WO2015178466A1 - フィブロイン様タンパク質の製造法 - Google Patents

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WO2015178466A1
WO2015178466A1 PCT/JP2015/064656 JP2015064656W WO2015178466A1 WO 2015178466 A1 WO2015178466 A1 WO 2015178466A1 JP 2015064656 W JP2015064656 W JP 2015064656W WO 2015178466 A1 WO2015178466 A1 WO 2015178466A1
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WO
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fibroin
protein
culture
expression
induction
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PCT/JP2015/064656
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English (en)
French (fr)
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健太郎 中瀬
Original Assignee
味の素株式会社
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a fibroin-like protein by heterologous expression using Escherichia coli.
  • Fibroin is a fibrous protein that forms spider silk and silkworm silk.
  • Spider silk is a material that has a strength four times higher than steel, a high toughness that surpasses that of carbon fibers and aramid fibers, and also has stretchability and heat resistance. Therefore, it is desired to mass-produce fibroin, which is a constituent component thereof, or a fibrous protein having a structure equivalent thereto (hereinafter also collectively referred to as “fibroin-like protein”).
  • Patent Documents 1 and 2 there are reports of heterologous expression using Escherichia coli.
  • Non-patent Document 1 the specific production rate of TrpA1 protein by Escherichia coli increases as the specific growth rate increases
  • Non-Patent Document 2 the specific production rate of ⁇ -lactamase by Escherichia coli decreases as the specific growth rate increases.
  • Non-Patent Document 3 the production amount of interferon (alpha) 1 by Escherichia coli increases by the growth rate fall by glucose restriction
  • Non-patent Document 4 it has been reported that the yield of recombinant interferon ⁇ by Escherichia coli increases as the specific growth rate before expression induction increases.
  • hGH human growth hormone
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing a fibroin-like protein.
  • the inventors of the present application have improved production of fibroin-like protein by reducing cell growth after induction of fibroin-like protein expression during heterologous expression of fibroin-like protein by Escherichia coli. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention can be exemplified as follows.
  • [1] Culturing Escherichia coli having a gene encoding a fibroin-like protein in a medium; A method for producing a fibroin-like protein comprising inducing expression of a gene encoding a fibroin-like protein and collecting the fibroin-like protein, A method of reducing cell growth after the induction of expression.
  • [2] The method according to claim 1, wherein one or more selected from the cell growth rate, the slope of the cell growth rate, and the cumulative specific growth rate are reduced after the expression induction.
  • [3] The method as described above, wherein cell growth after the induction of expression is reduced by culturing under growth factor restriction during a period after the induction of expression.
  • the growth factor is one or more components selected from carbon sources, nitrogen sources, phosphate sources, sulfur sources, minerals, and nutrients required by auxotrophy.
  • the growth factor is one or more components selected from a carbon source, an organic nitrogen source, and a phosphate source.
  • the result of the control condition is indicated by ⁇
  • the result of the organic nitrogen source restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • the figure which shows the result of microbial cell proliferation after IPTG solution addition (A) microbial cell amount; (B) microbial cell increase rate; (C) slope of microbial cell increase rate; (D) cumulative specific growth rate.
  • the result of the control condition is indicated by ⁇ , and the result of the organic nitrogen source restriction condition is indicated by ⁇ .
  • A Fibroin-like protein accumulation amount per culture volume
  • B Fibroin-like protein accumulation amount per cell weight
  • C Cumulative productivity of fibroin-like protein.
  • the result of the control condition is indicated by ⁇
  • the result of the organic nitrogen source restriction condition is indicated by ⁇ .
  • A OD620;
  • B Phosphoric acid concentration in culture (converted to KH 2 PO 4 );
  • the result of the control condition is indicated by ⁇
  • the result of the phosphate restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • the result of the control condition is indicated by ⁇ , and the result of the phosphate restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the result of the control condition is indicated by ⁇ , and the result of the phosphate restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the result of the control condition is shown by ⁇ , and the result of the condition that enhanced the cell growth before the expression induction is shown by ⁇ .
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • the result of the control condition is shown by ⁇ , and the result of the condition that enhanced the cell growth before the expression induction is shown by ⁇ .
  • A Fibroin-like protein accumulation amount per culture volume;
  • the result of the control condition is shown by ⁇ , and the result of the condition that enhanced the cell growth before the expression induction is shown by ⁇ .
  • the result of the control condition is indicated by ⁇ , and the result of the carbon source restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • A Cell mass;
  • the result of the control condition is indicated by ⁇ , and the result of the carbon source restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the figure which shows the result of the production of the fibroin like protein after IPTG solution addition (A) Fibroin-like protein accumulation amount per culture volume; (B) Fibroin-like protein accumulation amount per cell weight; (C) Cumulative productivity of fibroin-like protein.
  • the result of the control condition is indicated by ⁇ , and the result of the carbon source restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the result of the control condition is indicated by ⁇ , and the result of the Ile restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • the result of the control condition is indicated by ⁇ , and the result of the Ile restriction condition is indicated by ⁇ .
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • the figure which shows a culture result. (A) Ile concentration in culture solution; (B) Ile total consumption amount; (C) Phosphoric acid concentration in culture solution (KH 2 PO 4 conversion); (D) Total phosphate consumption (KH 2 PO 4 conversion) ).
  • the result of the control condition is shown by ⁇ , and the result of the condition that enhanced the cell growth before the expression induction is shown by ⁇ .
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • the result of the control condition is shown by ⁇ , and the result of the condition that enhanced the cell growth before the expression induction is shown by ⁇ .
  • the arrow indicates the time when the IPTG solution was added.
  • ADF3 accumulation amount per culture volume (B) ADF3 accumulation amount per cell weight; (C) ADF3 cumulative productivity.
  • ⁇ The result of the control condition is shown by ⁇ , and the result of the condition that enhanced the cell growth before the expression induction is shown by ⁇ .
  • fibroin-like protein is a general term for fibroin and a fibrous protein having a structure equivalent thereto.
  • Fibroin is a fibrous protein that forms spider silk and silkworm silk. That is, examples of fibroin include spider fibroin and silkworm fibroin. The type of spider, silkworm, and yarn are not particularly limited. Spiders include the Japanese spider (Araneususdiadematus) and the American spider (Nephila clavipes). Spider fibroin is produced by bookmark thread, frame thread, warp protein (large bottle-shaped gland protein) produced by large bottle-shaped gland, scaffold thread protein (small bottle-shaped gland protein) produced by small bottle-shaped gland, and flagellate gland And weft protein (flagellate protein).
  • spider fibroin examples include the large bottle-shaped gland proteins ADF3 and ADF4 of the spider spider and the large bottle-shaped gland proteins MaSp1 and MaSp2 of the American spider spider.
  • silkworms include Bombyx mori and Samia cynthia.
  • the amino acid sequences of these fibroin and the base sequence of the gene encoding these fibroin can be obtained from public databases such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). You can get it.
  • the amino acid sequence of ADF3 (partial; NCBI AAC47010.1 GI: 1263287) of the tiger spider is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the fibroin-like protein may be, for example, a protein having the amino acid sequence of fibroin disclosed in the database (for example, SEQ ID NO: 3).
  • the gene encoding the fibroin-like protein (also referred to as “fibroin-like protein gene”) may be, for example, a gene having the base sequence of the fibroin gene disclosed in the above database.
  • the expression “having an (amino acid or base) sequence” includes the case of “including the (amino acid or base) sequence” and the case of “consisting of the (amino acid or base) sequence”.
  • the fibrous protein having a structure similar to fibroin refers to a fibrous protein having the same sequence as the repetitive sequence of fibroin.
  • the “sequence similar to the repetitive sequence possessed by fibroin” may be a sequence actually possessed by fibroin or a sequence similar thereto.
  • Examples of the fibrous protein having a structure similar to fibroin include a polypeptide derived from a large sphincter bookmark protein described in WO2012 / 165476 and a recombinant spider silk protein described in WO2006 / 008163.
  • sequence similar to the repetitive sequence possessed by fibroin includes a sequence represented by the following formula I (hereinafter also referred to as “repetitive sequence I”) (WO2012 / 165476): REP1-REP2 (I)
  • REP1 is an amino acid sequence consisting of a continuous sequence of one or more amino acids selected from alanine and glycine.
  • the order of alanine and glycine is not particularly limited.
  • alanine may be 2 residues or more
  • glycine may be 2 residues or more
  • alanine and glycine may be alternately arranged.
  • the length of REP1 may be, for example, 2 residues or more, 3 residues or more, 4 residues or more, or 5 residues or more, 20 residues or less, 16 residues or less, 12 residues or less, or It may be 8 residues or less, or a combination thereof.
  • the length of REP1 may be, for example, 2-20 residues, 3-16 residues, 4-12 residues, or 5-8 residues.
  • REP1 corresponds to, for example, a crystal region that forms a crystal ⁇ sheet in a fiber in spider fibroin.
  • REP2 is an amino acid sequence containing one or more amino acids selected from glycine, serine, glutamine, and alanine.
  • the total number of residues of glycine, serine, glutamine, and alanine may be, for example, 40% or more, 60% or more, or 70% or more of the total number of amino acid residues of REP2.
  • the length of REP2 may be, for example, 2 residues or more, 10 residues or more, or 20 residues or more, 200 residues or less, 150 residues or less, 100 residues or less, or 75 residues or less. It may be present or a combination thereof.
  • the length of REP2 may be, for example, 2 to 200 residues, 10 to 150 residues, 20 to 100 residues, or 20 to 75 residues.
  • REP2 corresponds to, for example, an amorphous region that is flexible and largely lacks a regular structure in spider fibroin.
  • the number of repetitions of repetitive sequence I is not particularly limited.
  • the number of repetitions of the repetitive sequence I may be, for example, 2 or more, 5 or more, or 10 or more, 100 or less, 50 or less, or 30 or less, or a combination thereof.
  • the configuration of REP1 and REP2 may or may not be the same in each iteration.
  • a fibrous protein having a structure similar to fibroin has, for example, an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence near the C terminus of spider fibroin at the C terminus in addition to the sequence similar to the repetitive sequence possessed by fibroin. You may have.
  • Examples of the amino acid sequence near the C-terminal of spider fibroin include, for example, the amino acid sequence of C-terminal 50 residues of spider fibroin, the amino acid sequence obtained by removing C-terminal 20 residues from C-terminal 50 residues, C-terminal 50 residues An amino acid sequence obtained by removing 29 residues from the C-terminal.
  • amino acid sequence near the C-terminal of spider fibroin include, for example, positions 587 to 636 (C-terminal 50 residues) of ADF3 (partial; NCBI AAC47010.1 ⁇ GI: 1263287) shown in SEQ ID NO: 3 And the sequences of positions 587 to 616 and 587 to 607.
  • a fibrous protein having a sequence similar to the repetitive sequence of fibroin and having an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence near the C terminus of spider fibroin at the C terminus
  • examples thereof include a protein encoded by a gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 of WO2012 / 165476A1.
  • the base sequence of the gene is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the fibroin-like protein may be a variant of the above-exemplified fibroin-like protein (that is, the above-exemplified fibroin or a fibrillar protein having a structure equivalent thereto).
  • the fibroin-like protein gene is a variant of the above-exemplified fibroin-like protein gene (that is, a gene encoding fibroin exemplified above or a fibrous protein having a structure equivalent thereto). There may be.
  • Such a variant in which the original function is maintained may be referred to as a “conservative variant”. Examples of the conservative variant include the above-exemplified fibroin-like protein, homologues of genes encoding the same, and artificially modified variants.
  • the original function is maintained means that the variant of the gene or protein has a function (activity or property) corresponding to the function (activity or property) of the original gene or protein. That is, “the original function is maintained” means that in the case of a fibroin-like protein, the variant of the protein is a fibrous protein. In addition, in the case of a fibroin-like protein gene, “the original function is maintained” means that a variant of the gene encodes a protein in which the original function is maintained (that is, a fibrous protein). “Fibrous protein” refers to a protein that takes a fibrous form under predetermined conditions.
  • the fibrous protein may be a protein expressed in a fibrous form, or may be a protein that can be processed into a fibrous form although not in a fibrous form at the time of expression.
  • the fibrous protein may be, for example, a protein that is expressed as an inclusion body and can then be processed into a fibrous form by an appropriate technique.
  • homologs of fibroin-like proteins include proteins obtained from public databases by BLAST search and FASTA search using the amino acid sequence of the fibroin-like protein as a query sequence.
  • the homologue of the fibroin-like protein gene can be obtained, for example, by PCR using, as a primer, an oligonucleotide prepared based on the base sequence of the fibroin-like protein gene using chromosomes of various organisms as templates.
  • the fibroin-like protein is an amino acid in which one or several amino acids at one or several positions are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of the fibroin-like protein. It may be a protein having a sequence.
  • the above “one or several” varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, Preferably, it means 1-20, more preferably 1-10, even more preferably 1-5, particularly preferably 1-3.
  • substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids described above is a conservative mutation that maintains the protein function normally.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In this case, between Gln and Asn, when it is a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, when it is an acidic amino acid, between Asp and Glu, when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
  • the fibroin-like protein is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97%, based on the entire amino acid sequence of the fibroin-like protein. % Or more, particularly preferably a protein having an amino acid sequence having a homology of 99% or more.
  • “homology” may refer to “identity”.
  • the fibroin-like protein can be prepared from a base sequence of the fibroin-like protein gene, for example, a complementary sequence to the whole or a part of the base sequence, under stringent conditions. It may be a protein encoded by DNA that hybridizes with Such a probe can be prepared, for example, by PCR using an oligonucleotide prepared based on the base sequence as a primer and a DNA fragment containing the base sequence as a template. “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • highly homologous DNAs for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
  • are hybridized and DNAs with lower homology do not hybridize with each other, or normal Southern hybridization washing conditions of 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C., 0.1 ⁇ SSC And 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, conditions of washing once, preferably 2 to 3 times.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • the fibroin-like protein may be a fusion protein with another peptide.
  • the “other peptide” is not particularly limited as long as a fibroin-like protein having a desired property is obtained.
  • “Other peptides” can be appropriately selected depending on various conditions such as the purpose of use.
  • “Other peptides” include peptide tags and protease recognition sequences.
  • “Other peptides” may be linked, for example, to the N-terminus or C-terminus of a fibroin-like protein, or both.
  • Specific peptide tags include His tags, FLAG tags, GST tags, Myc tags, MBP (maltose binding protein), CBP (cellulose binding protein), TRX (Thioredoxin), GFP (green fluorescent protein), HRP (horseradish) peroxidase), ALP (Alkaline Phosphatase), and antibody Fc region.
  • the peptide tag can be used, for example, for detection and purification of the expressed fibroin-like protein.
  • protease recognition sequences include HRV3C protease recognition sequence, Factor® Xa protease recognition sequence, and proTEV protease recognition sequence.
  • the protease recognition sequence can be used, for example, to cleave the expressed fibroin-like protein.
  • a protease is introduced from the expressed fibroin-like protein by introducing a recognition sequence for the protease into the connecting portion of the fibroin-like protein and the peptide tag. Utilizing this, the peptide tag can be cleaved to obtain a fibroin-like protein having no peptide tag.
  • ADF3 SEQ ID NO: 5 of the elder spider in which a His tag and an HRV3C protease recognition sequence are added to the N-terminus
  • examples of the base sequence encoding the fusion protein of SEQ ID NO: 5 include the base sequence at positions 12 to 1994 of SEQ ID NO: 4.
  • the fibroin-like protein gene may be one obtained by substituting an arbitrary codon with a codon equivalent to the base sequence of the fibroin-like protein gene exemplified above or a conservative variant thereof.
  • the fibroin-like protein gene may be modified to have an optimal codon depending on the codon usage of the host to be used.
  • the bacterium of the present invention is Escherichia coli having a gene encoding a fibroin-like protein.
  • the bacterium of the present invention has a fibroin-like protein gene and thus has the ability to produce a fibroin-like protein.
  • “The bacterium of the present invention has the ability to produce a fibroin-like protein” means that, for example, when the bacterium of the present invention is cultured in a medium, the fibroin-like protein can be produced and recovered to the extent that it can be recovered. Means to accumulate.
  • Escherichia coli is not particularly limited, but includes bacteria classified as Escherichia coli according to classification known to microbiologists.
  • Escherichia coli include, for example, Escherichia coli K-12 strains such as W3110 strain (ATCC 32525) and MG1655 strain (ATCC 47076); Escherichia coli K5 strain (ATCC 23506); BL21 (DE3) strain And Escherichia coli B strains such as the BLR (DE3) strain, which is a recA-strain thereof, and derivatives thereof.
  • strains can be sold, for example, from the American Type Culture Collection (address 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States States of America). That is, a registration number corresponding to each strain is given, and it is possible to receive a sale using this registration number (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.
  • the BL21 (DE3) strain is available, for example, from Life Technologies (product number C6000-03).
  • the BLR (DE3) strain is available, for example, from Merck Millipore (product number 69053).
  • the bacterium of the present invention may be an auxotrophic strain.
  • An auxotrophic strain may have one type of auxotrophy and may have two or more types of auxotrophy.
  • Nutritional requirements include amino acid requirements such as isoleucine requirements and nucleic acid requirements.
  • the Escherichia coli BLR (DE3) strain has isoleucine requirements (Schmidt M, Romer L, Strehle M, Scheibel T, Biotechnol Lett 2007, 29 (11): 1741-1744.).
  • Escherichia coli having a fibroin-like protein gene can be obtained by introducing the same gene into the Escherichia coli strain as described above.
  • Escherichia coli strain into which the fibroin-like protein gene is introduced and introduced is also collectively referred to as “host”.
  • a fibroin-like protein gene can be obtained by cloning from an organism having a fibroin-like protein gene.
  • nucleic acids such as genomic DNA and cDNA containing the same gene can be used.
  • Fibroin-like protein genes can also be obtained by chemical synthesis (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).
  • the obtained fibroin-like protein gene can be appropriately modified to obtain the variant.
  • the gene can be modified by a known method.
  • a target mutation can be introduced into a target site of DNA by site-specific mutagenesis. That is, for example, the coding region of a gene can be modified by site-directed mutagenesis so that an amino acid residue at a specific site of the encoded protein includes substitution, deletion, insertion or addition.
  • site-directed mutagenesis a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, rlErlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., ethMeth.
  • the method for introducing the fibroin-like protein gene into the host is not particularly limited.
  • the fibroin-like protein gene is retained so that it is expressed under the control of an inducible promoter that functions in the host.
  • the fibroin-like protein gene may exist on a vector that autonomously replicates outside the chromosome, such as a plasmid, cosmid, or phagemid, or may be introduced on the chromosome.
  • the host may have only one copy of the fibroin-like protein gene or may have two or more copies.
  • the host may have only one type of fibroin-like protein gene or may have two or more types of fibroin-like protein genes.
  • the promoter for expressing the fibroin-like protein gene is not particularly limited as long as it is an inducible one that functions in the host.
  • the “inducible promoter that functions in a host” refers to a promoter having promoter activity that can be induced in a host.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous promoter.
  • Inducible promoters that function in Escherichia coli include lac promoter, trc promoter, tac promoter, trp promoter, araBAD promoter, tetA promoter, rhaP BAD promoter, proU promoter, cspA promoter, ⁇ P L promoter, ⁇ P R promoter, phoA Directly inducible promoters such as promoter and pstS promoter, and indirectly inducible promoters such as T3 promoter, T5 promoter, T7 promoter, SP6 promoter and the like can be mentioned.
  • Gene expression from the lac promoter, trc promoter, tac promoter can be induced by isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) or lactose.
  • Gene expression from the trp promoter can be induced by 3- ⁇ -indoleacrylic acid (IAA).
  • Gene expression from the araBAD promoter can be induced by L-arabinose.
  • Gene expression from the tetA promoter can be induced by anhydrotetracycline.
  • Gene expression from the rhaP BAD promoter can be induced by L-rhamnose.
  • Gene expression from the proU promoter can be induced by NaCl.
  • Gene expression from the trp promoter can also be induced by depletion of tryptophan in the medium.
  • Gene expression from the cspA promoter can be induced by low temperature conditions.
  • Gene expression from the ⁇ P L promoter and ⁇ P R promoter can be induced under high temperature conditions.
  • Gene expression from the phoA promoter and the pstS promoter can be induced by depletion of phosphate in the medium.
  • Transcription of genes from the T3 promoter, T5 promoter, T7 promoter, and SP6 promoter is performed by phage-derived T3 RNA polymerase, T5 RNA polymerase, T7 RNA polymerase, and SP6 RNA polymerase, respectively.
  • gene expression from the T3 promoter, T5 promoter, T7 promoter, and SP6 promoter can be indirectly induced by inducing and expressing the corresponding RNA polymerase under the control of a directly inducible promoter as described above.
  • the promoters as described above may be used as they are, or may be modified as appropriate.
  • a highly active type of the above conventional promoter may be obtained and used.
  • the activity of the promoter can be increased by bringing the ⁇ 35 and ⁇ 10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (WO 00/18935).
  • highly active promoters include various tac-like promoters (Katashkina JI et al.
  • the fibroin-like protein gene can be introduced into a host using a vector containing the gene, for example.
  • a vector containing a fibroin-like protein gene is also referred to as a recombinant DNA of a fibroin-like protein gene.
  • a recombinant DNA of a fibroin-like protein gene can be constructed, for example, by ligating a DNA fragment containing the fibroin-like protein gene with a vector that functions in the host. By transforming a host with a recombinant DNA of a fibroin-like protein gene, a transformant into which the recombinant DNA has been introduced can be obtained, that is, the gene can be introduced into the host.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell can be used.
  • the vector is preferably a multicopy vector. Further, the vector preferably has a marker such as an antibiotic resistance gene in order to select a transformant.
  • the vector may also be provided with an inducible promoter that functions in Escherichia coli for expressing the inserted gene.
  • the vector may be, for example, a vector derived from a bacterial plasmid, a vector derived from a yeast plasmid, a vector derived from a bacteriophage, a cosmid, or a phagemid.
  • vectors capable of autonomous replication in Escherichia coli include, for example, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (all available from Takara Bio Inc.), pACYC184, pMW219 (Nippon Gene), pTrc99A (Pharmacia), pPROK vector (Clontech), pKK233-2 (Clontech), pET vector (Novagen), pQE vector (Qiagen), pCold TF DNA (TaKaRa), pACYC, wide host Area vector RSF1010.
  • the coding region of the fibroin-like protein may be incorporated into the vector after being bound downstream of the promoter as described above.
  • a fibroin-like protein coding region may be incorporated downstream.
  • the fibroin-like protein gene can be introduced into the host chromosome, for example.
  • Introduction of a gene into a chromosome can be performed, for example, using homologous recombination (Miller I, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • homologous recombination Examples of gene introduction methods using homologous recombination include the Red-driven integration method (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97).
  • a transduction method using a phage Only one copy of the gene may be introduced, or two copies or more may be introduced.
  • multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a sequence having multiple copies on the chromosome as a target. Examples of sequences having many copies on a chromosome include repetitive DNA sequences (inverted DNA) and inverted repeats present at both ends of a transposon.
  • homologous recombination may be performed by targeting an appropriate sequence on a chromosome such as a gene unnecessary for carrying out the present invention.
  • the gene can also be randomly introduced onto the chromosome using transposon or Mini-Mu (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985, US Pat. No. 5,882,888, EP805867B1).
  • the coding region of a fibroin-like protein may be linked downstream of the promoter as described above and then incorporated into the chromosome.
  • a fibroin-like protein coding region may be incorporated downstream.
  • the introduction of a gene onto a chromosome can be attributed to, for example, Southern hybridization using a probe having a base sequence complementary to all or part of the gene, or a primer prepared based on the base sequence of the gene. Can be confirmed by PCR.
  • the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a transformation method for example, a method in which a recipient cell is treated with calcium chloride to increase DNA permeability as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162), as described for Bacillus subtilis, a method of preparing competent cells from cells at the growth stage and introducing DNA (Duncan, C. H. , Wilson, G. A. and Young, F. E .., 1997. Gene 1: 153-167).
  • recombinant DNA is prepared by transforming DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, into a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA.
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast
  • a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA.
  • the method of the present invention induces the expression of a gene encoding a fibroin-like protein by culturing Escherichia coli (the bacterium of the present invention) having a gene encoding a fibroin-like protein in a medium. And a method for producing a fibroin-like protein comprising collecting a fibroin-like protein, wherein the cell growth after the induction of expression is reduced.
  • culture of the bacterium of the present invention is started. After the start of culture, the expression of the fibroin-like protein gene is induced at an appropriate timing. After the induction of expression, the culture is further continued, and the fibroin-like protein is produced and accumulated in the medium and / or in the microbial cells.
  • “at the time of expression induction” means a time point at which the expression induction is performed, that is, a time point at which expression of a fibroin-like protein gene is induced.
  • the period from the start of culture to the expression induction is also referred to as “period before expression induction”, and the period from the expression induction to the end of culture is also referred to as “period after expression induction”.
  • the expression level of the fibroin-like protein gene increases as a result of induction of expression as compared to the normal time.
  • the expression level of the fibroin-like protein gene may be increased at least 2 times, preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more than usual.
  • “Normal” means a condition in which a fibroin-like protein gene is expressed under the control of a promoter that is not inducible, or a condition in which an expression inducing condition according to the configuration of the employed expression system is not satisfied.
  • “Conditions for expressing a fibroin-like protein gene under the control of a non-inducible promoter” include conditions under which the fibroin-like protein gene is expressed under the control of the original promoter of the gene that is not inducible. “Conditions that the expression induction condition according to the configuration of the adopted expression system is not satisfied” include the condition that the substance is not added when expression is induced by the presence of a certain substance, When expression is induced by deficiency, there is a condition that the substance is not deficient, and when expression is induced at a certain temperature, the temperature of the culture system is outside the temperature range at which the expression is induced. Can be mentioned.
  • the culture conditions are particularly limited as long as the bacterium of the present invention can grow in the period before the expression induction, the cell growth in the period after the expression induction is reduced, and the fibroin-like protein is produced and accumulated in the period after the expression induction. Not. In the period after expression induction, the bacterium of the present invention may or may not grow.
  • the culture conditions may or may not be the same in the period before expression induction and the period after expression induction. Culture conditions can be appropriately set by those skilled in the art according to various conditions such as the type of technique for reducing bacterial cell growth.
  • the length of “period before expression induction”, that is, the timing of expression induction can be appropriately set according to various conditions such as culture conditions.
  • Expression induction may be performed, for example, after 0 hours from the start of culture, after 1 hour, after 2 hours, or after 3 hours, up to 240 hours after the start of culture, up to 200 hours, 160 It may be performed until time, 120 hours, or 80 hours, or a combination thereof.
  • the expression induction may be performed, for example, when the OD620 of the culture becomes 40 to 500, 40 to 400, 40 to 300, or 40 to 200.
  • the length of the “period after expression induction” can be appropriately set according to various conditions such as culture conditions.
  • the culture time after induction of expression may be, for example, 1 hour or more, 4 hours or more, or 8 hours or more, and is 240 hours or less, 200 hours or less, 160 hours or less, 120 hours or less, or 80 hours or less. It may be a combination thereof.
  • Expression induction can be performed according to the configuration of the employed expression system. That is, for example, isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) or lactose is used when the lac promoter, trc promoter, or tac promoter is used, and 3- ⁇ -indoleacrylic acid is used when the trp promoter is used. (IAA), L-arabinose when using the araBAD promoter, Anhydrotetracycline when using the tetA promoter, L-rhamnose when using the rhaP BAD promoter, NaCl when using the proU promoter, By adding to each medium, the expression of fibroin-like protein can be induced.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • lactose lactose
  • trc promoter lactose
  • tac promoter 3- ⁇ -indoleacrylic acid
  • 3- ⁇ -indoleacrylic acid is used
  • fibroin-like protein expression can also be induced by depletion of tryptophan in the medium.
  • the expression of fibroin-like protein can be induced by lowering the temperature of the medium (eg, lowering to about 15 ° C.).
  • the .lambda.P L promoters or .lambda.P R promoter (raised to e.g. 42 ° C.) to raise the temperature of the medium by, it is possible to induce the expression of fibroin-like proteins.
  • expression of a fibroin-like protein can be induced by depletion of phosphate in the medium.
  • a T3 promoter, T5 promoter, T7 promoter, or SP6 promoter the expression of a fibroin-like protein can be induced by appropriately inducing the expression of the corresponding RNA polymerase.
  • the expression induction conditions can be appropriately selected. Further, depending on the configuration of the expression system, two or more expression induction conditions may be used in combination.
  • a normal medium used for culturing bacteria such as Escherichia coli can be used as it is or after being appropriately modified.
  • a liquid medium containing a component selected from a carbon source, a nitrogen source, a phosphoric acid source, a sulfur source, and other various organic and inorganic components as required can be used.
  • a person skilled in the art may appropriately set the type and concentration of the medium component.
  • carbon sources include glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, xylose, arabinose, waste molasses, starch hydrolysate, biomass hydrolyzate, and other sugars, acetic acid, fumaric acid, citric acid, Examples thereof include organic acids such as succinic acid and malic acid, alcohols such as glycerol, crude glycerol and ethanol, and fatty acids.
  • organic acids such as succinic acid and malic acid, alcohols such as glycerol, crude glycerol and ethanol, and fatty acids.
  • carbon sources other than organic acids are preferable, saccharides are more preferable, and glucose is particularly preferable.
  • the ratio of glucose in the total carbon source is 50% (w / w) or more, 70% (w / w) or more, 90% (w / w) or more, 95% (w / w) or more, or 100 % (W / w).
  • the nitrogen source examples include ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, meat extract, and soybean protein degradation product, ammonia, and urea.
  • ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, meat extract, and soybean protein degradation product, ammonia, and urea.
  • one kind of nitrogen source may be used, or two or more kinds of nitrogen sources may be used in combination.
  • the phosphoric acid source examples include phosphates such as potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate, and phosphate polymers such as pyrophosphoric acid.
  • phosphates such as potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate
  • phosphate polymers such as pyrophosphoric acid.
  • the phosphoric acid source one type of phosphoric acid source may be used, or two or more types of phosphoric acid sources may be used in combination.
  • the sulfur source include inorganic sulfur compounds such as sulfate, thiosulfate, and sulfite, and sulfur-containing amino acids such as cysteine, cystine, and glutathione.
  • the sulfur source one kind of sulfur source may be used, or two or more kinds of sulfur sources may be used in combination.
  • organic and inorganic components include, for example, inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride; trace metals such as iron, manganese, magnesium and calcium; vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6 and nicotine Examples include vitamins such as acid, nicotinamide, and vitamin B12; amino acids; nucleic acids; and organic components such as peptone, casamino acid, yeast extract, and soybean protein degradation products containing these.
  • inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride
  • trace metals such as iron, manganese, magnesium and calcium
  • vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6 and nicotine include vitamins such as acid, nicotinamide, and vitamin B12; amino acids; nucleic acids; and organic components such as peptone, casamino acid, yeast extract, and soybean protein degradation products containing these.
  • vitamins such as acid, nicotinamide, and vitamin B12
  • amino acids amino acids
  • nucleic acids amino acids
  • organic components such as peptone, casamino acid, yeast extract, and soybean
  • an auxotrophic strain that requires nutrients such as amino acids for growth it is preferable to supplement nutrients required for the medium.
  • a gene is introduced using a vector carrying an antibiotic resistance gene, it is preferable to add an antibiotic corresponding to the medium.
  • the culture can be performed aerobically, for example, by aeration culture or shaking culture.
  • the oxygen concentration may be controlled to be, for example, 5 to 50% of the saturated dissolved oxygen concentration, preferably 20 to 40% of the saturated dissolved oxygen concentration.
  • the culture temperature may be, for example, 20 to 45 ° C, 25 to 40 ° C, or 30 to 37 ° C.
  • the pH during the cultivation may be, for example, 5-9.
  • inorganic or organic acidic or alkaline substances such as calcium carbonate, ammonia gas, aqueous ammonia, etc. can be used for pH adjustment. Culturing can be carried out by batch culture, fed-batch culture, continuous culture, or a combination thereof.
  • the culture medium at the start of the culture is also referred to as “initial culture medium”.
  • a medium supplied to a culture system (fermentor) in fed-batch culture or continuous culture is also referred to as “fed-batch medium”.
  • supplying a feeding medium to a culture system in fed-batch culture or continuous culture is also referred to as “fed-batch”.
  • cultivation may be performed by dividing into preculture and main culture.
  • the preculture may be performed using, for example, a flat plate medium or a liquid medium.
  • each medium component may be contained in the initial medium, the fed-batch medium, or both.
  • the type of component contained in the initial culture medium may or may not be the same as the type of component contained in the fed-batch medium.
  • concentration of each component contained in a starting culture medium may be the same as the density
  • the method of the present invention is characterized in that cell growth after inducing expression of a fibroin-like protein is reduced.
  • the cell growth is reduced means that the parameter indicating the degree of cell growth is lower than the control condition, and includes the case where the cells are not growing at all.
  • “Parameter indicating the degree of cell growth” refers to the cell growth rate (cell growth rate), the slope of cell growth rate (cell growth rate slope), the cumulative specific growth rate ( ⁇ cumulative), or a combination of these.
  • the cell growth is reduced means, for example, that the parameter indicating the degree of cell growth is 95% or less, 90% or less, 80% or less, 70% or less, or 50% of the same parameter of the control condition.
  • “Bacterial growth is reduced” means, for example, that the cumulative specific growth rate is 0.070 (/ h) or less, 0.050 (/ h) or less, when accumulation of fibroin-like protein stops. It may be 0.030 (/ h) or less, 0.025 (/ h) or less, 0.020 (/ h) or less, or 0.015 (/ h) or less. “Bacterial growth is reduced” means, for example, that the slope of the increase rate of bacterial cells is 4.0 (% / h) or less and 3.5 (% /%) when the accumulation of fibroin-like protein stops.
  • Bacterial cell growth is reduced means, for example, that the rate of increase in bacterial cells is 80% or less, 70% or less, 60% or less, or 50% or less when the accumulation of fibroin-like protein stops. May be. The “point when the accumulation of fibroin-like protein stops” will be described later.
  • the cell growth may be reduced in the entire period after the induction of expression, or may be reduced only in a part of the period after the induction of expression.
  • the length of the “partial period” is not particularly limited as long as the production of fibroin-like protein is improved as compared with the control condition.
  • the “partial period” is, for example, a period of 50% or more, a period of 70% or more, a period of 90% or more, or a period of 95% or more of the entire period after the induction of expression. Good.
  • control condition refers to a condition in which cell growth after induction of expression is not reduced.
  • control condition in the case where cell growth after expression induction is reduced due to growth factor limitation, the control condition described in Examples 1, 2, and 4 is used in the presence of a sufficient amount of growth factor. Conditions for aerobic culture are included.
  • control condition in the case where the cell growth after the expression induction is reduced by sufficiently growing the cells during the period before the expression induction, the bacteria such as the control condition described in Example 3 are used. Examples include conditions for inducing expression before the body sufficiently proliferates.
  • “The production of fibroin-like protein is improved compared to the control condition” means that the parameter indicating the productivity of the fibroin-like protein is higher than the control condition.
  • “Fibroin-like protein productivity parameter” refers to the amount of fibroin-like protein accumulated per medium volume, fibroin-like protein accumulated per cell weight, fibroin-like protein cumulative productivity, or a combination thereof.
  • “Fibroin-like protein production is improved compared to control conditions” means that, for example, a parameter indicating the fibroin-like protein productivity is 1.1 times or more, 1.2 times or more of the same parameter of the control condition, It may be 1.3 times or more, 1.4 times or more, or 1.5 times or more.
  • the value at a given point in the period after the expression induction may be higher than the control condition, and the maximum value in the period after the expression induction is the control. It may be higher than the conditions.
  • the “predetermined time point” can be appropriately set according to various conditions such as culture conditions.
  • the “predetermined time point” may be a time point when accumulation of fibroin-like protein stops, for example.
  • the “time point when accumulation of fibroin-like protein stops” may be, for example, a time point when the rate of increase in the amount of fibroin-like protein accumulated per cell weight becomes 10% or less per 4 to 12 hours.
  • the time point at which the accumulation of fibroin-like protein stops varies depending on the culture conditions. For example, 4 hours, 9 hours, 14 hours, 21.5 hours, 30 hours after expression induction, It may be after 50 hours, after 70 hours, or after 100 hours.
  • the cell growth after the induction of expression can be reduced, for example, by culturing under growth factor restriction during the period after the induction of expression.
  • “Growth factor” refers to a component necessary for the growth of bacterial cells.
  • the growth factor generally includes a carbon source, a nitrogen source, a phosphate source, a sulfur source, and a mineral.
  • the nitrogen source for example, an organic nitrogen source may be limited.
  • examples of the growth factor include nutrients required by the auxotrophy. Examples of such nutrients include amino acids such as isoleucine and nucleic acids.
  • the growth factor restriction can be performed, for example, under conditions where a sufficient amount of essential components other than the component to be restricted is present or supplied.
  • the phosphate source can be limited under conditions where a sufficient amount of carbon source, nitrogen source, sulfur source, and mineral is present or supplied.
  • one type of growth factor may be restricted, or two or more types of growth factors may be restricted.
  • “Growth factor restriction” means that the supply of the growth factor to the culture system is restricted. Due to the growth factor limitation, the growth factor concentration in the culture system can be kept low. That is, “growth factor restriction” may be, for example, limiting the growth factor concentration in the medium to a certain concentration or less.
  • the value of “constant concentration” is not particularly limited as long as the production of fibroin-like protein is improved as compared with the control condition.
  • the value of “constant concentration” can be appropriately set according to various conditions such as the type of growth factor to be restricted. Specifically, to limit the phosphoric acid source, phosphate source concentration in the medium, in terms of KH 2 PO 4 amount, e.g., less than 0.5 g / L, less than 0.3 g / L, 0.
  • the growth factor concentration may be limited to a certain concentration or less in the entire period after the expression induction, or may be limited to a certain concentration or less only in a part of the period after the expression induction.
  • the length of the “partial period” is not particularly limited as long as the production of fibroin-like protein is improved as compared with the control condition.
  • the “partial period” is, for example, a period of 50% or more, a period of 70% or more, a period of 90% or more, or a period of 95% or more of the entire period after the induction of expression. Good.
  • the growth factor concentration may or may not be constant throughout the period after expression induction.
  • Growth factor limitation can be achieved, for example, by reducing the concentration of the growth factor in the initial medium, reducing the fed amount of the growth factor, or a combination thereof.
  • “Initial medium” may be read as “medium at the start of culture”.
  • the “culture medium at the start of cultivation” may be a culture solution immediately after inoculation.
  • the concentration of the growth factor in the initial medium is not particularly limited as long as the growth factor can be restricted during the period after expression induction.
  • the growth factor concentration in the initial culture medium may or may not be a certain concentration. That is, the growth factor concentration of the initial culture medium is higher than a certain concentration, but the growth factor concentration may be equal to or less than a certain concentration by consuming the growth factor in the initial culture medium during the culture.
  • the concentration of the growth factor in the initial medium can be set to a concentration that is depleted during the culture, for example.
  • concentration of the growth factor in the initial medium can be set to a concentration that is depleted during the culture, for example.
  • the timing of depletion is not particularly limited as long as cell growth after induction of expression can be reduced.
  • the timing of depletion may be before expression induction or after expression induction. After depletion, the culture can be continued as it is.
  • a growth factor may be added as appropriate before and / or after depletion.
  • the concentration of the growth factor in the initial medium can be appropriately set according to various conditions such as the type of growth factor and the culture conditions.
  • the organic nitrogen source concentration in the initial medium is, for example, 50 g / L or less, 30 g / L or less, 20 g / L or less, 10 g / L or less, 5 g / L or less, It may be 2 g / L or less, or 1 g / L or less.
  • the phosphate source concentration in the initial medium is, for example, 50 g / L or less, 30 g / L or less, 20 g / L in terms of KH 2 PO 4 amount. 10 g / L or less, 5 g / L or less, 3.5 g / L or less, 3.0 g / L or less, 2.5 g / L or less, 2.0 g / L or less, 1.5 g / L or less, 1.0 g / L or less, or 0.5 g / L or less.
  • a reduction in the concentration of the growth factor in the initial culture medium may be applied to any growth factor, but can be suitably applied to, for example, a phosphate source such as inorganic phosphate.
  • the mode of culture in the period before expression induction and the period after expression induction is particularly as long as growth factor limitation can be achieved in the period after expression induction.
  • the presence or absence of fed growth factors and the mode of fed feeding in the period before expression induction and the period after expression induction can be appropriately set so that growth factor restriction can be achieved in the period after expression induction.
  • the growth factor concentration in the fed-batch medium and the flow acceleration of the fed-batch medium are as follows.
  • the growth factor concentration in the feeding medium or the flow acceleration of the feeding medium when the growth factor is restricted by reducing the feeding amount of the growth factor may be set.
  • the growth factor limitation can be achieved in the period after the expression induction.
  • the growth factor is limited in the period after expression induction by reducing the amount of growth factor fed in the period after expression induction. Can be achieved.
  • the fed amount of the growth factor is not particularly limited as long as the growth factor can be restricted in the period after the expression induction. Note that “reducing the fed amount of growth factor” includes the case where the growth factor is not fed.
  • the fed amount of the growth factor may be reduced during the entire period after the induction of expression, or may be reduced only during a part of the period after the induction of expression.
  • the length of the “partial period” is not particularly limited as long as the production of fibroin-like protein is improved as compared with the control condition.
  • the “partial period” is, for example, a period of 50% or more, a period of 70% or more, a period of 90% or more, or a period of 95% or more of the entire period after the induction of expression.
  • the feeding amount of the growth factor can be reduced by reducing the concentration of the growth factor in the feeding medium, reducing the feeding amount of the feeding medium, or a combination thereof.
  • the feeding amount of the growth factor can be reduced by increasing the ratio of components other than the restricted growth factor to the total components in the fed-batch medium.
  • a carbon source may be mentioned as a component other than the restricted growth factor.
  • the ratio of components other than the restricted growth factors to the total components in the fed-batch medium is, for example, 70% (w / w) or more, 80% (w / w) or more, 90% (w / w) or more, 95 % (W / w) or more, or 100% (w / w).
  • the ratio of the growth factor restricted with respect to all the components in a feeding medium is less than 30% (w / w), less than 20% (w / w), less than 10% (w / w), 5%, for example.
  • the ratio of the phosphate source to all components in the fed-batch medium is, for example, less than 2.5% (w / w) in terms of KH 2 PO 4 amount. , Less than 1.5% (w / w), less than 1.0% (w / w), less than 0.5% (w / w), or 0 (zero).
  • the concentration of growth factor in the fed-batch medium and the flow acceleration of the fed-batch medium are such that the cumulative specific carbon source consumption rate ( ⁇ cumulative) after the induction of expression is, for example, 0.35 g / g / hr or less, 0.30 g / g / Hr or less, or 0.25 g / g / hr or less.
  • the cumulative specific carbon source consumption rate is calculated from the flow acceleration of the carbon source (determined from the concentration of the carbon source in the feed medium and the flow acceleration of the feed medium) and the bacterial cell concentration in the medium.
  • the carbon source can be, for example, glucose.
  • the cumulative specific carbon source consumption rate from the time of induction of expression to a predetermined time is calculated by the following equation.
  • the feeding of the fed-batch medium may be performed so that the growth factor concentration in the medium is maintained below a certain concentration. Maintaining the growth factor concentration in the medium below a certain concentration means, for example, that the growth factor supply rate (flow acceleration) to the culture system is lower than the consumption rate of the growth factor by the bacterium of the present invention in the culture system. Thus, it can be achieved by feeding the fed-batch medium.
  • the concentration of the growth factor in the feeding medium and the flow acceleration of the feeding medium may or may not be constant throughout the period after expression induction.
  • the feeding of the fed-batch medium may be performed continuously or intermittently.
  • the feeding of the feeding medium may be started from the start of the culture or may be started during the culture.
  • the feeding of the feeding medium may be started before expression induction, may be started at the time of expression induction, or may be started after expression induction.
  • the feeding of the fed-batch medium may be started, for example, after the concentration of the growth factor in the medium is equal to or lower than a certain level, specifically after the growth factor is depleted.
  • the second and subsequent fed batches are controlled so as to be started when the carbon source in the fermentation medium is depleted in the immediately preceding fed-batch period. Can automatically maintain the carbon source concentration in the fermentation medium at a low level (US Pat. No. 5,912,113). Carbon source depletion can be detected, for example, by increasing pH or increasing dissolved oxygen concentration (US Pat. No. 5,912,113).
  • the fed-batch medium may be fed so that, for example, the growth factor is not depleted or the state where the growth factor is depleted does not continue. However, the growth factor may be depleted as long as the production of fibroin-like protein is improved compared to the control conditions.
  • the period during which the growth factor is depleted depends on the type of the growth factor, but may be, for example, the entire period after the expression induction, or a period of 90% or less of the entire period after the expression induction. , A period of 70% or less, a period of 50% or less, a period of 30% or less, a period of 20% or less, a period of 10% or less, or a period of 5% or less.
  • a growth factor concentration in the medium of 0 (zero) does not necessarily mean that the growth factor is depleted. That is, for example, feeding of the growth factor to the culture system is continued, but the growth factor concentration in the medium is maintained at 0 (zero) by rapidly consuming the fed growth factor. If it is, it is assumed that it does not correspond to the depletion of growth factors.
  • the mode of cultivation in the period before expression induction is particularly limited as long as growth factor limitation can be achieved in the period after expression induction.
  • the concentration of the growth factor in the initial medium, the presence or absence of feeding of the growth factor in the period before the expression induction, and the mode of fed feeding should be appropriately set so that the growth factor restriction can be achieved in the period after the expression induction.
  • the concentration of the growth factor in the initial medium when the growth factor is restricted by reducing the concentration of the growth factor in the initial medium as exemplified above. May be set.
  • the cell growth after the induction of expression can be reduced, for example, by sufficiently growing the cells in the period before the expression induction.
  • “To sufficiently proliferate cells during the period before expression induction” may be, for example, that OD620 at the time of expression induction is 80 or more, 100 or more, 120 or more, 150 or more, or 200 or more.
  • Sufficient cell growth in the period before expression induction can be achieved by supplying a sufficient amount of carbon source and other components necessary for cell growth in the period before expression induction and culturing. All of the components necessary for the growth of the carbon source and other cells may be contained in a sufficient amount in the initial medium, or may be fed in a sufficient amount, or a combination thereof.
  • the concentration of the carbon source in the fed-batch medium and the flow acceleration of the fed-batch medium are, for example, the flow acceleration of the carbon source (the concentration of the carbon source in the fed-batch medium and the flow acceleration of the fed-batch medium).
  • fibroin-like protein By culturing the bacterium of the present invention as described above, fibroin-like protein accumulates in the medium and / or in the microbial cells. Fibroin-like proteins can accumulate as inclusion bodies in, for example, bacterial cells.
  • Fibroin-like protein can be recovered and quantified by, for example, known methods for recovering and quantifying heterologously expressed proteins (for example, “Neurochemistry Laboratory, Protein VI Synthesis and Expression”, Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin (1992) pp183 -184).
  • cells are collected from the culture solution by centrifugation and then suspended in a buffer solution.
  • the bacterial cell suspension is subjected to treatment such as ultrasonic treatment and French press to crush the bacterial cells.
  • treatment such as ultrasonic treatment and French press to crush the bacterial cells.
  • lysozyme may be added to the cell suspension at a final concentration of 0-200 mg / l and left in ice for 30 minutes to 20 hours.
  • an insoluble fraction is obtained as a precipitate from the crushed material by low-speed centrifugation (6000-15000 rpm, 5-10 minutes, 4 ° C.).
  • the insoluble fraction is appropriately washed with a buffer as necessary.
  • the number of times of washing is not particularly limited, and may be, for example, once, twice, or three times or more.
  • a buffer solution for suspending bacterial cells or fibroin-like protein a buffer solution having low fibroin-like protein solubility can be preferably used.
  • examples of such a buffer include a buffer containing 20 mM Tris-hydrochloric acid, 30 mM NaCl, and 10 mM mM EDTA, and a buffer containing 20 mM Tris-hydrochloric acid, 30 mM mM NaCl.
  • the pH of the buffer solution may be, for example, usually 4 to 12, preferably 6 to 9.
  • a fibroin-like protein solution can be obtained by dissolving the insoluble fraction with an SDS solution or a urea solution.
  • the recovered fibroin-like protein may contain components such as bacterial cells, medium components, and bacterial metabolic byproducts in addition to the fibroin-like protein.
  • the fibroin-like protein may be purified to the desired extent.
  • the amount of fibroin-like protein is determined based on the intensity of the band at the position corresponding to the molecular weight of the target fibroin-like protein by staining the sample containing fibroin-like protein such as suspension or solution with SDS-PAGE. Can be determined.
  • Staining can be performed by CBB staining, fluorescent staining, silver staining, or the like.
  • a protein with a known concentration can be used as a standard. Examples of such a protein include albumin and a fibroin-like protein whose concentration has been separately determined.
  • the fibroin-like protein obtained as described above can be used after fiberizing or the like as appropriate. Fibrinization of fibroin-like protein can be performed by, for example, a known method. Specifically, fibrin-like protein fibrillation can be performed with reference to, for example, the description of fibrosis of a polypeptide derived from a large sputum bookmarker protein described in WO2012 / 165476.
  • Reference Example 1 Construction of fibroin-like protein producing bacteria
  • the strains and genes used for fibroin-like protein production in this example are as follows.
  • Host Escherichia coli BLR (DE3)
  • Vector pET22b (+)
  • Fibroin-like protein gene gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 of WO2012 / 165476A1
  • a fibroin-like protein-producing bacterium can be obtained by transforming Escherichia coli BLR (DE3) with the pET22b (+) vector (WO2012 / 165476A1) carrying the above gene.
  • the base sequence of the above gene is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the fibroin-like protein encoded by the same gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the bean filtrate is a hydrolyzate of soy protein.
  • a stock solution was prepared using glucose and MgSO 4 ⁇ 7H 2 O as group A and other components as group B. Subsequently, the A section was left as it was, and the B section was sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes separately after adjusting the pH to 6.0 with KOH. Next, the A and B groups were mixed, and ampicillin was added to a final concentration of 100 mg / L to obtain a seed culture medium.
  • Example 1 Production of fibroin-like protein under reduced conditions of organic nitrogen source (1) Production of fibroin-like protein under control conditions The following procedure promotes cell growth after induction of expression of fibroin-like protein Therefore, the culture was carried out under conditions where a sufficient amount of organic nitrogen source was fed after expression induction. In Example 1, this condition is also referred to as “control condition”.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • a stock solution was prepared using glucose and MgSO 4 ⁇ 7H 2 O as group A and other components as group B. Next, A and B were separately sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes, and then mixed to obtain a production medium.
  • a stock solution was prepared using glucose as A group and other components as B group. Subsequently, Section A and Section B were used after being sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes separately.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • the OD620 of the culture solution was measured by the method shown in Reference Example 2. The measurement results are shown in FIG.
  • data relating to cell growth after addition of the IPTG solution are shown in FIGS. 2 (A) to (D), respectively.
  • the produced fibroin-like protein was appropriately quantified.
  • Data on fibroin-like protein production (fibroin-like protein accumulation per culture volume, fibroin-like protein accumulation per cell weight, and fibroin-like protein cumulative productivity) are shown in FIGS. ).
  • the cumulative specific growth rate after 14 (21.5) hours of IPTG addition was 0.031 (0.033) / h under the control condition, but decreased to 0.027 (0.022) / h under the organic nitrogen source restriction condition.
  • the rate of increase in bacterial cells after 14 (21.5) hours of IPTG addition was 57.5 (102.6)% under the control conditions, but decreased to 48.2 (62.6)% under the organic nitrogen source restriction conditions.
  • the slope of the cell growth rate after IPTG addition 14 (21.5) hours was 3.96 (4.77)% / h under the control condition, but decreased to 3.32 (2.91)% / h under the organic nitrogen source restriction condition. did.
  • the data outside the parentheses correspond to the data 14 hours after the addition of IPTG
  • the data within the parentheses correspond to the data 21.5 hours after the addition of IPTG (hereinafter the same).
  • the amount of fibroin-like protein accumulated per culture volume 14 (21.5) hours after the addition of IPTG was 0.44 (0.67) g / L in the control condition, while 0.65 (0.84) in the organic nitrogen source restriction condition Improved to g / L.
  • the amount of fibroin-like protein accumulated per cell weight 14 (21.5) hours after the addition of IPTG was 1.49 (1.86)% under the control condition, while it was 2.32 (2.86)% under the organic nitrogen source restriction condition. Improved.
  • the cumulative productivity of fibroin-like protein 14 (21.5) hours after the addition of IPTG was 0.030 (0.031) g / L / hr under the control conditions, compared with 0.045 (0.039) g under the organic nitrogen source restriction conditions. Improved to / L / hr.
  • Example 2 Production of fibroin-like protein under conditions with a reduced amount of phosphate source (1) Production of fibroin-like protein under control conditions In order to continue cell growth after inducing expression of fibroin-like protein by the following procedure In addition, the culture was carried out under the condition that a sufficient amount of phosphate source (12 g / L as KH 2 PO 4 ) was added to the feed medium. In Example 2, this condition is also referred to as “control condition”.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 227 ml of the production medium shown in Table 7 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • a stock solution was prepared using glucose and MgSO 4 ⁇ 7H 2 O as the A section, CSL (corn steep liquor) as the B section, and other components as the C section. Subsequently, the A group and the C group were sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes separately as they were. In Group B, the pH was lowered to 2 using sulfuric acid and a heat treatment at 80 ° C. was carried out for 60 minutes, followed by sterilization by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes. Next, A, B, and C were mixed, and ampicillin was added to a final concentration of 100 mg / L to obtain a seed culture medium.
  • a stock solution was prepared using glucose and MgSO 4 ⁇ 7H 2 O as the A section, CSL (corn steep liquor) as the B section, and other components as the C section. Subsequently, the A group and the C group were sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes separately as they were. In Group B, the pH was lowered to 2 using sulfuric acid and a heat treatment at 80 ° C. was carried out for 60 minutes, followed by sterilization by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes. Next, A, B, and C were mixed to obtain a production medium.
  • the oxygen sterilized by the filter is further reduced to 30-90 mL per minute. Aerated in range.
  • the flow rate of the feed liquid was reduced.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • a stock solution was prepared using glucose as A group and KH 2 PO 4 as B group. Subsequently, Section A and Section B were used after being sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes separately.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 227 ml of the production medium shown in Table 7 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • the oxygen sterilized by the filter is further reduced to 30-90 mL per minute. Aerated in range.
  • the flow rate of the feed liquid was reduced.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • the OD620 of the culture solution was measured by the method shown in Reference Example 2. Further, the phosphoric acid concentration in the medium was measured according to a conventional method using Phospha C-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The measurement results of OD620, phosphoric acid concentration (converted to KH 2 PO 4 ), and total phosphate consumption (converted to KH 2 PO 4 ) are shown in FIGS. 4 (A) to (C), respectively. Moreover, the data regarding the cell growth after addition of the IPTG solution (the amount of cells and the cumulative specific growth rate) are shown in FIGS. 5 (A) and 5 (B), respectively.
  • the produced fibroin-like protein was appropriately quantified.
  • Data on fibroin-like protein production (fibroin-like protein accumulation per culture volume, fibroin-like protein accumulation per cell weight, fibroin-like protein cumulative ratio production rate) are shown in FIGS. C).
  • the total phosphate consumption 25 hours after the addition of IPTG (32.5 hours after the start of culture) was 2.05 g under the control conditions, but decreased to 0.90 g under the phosphate restriction conditions.
  • the cumulative specific growth rate 25 hours after the addition of IPTG was 0.035 ⁇ ⁇ / h under the control conditions, but decreased to 0.030 / h under the phosphate-limited conditions.
  • the amount of fibroin-like protein accumulated per volume of culture solution 25 hours after the addition of IPTG was 1.61 g / L in the control condition, but improved to 2.32 g / L in the phosphate-restricted condition.
  • the amount of fibroin-like protein accumulated per cell weight 25 hours after the addition of IPTG was 4.20% in the control condition, and improved to 6.94% in the phosphate-restricted condition.
  • the cumulative productivity of fibroin-like protein 25 hours after the addition of IPTG was 0.072 g / L / h under the control conditions, but improved to 0.105 g / L / h under the phosphate-limited conditions.
  • Example 3 Production of fibroin-like protein under conditions that enhanced cell growth before expression induction (1) Production of fibroin-like protein under control conditions Culture was carried out under the following conditions. In Example 3, this condition is also referred to as “control condition”.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 255 ml of the production medium shown in Table 10 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • a stock solution was prepared using glucose and MgSO 4 ⁇ 7H 2 O as the A section, CSL (corn steep liquor) as the B section, and other components as the C section. Subsequently, the A group and the C group were sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes separately as they were. In Group B, the pH was lowered to 2 using sulfuric acid and a heat treatment at 80 ° C. was carried out for 60 minutes, followed by sterilization by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes. Next, A, B, and C were mixed, and ampicillin was added to a final concentration of 100 mg / L to obtain a seed culture medium.
  • a stock solution was prepared using glucose and MgSO 4 ⁇ 7H 2 O as the A section, CSL (corn steep liquor) as the B section, and other components as the C section. Subsequently, the A group and the C group were sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes separately as they were. In Group B, the pH was lowered to 2 using sulfuric acid and a heat treatment at 80 ° C. was carried out for 60 minutes, followed by sterilization by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes. Next, A, B, and C were mixed to obtain a production medium.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 255 ml of the production medium shown in Table 10 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • the stirring speed is increased to 2000 rpm. If the dissolved oxygen concentration is still insufficient, the oxygen sterilized by the filter is further reduced to 30-90 mL per minute. Aerated in range. When it was difficult to maintain the dissolved oxygen concentration, the flow rate of the feed liquid was reduced.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • the OD620 of the culture solution was measured by the method shown in Reference Example 2.
  • the measurement results are shown in FIG. 8A to 8D show data on the cell growth after addition of the IPTG solution (bacterial cell volume, cell increase rate, slope of cell increase rate, cumulative specific growth rate), respectively.
  • the produced fibroin-like protein was appropriately quantified. Data on the production amount of fibroin-like protein (fibroin-like protein accumulation amount per culture volume, fibroin-like protein accumulation amount per cell weight, and cumulative production of fibroin-like protein) are shown in FIGS. ).
  • the cumulative specific growth rate was 0.033 (0.029) / h 20 hours after IPTG addition in the control conditions, whereas 0.011 / 24 hours after IPTG addition in the conditions that enhanced cell growth before expression induction. It decreased with h.
  • the cell growth rate was 93.1 (131.3)% 20 (28) hours after IPTG addition under the control conditions, while 77.1% 24 hours after IPTG addition under the conditions that enhanced cell growth before expression induction. Declined.
  • the slope of the cell growth rate was 4.66 (4.69)% / h 20 (28) hours after addition of IPTG under the control conditions, whereas 24 hours after addition of IPTG under the conditions where cell growth before expression induction was enhanced. Later it decreased to 3.21% / h.
  • the data outside the parentheses correspond to the data 20 hours after the addition of IPTG, and the data within the parentheses correspond to the data 28 hours after the addition of IPTG (the same applies hereinafter).
  • the amount of fibroin-like protein accumulated per culture volume was 1.34 (1.36) g / L 20 (28) hours after IPTG addition under the control conditions, whereas under the conditions where cell growth was enhanced before expression induction. It improved to 2.70 g / L 24 hours after IPTG addition.
  • Fibroin-like protein accumulation per cell weight was 3.80 (3.45)% 20 (28) hours after IPTG addition under the control conditions, while IPTG addition was performed under conditions that enhanced cell growth before expression induction. After 24 hours, it improved to 5.12%.
  • the cumulative productivity of fibroin-like protein was 0.072 (0.054) g / L / hr 20 (28) hours after IPTG addition under the control conditions, while IPTG under the conditions that enhanced cell growth before induction of expression. 24 hours after the addition, it improved to 0.128 g / L / hr.
  • Example 4 Production of fibroin-like protein under reduced carbon source conditions (1) Production of fibroin-like protein under control conditions In order to continue cell growth after inducing the expression of fibroin-like protein by the following procedure The culture was performed under the condition that the flow acceleration of the carbon source (glucose) was 8 mL / hr. In Example 4, this condition is also referred to as “control condition”.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 255 ml of the production medium shown in Table 10 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the seed culture solution was inoculated into 255 ml of the production medium shown in Table 2 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • the OD620 of the culture solution was measured by the method shown in Reference Example 2.
  • the measurement result of OD620 is shown in FIG.
  • glucose consumption and cumulative specific glucose consumption rate ( ⁇ -cumulative) are shown in FIGS. 10 (B) and 10 (C).
  • the data regarding the cell growth after addition of the IPTG solution are shown in FIGS. 11A and 11B, respectively.
  • the produced fibroin-like protein was appropriately quantified. Data on the production amount of fibroin-like protein (fibroin-like protein accumulation amount per culture volume, fibroin-like protein accumulation amount per cell weight, and cumulative production of fibroin-like protein) are shown in FIGS. ).
  • the total glucose consumption was 47.6 g 13.7 hours after the addition of IPTG under the control condition, but decreased to 24.8 g under the carbon source restriction condition.
  • the cumulative specific glucose consumption rate was 0.40 g / g / h 13.7 hours after the addition of IPTG under the control condition, but decreased to 0.24 g / g / h under the carbon source restriction condition.
  • the cumulative specific growth rate 13.7 hours after the addition of IPTG was 0.071 kg / h under the control conditions, but decreased to 0.034 kg / h under the carbon source restriction conditions.
  • the amount of fibroin-like protein accumulated per culture volume was 0.85 g / L after 13.7 hours of IPTG addition under the control conditions, and improved to 1.24 g / L after 13.7 hours of IPTG addition under the carbon source restriction conditions.
  • the amount of fibroin-like protein accumulated per cell weight was 2.31% 13.7 hours after IPTG addition under the control conditions, whereas it was 4.35% 24 hours after IPTG addition under the conditions where cell growth before expression induction was enhanced. Improved.
  • the cumulative productivity of fibroin-like protein was 0.070 g / L / hr 13.7 hours after addition of IPTG under the control conditions, while 0.096 g after 13.7 hours after addition of IPTG under the conditions that enhanced cell growth before expression induction. Improved to / L / hr.
  • Example 5 Production of fibroin-like protein under conditions where the amount of required amino acid (Ile) was reduced (1) Production of fibroin-like protein under control conditions Culture was carried out under the following conditions. In Example 5, this condition is also referred to as “control condition”.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 255 ml of the production medium shown in Table 10 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 255 ml of the production medium shown in Table 11 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • a stock solution was prepared using glucose and MgSO 4 ⁇ 7H 2 O as the A section, CSL (corn steep liquor) as the B section, and other components as the C section. Subsequently, the A group and the C group were sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes separately as they were. In Group B, the pH was lowered to 2 using sulfuric acid and a heat treatment at 80 ° C. was carried out for 60 minutes, followed by sterilization by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes. Next, A, B, and C were mixed to obtain a production medium.
  • the OD620 of the culture solution was measured by the method shown in Reference Example 2.
  • the data regarding OD620 is shown in FIG. Table 12 shows data (cumulative specific growth rate) relating to cell growth after addition of the IPTG solution.
  • the Ile concentration in the culture solution was measured by the following procedure.
  • the culture supernatant separated from the culture solution was diluted 100-fold with 0.2 N HCl, and analyzed using an amino acid analyzer LC-8800C (Shimadzu Corporation).
  • the measurement results are shown in FIG. Table 12 shows the total consumption of Ile after the addition of the IPTG solution.
  • the produced fibroin-like protein was appropriately quantified.
  • Data relating to the production amount of fibroin-like protein is shown in Table 12.
  • the total amount of Ile consumed 24 hours after the addition of IPTG (28 hours after the start of culture) was 0.244 ⁇ g under the control conditions, but decreased to 0.033 ⁇ g under the Ile restriction conditions.
  • the cumulative specific growth rate 24 hours after the addition of IPTG was 0.033 kg / h under the control conditions, but decreased to 0.020 kg / h under the Ile restriction conditions.
  • the amount of fibroin-like protein accumulated per cell weight 24 hours after the addition of IPTG was 3.04% under the control condition, and improved to 4.79% under the Ile restriction condition.
  • Example 6 Production of wild type ADF3 under conditions in which cell growth before expression induction was enhanced
  • A Construction of wild type ADF3 producing bacteria
  • a His tag and HRV3C protease at the N-terminus were used as a fibroin-like protein.
  • NDF spider ADF3 with the recognition sequence added was produced.
  • the fusion protein is also simply referred to as “wild type ADF3”.
  • the DNA encoding wild type ADF3 was introduced into the NdeI-EcoRI site of pET22b (+) using an in-fusion kit to obtain wild type ADF3 expression plasmid pET22b-ADF3WT.
  • Escherichia coli BLR (DE3) was transformed with pET22b-ADF3WT to obtain wild-type ADF3-producing BLR (DE3) / pET22b-ADF3WT.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of the wild type ADF3 coding region and its peripheral sequence in pET22b-ADF3WT. Positions 12 to 1994 of SEQ ID NO: 4 correspond to the coding region of wild type ADF3.
  • the amino acid sequence of wild type ADF3 encoded by pET22b-ADF3WT is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 255 ml of the production medium shown in Table 10 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • the culture was performed under the conditions described in Reference Example 2 until glucose was completely consumed to obtain a seed culture solution. Thereafter, 45 ml of the above seed culture solution was inoculated into 255 ml of the production medium shown in Table 10 in the jar fermenter. Culture temperature was maintained at 37 ° C, 300 mL of air sterilized with a filter was aerated, stirring speed was 700 rpm, and culture solution pH was controlled at a constant pH of 6.9 by appropriately blowing ammonia gas. did. During the culture, the culture solution was sampled over time, and the glucose concentration in the culture solution was measured using BF-5 (Oji Scientific Instruments).
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary. If the dissolved oxygen concentration was still insufficient, 30 mL of oxygen sterilized by the filter was further aerated for 1 minute.
  • the oxygen sterilized by the filter is further reduced to 30-90 mL per minute. Aerated in range.
  • the flow rate of the feed liquid was reduced.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was measured using a dissolved oxygen concentration sensor OxyProbe (registered trademark) Dissolved Oxygen Sensors (Broadley-James) and maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • OxyProbe registered trademark
  • Dissolved Oxygen Sensors Broadley-James
  • the stirring speed was increased to 2000 rpm as necessary.
  • the culture solution pH was kept constant at pH 6.9 by appropriately blowing ammonia gas, and the culture was continued.
  • FIG. 15B shows the cumulative specific glucose consumption rate ( ⁇ -cumulative) after the addition of the IPTG solution.
  • concentration of Ile in the medium was measured by the method shown in Example 5.
  • the Ile concentration and the total consumption of Ile after addition of the IPTG solution are shown in FIGS. 16 (A) and 16 (B).
  • the phosphoric acid concentration in the medium was measured by the method shown in Example 2.
  • the phosphoric acid concentration (KH 2 PO 4 conversion) and the total phosphoric acid consumption (KH 2 PO 4 conversion) after addition of the IPTG solution are shown in FIGS. 16 (C) and 16 (D).
  • data relating to cell growth after addition of the IPTG solution (bacterial cell volume, cell growth rate, slope of cell increase rate, cumulative specific growth rate) are shown in FIGS. 17 (A) to 17 (D) and Table 14. .
  • the produced wild type ADF3 was appropriately quantified.
  • Data on the production amount of wild type ADF3 (wild type ADF3 accumulation amount per culture volume, wild type ADF3 accumulation amount per cell weight, wild type ADF3 cumulative productivity) are shown in FIGS. 18 (A) to (C), Table 14 shows.
  • the cumulative specific growth rate was 0.022 kg / h 42 hours after the addition of IPTG under the control conditions, whereas it decreased to 0.009 kg / h 38 hours after the addition of IPTG under the conditions where the cell growth before expression induction was enhanced.
  • the cell growth rate was 163.8% 42 hours after the addition of IPTG under the control condition, whereas it decreased to 36.3% 38 hours after the addition of IPTG under the condition where the cell growth before expression induction was enhanced.
  • the slope of the cell growth rate was 3.78% / h 42 hours after the addition of IPTG under the control conditions, whereas 0.96% / h 38 hours after the addition of IPTG under the conditions where the cell growth before expression induction was enhanced. Declined.
  • the amount of wild-type ADF3 accumulated per culture volume was 0.022 g / L 42 hours after addition of IPTG under the control conditions, whereas 0.055 hours after addition of IPTG under the conditions that enhanced cell growth before expression induction. Improved to g / L.
  • the amount of wild-type ADF3 accumulated per cell weight was 0.055% 42 hours after the addition of IPTG under the control conditions, whereas it was 0.100% 38 hours after the addition of IPTG under the conditions where the cell growth before the expression induction was enhanced. Improved.
  • the cumulative productivity of wild-type ADF3 was 0.00058 g / L / h 42 hours after addition of IPTG under the control conditions, whereas 0.0016 g / 38 hours after addition of IPTG under the conditions where the cell growth before expression induction was enhanced. Improved to L / h.
  • a fibroin-like protein can be produced efficiently.
  • SEQ ID NO: 1 Base sequence of the fibroin-like protein gene used in Examples 1 to 5
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of the protein encoded by the fibroin-like protein gene used in Examples 1 to 5
  • SEQ ID NO: 3 ADF3 protein of Nigori spider (Partial) amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 4 nucleotide sequence of the coding region of wild type ADF3 in pET22b-ADF3WT and its surrounding sequence
  • SEQ ID NO: 5 amino acid sequence of wild type ADF3 encoded by pET22b-ADF3WT

Abstract

フィブロイン様タンパク質の製造法を提供する。フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、およびフィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、前記発現誘導後の菌体増殖が低減されていることを特徴とする方法により、フィブロイン様タンパク質を製造する。

Description

フィブロイン様タンパク質の製造法
　本発明は、エシェリヒア・コリを利用した異種発現によるフィブロイン様タンパク質の製造法に関する。
　フィブロインは、クモの糸やカイコの糸を構成する繊維状タンパク質である。クモの糸は、鋼鉄の４倍という高い強度と炭素繊維やアラミド繊維を凌ぐ高い靱性を有し、且つ、伸縮性や耐熱性も兼ね備える材料である。そのため、その構成成分であるフィブロインまたはそれに準ずる構造を有する繊維状タンパク質（以下、総称して「フィブロイン様タンパク質」ともいう）の大量生産が望まれている。
　フィブロイン様タンパク質の生産については、エシェリヒア・コリを利用した異種発現の報告がある（特許文献１、２）。
　エシェリヒア・コリを利用したタンパク質の異種発現において、菌体の比増殖速度が異種タンパク質の比生産速度と相関するという報告がある。しかしながら、例えば、エシェリヒア・コリによるTrpA1タンパク質の比生産速度は比増殖速度が高い程向上するが（非特許文献１）、エシェリヒア・コリによるβ-lactamaseの比生産速度は比増殖速度が高い程低下する（非特許文献２）と報告されている。また、エシェリヒア・コリによるインターフェロンα１の生産量は、グルコース制限による生育速度低下により増大するが、リン酸制限には影響されないとの報告がある（非特許文献３）。また、エシェリヒア・コリによる組換えインターフェロンαの収率は、発現誘導前の比増殖速度が高い程増加するとの報告がある（非特許文献４）。また、エシェリヒア・コリによるヒト成長ホルモン（hGH）の発現量は、リン酸枯渇により2倍に増加との報告がある（非特許文献５）。このように、菌体の比増殖速度や培地成分の制限と、異種タンパク質の比生産速度との間には、一貫した関連性は認められない。
WO2012/165476 WO2006/008163
R. Siegel and D. D. Y. Ryu, Biotechnol. Bioeng., 27: 28-33 (1985). Seo, J.-H., Bailey, J. E. 1985b. Biotechnol. Bioeng. 27: 1668-1674. Riesenberg D, Menzel K, Schulz V, Schumann K, Veith G, Zuber G, Knorre WA., Appl Microbiol Biotechnol. 1990 Oct;34(1):77-82. C. Curless, J. Pope , L. Tsai, Biotechnol. Prog., 1990, 6 (2), pp 149-152. Bech Jensen, E. and Carlsen, S. Bio technol. Bioeng. 36: 1-11. 1990.
　本発明は、効率的なフィブロイン様タンパク質の製造法を提供することを課題とする。
　本願発明者らは、鋭意検討の結果、エシェリヒア・コリによるフィブロイン様タンパク質の異種発現の際に、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減することにより、フィブロイン様タンパク質の生産が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
　フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、
　フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、および
　フィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、
　前記発現誘導後の菌体増殖が低減されていることを特徴とする、方法。
［２］
　前記発現誘導後において、菌体増加割合、菌体増加割合の傾き、および累積比増殖速度から選択される１またはそれ以上が低下している、前記方法。
［３］
　前記発現誘導後の期間に生育因子制限下で培養が行われることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、前記方法。
［４］
　前記生育因子が、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、ミネラル、および栄養要求性により要求される栄養素から選択される１またはそれ以上の成分である、前記方法。
［５］
　前記生育因子が、炭素源、有機窒素源、およびリン酸源から選択される１またはそれ以上の成分である、前記方法。
［６］
　培養開始時における前記生育因子の培地中での濃度を低減することにより、生育因子が制限された、前記方法。
［７］
　前記発現誘導後の期間における前記生育因子の流加量を低減することにより、生育因子が制限された、前記方法。
［８］
　前記発現誘導後の期間に流加される流加培地中の全成分に対する前記生育因子の比率が３０％（ｗ／ｗ）未満である、前記方法。
［９］
　前記発現誘導後の期間に流加される流加培地中の全成分に対する炭素源の比率が７０％（ｗ／ｗ）以上である、前記方法。
［１０］
　前記発現誘導後の期間に累積比炭素源消費速度が０．３５ｇ／ｇ／ｈｒ以下となるように培養が行われる、前記方法。
［１１］
　前記発現誘導前の期間に菌体を十分に増殖させることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、前記方法。
OD620の経時変化を示す図。対照条件の結果を●、有機窒素源制限条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 IPTG溶液添加後の菌体増殖の結果を示す図。（Ａ）菌体量；（Ｂ）菌体増加割合；（Ｃ）菌体増加割合の傾き；（Ｄ）累積比増殖速度。対照条件の結果を●、有機窒素源制限条件の結果を△で示す。 IPTG溶液添加後のフィブロイン様タンパク質の生産の結果を示す図。（Ａ）培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量；（Ｂ）菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量；（Ｃ）フィブロイン様タンパク質の累積生産性。対照条件の結果を●、有機窒素源制限条件の結果を△で示す。 培養結果を示す図。（Ａ）OD620；（Ｂ）培養液中のリン酸濃度（KH2PO4換算）；（Ｃ）リン酸総消費量（KH2PO4換算）。対照条件の結果を●、リン酸制限条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 IPTG溶液添加後の菌体増殖の結果を示す図。（Ａ）菌体量；（Ｂ）累積比増殖速度。対照条件の結果を●、リン酸制限条件の結果を△で示す。 IPTG溶液添加後のフィブロイン様タンパク質の生産の結果を示す図。（Ａ）培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量；（Ｂ）菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量；（Ｃ）フィブロイン様タンパク質の累積生産性。対照条件の結果を●、リン酸制限条件の結果を△で示す。 OD620の経時変化を示す図。対照条件の結果を●、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 IPTG溶液添加後の菌体増殖の結果を示す図。（Ａ）菌体量；（Ｂ）菌体増加割合；（Ｃ）菌体増加割合の傾き；（Ｄ）累積比増殖速度。対照条件の結果を●、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件の結果を△で示す。 IPTG溶液添加後のフィブロイン様タンパク質の生産の結果を示す図。（Ａ）培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量；（Ｂ）菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量；（Ｃ）フィブロイン様タンパク質の累積生産性。対照条件の結果を●、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件の結果を△で示す。 培養結果を示す図。（Ａ）OD620の経時変化；（Ｂ）IPTG溶液添加後のグルコース消費量；（Ｃ）IPTG溶液添加後の累積比グルコース消費速度。対照条件の結果を●、炭素源制限条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 IPTG溶液添加後の菌体増殖の結果を示す図。（Ａ）菌体量；（Ｂ）累積比増殖速度。対照条件の結果を●、炭素源制限条件の結果を△で示す。 IPTG溶液添加後のフィブロイン様タンパク質の生産の結果を示す図。（Ａ）培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量；（Ｂ）菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量；（Ｃ）フィブロイン様タンパク質の累積生産性。対照条件の結果を●、炭素源制限条件の結果を△で示す。 OD620の経時変化を示す図。対照条件の結果を●、Ile制限条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 Ile濃度の経時変化を示す図。対照条件の結果を●、Ile制限条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 培養結果を示す図。（Ａ）OD620の経時変化；（Ｂ）IPTG溶液添加後の累積比グルコース消費速度。対照条件の結果を●、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 培養結果を示す図。（Ａ）培養液中のIle濃度；（Ｂ）Ile総消費量；（Ｃ）培養液中のリン酸濃度（KH2PO4換算）；（Ｄ）リン酸総消費量（KH2PO4換算）。対照条件の結果を●、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 IPTG溶液添加後の菌体増殖の結果を示す図。（Ａ）菌体量；（Ｂ）菌体増加割合；（Ｃ）菌体増加割合の傾き；（Ｄ）累積比増殖速度。対照条件の結果を●、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件の結果を△で示す。矢印はIPTG溶液を添加した時間を示す。 IPTG溶液添加後の野生型ＡＤＦ３の生産の結果を示す図。（Ａ）培養液容量当たりのＡＤＦ３蓄積量；（Ｂ）菌体重量当たりのＡＤＦ３蓄積量；（Ｃ）ＡＤＦ３累積生産性。対照条件の結果を●、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件の結果を△で示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞フィブロイン様タンパク質
　本発明において、「フィブロイン様タンパク質」とは、フィブロインおよびそれに準ずる構造を有する繊維状タンパク質の総称である。
　「フィブロイン」とは、クモの糸やカイコの糸を構成する繊維状タンパク質である。すなわち、フィブロインとしては、クモのフィブロインやカイコのフィブロインが挙げられる。クモの種類、カイコの種類、糸の種類は、特に制限されない。クモとしては、ニワオニグモ（Araneus diadematus）やアメリカジョロウグモ（Nephila clavipes）が挙げられる。クモのフィブロインとしては、大瓶状腺で産生するしおり糸、枠糸、縦糸のタンパク質（大瓶状腺タンパク質）、小瓶状腺で産生する足場糸のタンパク質（小瓶状腺タンパク質）、鞭状腺で産生する横糸のタンパク質（鞭状腺タンパク質）が挙げられる。クモのフィブロインとして、具体的には、例えば、ニワオニグモの大瓶状腺タンパク質ADF3およびADF4や、アメリカジョロウグモの大瓶状腺タンパク質MaSp1およびMaSp2が挙げられる。カイコとしては、家蚕（Bombyx mori）やエリ蚕（Samia cynthia）が挙げられる。これらフィブロインのアミノ酸配列、及びこれらフィブロインをコードする遺伝子（「フィブロイン遺伝子」ともいう）の塩基配列は、例えば、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公用データベースから取得できる。ニワオニグモのADF3（partial；NCBI AAC47010.1 GI:1263287）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。すなわち、フィブロイン様タンパク質は、例えば、上記データベースに開示されたフィブロインのアミノ酸配列（例えば配列番号３）を有するタンパク質であってよい。また、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子（「フィブロイン様タンパク質遺伝子」ともいう）は、例えば、上記データベースに開示されたフィブロイン遺伝子の塩基配列を有する遺伝子であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
　「フィブロインに準ずる構造を有する繊維状タンパク質」とは、フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有する繊維状タンパク質をいう。「フィブロインが有する反復配列と同様の配列」とは、実際にフィブロインが有する配列であってもよく、それと類似する配列であってもよい。フィブロインに準ずる構造を有する繊維状タンパク質としては、WO2012/165476に記載の大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドや、WO2006/008163に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。
　すなわち、「フィブロインが有する反復配列と同様の配列」としては、下記式Ｉに示される配列（以下、「反復配列Ｉ」ともいう）が挙げられる（WO2012/165476）：
　　ＲＥＰ１－ＲＥＰ２　・・・（Ｉ）
　式Ｉ中、ＲＥＰ１は、アラニン及びグリシンから選択される１またはそれ以上のアミノ酸の連続配列からなるアミノ酸配列である。ＲＥＰ１がアラニン及びグリシンの両方を含む場合、アラニン及びグリシンの順番は特に制限されない。例えば、ＲＥＰ１において、アラニンが２残基またはそれ以上連続していてもよく、グリシンが２残基またはそれ以上連続していてもよく、アラニン及びグリシンが交互に並んでいてもよい。ＲＥＰ１の長さは、例えば、２残基以上、３残基以上、４残基以上、または５残基以上であってもよく、２０残基以下、１６残基以下、１２残基以下、または８残基以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。ＲＥＰ１の長さは、例えば、２～２０残基、３～１６残基、４～１２残基、または５～８残基であってよい。ＲＥＰ１は、例えば、クモのフィブロインにおいて、繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に相当する。
　式Ｉ中、ＲＥＰ２は、グリシン、セリン、グルタミン、及びアラニンから選択される１またはそれ以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列である。ＲＥＰ２において、グリシン、セリン、グルタミン、及びアラニンの合計残基数は、例えば、ＲＥＰ２の総アミノ酸残基数の４０％以上、６０％以上、または７０％以上であってよい。ＲＥＰ２の長さは、例えば、２残基以上、１０残基以上、または２０残基以上であってもよく、２００残基以下、１５０残基以下、１００残基以下、または７５残基以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。ＲＥＰ２の長さは、例えば、２～２００残基、１０～１５０残基、２０～１００残基、または２０～７５残基であってよい。ＲＥＰ２は、例えば、クモのフィブロインにおいて、柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に相当する。
　反復配列Ｉの反復回数は、特に制限されない。反復配列Ｉの反復回数は、例えば、２以上、５以上、または１０以上であってもよく、１００以下、５０以下、または３０以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２の構成は、いずれも、各反復において同一であってもよく、そうでなくてもよい。
　フィブロインに準ずる構造を有する繊維状タンパク質は、フィブロインが有する反復配列と同様の配列に加えて、例えば、Ｃ末端にクモのフィブロインのＣ末端付近のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有していてもよい。クモのフィブロインのＣ末端付近のアミノ酸配列としては、例えば、クモのフィブロインのＣ末端５０残基のアミノ酸配列、Ｃ末端５０残基からＣ末端２０残基を除去したアミノ酸配列、Ｃ末端５０残基からＣ末端２９残基を除去したアミノ酸配列が挙げられる。クモのフィブロインのＣ末端付近のアミノ酸配列として、具体的には、例えば、配列番号３に示すニワオニグモのADF3（partial；NCBI AAC47010.1 GI:1263287）の５８７～６３６位（Ｃ末端５０残基）の配列、５８７～６１６位の配列、５８７～６０７位の配列が挙げられる。
　フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有し、且つ、Ｃ末端にクモのフィブロインのＣ末端付近のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する繊維状タンパク質として、具体的には、例えば、WO2012/165476A1の配列番号１０に記載の塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。同遺伝子の塩基配列を配列番号１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　フィブロイン様タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したフィブロイン様タンパク質（すなわち、上記例示したフィブロインまたはそれに準ずる構造を有する繊維状タンパク質）のバリアントであってもよい。同様に、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したフィブロイン様タンパク質遺伝子（すなわち、上記例示したフィブロインまたはそれに準ずる構造を有する繊維状タンパク質をコードする遺伝子）のバリアントであってもよい。なお、このような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したフィブロイン様タンパク質やそれをコードする遺伝子のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
　「元の機能が維持されている」とは、遺伝子やタンパク質のバリアントが、元の遺伝子やタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、フィブロイン様タンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが繊維状タンパク質であることをいう。また、「元の機能が維持されている」とは、フィブロイン様タンパク質遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質（すなわち繊維状タンパク質）をコードすることをいう。「繊維状タンパク質」とは、所定の条件下で繊維状の形態を取るタンパク質をいう。すなわち、繊維状タンパク質は、繊維状の形態で発現するタンパク質であってもよく、発現時には繊維状の形態ではないが繊維状の形態に加工可能なタンパク質であってもよい。繊維状タンパク質は、例えば、封入体として発現し、その後、適当な手法により繊維状の形態に加工可能なタンパク質であってもよい。
　フィブロイン様タンパク質のホモログとしては、例えば、上記フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得されるタンパク質が挙げられる。また、上記フィブロイン様タンパク質遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、上記フィブロイン様タンパク質遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
　以下、フィブロイン様タンパク質およびフィブロイン様タンパク質遺伝子の保存的バリアントについて例示する。
　フィブロイン様タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　また、フィブロイン様タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記フィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
　また、フィブロイン様タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記フィブロイン様タンパク質遺伝子の塩基配列から調製され得るプローブ、例えば同塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
　フィブロイン様タンパク質は、他のペプチドとの融合タンパク質であってもよい。「他のペプチド」は、所望の性状のフィブロイン様タンパク質が得られる限り、特に制限されない。「他のペプチド」は、その利用目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。「他のペプチド」としては、ペプチドタグやプロテアーゼの認識配列が挙げられる。「他のペプチド」は、例えば、フィブロイン様タンパク質のＮ末端、若しくはＣ末端、またはその両方に連結されてよい。「他のペプチド」としては、１種のペプチドを用いてもよく、２種またはそれ以上のペプチドを組み合わせて用いてもよい。
　ペプチドタグとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。ペプチドタグは、例えば、発現したフィブロイン様タンパク質の検出や精製に利用できる。
　プロテアーゼの認識配列として、具体的には、HRV3Cプロテアーゼ認識配列、Factor Xaプロテアーゼ認識配列、proTEVプロテアーゼ認識配列が挙げられる。プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現したフィブロイン様タンパク質の切断に利用できる。具体的には、例えば、フィブロイン様タンパク質をペプチドタグとの融合タンパク質として発現させる場合、フィブロイン様タンパク質とペプチドタグの連結部にプロテアーゼの認識配列を導入することにより、発現したフィブロイン様タンパク質からプロテアーゼを利用してペプチドタグを切断し、ペプチドタグを有さないフィブロイン様タンパク質を得ることができる。
　そのような融合タンパク質として、具体的には、Ｎ末端にHisタグとHRV3Cプロテアーゼ認識配列が付加されたニワオニグモのADF3（配列番号５）が挙げられる。また、配列番号５の融合タンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４の１２～１９９４位の塩基配列が挙げられる。
　フィブロイン様タンパク質遺伝子は、上記例示したフィブロイン様タンパク質遺伝子またはその保存的バリアントの塩基配列において、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
＜２＞本発明の細菌
　本発明の細菌は、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリである。
　本発明の細菌は、フィブロイン様タンパク質遺伝子を有することにより、フィブロイン様タンパク質の生産能を有する。「本発明の細菌がフィブロイン様タンパク質の生産能を有する」とは、例えば、本発明の細菌を培地で培養した際に、フィブロイン様タンパク質を生成し、回収できる程度に培地中および／または菌体内に蓄積することをいう。
　エシェリヒア・コリとしては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア・コリに分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株やそのrecA-株であるBLR(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。
　これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、BL21(DE3)株は、例えば、ライフテクノロジーズ社より入手可能である（製品番号C6000-03）。また、BLR(DE3)株は、例えば、メルクミリポア社より入手可能である（製品番号 69053）。
　本発明の細菌は、栄養要求性株であってもよい。栄養要求性株は、１種類の栄養要求性を有していてもよく、２またはそれ以上の種類の栄養要求性を有していてもよい。栄養要求性としては、イソロイシン要求性等のアミノ酸要求性や核酸要求性が挙げられる。例えば、エシェリヒア・コリBLR(DE3)株は、イソロイシン要求性を有する（Schmidt M, Romer L, Strehle M, Scheibel T, Biotechnol Lett 2007, 29(11):1741-1744.）。
　フィブロイン様タンパク質遺伝子を有するエシェリヒア・コリは、上記のようなエシェリヒア・コリ株に、同遺伝子を導入することにより取得できる。以下、フィブロイン様タンパク質遺伝子が導入されるおよび導入されたエシェリヒア・コリ株を総称して「宿主」ともいう。
　フィブロイン様タンパク質遺伝子は、フィブロイン様タンパク質遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。また、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
　また、取得したフィブロイン様タンパク質遺伝子を適宜改変してそのバリアントを取得することもできる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
　フィブロイン様タンパク質遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、当該宿主で機能する誘導可能なプロモーターの制御下で発現するように保持される。宿主において、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、プラスミド、コスミド、ファージミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、フィブロイン様タンパク質遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類のフィブロイン様タンパク質遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類のフィブロイン様タンパク質遺伝子を有していてもよい。
　フィブロイン様タンパク質遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能する誘導可能なものであれば特に制限されない。「宿主において機能する誘導可能なプロモーター」とは、宿主において誘導可能なプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。エシェリヒア・コリで機能する誘導可能なプロモーターとしては、lacプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーター、araBADプロモーター、tetAプロモーター、rhaPBADプロモーター、proUプロモーター、cspAプロモーター、λPLプロモーター、λPRプロモーター、phoAプロモーター、pstSプロモーター等の直接的に誘導可能なプロモーターや、T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター等の間接的に誘導可能なプロモーターが挙げられる。lacプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーターからの遺伝子発現は、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）またはラクトースにより誘導できる。trpプロモーターからの遺伝子発現は、３－β－インドールアクリル酸（ＩＡＡ）により誘導できる。araBADプロモーターからの遺伝子発現は、Ｌ－アラビノースにより誘導できる。tetAプロモーターからの遺伝子発現はアンヒドロテトラサイクリン（Anhydrotetracycline）により誘導できる。rhaPBADプロモーターからの遺伝子発現はＬ－ラムノース（L-rhamnose）により誘導できる。proUプロモーターからの遺伝子発現は、NaClにより誘導できる。trpプロモーターからの遺伝子発現は、培地中のトリプトファンを欠乏させることによっても誘導できる。cspAプロモーターからの遺伝子発現は、低温条件により誘導できる。λPLプロモーター、λPRプロモーターからの遺伝子発現は、高温条件により誘導できる。phoAプロモーター、pstSプロモーターからの遺伝子発現は、培地中のリン酸を欠乏させることにより誘導できる。T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターからの遺伝子の転写は、それぞれ、ファージ由来のT3 RNAポリメラーゼ、T5 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼにより行われる。よって、T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターからの遺伝子発現は、対応するRNAポリメラーゼを上記のような直接的に誘導可能なプロモーターの制御下で誘導発現することにより、間接的に誘導できる。上記のようなプロモーターは、そのまま用いてもよく、適宜改変して用いてもよい。例えば、各種レポーター遺伝子を用いることにより、上記のような在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
　フィブロイン様タンパク質遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。フィブロイン様タンパク質遺伝子を含むベクターを、フィブロイン様タンパク質遺伝子の組換えDNAともいう。フィブロイン様タンパク質遺伝子の組換えDNAは、例えば、フィブロイン様タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。フィブロイン様タンパク質遺伝子の組換えDNAで宿主を形質転換することにより、同組換えDNAが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するための、エシェリヒア・コリで機能する誘導可能なプロモーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリにおいて自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pCold TF DNA（TaKaRa）、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。組換えDNAの構築の際には、例えば、フィブロイン様タンパク質のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっている上記のようなプロモーターの下流にフィブロイン様タンパク質のコード領域を組み込んでもよい。
　また、フィブロイン様タンパク質遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、本発明の実施に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色体への遺伝子の導入の際には、例えば、フィブロイン様タンパク質のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在する上記のようなプロモーターの下流にフィブロイン様タンパク質のコード領域を組み込んでもよい。
　染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
　形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
＜３＞本発明の方法
　本発明の方法は、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリ（本発明の細菌）を培地で培養すること、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、およびフィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、前記発現誘導後の菌体増殖が低減されていることを特徴とする方法である。
　すなわち、まず、本発明の細菌の培養を開始する。培養開始後、適当なタイミングでフィブロイン様タンパク質遺伝子の発現を誘導する。発現誘導後、培養をさらに継続し、フィブロイン様タンパク質を培地中および／または菌体内に生成蓄積させる。本発明において、「発現誘導時」とは、当該発現誘導を実施する時点、すなわち、フィブロイン様タンパク質遺伝子の発現を誘導する時点、を意味する。また、培養開始から当該発現誘導までの期間を「発現誘導前の期間」、当該発現誘導から培養終了までの期間を「発現誘導後の期間」ともいう。
　発現誘導により、フィブロイン様タンパク質遺伝子の発現量が通常時と比較して上昇する。発現誘導により、フィブロイン様タンパク質遺伝子の発現量は、通常時の少なくとも2倍以上、好ましくは3倍以上、さらに好ましくは4倍以上に上昇されてよい。「通常時」とは、誘導可能でないプロモーターの制御下でフィブロイン様タンパク質遺伝子を発現する条件、あるいは、採用した発現系の構成に応じた発現誘導の条件が満たされていない条件を意味する。「誘導可能でないプロモーターの制御下でフィブロイン様タンパク質遺伝子を発現する条件」としては、フィブロイン様タンパク質遺伝子を、当該遺伝子の本来のプロモーターであって誘導可能でないものの制御下で発現する条件が挙げられる。「採用した発現系の構成に応じた発現誘導条件が満たされていない条件」としては、或る物質の存在により発現が誘導される場合には当該物質が添加されていない条件、或る物質の欠乏により発現が誘導される場合には当該物質が欠乏していない条件、或る温度において発現が誘導される場合には培養系の温度が当該発現が誘導される温度の範囲外である条件が挙げられる。
　培養条件は、発現誘導前の期間に本発明の細菌が増殖でき、発現誘導後の期間の菌体増殖が低減され、且つ、発現誘導後の期間にフィブロイン様タンパク質が生成蓄積する限り、特に制限されない。なお、発現誘導後の期間においては、本発明の細菌は増殖してもよく、しなくてもよい。培養条件は、発現誘導前の期間と発現誘導後の期間において同一であってもよく、同一でなくてもよい。培養条件は、菌体増殖を低減する手法の種類等の諸条件に応じて当業者が適宜設定することができる。
　「発現誘導前の期間」の長さ、すなわち発現誘導のタイミングは、培養条件等の諸条件に応じて適宜設定することができる。発現誘導は、例えば、培養開始０時間後以降、１時間後以降、２時間後以降、または３時間後以降の時点で実施してもよく、培養開始２４０時間後まで、２００時間後まで、１６０時間後まで、１２０時間後まで、または８０時間後までの時点で実施してもよく、それらの組み合わせの時点で実施してもよい。また、発現誘導は、例えば、培養液のＯＤ６２０が４０～５００、４０～４００、４０～３００、または４０～２００となった時点で実施してよい。「発現誘導後の期間」の長さは、培養条件等の諸条件に応じて適宜設定することができる。発現誘導後の培養時間は、例えば、１時間以上、４時間以上、または８時間以上であってもよく、２４０時間以下、２００時間以下、１６０時間以下、１２０時間以下、または８０時間以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
　発現誘導は、採用した発現系の構成に応じて実施することができる。すなわち、例えば、lacプロモーター、trcプロモーター、またはtacプロモーターを利用する場合はイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）またはラクトースを、trpプロモーターを利用する場合は３－β－インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を、araBADプロモーターを利用する場合はＬ－アラビノースを、tetAプロモーターを利用する場合はAnhydrotetracyclineを、rhaPBADプロモーターを利用する場合はL-rhamnoseを、proUプロモーターを使用する場合はNaClを、それぞれ培地に添加することにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、trpプロモーターを利用する場合は培地中のトリプトファンを欠乏させることによっても、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、cspAプロモーターを利用する場合は、培地の温度を下げる（例えば約15℃まで下げる）ことにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、λPLプロモーターまたはλPRプロモーターを利用する場合は培地の温度を上げる（例えば42℃まで上げる）ことにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、phoAプロモーターまたはpstSプロモーターを利用する場合は培地中のリン酸を欠乏させることにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、またはSP6プロモーターを利用する場合は、対応するRNAポリメラーゼの発現を適宜誘導することにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、上記のようなプロモーターを適宜改変して用いる場合も、適宜、発現誘導条件を選択することができる。また、発現系の構成によっては、２またはそれ以上の発現誘導条件を組み合わせて利用してもよい。
　培地としては、例えば、エシェリヒア・コリ等の細菌の培養に用いられる通常の培地を、そのまま、あるいは適宜改変して、用いることができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する液体培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定してよい。
　炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。これらの中では、有機酸類以外の炭素源が好ましく、糖類がより好ましく、グルコースが特に好ましい。例えば、全炭素源中のグルコースの比率が、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、９０％（ｗ／ｗ）以上、９５％（ｗ／ｗ）以上、または１００％（ｗ／ｗ）であってよい。
　窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
　リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
　硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
　その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
　また、生育にアミノ酸等の栄養素を要求する栄養要求性株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。また、抗生物質耐性遺伝子を搭載するベクターを用いて遺伝子を導入した際は、培地に対応する抗生物質を添加するのが好ましい。
　培養は、例えば、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。酸素濃度は、例えば、飽和溶存酸素濃度の５～５０％、好ましくは飽和溶存酸素濃度の２０～４０％となるように制御されてよい。培養温度は、例えば、２０～４５℃、２５～４０℃、または３０～３７℃であってよい。培養中のpHは、例えば、５～９であってよい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば、炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。また、培養は、前培養と本培養とに分けて行われてもよい。前培養は、例えば、平板培地や液体培地を用いて行ってよい。
　本発明において、各培地成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および／または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
　本発明の方法は、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖が低減されていることを特徴とする。「菌体増殖が低減されている」とは、菌体増殖の程度を示すパラメータが、対照条件と比較して低いことをいい、全く菌体が増殖していない場合を含む。「菌体増殖の程度を示すパラメータ」とは、菌体増加割合（cell growth rate）、菌体増加割合の傾き（cell growth rate slope）、累積比増殖速度（μ cumulative）、またはそれらの組み合わせをいう。「菌体増殖が低減されている」とは、例えば、菌体増殖の程度を示すパラメータが、対照条件の同パラメータの９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、または５０％以下であることであってよい。「菌体増殖が低減されている」とは、例えば、累積比増殖速度が、フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点で、０．０７０（/h）以下、０．０５０（/h）以下、０．０３０（/h）以下、０．０２５（/h）以下、０．０２０（/h）以下、または０．０１５（/h）以下であることであってもよい。「菌体増殖が低減されている」とは、例えば、菌体増加割合の傾きが、フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点で、４．０（%/h）以下、３．５（%/h）以下、３．０（%/h）以下、または２．５（%/h）以下であることであってもよい。「菌体増殖が低減されている」とは、例えば、菌体増加割合が、フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点で、８０％以下、７０％以下、６０％以下、または５０％以下であってもよい。「フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点」については後述する。菌体増殖は、発現誘導後の期間の全期間において低減されていてもよく、発現誘導後の期間の一部の期間にのみ低減されていてもよい。「一部の期間」の長さは、フィブロイン様タンパク質の生産が対照条件と比較して向上する限り特に制限されない。「一部の期間」とは、例えば、発現誘導後の期間の全期間の内の、５０％以上の期間、７０％以上の期間、９０％以上の期間、または９５％以上の期間であってよい。
　累積比増殖速度（μ cumulative）は下記式により算出される。
　累積比増殖速度（/h） = (Xt-X0)/∫Xtdt = ln(Xt/X0)/t
　　t：誘導開始後の時間（h）
　　Xt：誘導開始後t時間目の菌体量（g）
　　X0：誘導開始時の菌体量（g）
　　∫Xtdt：誘導開始後から誘導開始後t時間目までの積分菌体量（g・h）
　菌体増加割合（cell growth rate）は下記式により算出される。
　菌体増加割合（%） = (Xt-X0)/X0 × 100
　　Xt：誘導開始後t時間目の菌体量（g）
　　X0：誘導開始時の菌体量（g）
　菌体増加割合の傾き（cell growth rate slope）は下記式により算出される。
　菌体増加割合の傾き（%/h） = (Xt-X0)/X0 × 100/t
　　t：誘導開始後の時間（h）
　　Xt：誘導開始後t時間目の菌体量（g）
　　X0：誘導開始時の菌体量（g）
　本発明において、「対照条件」とは、発現誘導後の菌体増殖が低減されていない条件をいう。「対照条件」としては、生育因子制限により発現誘導後の菌体増殖を低減する場合には、実施例１、２、および４に記載の対照条件等の、十分量の生育因子の存在下で好気的に培養を行う条件が挙げられる。また、「対照条件」としては、発現誘導前の期間に菌体を十分に増殖させることにより発現誘導後の菌体増殖を低減する場合には、実施例３に記載の対照条件等の、菌体が十分に増殖する前に発現誘導を行う条件が挙げられる。
　「フィブロイン様タンパク質の生産が対照条件と比較して向上する」とは、フィブロイン様タンパク質の生産性を示すパラメータが、対照条件と比較して高いことをいう。「フィブロイン様タンパク質の生産性を示すパラメータ」とは、フィブロイン様タンパク質の培地容量当たりの蓄積量、フィブロイン様タンパク質の菌体重量当たりの蓄積量、フィブロイン様タンパク質の累積生産性、またはそれらの組み合わせをいう。「フィブロイン様タンパク質の生産が対照条件と比較して向上する」とは、例えば、フィブロイン様タンパク質の生産性を示すパラメータが、対照条件の同パラメータの１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、または１．５倍以上であることであってよい。フィブロイン様タンパク質の生産性を示すパラメータは、いずれも、例えば、発現誘導後の期間の所定の時点での値が対照条件と比較して高くてもよく、発現誘導後の期間における最大値が対照条件と比較して高くてもよい。「所定の時点」は、培養条件等の諸条件に応じて適宜設定することができる。「所定の時点」とは、例えば、フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点であってよい。「フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点」とは、例えば、菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質の蓄積量の増加割合が、４～１２時間当たり１０％以下となる時点であってよい。また、「フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点」とは、培養条件によっても異なるが、例えば、発現誘導の４時間後、９時間後、１４時間後、２１．５時間後、３０時間後、５０時間後、７０時間後、または１００時間後であってもよい。
　発現誘導時から所定の時点までのフィブロイン様タンパク質の累積生産性は、下記式により算出される。
　累積生産性 = F/V/(T1-T0)
　　F：フィブロイン様タンパク質の蓄積量（g）
　　V：培地量（L）
　　T1：サンプリング時刻（所定の時点）
　　T0：発現誘導時刻
　発現誘導後の菌体増殖を低減する手法は特に制限されない。
　発現誘導後の菌体増殖は、例えば、発現誘導後の期間に生育因子制限下で培養を行うことにより、低減できる。「生育因子」とは、菌体の生育に必要な成分をいう。生育因子としては、一般的に、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、ミネラルが挙げられる。窒素源としては、例えば、有機窒素源を制限してもよい。また、本発明の細菌が栄養要求性株である場合、生育因子としては、当該栄養要求性により要求される栄養素も挙げられる。そのような栄養素としては、イソロイシン等のアミノ酸類や核酸類が挙げられる。生育因子制限は、例えば、制限する成分以外の必須成分が十分量存在するまたは供給される条件下で実施することができる。すなわち、例えば、炭素源、窒素源、硫黄源、およびミネラルが十分量存在するまたは供給される条件下で、リン酸源を制限することができる。本発明の方法においては、１種の生育因子が制限されてもよく、２種またはそれ以上の生育因子が制限されてもよい。
　「生育因子制限」とは、培養系への生育因子の供給が制限されていることをいう。生育因子制限により、培養系中の生育因子濃度は低く維持され得る。すなわち、「生育因子制限」とは、例えば、培地中の生育因子濃度を一定濃度以下に制限することであってよい。「一定濃度」の値は、フィブロイン様タンパク質の生産が対照条件と比較して向上する限り特に制限されない。「一定濃度」の値は、制限する生育因子の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。具体的には、リン酸源を制限する場合、培地中のリン酸源濃度は、ＫＨ２ＰＯ４量に換算して、例えば、０．５ｇ／Ｌ未満、０．３ｇ／Ｌ未満、０．２ｇ／Ｌ未満、０．１ｇ／Ｌ未満、または０（ゼロ）に制限されてよい。生育因子濃度は、発現誘導後の期間の全期間において一定濃度以下に制限されていてもよく、発現誘導後の期間の一部の期間にのみ一定濃度以下に制限されていてもよい。「一部の期間」の長さは、フィブロイン様タンパク質の生産が対照条件と比較して向上する限り特に制限されない。「一部の期間」とは、例えば、発現誘導後の期間の全期間の内の、５０％以上の期間、７０％以上の期間、９０％以上の期間、または９５％以上の期間であってよい。生育因子濃度は、発現誘導後の期間を通じて一定であってもよく、一定でなくてもよい。
　生育因子制限は、例えば、初発培地中の生育因子の濃度を低減すること、生育因子の流加量を低減すること、またはそれらの組み合わせにより、達成できる。
　すなわち、例えば、初発培地中の生育因子の濃度を低減することにより、発現誘導後の期間において生育因子制限を達成できる。なお、「初発培地」を「培養開始時の培地」と読み替えてもよい。「培養開始時の培地」とは、具体的には、植菌直後の培養液であってよい。初発培地中の生育因子濃度は、発現誘導後の期間に生育因子制限を実施できる限り、特に制限されない。初発培地中の生育因子濃度は、一定濃度以下であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、初発培地の生育因子濃度が一定濃度より高いが、培養中に初発培地中の生育因子が消費されることにより生育因子濃度が一定濃度以下となってもよい。初発培地中の生育因子の濃度は、例えば、培養中に枯渇する濃度に設定することができる。培養中に枯渇する濃度で生育因子を含有する初発培地で培養を行うことにより、生育因子の枯渇後の菌体増殖を、生育因子が枯渇しない場合と比較して低減することができる。枯渇のタイミングは、発現誘導後の菌体増殖を低減できる限り特に制限されない。枯渇するタイミングは、発現誘導前であってもよく、発現誘導後であってもよい。枯渇後はそのまま培養を継続することができる。また、枯渇前および／または枯渇後に、生育因子を適宜流加してもよい。生育因子を流加することにより、例えば、枯渇のタイミングを遅延させることや、枯渇後に菌体増殖を再開させることができる。初発培地中の生育因子の濃度は、生育因子の種類や培養条件等の諸条件に応じて適宜設定できる。具体的には、有機窒素源を制限する場合、初発培地中の有機窒素源濃度は、例えば、５０ｇ／Ｌ以下、３０ｇ／Ｌ以下、２０ｇ／Ｌ以下、１０ｇ／Ｌ以下、５ｇ／Ｌ以下、２ｇ／Ｌ以下、または１ｇ／Ｌ以下であってよい。また、具体的には、リン酸源を制限する場合、初発培地中のリン酸源濃度は、ＫＨ２ＰＯ４量に換算して、例えば、５０ｇ／Ｌ以下、３０ｇ／Ｌ以下、２０ｇ／Ｌ以下、１０ｇ／Ｌ以下、５ｇ／Ｌ以下、３．５ｇ／Ｌ以下、３．０ｇ／Ｌ以下、２．５ｇ／Ｌ以下、２．０ｇ／Ｌ以下、１．５ｇ／Ｌ以下、１．０ｇ／Ｌ以下、または０．５ｇ／Ｌ以下であってよい。このような初発培地中の生育因子の濃度の低減は、いずれの生育因子に適用されてもよいが、例えば、無機リン酸塩等のリン酸源に好適に適用できる。
　初発培地中の生育因子濃度を低減することにより生育因子制限を行う場合、発現誘導前の期間および発現誘導後の期間における培養の態様は、発現誘導後の期間に生育因子制限を達成できる限り特に制限されない。すなわち、例えば、発現誘導前の期間および発現誘導後の期間における生育因子の流加の有無や流加の態様は、発現誘導後の期間に生育因子制限を達成できるように適宜設定することができる。具体的には、例えば、発現誘導後の期間に流加培地の流加を行う場合、流加培地中の生育因子濃度や流加培地の流加速度は、後述するような、発現誘導後の期間に生育因子の流加量を低減することにより生育因子制限を行う場合の流加培地中の生育因子濃度や流加培地の流加速度に設定してもよい。
　また、例えば、生育因子の流加量を低減することにより、発現誘導後の期間において生育因子制限を達成できる。具体的には、例えば、発現誘導後の期間に流加培地を流加する場合に、発現誘導後の期間における生育因子の流加量を低減することにより、発現誘導後の期間において生育因子制限を達成できる。生育因子の流加量は、発現誘導後の期間に生育因子制限を実施できる限り、特に制限されない。なお、「生育因子の流加量を低減すること」には、生育因子が流加されない場合も含まれる。生育因子の流加量は、発現誘導後の期間の全期間において低減されていてもよく、発現誘導後の期間の一部の期間にのみ低減されていてもよい。「一部の期間」の長さは、フィブロイン様タンパク質の生産が対照条件と比較して向上する限り特に制限されない。「一部の期間」とは、例えば、発現誘導後の期間の全期間の内の、５０％以上の期間、７０％以上の期間、９０％以上の期間、または９５％以上の期間であってよい。生育因子の流加量は、流加培地中の生育因子濃度を低減すること、流加培地の流加量を低減すること、またはそれらの組み合わせにより、低減できる。例えば、流加培地中の全成分に対する制限される生育因子以外の成分の比率を高めることで、生育因子の流加量を低減することができる。例えば、有機窒素源やリン酸源を制限する場合には、制限される生育因子以外の成分としては炭素源が挙げられる。流加培地中の全成分に対する制限される生育因子以外の成分の比率は、例えば、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、９０％（ｗ／ｗ）以上、９５％（ｗ／ｗ）以上、または１００％（ｗ／ｗ）であってよい。また、流加培地中の全成分に対する制限される生育因子の比率は、例えば、３０％（ｗ／ｗ）未満、２０％（ｗ／ｗ）未満、１０％（ｗ／ｗ）未満、５％（ｗ／ｗ）未満、または０（ゼロ）であってよい。具体的には、リン酸源を制限する場合、流加培地中の全成分に対するリン酸源の比率は、ＫＨ２ＰＯ４量に換算して、例えば、２．５％（ｗ／ｗ）未満、１．５％（ｗ／ｗ）未満、１．０％（ｗ／ｗ）未満、０．５％（ｗ／ｗ）未満、または０（ゼロ）であってよい。
　流加培地中の生育因子の濃度や流加培地の流加速度は、発現誘導後の累積比炭素源消費速度（ν cumulative）が、例えば、０．３５ｇ／ｇ／ｈｒ以下、０．３０ｇ／ｇ／ｈｒ以下、または０．２５ｇ／ｇ／ｈｒ以下となるように設定されてよい。累積比炭素源消費速度は、炭素源の流加速度（流加培地中の炭素源の濃度と流加培地の流加速度から決定される）と培地中の菌体濃度から算出される。炭素源は、例えば、グルコースであってよい。発現誘導時から所定の時点までの累積比炭素源消費速度は、下記式により算出される。
　累積比炭素源消費速度（g/(g・h)） = St/∫Xtdt
　　t：誘導開始後の時間（h）
　　St：誘導開始時から誘導開始後t時間目までの炭素源消費量（g）
　　∫Xtdt：誘導開始時から誘導開始後t時間目までの積分菌体量（g・h）
　流加培地の流加は、培地中の生育因子濃度が一定濃度以下に維持されるように行われてもよい。培地中の生育因子濃度を一定濃度以下に維持することは、例えば、培養系への生育因子の供給速度（流加速度）が培養系中の本発明の細菌による生育因子の消費速度よりも低くなるように、流加培地の流加を行うことにより達成できる。
　流加培地中の生育因子の濃度や流加培地の流加速度は、いずれも、発現誘導後の期間を通じて一定であってもよく、一定でなくてもよい。
　流加培地の流加は、連続的に行われてもよく、間欠的に行われてもよい。流加培地の流加は、培養開始時から開始してもよく、培養途中で開始してもよい。流加培地の流加は、発現誘導前に開始してもよく、発現誘導時に開始してもよく、発現誘導後に開始してもよい。流加培地の流加は、例えば、培地中の生育因子の濃度が一定濃度以下となってから、具体的には、生育因子が枯渇してから、開始してもよい。なお、複数回の流加が間欠的に行われる場合、２回目以降の流加を、その直前の流加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇したときに開始されるように制御することにより、発酵培地中の炭素源濃度を自動的に低レベルに維持することもできる（米国特許5,912,113号明細書）。炭素源の枯渇は、例えば、pHの上昇または溶存酸素濃度の上昇により検出できる（米国特許5,912,113号明細書）。
　流加培地の流加は、例えば、生育因子が枯渇しないように、あるいは生育因子が枯渇した状態が継続しないように、行われてよい。しかし、フィブロイン様タンパク質の生産が対照条件と比較して向上する限り、生育因子が枯渇していてもよい。生育因子が枯渇する期間は、生育因子の種類にもよるが、例えば、発現誘導後の期間の全期間であってもよく、発現誘導後の期間の全期間の内の、９０％以下の期間、７０％以下の期間、５０％以下の期間、３０％以下の期間、２０％以下の期間、１０％以下の期間、または５％以下の期間であってもよい。なお、培地中の生育因子濃度が０（ゼロ）であることは、必ずしも、生育因子が枯渇していることを意味しない。すなわち、例えば、培養系への生育因子の流加が継続されているが、流加される生育因子が速やかに消費されることにより、培地中の生育因子濃度が０（ゼロ）で維持されている場合は、生育因子の枯渇には該当しないものと想定される。
　発現誘導後の期間における生育因子の流加量を低減することにより生育因子制限を行う場合、発現誘導前の期間における培養の態様は、発現誘導後の期間に生育因子制限を達成できる限り特に制限されない。すなわち、例えば、初発培地における生育因子の濃度および発現誘導前の期間における生育因子の流加の有無や流加の態様は、発現誘導後の期間に生育因子制限を達成できるように適宜設定することができる。具体的には、例えば、初発培地における生育因子の濃度を、上記例示したような、初発培地中の生育因子の濃度を低減することにより生育因子制限を行う場合の初発培地中の生育因子の濃度に設定してもよい。
　発現誘導後の菌体増殖は、例えば、発現誘導前の期間に菌体を十分に増殖させることによっても、低減できる。「発現誘導前の期間に菌体を十分に増殖させる」とは、例えば、発現誘導時のＯＤ６２０が、８０以上、１００以上、１２０以上、１５０以上、または２００以上であることであってよい。発現誘導前の期間に菌体を十分に増殖させることは、発現誘導前の期間に十分量の炭素源およびその他菌体の増殖に必要な成分を供給して培養を行うことにより、達成できる。炭素源およびその他菌体の増殖に必要な成分は、いずれも、初発培地に十分量含まれていてもよく、十分量流加されてもよく、それらの組み合わせであってもよい。炭素源を流加する場合、流加培地中の炭素源の濃度や流加培地の流加速度は、例えば、炭素源の流加速度（流加培地中の炭素源の濃度と流加培地の流加速度から決定される）が、培養開始時の培養液１Ｌに対し、１ｇ／ｈｒ～１００ｇ／ｈｒとなるように設定されてよい。
　上記のような発現誘導後の菌体増殖を低減するための手法は、いずれかを単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
　上記のようにして本発明の細菌を培養することにより、培地中および／または菌体内にフィブロイン様タンパク質が蓄積する。フィブロイン様タンパク質は、例えば、菌体内に封入体として蓄積し得る。
　フィブロイン様タンパク質の回収および定量は、例えば、異種発現させたタンパク質を回収および定量する既知の方法（例えば、「新生化学実験講座　タンパク質VI　合成及び発現」日本生化学会編、東京化学同人(1992) pp183-184を参照）により行うことができる。
　以下、フィブロイン様タンパク質が菌体内に封入体として蓄積する場合の回収および定量の手順について例示する。まず、培養液から菌体を遠心操作にて集菌後、緩衝液で懸濁する。菌体懸濁液を、超音波処理やフレンチプレス等の処理に供し、菌体を破砕する。菌体破砕の前に、菌体懸濁液にリゾチームを終濃度0-200mg/lで添加し、氷中に30分から20時間放置してもよい。次いで、破砕物から、低速遠心分離（6000-15000 rpm, 5-10分、4℃）により、不溶性画分を沈殿として得る。不溶性画分は、必要により、適宜緩衝液で洗浄する。洗浄回数は特に制限されず、例えば、１回、２回、または３回以上であってもよい。不溶性画分を緩衝液で懸濁することにより、フィブロイン様タンパク質の懸濁液が得られる。菌体やフィブロイン様タンパク質の懸濁用の緩衝液としては、フィブロイン様タンパク質の溶解性が低いものを好ましく用いることができる。そのような緩衝液としては、例えば、20mMトリス-塩酸、30 mM NaCl、10 mM EDTAを含む緩衝液や20mMトリス-塩酸、30 mM NaClを含む緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは、例えば、通常4～12、好ましくは6～9であってよい。また、不溶性画分をSDS溶液や尿素溶液で溶解することにより、フィブロイン様タンパク質の溶液が得られる。回収されるフィブロイン様タンパク質は、フィブロイン様タンパク質以外に、細菌菌体、培地成分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。フィブロイン様タンパク質は、所望の程度に精製されていてよい。フィブロイン様タンパク質の量は、例えば、懸濁液や溶液等のフィブロイン様タンパク質を含むサンプルをSDS-PAGEに供して染色し、目的のフィブロイン様タンパク質の分子量に相当する位置のバンドの強度に基づいて決定することができる。染色は、CBB染色、蛍光染色、銀染色等により行うことができる。定量の際には、濃度既知のタンパク質を標準として利用することができる。そのようなタンパク質としては、例えば、アルブミンや、別途濃度を決定したフィブロイン様タンパク質が挙げられる。
　上記のようにして得られたフィブロイン様タンパク質は、適宜、繊維化等して利用することができる。フィブロイン様タンパク質の線維化は、例えば、既知の方法により行うことができる。フィブロイン様タンパク質の線維化は、具体的には、例えば、WO2012/165476に記載の大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドの繊維化に関する記載を参照して行うことができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。
参考例１：フィブロイン様タンパク質生産菌の構築
　本実施例（実施例１～５）でフィブロイン様タンパク質生産に用いた菌株および遺伝子は以下の通りである。
　宿主：エシェリヒア・コリBLR(DE3)
　ベクター：pET22b(+)
　フィブロイン様タンパク質遺伝子：WO2012/165476A1の配列番号１０に記載の塩基配列を有する遺伝子
　上記遺伝子を搭載するpET22b(+)ベクター（WO2012/165476A1）でエシェリヒア・コリBLR(DE3)を形質転換することにより、フィブロイン様タンパク質生産菌を得ることができる。上記遺伝子の塩基配列を配列番号１に、同遺伝子がコードするフィブロイン様タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
参考例２：シード培養液の調製
　ジャーファーメンター中の表１に示したシード培養用培地300mlに、フィブロイン様タンパク質生産菌をOD620=0.005となるよう植菌した。OD620は、分光光度計UV-mini1240（島津製作所）で測定した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は1500rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.7で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。12時間後に、シード培養用培地中のグルコースが全て消費された時点で培養を終了し、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　豆濾液とは、大豆タンパク質の加水分解物である。グルコースとMgSO4・7H2OをA区、その他の成分をB区としてストック液を調製した。次いで、A区はそのまま、B区はKOHを用いてpHを6.0とした後、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区およびB区を混合し、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように添加してシード培養用培地とした。
実施例１：有機窒素源量を低減した条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
（１）対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を促進するために、発現誘導後に十分量の有機窒素源をフィードする条件にて培養を実施した。実施例１においては、本条件を「対照条件」ともいう。
　ジャーファーメンター中の表２に示した生産培地255mlに、参考例２で得られたシード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　グルコースとMgSO4・7H2OをA区、その他の成分をB区としてストック液を調製した。次いで、A区およびB区を、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した後混合し、生産培地とした。
　培養開始後約2.5時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表３に示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表４に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　120℃、20分間オートクレーブで滅菌して使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　グルコースをA区、それ以外の成分をB区としてストック液を調製した。次いで、A区およびB区を、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌して使用した。
（２）有機窒素源制限条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、発現誘導後にグルコースのみをフィードする条件にて培養を実施した。実施例１においては、本条件を「有機窒素源制限条件」ともいう。
　ジャーファーメンター中の表２に示した生産培地255mlに、参考例２で得られたシード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
　培養開始後約2.5時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表３に示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表５に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　120℃、20分間オートクレーブで滅菌して使用した。
（３）解析
　上記（１）および（２）に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
　培養液のOD620を参考例２に示した方法で測定した。測定結果を図１に示す。また、IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ（菌体量、菌体増加割合、菌体増加割合の傾き、累積比増殖速度）を、それぞれ図２（Ａ）～（Ｄ）に示す。
　生産されたフィブロイン様タンパク質を適宜定量した。フィブロイン様タンパク質の生産量に関するデータ（培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、フィブロイン様タンパク質の累積生産性）を、それぞれ図３（Ａ）～（Ｃ）に示す。
　IPTG添加14(21.5)時間後の累積比増殖速度は、対照条件では0.031(0.033) /hであったのに対して、有機窒素源制限条件では0.027(0.022) /hと低下した。IPTG添加14(21.5)時間後の菌体増加割合は、対照条件では57.5(102.6)%であったのに対して、有機窒素源制限条件では48.2(62.6)%と低下した。IPTG添加14(21.5)時間後の菌体増加割合の傾きは、対照条件では3.96(4.77)%/hであったのに対して、有機窒素源制限条件では3.32(2.91)%/hと低下した。なお、上記データの表記において、括弧外のデータがIPTG添加14時間後のデータ、括弧内のデータがIPTG添加21.5時間後のデータにそれぞれ対応する（以下、同様）。
　IPTG添加後14(21.5)時間後の培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件では0.44(0.67) g/Lであったのに対して、有機窒素源制限条件では0.65(0.84) g/Lと向上した。IPTG添加後14(21.5)時間後の菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件では1.49(1.86)%であったのに対して、有機窒素源制限条件では2.32(2.86)%と向上した。IPTG添加後14(21.5)時間後のフィブロイン様タンパク質の累積生産性は、対照条件では0.030(0.031) g/L/hrであったのに対して、有機窒素源制限条件では0.045(0.039) g/L/hrと向上した。
　以上の結果より、発現誘導後の期間に有機窒素源制限条件で培養を行うことにより、同期間における菌体増殖が低減され、フィブロイン様タンパク質の生産が向上することが明らかとなった。
実施例２：リン酸源量を低減した条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
（１）対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後に菌体増殖を継続させるために、十分量のリン酸源（KH2PO4として12 g/L）を流加培地に添加した条件にて培養を実施した。実施例２においては、本条件を「対照条件」ともいう。
　表６に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表７に示した生産培地227mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL（コーンスティープリカー）をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように添加してシード培養用培地とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL（コーンスティープリカー）をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、生産培地とした。
　培養開始後約1.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表５に示したフィード液を1時間に4mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30～90mLの範囲で通気した。溶存酸素濃度の維持が困難となった場合は、フィード液の流速を低下させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
　培養開始後約8時間目において表５に示したフィード液量が28mLに達した時点で、表３に示した1M（238.3 g/L）IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表８に示したフィード液を1時間に4.0mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　グルコースをA区、KH2PO4をB区としてストック液を調製した。次いで、A区およびB区を、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌して使用した。
（２）リン酸制限条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、流加培地中のリン酸源を無添加とした条件にて培養を実施した。実施例２においては、本条件を「リン酸制限条件」ともいう。
　表６に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表７に示した生産培地227mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
　培養開始後約1.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表５に示したフィード液を1時間に4mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30～90mLの範囲で通気した。溶存酸素濃度の維持が困難となった場合は、フィード液の流速を低下させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
　培養開始後約8時間目において表５に示したフィード液量が28mLに達した時点で、表３に示した1M（238.3 g/L）IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表５に示したフィード液を1時間に4.0mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
（３）解析
　上記（１）および（２）に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
　培養液のOD620を参考例２に示した方法で測定した。また、培地中のリン酸濃度をホスファC-テストワコー（和光純薬工業（株））を用いて定法に従い測定した。OD620、リン酸濃度（KH2PO4換算）、およびリン酸総消費量（KH2PO4換算）の測定結果を、それぞれ図４（Ａ）～（Ｃ）に示す。また、IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ（菌体量、累積比増殖速度）を、それぞれ図５（Ａ）、（Ｂ）に示す。
　生産されたフィブロイン様タンパク質を適宜定量した。フィブロイン様タンパク質の生産量に関するデータ（培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、フィブロイン様タンパク質の累積比生産速度）を、それぞれ図６（Ａ）～（Ｃ）に示す。
　IPTG添加25時間後（培養開始32.5時間後）のリン酸総消費量は、対照条件では2.05 gであったのに対して、リン酸制限条件では0.90 gと低下した。
　IPTG添加25時間後の累積比増殖速度は、対照条件では0.035 /hであったのに対して、リン酸制限条件では0.030 /hと低下した。
　IPTG添加25時間後の培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件では1.61 g/Lであったのに対して、リン酸制限条件では2.32 g/Lと向上した。IPTG添加25時間後の菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件では4.20%であったのに対して、リン酸制限条件では6.94%と向上した。IPTG添加25時間後のフィブロイン様タンパク質の累積生産性は、対照条件では0.072 g/L/hであったのに対して、リン酸制限条件では0.105 g/L/hと向上した。
　以上の結果より、発現誘導後の期間にリン酸制限条件で培養を行うことにより、同期間における菌体増殖が低減され、フィブロイン様タンパク質の生産が向上することが明らかとなった。
実施例３：発現誘導前の菌体増殖を増強した条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
（１）対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の条件により培養を実施した。実施例３においては、本条件を「対照条件」ともいう。
　表９に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表１０に示した生産培地255mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL（コーンスティープリカー）をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように添加してシード培養用培地とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL（コーンスティープリカー）をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、生産培地とした。
　培養開始後約4.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表３に示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表５に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
（２）発現誘導前の菌体増殖を増強した条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、発現誘導前に十分量のグルコースをフィードして発現誘導前に菌体を十分に生育させた条件にて培養を実施した。実施例３においては、本条件を「発現誘導前の菌体増殖を増強した条件」ともいう。
　表９に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表１０に示した生産培地255mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
　培養開始後約4.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表５に示したフィード液の添加を開始し、培養を継続した。フィード液の流速は、1時間に10～40mlの範囲で、平均流速22.5mLとなるよう徐々に増加させた。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30～90mLの範囲で通気した。溶存酸素濃度の維持が困難となった場合は、フィード液の流速を低下させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
　培養開始後約８時間目において表5に示したフィード液量が90mLに達した時点で、表3に示した1M（238.3 g/L）IPTG水溶液1.2mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表５に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
（３）解析
　上記（１）および（２）に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
　培養液のOD620を参考例２に示した方法で測定した。測定結果を図７に示す。また、IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ（菌体量、菌体増加割合、菌体増加割合の傾き、累積比増殖速度）を、それぞれ図８（Ａ）～（Ｄ）に示す。
　生産されたフィブロイン様タンパク質を適宜定量した。フィブロイン様タンパク質の生産量に関するデータ（培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、フィブロイン様タンパク質の累積生産性）を、それぞれ図９（Ａ）～（Ｃ）に示す。
　累積比増殖速度は、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に0.033(0.029) /hであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に0.011 /hと低下した。菌体増加割合は、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に93.1(131.3)%であったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に77.1%と低下した。菌体増加割合の傾きは、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に4.66(4.69)%/hであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に3.21%/hと低下した。なお、上記データの表記において、括弧外のデータがIPTG添加20時間後のデータ、括弧内のデータがIPTG添加28時間後のデータにそれぞれ対応する（以下、同様）。
　培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に1.34(1.36) g/Lであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に2.70 g/Lと向上した。菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に3.80(3.45)%であったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に5.12%と向上した。フィブロイン様タンパク質の累積生産性は、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に0.072(0.054)g/L/hrであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に0.128 g/L/hrと向上した。
　以上の結果より、発現誘導前に菌体を十分に生育させることにより、発現誘導後の期間における菌体増殖が低減され、フィブロイン様タンパク質の生産が向上することが明らかとなった。
実施例４：炭素源量を低減した条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
（１）対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後に菌体増殖を継続させるために、炭素源（グルコース）の流加速度を8 mL/hrとした条件にて培養を実施した。実施例４においては、本条件を「対照条件」ともいう。
　表１に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表１０に示した生産培地255mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
　培養開始後約4.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表３に示した1M（238.3 g/L）IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表４に示したフィード液を1時間に8.0mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
（２）炭素源制限条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、炭素源（グルコース）の流加速度を4 mL/hrとした条件にて培養を実施した。実施例４においては、本条件を「炭素源制限条件」ともいう。
　表１に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表２に示した生産培地255mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
　培養開始後約4.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表３に示した1M（238.3 g/L）IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表４に示したフィード液を1時間に4.0mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
（３）解析
　上記（１）および（２）に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
　培養液のOD620を参考例２に示した方法で測定した。OD620の測定結果を、図１０（Ａ）に示す。また、グルコース消費量と累積比グルコース消費速度（ν-cumulative）を、図１０（Ｂ）、（Ｃ）に示す。また、IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ（菌体量、累積比増殖速度）を、それぞれ図１１（Ａ）、（Ｂ）に示す。
　生産されたフィブロイン様タンパク質を適宜定量した。フィブロイン様タンパク質の生産量に関するデータ（培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、フィブロイン様タンパク質の累積生産性）を、それぞれ図１２（Ａ）～（Ｃ）に示す。
　総グルコース消費量は、対照条件ではIPTG添加13.7時間後に47.6 gであったのに対して、炭素源制限条件では24.8 gと低下した。累積比グルコース消費速度は、対照条件でIPTG添加13.7時間後に0.40 g/g/hであったのに対して、炭素源制限条件では0.24 g/g/hと低下した。
　IPTG添加13.7時間後の累積比増殖速度は、対照条件では0.071 /hであったのに対して、炭素源制限条件では0.034 /hと低下した。
　培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件ではIPTG添加13.7時間後に0.85 g/Lであったのに対して、炭素源制限条件ではIPTG添加13.7時間後に1.24 g/Lと向上した。菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件ではIPTG添加13.7時間後に2.31%であったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に4.35%と向上した。フィブロイン様タンパク質の累積生産性は、対照条件ではIPTG添加13.7時間後に0.070g/L/hrであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加13.7時間後に0.096 g/L/hrと向上した。
　以上の結果より、発現誘導後の期間に炭素源制限条件で培養を行うことにより、同期間における菌体増殖が低減され、フィブロイン様タンパク質の生産が向上することが明らかとなった。
実施例５：要求性アミノ酸（Ile）量を低減した条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
（１）対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の条件により培養を実施した。実施例５においては、本条件を「対照条件」ともいう。
　表９に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表１０に示した生産培地255mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
　培養開始後約4.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表３に示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表５に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
（２）Ile制限条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
　以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、生産培地（初発培地）中のIle濃度を低減した条件にて培養を実施した。実施例５においては、本条件を「Ile制限条件」ともいう。
　表９に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表１１に示した生産培地255mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL（コーンスティープリカー）をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、生産培地とした。
　培養開始後約4.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表３に示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表５に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
（３）解析
　上記（１）および（２）に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
　培養液のOD620を参考例２に示した方法で測定した。OD620に関するデータを図１３に示す。IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ（累積比増殖速度）を、表１２に示す。
　培養液中のIle濃度を以下の手順で測定した。培養液から分離した培養上清を0.2 N HClで100倍希釈し、アミノ酸分析装置LC-8800C（島津製作所）を用いて分析した。測定結果を図１４に示す。IPTG溶液添加後のIle総消費量を、表１２に示す。
　生産されたフィブロイン様タンパク質を適宜定量した。フィブロイン様タンパク質の生産量に関するデータ（培養液容量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量、菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量）を、表１２に示す。
　IPTG添加24時間後（培養開始28時間後）のIle総消費量は、対照条件では0.244 gであったのに対して、Ile制限条件では0.033 gと低下した。
　IPTG添加24時間後の累積比増殖速度は、対照条件では0.033 /hであったのに対して、Ile制限条件では0.020 /hと低下した。
　IPTG添加24時間後の菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質蓄積量は、対照条件では3.04%であったのに対して、Ile制限条件では4.79%と向上した。
　以上の結果より、発現誘導後の期間にIle制限条件で培養を行うことにより、同期間における菌体増殖が低減され、フィブロイン様タンパク質の生産が向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実施例６：発現誘導前の菌体増殖を増強した条件での野生型ＡＤＦ３の生産
（Ａ）野生型ＡＤＦ３生産菌の構築
　本実施例では、フィブロイン様タンパク質として、Ｎ末端にHisタグとHRV3Cプロテアーゼ認識配列が付加されたニワオニグモのＡＤＦ３を生産した。本実施例において、同融合タンパク質を単に「野生型ＡＤＦ３」ともいう。
　野生型ＡＤＦ３をコードするＤＮＡをin-fusionキットにてpET22b(+)のNdeI-EcoRIサイトに導入し、野生型ＡＤＦ３の発現プラスミドpET22b-ADF3WTを得た。pET22b-ADF3WTでエシェリヒア・コリBLR(DE3)を形質転換し、野生型ＡＤＦ３生産菌BLR(DE3)/pET22b-ADF3WTを得た。pET22b-ADF3WTにおける野生型ＡＤＦ３のコード領域の塩基配列とその周辺配列を配列番号４に示す。配列番号４の１２～１９９４位が野生型ＡＤＦ３のコード領域に対応する。また、pET22b-ADF3WTにコードされる野生型ＡＤＦ３のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
（Ｂ）野生型ＡＤＦ３の生産
（１）対照条件での野生型ＡＤＦ３の生産
　以下の条件により培養を実施した。実施例６においては、本条件を「対照条件」ともいう。
　表９に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表１０に示した生産培地255mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
　培養開始後約4.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表３に示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表１３に示したフィード液を1時間に2.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 　120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。
（２）発現誘導前の菌体増殖を増強した条件での野生型ＡＤＦ３の生産
　以下の手順により、野生型ＡＤＦ３の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、発現誘導前に十分量のグルコースをフィードして発現誘導前に菌体を十分に生育させた条件にて培養を実施した。実施例６においては、本条件を「発現誘導前の菌体増殖を増強した条件」ともいう。
　表９に示したシード培養用培地を用い、参考例２に記載した条件にてグルコースが完全に消費されるまで培養を行い、シード培養液を得た。その後、ジャーファーメンター中の表１０に示した生産培地255mlに、上記シード培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
　培養開始後約4.0時間目に生産培地中のグルコースが完全に消費された。直後に表１３に示したフィード液を1時間に14.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30～90mLの範囲で通気した。溶存酸素濃度の維持が困難となった場合は、フィード液の流速を低下させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
　培養開始後約８時間目において表１３に示したフィード液の流加量が58mLに達した時点で、表３に示した1M IPTG水溶液1.1mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表１３に示したフィード液を1時間に2.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe（登録商標）Dissolved Oxygen Sensors（Broadley-James社）を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
（３）解析
　上記（１）および（２）に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
　培養液のOD620を参考例２に示した方法で測定した。測定結果を図１５（Ａ）に示す。また、IPTG溶液添加後の累積比グルコース消費速度（ν-cumulative）を、図１５（Ｂ）に示す。また、培地中のIle濃度濃度を実施例５に示した方法で測定した。Ile濃度およびIPTG溶液添加後のIle総消費量を、図１６（Ａ）、（Ｂ）に示す。また、培地中のリン酸濃度を実施例２に示した方法で測定した。リン酸濃度（KH2PO4換算）およびIPTG溶液添加後のリン酸総消費量（KH2PO4換算）を、図１６（Ｃ）、（Ｄ）に示す。また、IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ（菌体量、菌体増殖割合、菌体増加割合の傾き、累積比増殖速度）を、図１７（Ａ）～（Ｄ）、表１４に示す。
　生産された野生型ＡＤＦ３を適宜定量した。野生型ＡＤＦ３の生産量に関するデータ（培養液容量当たりの野生型ＡＤＦ３蓄積量、菌体重量当たりの野生型ＡＤＦ３蓄積量、野生型ＡＤＦ３累積生産性）を、図１８（Ａ）～（Ｃ）、表１４に示す。
　累積比増殖速度は、対照条件ではIPTG添加42時間後に0.022 /hであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加38時間後に0.009 /hと低下した。菌体増加割合は、対照条件ではIPTG添加42時間後に163.8%であったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加38時間後に36.3%と低下した。菌体増加割合の傾きは、対照条件ではIPTG添加42時間後に3.78%/hであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加38時間後に0.96%/hと低下した。
　培養液容量当たりの野生型ＡＤＦ３蓄積量は、対照条件ではIPTG添加42時間後に0.022 g/Lであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加38時間後に0.055 g/Lと向上した。菌体重量当たりの野生型ＡＤＦ３蓄積量は、対照条件ではIPTG添加42時間後に0.055%であったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加38時間後に0.100%と向上した。野生型ＡＤＦ３累積生産性は、対照条件ではIPTG添加42時間後に0.00058g/L/hであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加38時間後に0.0016g/L/hと向上した。
　以上の結果より、発現誘導前に菌体を十分に生育させることにより、発現誘導後の期間における菌体増殖が低減され、野生型ＡＤＦ３の生産が向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　本発明により、フィブロイン様タンパク質を効率的に製造できる。
＜配列表の説明＞
配列番号１：実施例１～５で用いたフィブロイン様タンパク質遺伝子の塩基配列
配列番号２：実施例１～５で用いたフィブロイン様タンパク質遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：ニワオニグモのADF3タンパク質（partial）のアミノ酸配列
配列番号４：pET22b-ADF3WTにおける野生型ＡＤＦ３のコード領域の塩基配列とその周辺配列
配列番号５：pET22b-ADF3WTにコードされる野生型ＡＤＦ３のアミノ酸配列

Claims (11)

  1. 　フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、
    　フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、および
    　フィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、
    　前記発現誘導後の菌体増殖が低減されていることを特徴とする、方法。
  2. 　前記発現誘導後において、菌体増加割合、菌体増加割合の傾き、および累積比増殖速度から選択される１またはそれ以上が低下している、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記発現誘導後の期間に生育因子制限下で培養が行われることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記生育因子が、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、ミネラル、および栄養要求性により要求される栄養素から選択される１またはそれ以上の成分である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記生育因子が、炭素源、有機窒素源、およびリン酸源から選択される１またはそれ以上の成分である、請求項３または４に記載の方法。
  6. 　培養開始時における前記生育因子の培地中での濃度を低減することにより、生育因子が制限された、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記発現誘導後の期間における前記生育因子の流加量を低減することにより、生育因子が制限された、請求項３～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記発現誘導後の期間に流加される流加培地中の全成分に対する前記生育因子の比率が３０％（ｗ／ｗ）未満である、請求項３～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記発現誘導後の期間に流加される流加培地中の全成分に対する炭素源の比率が７０％（ｗ／ｗ）以上である、請求項３～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記発現誘導後の期間に累積比炭素源消費速度が０．３５ｇ／ｇ／ｈｒ以下となるように培養が行われる、請求項３～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記発現誘導前の期間に菌体を十分に増殖させることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
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