 5 horas. Las muestras de cada cultivo se analizaron mediante SDS-PAGE en un gen NuPAGE en gradiente del 4 al 12% (Invitrogen) bajo condiciones reductoras tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados indican que la producción de IL-21 por ZGOLD1 y ZGOLD3 es equivalente a la de la cepa parental W3110. Se seleccionó ZGOLD1/pTAP337 #1 (depositada en la American Type Culture Collection en Manassas, VA. (no designada en el momento de la solicitud)) para el desarrollo posterior del proceso para la producción de IL-21.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

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Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet US 6207442 B [0061]

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<110> ZymoGenetics, Inc.

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<120> PRODUCCIÓN DE IL-21 EN HUÉSPEDES PROCARIOTAS

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<130> 02-12PC

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<160> 42

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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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<210> 1

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<211> 642

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (47)...(535)

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<400> 1

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\hskip1cm15

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<210> 2

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<211> 162

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial del oligonucleótido ZC29740

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<220>

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<223> oligonucleótido ZC29740

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<400> 3

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ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa

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50

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<210> 4

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido ZC29741

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<400> 4

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tctgatttaa tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cg

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<210>5

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<211> 62

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido ZC29736

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido ZC29738

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\hskip1cm19

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<210> 7

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<211> 62

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido ZC29084

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\hskip1cm20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido ZC22127

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<400> 8

\hskip1cm21

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<210> 9

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido ZC22913

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ggaaccaggt cgttcacata gtttttcagc tgatcaacaa

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido ZC22914

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<400> 10

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ttgttgatca gctgaaaaac tatgtgaacg acctggttcc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22915

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtttctgac gacgacctgc gttggtggac ggcggtttac

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22916

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaccgcc gtccaccaac gcaggtcgtc gtcagaaaca

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22961

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttcacga gcacttcacc aacaaggacc atagattatg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22962

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaaggacc atagattatg caggatcgcc acatgattcg tatgcgtcag

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22963

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttttcagc tgatcaacaa tatcgatcag ctgacgcata cgaatcatgt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22964

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgtgaacg acctggttcc ggaattcctg ccggctccgg aagatgttga gaccaactgt

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22965

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagctgggc tttctggaaa caggagaaag cggaccactc acagttggtc tcaacatctt

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22966

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttccagaaa gcccagctga aatccgcaaa caccggtaac aacgaacgta tcatcaacgt

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22967

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttggtggac ggcggtttac gtttcagttt tttaatggaa acgttgatga tacgttcgtt

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22968

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaggtcgtc gtcagaaaca ccgtctgacc tgcccgtcct gtgattctta tgagaaaaaa

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22969

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagcaggga tttgaaacgt tccaggaatt ctttcggcgg ttttttctca taagaatcac

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22970

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtttcaaa tccctgctgc agaaaatgat tcaccagcac ctgtcctctc gtacccacgg

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22971

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatcttatct catccgccaa aacatcagga atcttcggaa ccgtgggtac gagaggacag

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC22972

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaatctgta tcaggctgaa aatcttatct catccgccaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC40133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC40107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 405

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IL-21 optimizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(405)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IL-21 optimizada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC43,586

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC43,587

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1965

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADN del operón de Red Recombinasa amplificada con ZC43,586 y ZC43,587

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC45.112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC45,171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1591

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de PCR del gen de promotor de tetraciclina::tetraciclina (tetp::tet) amplificado con ZC45,112 y ZC45,171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC45,357

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcattaagtt agatataaaa aatacatatt ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC45,350

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taattgttac attgaaatgg ctagttatt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC45.353

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaaatcta acaatgcgct catcgtc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC45,355

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaggtcgag gtggcccggc tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido ZC45,354

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctaccgaga ctttatcgtt tactcct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> oligonucleótido ZC45,359

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<400> 40

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttaaaatgtg tacttaagac cagcagta

\hfill

28

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<210> 41

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<211> 1585

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia del fragmento de PCR de 1584 bp amplificado con el grupo de cebadores #1 (ZC45,357 y ZC45,350)

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<400> 41

\hskip1cm29

\hskip1cm290

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<210> 42

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<211> 1191

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia del fragmento de PCR de 1190 bp amplificado con el grupo de cebadores #2 (ZC45,353 y ZC45,355)

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<400> 42

\hskip1cm30

Claims

1. Vector de expresión para producir la proteína IL-21 que comprende los siguientes elementos unidos operativamente:

(a) un origen de replicación procariota;

(b) un elemento de ADN de inicio de la transcripción;

(c) una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 27; y

(d) un terminador de la transcripción.

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2. Vector de expresión según la reivindicación 1, que comprende además un marcador seleccionable.

3. Vector de expresión según la reivindicación 2, en el que dicho marcador seleccionable comprende un gen de resistencia a kanamicina.

4. Célula huésped procariota transformada con un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Célula huésped según la reivindicación 4, en la que la célula huésped es la cepa W3110 de E. coli.

6. Célula huésped según la reivindicación 5, depositada en la American Type Culture Collection en Manassas, VA. bajo la Designación de Depósito para Patente PTA-4853.

7. Célula huésped según la reivindicación 4, en la que la célula huésped es una cepa deficiente de proteasa OmpT.

8. Célula huésped según la reivindicación 7, en la que la célula huésped es una cepa deficiente de proteasa OmpT de E. coli W3110.

9. Método para producir proteínas IL-21, que comprende:

(a) cultivar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 en un medio de crecimiento bajo condiciones en las que se expresa IL-21;

(b) recuperar las células huésped del medio de crecimiento; y

(c) aislar la proteína IL-21 de las células huésped.

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10. Método según la reivindicación 9, en el que la célula huésped se cultiva mediante fermentación por alimentación discontinua.

11. Método según la reivindicación 9, en el que dicha etapa de cultivo comprende:

(a) cultivar dicha célula huésped en un matraz de agitación hasta una DO600 de 5 a 20 en un medio de crecimiento;

(b) inocular un recipiente de fermentación con 1 a 12% v/v de medio del matraz de agitación que contiene células huésped;

(c) cultivar las células huésped en un medio de crecimiento a un pH de 6,2 a 7,2, en el que se introduce una solución de alimentación en el recipiente de fermentación antes de un tiempo de fermentación transcurrido (EFT) de 15 horas; y

(d) añadir un agente inductor al recipiente de fermentación a un EFT de 20 a 30 horas;

y en el que dicha etapa de recuperación comprende recoger las células huésped a un EFT de 48 a 56 horas.

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12. Método según la reivindicación 11, en el que el agente inductor es tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) a una concentración de 0,5 a 2 mM.

13. Método según la reivindicación 11, en el que la solución de alimentación comprende un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste en glicerol y glucosa a una concentración de medio de crecimiento, y una velocidad de alimentación de 5-15 gramos de carbohidrato por hora.

14. Método según la reivindicación 13, en el que el glicerol es del 40 al 70% v/v en glicerol o la glucosa es del 40 al 70% p/v en glucosa.

15. Método según la reivindicación 13, en el que el glicerol es del 70% v/v o la glucosa es del 60% p/v.

16. Método según la reivindicación 9, en el que dicha etapa de cultivo comprende:

(a) sembrar un matraz con un inóculo que comprende una célula huésped de E. coli W3110 que comprende un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que se expresa un polipéptido IL-21, y con un medio de crecimiento que comprende glicerol 5 g/L;

(b) cultivar el inóculo en el medio de crecimiento durante 16-20 horas a 30ºC;

(c) transferir el inóculo cultivado en un medio de crecimiento a un fermentador por lotes a una concentración de inóculo de 0,5-5% v/v;

(d) fermentar la fermentación por lotes a 37ºC y pH 6,8; con glicerol al 2%;

(e) introducir una alimentación de glucosa a un tiempo de fermentación transcurrido (EFT) de 8 horas de 9,5 g glucosa/litro/hora y que continúa hasta el final de la reacción de fermentación;

(f) añadir IPTG a un EFT de 24 horas hasta una concentración final de 0,5 a 2 mM;

(g) fermentar 28 horas después de la adición de IPTG;

y en el que dicha etapa de recuperación comprende recoger el caldo de fermentación del fermentador;

y en el que dicha etapa de aislamiento comprende añadir un volumen igual de agua al caldo de fermentación y homogeneizar y centrifugar el caldo de fermentación para recoger un residuo celular o emulsión celular que comprende material proteico de IL-21.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-16, en el que dicha proteína IL-21 comprende una secuencia de residuos de aminoácidos tal como se muestra en la SEC ID No. 28, y en el que dicha etapa de aislamiento comprende además:

(a) separar el material proteico de IL-21 insoluble en agua de un residuo celular o emulsión celular;

(b) disolver el material proteico de IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico;

(c) diluir el disolvente caotrópico y replegar la proteína IL-21; en el que la proteína IL-21 aislada es capaz de ser biológicamente activa.

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18. Método según la reivindicación 17, en el que dicha etapa de aislamiento comprende además eliminar las proteínas no plegadas y agregadas de dicha proteína IL-21 replegada mediante filtración, y en el que dicho método comprende además

(d) purificar la proteína IL-21 replegada en una columna de intercambio catiónico.

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19. Método según la reivindicación 18, en el que la proteína IL-21 aislada tiene por lo menos un 90% de pureza.

20. Método según la reivindicación 19 en el que la proteína IL-21 aislada tiene un nivel de endotoxina inferior a 10 unidades de endotoxina por mg de proteína IL-21.

21. Método según la reivindicación 18, que comprende la etapa inicial de separar de un caldo de fermentación un residuo celular o emulsión celular que comprende material proteico de IL-21 insoluble en agua;

en el que dicha etapa de separación (a) según la reivindicación 17, comprende homogeneizar el residuo celular o la emulsión celular para recoger los cuerpos de inclusión;

en el que dicho disolvente caotrópico comprende una sal de guanidina, y

en el que el disolvente caotrópico se diluye mediante la adición de un tampón de repliegue que comprende sales de arginina y una mezcla de componentes reductores y oxidantes.

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22. Método según la reivindicación 21, que comprende además la etapa de:

(e) purificar el eluato de Il-21 de la columna de intercambio catiónico en una columna de interacción hidrofóbica, en el que la proteína IL-21 aislada y purificada es capaz de ser biológicamente activa.

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23. Método según la reivindicación 18, en el que dicha etapa de separación (a) según la reivindicación 17 comprende homogeneizar el residuo celular o la emulsión celular para recoger cuerpos de inclusión; dicha etapa de disolución (b) según la reivindicación 17 comprende disolver la proteína IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende clorhidrato de guanidina 6 M, ditiotreitol 40 mM (DTT) durante una hora a temperatura ambiente; dichas etapas de dilución y repliegue (c) según la reivindicación 17 comprende:

(a) replegar los cuerpos de inclusión disueltos en una solución mediante la dilución en tampón de repliegue que comprende arginina 0,75 mM, pareja de oxidación-reducción DTT 2 mM/cistina 4 mM por lo menos 20 veces;

(b) ajustar el pH a 5,5 con ácido acético al 20% y dejar que la solución reaccione durante por lo menos 5 horas;

(c) diluir la solución con 1 + 1,4 volúmenes de acetato 25 mM, pH 5,5:

y en el que dichas etapas de filtración y purificación según la reivindicación 18, comprende:

(a): filtrar la solución;

(b): cargar la solución en una columna de resina equilibrada a pH 5,5 utilizando tampón de acetato de sodio;

(c): lavar la columna de resina con cloruro de sodio 0,4 M;

(d): lavar la columna de resina con cloruro de sodio 0,75 M para eluir la proteína IL-21 unida;

(e): añadir sulfato de amonio hasta una concentración de 1,5 M para eluir y filtrar la solución de eluato;

(f): cargar el eluato en una columna Tosohaas butil 650-M equilibrada a sulfato de amonio 1,5 M, cloruro de sodio 0,05 M en tampón de acetato de sodio;

(g): lavar la columna con sulfato de amonio 0,15 m, cloruro de sodio 0,05 en tampón acetato de sodio;

(h): diluir el eluato hasta una conductividad de 30 mS/cm con agua;

(i): cargar el eluato en una columna SP Sepharose HP equilibrada con tampón acetato de sodio;

(j): lavar la columna con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna desde 0,3 a 0,7 M de cloruro de sodio;

(k): concentrar la proteína IL-21; e

(l): intercambiar el tampón por el tampón de formulación utilizando una ultrafiltración de flujo tangencial.

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24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que la actividad biológica se mide utilizando un ensayo celular de unión a receptor de IL-21.