JP6923036B2 - フィブロイン様タンパク質の製造法 - Google Patents
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Description
[1]
タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、
タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、および
タンパク質を採取することを含む、タンパク質の製造法であって、
前記発現誘導時の有機酸蓄積が低減されていることを特徴とする、方法。
[2]
フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、
フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、および
フィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、
前記発現誘導時の有機酸蓄積が低減されていることを特徴とする、方法。
[3]
前記発現誘導時の有機酸の培地中での蓄積量が4.5g/L以下である、前記方法。
[4]
前記発現誘導時の酢酸の培地中での蓄積量が4.0g/L以下である、前記方法。
[5]
前記発現誘導前の期間に炭素源制限下で培養が行われることにより、前記発現誘導時の有機酸蓄積が低減された、前記方法。
[6]
前記発現誘導前の期間に培地中の炭素源濃度を0.5g/L以下に制限して培養が行われる、前記方法。
[7]
前記炭素源がグルコースである、前記方法。
[8]
前記エシェリヒア・コリが有機酸の生産能が低下するように改変されたことにより、前記発現誘導時の有機酸蓄積が低減された、前記方法。
本発明において製造されるタンパク質は、エシェリヒア・コリを宿主として発現可能なものであれば特に制限されない。タンパク質は、エシェリヒア・コリ由来のタンパク質であってもよく、異種由来のタンパク質であってもよい。異種由来のタンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。タンパク質は、分泌性タンパク質であってもよく、非分泌性タンパク質であってもよい。なお、「タンパク質」には、オリゴペプチドやポリペプチド等の、ペプチドと呼ばれる態様も包含される。
る構造を有する繊維状タンパク質の総称である。
REP1−REP2 ・・・(I)
50残基以下、100残基以下、または75残基以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。REP2の長さは、例えば、2〜200残基、10〜150残基、20〜100残基、または20〜75残基であってよい。REP2は、例えば、クモのフィブロインにおいて、柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に相当する。
質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得されるタンパク質が挙げられる。また、上記フィブロイン様タンパク質遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、上記フィブロイン様タンパク質遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
しくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1%
SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2〜3回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
本発明の細菌は、フィブロイン様タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子を有す
るエシェリヒア・コリである。以下、フィブロイン様タンパク質を製造する場合を想定して本発明の細菌について説明するが、当該説明はフィブロイン様タンパク質以外の任意のタンパク質を製造する場合にも準用できる。
L, Strehle M, Scheibel T, Biotechnol Lett 2007, 29(11):1741-1744.)。
Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989);Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987))や、ファージを用いる方法(Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987);Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))
が挙げられる。
RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼにより行われる。よって、T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターからの遺伝子発現は、対応するRNAポリメラーゼを上記のような直接的に誘導可能なプロモーターの制御下で誘導発現することにより、間接的に誘導できる。上記のようなプロモーターは、そのまま用いてもよく、適宜改変して用いてもよい。例えば、各種レポーター遺伝子を用いることにより、上記のような在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる(国際公開第00/18935号)。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター(Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574)やpnlp8プロモーター(WO2010/027045)が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。
ン様タンパク質遺伝子の組換えDNAともいう。フィブロイン様タンパク質遺伝子の組換えDNAは、例えば、フィブロイン様タンパク質遺伝子を含むDNA断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。フィブロイン様タンパク質遺伝子の組換えDNAで宿主を形質転換することにより、同組換えDNAが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するための、エシェリヒア・コリで機能する誘導可能なプロモーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリにおいて自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(いずれもタカラバイオ社より入手可)、pACYC184、pMW219(ニッポンジーン社)、pTrc99A(ファルマシア社)、pPROK系ベクター(クロンテック社)、pKK233‐2(クロンテック社製)、pET系ベクター(ノバジェン社)、pQE系ベクター(キアゲン社)、pCold TF DNA(TaKaRa)、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。組換えDNAの構築の際には、例えば、フィブロイン様タンパク質のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっている上記のようなプロモーターの下流にフィブロイン様タンパク質のコード領域を組み込んでもよい。
Biol. 1970, 53, 159-162)、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増
殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法(Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167)などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法(Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933)も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法(特開平2-207791号公報)を利用することもできる。
アミノ酸配列、及びこれら酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等の公用データベースから取得できる。本発明の細菌においては、有機酸の生合成経路の酵素から選択される1種の酵素の活性が低下してもよく、2種またはそれ以上の酵素の活性が低下してもよい。
異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
本発明の方法は、タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリ(本発明の細菌)を培地で培養すること、タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、およびタンパク質を採取することを含む、タンパク質の製造法であって、前記発現誘導時の有機酸蓄積が低減されていることを特徴とする方法である。本発明の方法の一態様は、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、およびフィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、前記発現誘導時の有機酸蓄積が低減されていることを特徴とする方法である。以下、フィブロイン様タンパク質を製造する場合を想定して本発明の方法について説明するが、当該説明はフィブロイン様タンパク質以外の任意のタンパク質を製造する場合にも準用できる。
。また、培養開始から当該発現誘導までの期間を「発現誘導前の期間」、当該発現誘導から培養終了までの期間を「発現誘導後の期間」ともいう。
利用する場合は培地中のリン酸を欠乏させることにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、T3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、またはSP6プロモーターを利用する場合は、対応するRNAポリメラーゼの発現を適宜誘導することにより、フィブロイン様タンパク質の発現を誘導することができる。また、例えば、上記のようなプロモーターを適宜改変して用いる場合も、適宜、発現誘導条件を選択することができる。また、発現系の構成によっては、2またはそれ以上の発現誘導条件を組み合わせて利用してもよい。
またはそれらの組み合わせにより実施されてよい。「十分量の炭素源存在下で培養を行う条件」としては、例えば、培地中のグルコース濃度が、培養開始時から発現誘導の直前まで常に一定濃度以上となるように培養を行う条件が挙げられる。「発現誘導の直前」とは、例えば、発現誘導の1時間前から発現誘導までのいずれかの時点であってよい。「一定濃度以上」とは、例えば、0.5g/L以上、1.0g/L以上、2.0g/L以上、3.0g/L以上、5.0g/L以上、または10.0g/L以上であってよい。「有機酸を副生する一般的な培養条件」として、具体的には、例えば、実施例に記載の対照条件等の、十分量のグルコースを含有する液体培地を用いて好気的に回分培養を行う条件が挙げられる。「一般的なエシェリヒア・コリ株」とは、有機酸の生産能が低下するよう改変されていないエシェリヒア・コリであれば特に制限されない。「一般的なエシェリヒア・コリ株」としては、本発明の細菌が有機酸の生産能が低下するよう改変されていない場合は本発明の細菌、本発明の細菌が有機酸の生産能が低下するよう改変されている場合はその改変前の株(有機酸の生産能が低下するように改変される前の株)が挙げられる。
累積生産性 = F/V/(T1-T0)
F:フィブロイン様タンパク質の蓄積量(g)
V:培地量(L)
T1:サンプリング時刻(所定の時点)
T0:発現誘導時刻
累積比生産速度(g/(g・h)) = Pt/∫Xtdt
t:誘導開始後の時間(h)
Pt:誘導開始後t時間目のフィブロイン蓄積(g)
∫Xtdt:誘導開始時から誘導開始後t時間目までの積分菌体量(g・h)
される。
ことができる。フィブロイン様タンパク質の線維化は、例えば、既知の方法により行うことができる。フィブロイン様タンパク質の線維化は、具体的には、例えば、WO2012/165476に記載の大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドの繊維化に関する記載を参照して行うことができる。
本実施例(実施例1〜2)でフィブロイン様タンパク質生産に用いた菌株および遺伝子は以下の通りである。
宿主:エシェリヒア・コリBLR(DE3)
ベクター:pET22b(+)
フィブロイン様タンパク質遺伝子:WO2012/165476A1の配列番号10に記載の塩基配列を有する遺伝子
ジャーファーメンター中の表1に示したシード培養用培地300mlに、フィブロイン様タンパク質生産菌をOD620=0.005となるように植菌した。OD620は、分光光度計UV-mini1240(島津製作所)で測定した。培養液温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は1500rpmとし、培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.7で一定に制御して培養した。培養中、経時的に培養液をサンプリングし、培養液中のグルコース濃度をBF-5(王子計測機器)を用いて測定した。12時間後に、シード培養用培地中のグルコースが全て消費された時点で培養を終了し、シード培養液を得た。
20分間オートクレーブで滅菌した。B区は硫酸を用いてpHを2に低下させ80℃の加熱処理を60分実施した後、120℃、20分間オートクレーブで滅菌した。次いで、A区、B区、およびC区を混合し、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように添加してシード培養用培地とした。
(1)対照条件でのフィブロイン様タンパク質の生産
以下の手順により、従来の一般的な培養条件、すなわち、適当量のグルコースを含有する初発培地を用いて培養液中のグルコースが全て消費されるまで培養する回分培養条件、にてフィブロイン様タンパク質生産菌の培養を実施した。本条件では、培養終了直前(発現誘導直前)まで、フィブロイン様タンパク質生産菌によるグルコース消費量に対して、十分量のグルコースが培養液中に存在する。実施例1においては、本条件を「対照条件」ともいう。
した1M IPTG水溶液0.3mlを添加した。その後、培養温度を30℃に設定し、表4に示したフィード液を1時間に3.6mlの流速で添加を開始し、培養を継続した。フィルターで除菌した空気を1分間に300mL通気し、攪拌速度は700rpmとした。培養中、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素濃度センサーOxyProbe(登録商標)Dissolved Oxygen Sensors(Broadley-James社)を用いて測定し、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。溶存酸素濃度を飽和濃度の20%に維持するに当たり、必要により撹拌速度を2000rpmまで増加させた。培養液pHはアンモニアガスを適宜吹き込むことによりpH6.9で一定に制御して培養を継続した。
以下の手順により、培地中のグルコース濃度を低く維持する条件にてフィブロイン様タンパク質生産菌の培養を実施した。実施例1においては、本条件を「グルコース制限条件」ともいう。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
カラム:パックドカラム Simpack SCR-102 (H) 直列×2本,
条件 :ポラリティー;+,Response;Slow,Gain;0.1 μS/cm,レンジ;1,カラム温度;40°C,移動層及び反応層流量;0.8 mL/min。
測定結果を図3に示す。
様タンパク質の生産が向上することが示唆される。
以下の手順により、従来の一般的な培養条件、すなわち、適当量のグルコースを含有する初発培地を用いて培養液中のグルコースが全て消費されるまで培養する回分培養条件、にてフィブロイン様タンパク質生産菌の培養を実施した。本条件では、培養終了直前(発現誘導直前)まで、フィブロイン様タンパク質生産菌によるグルコース消費量に対して、十分量のグルコースが培養液中に存在する。実施例2においては、本条件を「対照条件」ともいう。
実施例1におけるグルコース制限条件の結果を、実施例2におけるグルコース制限条件の結果として利用した。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
カラム:パックドカラム Simpack SCR-102 (H) 直列×2本,
条件 :ポラリティー;+,Response;Slow,Gain;0.1 μS/cm,レンジ;1,カラム
温度;40°C,移動層及び反応層流量;0.8 mL/min。
測定結果を図11に示す。
(A)野生型ADF3生産菌の構築
本実施例では、フィブロイン様タンパク質として、N末端にHisタグとHRV3Cプロテアーゼ認識配列が付加されたニワオニグモのADF3を生産した。本実施例において、同融合タンパク質を単に「野生型ADF3」ともいう。
(1)対照条件での野生型ADF3の生産
以下の条件により培養を実施した。実施例3においては、本条件を「対照条件」ともいう。
以下の手順により、発現誘導前の菌体増殖時に培地中のグルコース濃度を低く維持する条件にて野生型ADF3生産菌の培養を実施した。実施例3においては、本条件を「グルコース制限条件」ともいう。
上記(1)および(2)に記載の培養においては、培養途中および培養終了後に適当量の培養液をサンプリングし、以下に示す分析に供した。
カラム:パックドカラム Simpack SCR-102 (H) 直列×2本,
条件 :ポラリティー;+,Response;Slow,Gain;0.1 μS/cm,レンジ;1,カラム温度;40°C,移動層及び反応層流量;0.8 mL/min。
測定結果を図19、表9に示す。グルコース制限条件では、IPTG添加時の酢酸濃度が低減されていた。
配列番号1:実施例1〜2で用いたフィブロイン様タンパク質遺伝子の塩基配列
配列番号2:実施例1〜2で用いたフィブロイン様タンパク質遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:ニワオニグモのADF3タンパク質(partial)のアミノ酸配列
配列番号4:pET22b-ADF3WTにおける野生型ADF3のコード領域の塩基配列とその周辺配列
配列番号5:pET22b-ADF3WTにコードされる野生型ADF3のアミノ酸配列
Claims (4)
- フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、
フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、および
フィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、
前記発現誘導前の期間に炭素源制限下で培養が行われることにより、前記発現誘導時の有機酸蓄積が低減されていることを特徴とし、
前記発現誘導時の有機酸の培地中での蓄積量が0.2g/L以下である、方法。 - 前記発現誘導前の期間に培地中の炭素源濃度を0.5g/L以下に制限して培養が行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記炭素源がグルコースである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記エシェリヒア・コリが有機酸の生産能が低下するように改変されたことにより、前記発現誘導時の有機酸蓄積がさらに低減された、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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