JP6788255B2 - 新規ベクター及びこれを用いた可溶化タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
大腸菌のL11遺伝子は、染色体上に1つしか存在せず、mRNAへの転写量は、L11遺伝子の上流に位置するプロモーター領域によって制御されていることが知られている。本実施例においては、L11の発現を任意に制御する必要があるため、アラビノースによる発現制御可能な、araBADプロモーターを持つ、pBAD-24を用いて、アラビノースによってL11の細胞内補填を行うベクター(pBAD24-Ec_L11)を作製した。pBR322/His-Ec_L11の6xHis(Hisタグ)から、L11遺伝子を含むDNA領域をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅し、制限酵素EcoRIとHindIIIを用いてpBAD24を処理し、In Fusionクローニングを行った。図2にpBAD24/Ec_L11作製の模式図を示す。
5’-CAGGAGGAATTCACCATGCATCATCATCATCATCATA-3’
5’-CAAAACAGCCAAGGCTTTTAGTCCTCCACTACCAGG-3’
大腸菌野生株(W3110株)のゲノムDNAからpBR322ベクターに6xHis(Hisタグ)がN末端に付加された状態でpBR322ベクターにクローニングしたpBR322/His-Ec_L11をテンプレートにして、以下に示す反応溶液にて、PCR反応を行った。
In Fusion反応を行うために、Ec_L11遺伝子DNA断片に対し、エンハンサー処理を行った。以下に示す反応溶液を調製し、37℃で20分インキュベートを行った後、80℃で15分インキュベートを行った。
5’- CGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGC -3’
5’-CAAAACAGCCAAGGCTTTTAGTCCTCCACTACCAGG-3’
本実施例においては、L11の発現誘導物質にアラビノースを採用したため、ターゲットタンパク質の発現誘導には、これとは異なる誘導物質を用いる必要がある。本実施例では、IPTGによる発現制御が可能な、Tacプロモーターを持つ、pGEX-6P-1ベクターを用いて、目的となるタンパク質とL11との2つの発現制御が可能な二制御系ベクター(pTAK)を構築した。
5’- CCATGACCCAGTCACATTGTCTGATTCGTTACCAATT -3’
5’- GAAAAGTGCCACCTGAAAAGGCCATCCGTCAGGAT -3’
作製したpBAD24/EC_L11をテンプレートにして、PCRを以下の反応溶液を用いて行った。
pGEX-6P-1ベクターに対してBsaAIによる制限酵素消化を行った後にAatIIによる制限酵素消化を行った。以下に示す反応溶液を調製し、37℃にて1時間反応を行った。
制限酵素消化を行ったpGEX-6P-1ベクターに、araC-Ec_L11遺伝子DNA断片を導入するためIn Fusion反応を行った。以下に示す反応溶液を調製し、50℃で15分インキュベートを行った。
5’- CGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCG -3’
5’- GGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACAT -3’
本実施例においては、ターゲットタンパク質として、ホタルのルシフェラーゼ(Luc)を採用した。具体的には、pSP-luc+NFベクターのLuc遺伝子を含むDNA領域を、PCR増幅し、制限酵素XhoIと、SmaIを用いて、pTAKを処理後、In Fusionクローニングを行った。図4に、pTAK/Lucベクター作製の模式図を示す。
5’- ATCCCCGGAATTCCCCATGGTCACCGACGCCAA -3’
5’- GATGCGGCCGCTCGATTACACGGCGATCTTTCCG -3’
Luc遺伝子DNA領域のPCRを以下に示す反応溶液にて行った。
pTAKベクターに対してXhoIによる制限酵素消化を行った後にSmaIによる制限酵素消化を行った。以下に示す反応溶液を調製し、37℃にて3時間反応を行った。
制限酵素消化を行ったpTAKベクターに、Luc遺伝子DNA 断片を導入するためIn Fusion反応を行った。以下に示す反応溶液を調製し、50℃で15分間反応を行った後、氷上静置した。
作製したpBAD24/Ec_L11、pTAK、pTAK/Lucベクターを用いて、ΔL11株を形質転換し、抗生物質アンピシリンとアラビノースを含むLB寒天培地(LB-Ap-Ara寒天培地)で培養することで、本実施例に係る形質転換体(ΔL11-pBAD24/Ec_L11、ΔL11-pTAK、ΔL11-pTAK/Lucを作製した。なお、アラビノース非存在条件でも、形質転換体は得られたが、存在条件下よりも取得に長時間を必要とした。
形質転換体であるΔL11-pBAD24/Ec_L11の生育に及ぼすアラビノースの影響を解析するため、アラビノース存在、非存在条件にて静置培養を行った。ΔL11-pBAD24/Ec_L11をLB-Ap-Ara選択液体培地にてOD600nmが0.4まで37℃にて震盪培養し、その培養液をLB-Ap(左)、LB-Ap-Ara(右)選択寒天培地に画線して、37℃にて64時間静置培養を行った。培養結果の写真を図5Aに示す。
形質転換体であるΔL11-pTAKの生育に及ぼすアラビノースの影響を解析するため、アラビノース存在、非存在条件にて静置培養を行った。ΔL11-pTAKをLB-Ap-Ara選択液体培地にてOD600nmが0.4まで37℃にて震盪培養し、その培養液をLB-Ap(左)、LB-Ap-Ara(右)選択寒天培地に画線して、37℃にて64時間静置培養を行った。培養結果の写真を図6Aに示す。
pTAKベクターには、Tacプロモーター制御下にGlutathione S-transferase(GST)遺伝子が存在しており(図3右)、IPTGによるGSTの発現誘導が可能である。一般的に、IPTGによる発現誘導は、大腸菌の対数増殖期(OD600nmが0.2から1.0)で行われるため、この培養期間内における、ΔL11-pTAKの細胞内におけるL11のアラビノースの有無による発現制御について解析した。ΔL11-pTAKをLB-Ap-Ara(0%、0.4%)選択液体培地にて、37℃条件下で震盪培養し、OD600nmを継時的に測定しつつ、各地点の培養液を回収した。結果を図7A上部に示す。また、OD600nmが0.04相当分の各サンプルを用いてHis-Probeによるウエスタンブロットを行うことでL11の存在状態を解析した。結果を図7A下部に示す。
ΔL11-pTAK、およびpTAKベクターを用いて形質転換した大腸菌野生株(WT-pTAK)の細胞内にて発現させたGSTの存在状態を解析した。ΔL11-pTAK、WT-pTAKをLB-Ap液体選択培地にてOD600nmが0.5になるまで37℃条件下で振盪培養を行い、終濃度が1 mMとなるようにIPTGを添加して、3時間後に培養液を回収した。その後、凍結融解、さらに、終濃度が4 μg/mlとなるようにリゾチームを加え、再度凍結融解し、一部をTotal(T)画分として回収し、Supernatat(S)画分とPrecipitate(P)画分に分離した。OD600nmが0.03相当分の各サンプルを用いてSDS-PAGEを行い、クマシー染色を行った。結果を図8A上部に示す。また、検出されたGSTのバンド強度を、ソフトウェアImageJにて数値化してグラフ化した。結果を図8A下部に示す。
Claims (2)
- GST発現遺伝子とその下流のMCS領域にターゲットタンパク質発現遺伝子が組み込まれた系の上流にtacプロモーターを有したターゲットタンパク質遺伝子の発現誘導システムを有し、さらに、L11発現遺伝子とその上流にaraBADプロモーターが組み込まれたL11遺伝子の発現誘導システムが非MCS領域に導入されたベクターにより、形質転換がなされたL11欠損大腸菌を用いたタンパク質の製造方法であって、
0.3%以上の濃度のアラビノース(arabinose)を含む液体培地中で前記L11欠損大腸菌の生育を高速化させるプロセスと、
0.1%以下の濃度のアラビノースを含む液体培地中で前記L11欠損大腸菌の生育を低速化させるプロセスと、
さらにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)存在下でターゲットタンパク質の発現誘導を実行させるプロセスと、を含むことを特徴とするタンパク質の製造方法。 - 請求項1に記載のタンパク質の製造方法に用いるL11欠損大腸菌を形質転換するベクターであって、配列表の配列番号1に示される塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示される塩基配列を有するベクター。
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