JP7328390B2 - フィブロイン様タンパク質の製造法 - Google Patents
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Description
特許文献1)、エシェリヒア・コリによるβ-lactamaseの比生産速度は比増殖速度が高い程低下する(非特許文献2)と報告されている。また、エシェリヒア・コリによるインターフェロンα1の生産量は、グルコース制限による生育速度低下により増大するが、リン酸制限には影響されないとの報告がある(非特許文献3)。また、エシェリヒア・コリによる組換えインターフェロンαの収率は、発現誘導前の比増殖速度が高い程増加するとの報告がある(非特許文献4)。また、エシェリヒア・コリによるヒト成長ホルモン(hGH
)の発現量は、リン酸枯渇により2倍に増加との報告がある(非特許文献5)。このよう
に、菌体の比増殖速度や培地成分の制限と、異種タンパク質の比生産速度との間には、一貫した関連性は認められない。
[1]
フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、
フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、および
フィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、
前記発現誘導後の菌体増殖が低減されていることを特徴とする、方法。
[2]
前記発現誘導後において、菌体増加割合、菌体増加割合の傾き、および累積比増殖速度から選択される1またはそれ以上が低下している、前記方法。
[3]
前記発現誘導後の期間に生育因子制限下で培養が行われることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、前記方法。
[4]
前記生育因子が、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、ミネラル、および栄養要求性により要求される栄養素から選択される1またはそれ以上の成分である、前記方法。
[5]
前記生育因子が、炭素源、有機窒素源、およびリン酸源から選択される1またはそれ以上の成分である、前記方法。
[6]
培養開始時における前記生育因子の培地中での濃度を低減することにより、生育因子が制限された、前記方法。
[7]
前記発現誘導後の期間における前記生育因子の流加量を低減することにより、生育因子が制限された、前記方法。
[8]
前記発現誘導後の期間に流加される流加培地中の全成分に対する前記生育因子の比率が30%(w/w)未満である、前記方法。
[9]
前記発現誘導後の期間に流加される流加培地中の全成分に対する炭素源の比率が70%(w/w)以上である、前記方法。
[10]
前記発現誘導後の期間に累積比炭素源消費速度が0.35g/g/hr以下となるように培養が行われる、前記方法。
[11]
前記発現誘導前の期間に菌体を十分に増殖させることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、前記方法。
本発明において、「フィブロイン様タンパク質」とは、フィブロインおよびそれに準ずる構造を有する繊維状タンパク質の総称である。
は、例えば、上記データベースに開示されたフィブロインのアミノ酸配列(例えば配列番号3)を有するタンパク質であってよい。また、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子(「フィブロイン様タンパク質遺伝子」ともいう)は、例えば、上記データベースに開示されたフィブロイン遺伝子の塩基配列を有する遺伝子であってよい。なお、「(アミノ酸または塩基)配列を有する」という表現は、当該「(アミノ酸または塩基)配列を含む」場合および当該「(アミノ酸または塩基)配列からなる」場合を包含する。
REP1-REP2 ・・・(I)
、4~12残基、または5~8残基であってよい。REP1は、例えば、クモのフィブロインにおいて、繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に相当する。
)の配列、587~616位の配列、587~607位の配列が挙げられる。
基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。同遺伝子の塩基配列を配列番号1に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号2に示す。
、元の機能が維持されたタンパク質(すなわち繊維状タンパク質)をコードすることをいう。「繊維状タンパク質」とは、所定の条件下で繊維状の形態を取るタンパク質をいう。すなわち、繊維状タンパク質は、繊維状の形態で発現するタンパク質であってもよく、発現時には繊維状の形態ではないが繊維状の形態に加工可能なタンパク質であってもよい。繊維状タンパク質は、例えば、封入体として発現し、その後、適当な手法により繊維状の形態に加工可能なタンパク質であってもよい。
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
ードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基配列を含むDNA断片を鋳型
とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ま
しくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1
% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1%
SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2~3回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合
には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げ
られる。
ン様タンパク質の検出や精製に利用できる。
本発明の細菌は、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリである。
シェリヒア・コリK-12株;エシェリヒア・コリK5株(ATCC 23506);BL21(DE3)株やそのrecA-株であるBLR(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株;およびそれらの派生株が挙げられ
る。
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(http://www.atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、BL21(DE3)株は、例えば、ライフテ
クノロジーズ社より入手可能である(製品番号C6000-03)。また、BLR(DE3)株は、例えば、メルクミリポア社より入手可能である(製品番号 69053)。
L, Strehle M, Scheibel T, Biotechnol Lett 2007, 29(11):1741-1744.)。
も取得できる(Gene, 60(1), 115-127 (1987))。
えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法(Higuchi, R., 61, in PCR technology,
Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989);Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987))や、ファージを用いる方法(Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987);Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))
が挙げられる。
プロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーター、araBADプロモー
ター、tetAプロモーター、rhaPBADプロモーター、proUプロモーター、cspAプロモーター
、λPLプロモーター、λPRプロモーター、phoAプロモーター、pstSプロモーター等の直接的に誘導可能なプロモーターや、T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター等の間接的に誘導可能なプロモーターが挙げられる。lacプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーターからの遺伝子発現は、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)またはラクトースにより誘導できる。trpプロモーターから
の遺伝子発現は、3-β-インドールアクリル酸(IAA)により誘導できる。araBADプロモーターからの遺伝子発現は、L-アラビノースにより誘導できる。tetAプロモーターからの遺伝子発現はアンヒドロテトラサイクリン(Anhydrotetracycline)により誘導で
きる。rhaPBADプロモーターからの遺伝子発現はL-ラムノース(L-rhamnose)により誘
導できる。proUプロモーターからの遺伝子発現は、NaClにより誘導できる。trpプロモー
ターからの遺伝子発現は、培地中のトリプトファンを欠乏させることによっても誘導できる。cspAプロモーターからの遺伝子発現は、低温条件により誘導できる。λPLプロモーター、λPRプロモーターからの遺伝子発現は、高温条件により誘導できる。phoAプロモーター、pstSプロモーターからの遺伝子発現は、培地中のリン酸を欠乏させることにより誘導できる。T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターからの遺
伝子の転写は、それぞれ、ファージ由来のT3 RNAポリメラーゼ、T5 RNAポリメラーゼ、T7
RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼにより行われる。よって、T3プロモーター、T5
プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターからの遺伝子発現は、対応するRNAポリメラーゼを上記のような直接的に誘導可能なプロモーターの制御下で誘導発現することにより、間接的に誘導できる。上記のようなプロモーターは、そのまま用いてもよく、適宜改変して用いてもよい。例えば、各種レポーター遺伝子を用いることにより、上記のような在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる(国際公開第00/18935号)。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター(Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574)やpnlp8プロモーター(WO2010/027045)が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。
ン様タンパク質遺伝子の組換えDNAともいう。フィブロイン様タンパク質遺伝子の組換えDNAは、例えば、フィブロイン様タンパク質遺伝子を含むDNA断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。フィブロイン様タンパク質遺伝子の組換えDNAで宿主を形質転換することにより、同組換えDNAが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するための、エシェリヒア・コリで機能する誘導可能なプロモーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリにおいて自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(いずれもタカラバ
イオ社より入手可)、pACYC184、pMW219(ニッポンジーン社)、pTrc99A(ファルマシア
社)、pPROK系ベクター(クロンテック社)、pKK233‐2(クロンテック社製)、pET系ベ
クター(ノバジェン社)、pQE系ベクター(キアゲン社)、pCold TF DNA(TaKaRa)、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。組換えDNAの構築の際には、例えば、フィブロイン様タンパク質のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっている上記のようなプロモーターの下流にフィブロイン様タンパク質のコード領域を組み込んでもよい。
度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、1コピーのみ導入されてもよく、2コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列(repetitive DNA)、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、
本発明の実施に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導
入することもできる(特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1)。染色体への
遺伝子の導入の際には、例えば、フィブロイン様タンパク質のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在する上記のようなプロモーターの下流にフィブロイン様タンパク質のコード領域を組み込んでもよい。
を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法(Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol.
Biol. 1970, 53, 159-162)、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増
殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法(Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167)などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法(Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933)も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ
型細菌について報告されているような、電気パルス法(特開平2-207791号公報)を利用することもできる。
本発明の方法は、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリ(本発明の細菌)を培地で培養すること、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、およびフィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、前記発現誘導後の菌体増殖が低減されていることを特徴とする方法である。
とは、誘導可能でないプロモーターの制御下でフィブロイン様タンパク質遺伝子を発現する条件、あるいは、採用した発現系の構成に応じた発現誘導の条件が満たされていない条件を意味する。「誘導可能でないプロモーターの制御下でフィブロイン様タンパク質遺伝子を発現する条件」としては、フィブロイン様タンパク質遺伝子を、当該遺伝子の本来のプロモーターであって誘導可能でないものの制御下で発現する条件が挙げられる。「採用した発現系の構成に応じた発現誘導条件が満たされていない条件」としては、或る物質の存在により発現が誘導される場合には当該物質が添加されていない条件、或る物質の欠乏により発現が誘導される場合には当該物質が欠乏していない条件、或る温度において発現が誘導される場合には培養系の温度が当該発現が誘導される温度の範囲外である条件が挙げられる。
時間後まで、200時間後まで、160時間後まで、120時間後まで、または80時間後までの時点で実施してもよく、それらの組み合わせの時点で実施してもよい。また、発現誘導は、例えば、培養液のOD620が40~500、40~400、40~300、または40~200となった時点で実施してよい。「発現誘導後の期間」の長さは、培養条件等の諸条件に応じて適宜設定することができる。発現誘導後の培養時間は、例えば、1時間以上、4時間以上、または8時間以上であってもよく、240時間以下、200時間以下、160時間以下、120時間以下、または80時間以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
ロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)またはラクトースを、trpプロモ
ーターを利用する場合は3-β-インドールアクリル酸(IAA)を、araBADプロモーターを利用する場合はL-アラビノースを、tetAプロモーターを利用する場合はAnhydrotetracyclineを、rhaPBADプロモーターを利用する場合はL-rhamnoseを、proUプロモーターを使用する場合はNaClを、それぞれ培地に添加することにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、trpプロモーターを利用する場合は培地
中のトリプトファンを欠乏させることによっても、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、cspAプロモーターを利用する場合は、培地の温度を下げる(例えば約15℃まで下げる)ことにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、λPLプロモーターまたはλPRプロモーターを利用する場合は培地の温度を上げる(例えば42℃まで上げる)ことにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、phoAプロモーターまたはpstSプロモーターを利用する場合は培地中のリン酸を欠乏させることにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、またはSP6プロモーターを利用する場合は、対応するRNAポリメラーゼの発現を適宜誘導することにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、上記のようなプロモーターを適宜改変して用いる場合も、適宜、発現誘導条件を選択することができる。また、発現系の構成によっては、2またはそれ以上の発現誘導条件を組み合わせて利用してもよい。
用いてもよく、2種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
タミン類;アミノ酸類;核酸類;これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、1種の成分を用いてもよく、2種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
らの組み合わせをいう。「菌体増殖が低減されている」とは、例えば、菌体増殖の程度を
示すパラメータが、対照条件の同パラメータの95%以下、90%以下、80%以下、70%以下、または50%以下であることであってよい。「菌体増殖が低減されている」とは、例えば、累積比増殖速度が、フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点で、0.070(/h)以下、0.050(/h)以下、0.030(/h)以下、0.025(/h)以下、0.020(/h)以下、または0.015(/h)以下であることであってもよい。「菌体増殖が低減されている」とは、例えば、菌体増加割合の傾きが、フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点で、4.0(%/h)以下、3.5(%/h)以下、3.0(%/h)以下、または2.5(%/h)以下であることであってもよい。「菌体増殖が低減されている」とは、例えば、菌体増加割合が、フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点で、80%以下、70%以下、60%以下、または50%以下であってもよい。「フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点」については後述する。菌体増殖は、発現誘導後の期間の全期間において低減されていてもよく、発現誘導後の期間の一部の期間にのみ低減されていてもよい。「一部の期間」の長さは、フィブロイン様タンパク質の生産が対照条件と比較して向上する限り特に制限されない。「一部の期間」とは、例えば、発現誘導後の期間の全期間の内の、50%以上の期間、70%以上の期間、90%以上の期間、または95%以上の期間であってよい。
累積比増殖速度(/h) = (Xt-X0)/∫Xtdt = ln(Xt/X0)/t
t:誘導開始後の時間(h)
Xt:誘導開始後t時間目の菌体量(g)
X0:誘導開始時の菌体量(g)
∫Xtdt:誘導開始後から誘導開始後t時間目までの積分菌体量(g・h)
菌体増加割合(%) = (Xt-X0)/X0 × 100
Xt:誘導開始後t時間目の菌体量(g)
X0:誘導開始時の菌体量(g)
菌体増加割合の傾き(%/h) = (Xt-X0)/X0 × 100/t
t:誘導開始後の時間(h)
Xt:誘導開始後t時間目の菌体量(g)
X0:誘導開始時の菌体量(g)
ロイン様タンパク質の生産性を示すパラメータは、いずれも、例えば、発現誘導後の期間の所定の時点での値が対照条件と比較して高くてもよく、発現誘導後の期間における最大値が対照条件と比較して高くてもよい。「所定の時点」は、培養条件等の諸条件に応じて適宜設定することができる。「所定の時点」とは、例えば、フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点であってよい。「フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点」とは、例えば、菌体重量当たりのフィブロイン様タンパク質の蓄積量の増加割合が、4~12時間当たり10%以下となる時点であってよい。また、「フィブロイン様タンパク質の蓄積が停止する時点」とは、培養条件によっても異なるが、例えば、発現誘導の4時間後、9時間後、14時間後、21.5時間後、30時間後、50時間後、70時間後、または100時間後であってもよい。
累積生産性 = F/V/(T1-T0)
F:フィブロイン様タンパク質の蓄積量(g)
V:培地量(L)
T1:サンプリング時刻(所定の時点)
T0:発現誘導時刻
源を制限する場合には、制限される生育因子以外の成分としては炭素源が挙げられる。流加培地中の全成分に対する制限される生育因子以外の成分の比率は、例えば、70%(w/w)以上、80%(w/w)以上、90%(w/w)以上、95%(w/w)以上、または100%(w/w)であってよい。また、流加培地中の全成分に対する制限される生育因子の比率は、例えば、30%(w/w)未満、20%(w/w)未満、10%(w/w)未満、5%(w/w)未満、または0(ゼロ)であってよい。具体的には、リン酸源を制限する場合、流加培地中の全成分に対するリン酸源の比率は、KH2PO4量に換算して、例えば、2.5%(w/w)未満、1.5%(w/w)未満、1.0%(w/w)未満、0.5%(w/w)未満、または0(ゼロ)であってよい。
以下、または0.25g/g/hr以下となるように設定されてよい。累積比炭素源消費速度は、炭素源の流加速度(流加培地中の炭素源の濃度と流加培地の流加速度から決定される)と培地中の菌体濃度から算出される。炭素源は、例えば、グルコースであってよい。発現誘導時から所定の時点までの累積比炭素源消費速度は、下記式により算出される。
累積比炭素源消費速度(g/(g・h)) = St/∫Xtdt
t:誘導開始後の時間(h)
St:誘導開始時から誘導開始後t時間目までの炭素源消費量(g)
∫Xtdt:誘導開始時から誘導開始後t時間目までの積分菌体量(g・h)
、例えば、pHの上昇または溶存酸素濃度の上昇により検出できる(米国特許5,912,113号
明細書)。
と想定される。
時間放置してもよい。次いで、破砕物から、低速遠心分離(6000-15000 rpm, 5-10分、4
℃)により、不溶性画分を沈殿として得る。不溶性画分は、必要により、適宜緩衝液で洗浄する。洗浄回数は特に制限されず、例えば、1回、2回、または3回以上であってもよい。不溶性画分を緩衝液で懸濁することにより、フィブロイン様タンパク質の懸濁液が得られる。菌体やフィブロイン様タンパク質の懸濁用の緩衝液としては、フィブロイン様タンパク質の溶解性が低いものを好ましく用いることができる。そのような緩衝液としては、例えば、20mMトリス-塩酸、30 mM NaCl、10 mM EDTAを含む緩衝液や20mMトリス-塩酸、30 mM NaClを含む緩衝液が挙げられる。緩衝液のpHは、例えば、通常4~12、好ましく
は6~9であってよい。また、不溶性画分をSDS溶液や尿素溶液で溶解することにより、フ
ィブロイン様タンパク質の溶液が得られる。回収されるフィブロイン様タンパク質は、フィブロイン様タンパク質以外に、細菌菌体、培地成分、及び細菌の代謝副産物等の成分を
含んでいてもよい。フィブロイン様タンパク質は、所望の程度に精製されていてよい。フィブロイン様タンパク質の量は、例えば、懸濁液や溶液等のフィブロイン様タンパク質を含むサンプルをSDS-PAGEに供して染色し、目的のフィブロイン様タンパク質の分子量に相当する位置のバンドの強度に基づいて決定することができる。染色は、CBB染色、蛍光染
色、銀染色等により行うことができる。定量の際には、濃度既知のタンパク質を標準として利用することができる。そのようなタンパク質としては、例えば、アルブミンや、別途濃度を決定したフィブロイン様タンパク質が挙げられる。
参照して行うことができる。
本実施例(実施例1~5)でフィブロイン様タンパク質生産に用いた菌株および遺伝子は以下の通りである。
宿主:エシェリヒア・コリBLR(DE3)
ベクター:pET22b(+)
フィブロイン様タンパク質遺伝子:WO2012/165476A1の配列番号10に記載の塩基配列
を有する遺伝子
ジャーファーメンター中の表1に示したシード培養用培地300mlに、フィブロイン様タ
ンパク質生産菌をOD620=0.005となるよう植菌した。OD620は、分光光度計UV-mini1240(
島津製作所)で測定した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間
に300mL通気し、攪拌速度は1500rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.7で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培
養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。12時間後に、シード培養用培地中のグルコースが全て消費された時点で培養を終了し、シード培養液を得た。
豆濾液とは、大豆タンパク質の加水分解物である。グルコースとMgSO4・7H2OをA区、その他の成分をB区としてストック液を調製した。次いで、A区はそのまま、B区はKOHを用いてpHを6.0とした後、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区およ
びB区を混合し、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように添加してシード培養用培地
とした。
(1)対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を促進するために、発現誘導後に十分量の有機窒素源をフィードする条件にて培養を実施した。実施例1においては、本条件を「対照条件」ともいう。
培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液
中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃
度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
グルコースとMgSO4・7H2OをA区、その他の成分をB区としてストック液を調製した。次
いで、A区およびB区を、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した後混合し、生産
培地とした。
示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表4に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度
の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
120℃、20分間オートクレーブで滅菌して使用した。
グルコースをA区、それ以外の成分をB区としてストック液を調製した。次いで、A区お
よびB区を、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌して使用した。
以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、発現誘導後にグルコースのみをフィードする条件にて培養を実施した。実施例1においては、本条件を「有機窒素源制限条件」ともいう。
培養液45mlを植菌した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液
中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃
度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表5に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度
の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
120℃、20分間オートクレーブで滅菌して使用した。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
累積比増殖速度)を、それぞれ図2(A)~(D)に示す。
のに対して、有機窒素源制限条件では0.027(0.022) /hと低下した。IPTG添加14(21.5)時
間後の菌体増加割合は、対照条件では57.5(102.6)%であったのに対して、有機窒素源制限条件では48.2(62.6)%と低下した。IPTG添加14(21.5)時間後の菌体増加割合の傾きは、対
照条件では3.96(4.77)%/hであったのに対して、有機窒素源制限条件では3.32(2.91)%/hと低下した。なお、上記データの表記において、括弧外のデータがIPTG添加14時間後のデータ、括弧内のデータがIPTG添加21.5時間後のデータにそれぞれ対応する(以下、同様)。
(1)対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後に菌体増殖を継続させるために、十分量のリン酸源(KH2PO4として12 g/L)を流加培地に添加した条件にて培養を実施した。実施例2においては、本条件を「対照条件」ともいう。
保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中
、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さら
に、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL(コーンスティープリカー)をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように添加してシード培養用培地とした。
グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL(コーンスティープリカー)をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC
区を混合し、生産培地とした。
示したフィード液を1時間に4mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和
濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30~90mLの
範囲で通気した。溶存酸素濃度の維持が困難となった場合は、フィード液の流速を低下させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養
を継続した。
に示した1M(238.3 g/L)IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表8に示したフィード液を1時間に4.0mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素
濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継
続した。
グルコースをA区、KH2PO4をB区としてストック液を調製した。次いで、A区およびB区を、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌して使用した。
以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、流加培地中のリン酸源を無添加とした条件にて培養を実施した。実施例2においては、本条件を「リン酸制限条件」ともいう。
保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中
、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存
酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さら
に、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
したフィード液を1時間に4mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃
度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30~90mLの範
囲で通気した。溶存酸素濃度の維持が困難となった場合は、フィード液の流速を低下させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を
継続した。
に示した1M(238.3 g/L)IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表5に示したフィード液を1時間に4.0mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素
濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継
続した。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
ファC-テストワコー(和光純薬工業(株))を用いて定法に従い測定した。OD620、リン
酸濃度(KH2PO4換算)、およびリン酸総消費量(KH2PO4換算)の測定結果を、それぞれ図4(A)~(C)に示す。また、IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ(菌体量、累積比増殖速度)を、それぞれ図5(A)、(B)に示す。
ったのに対して、リン酸制限条件では6.94%と向上した。IPTG添加25時間後のフィブロイ
ン様タンパク質の累積生産性は、対照条件では0.072 g/L/hであったのに対して、リン酸
制限条件では0.105 g/L/hと向上した。
(1)対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
以下の条件により培養を実施した。実施例3においては、本条件を「対照条件」ともいう。
に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養
中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さ
らに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL(コーンスティープリカー)をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように添加してシード培養用培地とした。
グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL(コーンスティープリカー)をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、生産培地とした。
示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表5に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度
の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、発現誘導前に十分量のグルコースをフィードして発現誘導前に菌体を十分に生育させた条件にて培養を実施した。実施例3においては、本条件を「発現誘導前の菌体増殖を増強した条件」ともいう。
に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養
中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必
要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さ
らに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
示したフィード液の添加を開始し、培養を継続した。フィード液の流速は、1時間に10~40mlの範囲で、平均流速22.5mLとなるよう徐々に増加させた。フィルターで除菌した空気
を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度
が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30~90mLの範囲で通気
した。溶存酸素濃度の維持が困難となった場合は、フィード液の流速を低下させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した
。
度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続
した。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
累積比増殖速度)を、それぞれ図8(A)~(D)に示す。
に対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に0.011 /hと低下した。菌体増加割合は、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に93.1(131.3)%であったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に77.1%と低下した
。菌体増加割合の傾きは、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に4.66(4.69)%/hであった
のに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に3.21%/hと低
下した。なお、上記データの表記において、括弧外のデータがIPTG添加20時間後のデータ、括弧内のデータがIPTG添加28時間後のデータにそれぞれ対応する(以下、同様)。
積量は、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に3.80(3.45)%であったのに対して、発現誘
導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に5.12%と向上した。フィブロイン
様タンパク質の累積生産性は、対照条件ではIPTG添加20(28)時間後に0.072(0.054)g/L/hrであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖を増強した条件ではIPTG添加24時間後に0.128 g/L/hrと向上した。
(1)対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後に菌体増殖を継続させるために、炭素源(グルコース)の流加速度を8 mL/hrとした条件にて培養を実施した。実施
例4においては、本条件を「対照条件」ともいう。
に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養
中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さ
らに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
示した1M(238.3 g/L)IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表4に示したフィード液を1時間に8.0mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃
度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続
した。
以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、炭素源(グルコース)の流加速度を4 mL/hrとした条件にて培養を実施した。実施例
4においては、本条件を「炭素源制限条件」ともいう。
保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養中
、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyP
robe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さら
に、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
示した1M(238.3 g/L)IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表4に示したフィード液を1時間に4.0mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃
度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続
した。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
10(B)、(C)に示す。また、IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ(菌体量、累積比増殖速度)を、それぞれ図11(A)、(B)に示す。
強した条件ではIPTG添加13.7時間後に0.096 g/L/hrと向上した。
産
(1)対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
以下の条件により培養を実施した。実施例5においては、本条件を「対照条件」ともいう。
に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養
中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さ
らに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表5に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度
の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
以下の手順により、フィブロイン様タンパク質の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、生産培地(初発培地)中のIle濃度を低減した条件にて培養を実施した。実施例5に
おいては、本条件を「Ile制限条件」ともいう。
に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養
中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さ
らに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
グルコースとMgSO4・7H2OをA区、CSL(コーンスティープリカー)をB区、その他の成分をC区としてストック液を調製した。次いで、A区およびC区は、そのまま、別々に120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、生産培地とした。
示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表5に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度
の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
を図14に示す。IPTG溶液添加後のIle総消費量を、表12に示す。
おける菌体増殖が低減され、フィブロイン様タンパク質の生産が向上することが明らかとなった。
(A)野生型ADF3生産菌の構築
本実施例では、フィブロイン様タンパク質として、N末端にHisタグとHRV3Cプロテアーゼ認識配列が付加されたニワオニグモのADF3を生産した。本実施例において、同融合タンパク質を単に「野生型ADF3」ともいう。
を配列番号4に示す。配列番号4の12~1994位が野生型ADF3のコード領域に対応する。また、pET22b-ADF3WTにコードされる野生型ADF3のアミノ酸配列を配列番号
5に示す。
(1)対照条件での野生型ADF3の生産
以下の条件により培養を実施した。実施例6においては、本条件を「対照条件」ともいう。
に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養
中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さ
らに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
示した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表13に示したフィード液を1時間に2.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃
度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。
以下の手順により、野生型ADF3の発現誘導後の菌体増殖を低減するために、発現誘導前に十分量のグルコースをフィードして発現誘導前に菌体を十分に生育させた条件にて培養を実施した。実施例6においては、本条件を「発現誘導前の菌体増殖を増強した条件」ともいう。
に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養した。培養
中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。また、培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さ
らに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30mL通気した。
に示したフィード液を1時間に14.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルタ
ーで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の
溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度
を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させ、それでも溶存酸素濃度が不足した場合は、さらに、フィルターで除菌した酸素を1分間に30~90mLの範囲で通気した。溶存酸素濃度の維持が困難となった場合は、フィード液の流速を
低下させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御し
て培養を継続した。
度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続
した。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
また、IPTG溶液添加後の累積比グルコース消費速度(ν-cumulative)を、図15(B)
に示す。また、培地中のIle濃度濃度を実施例5に示した方法で測定した。Ile濃度およびIPTG溶液添加後のIle総消費量を、図16(A)、(B)に示す。また、培地中のリン酸
濃度を実施例2に示した方法で測定した。リン酸濃度(KH2PO4換算)およびIPTG溶液添加後のリン酸総消費量(KH2PO4換算)を、図16(C)、(D)に示す。また、IPTG溶液添加後の菌体増殖に関するデータ(菌体量、菌体増殖割合、菌体増加割合の傾き、累積比増殖速度)を、図17(A)~(D)、表14に示す。
、対照条件ではIPTG添加42時間後に3.78%/hであったのに対して、発現誘導前の菌体増殖
を増強した条件ではIPTG添加38時間後に0.96%/hと低下した。
配列番号1:実施例1~5で用いたフィブロイン様タンパク質遺伝子の塩基配列
配列番号2:実施例1~5で用いたフィブロイン様タンパク質遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:ニワオニグモのADF3タンパク質(partial)のアミノ酸配列
配列番号4:pET22b-ADF3WTにおける野生型ADF3のコード領域の塩基配列とその周辺
配列
配列番号5:pET22b-ADF3WTにコードされる野生型ADF3のアミノ酸配列
Claims (13)
- フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、
フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、
前記発現誘導後の期間に流加培地を流加すること、および
フィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、
前記発現誘導後の期間に生育因子制限下で培養が行われることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が前記発現誘導前よりも低減されていることを特徴とし、
フィブロイン様タンパク質が、下記(A)または(B)に記載のタンパク質:
(A)フィブロイン;
(B)フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有する繊維状タンパク質
であり、
前記フィブロインが有する反復配列と同様の配列が、下記式(I)に示される配列であり:
REP1-REP2 ・・・(I)
前記タンパク質(B)が、前記式(I)に示される配列を2回またはそれ以上の繰り返し数で有し、
各繰り返しにおいて独立に、前記REP1が、アラニン及びグリシンから選択される1またはそれ以上のアミノ酸の連続配列からなる2~20残基のアミノ酸配列であり、
各繰り返しにおいて独立に、前記REP2が、グリシン、セリン、グルタミン、及びアラニンから選択される1またはそれ以上のアミノ酸を含む2~200残基のアミノ酸配列であって、グリシン、セリン、グルタミン、及びアラニンの合計残基数がREP2の総アミノ酸残基数の40%以上であるアミノ酸配列である、方法。 - 前記発現誘導後において、菌体増加割合、菌体増加割合の傾き、および累積比増殖速度から選択される1またはそれ以上が低下している、請求項1に記載の方法。
- 前記生育因子が、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、ミネラル、および栄養要求性に
より要求される栄養素から選択される1またはそれ以上の成分である、請求項1または2に記載の方法。 - 前記生育因子が、炭素源、有機窒素源、およびリン酸源から選択される1またはそれ以上の成分である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導後の期間における前記生育因子の流加培地中での濃度を一定濃度以下に維持することにより、生育因子が制限された、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導後の期間における前記生育因子の流加培地中での濃度を低減することにより、生育因子が制限された、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導後の期間における前記生育因子の流加量を低減することにより、生育因子が制限された、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導後の期間に流加される流加培地中の全成分に対する前記生育因子の比率が30%(w/w)未満である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導後の期間に流加される流加培地中の全成分に対する炭素源の比率が70%(w/w)以上である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導後の期間に累積比炭素源消費速度が0.35g/g/hr以下となるように培養が行われる、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導前の期間に生育因子を制限せずに培養が行われることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導時のOD620が80以上となるように前記発現誘導前の期間に菌体を増殖させることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現誘導時のOD620が40~500となるように前記発現誘導前の期間に菌体を増殖させることにより、前記発現誘導後の菌体増殖が低減された、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
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