JP2021035330A - 発現カセット - Google Patents
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Abstract
【課題】目的タンパク質をコードする遺伝子を含む複数種の遺伝子を発現させることができ、かつ、目的タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子を、目的タンパク質をコードする遺伝子よりも低い量で発現させる発現カセットを提供すること。【解決手段】センス鎖の5´から3´の方向に、プロモータ、並びに該プロモータに操作可能に連結した第一の核酸、ターミネータ及び第二の核酸を順に含む発現カセットであって、第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ少なくとも1つの遺伝子を含む、発現カセット。【選択図】なし
Description
本発明は、発現カセットに関し、特に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む複数種の遺伝子を発現させるための発現カセットに関する。
組換えタンパク質等の異種発現のための多くの発現系が研究されてきた。同一の細胞内において、目的タンパク質を発現させると共に、目的タンパク質をコードする遺伝子とは異なる遺伝子の発現量又は発現タイミングをコントロールする場合がある。例えば、目的タンパク質と細胞を溶解する溶解酵素とを発現させる場合、目的タンパク質が所望の量得られたタイミングで、溶解酵素が細胞を溶解可能な量発現させることが望ましい。
同一の細胞内において目的タンパク質をコードする遺伝子を含む複数種の遺伝子を発現させる系として、例えば、目的タンパク質を所望の量発現させた後に、別のプロモータ制御下にある別の遺伝子の発現を誘導する系が知られている(特許文献1)。しかしながら、この方法では、目的タンパク質をコードする遺伝子とは異なる別の遺伝子を所望の量発現させることができない場合がある。例えば、目的タンパク質以外のタンパク質が細胞溶解酵素であった場合、目的タンパク質を所望の量発現させた後に、当該溶解酵素の誘導発現を試みても、宿主細胞を溶解可能な量まで発現させることはできないという問題点がある。
本発明は、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む複数種の遺伝子を発現させることができ、かつ、目的タンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子を、目的タンパク質をコードする遺伝子よりも低い量で発現させる発現カセットを提供することを目的とする。
本発明者らは、発現カセットが、1つのプロモータの駆動下に、それぞれ遺伝子を含む第一の核酸及び第二の核酸を含み、かつ、第一の核酸及び第二の核酸の間にターミネータを含むことで、第一の核酸及び第二の核酸に含まれるそれぞれの遺伝子を発現させることができ、かつ、ターミネータの下流の第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量が第一の核酸に含まれる遺伝子の発現量よりも低くなることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、例えば以下の[1]〜[17]を提供する。
[1]
センス鎖の5´から3´の方向に、プロモータ、並びに該プロモータに操作可能に連結した第一の核酸、ターミネータ及び第二の核酸を順に含む発現カセットであって、
第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ少なくとも1つの遺伝子を含む、
発現カセット。
[2]
ターミネータの下流かつ第二の核酸の上流に改変されたリボソーム結合部位(RBS)が存在する、[1]に記載の発現カセット。
[3]
上記第一の核酸が、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、[1]または[2]に記載の発現カセット。
[4]
上記目的タンパク質が構造タンパク質である、[3]に記載の発現カセット。
[5]
上記構造タンパク質が、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群より選ばれるタンパク質又はこれら由来のタンパク質である、[4]に記載の発現カセット。
[6]
上記第二の核酸が、宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及び/又はデオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む、[1]〜[5]のいずれかに記載の発現カセット。
[7]
宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、リゾチーム遺伝子、VanX遺伝子、S遺伝子、R遺伝子及びRz遺伝子からなる群より選ばれる、[6]に記載の発現カセット。
[8]
上記第二の核酸が、S遺伝子、R遺伝子及びRz遺伝子を含む、[6]に記載の発現カセット。
[9]
上記デオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子がDNaseIをコードする遺伝子である、[6]〜[8]のいずれかに記載の発現カセット。
[10]
上記プロモータがT7プロモータである、[1]〜[9]のいずれかに記載の発現カセット。
[11]
上記ターミネータがT7ターミネータである、[1]〜[10]に記載のいずれかに記載の発現カセット。
[12]
上記第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量が、上記第一の核酸に含まれる遺伝子の発現量の20%以下である、[1]〜[11]のいずれかに記載の発現カセット。
[13]
[3]〜[12]のいずれかに記載の発現カセットが導入された組換え細胞。
[14]
プラスミドを用いて上記発現カセットを宿主細胞に導入することを含む、[13]に記載の組換え細胞の製造方法。
[15]
発現カセットが、宿主細胞のゲノムDNAに導入されている、[13]に記載の組換え細胞の製造方法。
[16]
目的タンパク質が発現し得る条件下で、[13]に記載の組換え細胞を培養する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
[17]
薬剤による誘導、温度変化による誘導、又は飢餓による誘導によりプロモータを活性化することを含む、[16]に記載の方法。
[18]
上記薬剤による誘導がIPTGによる誘導である、[17]に記載の方法。
[1]
センス鎖の5´から3´の方向に、プロモータ、並びに該プロモータに操作可能に連結した第一の核酸、ターミネータ及び第二の核酸を順に含む発現カセットであって、
第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ少なくとも1つの遺伝子を含む、
発現カセット。
[2]
ターミネータの下流かつ第二の核酸の上流に改変されたリボソーム結合部位(RBS)が存在する、[1]に記載の発現カセット。
[3]
上記第一の核酸が、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、[1]または[2]に記載の発現カセット。
[4]
上記目的タンパク質が構造タンパク質である、[3]に記載の発現カセット。
[5]
上記構造タンパク質が、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群より選ばれるタンパク質又はこれら由来のタンパク質である、[4]に記載の発現カセット。
[6]
上記第二の核酸が、宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及び/又はデオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む、[1]〜[5]のいずれかに記載の発現カセット。
[7]
宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、リゾチーム遺伝子、VanX遺伝子、S遺伝子、R遺伝子及びRz遺伝子からなる群より選ばれる、[6]に記載の発現カセット。
[8]
上記第二の核酸が、S遺伝子、R遺伝子及びRz遺伝子を含む、[6]に記載の発現カセット。
[9]
上記デオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子がDNaseIをコードする遺伝子である、[6]〜[8]のいずれかに記載の発現カセット。
[10]
上記プロモータがT7プロモータである、[1]〜[9]のいずれかに記載の発現カセット。
[11]
上記ターミネータがT7ターミネータである、[1]〜[10]に記載のいずれかに記載の発現カセット。
[12]
上記第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量が、上記第一の核酸に含まれる遺伝子の発現量の20%以下である、[1]〜[11]のいずれかに記載の発現カセット。
[13]
[3]〜[12]のいずれかに記載の発現カセットが導入された組換え細胞。
[14]
プラスミドを用いて上記発現カセットを宿主細胞に導入することを含む、[13]に記載の組換え細胞の製造方法。
[15]
発現カセットが、宿主細胞のゲノムDNAに導入されている、[13]に記載の組換え細胞の製造方法。
[16]
目的タンパク質が発現し得る条件下で、[13]に記載の組換え細胞を培養する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
[17]
薬剤による誘導、温度変化による誘導、又は飢餓による誘導によりプロモータを活性化することを含む、[16]に記載の方法。
[18]
上記薬剤による誘導がIPTGによる誘導である、[17]に記載の方法。
本発明によれば、1つのプロモータ駆動下で複数の遺伝子を発現させることができ、かつ、ターミネータの下流の遺伝子を上流の遺伝子よりも低く発現させることができる。それによって、例えば1つのプロモータ駆動下で、目的タンパク質の発現量よりも溶解酵素の発現量を低く抑えることで、所望量の目的タンパク質が発現する前に細胞溶解が起こらず、所望量の目的タンパク質が発現した後に細胞を溶解可能な量の溶解酵素が得られ、細胞溶解によって所望量の目的タンパク質を得ることができる。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
[発現カセット]
本発明において、発現カセットとは、遺伝子を含む核酸にプロモータとターミネータとが連結したDNA断片を意味する。本実施形態に係る発現カセットは、センス鎖の5´から3´の方向に、プロモータ、並びに該プロモータに操作可能に連結した第一の核酸、ターミネータ及び第二の核酸を順に含む発現カセットであって、第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ少なくとも1つの遺伝子を含む、発現カセットである。
本発明において、発現カセットとは、遺伝子を含む核酸にプロモータとターミネータとが連結したDNA断片を意味する。本実施形態に係る発現カセットは、センス鎖の5´から3´の方向に、プロモータ、並びに該プロモータに操作可能に連結した第一の核酸、ターミネータ及び第二の核酸を順に含む発現カセットであって、第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ少なくとも1つの遺伝子を含む、発現カセットである。
[プロモータ]
プロモータとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、trpプロモータ(Ptrp)、lacプロモータ、PLプロモータ、PRプロモータ、T7プロモータ等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモータ、Ptrpを2つ直列させたプロモータ(Ptrp×2)、tacプロモータ、lacT7プロモータ、lacT7.1プロモータ、lacT7.2プロモータ、lacT7.3プロモータ、lacT7.4プロモータ、lacT7.5プロモータ、let Iプロモータのように人為的に設計改変されたプロモータ、araBADプロモータ、rhaBADプロモータ、xylFプロモータ、xylAプロモータ、phoAプロモータ、cstAプロモータ及びcstA−lacZプロモータ、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモータ、PHO5プロモータ、PGKプロモータ、GAPプロモータ、ADHプロモータ、gal 1プロモータ、gal 10プロモータ、ヒートショックポリペプチドプロモータ、MFα1 プロモータ、CUP 1プロモータ、pGAPプロモータ、pGCW14プロモータ、AOX1プロモータ、MOXプロモータ等を用いることができる。
プロモータとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、trpプロモータ(Ptrp)、lacプロモータ、PLプロモータ、PRプロモータ、T7プロモータ等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモータ、Ptrpを2つ直列させたプロモータ(Ptrp×2)、tacプロモータ、lacT7プロモータ、lacT7.1プロモータ、lacT7.2プロモータ、lacT7.3プロモータ、lacT7.4プロモータ、lacT7.5プロモータ、let Iプロモータのように人為的に設計改変されたプロモータ、araBADプロモータ、rhaBADプロモータ、xylFプロモータ、xylAプロモータ、phoAプロモータ、cstAプロモータ及びcstA−lacZプロモータ、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモータ、PHO5プロモータ、PGKプロモータ、GAPプロモータ、ADHプロモータ、gal 1プロモータ、gal 10プロモータ、ヒートショックポリペプチドプロモータ、MFα1 プロモータ、CUP 1プロモータ、pGAPプロモータ、pGCW14プロモータ、AOX1プロモータ、MOXプロモータ等を用いることができる。
プロモータとしては、発現誘導可能なプロモータが好ましい。発現誘導可能なプロモータは、誘導物質(発現誘導剤)の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはpH値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できる。
発現誘導可能なプロモータとしては、ラクトース又はそのアナログであるIPTG(イソプロピルチオール−β−D−ガラクトシド)により誘導されるT7プロモータ、tac及びtrcプロモータ、lac及びlacUV5プロモータ;アラビノースにより誘導されるaraBADプロモータ;β−インドールアクリル酸添加若しくはトリプトファン飢餓により誘導され、トリプトファン添加により抑制されるtrpプロモータ;ラムノースにより誘導されるrhaBADプロモータ;キシロースにより誘導されるxylFプロモータ及びxylAプロモータ;温度上昇により誘導されるλファージのPRプロモータ及びPLプロモータ;リン酸飢餓により誘導されるphoAプロモータ;並びにグルコース飢餓により誘導されるcstAプロモータ及びcstA−lacZプロモータ等が挙げられる。本発明の発現カセットにおいては、T7プロモータを用いることが好ましい。
[ターミネータ]
ターミネータ(転写終結配列)としては、宿主細胞において、プロモータにより開始された転写を終結させる塩基配列であればいずれも用いることができる。原核生物や真核生物由来のターミネータであっても、ファージ由来のターミネータであってもよい。バクテリオファージターミネータとしては、例えばT7ターミネータ、T3ターミネータおよびSP6ターミネータ等が挙げられる。
ターミネータ(転写終結配列)としては、宿主細胞において、プロモータにより開始された転写を終結させる塩基配列であればいずれも用いることができる。原核生物や真核生物由来のターミネータであっても、ファージ由来のターミネータであってもよい。バクテリオファージターミネータとしては、例えばT7ターミネータ、T3ターミネータおよびSP6ターミネータ等が挙げられる。
用いるプロモータに対応するターミネータを用いることが好ましいが、これに限定されない。対応する例としては、プロモータがT7プロモータである場合は、T7ターミネータを用いることが好ましい。
また、ターミネータは、第一の核酸及び第二の核酸間以外にも含まれていてよく、例えば、第二の核酸の下流に含まれていてもよい。上記プロモータにより転写される最後の遺伝子の後にターミネータが含まれていてもよく、含まれていなくともよい。
[核酸]
本発明の発現カセットは、少なくとも第一の核酸及び第二の核酸を含む。本発明はこれに限定されず、さらに1以上の核酸を有することができる。本発明の発現カセットは、例えば、第三の核酸をさらに含んでもよい。
本発明の発現カセットは、少なくとも第一の核酸及び第二の核酸を含む。本発明はこれに限定されず、さらに1以上の核酸を有することができる。本発明の発現カセットは、例えば、第三の核酸をさらに含んでもよい。
第一の核酸及び第二の核酸はそれぞれ少なくとも1つの遺伝子を含む。本発明はこれに限定されず、各核酸が2以上の遺伝子を含んでもよく、2以上の遺伝子が異なってもよく、同じであってもよい。遺伝子とは、タンパク質の一次構造に対応する転写産物又は転移RNA(tRNA)やリボソームRNA等の転写産物の情報を含む核酸(DNA)分子上の特定の領域を意味する。また、核酸は、遺伝子の他にも、例えば、スペーサ、ターミネータ、及びリボソーム結合部位(RBS)等を含んでよい。
遺伝子の発現は、遺伝子の遺伝情報に基づいてタンパク質が合成されること及び遺伝子の遺伝情報に基づいて転写産物が合成されること(転写)を含む。
本発明は、第一の核酸及び第二の核酸間にターミネータ配列を有する。ターミネータにより転写が完全に終結するわけではなく、20〜30%はリードスルーすることが知られている。リードスルーとは、本来ターミネータにより終結するはずの転写が終結せず、更に転写が継続することである。T7ターミネータの場合、30%程度リードスルーが起こるとされている(Merck社 pET system manual 18ページ)。
本発明はこのリードスルーを利用し、ターミネータ以降の遺伝子の発現を制御する。すなわち、1つのプロモータ駆動下において、第一の核酸及び第二の核酸間にターミネータを有することで、第二の核酸に含まれる遺伝子は、リードスルーにより、転写されるものの、転写されるコピー数が第一の核酸に含まれる遺伝子よりも減少する。転写されるコピー数が少ないと、その遺伝子の発現量(タンパク質をコードする遺伝子である場合には、タンパク質の分子数)が減少するため、第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量は、第一の核酸に含まれる遺伝子の発現量よりも低くなる。本発明においては、第二の核酸に含まれる遺伝子の発現は低く抑えられるが、完全には抑制されない。したがって、1つのプロモータ配列の下流の、第一の核酸及び第二の核酸間に存在するターミネータにより転写が完全に終結しない。転写が完全には終結していないことは、例えばRT−PCR等により確認することができる。リードスルーの頻度は、第二の核酸に含まれる遺伝子の転写量/第一の核酸に含まれる遺伝子の転写量×100(%)、又は第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量/第一の核酸に含まれる遺伝子の発現量×100(%)として算出できる。各遺伝子の転写量は、例えばRT−PCR等により確認することができる。各遺伝子の発現量は、例えばHPLC、SDS−PAGE等により確認することができる。リードスルーの頻度は10〜40%が好ましく、20〜30%がより好ましい。
第一の核酸及び第二の核酸間にターミネータ配列を有するため、上述したように、第二の核酸に含まれる遺伝子は、リードスルーにより、その発現が抑制される。したがって、リードスルーにより発現が抑制されない第一の核酸に含まれる遺伝子は、目的タンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。第一の核酸が、構造タンパク質をコードする遺伝子を含むことがより好ましい。リードスルーにより発現が抑制される第二の核酸に含まれる遺伝子としては、例えば、宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子配列及び/又はデオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子が好ましい。また、第一の核酸が、構造タンパク質をコードする遺伝子を含み、第二の核酸が、宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及び/又はデオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含むことがより好ましい。
[タンパク質]
目的タンパク質とは、タンパク質発現方法により発現させた後、回収等して利用することを目的とするタンパク質のことを意味する。目的タンパク質としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、及び完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体等を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、フィブロイン(例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等)、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、及びこれらタンパク質の断片、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
目的タンパク質とは、タンパク質発現方法により発現させた後、回収等して利用することを目的とするタンパク質のことを意味する。目的タンパク質としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、及び完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体等を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、フィブロイン(例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等)、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、及びこれらタンパク質の断片、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
スパイダーシルクとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属(Araneus属)に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属(Neoscona属)に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属(Pronus属)に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属(Cyrtarachne属)に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属(Gasteracantha属)に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属(Ordgarius属)に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属(Argiope属)に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属(Arachnura属)に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属(Acusilas属)に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属(Cytophora属)に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属(Poltys属)に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属(Cyclosa属)に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属(Chorizopes属)に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属(Tetragnatha属)に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属(Leucauge属)に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属(Nephila属)に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属(Menosira属)に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属(Dyschiriognatha属)に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属(Latrodectus属)に属するクモ、及びユープロステノプス属(Euprosthenops属)に属するクモ等のアシナガグモ科(Tetragnathidae科)に属するクモが産生するスパイダーシルク等が挙げられる。
フィブロイン様タンパク質であるスパイダーシルク又はカイコシルク由来のタンパク質として、例えば、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式1中、(A)nモチーフは4〜20アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が80%以上である。REPは10〜200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。mは8〜300の整数を示す。複数存在する(A)nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するREPは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式2:[REP2]oで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式2中、oは5〜300の整数を示す。REP2はGly一X一Yから構成されるアミノ酸配列を示し、X及びYはGly以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するREP2は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式3:[REP3]pで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式3中、pは4〜300の整数を示す。REP3はSer一J一J一Tyr一Gly一U−Proから構成されるアミノ酸配列を示す。Jは任意のアミノ酸残基を示し、特にAsp、Ser及びThrからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Uは任意のアミノ酸残基を示し、特にPro、Ala、Thr及びSerからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するREP3は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、NCBIのGenBankのアクセッション番号AAC98395(ヒト)、I47076(ヒツジ)、NP786966(ウシ)等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス(Capra hircus)のタイプIケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号2で示されるアミノ酸配列(NCBIのGenBankのアクセッション番号ACY30466のアミノ酸配列)を含むタンパク質を挙げることができる。
上述のように、リードスルーにより、第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量は、第一の核酸に含まれる遺伝子の発現量よりも低くなる。したがって、第二の核酸に含まれる遺伝子がコードするタンパク質の発現量も、第一の核酸に含まれる遺伝子がコードするタンパク質の発現量よりも低くなる。第二の核酸に含まれる遺伝子がコードするタンパク質は、第一の核酸に含まれる遺伝子がコードするタンパク質と異なってもよく、同じであってもよい。第二の核酸に含まれる遺伝子は1種類に限定されず、2種類であっても、3種類であっても、4種類であってもよく、また、複数個存在して良い。
例えば、発現量を抑制させるタンパク質しては、第一の核酸に含まれる遺伝子の発現に影響を与えるようなタンパク質を挙げることができる。具体的には、例えば、加水分解酵素、核酸分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、脱離酵素、及び異性化酵素合成酵素等が挙げられる。
前記加水分解酵素としては、例えば、溶解酵素、プロテアーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼ、等が挙げられる。
前記溶解酵素は、宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質であれば、特に限定されない。例えば、細胞壁分解酵素であるホリン、エンドリシン、ペクチナーゼ、リゾチーム、セルラーゼ、チモリアーゼ、ドリスラーゼ及びバンコマイシン耐性に関わる溶菌活性を有するVanX等が挙げられる。
複数の溶解酵素(溶解酵素群)が連携することで効果的に宿主細胞を溶解することも知られている。したがって、これらの酵素をコードする複数の遺伝子は、第一の核酸の後(下流)の核酸に含まれてよく、例えば、第二の核酸に含まれてもよい。このように連携して効果的に宿主細胞を溶解する酵素をコードする遺伝子としては、例えば、Enterobacteria phage lambdaのholinをコードするS遺伝子(NCBIのGenBankのGeneID:5740919)、endolysinをコードするR遺伝子(NCBIのGenBankのGeneID:2703480)、cell lysis proteinをコードするRz遺伝子(NCBIのGenBankのGeneID:2703481)からなるEnterobacteria phage lambdaのSRRzを挙げることができる。
したがって、第二の核酸は、リゾチーム遺伝子、VanX遺伝子、S遺伝子、R遺伝子、及びRz遺伝子からなる群より選ばれる1以上の遺伝子を含んでもよい。例えば、第二の核酸がS遺伝子の配列を含み、その下流に含まれる第三の核酸がR遺伝子の配列を含んでもよい。また、例えば、第二の核酸が、S遺伝子、R遺伝子、及びRz遺伝子の配列を含んでもよい。
前記核酸分解酵素としては、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、リボヌクレアーゼ(RNase)等が挙げられ、DNaseとしては、例えば、好熱菌由来のTaqI、大腸菌ペリプラズムのEndA、及びウシ膵臓由来のDNaseI遺伝子等が挙げられる。本発明において、第二の核酸が、デオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含むことが好ましく、DNaseI遺伝子を含むことがより好ましい。発現カセットを形質転換した大腸菌を用いてタンパク質を発現させる場合、破砕した大腸菌の菌体からはDNA等の核酸が溶出し、処理液の粘性を高めるため、以後の工程で邪魔になるが、DNaseを発現させることによりこのような問題も解決できる。
第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量は、第一の核酸に含まれる遺伝子の発現量に対して40%以下であることが好ましく、30%以下であることがより好ましく、20%以下であることがさらに好ましい。また、第一の核酸が目的タンパク質をコードする遺伝子を含む場合には、第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量は、目的タンパク質をコードする遺伝子の発現量に対して40%以下であることが好ましく、30%以下であることがより好ましく、20%以下であることがさらに好ましい。また、第一の核酸が目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、第二の核酸が溶解酵素又は溶解酵素群をコードする遺伝子を含む場合には、溶解酵素又は溶解酵素群をコードする遺伝子の発現量が目的タンパク質をコードする遺伝子の発現量に対して20%以下であることが好ましい。上記の発現量とすることで、目的タンパク質を十分発現させた後に、第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量が、遺伝子の遺伝情報に基づいて合成されるタンパク質又は転写産物が機能するために十分な量となるからである。
[リボソーム結合部位(RBS)]
リボソーム結合部位(RBS)は、各遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置する、翻訳を開始するためにリボソームが結合するための配列である。このRBS配列を改変することにより、下流の遺伝子の発現を制御することができる。ターミネータからのリードスルーの頻度が所望の頻度よりも高い場合、このRBS配列を改変することにより、下流の遺伝子の発現を抑制することができる。
リボソーム結合部位(RBS)は、各遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置する、翻訳を開始するためにリボソームが結合するための配列である。このRBS配列を改変することにより、下流の遺伝子の発現を制御することができる。ターミネータからのリードスルーの頻度が所望の頻度よりも高い場合、このRBS配列を改変することにより、下流の遺伝子の発現を抑制することができる。
RBS配列の改変は、天然のRBS配列を塩基の欠失、挿入又は置換等により変異させることを意味する。リボソームは3〜9塩基長のプリン塩基(アデニン・グアニン)に富む領域に結合するため、これらの塩基の含有量を低減することにより発現頻度を抑制することができる。例えば、RBS配列の改変は、上記の3〜9塩基長のプリン塩基に富む領域において、アデニン及び/又はグアニンの数を、欠失又は置換等により減少させる変異とすることができる。置換させる塩基としては、アデニン又はグアニンをチミン又はシトシンを挙げることができる。即ち、上記の3〜9塩基長のプリン塩基に富む領域において、プリン塩基を、1〜7塩基チミン又はシトシンに置換する変異を挙げることができる。例えば、改変したRBS配列は、天然のRBS配列に対して、1〜10塩基の置換、欠失又は挿入を含んでよい。また、改変したRBS配列は、例えば、天然のRBS配列に対して、1〜9塩基、1〜8塩基、1〜7塩基、1〜6塩基、1〜5塩基、1〜4塩基、1〜3塩基又は1〜2塩基の置換を含んでよい。また、改変したRBS配列は、例えば、配列番号3に示すRBS1の配列における、5’末端から8番目のaをcに置換する変異、5’末端から7〜8番目のgaをtcに置換する変異、又は他の天然のRBS配列におけるこれらに対応する変異を含んでよい。他の天然のRBS配列における対応する変異については、例えば、配列アラインメント法等従来公知の方法を用いて他の天然のRBS配列におけるRBS1の上記変異を含む位置を特定し、同様の変異を含むように改変すればよい。
ターミネータ配列とRBS配列の間には、任意の配列を有するスペーサが存在してもよく、存在しなくてもよい。スペーサの長さは、転写制御機能を発揮できる限り特に限定されない。
[タンパク質の発現]
本発明の発現カセットは発現ベクターに挿入して、タンパク質の発現に用いる。
本発明の発現カセットは発現ベクターに挿入して、タンパク質の発現に用いる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主細胞のゲノムDNAへの組込みが可能なものであればいずれも用いることができる。発現ベクターの種類は、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、及び人工染色体ベクター等、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
宿主細胞として、原核生物の細胞、並びに酵母細胞、糸状真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、及び植物細胞等の真核生物の細胞のいずれも好適に用いることができる。
細菌等の原核生物の宿主細胞としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。原核生物の好ましい例としては、例えば、大腸菌、バチルス・ズブチリス、シュードモナス、コリネバクテリウム、及びラクトコッカス等を挙げることができる。宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)であることが好ましい。
エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ BL21(ノバジェン社)、エシェリヒア・コリ BL21(DE3)(ライフテクノロジーズ社)、エシェリヒア・コリ BLR(DE3)(メルクミリポア社)、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ GI698、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ K5(ATCC 23506)、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ MG1655(ATCC 47076)、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ Rosetta(DE3)(ノバジェン社)、エシェリヒア・コリ TB1、エシェリヒア・コリ Tuner(ノバジェン社)、エシェリヒア・コリ Tuner(DE3)(ノバジェン社)、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ W3110(ATCC 27325)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) XL1−Blue、エシェリヒア・コリ XL2−Blue等を挙げることができる。
上記宿主細胞への本発現カセットの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110 (1972)〕、プロトプラスト法(特開昭63−248394号公報)、又はGene,17,107(1982)やMolecular & General Genetics,168,111(1979)に記載の方法等を挙げることができる。
ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Takahashiらの方法(J.Bacteriol.,1983,156:1130−1134)や、Takagiらの方法(Agric.Biol.Chem.,1989,53:3099−3100)、又はOkamotoらの方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1997,61:202−203)により実施することができる。
本発現カセットを導入するベクター(以下、単に「ベクター」という。)としては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもベーリンガーマンハイム社より市販)、pKK233−2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX−1(Promega社製)、pQE−8(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58−110600号公報)、pKYP200〔Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)〕、pLSA1〔Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)〕、pBluescript II SK(−)(Stratagene社製)、pTrs30〔Escherichiacoli JM109/pTrS30(FERM BP−5407)より調製〕、pTrs32〔Escherichia coli JM109/pTrS32(FERM BP−5408)より調製〕、pGHA2〔Escherichia coli IGHA2(FERM B−400)より調製、特開昭60−221091号公報〕、pGKA2〔Escherichia coli IGKA2(FERM BP−6798)より調製、特開昭60−221091号公報〕、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J.Bacteriol.,172,2392(1990)〕、pGEX(Pharmacia社製)、pETシステム(Novagen社製)等を挙げることができる。
宿主細胞として大腸菌を用いる場合は、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold等を好適なベクターとして挙げることができる。
ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるpUB110、又はpHY500(特開平2−31682号公報)、pNY700(特開平4−278091号公報)、pHY4831(J.Bacteriol.,1987,1239−1245)、pNU200(鵜高重三、日本農芸化学会誌1987,61:669−676)、pNU100(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,30:75−80)、pNU211(J.Biochem.,1992,112:488−491)、pNU211R2L5(特開平7−170984号公報)、pNH301(Appl.Environ.Microbiol.,1992,58:525−531)、pNH326、pNH400(J.Bacteriol.,1995,177:745−749)、pHT210(特開平6−133782号公報)、pHT110R2L5(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1994,42:358−363)、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるpNCO2(特開2002−238569号公報)等を挙げることができる。
真核生物の宿主細胞としては、例えば、酵母及び糸状真菌(カビ等)を挙げることができる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、シワニオミセス(Schwanniomyces)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点(宿主細胞における増幅が必要である場合)及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のための誘導性プロモータ及びターミネータ、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。
発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列(ARS)を含むことが好ましい。これにより細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる(Myers、A.M.、et al.(1986)Gene 45:299−310)。
酵母を宿主細胞として用いる場合のベクターとしては、例えば、YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、YIp、pHS19、pHS15、pA0804、pHIL3Ol、pHIL−S1、pPIC9K、pPICZα、pGAPZα、pPICZ B等を挙げることができる。
酵母を宿主細胞とした場合のプロモータの具体例として、ガラクトース誘導性のgal 1プロモータ及びgal 10プロモータ;銅誘導性のCUP 1プロモータ;チアミン誘導性のnmt1プロモータ;並びにメタノール誘導性のAOX1プロモータ、AOX2プロモータ、DHASプロモータ、DASプロモータ、FDHプロモータ、FMDHプロモータ、MOXプロモータ、ZZA1、PEX5−、PEX8−及びPEX14−プロモータ等を挙げることができる。
酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法(Methods Enzymol.,194,182(1990))、スフェロプラスト法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984))、酢酸リチウム法(J.Bacteriol.,153,163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)記載の方法等を挙げることができる。
糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ウスチラーゴ(Ustilago)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ノイロスポラ(Neurospora)属、フザリウム(Fusarium)属、フミコーラ(Humicola)属、ペニシリウム(Penicillium)属、マイセリオフトラ(Myceliophtora)属、ボトリティス(Botryts)属、マグナポルサ(Magnaporthe)属、ムコア(Mucor)属、メタリチウム(Metarhizium)属、モナスカス(Monascus)属、リゾプス(Rhizopus)属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
糸状真菌を宿主細胞とした場合のプロモータの具体例として、サリチル酸誘導性PR1aプロモータ;シクロヘキシミド誘導性Placcプロモータ;及びキナ酸誘導性Pqa−2プロモータ等を挙げることができる。
糸状真菌への発現ベクターの導入は,従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Cohenらの方法(塩化カルシウム法)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972)]、プロトプラスト法[Mol.Gen.Genet.,168:111(1979)]、コンピテント法[J.Mol.Biol.,56:209(1971)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
本発明の発現カセットが導入された宿主細胞を、本明細書においては「組換え細胞」ともいう。本発明の発現カセットを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、発現カセットを導入した発現ベクターを宿主細胞に形質転換させる方法及び上記発現ベクター又は本発現カセットを宿主細胞のゲノムDNAに直接組み込む方法が挙げられる。発現カセットを導入した発現ベクターを宿主細胞に形質転換させる方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、プラスミドを用いて発現ベクターを宿主細胞に形質転換させることが挙げられる。上記方法により発現カセットを大腸菌に導入することで、組換え大腸菌を製造することができる。
上記発現ベクターあるいは発現カセットを宿主細胞のゲノムDNAへ組み込む方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、λファージの2重鎖切断修復における組換え機構を応用したλred法、Red/ET相同組換え法、pUT−mini Tn5を用いたトランスポゾン活性を利用した転移法が挙げられる。また、例えば、バイオメダル社の「トランスポゾンによる遺伝子導入キット:pUTmini−Tn5 Kit」等を用い、キットに記載の方法に準じて、発現カセットを宿主細胞のゲノムDNAに組み込むことができる。
[培養方法]
本発明に係る発現カセットの遺伝子にコードされたタンパク質は、当該発現カセットを導入した宿主細胞(組換え細胞)を培養培地中で培養し、発現させることにより得られる。本発明に係る組換え細胞を培養培地中で培養する方法は、組換え細胞の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。また、目的タンパク質を製造するための培養の場合は、目的タンパク質が発現し得る条件下で組換え細胞を培養すればよい。
本発明に係る発現カセットの遺伝子にコードされたタンパク質は、当該発現カセットを導入した宿主細胞(組換え細胞)を培養培地中で培養し、発現させることにより得られる。本発明に係る組換え細胞を培養培地中で培養する方法は、組換え細胞の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。また、目的タンパク質を製造するための培養の場合は、目的タンパク質が発現し得る条件下で組換え細胞を培養すればよい。
本実施形態に係る培養方法としては、回分培養、半回分培養(流加培養)、連続培養等を挙げることができる。
増殖のための培養を流加培養で行う場合、流加基質溶液は、例えば、培地成分の1以上の栄養素を含むものとすることができる。流加基質溶液のフィードは、当該技術分野で公知の方法に従って、連続方式、不連続方式等で行えばよい。フィード量について特に制限はなく、線形定係数方式、線形増加方式、段階的増加方式、指数関数的フィード方式等を組み合わせ、増殖した菌体量を指標としてフィードを行えばよい。菌体量は、例えば、乾燥菌体重量、湿菌体重量、コロニー形成単位等で確認することができる。フィードを行うことにより組換え細胞を高密度に培養することができる。
培養に用いられる培地の種類に関して特に制限はない。組換え細胞が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、組換え細胞の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、組換え細胞が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
培養温度は、例えば、15〜40℃である。発現カセットを形質転換した組換え大腸菌を用いる場合には、大腸菌の培養工程がpH調整工程を含むことが好ましい。培養中の培養液のpHは3.0〜9.0に保持することが好ましい。またpHの下限は6.0以上、好ましくは6.5以上、さらに好ましくは7.0以上、pHの上限は9.0以下、好ましくは8.5以下、さらに好ましくは8.0以下の一定範囲に調整することで組換え細胞の増殖を促進させ、目的タンパク質の生産性を向上させることができる。培養液のpHは、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて調整することができる。
[発現誘導]
本発現カセットの発現誘導は、プロモータによる転写(目的とするタンパク質をコードする核酸の転写)を活性化することにより行われる。プロモータの活性化は、プロモータの種類に応じて、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。発現カセットが大腸菌に導入される場合のプロモータの活性化は、例えば、薬剤による誘導、温度変化による誘導又は飢餓による誘導により行われてよい。
本発現カセットの発現誘導は、プロモータによる転写(目的とするタンパク質をコードする核酸の転写)を活性化することにより行われる。プロモータの活性化は、プロモータの種類に応じて、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。発現カセットが大腸菌に導入される場合のプロモータの活性化は、例えば、薬剤による誘導、温度変化による誘導又は飢餓による誘導により行われてよい。
誘導物質(発現誘導剤)の存在により活性化されるプロモータを使用した場合、当該誘導物質を培養液に添加することにより、本発現カセットの発現を誘導することができる。誘導物質は、IPTG、アラビノース、β−インドールアクリル酸、ラムノース及びキシロースからなる群から選択されてよく、発現カセットが大腸菌に導入される場合には、IPTGであることが好ましい。また例えば、T7プロモータ、tac及びtrcプロモータ、並びにlac及びlacUV5プロモータを用いた場合には、誘導物質はIPTGであることが好ましく、araBADプロモータを用いた場合には、誘導物質はアラビノースであることが好ましく、trpプロモータを用いた場合には、誘導物質はβ−インドールアクリル酸であることが好ましく、rhaBADプロモータを用いた場合には、誘導物質はラムノースであることが好ましく、xylFプロモータ及びxylAプロモータを用いた場合には、誘導物質はキシロースであることが好ましい。誘導物質は、1度に、又は複数回に分けて培養液に添加してもよく、また、連続フィードにより培養液に添加してもよい。流加基質溶液に誘導物質を含有させてフィードしてもよい。添加する誘導物質の量は、誘導物質及びプロモータの種類に応じて設定することができるが、例えば、組換え細胞の乾燥重量1g当たり0.1〜30μgの範囲とすることができ、好ましくは、0.5〜20μgの範囲である。
飢餓により活性化されるプロモータを使用した場合、特定の物質を含まない培地を用いるか、当該物質の濃度を低減させた培地を用いるか、当該物質が消費されることにより培地中の濃度を低減させることで、タンパク質の発現を誘導することができる。飢餓の対象となる物質としては、例えば、トリプトファン、リン酸及びグルコース等が挙げられる。例えば、trpプロモータを用いた場合には、トリプトファン飢餓とすることが好ましく、phoAプロモータを用いた場合には、リン酸飢餓とすることが好ましく、cstAプロモータ及びcstA−lacZプロモータと用いた場合には、グルコース飢餓とすることが好ましい。
温度の上昇又は低下により活性化されるプロモータを使用した場合、培養液の温度を上昇又は低下させることにより、タンパク質の発現を誘導することができる。例えば、温度上昇により活性化されるλファージのPRプロモータ又はPLプロモータを使用した場合、増殖時の培養液の温度を20〜37℃の範囲とすることで増殖時の組換えタンパク質の発現は抑えられ、次いで培養液の温度を38〜44℃に上昇させることにより、タンパク質の発現を誘導させることができる。このときに熱ショックタンパク質による影響を緩和させるために、特開平6−292563号公報に記載のように増殖時の培養液のpHを6.5〜7.5とし、タンパク質の発現誘導を開始する時点で培養液のpHを4.5〜6.5と変動させることにより、より安定した発現誘導を行うことができる。
組換え細胞の増殖を行う段階から、本発現カセットの発現を誘導する段階へ移行する時期には、特に制限はなく、培養システムの構成、生産プロセスの設計に応じて適宜設定することができる。目的タンパク質の生産を効率よく行う観点からは、組換え細胞の増殖が対数増殖期の中期〜後期に達した時に、本発現カセットの発現の誘導を開始するのが好ましい。
組換え細胞の増殖は、遅延期又は誘導期(培養初期の細胞数の増加が遅い時期)から始まり、対数増殖期(単位時間ごとに細胞数が2倍と対数的に増加する時期)を経て、定常期(細胞の正味の数に変動の見られない時期)に至る。対数増殖期の中期とは、遅延期における細胞数と定常期における細胞数の中間程度の細胞数になる時期をいい、対数増殖期の後期とは、中期から定常期までの時期をいう。本発現カセットの発現の誘導を開始する時期の具体例として、例えば、定常期におけるOD600の値が約150になる組換え細胞の場合、OD600の値が30〜110に達した時期であるのが好ましく、40〜90に達した時期であるのがより好ましく、50〜80に達した時期であるのが更に好ましい。
本発現カセットの発現を誘導する時間は、使用する宿主、タンパク質の種類に応じて、設定した生産量に達するまで行えばよい。培養液の温度等の培養条件により生産速度は変化するため、タンパク質の発現を誘導する時間を一義的に決める必要はない。次工程のタンパク質の分離及び精製の進行に合わせて組換えタンパク質の発現を誘導する時間を設定してもよい。また、並行して行っている組換え細胞の増殖、及び当該増殖した組換え細胞の移送に影響がないように本発現カセットの発現を誘導する時間を設定することが、工業的生産においては好ましい。
本発現カセットの発現誘導を行った培養液より、目的タンパク質は後述の方法により分離、精製することができる。必要であれば、本発現カセットで発現された他のタンパク質も同様に分離、精製することができる。
[目的タンパク質の単離及び精製]
目的タンパク質の単離及び精製は、通常用いられている方法で行うことができる。例えば、目的タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、例えば、以下の方法により行うことができる。目的タンパク質を発現するための培養終了後、組換え細胞を遠心分離により回収し、組換え細胞を破壊することで、無細胞抽出液を得る。組換え細胞の破壊は、例えば、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により組換え細胞を破砕すること、酵素等の薬剤添加による組換え細胞の処理、並びに有機溶媒等の添加による組換え細胞の処理等により行うことができる。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化成社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、目的タンパク質を単離及び精製することができる。
目的タンパク質の単離及び精製は、通常用いられている方法で行うことができる。例えば、目的タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、例えば、以下の方法により行うことができる。目的タンパク質を発現するための培養終了後、組換え細胞を遠心分離により回収し、組換え細胞を破壊することで、無細胞抽出液を得る。組換え細胞の破壊は、例えば、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により組換え細胞を破砕すること、酵素等の薬剤添加による組換え細胞の処理、並びに有機溶媒等の添加による組換え細胞の処理等により行うことができる。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化成社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、目的タンパク質を単離及び精製することができる。
また、目的タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に組換え細胞を回収後、破壊し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として目的タンパク質の不溶体を回収する。回収した目的とするタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により目的タンパク質の精製標品を得ることができる。
目的タンパク質が組換え細胞の溶解により細胞外に存在する場合には、培養上清から目的タンパク質を回収することができる。すなわち、培養液を遠心分離等の手法により処理することにより、培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、目的タンパク質を単離及び精製することができる。
目的タンパク質が細胞外に分泌された場合にも、培養上清から目的とするタンパク質を回収することができる。すなわち、培養液を遠心分離等の手法により処理することにより、培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、目的タンパク質を単離及び精製することができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例1]
(1)目的タンパク質をコードする遺伝子及び発現量を抑制させるタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸の合成、並びに発現ベクターの構築
目的タンパク質として、ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のフィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号4(PRT799)に示されるアミノ酸配列を有するスパイダーシルクタンパク質(SSP)を設計した。
(1)目的タンパク質をコードする遺伝子及び発現量を抑制させるタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸の合成、並びに発現ベクターの構築
目的タンパク質として、ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のフィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号4(PRT799)に示されるアミノ酸配列を有するスパイダーシルクタンパク質(SSP)を設計した。
設計した配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸をそれぞれ合成した。当該核酸には、5’末端にNdeIサイト、終止コドン下流にEcoRIサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター(pUC118)にクローニングした。当該核酸をNdeI及びEcoRIで制限酵素処理して切り出した後、プラスミドベクターである、タンパク質発現ベクターpET−22b(+)(GSL Biotech LLC)のT7プロモータ誘導型の発現ベクターVEC214−GEN923を得た。以後、発現ベクターVEC214−GEN923のプロモータ、スパイダーシルク及びターミネータを含む領域を「pro−SSP−terカセット」(カセット0)と称する。
発現量を抑制させるタンパク質として、宿主大腸菌を溶菌する活性を有するタンパク質及びDNAの分解酵素、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)について検討した。
宿主大腸菌を溶菌する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として、溶菌酵素群である、Enterobacteria phage lambdaのholinをコードする遺伝子S(NCBIのGenBankのGeneID:5740919、配列番号5)、endolysinをコードする遺伝子R(NCBIのGenBankのGeneID:2703480。配列番号6)、cell lysis proteinをコードする遺伝子Rz(NCBIのGenBankのGeneID:2703481、配列番号7)からなるλSRRz(配列番号8)を用いた。λSRRzの塩基配列の上流に、RBS領域を含む配列番号1の塩基配列を有するDNA(RBS1)を合成した。RBS領域を、配列番号9(RBS2)、配列番号10(RBS3)、配列番号11(RBS4)、配列番号12(RBS5)に示す塩基配列に改変したものも合成した。RBS2はRBS1の5’末端から8番目のaをcに置換した配列であり、RBS3はRBS1の5’末端から7〜8番目のgaをtcに置換した配列であり、RBS4はRBS1の5’末端から4〜8番目のaaggaをctttcに置換した配列であり、RBS5はRBS1の5’末端から1〜8番目のaagaaggaをtgcgtttcに置換した配列である。
当該RBS1、2、3、4または5領域を上流に含むλSRRzを上記同様にpUC118にそれぞれクローニングした。RBS1、2、3、4または5領域を上流に含むλSRRzを、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa Bio社製)を使用し、PCRで増幅した。RBS1領域(AAGAAGGAt)を含むλSRRzの増幅には、プライマーとして配列番号13および配列番号14のオリゴヌクレオチドを用いた。
増幅したDNA断片をDpnI処理し、発現ベクターVEC214−GEN923のpro−SSP−terカセットの直下に、In−Fusion(商標) HD Cloning Kit(TaKaRa Bio社製)を用い、添付のマニュアルに従って挿入した。
上記挿入された「pro−SSP−terカセット」を含む領域を、以後、それぞれ「pro−SSP−ter−RBS1−λSRRzカセット」(カセット1)、「pro−SSP−ter−RBS2−λSRRzカセット」(カセット2)、「pro−SSP−ter−RBS3−λSRRzカセット」(カセット3)、「pro−SSP−ter−RBS4−λSRRzカセット」(カセット4)、「pro−SSP−ter−RBS5−λSRRzカセット」(カセット5)と称する。
発現量を制御したいタンパク質、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)としてはウシ膵臓由来のエンドヌクレアーゼIを用いた。GenBank:M60606のアミノ酸配列に由来するエンドヌクレアーゼIをコードする、配列番号15に記載のDNase Iを合成した。当該DNase I遺伝子を上記と同様の方法で、λSRRz直下に挿入し、pro−SSP−ter−RBS1−λSRRz−DNaseカセット(カセット1D)、及びpro−SSP−ter−RBS2−λSRRz−DNase(カセット2D)がそれぞれVEC214−GEN923に挿入された発現ベクターを作製した。
(2)タンパク質発現株の作製
上記(1)で作製したそれぞれの発現ベクターで、大腸菌BLR(DE3)を形質転換し、形質転換株(以下、「プラスミド形質転換株」ともいう)を取得した。
上記(1)で作製したそれぞれの発現ベクターで、大腸菌BLR(DE3)を形質転換し、形質転換株(以下、「プラスミド形質転換株」ともいう)を取得した。
また、バイオメダル社のpUTmini−Tn5 Kitを用いて、Kitに付属のマニュアルに準じて、上記で作製した各カセットをpUTmini−Tn5に導入し、大腸菌のゲノムDNAに組み入れ、形質転換株(以下、「ゲノムDNA組込み型発現株」ともいう)を取得した。具体的には以下のようにゲノムDNA組込み型発現株を取得した。上記で作製した各カセット領域をpUTmini−Tn5 KmのNotIサイトに挿入したプラスミドを作製した。次に、当該プラスミドでS17−1 λpirを形質転換させた株と、大腸菌BLR(DE3)を1:1で混合し、LB及びKm含有プレート培地で培養した。Km耐性及びAp感受性を示した株から、ゲノムDNAに各カセットをNotI処理した、pro−SSP−ter−RBS(1、2、3、4又は5)−λSRRz−DNaseを含む断片が組み込まれたゲノムDNA組込み型発現株を取得した。
(3)タンパク質の発現
L字管での培養によるタンパク質発現の評価を行なった。LB培地を用い、37℃で振盪培養を行ない、OD600=0.6〜0.8になった時点でIPTGを添加し、発現誘導を行った。
L字管での培養によるタンパク質発現の評価を行なった。LB培地を用い、37℃で振盪培養を行ない、OD600=0.6〜0.8になった時点でIPTGを添加し、発現誘導を行った。
誘導前の増殖速度、誘導後のOD600における培養液の濁度を測定することで溶菌強度を評価した。スパイダーシルクタンパク質SSPの発現状況はビシンコニン酸タンパク質定量法(BCA法)で確認した。即ち、培養菌体の抽出液に対してDMSOを添加した後、1500rpmで攪拌しながら、85℃で30分間反応させることで各SSPを溶解させた。溶解後、適宜希釈し、BCA Reagent Aを必要量混合し、エッペンチューブに分取した。分取したエッペンチューブにBCA Reagent Bを添加し、37℃で30分間静置して反応させた。反応終了後、各サンプルの吸光強度の測定を行うことによりSSPの発現量を確認した。結果を表1に示す。SSP発現はカセットNo.0の発現量を++として+及び++の2段階で評価し、溶菌強度は溶菌が観察されないカセットNo.0を−として−〜+++の4段階で評価した。
表1より、ターミネータを介してもターミネータ下流の遺伝子は発現することが確認できた。ターミネータ下流の遺伝子のいずれの遺伝子の発現量も、SSP遺伝子の発現量より低いことを、培養の途中では溶菌が起こらないことにより確認した。ターミネータ下流の遺伝子の発現量が高い(溶菌効果が優れている)場合には、目的タンパク質であるSSPの発現量が減少する傾向があることが確認された。しかしながら、リボソーム結合領域を改変することにより、ターミネータ下流の遺伝子の発現量を制御することができ、それによりSSPの発現量を向上させることが可能であることも確認できた(表1)。
[実施例2]
L字管培養で有効性が認められたため、以下の方法で、回分培養(1L Jar培養)での評価を行った。2mLのLB培地に実施例1で作製した菌株を植菌し、15時間培養した。当該培養液を、100mLのシード培養用培地(表2)にOD600が0.05となるように添加した。
L字管培養で有効性が認められたため、以下の方法で、回分培養(1L Jar培養)での評価を行った。2mLのLB培地に実施例1で作製した菌株を植菌し、15時間培養した。当該培養液を、100mLのシード培養用培地(表2)にOD600が0.05となるように添加した。
当該シード培養液を500mlの生産培地(表3)にOD600が0.05となるように添加し、ジャーファーメンターで、温度36±0.5℃、pH6.3〜6.1の条件で培養した。
培養液中の溶存酸素濃度が、溶存酸素飽和濃度の30〜40%に維持されるように、通気攪拌した。これらの制御には、マスフローコントローラー(MPC0005BBRN0100D0、アズビル株式会社製)を用いた。
培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液(グルコース445g/1L、Yeast Extract 9g/L)を1mL/分の速度で添加した。濁度(OD600)が60以上であることを確認し、1Mのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養液に対して終濃度0.1mMになるよう添加し、タンパク質の発現誘導を行った。
培養終了のタイミングは誘導後20時間(T20)とした。菌体中のタンパク質の定量評価はBCA法により比較した。同時に培養液中の菌体重量(乾燥菌体重量(g))及び菌数を測定し、一菌体あたりの収率を算出した。
IPTG添加後、各時間経過した時点で、培養液をサンプリングし、菌体を回収した。IPTG添加前とIPTG添加後の培養液から調製した菌体を用いてSDS−PAGEを行い、IPTG添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的タンパク質の発現を確認した。
カセット0、1、2、1D及び2DそれぞれのゲノムDNA組込み型発現株を用いた、タンパク質発現の経時変化を図1に、OD600における培養液の濁度を経時変化を図2に示す。表4における各カセットの値は、誘導後20時間(T20)のカセット0を基準とした相対値である。
カセット1ゲノムDNA組込み型発現株、カセット1DゲノムDNA組込み型発現株では、溶菌酵素群遺伝子を導入していない株と比較してSSPの発現量が低下した(図1)。これは、カセット1ゲノムDNA組込み型発現株、1DゲノムDNA組込み型発現株においては、溶菌酵素群遺伝子が早期から強く発現し、宿主が溶菌し始めたため(図2)と考えられる。リボソーム結合部位を改変したカセット2ゲノムDNA組込み型発現株では溶菌酵素群遺伝子を導入していない株とほぼ同等のSSPの発現が認められ(図1)、かつ、培養後半から濁度の減少が確認され(図2)、適切な時期に宿主を溶菌させることができたことが確認された。
リボソーム結合部位を更に改変したカセット3、カセット4及びカセット5それぞれのプラスミド形質転換株を用いた結果を図3及び4に示す。表5における各カセットの値は、誘導後20時間(T20)のカセット0を基準とした相対値である。
溶菌酵素群遺伝子を導入した株のいずれも、導入していない株と同程度のSSPの発現が認められ(図3)、かつ、培養後半から濁度の減少が確認され(図4)、溶菌酵素が適切な時期に宿主を溶菌させることができたことが確認された。
宿主細胞を用いたタンパク質の製造においては、目的タンパク質を回収するために、組換え宿主細胞を破砕等により処理する必要があるが、上記のように溶菌酵素を適切な時期に作用させることができれば、そのような処理の軽減が可能である。
また、破砕した菌体からはDNA等の核酸が溶出し、処理液の粘性を高めるため、以後の工程で邪魔になるが、DNaseを発現させることにより、これを防ぐこともできる。
比較として、製造を目的とするタンパク質を発現させた後に、別のプロモータから、溶菌酵素等の、別のタンパク質の誘導発現を試みたが、上記のように適切に宿主を溶菌させることはできなかった。
Claims (18)
- センス鎖の5´から3´の方向に、プロモータ、並びに該プロモータに操作可能に連結した第一の核酸、ターミネータ及び第二の核酸を順に含む発現カセットであって、
第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ少なくとも1つの遺伝子を含む、
発現カセット。 - ターミネータの下流かつ第二の核酸の上流に改変されたリボソーム結合部位(RBS)が存在する、請求項1に記載の発現カセット。
- 前記第一の核酸が、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項1または2に記載の発現カセット。
- 前記目的タンパク質が構造タンパク質である、請求項3に記載の発現カセット。
- 前記構造タンパク質が、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群より選ばれるタンパク質又はこれら由来のタンパク質である、請求項4に記載の発現カセット。
- 前記第二の核酸が、宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及び/又はデオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の発現カセット。
- 前記宿主細胞を溶解する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、リゾチーム遺伝子、VanX遺伝子、S遺伝子、R遺伝子及びRz遺伝子からなる群より選ばれる、請求項6に記載の発現カセット。
- 前記第二の核酸が、S遺伝子、R遺伝子及びRz遺伝子を含む、請求項6に記載の発現カセット。
- 前記デオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子がDNaseIをコードする遺伝子である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の発現カセット。
- 前記プロモータがT7プロモータである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の発現カセット。
- 前記ターミネータがT7ターミネータである、請求項1〜10に記載のいずれか一項に記載の発現カセット。
- 前記第二の核酸に含まれる遺伝子の発現量が、前記第一の核酸に含まれる遺伝子の発現量の20%以下である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の発現カセット。
- 請求項3〜12のいずれか一項に記載の発現カセットが導入された組換え細胞。
- プラスミドを用いて前記発現カセットを宿主細胞に導入することを含む、請求項13に記載の組換え細胞の製造方法。
- 発現カセットが、宿主細胞のゲノムDNAに導入されている、請求項13に記載の組換え細胞の製造方法。
- 目的タンパク質が発現し得る条件下で、請求項13に記載の組換え細胞を培養する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
- 薬剤による誘導、温度変化による誘導、又は飢餓による誘導によりプロモータを活性化することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記薬剤による誘導がIPTGによる誘導である、請求項17に記載の方法。
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2018
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