JP2002509714A

JP2002509714A - 生体適合材料の製造のための微生物株およびプロセス

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Publication number: JP2002509714A
Application number: JP2000541277A
Authority: JP
Inventors: グジャルトダブリュー．ハイスマン，; ローラボイントン，; ダニエルエム．ホロウィッツ，; ティルマンユー．ジャーングロス，; オリバーピー．ピープルズ，
Original assignee: メタボリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-03-30
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2002-04-02
Anticipated expiration: 2019-03-30
Also published as: MXPA00009561A; US8748139B2; CA2325350A1; AU752620B2; AU3215799A; US8728778B2; US20090226962A1; EP1068294A1; ATE386102T1; EP1068294B1; JP4298165B2; US20040014197A1; DE69938127T2; DE69938127D1; CA2325350C; WO1999050389A1

Abstract

(57)【要約】ＤＮＡ構築物およびこれらのＤＮＡ構築物を使用して構築した遺伝的に操作された微生物株を提供する。この微生物株は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡに特異性を有するヌクレアーゼ酵素を産生する。これらの株は、ペリプラズムまたは増殖培地中に、ポリマーの生産性および／または回収率を増強するために有効な量のヌクレアーゼを分泌し、そして特に、高い細胞密度の発酵プロセスにおける使用に適している。これらの構築物は、細胞内タンパク質のようなポリマー（例えば、酵素、増殖因子、およびサイトカイン）のための産生プロセスおよび回収プロセスを改善するための微生物株を改変するために；ポリヒドロキシアルカノエートを産生するために；ならびに細胞外ポリサッカリド（例えば、キサンタンガム、アルギネート、ジェランガム、ゾーグラン、ヒアルロン酸、および微生物セルロース）を産生するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願に対する相互参照）優先権は、１９９８年３月３０日に出願された、米国仮出願番号第６０／０７
９，９３８号に対して請求される。

【０００２】（発明の背景）本発明は、一般的に、細胞内タンパク質、ポリヒドロキシアルカノエート材料
、および細胞外ポリサッカリドのようなポリマーの増強した産生および回収率の
ための、遺伝的に操作された細菌系の分野にある。

【０００３】微生物発酵は、抗生物質、有機酸、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ポリマ
ー（例えば、ポリヒドロキシアルカノエート）、およびポリサッカリドを含む、
大量の薬学的産物および産業的産物の製造に使用される（Ａｔｋｉｎｓｏｎおよ
びＭａｖｉｔｕｎａ、「ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａ
ｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＨａｎｄｂｏｏｋ」第２版（Ｓｔｏｃｋｔ
ｏｎＰｒｅｓｓ、ＵＳＡ１９９１））。より高度に精製された産物の生産性
および回収率の増加は、収益性を増加するための開発の主な領域である。多くの
これらの産物に関して、産業の傾向は一般的に、生産性を増加するための、より
高い細胞密度の発酵を指向している。１００ｇ／Ｌを越える細胞密度が慣用的に
達成される。細胞バイオマスからの、（またはいくつかの場合においては培地か
らの）産物の回収率を増加することによる発酵プロセスの費用全体の減少が、生
産性を増加する別の手段である。

【０００４】ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、産業的および生物医学的適用の
広い範囲で、再生可能な供給源から産生される、生分解性および生体適合性の熱
可塑性材料である（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ
２６：３８〜４４（１９９６））。多くの細菌株および発酵プロセスは、例え
ば、以下に記載されるように、ＰＨＡの産生について記載されている：Ｌｅｅお
よびＣｈａｎｇ、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５２：２７〜５８（１９９５）
；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：１４２〜５０（１
９９５）；Ｄｏｉ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８：５８５〜９９（１９９
５）。特定の細菌株を使用するＰＨＡ産生方法は、Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第
４，４７７，６５４号、Ｂｙｒｏｍの同第５，３６４，７７８号、およびＳｅｎ
ｉｏｒらの同第５，２６６、４７０号（炭水化物からのＲａｌｓｔｏｎｉａｅ
ｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を使
用する）；Ａｋｉｙａｍａらの米国特許第５，３４６，８１７号（脂肪酸上で増
殖するＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ株を使用する）；Ｐｏｗｅｌｌら
の米国特許第４，３３６，３３４号（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｏｒ
ｇａｎｏｐｈｉｌｕｍを使用する）；Ｇｒｏｌｅａｕらの米国特許第５，３０２
，５２５号および同第５，４３４，０６２号（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓを使用する）；Ｓｈｉｏｔａｎｉらの米国特許第５，
２９２，８６０号（脂肪酸上で増殖するＡｅｒｏｍｏｎａｓ株を使用する）；Ｐ
ａｇｅらの米国特許第５，０５９，５３６号および同第５，０９６，８１９号（
Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを使用する）；Ｌａｆｆｅｒｔ
ｙの米国特許第４，７８６，５９８号（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓを
使用する）；Ｗｉｔｈｏｌｔらの米国特許第５，３４４，７６９号およびＳｈｉ
ｏｔａｎｉらの同第５，２９０，９１０号、ＰＣＴＷＯ９２／１８５５３およ
びＰＣＴＷＯ９２／２１７０８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａを使
用する）；Ｐｅｏｐｌｅｓらの米国特許第５，２４５，０２３号、Ｄｅｎｎｉｓ
の同第５，３３４，５２０号、Ｄｅｎｎｉｓらの同第５，３７１，００２号、Ｄ
ｅｎｎｉｓの同第５，５１２，４５６号、Ｄｅｎｎｉｓらの同第５，５１８，９
０７号、ならびにＰｅｏｐｌｅｓらの同第５，６６３，０６３号（トランスジェ
ニックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉを使用する）。

【０００５】ＰＨＡは、分散した顆粒の封入体（これは、天然においてアモルファスである
が、水に不溶性である）として微生物細胞の内側に蓄積する。発酵後の細胞から
のＰＨＡの回収は、以下を含む任意のいくつかの方法によって達成され得る：（
１）溶媒抽出；（２）次亜塩素酸塩、過酸化水素またはオゾン処理を使用する全
ての非ＰＨＡバイオマスの化学的破壊；ならびに（３）細胞破壊、酵素処理、お
よび洗浄を含む緩和なプロセス化。後者のプロセスの場合、アモルファス状態に
おいてＰＨＡ顆粒を保持すること、および洗浄した顆粒懸濁液をラテックスとし
て使用することが可能である。水性プロセスを使用して細胞からＰＨＡラテック
スを得るために、ＰＨＡ含有細胞を溶解することが必要である。溶解物の粘稠性
を低減するための試みがなされている。例えば、Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４
，９１０，１４５号は、細菌性バイオマスからのＰＨＡの抽出のための水性プロ
セスを記載する。このプロセスは、溶解物の粘稠性を低減するために１５０℃で
の熱処理工程を用いる。ＰＣＴＷＯ９４／２４３０２およびＰＣＴＷＯ９４
／１０２８９は、粘稠性を低減するための手段として、核酸を分解するための過
酸化水素処理の使用を教示する。粘稠性を低減し、そしてさらにプロセス化を増
強するための細胞溶解物へのヌクレアーゼの添加もまた、一般に公知である。し
かし、このアプローチは、あまりにも高価であり、高い細胞密度の発酵を含む商
品発酵産物のために使用できない。

【０００６】発酵プロセスは、酵素および他の生物活性タンパク質の製造のために、広範に
使用される。多くの場合において、回収率は、核酸を分解するために粗細胞溶解
物へヌクレアーゼを添加することによって改善され得る。有利には、このアプロ
ーチはまた、完全にＤＮＡを分解し、これは、抗生物質耐性マーカーまたは他の
遺伝的エレメントの潜在的な展開を効果的に排除する。しかし、ＰＨＡの場合に
おけるように、外因性ヌクレアーゼ添加のプロセスは、高価である。

【０００７】微生物のポリサッカリドは、多くの異なる微生物の発酵によって産生される（
Ｄｅｌｅｓｔ，Ｐ．１９８９、３０１〜３１３頁、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉ
ｄｅｓｉｎＧｕｍｓａｎｄＳｔａｂｉｌｉｓｅｒｓｆｏｒｔｈｅ
ＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ５、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｏ．、Ｗｅｄｌｏｃ
ｋ，Ｄ．Ｊ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ａ．編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ（Ｏｘ
ｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。例えば、
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ株は、キサンタンガムの産生のために商業的に使用され
（ＫｅｎｎｅｄｙおよびＢｒａｄｓｈａｗ、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．１９：３１９〜７１（１９８４））、そして遺伝子操作技術に供されてい
る（ＨａｓｓｌｅｒおよびＤｏｈｅｒｔｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．
６：１８２〜８７（１９９０））。この発酵および類似の発酵の間、培地の粘稠
性は、細胞外ポリサッカリドが産生されるので、劇的に増加する。発酵槽中で良
好に混合することに従って、および発酵槽中で良好に混合することを達成するた
めに、撹拌機は、さらなるエネルギーを必要とする。得られた増加した剪断は、
培地へ核酸を放出するいくつかの細胞溶解物を生じ得る。この核酸は、取り除く
ことが困難であり、そしてクロマトグラフィー、結晶化、沈澱、遠心分離、およ
び濾過のような分離プロセスの効率を低減する有意な産物の質の問題（特に生物
医学の適用におけるポリサッカリドの使用における）を提示する。

【０００８】従って、本発明の目的は、発酵プロセスを使用して産物および回収の改善した
方法（特にポリヒドロキシアルカノエート、ポリサッカリド、ならびに他の細胞
内成分および細胞外成分の高い細胞密度を使用する方法）を提供することである
。

【０００９】本発明の別の目的は、発酵プロセスの使用のための改良された微生物株、特に
細胞溶解物または高い細胞密度を生じる、すなわち高い粘稠性を生じる株を提供
することである。

【００１０】（発明の要旨）ＤＮＡ構築物およびこれらのＤＮＡ構築物を使用して構築した遺伝的に操作さ
れた微生物株を、開発した。この微生物株は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡに特
異的な異種ヌクレアーゼ酵素もしくは改変した同種ヌクレアーゼ酵素を産生する
。異種ヌクレアーゼは、別の生物から獲得され得、変異した同じ株において酵素
活性または同種ヌクレアーゼを増加するために操作され得、次いで、増強した活
性を有するヌクレアーゼを発現する細菌を選択するためのヌクレアーゼ活性につ
いてのアッセイを使用して選択され得る。これらの株は、ペリプラズムまたは増
殖培地中へポリマーの回収率を増強するために有効な量のヌクレアーゼを分泌し
、そして特に、高い細胞密度の発酵プロセスにおける使用に適している。例示的
なポリマーとしては、細胞内タンパク質（例えば、酵素、増殖因子、およびサイ
トカイン）；ポリヒドロキシアルカノエート；ならびにポリサッカリド（例えば
、キサンタンガム、アルギネート、ジェランガム、ゾーグラン（ｚｏｏｇｌａｎ
）、ヒアルロン酸、および微生物セルロースが挙げられる。

【００１１】（発明の詳細な説明）発酵プロセスおよび発酵プロセスの間にヌクレアーゼを分泌する株を用いるこ
とによる微生物発酵産物の回収プロセスを改善する方法が示されている。ここで
、このヌクレアーゼ自体は所望の発酵産物ではない。この方法において有用なヌ
クレアーゼを分泌する株を遺伝子操作する方法を開示する。１つの実施態様にお
いて、適切なヌクレアーゼを発現しない株は、遺伝子操作されて、所望のプロセ
ス改善を得るに十分な活性を有する異種ヌクレアーゼを発現する。第２の実施態
様において、ヌクレアーゼを発現するが、所望のプロセス改善を得るには不十分
な活性でヌクレアーゼを発現する株を遺伝的に改変して、その株から単離された
ヌクレアーゼ遺伝子および本明細書中に記載の方法を使用して、十分なヌクレア
ーゼを発現させる。第３の実施態様において、異種または同種のヌクレアーゼ遺
伝子から適切なヌクレアーゼを発現する株を変異させ、そして変異体は、所望の
プロセス改善を得るために選択された十分なレベルのヌクレアーゼを発現する。

【００１２】（定義）用語「増強」とは、発酵の間に細胞溶解によって放出される核酸が、粘稠性が
増加することを防ぐ量でヌクレアーゼによって分解される、改善した発酵プロセ
スをいう。粘稠性の増加は、発泡、不十分な混合、および混合に必要なより大き
なエネルギーを生じ得る。用語、増強される（増強された）とはまた、改善され
た回収プロセスをいい、ここで、所望の産物が細胞内で生成され、そして回収の
ために細胞溶解が必要であるプロセスにおいて、発酵の間に細胞溶解によって放
出された核酸が、粘稠性の増加を防ぐ量で細胞溶解工程の後に分解され、そして
遠心濾過、沈澱などを包含し得る回収工程を容易にする。

【００１３】語句「異種ヌクレアーゼ遺伝子」とは、改善される株以外の宿主から単離され
たヌクレアーゼ遺伝子をいう。

【００１４】語句「同種ヌクレアーゼ遺伝子」とは、改善される宿主から単離されたヌクレ
アーゼ遺伝子をいう。この遺伝子は、さらに改変されて、ヌクレアーゼの活性が
改善され得る。

【００１５】（ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼをコードする遺伝子）本明細書中に記載の方法において使用するために適切であるヌクレアーゼおよ
びヌクレアーゼをコードする遺伝子は、多くの供給源から得られ得る。本明細書
中で使用される場合「異種」ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼをコードする核酸か
ら発現され、ここで、このヌクレアーゼは、ポリマー生成および／または回収を
増強するように挿入される生物以外の生物から得られ、またはここで、この生物
は、増強したヌクレアーゼ活性について変異され、そしてスクリーニングされる
。増強したヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼの量またはヌクレアーゼの比活性
または基質特異性が増加される場合に得られ得る。

【００１６】ヌクレアーゼは、広範囲の微生物によって分泌され、そして対応する遺伝子の
いくつかがクローニングされ、そして特徴づけられた。ヌクレアーゼ遺伝子の供
給源としては、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１９４９
５）、ＡｎａｂａｅｎａＰＣＣ７１２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６４７０
６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６６４
８０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈｙｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番
号Ｌ２３９７３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ（
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６７６７８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５５８１８）、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ
（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３０４７１）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ００
０８３３）、および、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６７５８４）が挙げられる。

【００１７】好ましくは、ヌクレアーゼは、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（
ＤＮＡ）の両方を切断する。このヌクレアーゼは、好ましくは、広い温度範囲お
よび広いｐＨ範囲にわたって活性である。このヌクレアーゼはまた、好ましくは
、プロセシング添加剤（例えば、塩、界面活性剤、および安定化剤）の存在に寛
容性である。細胞溶解およびこのヌクレアーゼが核酸を分解するインキュベーシ
ョン期間後に、このヌクレアーゼは、例えば、プロテアーゼ消化、クロマトグラ
フィー、濾過または遠心分離によって容易に取り出し可能であることが好ましい
。

【００１８】例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌヌクレアーゼ［（デオキシ）リボヌクレエー
ト（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｔｅ）−３’−ヌクレオチドヒドロラーゼ、ＥＣ３．
１．４．７］は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいず
れかを加水分解して、３’−ホスホモノヌクレオチドおよびホスホジヌクレオチ
ドを生成する。この酵素は約ｐＨ０．１〜１０の間で安定であり、最大活性は、
０．１〜１００ｍＭＣａ²⁺イオンの存在下で約ｐＨ９〜１０である。この酵素
をコードする遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓから単離
され、そして特徴づけられた（Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｇｅｎｅ２２：１８１−８９
（１９８３））。そしてこの遺伝子は、多くの異種細菌において機能的に発現さ
れる（Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｇｅｎｅ２２：１８１−８９（１９８３）；Ｍｅｉｌ
ｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：３５０８−１４（１９８７）；Ｌ
ｉｅｂｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：１８５４−６１（１９９２）；
ＬｅＬｏｉｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５１３５−３９（１９９６
））。

【００１９】Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来の細胞外ヌクレアーゼは、ＢＥ
ＮＺＯＮＡＳＥ^TM（ＡｍｅｒｉｃａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍ
ｉｃａｌＩｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を含む、ＮｙｃｏｍｅｄＰｈａｒ
ｍａＡ／Ｓおよびその提携会社）として市販の組換え系において生成される。
この酵素をコードする遺伝子もまた、特徴づけられた（Ａｈｒｅｎｈｏｌｔｚら
、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６０：３７４６−５１（１９９４））。

【００２０】（微生物株を操作する方法）一旦選択されたヌクレアーゼ酵素をコードするヌクレアーゼ遺伝子が単離され
、そして特徴づけられると、この生物がペリプラズムまたは増殖培地へヌクレア
ーゼを分泌するように微生物株へ組み込まれる。

【００２１】好ましい実施態様において、短鎖長ＰＨＡの生成のための微生物株（Ｒ．ｅｕ
ｔｒｏｐｈａ、Ｅ．ｃｏｌｉ）または中間鎖長ＰＨＡの生成のための微生物株（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＭＢＸ９７８およびＰ．ｐｕｔｉｄａ）は、ヌ
クレアーゼ遺伝子（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ遺伝子）をＰＨＡ生
成株の染色体に組み込むことによって生成される。例えば、ヌクレアーゼをコー
ドする遺伝子は、ヌクレアーゼをコードするｎｕｃ遺伝子を認識するオリゴヌク
レオチドとのポリメラーゼ連鎖反応を用いる増殖によってＳ．ａｕｒｅｕｓから
単離され得る。ＰＣＲ後に、増幅されたＤＮＡはＰＣＲクローニングベクターｐ
ＣＲ２．１（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）
へクローニングされ得る。ヌクレアーゼ遺伝子挿入物を含むプラスミドは、ＤＮ
Ａｓｅ寒天プレート（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ
ＭＩ）を使用するヌクレアーゼの発現のために同定され、そして分析され得る
。

【００２２】いくつかの手段は、ヌクレアーゼ遺伝子の発現のために選択されたＰＨＡ生成
株へヌクレアーゼ遺伝子を移入するために利用可能である。例えば、Ｒａｌｓｔ
ｏｎｉａへの移入のために、遺伝子はＲａｌｓｔｏｎｉａプロモーターの制御下
におかれ得、そして広い宿主範囲のクローニングベクター（例えば、ｐＬＡＦＲ
３）へ挿入され得る。Ｒａｌｓｔｏｎｉａにおける発現を達成するためのプロモ
ーターおよび方法は、ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．（１９８９）ならびにＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６２，１５２９
８−１５３０３（１９８９）において見出され得る。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｚ
ｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｍｅｔ
ｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＺｏｏｇｌｏｅａのような属に由来する細菌は、
広い宿主範囲のクローニングベクターを用いる類似のアプローチに従い得る。

【００２３】あるいは、発現カセットは、適切な宿主の染色体に組み込まれ得、そして発現
され得るように、ヌクレアーゼについて操作され得る。適切な発現カセットは、
例えば、Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６７
（１９９０）に記載される。ヌクレアーゼ遺伝子およびマーカー遺伝子（例えば
、抗生物質耐性を与える遺伝子）は、ベクター（例えば、ｐＵＴおよびｐＬＯＦ
シリーズ）におけるトランスポザーゼの認識配列の間にクローニングされる（Ｈ
ｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６７（１９９０
））。ｐＵＴプラスミドが使用される場合、転写調節配列は、トランスポザーゼ
の認識配列の間に供給される必要はないが、ｐＬＯＦシリーズでは、これらの調
節配列は、トランスポザーゼの認識配列の間の領域内に存在するべきである。ｐ
ＵＴおよびｐＬＯＦプラスミドは、λ ｐｉｒリゾゲンの存在のために、このプ
ラスミドを複製させるＥ．ｃｏｌｉ株中でのみ維持され得る。ヌクレアーゼ−マ
ーカー構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉ λ ｐｉｒ株の接合またはプラスミドＤＮＡを
用いる形質転換もしくはエレクトロポレーションによって細菌細胞へ導入される
。λ ｐｉｒの非存在下では、このプラスミドは細胞から喪失される。特定の頻
度で、トランスポザーゼ認識配列に囲まれ、そしてトランスポザーゼ認識配列を
含むＤＮＡフラグメントは、染色体に移入される。この事象が生じる細胞は、接
合体、形質転換またはエレクトロポレーション混合物を構築物によって耐性が付
与される抗生物質を含有する固体増殖培地にプレートすることによる選択によっ
て単離され得る。次いで、この培地上で増殖する細胞のコロニーを、インビボま
たはインビトロでのヌクレアーゼ活性についてスクリーニングする。インビボ活
性は、１ＮＨＣｌまたはメチルグリーン（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，ＤｅｔｒｏｉｔＭＩ）を用いる可視化を用いてＤＮａｓｅ試験寒天プレ
ート上で推定ヌクレアーゼプロデューサーをプレートすることによって試験され
得る。インビトロ活性は、高分子量ＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡ）でクロロホ
ルム処理した細胞の培養培地または水性上清をインキュベートし、次いで、ｐＨ
緩衝化アガロースゲル上でのＤＮＡの分離によって決定され得る。

【００２４】これらの操作された細胞株の利用性は、野生型およびヌクレアーゼ成分を使用
する発酵および下流プロセスの結果を比較することによって容易に評価される。

【００２５】（操作された株を使用する方法）操作された株は、薬学的および産業製品（抗生物質、有機酸、アミノ酸、タン
パク質、ビタミン類、ポリヒドロキシアルカノエート、およびポリサッカリドを
含む）の製造において利用される種々の微生物発酵で使用され得る（Ａｔｋｉｎ
ｓｏｎおよびＭａｖｉｔｕｎａ、「ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＨａｎｄｂｏｏｋ」、第２版（
ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、ＵＳＡ１９９１））。好ましい実施態様にお
いて、発酵プロセスは、１００ｇ／Ｌを超える細胞密度を含む。この株は、産物
が細胞溶解で回収されなければならないプロセスにおいて特に有用であり、そし
てクロマトグラフィー、結晶化、沈澱、遠心分離、および／または濾過分離プロ
セスを必要とするプロセスにおいては、よりさらに有用である。

【００２６】好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および株は、（例えば、
ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５２：２７−５８（１
９９５）；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：１４２−
５０（１９９５）；Ｄｏｉ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８：５８５−９９
（１９９５）；Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４，４７７，６５４号、Ｂｙｒｏｍ
の米国特許第５，３６４，７７８号、Ｓｅｎｉｏｒらの米国特許第５，２６６，
４７０号、Ａｋｉｙａｍａらの米国特許第５，３４６，８１７号、Ｐｏｗｅｌｌ
らの米国特許第４，３３６，３３４号、Ｇｒｏｌｅａｕらの米国特許第５，３０
２，５２５号および同第５，４３４，０６２号、Ｓｈｉｏｔａｎｉらの米国特許
第５，２９２，８６０号、Ｐａｇｅらの米国特許第５，０５９，５３６号および
同第５，０９６，８１９号、Ｌａｆｆｅｒｔｙの米国特許第４，７８６，５９８
号、Ｗｉｔｈｏｌｔらの米国特許第５，３４４，７６９号、ならびにＳｈｉｏｔ
ａｎｉらの米国特許第５，２９０，９１０号、Ｐｅｏｐｌｅｓらの米国特許第５
，２４５，０２３号、Ｄｅｎｎｉｓの米国特許第５，３３４，５２０号、Ｄｅｎ
ｎｉｓらの米国特許第５，３７１，００２号、Ｄｅｎｎｉｓの米国特許第５，５
１２，４５６号、Ｄｅｎｎｉｓらの米国特許第５，５１８，９０７号、ならびに
Ｐｅｐｌｅｓらの米国特許第５，６６３，０６３号に記載されるような）ＰＨＡ
の生成についての発酵プロセスにおいて使用される。

【００２７】別の好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および株は、非常に
純粋なＰＨＡラテックスの生成において使用され、これは、多くの適用を有し得
る。これらの適用の例は、ＰＣＴＷＯ９１／１３２０７（ＰＨＡｌａｔｅｘ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｃｏａｔｉｎｇｐａｐｅｒ）；ＧＢ２
２９２６４８Ａ（ＰＨＡｌａｔｅｘｉｎａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａ
ｌｃｏａｔｉｎｇｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）；ＰＣＴＷＯ９６／００
２６３（ＰＨＡｌａｔｅｘａｓｆｏｏｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｃｈｅ
ｅｓｅ，ｃｏａｔｉｎｇｓ）；ＰＣＴＷＯ９２／０９２１１ならびにＹａｌｐ
ａｎｉの米国特許第５，２２９，１５８号（ＰＨＡｇｒａｎｕｌｅｃｏｍｐ
ｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｕｓｅａｓｄａｉｒｙｃｒｅａｍｓｕｂｓ
ｔｉｔｕｔｅｓ）；ＰＣＴＷＯ／９２／０９２１０ならびにＹａｌｐａｎｉの
米国特許第５，２２５，２２７（ＰＨＡｓａｓｆｌａｖｏｒｄｅｌｉｖｅ
ｒｙａｇｅｎｔｓｉｎｆｏｏｄｓ）；およびＰＣＴＷＯ９６／１７３６
９（ＰＨＡｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃａｔ
ｈｏｄｅｒａｙｔｕｂｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）に記載される。水性プロ
セスに使用する細胞からＰＨＡラテックスを得るために、ＰＨＡ含有細胞を溶解
することが一般に必要である。微生物細胞を溶解する方法は周知であり、そして
物理的均質化処理、超音波処理、酵素処理および界面活性剤処理、ならびに凍結
／融解サイクルが挙げられる。

【００２８】別の好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および操作された株
は、ポリサッカリドの生成に有用である。微生物ポリサッカリドは、多くの異な
る微生物の発酵により生成され得る。例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ株は、キ
サンタンガムの生成のために商業的に使用され（ＫｅｎｎｅｄｙおよびＢｒａｄ
ｓｈａｗ、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：３１９−７１（１９
８４））、そしてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅｌｏｄｅａ株は、ジェランガムを
生成するために使用される（Ｋａｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏ．４３：１０８６−９１（１９８２））。他の例としては、食品産業において
広範に使用されるアルギネート（主に、褐藻類由来）が挙げられる（Ｗｅｌｌｓ
、ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒ
ｉｄｅｓ（ＳａｎｆｏｒｄおよびＬａｓｋｉｎ編）第２９９頁（ＡＣＳ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ１９７７））。アルギネートはまた、Ａｚｏｔｏｂａｃ
ｔｅｒ株の発酵によって生成され得る（Ｃｈｅｎら、Ａｐｌｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ
．Ｍｉｃｒｏ．４９：５４３−４６（１９８５））。ヒアルロン酸は、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｉを使用する生物医学的適用について生じるポリマーの別の例で
ある（ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびｖａｎｄｅＲｉｊｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９：１６９−７５（１９９４））。

【００２９】本明細書中に記載の方法および系は、Ｐｏｌｌｏｃｋ、米国特許第５，３５４
，６７１号およびＭｕｒｏｆｕｓｈｉら、米国特許第５，７０５，３６８号、お
よびＨｏｍｍａら、米国特許第５，６７９，５５６号によって記載されるキサン
タンガムの回収に対して、細胞溶解アプローチと合わせて使用される場合、特に
有利であり得る。開示された方法を実施するために適切なＸａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ株は、Ｂａｕｅｒら、米国特許第４，４００，４６７号およびＰｏｌｌｏｃｋ
ら、米国特許第５，４７２，８７０号に記載される。

【００３０】多くの他の微生物株を使用してポリサッカリドを産生し、そして本明細書に開
示される方法に従うようにする。遺伝子操作技術は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第２０４巻、ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉ
ｃＳｙｓｔｅｍｓ：Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されるように、現在、これらの全ての微生物につい
て利用可能である。Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒによるセルロースの産生は、Ｂｅｎ
−Ｂａｓｓａｔらによって米国特許第５，８２１，１０９号に開示され、そして
遺伝子操作したＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒについては、Ｔｏｎｏｕｃｈｉらによっ
て米国特許第５，７９２，６３０号に開示される。Ｚｏｏｇｌｏｅａによるエキ
ソポリサッカリド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の産生およびこの微
生物の遺伝子操作は、Ｅａｓｓｏｎらによって米国特許第４，９４８，７３３号
および同第５，０９１，３７６号に記載される。ジェランガムとして公知の微生
物のポリサッカリドは、「スフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）」として公知の構
造的に関連するエキソポリサッカリドのファミリーの１つのメンバーである（Ｐ
ｏｌｌｏｃｋ，Ｔ．Ｊ．１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：
１９３９−１９４５，Ｐｏｌｌｏｃｋらの米国特許第５，８５４，０３４号およ
びその中の参考文献）。ジェランガムは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅｌｏｄｅ
ａ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ菌株
番号ＡＴＣＣ３１４６１）によって、米国特許第４，３２６，０５２号；同第４
，３７７，６３６号；同第４，３８５，１２６号および同第４，５０３，０８４
号に記載される過程によって産生される。この株および増強したジェランガム産
生特性を有する変異誘導株は、Ｆｉａｌｈｏら，１９９１Ｌｅｔｔｅｒｓｉ
ｎＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１２：８５−８７およびＰｏ
ｌｌｏｃｋらの米国特許第５，８５４，０３４号によって記載されるように、遺
伝的に操作され得る。例えば、ＰＨＢの蓄積を欠損するこの株の変異株はまた、
開示される本方法を実行するために使用され得、そして菌株番号ＡＴＣＣ５３９
６７として、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎから入手可能である。ヒアルロン酸は、例えば、Ｅｌｌｗｏｏｄらの米国特
許第５，５６３，０５１号に記載されるようにＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｕｓ細菌に
より産生される。

【００３１】本明細書に記載される組成物および調製方法、ならびにそれらの使用は、以下
の限定的ではない実施例によって、さらに記載される。

【００３２】（実施例１：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ遺伝
子の単離）プラスミドｐＮｕｃ１は、Ｌｉｅｂｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４
：１８５４−６１（１９９２）に記載されている。小球菌ヌクレアーゼをコード
するｎｕｃ遺伝子の配列は決定されており（Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｇｅｎｅ２２：
１８１−８９（１９８３））、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０１７８５でア
クセス可能である。ｎｕｃ遺伝子は、精製したプラスミドｐＮｕｃ１、および以
下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅され：

【００３３】

【化１】ＰＣＲの条件は以下を使用した：１０ｎｇのｐＮｕｃ１ＤＮＡおよび５００ｎ
Ｍの各プライマーを、４５μｌのＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＧｉｂｃｏＢＲ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と混合して、そして増幅した（９５℃で
２分、次いで、９５℃で３０秒、５５℃で４５秒、７２℃で４５秒を３０サイク
ル、そして最後に、６８℃で７分の伸張工程）。ＰＣＲでの増幅に続いて、ヌク
レアーゼ遺伝子（配列番号３）フラグメントを含む０．６５Ｋｂを、アガロース
ゲル電気泳動により精製し、そしてｐＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結してｐＣＲ２．１−ｎｕｃを
得た。このプラスミドの挿入物を、ＤＮＡ配列決定により、Ｓｈｏｒｔｌｅ（Ｓ
ｈｏｒｔｌｅ，１９９３，Ｇｅｎｅ２２：１８１−１８９）によって報告され
たＤＮＡの対応する領域と同一であるか確認した。

【００３４】（実施例２：ヌクレアーゼを発現するトランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ
ＫＴ２４４２株の構築）ｎｕｃ遺伝子を、プラスミドｐＣＲ２．１−ｎｕｃから、制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＡｃｃ６５Ｉを使用して切り出し、そしてｐＵＣ１８ＮｏｔＩの対応する
部位に挿入してｐＵＣ１８−ｎｕｃＩを得た。プラスミドｐＢＧＳ１８（Ｓｐｒ
ａｔｔら，１９８６，Ｇｅｎｅ４１：３３７−３４２；ＡＴＣＣ受託番号３７
４３７）に由来する、プロモーターを有さないカナマイシン遺伝子を、以下のプ
ライマーを使用するＰＣＲ増幅によって得：

【００３５】

【化２】そして、０．９Ｋｂフラグメント（配列番号６）をｐＵＣ１８Ｎｏｔ（Ｈｅｒｒ
ｅｒｏら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６５６７）
のＥｃｌ１３６ＩＩ部位に挿入してｐＭＮＸ−ｋａｎを得た。このプロモーター
を有さないカナマイシン遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＡｃｃ６５１での消化によ
って切り出し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて平滑末端化
し、そしてｐＵＣ１８ｎｕｃ−１のＳｍａＩ部位に挿入した。

【００３６】得られたプラスミドであるｐＭＮＸ−ｎｕｃを、ＳｍａＩで直線化し、そして
ｐＭＮＸ−ｋａｎに由来する、プロモーターを有さないカナマイシン遺伝子を含
む平滑末端化したＥｃｏＲＩ／Ａｃｃ６５Ｉフラグメントと連結した。組換えｐ
ＭＮＸ−ｎｕｃ−ｋａｎプラスミドを、ｌａｃプロモーターに由来するｎｕｃ−
ｋａｎオペロンの発現によって与えられるそれらのカナマイシン耐性に基づいて
単離した。続いて、このｎｕｃ−ｋａｎオペロンをＮｏｔＩフラグメントとして
切り出し、そしてｐＵＴｋａｎの対応する部位に挿入した。続いて、プラスミド
ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎを使用して、プロモーターを有さないｎｕｃ−ｋａｎ
オペロンを無作為にＰ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４４２の染色体に組み込んだ。プ
ラスミドの接合を、Ｅ．ｃｏｌｉＳ１７−１［ｐＭＵＸｎｕｃ−ｋａｎ］を使
用して達成した。

【００３７】トランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ株を、Ｅ２／１０ｍＭオクタン酸／カ
ナマイシン／クロラムフェニコールプレート上で選択した。１２，０００の無作
為な組み込み体のうち、１５００のコロニーをＤＮＡｓｅ寒天プレートにレプリ
カプレーティングして、ヌクレアーゼを発現しているクローンを選択した。培養
上清中および株のペリプラズム中のヌクレアーゼレベルのインビトロ分析のため
に、ヌクレアーゼを発現している３５のクローンを選択した。この目的のために
、細胞を遠心沈殿し、そして分泌されたヌクレアーゼを含む上清を回収した。続
いて、この細胞ペレットを新鮮な培地中に再懸濁し、そして５００μｌの懸濁液
に１００μｌのクロロホルムを添加して、ペリプラズムのヌクレアーゼを放出さ
せた。続いて、細胞片を遠心沈殿した。ＤＮＡゲル電気泳動を、ベンゾナーゼ（
ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（０．０２Ｕ）で処理したサンプル、ヌクレアーゼが組み
込まれた株の培養上清で処置したサンプル、およびＰ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４
４２の上清で処理したサンプルを用いて行った。Ｐ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４４
２由来の染色体ＤＮＡ上の９の異なるＰ．ｐｕｔｉｄａｎｕｃ組み込み体の分
泌画分およびペリプラズム画分に、ヌクレアーゼ活性が存在した。続いて、細胞
片を遠心分離によって除去した。

【００３８】ヌクレアーゼの存在を、清澄化した上清のアリコートを、４μｇのＰ．ｐｕｔ
ｉｄａ染色体ＤＮＡと共に３７℃で１時間インキュベートすることによって決定
した。コントロールとして、染色体ＤＮＡを、市販されているＢＥＮＺＯＮＡＳ
Ｅ^TM（ポシティブコントロールとして０．０２ユニット、またはネガティブコン
トロールとしてヌクレアーゼ無し）と共にインキュベートした。消化に続いて、
このサンプルを、アガロースゲル電気泳動により分析した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）。こ
の試験を使用して、異なるレベルで、および細胞外領域でもしくはペリプラズム
空間でまたはその両方でヌクレアーゼ活性を発現する株を容易に同定した。

【００３９】これらの株を、ｐ．ｐｕｔｉｄａＭＢＸ９１８〜ＭＢＸ９２６と呼ぶ。Ｐ．
ｐｕｔｉｄａＭＢＸ９２４は、ヌクレアーゼをペリプラズムおよび細胞外培地
の両方に分泌し、そして２３ＳｒＲＮＡコード遺伝子に組み込まれたｎｕｃ−
ｋａｎオペロンを有する。

【００４０】（実施例３：ヌクレアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックＲ．ｅｕｔｒ
ｏｐｈａ４０１２４株の構築）トランスジェニックＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ４０１２４株を、その宿主株をＥ
．ｃｏｌｉＳ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＰＣＴ／１％グルコー
ス／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ）／カナマイシンプレート
上で接合した後に選択した。１０の無作為コロニーを、ＰＣＴ／１％グルコース
／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ）／カナマイシン液体培地中
に接種し、そして３０℃で２０時間増殖させた。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａＭＢＸ
９１７培養物のみが活性なヌクレアーゼを産生し、このヌクレアーゼは、トラン
スジェニック株のペリプラズムに局在した。

【００４１】（実施例４：ヌクレアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックＰ．ｐｕｔｉ
ｄａＭＢＸ９７８株の構築）トランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａＭＢＸ９７８株を、その宿主株をＥ．
ｃｏｌｉＳ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＥ２／１０ｍＭオクタ
ン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ）プレー
ト上で接合した後に選択し、続いて、適切な抗生物質を含むＤＮＡｓｅ寒天プレ
ート上にレプリカプレーティングした。全部で５０のヌクレアーゼポシティブの
コロニーを、Ｅ２／１０ｍＭオクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎ
ａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ）プレートにレプリカプレーティングした。続いて
、９の単離株（Ｐ．ｐｕｔｉｄａＭＢＸ９７９〜９８７）を、Ｅ２／１０ｍＭ
オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ
）液体培地中で増殖させた。全てのクローンが、ヌクレアーゼ活性をペリプラズ
ムに分泌した。ＭＢＸ９８４は、最高レベルのヌクレアーゼ活性を分泌した。９
つ全ての株を、増殖特性およびＰＨＡ蓄積について、５０ｍｌのＥ２／１０ｍＭ
オクタン酸液体培地中で試験した。結果を以下の表１に示す。細胞は、炭素供給
源として、１０ｍＭオクタン酸を含むＥ２培地上で増殖させた。ＭＢＸ９８５は
、野生型株の増殖能力およびＰＨＡ蓄積活性を保持した。

【００４２】

【表１】（実施例５：ヌクレアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ
ＭＢＸ２４７株の構築）トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉＭＢＸ２４７株を、その宿主株をＥ．ｃｏ
ｌｉＳ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＥ２／１０ｍＭオクタン酸
／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ）プレート上
で接合した後に選択し、続いて、適切な抗生物質を含むＤＮＡｓｅ寒天プレート
上にレプリカプレーティングした。全部で７５のヌクレアーゼポシティブのコロ
ニーを、Ｅ２／１０ｍＭオクタン酸／０．５％コーンスティープ酒／カナマイ
シン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ）プレートにレプリカプ
レーティングした。続いて、９つの単離株を、Ｒ１０／２％グルコース／カナマ
イシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ）液体培地中で増殖さ
せた。４つの単離株（ＭＢＸ９８８〜９９１）において、ヌクレアーゼ遺伝子が
、染色体に首尾良く組み込まれていた。この異なるトランスジェニック株におけ
るヌクレアーゼ活性を分析した。ＤＮＡゲル電気泳動を、Ｅ．ｃｏｌｉＭＢＸ
２４７のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｒ１０培地上で増殖させたＥ．
ｃｏｌｉＭＢＸ９８８のペリプラズム画分で処理したサンプル、ＬＢ培地上で
増殖させたＥ．ｃｏｌｉＭＢＸ９８８のペリプラズム画分で処理したサンプル
、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａＭＢＸ９１７のペリプラズム画分で処理したサンプル
、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ４０１２４のペリプラズム画分で処理したサンプル、
ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＭＢＸ９８５のペリプラズム画分で処理したサンプル
、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＭＢＸ９７８のペリプラズム画分で処理したサンプ
ル、Ｐ．ｐｕｔｉｄａＭＢＸ９２４のペリプラズム画分で処理したサンプル、
Ｐ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４４２のペリプラズム画分で処理したサンプル、およ
び分子量マーカーを用いて行った。

【００４３】ヌクレアーゼ活性を、異なるトランスジェニック株において、実施例２に記載
される染色体ＤＮＡ消化およびゲル電気泳動アッセイを使用して分析した。

【００４４】これらの操作した株を、ＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子を導入すること
によってさらに改変した（米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，３３４，
５２０号；同第５，３７１，００２号；同第５，５１２，４５６号；同第５，５
１８，９０７号；および同第５，６６３，０６３号に記載される）。

【００４５】（実施例６：ＰＨＡ顆粒懸濁物のＰ．ｐｕｔｉｄａＭＢＸ９７８からの単離
およびヌクレアーゼを発現する誘導株）Ｐ．ｐｕｔｉｄａＭＢＸ９７８およびＰ．ｐｕｔｉｄａＭＢＸ９８５を、
炭素供給源としてオクタン酸を含む２０Ｌの流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈｃ
ｕｌｔｕｒｅ）中で細胞密度が２００ｇ／Ｌになるまで増殖させた。発酵に続い
て、それぞれの培養物に１ｍＭＣａＣｌ₂を補充して、そして水酸化アンモニウムを用いてｐＨ８．５に調整した。次いで、この培養物を、高圧ホモジナイザ
ーを使用して圧力を８，０００ｐｓｉから２０，０００ｐｓｉまで変化させる操
作をして溶解した。溶解物の各サンプルを室温で１時間インキュベートし、次い
で、この粘稠性を２０℃でＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄＬＶＦＶｉｓｃｏｍｅｔｅ
ｒ（スピンドル番号１、６０ｒｐｍ）を使用して決定した。野生型株およびヌク
レアーゼ発現株のサンプルに加えて、市販のヌクレアーゼ（ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ ^TM ，１０μＬ／Ｌ培養物）を補充した野生型の培養物から溶解物を調製した。粘
稠性決定についての結果を表２に示し、そしてこの結果は、ヌクレアーゼ遺伝子
の組み込みが、ＭＢＸ９８５における場合、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ
）を添加した野生型株で得られた粘稠性と類似するレベルまでの溶解物の粘稠性
の低減を生じることを示す。

【００４６】

【表２】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ホロウィッツ，ダニエルエム．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02143，サマービル，ワシントンストリート 435，アパートメントナンバー 206 (72)発明者ジャーングロス，ティルマンユー．アメリカ合衆国ニューハンプシャー 03755，ハノーバー，ドランスプレイス６ (72)発明者ピープルズ，オリバーピー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02174，アーリントン，レッドクリフロード 27 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA11 CA04 DA09 EA04 GA11 GA19 HA01 HA08 4B064 AD83 AF11 CA02 CA19 CC24 DA01 DA20 4B065 AA01Y AA09Y AA12Y AA14Y AA26Y AA29Y AA42Y AA43Y AA44X AA44Y AA53Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA12 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗生物質、有機酸、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ポリ
ヒドロキシアルカノエート、およびポリサッカリドからなる群から選択される産
物の産生のための細菌株であって、ここで、該細菌が、核酸を分解するために、
ペリプラズムまたは該細菌が発酵される増殖培地中にヌクレアーゼを分泌するの
に有効な量において異種ヌクレアーゼ遺伝子または遺伝的に改変された同種ヌク
レアーゼ遺伝子を発現し、それによって該産物の回収率が増強される、細菌株。
【請求項２】少なくとも５０ｇ／ｌの細胞密度まで増殖し得る、請求項１
に記載の細菌。
【請求項３】前記細菌株の乾燥細胞重量の少なくとも４０％のレベルまで
ポリヒドロキシアルカノエートを産生する、請求項２に記載の細菌株。
【請求項４】本質的に核酸を含まないポリ（３−ヒドロキシアルカノエー
ト）顆粒懸濁液を製造するための水性プロセスにおける使用のための、請求項２
に記載の細菌株。
【請求項５】キサンタンガム、アルギネート、ジェランガム、ゾーグラン
、ヒアルロン酸、および微生物セルロースからなる群から選択されるポリサッカ
リドを作製するためのプロセスにおける使用のための、請求項１に記載の細菌株
。
【請求項６】前記ヌクレアーゼ遺伝子が、前記細菌株以外の生物から得ら
れる異種遺伝子である、請求項１に記載の細菌株。
【請求項７】前記ヌクレアーゼ遺伝子が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒ
ｏｐｈａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ
ｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
ｃａｖｉａｅ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｒｅｓｉｎｏｖ
ｏｒａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ
からなる群から選択される宿主株に組み込まれる、請求項１に記載の細菌株。
【請求項８】前記ヌクレアーゼが、前記細胞の溶解後２４時間未満内に放
出される全ての前記核酸の少なくとも９５％を分解するために有効な量において
発現される、請求項１に記載の細菌株。
【請求項９】前記ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼ活性を増強するために改
変されている同種遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の細菌株。
【請求項１０】前記細菌株が変異され、そして該変異された細菌がヌクレ
アーゼ活性の増加する量についてスクリーニングされる、請求項９に記載の細菌
株。
【請求項１１】発酵プロセスであって、以下：抗生物質、有機酸、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ポリヒドロキシアルカ
ノエート、およびポリサッカリドからなる群から選択される産物の産生のための
細菌株を増殖培地に添加する工程であって、ここで、該細菌が、核酸を分解する
ために、ペリプラズムまたは増殖培地中にヌクレアーゼを分泌するのに有効な量
において異種ヌクレアーゼ遺伝子または遺伝的に改変された同種ヌクレアーゼ遺
伝子を発現し、それによって該産物の回収率が増強される工程を包含する、発酵
プロセス。
【請求項１２】前記細菌株が、少なくとも５０ｇ／ｌの細胞密度まで増殖
する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記細菌株が、ポリヒドロキシアルカノエートを産生する
、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】前記細菌株の乾燥細胞重量の少なくとも４０％のレベルを
産生するために該細菌株を増殖する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の
方法。
【請求項１５】前記細胞を溶解する工程をさらに包含する。請求項１１に
記載の方法。
【請求項１６】本質的に核酸を含まないポリ（３−ヒドロキシアルカノエ
ート）顆粒懸濁液を製造するための水性プロセスを使用する工程をさらに包含す
る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】キサンタンガム、アルギネート、ジェランガム、ゾーグラ
ン、ヒアルロン酸、および微生物セルロースからなる群から選択されるポリサッ
カリドを作製するためのプロセスにおいて使用される、請求項１１に記載の方法
。
【請求項１８】酵素、増殖因子、およびサイトカインからなる群から選択
される細胞内タンパク質を作製するためのプロセスにおいて使用される、請求項
１１に記載の方法。
【請求項１９】前記ヌクレアーゼ遺伝子が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔ
ｒｏｐｈａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ、
Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａ
ｓｃａｖｉａｅ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｒｅｓｉｎｏ
ｖｏｒａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａからなる群から選択される宿主株に組み込まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】前記株が、ペリプラズムまたは増殖培地中にヌクレアーゼ
を分泌する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】前記株が、前記増殖培地中の細胞の溶解後２４時間未満内
に放出される全ての前記核酸の少なくとも９５％を分解するために有効な量にお
いて、該増殖培地中にヌクレアーゼを発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】前記細菌株が同種ヌクレアーゼを発現する、請求項１１に
記載の方法であって、該細菌株を変異させる工程および増強するヌクレアーゼ活
性を表す細菌をスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項２３】前記細菌が同種ヌクレアーゼを発現する、請求項１１に記
載の方法であって、ヌクレアーゼ活性を増強するために該ヌクレアーゼを遺伝的
に操作する工程をさらに包含する、方法。