WO2020067551A1 - 組換え細胞、組換え細胞の破砕方法及び目的タンパク質の製造方法 - Google Patents

組換え細胞、組換え細胞の破砕方法及び目的タンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2020067551A1
WO2020067551A1 PCT/JP2019/038432 JP2019038432W WO2020067551A1 WO 2020067551 A1 WO2020067551 A1 WO 2020067551A1 JP 2019038432 W JP2019038432 W JP 2019038432W WO 2020067551 A1 WO2020067551 A1 WO 2020067551A1
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WO
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polypeptide
nucleic acid
promoter
recombinant cell
cell
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PCT/JP2019/038432
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English (en)
French (fr)
Inventor
憲治 中東
英詞 森
史門 後藤
秀喜 中山
俵太 姫野
Original Assignee
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant cell, a method for disrupting a recombinant cell, and a method for producing a target protein.
  • a liquid obtained by crushing the recombinant cells often has a high viscosity due to nucleic acids contained therein. If the cell lysate has a high viscosity, the recovery rate of the target protein decreases, or the purification of the target protein becomes difficult. The effect of such an increase in the viscosity of the cell lysate becomes more pronounced as the scale is increased.
  • the inclusion body which is one method for purifying the target protein overexpressed in E. coli, is not easily affected by the external environment such as protease and temperature, and can be purified by a simple and efficient mechanical method.
  • the inclusion body when it is regenerated, it may be decomposed into protease attached to the inclusion body. Removal of the attached protease requires degradation of the nucleic acid in the cell lysate.
  • Patent Document 1 As a method for decomposing the nucleic acid in the cell lysate, a mechanical treatment (ultrasonic crushing treatment or French press treatment) or a combination of a chemical treatment using a surfactant and a nuclease treatment has been reported. (Patent Document 1), there is a problem that a large amount of expensive enzyme is required.
  • a recombinant cell can express a polypeptide having nucleolytic ability by itself.
  • the present invention relates to a recombinant cell expressing a polypeptide having nucleic acid resolution, including a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence, a method for disrupting the recombinant cell, and a method for decomposing a target protein using the recombinant cell. It is intended to provide a manufacturing method.
  • the present invention relates to, for example, the following inventions.
  • a recombinant cell expressing a polypeptide having nucleic acid resolution A recombinant cell, wherein the polypeptide having the nucleic acid resolution includes a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence.
  • An expression cassette for expressing the polypeptide having the nucleic acid resolution is introduced, or a promoter sequence is introduced upstream of a polynucleotide encoding the polypeptide having the nucleic acid resolution present in the genome of the host cell.
  • a step of disrupting the recombinant cells by applying a physical or chemical external stimulus to the recombinant cells expressing the polypeptide having nucleic acid resolution includes a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence, A method for disrupting recombinant cells.
  • the method according to [6] wherein the recombinant cells further express a polypeptide having a bacteriolytic activity, and the disruption of the recombinant cells is self-disruption by lysis.
  • the method according to [6] or [7], wherein the polypeptide having nucleic acid resolution is a deoxyribonuclease.
  • polypeptide having bacteriolytic activity is a polypeptide having peptidoglycan decomposability.
  • the polypeptide having the nucleic acid resolution includes a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence, A method for producing a target protein.
  • the method according to [10] wherein the polypeptide having nucleic acid resolution is a deoxyribonuclease.
  • the polypeptide having the bacteriolytic activity is a polypeptide having peptidoglycan decomposability.
  • the recombinant cell since the recombinant cell itself expresses a polypeptide having nucleic acid resolution, it is not necessary to add a nuclease or the like.
  • the polypeptide having nucleic acid resolution includes a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence, so that the nuclease can be expressed not in the cytoplasm but in the periplasm or the inner membrane. Become. This makes it possible to suppress the growth inhibition of the recombinant cells due to the polypeptide having nucleic acid resolution.
  • the nuclease when the recombinant cells are crushed, the nuclease degrades the chromosomal DNA, whereby the viscosity of the cell lysate can be reduced.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a nuclease-expressing vector used in Example 1.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the mRFP1 expression vector used in Example 1. It is an electrophoresis photograph which shows the effect of the nuclease in lysis.
  • the first to fourth lanes from the left indicate samples of CZ1 @ BL21 @ pSAompA2nucS (NucS), and the lanes 5 to 8 from the left indicate samples of CZ1 @ BL21 @ pSAompA1mRFP1 (control).
  • 0, 5, 10, and 20 (minutes) indicate incubation times after adding chloroform, respectively.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a nuclease-expressing vector used in Example 1.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the mRFP1 expression vector used in Example 1. It is an electrophoresis photograph which shows the effect of the nuclease in lysis.
  • the first to fourth lanes from the left indicate samples of C
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the peptidoglycan degrading enzyme expression vector (sequence 1) used in Example 2 and a state of insertion into a chromosome. Each numerical value indicates a position in Sequence 1, and each arrow indicates the direction of gene transcription. It is a graph which shows productivity (%) at 0 hour after induction and 24 hours after induction of the G11 strain when the production amount (g / L) of control SSP at 24 hours after induction is 100%. It is a graph which shows the ratio of DCW after each process when DCW of the cell solution after culture completion (24 hours after induction) is 100%. It is a graph which shows the result of having measured the particle diameter after each process. The horizontal axis indicates the particle diameter, and the vertical axis indicates the ratio of a certain particle diameter group to the total particle volume.
  • the recombinant cell expresses a polypeptide having nucleic acid resolution.
  • the polypeptide having nucleic acid resolution includes a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence.
  • the recombinant cell according to the present embodiment expresses a polypeptide having nucleic acid resolution.
  • a recombinant cell is a cell that has been engineered to express a polypeptide having nucleic acid resolution.
  • the recombinant cells according to the present embodiment can be obtained, for example, by introducing an expression cassette for expressing a polypeptide having nucleic acid resolution.
  • the expression cassette include an expression cassette having a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having nucleic acid resolution and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence.
  • Some host cells have (but do not express) a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having nucleic acid resolution, including a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence.
  • the polypeptide originally contained in the host cell is hereinafter also referred to as a polypeptide having “endogenous” nucleic acid resolution. Therefore, the recombinant cell according to the present embodiment can also be obtained, for example, by introducing a promoter sequence upstream of a polynucleotide encoding a polypeptide having an (endogenous) nucleic acid resolution present in the genome of a host cell. it can.
  • a polypeptide having an ability to degrade nucleic acid containing an endogenous transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence can be expressed on the periplasm or inner membrane.
  • Examples of a method of introducing an expression cassette into a host cell include a method of transforming an expression vector into which the expression cassette has been introduced into a host cell, and a method of directly incorporating the above expression vector or the present expression cassette into genomic DNA of the host cell.
  • the expression cassette for the target protein, the expression cassette for the polypeptide having bacteriolytic activity, and the expression cassette for the nuclease described below are incorporated into the genomic DNA of the host cell.
  • a known method can be used to transform the expression vector into which the expression cassette has been introduced into a host cell.
  • the expression vector can be transformed into a host cell using a plasmid.
  • a recombinant Escherichia coli can be produced by introducing an expression cassette into Escherichia coli by the above method.
  • an expression cassette can be incorporated into the genomic DNA of a host cell using a transposon gene transfer kit: pUTmini-Tn5 @ Kit from Biomedal, according to the method described in the kit.
  • a method for introducing a promoter sequence upstream of a polynucleotide encoding a polypeptide having an (endogenous) nucleic acid resolution existing in the genome of a host cell a known method can be used.
  • the ⁇ red method and the Red / ET homologous recombination method utilizing the recombination mechanism in phage double-strand break repair, and the promoter to be introduced include any promoter capable of expressing the above-mentioned endogenous polypeptide. Any promoter, including those described herein, can be used, but constitutive promoters are preferred because they can be easily combined with any expression system.
  • the host cell any of prokaryotic cells such as bacteria and eukaryotic cells such as yeast cells, filamentous fungal cells, insect cells, animal cells, and plant cells can be used.
  • the recombinant cell further expresses a polypeptide having a bacteriolytic activity
  • the host cell is preferably a prokaryotic cell such as a bacterium from the viewpoint of exhibiting the effect of the bacteriolytic activity.
  • prokaryotic host cells such as bacteria include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium and Pseudomonas. .
  • Preferred examples of prokaryotes include, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas, Corynebacterium, and Lactococcus.
  • the host cell is Escherichia coli.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli BL21 (Novagen), Escherichia coli BL21 (DE3) (Life Technologies), Escherichia coli BLR (DE3) (Merck Millipore), Escherichia coli DH1, and Escherichia.
  • Escherichia coli BL21 Novagen
  • Escherichia coli BL21 (Novagen)
  • Escherichia coli BL21 DE3 (Life Technologies)
  • Escherichia coli BLR DE3 (Merck Millipore)
  • Escherichia coli DH1 Escherichia coli DH1
  • Escherichia E. coli GI698, Escherichia coli HB101, Escherichia coli JM109, Escherichia coli K5 (ATCC 23506), Escherichia coli KY3276, Escherichia coli MC
  • the host cell is Escherichia coli.
  • any method for introducing the present expression cassette into the above host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. ⁇ Natl. ⁇ Acad. ⁇ Sci. USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (JP-A-63-248394), or the method described in Gene, 17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • a method using calcium ions [Proc. ⁇ Natl. ⁇ Acad. ⁇ Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • the protoplast method JP-A-63-248394
  • Transformation of microorganisms belonging to the genus Brevibacillus is carried out, for example, by the method of Takahashi et al. (J. Bacteriol., 1983, 156: 1130-1134) or the method of Takagi et al. (Agric. Biol. Chem., 1989, 53: 3099). -3100) or the method of Okamoto et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, 61: 202-203).
  • vector into which the present expression cassette is introduced
  • vector can be appropriately selected depending on the type of host, such as a plasmid vector, a virus vector, a cosmid vector, a fosmid vector, and an artificial chromosome vector.
  • examples of the vector include pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all commercially available from Boehringer Mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 ( QIAGEN), pKYP10 (JP-A-58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem.
  • PGHA2 prepared from Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400), JP-A-60-221091]
  • pGKA2 prepared from Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798), JP-A-60-221091] Gazette
  • pTerm2 US Pat. No. 4,686,191, US Pat. No. 4,939,094, US Pat. No. 51607) No. 5
  • pSupex pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol. 172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen) and the like.
  • pUC18 When Escherichia coli is used as a host cell, pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold and the like can be mentioned as suitable vectors.
  • vectors suitable for microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include pUB110, which is known as a Bacillus subtilis vector, or pHY500 (JP-A-2-31682), pNY700 (JP-A-4-278091), and pHY4831 (J Bacteriol., 1987, 1239-1245), pNU200 (Shigezo Udaka, Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry 1987, 61: 669-676), pNU100 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30: 75-80), pNU211 (J.
  • pNU211R2L5 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 7-170984
  • pNH301 Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58: 525-531.
  • PNH326, pNH400 J. Bacteriol., 1995, 177: 745-749
  • pHT210 JP-A-6-133782
  • pHT110R2L5 Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42: 358-363
  • Escherichia coli Escherichia coli.
  • pNCO2 JP-A-2002-238569 which is a shuttle vector of a microorganism belonging to the genus Brevibacillus.
  • Examples of eukaryotic host cells include yeast and filamentous fungi (such as mold).
  • yeast examples include, for example, genus Saccharomyces, genus Schizosaccharomyces, genus Kluyveromyces, genus Trichosporon, genus Trichosponi, and genus Schiwanidas And yeasts belonging to the genus Yarrowia and the genus Hansenula.
  • the expression vector When yeast is used as a host cell, the expression vector is usually an origin of replication (if amplification in the host cell is required) and a selectable marker for propagation of the vector in E. coli, induction for recombinant protein expression in yeast. It is preferred to include a sex promoter and terminator, and a selectable marker for yeast.
  • the expression vector is a non-integrated vector, it preferably further contains an autonomously replicating sequence (ARS). This can improve the stability of the expression vector in the cell (Myers, AM, et al. (1986) Gene 45: 299-310).
  • ARS autonomously replicating sequence
  • Examples of a vector when yeast is used as a host cell include, for example, YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), YIp, pHS19, pHS15, pA0804, pHIL3O1, pHIL-S1, pPIC9K, pPICZp, pGAPZ ⁇ . B and the like.
  • promoters when yeast is used as a host cell include galactose-inducible gal @ 1 promoter and gal @ 10 promoter; copper-inducible CUP @ 1 promoter; thiamine-inducible nmt1 promoter; and methanol-inducible AOX1 promoter and AOX2.
  • Promoters, DHAS promoters, DAS promoters, FDH promoters, FMDH promoters, MOX promoters, ZZA1, PEX5-, PEX8- and PEX14- promoters can be mentioned.
  • any method for introducing DNA into yeast can be used. For example, electroporation (Methods @ Enzymol., 194, 182 (1990)), spheroplast Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)), lithium acetate method (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • filamentous fungi examples include the genus Acremonium (Acremonium), the genus Aspergillus, the genus Ustilago, the genus Trichoderma, the genus Neurospora, and the genus Fusarium, Fusarium The genus Penicillium, the genus Myceliophtotra, the genus Botrytis, the genus Magnaporthe, the genus Mucor, the genus Metalithium, and the genus Monascus R. Monascus And bacteria belonging to the genus Rhizomucor.
  • promoters when a filamentous fungus is used as a host cell include a salicylic acid-inducible PR1a promoter; a cycloheximide-inducible Plac promoter; and a quinic acid-inducible Pqa-2 promoter.
  • the regulatory sequence is a sequence that controls the expression of the recombinant protein in the host (for example, a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a transcription termination sequence, and the like), and can be appropriately selected depending on the type of the host.
  • the promoter can be any array of DNA sequences that interact specifically with cellular transcription factors to regulate transcription of downstream genes. The choice of a particular promoter will depend on which cell type is used to express the protein of interest.
  • the transcription regulatory sequence can be from a host microorganism. In various embodiments, a constitutive or inducible promoter is selected for use in the host cell. Depending on the host cell, a constitutive promoter and an inducible promoter that are known and can control the function of the host cell can be used.
  • Promoters widely used in recombinant technology include, for example, the lac and trp operons of Escherichia coli, the tac promoter, the bacteriophage pL promoter, the bacteriophage T7 promoter and the SP6 promoter, the ⁇ -actin promoter, the insulin promoter, baculo. Viral polyhedrin and the p10 promoter may be utilized.
  • the term “constitutive promoter” refers to a promoter that constantly performs transcription at a constant level.
  • the constitutive promoter includes a promoter capable of expressing a gene arranged downstream of the promoter without induction using an inducer represented by IPTG or the like.
  • an inducible promoter that is constantly and continuously active can also act as a constitutive promoter, and is therefore included in the present specification.
  • a promoter whose expression is regulated by environmental pH such as a promoter of the hydA gene from Clostridium acetobutylicum, and a temperature-regulated promoter are also included in the constitutive promoters.
  • constitutive promoter examples include, for example, an int promoter of bacteriophage lambda, a bla promoter of a ⁇ -lactamase gene sequence of pBR322, hydA or thlA of Clostridium, Streptomyces coelicolor hrB, or a clone of whiE, pPR325.
  • CAT promoter of ramphenicol acetyl transferase gene sequence Staphylococcal constitutive promoter blaZ, artificially constructed constitutive promoter (Mutalik, VK et. Al. Nat Nat Methods 2013/10 (4) @ 354) -360 ⁇ Precision ⁇ reliable ⁇ gene ⁇ expres ion via standard transcription and translation initiation elements.), and the like.
  • an inducible promoter that regulates the expression of downstream genes in a controlled manner such as under specific cell culture conditions may be used.
  • prokaryotic inducible promoters include the major right and left bacteriophage promoters trp, recA, lacZ, AraC, and the E. coli gal promoter, Bacillus subtilis ⁇ -amylase (Ulmanen ⁇ Ett ⁇ at., ⁇ J. ⁇ Bacteriol. # 162).
  • ⁇ -D-specific promoters Gilman et al., Gene Sequence 32: 11-20 (1984)
  • Bacillus bacteriophage promoters Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacillus, Bacillus). Academic Press, Inc., NY (1982)
  • Streptomyces promoter Ward et at., M) oI. Gen. Genet. 203: 468-478, 1986.
  • Exemplary prokaryotic promoters are Glick (J. Ind. ⁇ Microtiot. ⁇ 1 ⁇ : 277-282, ⁇ 1987); Cenatiempo (Biochimie 68: 505-516, 1986); and Gottesrnan (Ann. ⁇ Rev. ⁇ Genet. ⁇ 1841-). 442, 1984).
  • the constitutive promoter can be located upstream of the ORF of the gene sequence encoding the polypeptide having nucleic acid resolution, and since it is constitutive, the gene of interest can be expressed without induction of gene expression by an inducer. Is preferred because it can be expressed efficiently. As long as it exhibits constitutive promoter activity in the host, it can be used as a constitutive promoter without being limited to the promoters exemplified above.
  • a polypeptide having nucleic acid resolution means a polypeptide having an activity of decomposing nucleic acids.
  • Nucleolytic enzymes are used in a wide variety of situations, from laboratory scale to industrial scale. For example, if nuclease is used, the viscosity of the cell extract can be reduced by its nucleolytic activity. Therefore, if nuclease is used when isolating and purifying proteins and other target substances in the cell extract, the process time can be reduced, the yield of the target substance can be improved, and the fractionation by centrifugation can be improved (pellet and supernatant).
  • nuclease when isolating and purifying a virus or an inclusion body to which a nucleic acid is non-specifically adsorbed, it is expected that the yield thereof can be improved. Furthermore, if nuclease is used for sample preparation such as ELISA, chromatography, 2D-PAGE, and footprint analysis for analyzing a biological sample, measurement errors due to unnecessary nucleic acids can be avoided.
  • nucleases examples include ribonuclease (Rnase) that degrades RNA and deoxyribonuclease (Dnase) that degrades DNA, and nuclease that degrades RNA and DNA. It also includes both endonuclease and exonuclease. Exonucleases are enzymes that remove nucleotides sequentially from the 5 'or 3' end, and endonucleases are enzymes that cut midway in the nucleotide chain. There are two types of nucleases depending on which side of the phosphodiester bond is degraded. In the case of DNase, there are enzymes that cut single strands and enzymes that cut double strands.
  • DNase examples include TaqI derived from thermophiles, EndA of Escherichia coli periplasm, and DNaseI gene derived from bovine pancreas.
  • the polypeptide having nucleic acid resolution is preferably a deoxyribonuclease.
  • a polypeptide having nucleic acid resolution and expressed in a recombinant cell includes a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence. This is because a polypeptide having nucleic acid decomposability, which is a toxic substance for bacteria, is expressed not on the cytoplasm but on the periplasm or the inner membrane.
  • a polypeptide having a nucleic acid resolution containing a transmembrane signal sequence for example, E. coli E. coli EndA.
  • Polypeptides having the ability to degrade nucleic acids having properties retained in the cytoplasm can be expressed on the periplasm or inner membrane by adding a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence.
  • the transmembrane signal sequence may be translocated or post-translationally translated through the prokaryotic plasma membrane (or the inner membrane of Gram-negative bacteria such as E. coli) or through the endoplasmic reticulum membrane of eukaryotic cells.
  • the ability to direct transport out of the cytoplasm can be a functional feature. (Control so that the signal peptide targets the periplasm of host cells such as E. coli.)
  • the transmembrane signal sequence is not particularly limited as long as it functions in the host. Specifically, the ⁇ -factor signal sequence of yeast, E. coli TorA signal sequence, E. coli. E. coli SufI signal sequence, E. coli. E. coli PelB signal sequence; E. coli OmpA signal sequence; Bacillus subtilis PhoD signal sequence; subtilis LipA signal sequence and Arthrobacter @globiformis IMD signal sequence (WO2013 / 118544).
  • the inner membrane binding sequence is a sequence having a function of binding to a cell membrane or an inner membrane.
  • it may be a sequence capable of binding to a lipid, a sequence capable of binding to a membrane protein, or a signal anchor sequence having a membrane-binding function.
  • An expression cassette for expressing a polypeptide having a nucleic acid resolution to which a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence is added is a polypeptide having a nucleic acid resolution to which a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence is added in a cell.
  • Typical examples of such expression cassettes include a promoter and a polynucleotide comprising a reporter protein coding sequence placed under the control of the promoter.
  • a method for introducing an expression cassette for a polypeptide having at least one nucleic acid resolution linked to a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence into cells is not particularly limited, and examples thereof include those skilled in the art such as a method using an expression vector. A well-known method can be used.
  • An expression vector can be produced, for example, by ligating the DNA downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • the expression vector can optionally contain a terminator, a repressor, a drug resistance gene, a selection marker such as an auxotrophic complement gene, an origin of replication that can function in a host, and the like.
  • the promoter that controls the expression of a polypeptide having nucleic acid resolution is not limited as long as it functions in a host cell.
  • a promoter derived from Escherichia coli or a phage such as a trp promoter (Ptrp), a lac promoter, a PL promoter, a PR promoter, a T7 promoter, a promoter in which two Ptrps are connected in series (Ptrp ⁇ 2), a tac promoter, a lacT7 promoter, Artificially designed and modified promoters such as lacT7.1 promoter, lacT7.2 promoter, lacT7.3 promoter, lacT7.4 promoter, lacT7.5 promoter, let I promoter, araBAD promoter, rhaBAD promoter, xylF promoter, xylA Glycolytic systems such as promoter, phoA promoter, cstA promoter and cstA-lac
  • An artificially constructed constitutive promoter (Mutalik, VK et. Al., Nat Methods 2013 @ 10 (4) 354-360) can also be used. It is preferable that the expression of the polypeptide having nucleic acid resolution is controlled by a constitutive promoter.
  • the recombinant cell according to the present embodiment may further express a polypeptide having bacteriolytic activity.
  • a polypeptide having a bacteriolytic activity is a polypeptide having an activity of destroying a barrier separating cell contents from the surrounding environment, and includes, for example, a polypeptide having a cell wall resolution and a polypeptide having an outer membrane resolution. .
  • Polypeptides having cell wall resolution include, for example, polypeptides having peptidoglycan resolution.
  • the polypeptide having bacteriolytic activity may further have cell binding activity. Cell binding activity means having an amino acid sequence that can be attached to, bound to, or integrated with cells.
  • the polypeptide having bacteriolytic activity is preferably a polypeptide having peptidoglycan decomposability.
  • Peptidoglycan is a polymer of a glycopeptide characterized by containing N-acetyl or N-glycolylmuramic acid and a D-amino acid, and plays an important role as a cell wall component of a bacterium in maintaining the shape of the bacterium.
  • a polypeptide having peptidoglycan degradability refers to a polypeptide that is suitable for dissolving peptidoglycan.
  • Polypeptides having peptidoglycan degradability include at least one of the following activities: endopeptidase, N-acetyl-muramoyl-L-alanine-amidase (amidase), N-acetyl-muramidase (lysozyme or soluble transglycosylase), And N-acetyl-glucosaminidase.
  • Polypeptides that have the ability to degrade peptidoglycan include, for example, so-called “endolysins” encoded by phage or prophage, related cell wall lytic enzymes encoded by bacteria, so-called “autolysins", other bacterial peptidoglycans such as bacteriocin Examples include those derived from lytic enzymes, virulence factors or other antimicrobial polypeptides (eg, lysostaphin, ALE-1 lysine, mutanolysin, enterolysin).
  • endolysins encoded by phage or prophage
  • autolysins other bacterial peptidoglycans
  • bacteriocin examples include those derived from lytic enzymes, virulence factors or other antimicrobial polypeptides (eg, lysostaphin, ALE-1 lysine, mutanolysin, enterolysin).
  • polypeptide having peptidoglycan degradability is selected from the group consisting of endolysin, autolysin, other bacterial peptidoglycan lytic enzymes, virulence factors or antimicrobial polypeptides.
  • polypeptides having peptidoglycan degradability may contain regions that are enzymatically inactive and bind to the cell wall of the host bacterium.
  • the polypeptide having the ability to degrade peptidoglycan is preferably selected from the group consisting of endolysin, amidase, transglycosylase, endopeptidase, autolysin, cell wall hydrolase, and lysozyme, and more preferably endolysin.
  • the polypeptide having peptidoglycan degradability is preferably amidase_5 (bacteriophage peptidoglycan hydrolase, pfam05382), amidase_2 (N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, pfam01510), amidase_3 (N-acetylmuramoyl-L-alanine).
  • amidase_5 bacteriophage peptidoglycan hydrolase, pfam05382
  • amidase_2 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, pfam01510
  • amidase_3 N-acetylmuramoyl-L-alanine
  • accession numbers starting with pfam, COG, CD and smart are respectively PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/) and COG (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). / COG /), NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) indicate the numbers registered in the database.
  • Polypeptides having peptidoglycan decomposability are preferably SH3_5 (bacterial SH3 domain, pfam08460), SH3_4 (bacterial SH3 domain, pfam06347), SH3_3 (bacterial SH3 domain, pfam08239), SH3b (bacterial SH3 domain homolog, smartsM Cell, L28).
  • LysM domains found in various enzymes involved in degradation pfam01476 and cd00118
  • PG_binding_1 putative peptidoglycan binding domain, pfam01471)
  • PG_binding_2 putative peptidoglycan binding domain, pfam08823
  • MtlA murein degradation
  • Cpl-7 C Consists of the C-terminal domain of 1-7 lysozyme, pfam08230
  • CW_binding_1 putative cell wall binding repeat, pfam01473
  • LytB putative cell wall binding domain, COG2247)
  • LytE LysM repeat, COG1388).
  • Polypeptides having peptidoglycan decomposability include fusion proteins with polypeptides having peptidoglycan decomposability, and proteins obtained by adding a known protein tag, a known signal sequence, etc. to a polypeptide having peptidoglycan decomposability. Further, the polypeptide having peptidoglycan decomposability may be a part of a known protein as long as it functions normally.
  • Endolysin is a cell wall lytic enzyme encoded in the late gene region of dsDNA phage and produced at the end of the lytic growth cycle. Similar enzymes are also found in the prophage genome integrated into the bacterial genome. Their function is the degradation of bacterial peptidoglycans from the inside, resulting in lysis of host cells and release of phage progeny.
  • endolysins can be divided into five classes: both are glycosidases and each cleave one of the two ⁇ -1,4-glycosidic bonds of the glycan chain (i) N-acetyl- ⁇ -D-muramidase (also known as lysozyme) and (ii) N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminidase; (iii) cleaves a similar bond to muramidase but by a different mechanism.
  • Glycosylase (iv) N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, which cuts between the glycan and the peptide moiety; and (v) endopeptidase, which cuts inside the peptide moiety. All endolysins except lytic transglycosylase are hydrolases. Similar enzymatic activity is also found in other bacterial cell wall lytic polypeptides such as bacterial enzymes that lyse their own cell walls or the cell walls of closely related bacteria, so-called autolysins, and bacteriocins. Bacterial autolysins are cell wall lytic enzymes that play important roles in cell wall remodeling, cell division, transformation, or as a virulence factor. They can be put together as peptidoglycan lytic enzymes.
  • the recombinant cells may express a polypeptide having bacteriolytic activity in the cytoplasm.
  • the recombinant cell may express a polypeptide having bacteriolytic activity outside of the cytoplasm.
  • polypeptides having bacteriolytic activity expressed outside the cytoplasm include Rz (i-spanin, GeneID of GenBank: 2703481) and Rz1 (o-) which are lytic factors of ⁇ phage anchored to the inner and outer membranes. spanin, GenBank GeneID: 5 739 319).
  • the recombinant cell according to the present embodiment may further express the target protein.
  • the target protein means a protein whose purpose is to express it by a protein expression method and then recover and utilize it.
  • the target protein include any protein that is preferably produced on an industrial scale, such as a protein that can be used for industrial purposes, a protein that can be used for medical purposes, and a structural protein.
  • proteins that can be used for industrial or medical purposes include enzymes, regulatory proteins, receptors, peptide hormones, cytokines, membranes or transport proteins, antigens used for vaccination, vaccines, antigen-binding proteins, immunostimulating proteins, Allergens and full-length antibodies or antibody fragments or derivatives can be mentioned.
  • Specific examples of the structural proteins include fibroin (eg, spider silk, silkworm silk, etc.), keratin, collagen, elastin, resilin, fragments of these proteins, and proteins derived therefrom.
  • fibroin includes naturally occurring fibroin and modified fibroin.
  • ⁇ naturally occurring fibroin '' means a fibroin having the same amino acid sequence as naturally occurring fibroin
  • ⁇ modified fibroin '' means a fibroin having an amino acid sequence different from that of naturally occurring fibroin. I do.
  • Fibroin may be spider silk fibroin.
  • Spider silk fibroin includes natural spider silk fibroin and modified fibroin derived from natural spider silk fibroin. Examples of natural spider silk fibroin include spider silk proteins produced by spiders.
  • Fibroin is, for example, a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. You may.
  • an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) may be further added to one or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence.
  • the N-terminal sequence and the C-terminal sequence are, but not limited to, typically a region having no repeat of the amino acid motif characteristic of fibroin, and are composed of about 100 amino acids.
  • domain sequence refers to a crystalline region unique to fibroin (typically, corresponding to the (A) n motif of the amino acid sequence) and an amorphous region (typically, the REP of the amino acid sequence).
  • the (A) n motif indicates an amino acid sequence mainly containing an alanine residue, and has 2 to 27 amino acid residues.
  • the number of amino acid residues in the n motif may be an integer of 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16 .
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 40% or more, and is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
  • At least seven of the (A) n motifs present in the domain sequence may be composed of only alanine residues.
  • REP indicates an amino acid sequence composed of 2 to 200 amino acid residues.
  • REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300, and may be an integer of 10 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • a plurality of REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • Naturally occurring fibroin examples include a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. Including proteins. Specific examples of naturally occurring fibroin include, for example, fibroin produced by insects or spiders.
  • fibroin produced by insects examples include Bombyx @ mori, Bombyx @ mandarina, natural silkworm (Antheraea @ yamamai), tussah (Anterea @ pernii), and maple silkworm (Erioganyerii). ), Silkworms produced by silkworms (Samia cynthia), chestnut worms (Caligura japonica), tussah silkworms (Antheraea mylitta), silkworms such as moga silkworms (Antheraea assama), and silkworms produced by larvae of the hornet beetle Hornet silk protein.
  • fibroin produced by insects include, for example, silkworm fibroin L chain (GenBank Accession No. M76430 (base sequence) and AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • Examples of the fibroin produced by spiders include spiders belonging to the genus Araneus (genus Araneus), such as Orion spider, Elder spider, Red-colored Spider, Blue-colored Spider, etc. Spiders belonging to the genus Argiope genus (Genus Pronus), such as spiders belonging to the genus Procarpus spp., Spiders belonging to the genus Pronus, and spider spiders belonging to the genus Cynotarachne, such as the genus Cyrtarachne, such as Torinofundamashi and Otorinofundamashi.
  • Genus Araneus such as Orion spider, Elder spider, Red-colored Spider, Blue-colored Spider, etc.
  • Spiders belonging to the genus Argiope genus such as spiders belonging to the genus Procarpus spp.
  • Spiders belonging to the genus Pronus and spider spiders belonging to the genus Cynotarachne, such as the genus Cyrtarachne, such
  • Spiders belonging to the genus Ordgarius such as spiders belonging to the genus (Gasteracantha), spiders belonging to the genus Orbalis, and spiders belonging to the genus Ordgarius, such as the spiders belonging to the genus Ordgarius.
  • Spiders belonging to the genus Argiope such as Argiope bruennichi, spiders belonging to the genus Argiope sp.
  • Spiders belonging to the genus Spider such as spiders belonging to the genus (Cytophora) and spiders belonging to the genus (Potys), spiders belonging to the genus Spiders (genus Cyclosa) such as the spiders belonging to the genus Cyclosa and spiders belonging to the genus Cygnus spp.
  • Spider silk proteins produced by spiders belonging to the genus Chorizopes), and asina such as red-headed spiders, red-backed spiders, blue-backed spiders and urocore-red spiders Spiders belonging to the genus Tetragnatha, spiders belonging to the genus Tetragnatha, spiders belonging to the genus Leucaegium, such as the spiders Argiope bruennichi and spiders spiders belonging to the genus Leucauge, such as the spiders belonging to the genus Nephila sp.
  • Spiders belonging to the genus Dyschiriognatha such as spiders belonging to the genus Menosira and spiders belonging to the genus Dyschiriognatha, such as the spiders belonging to the genus Latus and the spiders belonging to the genus Lastroconidae belonging to the genus Latus sp.
  • Spiders belonging to the family Tetragnathidae such as spiders belonging to the genus Prostenops (Euprosthenops) are produced.
  • Spider silk protein examples include dragline proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), and MiSp (MiSp1 and MiSp2).
  • Keratin-derived proteins include, for example, Capra ⁇ hircus type I keratin and the like.
  • Examples of the protein derived from collagen include, for example, a protein containing a domain sequence represented by the formula 3: [REP2] p (where p represents an integer of 5 to 300.
  • REP2 is Gly-X- And X and Y each represent an amino acid residue other than Gly.
  • a plurality of REP2s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.) it can.
  • elastin-derived proteins include proteins having an amino acid sequence such as NCBI GenBank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine).
  • Examples of the protein derived from resilin include, for example, a protein containing a domain sequence represented by Formula 4: [REP3] q (wherein, in Formula 4, q represents an integer of 4 to 300.
  • REP3 is Ser-JJ
  • 1 shows an amino acid sequence composed of -Tyr-Gly-U-Pro, wherein J represents an arbitrary amino acid residue, and is particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser, and Thr. And preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr and Ser ..
  • a plurality of REP4s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. ).
  • the method for disrupting a recombinant cell includes a step of disrupting the recombinant cell by applying a physical or chemical external stimulus to a recombinant cell expressing a polypeptide having nucleic acid resolution.
  • the polypeptide having nucleic acid resolution includes a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence.
  • Step of disrupting recombinant cells Recombinant cells are disrupted by applying a physical or chemical external stimulus.
  • the disruption of the recombinant cells is not limited to the case where the cells are directly disrupted by an external stimulus, but also by the fact that the external stimulus causes autolysis (hereinafter also referred to as “self-disruption by lysis”). It also includes disruption of cells. According to self-disruption by lysis, at the same time as the cells are disrupted, a polypeptide having the ability to degrade nucleic acids works, so that nucleic acids can be rapidly degraded.
  • the physical or chemical external stimulus is not particularly limited as long as the recombinant cell can be disrupted.
  • Examples of the physical external stimulus include crushing with an ultrasonic crusher, a French press and a homogenizer, freeze-thaw and low osmotic pressure.
  • Examples of the chemical external stimulus include a method using a protein extraction reagent, a treatment using a combination of methods such as a surfactant treatment and an enzyme treatment, and the like.
  • the recombinant cells further express a polypeptide having bacteriolytic activity.
  • the polypeptide having the bacteriolytic activity leaks into the periplasm by external stimulus to cause autolysis. Therefore, it is possible not to directly destroy the outer membrane or cell wall of the cell but to damage the inner membrane of the cell.
  • external stimulation by any of the following (1) to (3) is preferable. .
  • the following (1) to (3) are more inexpensive and simpler. (1) A method of adding a chelating agent, a surfactant, or chloroform to a liquid containing cells (2) A method of damaging the inner membrane by freeze-thawing cells (3) A method of reducing osmotic pressure
  • a culture solution may be used as it is, or a liquid in which cells are concentrated and suspended by centrifugation or the like may be used.
  • the chelating agent examples include EDTA and citric acid.
  • the surfactant examples include Triton-X100 and SDS.
  • the liquid containing cells for example, a mixed solution of EDTA and Triton may be used.
  • the addition amounts of the chelating agent, the surfactant and the chloroform are not particularly limited as long as they are concentrations that damage the inner membrane of cells, and can be appropriately adjusted.
  • the method of freezing and thawing cells can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, there is a method of freezing at ⁇ 20 ° C. and then thawing at 37 ° C. Freezing and thawing may be performed once or may be repeated several times.
  • the method of reducing the osmotic pressure can be performed by a method known to those skilled in the art.
  • the low osmotic pressure may be, for example, a method of diluting the culture solution (10-fold), or suspending in water after centrifugation.
  • Method for producing target protein by applying a physical or chemical external stimulus to a recombinant cell expressing a polypeptide having nucleic acid resolution, a polypeptide having bacteriolytic activity and a target protein, A step of lysing the recombinant cells and a step of recovering the target protein.
  • the polypeptide having nucleic acid resolution includes a transmembrane signal sequence or an inner membrane binding sequence.
  • the step of lysing the recombinant cells includes applying a physical or chemical external stimulus to the recombinant cells expressing the polypeptide having nucleic acid resolution, the polypeptide having bacteriolytic activity, and the target protein.
  • Polypeptides having bacteriolytic activity are expressed in the cytoplasm of recombinant cells.
  • a physical or chemical external stimulus to the recombinant cells, the inner membrane of the recombinant cells is damaged, and a polypeptide having bacteriolytic activity leaks out of the inner membrane, and the bacteriolytic activity of the polypeptide is increased. This causes lysis (autolysis) of the recombinant cells. It is preferred that the polypeptide having bacteriolytic activity leaks into the periplasm, causing autolysis. It is desirable that the lysis of the recombinant cells be performed at the timing when the desired amount of the target protein is obtained.
  • Whether the cells are lysed can be determined to be lysed, for example, when the dry cell weight (DCW) decreases before and after the lysis treatment. When the particle diameter is reduced, it can be determined that the cells are lysed.
  • DCW dry cell weight
  • Step of recovering target protein The method of recovering the target protein can be performed by a commonly used method.
  • a method usually used for isolating and purifying the protein from the supernatant obtained by centrifuging the lysate in which the recombinant cells have been lysed That is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate or the like, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, an anion using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) or the like.
  • a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) or the like.
  • the target protein when expressed in an insoluble form in the cells, the target protein is similarly obtained as a precipitate fraction obtained by centrifuging the cell-free extract in which the recombinant cells are dissolved. Insolubles can be recovered. The recovered insoluble form of the target protein can be solubilized with a protein denaturant. After this operation, a purified sample of the target protein can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the target protein can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation, and a purified sample can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • CZ1 prepared by introducing a CZ module (P3 promoter-RRzRz1-endA) into BL21 star (DE3) strain was transformed with a nuclease expression vector (CZ1 BL21 pSAompA2nucS).
  • CZ1 BL21 pSAompA2nucS a strain transformed with an expression vector using mRFP1 expressed in periplasmic instead of nucS was also prepared (CZ1 BL21 pSAompA1mRFP1). Details of each expression vector are shown below.
  • ⁇ Nucleolytic enzyme expression vector> a gene that allows the secretory protein fused with a signal peptide derived from the E. coli ompA gene to be transcribed by a constitutive promoter was constructed using a nucS structural gene derived from Streptomyces bacteria as a nuclease.
  • pSAum pSC101 ori ampicillin-resistant plasmid
  • the signal peptide portion of Escherichia coli ompA and the artificially synthesized nucS structural gene were amplified and isolated by PCR, and ligated by the Gibson assembly method. This was introduced into a plasmid derived from pSC101 to prepare a nuclease expression vector. (Fig. 1)
  • Constitutive promoter P3: aaaaaatttatttgcttattaatcatccggctcgtataatgtgtgga (SEQ ID NO: 7)
  • ompA signal peptide atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcc (SEQ ID NO: 8) nucS (core): (SEQ ID NO: 9)
  • 0.1 mL of an LB culture solution obtained by culturing the above transformant was centrifuged at 15,000 rpm for 1 minute. The pellet after centrifugation was suspended in 0.01 mL of buffer (10 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 100 mM KCl). After adding a drop of chloroform to the suspension, it was incubated at 37 degrees for 0, 5, 10 and 20 minutes. The reaction was stopped by adding 0.1 mL of TE + 0.09% SDS, 5% glycerol, 0.005% BPB. After electrophoresis of 0.01 mL using agarose gel (0.7% / TAE), a band was confirmed by EtBr staining.
  • the results are shown in FIG.
  • the first to fourth lanes from the left indicate samples of CZ1 @ BL21 @ pSAompA2nucS (NucS), and the lanes 5 to 8 from the left indicate samples of CZ1 @ BL21 @ pSAompA1mRFP1 (control).
  • 0, 5, 10, and 20 (minutes) indicate the incubation time after the addition of chloroform, respectively.
  • Samples of NucS incubated with chloroform for 5 and 10 minutes showed more nucleic acid degradation than control samples incubated for the same time.
  • Example 2 ⁇ Peptidoglycan degrading enzyme (endolysin) expression vector>
  • R of ⁇ phage was used as a peptidoglycan-degrading enzyme
  • endonuclease I of Escherichia coli encoded by the endA gene, SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 2 endA gene
  • Rz (i-spanin) and Rz1 (o-spanin) are lytic factors of ⁇ phage anchored to the inner and outer membranes, and promote lysis more than when only R is expressed.
  • the lysis module was prepared by incorporating a cassette [transcription promoter] -R-Rz-Rz1 downstream of the constitutive promoter (P3 promoter). After kanamycin was ligated as a marker and inserted into the genome, an FRT sequence recognized by FLP recombinase was inserted at both ends of the marker so that only the marker could be removed by site-specific recombination.
  • Nucleolytic enzymes expressed in the lysis module and periplasm by inserting a homologous recombination between the promoter of the endA gene and the structural gene on the genome to give a sequence homologous to the Escherichia coli genome at both ends of the cassette. Constructed a strain controlled by the promoter. The above structure was first constructed in BW25113 strain, and then introduced into BL21 @ star (DE3) by P1 @ transduction.
  • ⁇ ⁇ Sequence 1 shows a construct using a constitutive promoter (P3 promoter) as a promoter and a kanamycin resistance gene as a resistance marker.
  • P3 promoter aaaaaatttatttgcttattaatcatccggctcgtataatgtgtgga (SEQ ID NO: 3)
  • R Atggtagaaatcaataatcaacgtaaggcgttcctcgatatgctggcgtggtcggagggaactgataacggacgtcagaaaaccagaaatcatggttatgacgtcattgtaggcggagagctatttactgattactccgatcaccctcgcaaacttgtcacgctaaacccaaaactcaaatcaacaggcgcggacgctaccagcttctttcccgttggtgggatgcctaccgcaagcagcttggctggtgggatgcctaccgcaagcagcttggctggtgggatgcctaccgcaagcag
  • G11 strain based on the BL21 star (DE3) strain was prepared.
  • the G11 strain contains sequence 1 in the construct of FIG.
  • the transformed E. coli G11 strain was cultured in 2 mL of LB medium for 15 hours.
  • the culture solution was added to 100 mL of a seed culture medium (Table 1) so that the OD 600 became 0.005.
  • the temperature of the culture was maintained at 30 ° C., and the flask was cultured for about 15 hours until the OD 600 reached 5, to obtain a seed culture.
  • the seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of a production medium (Table 2) had been added so that the OD 600 was 0.05, and the transformed Escherichia coli was inoculated.
  • the temperature of the culture was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9. During the culture, the dissolved oxygen concentration in the culture was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • a feed solution (455 g / 1 L glucose, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 0.1 mL / min.
  • the temperature of the culture was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9. Culture was performed while maintaining the dissolved oxygen concentration in the culture solution at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • 1 M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce the expression of SSP (the target protein).
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • SSP the target protein
  • the lysis of the cells was determined based on the increase / decrease in dry cell weight (DCW).
  • a reference control strain (expressing the same SSP as the other strains, but a vector expressing the peptidoglycan degrading enzyme was not introduced) was prepared, and DCW decreased before and after the lysis treatment compared to the control strain. was used as an indicator of lysis.
  • the degree of lysis was confirmed by measuring the particle size. Particles can include cells and cell debris or fragments.
  • DCW was specifically determined as follows. A sample solution in which cells of 5 mL were suspended was collected, centrifuged (3,000 ° C., 20 ° C., 15 minutes), and the supernatant was discarded. 5 mL of 0.9% NaCl was added to the cell pellet, suspended, and centrifuged under the same conditions. The cell pellet from which the supernatant had been removed again was frozen, and then dried for 72 hours using a freeze dryer. This was weighed with a precision electronic balance, and the weight of the previously weighed container was removed to obtain the dry cell weight [g / L]. Since DCW also reflects the amount of SSP produced, the degree of lysis between strains was evaluated using DCW excluding the amount of SSP.
  • FIG. 6 shows the results.
  • FIG. 7 shows the results of measuring the particle diameter after each treatment.
  • the horizontal axis indicates the particle diameter
  • the vertical axis indicates the ratio of a certain particle diameter group to the total particle volume.
  • the graph is cut off at 0.65 ⁇ m or less due to the lower limit of measurement.

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Abstract

核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞であって、上記核酸分解能を有するポリペプチドが、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む、組換え細胞を開示する。

Description

組換え細胞、組換え細胞の破砕方法及び目的タンパク質の製造方法
　本発明は、組換え細胞、組換え細胞の破砕方法及び目的タンパク質の製造方法に関する。
　組換え細胞を使用した目的タンパク質の製造において、組換え細胞を破砕した液（細胞破砕液）は含まれる核酸によってしばしば高粘度となる。細胞破砕液が高粘度であると、目的タンパク質の回収率が低下したり、目的タンパク質の精製が困難になったりする。このような細胞破砕液の粘度上昇による影響はスケールアップすることでより顕著になる。
　また、大腸菌で過剰発現させた目的タンパク質を精製する一つの方法であるインクルージョンボディは、プロテアーゼ及び温度等の外部環境の影響を受けにくく、シンプルかつ効率的な機械的な手法での精製が可能である一方、再生させるとインクルージョンボディに付着していたプロテアーゼに分解されてしまう可能性がある。付着プロテアーゼの除去には、細胞破砕液中の核酸を分解する必要がある。
　細胞破砕液中の核酸を分解する方法としては、機械的な処理（超音波破砕処理やフレンチプレス処理）又は界面活性剤を用いる化学的処理と核酸分解酵素処理との組み合わせが報告されているが（特許文献1）、高価な酵素を大量に必要とするという問題があった。
特許第６０１５１４７号公報
　核酸分解酵素を添加することなく核酸分解酵素処理を行うことができる方法として、組換え細胞が自ら核酸分解能を有するポリペプチドを発現できるようにすることが望ましい。
　したがって、本発明は、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む、核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞、当該組換え細胞の破壊方法、及び当該組換え細胞を用いた目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
　核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞であって、
上記核酸分解能を有するポリペプチドが、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む、組換え細胞。
［２］
　上記組換え細胞が、
　上記核酸分解能を有するポリペプチドを発現させるための発現カセットを導入したものであるか、又は
　宿主細胞のゲノムに存在する上記核酸分解能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流にプロモーター配列を導入したものである、［１］に記載の組換え細胞。
［３］
　上記核酸分解能を有するポリペプチドがデオキシリボヌクレアーゼである、［１］又は［２］に記載の組換え細胞。
［４］
　さらに、細菌溶解活性を有するポリペプチドを発現する、［１］～［３］のいずれかに記載の組換え細胞。
［５］
　さらに、目的タンパク質を発現する、［１］～［４］のいずれかに記載の組換え細胞。
［６］
　核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞に、物理的又は化学的な外部刺激を与えることにより、上記組換え細胞を破砕する工程を含み、
　上記核酸分解能を有するポリペプチドが、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む、
組換え細胞を破砕する方法。
［７］
　上記組換え細胞が、さらに細菌溶解活性を有するポリペプチドを発現し、上記組換え細胞の破砕が、溶解による自己破砕である、［６］に記載の方法。
［８］
　上記核酸分解能を有するポリペプチドがデオキシリボヌクレアーゼである、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］
　上記細菌溶解活性を有するポリペプチドがペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドである、［７］に記載の方法。
［１０］
　核酸分解能を有するポリペプチド、細菌溶解活性を有するポリペプチド及び目的タンパク質を発現する組換え細胞に、物理的又は化学的な外部刺激を与えることにより、上記組換え細胞を溶解する工程、並びに
　上記目的タンパク質を回収する工程を含み、
　上記核酸分解能を有するポリペプチドが、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む、
目的タンパク質の製造方法。
［１１］
　上記核酸分解能を有するポリペプチドがデオキシリボヌクレアーゼである、［１０］に記載の方法。
［１２］
　上記細菌溶解活性を有するポリペプチドがペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドである、［１０］又は［１１］に記載の方法。
　本発明によれば、組換え細胞自体が核酸分解能を有するポリペプチドを発現するため、核酸分解酵素等を添加する必要がない。
　また、本発明によれば、核酸分解能を有するポリペプチドを膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含むものとすることにより、核酸分解酵素を細胞質でなく、ペリプラズム又は内膜上に発現させることが可能となる。これにより、核酸分解能を有するポリペプチドによる組換え細胞の生育阻害を抑制することができる。
　また、本発明によれば、当該組換え細胞を破砕した際に、核酸分解酵素が染色体ＤＮＡを分解することにより、細胞破砕液の粘性を減らすことができる。
　初期精製における時間のロスは目的タンパク質のロスを避けるために必要最小限にすることが求められる。本発明によれば、細胞破砕液において核酸分解能を有するポリペプチドがすぐに働くため、迅速かつ効率的に核酸を分解する（粘性を低下させる）ことができる。
実施例１で用いた核酸分解酵素発現ベクターの模式図である。 実施例１で用いたｍＲＦＰ１発現ベクターの模式図である。 溶菌における核酸分解酵素の効果を示す電気泳動写真である。左から１～４番目のレーンはＣＺ１　ＢＬ２１　ｐＳＡｏｍｐＡ２ｎｕｃＳのサンプル（ＮｕｃＳ）、左から５～８のレーンはＣＺ１　ＢＬ２１　ｐＳＡｏｍｐＡ１ｍＲＦＰ１のサンプル（コントロール）を示す。また、０、５、１０、２０（分）はそれぞれクロロホルムを加えた後のインキュベート時間を示す。 実施例２で用いたペプチドグリカン分解酵素発現ベクター（配列１）及び染色体への挿入状態の模式図である。各数値は配列１における位置を示し、各矢印は遺伝子の転写の方向を示す。 誘導２４時間後におけるコントロールのＳＳＰの生産量（ｇ／Ｌ）を１００％とした場合の、Ｇ１１株の誘導０時間後及び誘導２４時間後における生産性（％）を示すグラフである。 培養終了後（誘導２４時間後）の菌体溶液のＤＣＷを１００％とした場合の、各処理後のＤＣＷの割合を示すグラフである。 各処理後の粒子径を測定した結果を示すグラフである。横軸は粒子径であり、縦軸はある粒子径の集団が全粒子体積に占める割合を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
［核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞］
　一実施形態に係る組換え細胞は、核酸分解能を有するポリペプチドを発現する。ここで、核酸分解能を有するポリペプチドは膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む。
（組換え細胞）
　本実施形態に係る組換え細胞は、核酸分解能を有するポリペプチドを発現している。組換え細胞は、核酸分解能を有するポリペプチドを発現するように組換え操作をした細胞を意味する。
　本実施形態に係る組換え細胞は、例えば、核酸分解能を有するポリペプチドを発現させるための発現カセットを導入することにより得ることができる。上記発現カセットとしては、例えば、核酸分解能を有するポリペプチドをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現カセットが挙げられる。
　また、宿主細胞の中には、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む核酸分解能を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する（ただし発現はしていない）ものも存在する。宿主細胞に元々含まれているポリペプチドを以下「内在性の」核酸分解能を有するポリペプチドともいう。したがって、本実施形態に係る組換え細胞は、例えば、宿主細胞のゲノムに存在する（内在性の）核酸分解能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流にプロモーター配列を導入することにより得ることもできる。上記プロモーター配列を導入することで、内在性の膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む核酸分解能を有するポリペプチドをペリプラズム又は内膜上に発現させることができる。
　発現カセットを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、発現カセットを導入した発現ベクターを宿主細胞に形質転換させる方法、及び上記発現ベクター又は本発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡに直接組み込む方法が挙げられる。目的タンパク質の発現カセット、細菌溶解活性を有するポリペプチドの発現カセット、及び後述する核酸分解酵素の発現カセットは宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことが好ましい。
　発現カセットを導入した発現ベクターを宿主細胞に形質転換させる方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、プラスミドを用いて発現ベクターを宿主細胞に形質転換させることが挙げられる。例えば、上記方法により発現カセットを大腸菌に導入することで、組換え大腸菌を製造することができる。
　上記発現ベクターあるいは発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡへ組み込む方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、λファージの２重鎖切断修復における組換え機構を応用したλｒｅｄ法、Ｒｅｄ／ＥＴ相同組換え法、ｐＵＴ－ｍｉｎｉ　Ｔｎ５を用いたトランスポゾン活性を利用した転移法が挙げられる。また、例えば、バイオメダル社の「トランスポゾンによる遺伝子導入キット：ｐＵＴｍｉｎｉ－Ｔｎ５　Ｋｉｔ」等を用い、キットに記載の方法に準じて、発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことができる。
　また、プロモーター配列を宿主細胞のゲノムに存在する（内在性の）核酸分解能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に導入する方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、λファージの２重鎖切断修復における組換え機構を応用したλｒｅｄ法、Ｒｅｄ／ＥＴ相同組換え法、導入するプロモーターとしては、上記の内在性ポリペプチドを発現させることができるプロモーターであれば、本明細書中に記載されたプロモーターを含むいかなるプロモーターも使用することができるが、どのような発現系とも容易に組み合わせることができるため、構成的プロモーターが好ましい。
　宿主細胞として、細菌等の原核生物の細胞、並びに酵母細胞、糸状真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、及び植物細胞等の真核生物の細胞のいずれも用いることができる。ただし、組換え細胞が細菌溶解活性を有するポリペプチドをさらに発現する場合には、細菌溶解活性による効果を発揮させる観点から、宿主細胞は細菌等の原核細胞の細胞であることが好ましい。
　細菌等の原核生物の宿主細胞としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。原核生物の好ましい例としては、例えば、大腸菌、バチルス・ズブチリス、シュードモナス、コリネバクテリウム、及びラクトコッカス等を挙げることができる。宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることが好ましい。
　エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ　ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ　ＤＨ１、エシェリヒア・コリ　ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ　ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ　Ｋ５（ＡＴＣＣ　２３５０６）、エシェリヒア・コリ　ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ　ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ　４７０７６）、エシェリヒア・コリ　Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ　Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　ＴＢ１、エシェリヒア・コリ　Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ　２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることが好ましい。
　上記宿主細胞への本発現カセットの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
　ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９－３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２－２０３）により実施することができる。
　本発現カセットを導入するベクター（以下、単に「ベクター」という。）の種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　Ｂ－４００）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（米国特許４６８６１９１号、米国特許４９３９０９４号、米国特許５１６０７３５号）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
　宿主細胞として大腸菌を用いる場合は、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。
　ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９－１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９－６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５－８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８－４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５－５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５－７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８－３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主細胞としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。
　酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点（宿主細胞における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のための誘導性プロモーター及びターミネーター、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。
　発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これにより細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ　４５：２９９－３１０）。
　酵母を宿主細胞として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ－Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ　Ｂ等を挙げることができる。
　酵母を宿主細胞とした場合のプロモーターの具体例として、ガラクトース誘導性のｇａｌ　１プロモーター及びｇａｌ　１０プロモーター；銅誘導性のＣＵＰ　１プロモーター；チアミン誘導性のｎｍｔ１プロモーター；並びにメタノール誘導性のＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＤＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤＨプロモーター、ＭＯＸプロモーター、ＺＺＡ１、ＰＥＸ５－、ＰＥＸ８－及びＰＥＸ１４－プロモーター等を挙げることができる。
　酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
　糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
　糸状真菌を宿主細胞とした場合のプロモーターの具体例として、サリチル酸誘導性ＰＲ１ａプロモーター；シクロヘキシミド誘導性Ｐｌａｃｃプロモーター；及びキナ酸誘導性Ｐｑａ－２プロモーター等を挙げることができる。
　糸状真菌への発現ベクターの導入は，従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
　調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
　プロモーターは、下流遺伝子の転写を調節するために細胞転写因子と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の任意のアレイであり得る。特定のプロモーターの選択は、対象となるタンパク質を発現するためにどの細胞型が使用されるかに依存する。転写調節配列は宿主微生物からのものであり得る。種々の態様において、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターが宿主細胞における使用に選択される。宿主細胞に応じて、公知でかつ宿主細胞の機能を操作し得る構成的プロモーター及び誘導性プロモーターを用いることができる。
　組換え技術で広く利用されるプロモーターとして、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のｌａｃ及びｔｒｐオペロン、ｔａｃプロモーター、バクテリオファージｐＬプロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター及びＳＰ６プロモーター、β－アクチン・プロモーター、インスリン・プロモーター、バキュロウイルス・ポリヘドリン及びｐ１０プロモーターが利用され得る。
　本明細書において、構成的プロモーターとは、常に一定レベルで転写を行なっているプロモーターをいう。構成的プロモーターには、ＩＰＴＧ等に代表される誘導物質を用いて誘導することなく、プロモーターの下流に配置された遺伝子を発現させることができるプロモーターが含まれる。さらに、定常的・連続的に活性である誘導性プロモーターは、同様に構成的プロモーターとして作用することができるため、本明細書においては構成的プロモーターに含まれる。例えば、クロストリジウム・アセトブティリキュムからのｈｙｄＡ遺伝子のプロモーターのように環境ｐＨにより発現が調節されるプロモーター、及び温度調節プロモーターも構成的プロモーターに含まれる。
　構成的プロモーターとしては、例えば、バクテリオファージ・ラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ－ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、クロストリジウムのｈｙｄＡ又はｔｈｌＡ、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）ｈｒｄＢ、又はｗｈｉＥ、ｐＰＲ３２５のクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモーター、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）構成的プロモーターｂｌａＺ、人工的に構築された構成的プロモーター（Ｍｕｔａｌｉｋ，Ｖ．Ｋ．　ｅｔ．　ａｌ　　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１３　１０（４）　３５４－３６０　Ｐｒｅｃｉｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｉａ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ．）等が挙げられる。
　また、特定の細胞培養条件下などの制御様式で下流遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターを使用してもよい。原核生物誘導性プロモーターの例は、バクテリオファージの主要な右及び左プロモーターのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ＡｒａＣ、及び大腸菌のｇａｌプロモーター、枯草菌のα－アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ　Ｅｔｔ　ａｔ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１６２：１７６－１８２，　１９８５）及びσ－Ｄ特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　３２：１１－２０（１９８４））、バチルスのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，　Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．，　ＮＹ　（１９８２））、ストレプトマイセスのプロモーター（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｔ．，　ＭｏＩ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２０３：４６８－４７８，　１９８６）などを含む。例示的な原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ（Ｊ．　Ｉｎｄ．　Ｍｉｃｒｏｔｉｏｔ．　１　：２７７－２８２，　１９８７）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　６８：５０５－５１６，　１９８６）；及びＧｏｔｔｅｓｒｎａｎ（Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．　１８：４１５－４４２，　１９８４）に概説される。
　構成的プロモーターは、核酸分解能を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦの上流に局在させることができ、構成的であることから、誘導物質による遺伝子発現誘導を行わなくても、目的の遺伝子を効率的に発現させることができるため、好ましい。宿主において構成的プロモーター活性を呈するのであれば、上記例示したプロモーターに限らず構成的プロモーターとして使用できる。
（核酸分解能を有するポリペプチド）
　核酸分解能を有するポリペプチド（核酸分解酵素）は、核酸を分解する活性を有するポリペプチドを意味する。核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）は、研究室スケールから工業スケールまで、多種多様な場面で使用されている。例えば、ヌクレアーゼを用いれば、その核酸分解活性により細胞抽出液の粘性を下げることができる。そこで、細胞抽出液中のタンパク質その他の目的物質を単離及び精製する際に、ヌクレアーゼを用いれば、プロセス時間の短縮、目的物質の収量向上、遠心分離法による分画の改善（ペレットと上清との分離性）、溶液の円滑なろ過（特に限外ろ過）、クロマトグラフィー工程の効率向上などが期待できる。また、核酸が非特異的に吸着するウイルスやインクルージョンボディなどを単離及び精製する際にヌクレアーゼを用いれば、これらの収率を向上させることが期待できる。さらに、生体試料を解析するためのＥＬＩＳＡ、クロマトグラフィー、２Ｄ－ＰＡＧＥやフットプリント解析などのサンプル調製にヌクレアーゼを用いれば、不要な核酸による測定誤差を回避できる。
　核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）としては、ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼ（Ｒｎａｓｅ）とＤＮＡを分解するデオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、並びにＲＮＡ及びＤＮＡを分解するヌクレアーゼ等が挙げられる。また、エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）及びエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）の両方が含まれる。エキソヌクレアーゼは、５’又は３’末端から順にヌクレオチドをはずしていく酵素であり、エンドヌクレアーゼは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素である。ヌクレアーゼにはホスホジエステル結合のどちら側を分解するかで、次の２つがある。ＤＮａｓｅの場合、一本鎖を切断する酵素と、二本鎖を切断する酵素がある。ＤＮａｓｅとしては、例えば、好熱菌由来のＴａｑＩ、大腸菌ペリプラズムのＥｎｄＡ、及びウシ膵臓由来のＤＮａｓｅＩ遺伝子等が挙げられる。本実施形態においては、核酸分解能を有するポリペプチドは、デオキシリボヌクレアーゼであることが好ましい。
　一実施形態に係る組換え細胞において発現する、核酸分解能を有するポリペプチドは、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む。菌にとっては毒物質である核酸分解能を有するポリペプチドを細胞質ではなく、ペリプラズム又は内膜上で発現させるためである。
　膜通過シグナル配列を含む核酸分解能を有するポリペプチドとしては、例えば、Ｅ．　ｃｏｌｉのＥｎｄＡが挙げられる。
　細胞質に保持される性質を持つ核酸分解能を有するポリペプチドは、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を付加することにより、ペリプラズム又は内膜上で発現させることができる。
　膜通過シグナル配列（シグナルペプチド）は、原核生物の原形質膜（又は大腸菌のようなグラム陰性菌の内膜）を通してか、真核細胞の小胞体膜を通して、共翻訳的又は翻訳後にポリペプチドの細胞質外への輸送を方向づける能力を機能的な特徴とし得る。（シグナルペプチドが大腸菌のような宿主細胞のペリプラズムにターゲティングするように制御する。）
　膜通過シグナル配列は、宿主で機能するものであれば、特に制限されない。具体的には、酵母のα因子シグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｏｒＡシグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉのＳｕｆＩシグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｅｌＢシグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉのＯｍｐＡシグナル配列、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓのＰｈｏＤシグナル配列、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＬｉｐＡシグナル配列、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓのＩＭＤシグナル配列が挙げられる（ＷＯ２０１３／１１８５４４）。
　内膜結合配列は、細胞膜又は内膜へ結合する機能を持つ配列である。例えば、脂質と結合することができる配列であってもよく、膜タンパク質と結合することができる配列であってもよく、膜結合の機能を持つシグナルアンカー配列であってもよい。
　膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を付加した核酸分解能を有するポリペプチドを発現させるための発現カセットは、細胞内で膜通過シグナル配列又は内膜結合配列が付加される核酸分解能を有するポリペプチドを発現可能なポリヌクレオチドである限り特に制限されない。該発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたレポータータンパク質コード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　膜通過シグナル配列又は内膜結合配列が連結された少なくとも一つの核酸分解能を有するポリペプチドの発現カセットを細胞に導入する方法は、特に制限されず、例えば、発現ベクターを使用した方法等当業者に周知の方法を用いることができる。
　発現ベクターは、例えば、該ＤＮＡを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。また、発現ベクターは、所望によりターミネーター、リプレッサー、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー、宿主で機能し得る複製起点などを含有することができる。
　核酸分解能を有するポリペプチドの発現を制御するプロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモーター、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌａｃＴ７．１プロモーター、ｌａｃＴ７．２プロモーター、ｌａｃＴ７．３プロモーター、ｌａｃＴ７．４プロモーター、ｌａｃＴ７．５プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｘｙｌＦプロモーター、ｘｙｌＡプロモーター、ｐｈｏＡプロモーター、ｃｓｔＡプロモーター及びｃｓｔＡ－ｌａｃＺプロモーター、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ　１プロモーター、ｇａｌ　１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１　プロモーター、ＣＵＰ　１プロモーター、ｐＧＡＰプロモーター、ｐＧＣＷ１４プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＭＯＸプロモーター等を用いることができる。人工的に構築された構成的プロモーター（Ｍｕｔａｌｉｋ，Ｖ．Ｋ．　ｅｔ．　ａｌ，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１３　１０（４）３５４－３６０）を用いることもできる。核酸分解能を有するポリペプチドは構成的プロモーターにより発現が制御されていることが好ましい。
（細菌溶解活性を有するポリペプチド）
　本実施形態に係る組換え細胞は、細菌溶解活性を有するポリペプチドをさらに発現するものであってもよい。細菌溶解活性を有するポリペプチドは、周囲環境から細胞内容物を分離する障壁を破壊する活性を有するポリペプチドであり、例えば、細胞壁分解能を有するポリペプチド及び外膜分解能を有するポリペプチド等が含まれる。細胞壁分解能を有するポリペプチドは、例えば、ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチド等が含まれる。細菌溶解活性を有するポリペプチドは、さらに細胞結合活性を有していてもよい。細胞結合活性とは、細胞へ付着、結合、若しくはインテグレートできるアミノ酸配列を有することである。細菌溶解活性を有するポリペプチドは、ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドであることが好ましい。
　ペプチドグリカンは、Ｎ－アセチル又はＮ－グリコリルムラミン酸とＤ－アミノ酸を含むことを特徴とする糖ペプチドのポリマーで、細菌の細胞壁成分として菌の形状の保持に重要な働きをしている。本明細書において使用するペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドは、ペプチドグリカンを溶解するのに適当であるポリペプチドを指す。ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドは、以下の活性の少なくとも１つを含む：エンドペプチダーゼ、Ｎ－アセチル－ムラモイル－Ｌ－アラニン－アミダーゼ（アミダーゼ）、Ｎ－アセチル－ムラミダーゼ（リゾチーム若しくは溶解性トランスグリコシラーゼ）、及びＮ－アセチル－グルコサミニダーゼ。ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドとしては、例えば、ファージ若しくはプロファージにコードされる、いわゆる「エンドリシン」、細菌によりコードされる関連した細胞壁溶解酵素、いわゆる「オートリシン」、バクテリオシン等の他の細菌ペプチドグリカン溶解酵素、病原性因子若しくは他の抗菌ポリペプチド（例えば、リゾスタフィン、ＡＬＥ－１リシン、ムタノリシン、エンテロリシン）に由来するものが挙げられる。ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドが、エンドリシン、オートリシン、他の細菌ペプチドグリカン溶解酵素、病原性因子若しくは抗菌ポリペプチドに由来するものからなる群から選択されることが好ましい。加えて、ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドは、酵素的に不活性であり、かつ宿主細菌の細胞壁に結合する領域を含有してもよい。
　ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドは、エンドリシン、アミダーゼ、トランスグリコシラーゼ、エンドペプチダーゼ、オートリシン、細胞壁ヒドロラーゼ、及びリゾチームからなる群から選択されることが好ましく、エンドリシンであることがより好ましい。
　ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドは好ましくは、アミダーゼ＿５（バクテリオファージペプチドグリカンヒドロラーゼ、ｐｆａｍ０５３８２）、アミダーゼ＿２（Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ、ｐｆａｍ０１５１０）、アミダーゼ＿３（Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ、ｐｆａｍ０１５２０）、Ｔｒａｎｓｇｌｙ（トランスグリコシラーゼ、ｐｆａｍ００９１２）、ペプチダーゼ＿Ｍ２３（ペプチダーゼファミリーＭ２３、ｐｆａｍ０１５５１）、エンドリシン＿オートリシン（ＣＤ００７３７）、ヒドロラーゼ＿２（細胞壁ヒドロラーゼ、ｐｆａｍ０７４８６）、ＣＨＡＰ（アミダーゼ、ｐｆａｍ０５２５７）、トランスグリコシラーゼ（トランスグリコシラーゼ様ドメイン、ｐｆａｍ０６７３７）、ＭｔｌＢ（膜結合型溶解性ムレイントランスグリコシラーゼＢ、ＣＯＧ２９５１）、ＭｔｌＡ（膜結合型溶解性ムレイントランスグリコシラーゼＡ、ＣＯＧ２８２１）、ＭｔｌＥ（膜結合型溶解性ムレイントランスグリコシラーゼＥ、ＣＯＧ０７４１）、バクテリオファージ＿λ＿リゾチーム（Ｎ－アセチルムラミン酸とＮ－アセチルグルコサミンとの間の結合の溶解、ＣＤ００７３６）、ペプチダーゼ＿Ｍ７４（ペニシリン非感受性ムレインエンドペプチダーゼ、ｐｆａｍ０３４１１）、ＳＬＴ（トランスグリコシラーゼＳＬＴ、ｐｆａｍ０１４６４）、Ｌｙｓ（Ｃ型リゾチーム／α－ラクトアルブミンファミリー、ｐｆａｍ０００６２）、ＣＯＧ５６３２（Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ、ＣＯＧ５６３２）、ＭｅｐＡ（ムレインエンドペプチダーゼ、ＣＯＧ３７７０）、ＣＯＧ１２１５（グリコシルトランスフェラーゼ、ＣＯＧ１２１５）、ＡｍｉＣ（Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ、ＣＯＧ０８６０）、Ｓｐｒ（細胞壁結合型ヒドロラーゼ、ＣＯＧ０７９１）、バクテリオファージ＿Ｔ４様＿リゾチーム（Ｎ－アセチルムラミン酸とＮ－アセチルグルコサミンとの間の結合の溶解、ｃｄ００７３５）、ＬＴ＿ＧＥＷＬ（溶解性トランスグリコシラーゼ（ＬＴ）及びガチョウ卵白リゾチーム（ＧＥＷＬ）ドメイン、ｃｄ００２５４）、ペプチダーゼ＿Ｓ６６（ＬＤ－カルボキシペプチダーゼ、ｐｆａｍ０２０１６）、グリコ＿ヒドロ＿７０（グリコシルヒドロラーゼファミリー７０、ｐｆａｍ０２３２４）、グリコ＿ヒドロ＿２５（グリコシルヒドロラーゼファミリー２５）、ＶａｎＹ（Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニンカルボキシペプチダーゼ、ｐｆａｍ０２５５７）、及びＬＹＺ２（リゾチームサブファミリー２、ｓｍａｒｔ　０００４７）から構成される群より選択される少なくとも１つの酵素活性ドメインを含む。
　なお、ここでｐｆａｍ、ＣＯＧ、ＣＤ及びｓｍａｒｔから始まるアクセッション番号は、それぞれＰＦＡＭ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）、ＣＯＧ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＯＧ／）、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）及びＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）のデータベースに登録された番号を示す。
　ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドは好ましくは、ＳＨ３＿５（細菌ＳＨ３ドメイン、ｐｆａｍ０８４６０）、ＳＨ３＿４（細菌ＳＨ３ドメイン、ｐｆａｍ０６３４７）、ＳＨ３＿３（細菌ＳＨ３ドメイン、ｐｆａｍ０８２３９）、ＳＨ３ｂ（細菌ＳＨ３ドメインホモログ、ｓｍａｒｔ００２８７）、ＬｙｓＭ（細胞壁分解に関与する種々の酵素において見出されるＬｙｓＭドメイン、ｐｆａｍ０１４７６及びｃｄ００１１８）、ＰＧ＿結合＿１（推定上のペプチドグリカン結合ドメイン、ｐｆａｍ０１４７１）、ＰＧ＿結合＿２（推定上のペプチドグリカン結合ドメイン、ｐｆａｍ０８８２３）、ＭｔｌＡ（ムレイン分解トランスグリコシラーゼ由来のペプチドグリカン結合ドメイン、ｐｆａｍ０３４６２）、Ｃｐｌ－７（Ｃｐｌ－７リゾチームのＣ末端ドメイン、ｐｆａｍ０８２３０）、ＣＷ＿結合＿１（推定上の細胞壁結合リピート、ｐｆａｍ０１４７３）、ＬｙｔＢ（推定上の細胞壁結合ドメイン、ＣＯＧ２２４７）、及びＬｙｔＥ（ＬｙｓＭリピート、ＣＯＧ１３８８）から構成される群より選択される少なくとも１つの細胞壁に結合する領域を含む。
　ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドには、ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドとの融合タンパク質や、ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドに公知のタンパク質タグ、公知のシグナル配列等が付加されてなるタンパク質も包含される。また、ペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドは、正常に機能する限り、公知のタンパク質の一部であってもよい。
　エンドリシンは、ｄｓＤＮＡファージの後期遺伝子領域にコードされ、及び溶解性増殖サイクルの終わりに産生される細胞壁溶解酵素である。同様の酵素はまた、細菌ゲノム中に組み込まれたプロファージゲノム内でも見出される。それらの機能は内側からの細菌ペプチドグリカンの分解であり、宿主細胞の溶解及びファージ子孫の放出をもたらす。ペプチドグリカン内の異なる標的結合に従い、エンドリシンは５つのクラスに分類することができる：両方ともグリコシダーゼであり、かつグリカン鎖の２つのβ－１，４－グリコシド結合の１つをそれぞれ切断する（ｉ）Ｎ－アセチル－β－Ｄ－ムラミダーゼ（リゾチームとしても公知である）及び（ｉｉ）Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニダーゼ；（ｉｉｉ）ムラミダーゼと同様の結合を切断するが、異なる機構による溶解性トランスグリコシラーゼ；（ｉｖ）グリカンとペプチド部分との間を切るＮ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ；及び（ｖ）ペプチド部分内部を切断するエンドペプチダーゼ。溶解性トランスグリコシラーゼを除くすべてのエンドリシンはヒドロラーゼである。同様の酵素活性はまた、それ自身の細胞壁又は密接に関連した細菌の細胞壁を溶解する細菌酵素、いわゆるオートリシン、及びバクテリオシンなどの他の細菌細胞壁溶解ポリペプチドにおいても見出される。細菌オートリシンは、細胞壁リモデリング、細胞分裂、形質転換において、又は病原性因子として重要な役割を果たす細胞壁溶解酵素である。それらは一緒にペプチドグリカン溶解酵素としてまとめることができる。
　本実施形態において、組換え細胞は細胞質において細菌溶解活性を有するポリペプチドを発現していてもよい。組換え細胞は、細胞質以外において細菌溶解活性を有するポリペプチドを発現していてもよい。細胞質以外において発現する細菌溶解活性を有するポリペプチドとしては、例えば、内膜及び外膜にアンカーされるλファージの溶菌因子であるＲｚ（ｉ－ｓｐａｎｉｎ、ＧｅｎＢａｎｋのＧｅｎｅＩＤ：２７０３４８１）及びＲｚ１（ｏ－ｓｐａｎｉｎ、ＧｅｎＢａｎｋのＧｅｎｅＩＤ：５７３９３１９）が挙げられる。細胞溶解活性を有するポリペプチドとしてλファージの溶菌因子であるＲを用いる場合には、Ｒｚ及び／又はＲｚ１を共発現させることでＲのみを発現させる場合と比較して溶菌がより促進される。
（目的タンパク質）
　本実施形態に係る組換え細胞は、目的タンパク質をさらに発現するものであってもよい。目的タンパク質とは、タンパク質発現方法により発現させた後、回収等して利用することを目的とするタンパク質のことを意味する。目的タンパク質としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、及び完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体等を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、フィブロイン（例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等）、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン、レシリン、及びこれらタンパク質の断片、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
　本明細書においてフィブロインは、天然由来のフィブロインと改変フィブロインとを含む。本明細書において「天然由来のフィブロイン」とは、天然由来のフィブロインと同一のアミノ酸配列を有するフィブロインを意味し、「改変フィブロイン」とは、天然由来のフィブロインとは異なるアミノ酸配列を有するフィブロインを意味する。
　フィブロインは、クモ糸フィブロインであってよい。クモ糸フィブロインには、天然クモ糸フィブロイン、及び天然クモ糸フィブロインに由来する改変フィブロインが含まれる。天然クモ糸フィブロインとしては、例えば、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。
　フィブロインは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってもよい。本実施形態に係るフィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２～２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、１０～３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　天然由来のフィブロインとしては、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。天然由来のフィブロインの具体例としては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ　ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。
　コラーゲン由来のタンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。
　エラスチン由来のタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
　レシリン由来のタンパク質としては、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｑは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ－Ｊ－Ｊ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意アミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。
［組換え細胞を破砕する方法］
　一実施形態に係る組換え細胞を破砕する方法は、核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞に、物理的又は化学的な外部刺激を与えることにより、上記組換え細胞を破砕する工程を含む。ここで、核酸分解能を有するポリペプチドは膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む。
（組換え細胞を破砕する工程）
　組換え細胞は、物理的又は化学的な外部刺激を与えることにより破砕される。本明細書において、組換え細胞の破砕には、外部刺激により直接的に細胞を破砕する場合だけではなく、外部刺激により自己溶菌（以下、「溶解による自己破砕」ともいう）が引き起こされることにより細胞が破砕されることも含まれる。溶解による自己破砕によれば、菌体が破砕されるのと同時に、核酸分解能を有するポリペプチドが働くため、速やかに核酸を分解することができる。
（物理的又は化学的な外部刺激）
　物理的又は化学的な外部刺激は、組換え細胞を破砕することができれば、特に限定されない。物理的な外部刺激としては、例えば、超音波破砕装置、フレンチプレス及びホモジェナイザー等による破砕、凍結融解及び低浸透圧が挙げられる。また、化学的な外部刺激としては、例えば、タンパク質の抽出試薬を用いた方法、界面活性剤処理、酵素処理等の方法を組み合わせた処理等が挙げられる。
　組換え細胞は、細菌溶解活性を有するポリペプチドをさらに発現していることが好ましい。この場合には、細菌溶解活性を有するポリペプチドが外部刺激によりペリプラズムに漏出し、自己溶菌が引き起こされることが好ましい。したがって、細胞の外膜や細胞壁を直接的に破壊するのではなく、細胞の内膜を中心に傷つけることが可能である、例えば以下の（１）～（３）のいずれかによる外部刺激が好ましい。以下の（１）～（３）は、さらに安価かつ簡便である。
（１）細胞を含む液にキレート剤、界面活性剤又はクロロホルムを添加する方法
（２）細胞を凍結融解することで内膜を傷つける方法
（３）低浸透圧にする方法
　細胞を含む液としては、例えば、培養液をそのまま用いてもよく、遠心等により細胞を濃縮・懸濁した液を用いてもよい。
　キレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、及びＳＤＳ等が挙げられる。細胞を含む液に、例えば、ＥＤＴＡ及びＴｒｉｔｏｎの混合溶液を用いてもよい。キレート剤、界面活性剤及びクロロホルムの添加量は、細胞の内膜を傷つける濃度であれば特に制限されず、適宜調整することができる。
　細胞を凍結融解する方法は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、－２０℃で凍結した後に３７℃で融解する方法が挙げられる。凍結融解は一回行ってもよく、複数回繰り返し行ってもよい。
　低浸透圧にする方法は、当業者に公知の方法により行うことができる。低浸透圧は、例えば、培養液を（１０倍に）希釈する、遠心の後に水に懸濁する等の方法であってよい。
 
　上記組換え細胞を破砕する工程の他の構成については、核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞に関して上述したとおりである。
［目的タンパク質の製造方法］
　一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、核酸分解能を有するポリペプチド、細菌溶解活性を有するポリペプチド及び目的タンパク質を発現する組換え細胞に、物理的又は化学的な外部刺激を与えることにより、組換え細胞を溶解する工程、並びに目的タンパク質を回収する工程を含む。ここで、核酸分解能を有するポリペプチドは膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む。
（組換え細胞を溶解する工程）
　組換え細胞を溶解する工程は、核酸分解能を有するポリペプチド、細菌溶解活性を有するポリペプチド及び目的タンパク質を発現している組換え細胞に、物理的又は化学的な外部刺激を与えることを含む。細菌溶解活性を有するポリペプチドは組換え細胞の細胞質において発現する。物理的又は化学的な外部刺激を組換え細胞に与えることで、組換え細胞の内膜に傷がつき、細菌溶解活性を有するポリペプチドが内膜外に漏出し、上記ポリペプチドの細菌溶解活性により組換え細胞の溶解（自己溶菌）が引き起こされる。細菌溶解活性を有するポリペプチドがペリプラズムに漏出し、自己溶菌が引き起こされることが好ましい。また、組換え細胞の溶解は、目的タンパク質が所望の量得られたタイミングで行われることが望ましい。
　細胞が溶解しているか否かは、例えば、溶菌処理の前後で乾燥菌体重量（ｄｒｙ　ｃｅｌｌ　ｗｅｉｇｈｔ、ＤＣＷ）が減少している場合に細胞が溶解していると判断することができる。また、粒子径が減少している場合に細胞が溶解していると判断することもできる。
（目的タンパク質を回収する工程）
　目的タンパク質を回収する方法は、通常用いられている方法で行うことができる。目的とするタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、組換え細胞が溶解した溶解液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用することで、精製標品を得ることができる。
　上記クロマトグラフィーとしては、フェニル－トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ－トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ－１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。
　また、目的とするタンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に組換え細胞が溶解した無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる沈殿画分として目的とするタンパク質の不溶体を回収することができる。回収した目的とするタンパク質の不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により目的とするタンパク質の精製標品を得ることができる。
　また、培養上清から目的とするタンパク質を回収することもできる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　上記目的タンパク質の製造方法の他の構成については、核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞及び組換え細胞を破砕する方法に関して上述したとおりである。
［実施例１］
　ＣＺモジュール（Ｐ３プロモーター－ＲＲｚＲｚ１－ｅｎｄＡ）をＢＬ２１　ｓｔａｒ（ＤＥ３）株に導入して作製したＣＺ１を、核酸分解酵素発現ベクターで形質転換した（ＣＺ１　ＢＬ２１　ｐＳＡｏｍｐＡ２ｎｕｃＳ）。また、比較として、ｎｕｃＳに代えて、ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃに発現するｍＲＦＰ１を用いた発現ベクターで形質転換した株も作製した（ＣＺ１　ＢＬ２１　ｐＳＡｏｍｐＡ１ｍＲＦＰ１）。各発現ベクターの詳細を以下に示す。
＜核酸分解酵素発現ベクター＞
　本実施例では、核酸分解酵素としてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌由来のｎｕｃＳの構造遺伝子を用い、大腸菌ｏｍｐＡ遺伝子由来のシグナルペプチドを融合した分泌型タンパク質が、構成的プロモーターによって転写させる遺伝子を構築した。
　具体的には、ｐＳＡｕｍ（ｐＳＣ１０１　ｏｒｉ　アンピシリン耐性プラスミド）を骨格とし、大腸菌ｏｍｐＡのシグナルペプチド部分と、人工合成したｎｕｃＳの構造遺伝子をＰＣＲによって増幅、単離し、Ｇｉｂｓｏｎ　ａｓｓｅｍｂｌｙ法によって結合した。これをｐＳＣ１０１由来プラスミドに導入して核酸分解酵素発現ベクターを作製した。（図１）
（核酸分解酵素発現ベクターに関連する遺伝子情報）
構成的プロモーター（Ｐ３）：
aaaaaatttatttgcttattaatcatccggctcgtataatgtgtgga（配列番号７）
ｏｍｐＡシグナルペプチド：
atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcc（配列番号８）
ｎｕｃＳ（ｃｏｒｅ）：
gcacttcctacacccgtgtcggccgctactgctaggggatatttggcttcattgaaggtagcaccagagaatagaacagggtataaacgggatctttttccccactggataacccaatccgggacctgcaataccagggagacggtactgaagagggatggaactaatgttgttacagatgctgcgtgcgcagccacttcgggttcgtggtactccccttttgatggggccacatggacggctgcatcagacgtagacatcgaccatcttgttccgttggcggaggcgtgggattcaggcgcgtcagcctggactaccgctcaacgacaggcctttgcgaacgatctaactagaccacagttactcgctgtcacagatacagtaaatcagtctaaaggagataaggaccctgctgagtggatgcccccgagggcggcctatcactgcacgtatgtaagagcatgggtacaagtcaagtactactatgggctatcggtggacaccgccgagaaaactgccctaacgaatcgtcttgctggttgttaa（配列番号９）
＜ｍＲＦＰ１発現ベクター＞
　上記核酸分解酵素発現ベクターと同様にｍＲＦＰ１発現ベクターを作製した（図２）。
（ｍＲＦＰ１発現ベクターに関連する遺伝子情報）
構成的プロモーター（Ｐ３）：
aaaaaatttatttgcttattaatcatccggctcgtataatgtgtgga（配列番号１０）
ｏｍｐＡシグナルペプチド：
atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcc（配列番号１１）
ｍＲＦＰ１：
gcttcctccgaagacgttatcaaagagttcatgcgtttcaaagttcgtatggaaggttccgttaacggtcacgagttcgaaatcgaaggtgaaggtgaaggtcgtccgtacgaaggtacccagaccgctaaactgaaagttaccaaaggtggtccgctgccgttcgcttgggacatcctgtccccgcagttccagtacggttccaaagcttacgttaaacacccggctgacatcccggactacctgaaactgtccttcccggaaggtttcaaatgggaacgtgttatgaacttcgaagacggtggtgttgttaccgttacccaggactcctccctgcaagacggtgagttcatctacaaagttaaactgcgtggtaccaacttcccgtccgacggtccggttatgcagaaaaaaaccatgggttgggaagcttccaccgaacgtatgtacccggaagacggtgctctgaaaggtgaaatcaaaatgcgtctgaaactgaaagacggtggtcactacgacgctgaagttaaaaccacctacatggctaaaaaaccggttcagctgccgggtgcttacaaaaccgacatcaaactggacatcacctcccacaacgaagactacaccatcgttgaacagtacgaacgtgctgaaggtcgtcactccaccggtgcttaa（配列番号１２）
　下記のように、溶菌における核酸分解酵素の効果を検討した。
　上記形質転換株を培養したＬＢ培養液を０．１ｍＬとり、１５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。遠心後のペレットを０．０１ｍＬのｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．５，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　ＫＣｌ）に懸濁した。懸濁液にクロロホルムを一滴加えた後、３７度で０、５、１０及び２０分間インキュベートした。０．１ｍＬのＴＥ＋０．０９％　ＳＤＳ、５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．００５％　ＢＰＢを加えて反応を停止させた。０．０１ｍＬをアガロースゲル（０．７％／ＴＡＥ）を用いて電気泳動した後、ＥｔＢｒ染色によりバンドを確認した。
　結果を図３に示す。左から１～４番目のレーンはＣＺ１　ＢＬ２１　ｐＳＡｏｍｐＡ２ｎｕｃＳのサンプル（ＮｕｃＳ）、左から５～８のレーンはＣＺ１　ＢＬ２１　ｐＳＡｏｍｐＡ１ｍＲＦＰ１のサンプル（コントロール）を示す。０、５、１０、２０（分）はそれぞれクロロホルムを加えた後のインキュベート時間を示す。クロロホルムを加えて５分間及び１０分間インキュベートしたＮｕｃＳのサンプルは、同時間インキュベートしたコントロールのサンプルと比較して、より多くの核酸が分解されていることが示された。
［実施例２］
＜ペプチドグリカン分解酵素（エンドリシン）発現ベクター＞
　本実施例では、ペプチドグリカン分解酵素としてλファージのＲを、ヌクレアーゼとして大腸菌のｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ（ｅｎｄＡ遺伝子がコードする、配列番号２）を用いた。Ｒを細胞質、ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉをペリプラズムでそれぞれ発現させることで、内膜により、それぞれのターゲットであるペプチドグリカン及び染色体ＤＮＡから隔てられた状態となる。具体的なコンストラクトは図４に示す。Ｒｚ（ｉ－ｓｐａｎｉｎ）及びＲｚ１（ｏ－ｓｐａｎｉｎ）は内膜及び外膜にアンカーされるλファージの溶菌因子であり、Ｒのみを発現した場合よりも溶菌が促進される。溶菌モジュールは［転写プロモーター］－Ｒ－Ｒｚ－Ｒｚ１というカセットを構成的プロモーター（Ｐ３プロモーター）の下流に組み込んで作製した。マーカーとしてカナマイシンを連結し、ゲノムに挿入した後は部位特異的組み換えによってマーカーのみを除去できるよう、マーカーの両端にＦＬＰリコンビナーゼによって認識されるＦＲＴ配列を挿入した。
　上記カセットの両端に大腸菌ゲノムと相同の配列を持たせ、ゲノム上のｅｎｄＡ遺伝子のプロモーターと構造遺伝子の間に、相同組み換えによってこのカセットを挿入することで、溶菌モジュールとペリプラズムにおいて発現する核酸分解酵素が、上記プロモーターによって制御される株を構築した。上記構造はＢＷ２５１１３株で最初に構築した後、ＢＬ２１　ｓｔａｒ（ＤＥ３）にＰ１　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎで導入した。
　プロモーターとして構成的プロモーター（Ｐ３プロモーター）を、耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を用いたコンストラクトを配列１に示した。
　（配列１に関連する遺伝子情報）
Ｐ３プロモーター：aaaaaatttatttgcttattaatcatccggctcgtataatgtgtgga（配列番号３）
Ｒ：Atggtagaaatcaataatcaacgtaaggcgttcctcgatatgctggcgtggtcggagggaactgataacggacgtcagaaaaccagaaatcatggttatgacgtcattgtaggcggagagctatttactgattactccgatcaccctcgcaaacttgtcacgctaaacccaaaactcaaatcaacaggcgccggacgctaccagcttctttcccgttggtgggatgcctaccgcaagcagcttggcctgaaagacttctctccgaaaagtcaggacgctgtggcattgcagcagattaaggagcgtggcgctttacctatgattgatcgtggtgatatccgtcaggcaatcgaccgttgcagcaatatctgggcttcactgccgggcgctggttatggtcagttcgagcataaggctgacagcctgattgcaaaattcaaagaagcgggcggaacggtcagagagattgatgtatga（配列番号４）
Ｒｚ：Atgagcagagtcaccgcgattatctccgctctggttatctgcatcatcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgtgataacgccattacctacaaagcccagcgcgacaaaaatgccagagaactgaagctggcgaacgcggcaattactgacatgcagatgcgtcagcgtgatgttgctgcgctcgatgcaaaatacacgaaggagttagctgatgctaaagctgaaaatgatgctctgcgtgatgatgttgccgctggtcgtcgtcggttgcacatcaaagcagtctgtcagtcagtgcgtgaagccaccaccgcctccggcgtggataatgcagcctccccccgactggcagacaccgctgaacgggattatttcaccctcagagagaggctgatcactatgcaaaaacaactggaaggaacccagaagtatattaatgagcagtgcagatag（配列番号５）
Ｒｚ１： atgctaaagctgaaaatgatgctctgcgtgatgatgttgccgctggtcgtcgtcggttgcacatcaaagcagtctgtcagtcagtgcgtgaagccaccaccgcctccggcgtggataatgcagcctccccccgactggcagacaccgctgaacgggattatttcaccctcagagagaggctga（配列番号６）
＜目的タンパク質発現カセットの導入＞
　上記のペプチドグリカン分解酵素発現ベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１　ｓｔａｒ（ＤＥ３）におけるｍａｎＸ遺伝子を、Ｔ７プロモーター下流にスパイダーシルクタンパク質（Ｓｐｉｄｅｒ　Ｓｉｌｋ　Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＳＰ、配列番号１）遺伝子を結合したＳＳＰ発現カセットと置き換えた。
＜目的タンパク質の生産及び溶菌＞
　上述のように、ＢＬ２１　ｓｔａｒ（ＤＥ３）株をベースとしたＧ１１株を作製した。Ｇ１１株は、図４のコンストラクトに配列１を含んでいる。
　上記形質転換大腸菌Ｇ１１株を、２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで約１５時間のフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加して形質転換大腸菌を植菌した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養の間、培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を０.１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持しながら、培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、ＳＳＰ（目的のタンパク質）を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２４時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後２４時間の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドを定量し、目的とするタンパク質の発現を確認した。
　誘導２４時間後におけるコントロール（他の株と同様のＳＳＰを発現するが、ペプチドグリカン分解酵素を発現するベクターは導入されていない）のＳＳＰの生産量（ｇ／Ｌ）を１００％とした場合の、Ｇ１１株の誘導０時間後及び誘導２４時間後における生産性（％）を算出した。結果を図５に示す。Ｇ１１株の誘導２４時間後におけるタンパク質の生産性はコントロールと比較して低下しておらず、溶菌モジュールの存在により、目的タンパク質の生産が悪影響を受けないことが分かった。
（外部刺激）
　回収した培養液を遠心処理した後、上清を捨てて、所定の濃度にした試薬溶液を加え、菌体ペレットを懸濁した。この際、元の体積になるように試薬溶液を加えている。外部刺激としては、終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ及び１００ｍＭ　ＥＤＴＡの混合溶液を用い、反応のため３時間放置した。また、ホモジェナイザー処理は６０ＭＰａの圧力で行なった。
（溶菌の確認）
　菌体の溶菌の確認は、乾燥菌体重量（ｄｒｙ　ｃｅｌｌ　ｗｅｉｇｈｔ、ＤＣＷ）の増減に基づき判断した。基準となるコントロール株（他の株と同様のＳＳＰを発現するが、ペプチドグリカン分解酵素を発現するベクターは導入されていない）を用意して、溶菌処理の前後でＤＣＷがコントロール株よりも減少していることを溶菌の指標とした。また、粒子径を測定することで溶菌の程度を確認した。粒子は、細胞及び細胞残渣若しくは断片を含み得る。
　ＤＣＷは具体的には以下のように求めた。５ｍＬ分の菌体が懸濁されたサンプル溶液を回収し、遠心（２０℃、３，０００ｇ、１５分）した後、上清を捨てた。５ｍＬの０．９％　ＮａＣｌを菌体ペレットに加えて、懸濁し、同条件で遠心した。再び上清を除いた菌体ペレットを凍結後、凍結乾燥機により７２時間乾燥させた。これを精密電子天秤により計量し、事前に計量した容器の重さを除くことで乾燥菌体重量［ｇ／Ｌ］を求めた。ＤＣＷはＳＳＰの生産量も反映されるため、ＳＳＰの量を除いたＤＣＷで株間の溶菌の程度を評価した。
　培養終了後（誘導２４時間後）の菌体溶液のＤＣＷを基準として、それに対する各処理後のＤＣＷの割合を算出した。結果を図６に示す。
　また、各処理後の粒子径を測定した結果を図７に示す。横軸は粒子径であり、縦軸はある粒子径の集団が全粒子体積に占める割合を示す。０．６５μｍ以下でグラフが切れているのは測定下限値に由来する。
　上記ＤＣＷ及び細胞系の結果から、ＥＤＴＡ及びＴｒｉｔｏｎの混合溶液を用いた場合には、コントロール株をホモジェナイザーで処理した場合と同程度か、それ以上の効果が得られることが示された。

Claims (12)

  1. 　核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞であって、
    前記核酸分解能を有するポリペプチドが、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む、組換え細胞。
  2. 　前記組換え細胞が、
    　前記核酸分解能を有するポリペプチドを発現させるための発現カセットを導入したものであるか、又は
    　宿主細胞のゲノムに存在する前記核酸分解能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流にプロモーター配列を導入したものである、請求項１に記載の組換え細胞。
  3. 　前記核酸分解能を有するポリペプチドがデオキシリボヌクレアーゼである、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
  4. 　さらに、細菌溶解活性を有するポリペプチドを発現する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  5. 　さらに、目的タンパク質を発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  6. 　核酸分解能を有するポリペプチドを発現する組換え細胞に、物理的又は化学的な外部刺激を与えることにより、前記組換え細胞を破砕する工程を含み、
    　前記核酸分解能を有するポリペプチドが、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む、
    組換え細胞を破砕する方法。
  7. 　前記組換え細胞が、さらに細菌溶解活性を有するポリペプチドを発現し、前記組換え細胞の破砕が、溶解による自己破砕である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記核酸分解能を有するポリペプチドがデオキシリボヌクレアーゼである、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　前記細菌溶解活性を有するポリペプチドがペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
  10. 　核酸分解能を有するポリペプチド、細菌溶解活性を有するポリペプチド及び目的タンパク質を発現する組換え細胞に、物理的又は化学的な外部刺激を与えることにより、前記組換え細胞を溶解する工程、並びに
    　前記目的タンパク質を回収する工程を含み、
    　前記核酸分解能を有するポリペプチドが、膜通過シグナル配列又は内膜結合配列を含む、
    目的タンパク質の製造方法。
  11. 　前記核酸分解能を有するポリペプチドがデオキシリボヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記細菌溶解活性を有するポリペプチドがペプチドグリカン分解能を有するポリペプチドである、請求項１０又は１１に記載の方法。
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