KR100321631B1 - 알칼리게네스레이터스유래의폴리하이드록시알칸산생합성관련유전자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리하이드록시알칸산 (polyhydroxyalkanoate, PHA) 생합성 관련 유전자 및 이를 이용하여 폴리하이드록시알칸산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 알칼리게네스 레이터스 (Alcaligenes latus) 유래의 폴리하이드록시알칸산 합성효소 (PHA synthase), β-케토티올레아제 (β-ketothiolase) 및 아세토아세틸-CoA 환원효소 (acetoacetyl-CoA reductase) 및 그의 아미노산 서열, 이들 효소 유전자 및 그의 염기 서열, 이 유전자를 모두 포함하는 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자 그리고 이를 이용하여 생분해성 천연 고분자 물질인 폴리하이드록시알칸산 및 그 공중합체를 미생물에서 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자
본 발명은 폴리하이드록시알칸산 (polyhydroxyalkanoate, PHA) 생합성 관련 유전자 및 이를 이용하여 폴리하이드록시알칸산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 알칼리게네스 레이터스 (Alcaligenes latus) 유래의 폴리하이드록시알칸산 합성효소 (PHA synthase), β-케토티올레아제 (β-ketothiolase) 및 아세토아세틸-CoA 환원효소 (acetoacetyl-CoA reductase) 및 그의 아미노산 서열, 이들 효소 유전자 및 그의 염기 서열, 이 유전자를 모두 포함하는 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자 그리고 이를 이용하여 생분해성 천연 고분자 물질인 폴리하이드록시알칸산 및 그 공중합체를 미생물에서 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
일상적인 자연 환경에서 분해되지 않는 석유합성 고분자는 내구성이 있어 폐플라스틱으로 인한 환경오염이 사회 문제로 크게 대두되고 있다. 특히 일회용 위생용품과 포장지의 사용이 급격히 증가하고 있어 매년 엄청난 양의 폐플라스틱이 버려지고 있다. 이러한 폐플라스틱 등으로 인한 환경 문제를 해결하기 위하여 생분해성 고분자로서 석유합성 고분자를 대체하려는 연구가 전세계적으로 진행되고 있다.
생분해성 고분자는 자연 환경하에서 일정 기간이 경과한 다음 완전히 분해되는 고분자 물질을 말한다. 현재 많은 연구가 이루어져 있는 여러 물질 가운데 폴리하이드록시알칸산은 미생물에 의하여 합성·축적되는 천연 폴리에스테르(polyester) 물질로서 현재 사용되고 있는 합성 플라스틱과 기계적 물성이 유사하고 생분해성이 탁월하여 많은 관심을 끌고 있다 (Lee, S. Y.,Biotechnol. Bioeng.,49: 1-14, 1996; Lee, S. Y.,Trends Biotechnol.,14: 431-438, 1996). 구체적으로, 폴리하이드록시알칸산 (polyhydroxyalkanoate, PHA)은 슈도모나스 (Pseudomonas), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 아조토박터 (Azotobacter), 바실러스 (Bacillus) 속 미생물 등에서 발견되는 에너지 저장물질로서, 배양액에 질소, 인, 황, 산소 등이 고갈되는 등 상기 미생물이 증식하는데 불리한 환경이 될 때 미생물 내에 과립 상으로 축적된다. 이는 1925년 레모이니 (Lemoigne)에 의하여 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)에서 처음으로 발견되었고, 이후 그의 화학적 및 물리적 특성들이 광범위하게 연구되었다 (Lemoigne, M.,Bull. Soc. Chem. Biol.,8: 770-782, 1926).
이와 같은 폴리하이드록시알칸산의 종류로는 폴리하이드록시부티릭산 [poly(3- hydroxybutyrate)]가 처음 발견되었고 이후 단량체인 하이드록시알칸산 내 주 사슬의 탄소수와 치환기의 형태에 따라 수많은 하이드록시알칸산이 보고되고 있다. 폴리하이드록시알칸산의 열가소성 고분자로서의 가능성은 1960년대 초부터 인식되었고 그 이후에 여러 종류의 폴리하이드록시알칸산 공중합체들이 합성되면서 그의 기계적 물성이 우수하고 자연계 내에서의 생분해성이 탁월함이 밝혀져 큰 관심을 끌게 되었다. 더욱이 최근 들어 석유합성 고분자들의 폐기물에 의한 환경오염 문제가 심각하게 인식됨으로써 자연계에서 분해되지 않는 플라스틱 물질을 대체할 수 있는 물질로서 전세계적으로 활발히 연구되고 있다. 이외에도 폴리하이드록시알칸산은 생체융화성 및 생체흡수성 등이 있어, 농업용 고분자 소재 (농약 서방제), 의료용 고분자 소재, 정밀화학 제품의 전구체 (precursor), 약물 전달계의 모체 및 포장용 소재 등으로 다양한 분야에서 유용하게 사용될 수 있다 (Anderson and Dawes, E. A.,Microbiol. Rev.,1990, 54, 450-472).
지금까지 여러 가지 박테리아를 이용하여 폴리하이드록시알칸산의 생합성에 관한 분자 생물학적인 연구가 이루어져, 4개의 서로 다른 폴리하이드록시알칸산 생합성 경로가 존재한다는 것이 밝혀졌다 (Steinbuchel, A. in Biomaterials : novel materials from biological sources, 215-262, 1991). 구체적으로 가장 널리 알려진 알칼리게네스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus)의 경우 β-케토티올레아제, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (acetoacetyl-CoA reductase) 그리고 폴리하이드록시알칸산 합성효소 (PHA synthase) 등의 3 효소가 관여한다고 알려져 있다 (People, O. P. and Shinskey, A. J.,J. Biol. Chem.,264: 15298-15303, 1989; Schubert, P., Steinbuchel, A. and Schlegel, H. G.,J. Bacteriol.,170: 5837-5847, 1988; Slater, S. C., Voige, W. H. and Dennis, D. E.,J. Bacteriol.,170: 4431-4436, 1988).
그램 음성 세균인 알칼리게네스 유트로푸스에서의 구체적인 폴리하이드록시알칸산의 생합성 경로는 다음과 같다. 먼저phbA유전자 산물인 β-케토티올레아제 (β-ketothiolase)를 촉매로 한 생물학적인 클라센 응축반응 (Claisen condensation)에 의하여 2 분자의 아세틸-CoA 에 탄소-탄소 결합이 형성되고, 이렇게 얻은 아세토아세틸-CoA 는 다시phbB유전자 산물인 NADPH-의존성아세토아세틸-CoA 환원효소 (NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase)에 의하여 입체 선택적으로 환원되어져 D(-)-베타하이드록시부티릴-CoA 로 전환되며, 마지막으로 D(-)-베타하이드록시부티릴-CoA 는phbC유전자 산물인 폴리하이드록시알칸산 합성효소(PHA synthase)에 의하여 고분자 에스테르 결합을 하게 된다.
알칼리게네스 유트로푸스의 폴리하이드록시알칸산 생합성 경로 이외에도 다른 여러 박테리아들의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 클로닝하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 이와 같이 박테리아 내에서 폴리하이드록시알칸산의 생합성 경로를 이해함으로써 폴리하이드록시알칸산의 효율적인 생산, 사용 기질의 다양화, 새로운 폴리하이드록시알칸산의 합성 그리고 폴리하이드록시알칸산과 유사한 생체 고분자의 개발 등이 가능하다. 또한, 이러한 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 이용하여 얻은 재조합 균주들은 고효율로 여러 폴리하이드록시알칸산을 합성할 수 있어 학문적으로나 산업적으로 큰 의미를 갖는다 (Lee, S. Y.,Nature Biotechnol.,15: 17-18, 1997).
알칼리게네스 레이터스 (Alcaligenes latus) 균주는 폴리하이드록시알칸산의 생산성이 우수하여 세포 내에 90 % 전후의 비율로 폴리하이드록시알칸산을 축적하는 것으로 보고되어 있는 균주로서, 성장 속도가 빠르고 가격이 저렴한 기질을 탄소원으로 이용하는 등의 장점을 가진다 (Wang, F. and Lee, S. Y.,Appl. Environ. Microbiol.,63: 3703-3706, 1997). 특히, 알칼리게네스 레이터스는 알칼리게네스 유트로푸스와는 달리 균체 성장과 동시에 폴리하이드록시알칸산을 축적하는 특성을 가지고 있어 알칼리게네스 유트로푸스에 비해서는 낮지만 1 단계 배양만으로도 이를 대량 생산할 수 있다.
이러한 특성을 가지는 알칼리게네스 레이터스를 이용하여 폴리하이드록시알칸산을 생산하는 연구는 1980년대 중반에 오스트리아의 케미 린츠 AG 사 (Chemie Linz AG)에 의하여 본격적으로 시작되었고, 오스트리아의 btH 사 (Biotechnologishe forchungesellschaft mbH 사)는 변이주인 알칼리게네스 속 btF-96 균주를 이용하여 1 단계 배양만으로 폴리하이드록시알칸산을 생산하는 공정을 개발하였는데 이를 통하여 15m3크기의 발효조에서 주당 1톤을 얻을 수 있었다 (Hrabak, O.,FEMS Microbiol. Rev.,103: 251-256, 1992). 또한, 일본 이화학연구소의 도이 등은 이당류를 탄소원으로 한 배지에 3-하이드록시프로피온산 (3-hydroxypropionate) 및 감마-부티로락톤 (γ-butyrolactone)을 첨가하여 이의 공중합체인 폴리(3-하이드록시부티릭산/3-하이드록시프로피온산) (P3HB/3HP) 및 P3HB/4HB 를 생산한 바 있었다 (Hiramitsu, M., Koyama, N. and Doi, Y.,Biotechnol. Lett.,15: 461-464, 1993).
이와 같이 폴리하이드록시알칸산은 생물학적인 방법뿐만 아니라 화학적인 방법에 의해서도 생산이 가능하지만 상용 고분자 규모의 생산은 생물학적인 공정에 의해서만 가능하다. 하지만 아직까지 상용 고분자로서의 폴리하이드록시알칸산의 생산 단가는 상용합성 고분자와 비교하여 매우 높기 때문에 생산 비용의 절감을 위한 신기술의 개발이 필요하다. 특히 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 균주의 개발과 개량은 신규 생합성 고분자의 생산, 저가의 기질 이용성, 고효율 생산, 분리 및 정제의 용이성 등의 장점이 있지만 이러한 재조합 균주를 개발하기 위하여 먼저 폴리하이드록시알칸산 생합성 경로와 관련된 효소를 잘 이해하는 것이 필요하다.
이에 본 발명자들은 생분해성 천연 고분자 물질인 폴리하이드록시알칸산 및 그의 공중합체를 효과적으로 대량 생산하기 위하여, 알칼리게네스 레이터스 균주로부터 폴리하이드록시알칸산 합성효소, β-케토티올레아제 및 아세토아세틸-CoA 환원효소를 모두 코딩하는 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 클로닝하고 각 효소의 아미노산 서열 및 그 유전자 염기 서열을 확인한 다음 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하여 이로 형질전환된 대장균 형질전환체에서 폴리하이드록시알칸산의 축적을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 효소 및 그들의 유전자를 제공하여 생분해성 천연 고분자인 폴리하이드록시알칸산 및 그의 공중합체를 대량 생산하는데 그 목적이 있다.
도 1은 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 재조합 대장균이 폴리하이드록시알칸산을 축적하여 균체가 고체 배지에서 불투명한 형태를 보이는 것을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 재조합 대장균이 액체 배지에서 폴리하이드록시알칸산을 축적한 것을 나타낸 것이고,
도 3는 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 6.4kb 크기의 염색체 유전자 부분의 전체 염기 서열을 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 6.4kb 크기의 염색체 유전자 부분의 제한효소 지도 및 생합성 관련 유전자의 구조를 나타낸 것이고,
도 5는 본 발명의 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pJC1 의 구조를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 합성효소 유전자, β-케토티올레아제 유전자 및 아세토아세틸-CoA 환원효소 유전자를 순서대로 포함하는 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 제공한다.
본 발명의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자는 서열 1 의 염기 서열을 가지고, 이에는 서열 2 의 폴리하이드록시알칸산 합성효소 유전자, 서열 3 의 β-케토티올레아제 유전자 및 서열 4 의 아세토아세틸-CoA 환원효소 유전자를 포함한다.
또한, 본 발명은 폴리하이드록시알칸산 생합성과 관련된 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 합성효소 및 그의 아미노산 서열, β-케토티올레아제 효소 및 그의 아미노산 서열 그리고 아세토아세틸-CoA 환원효소 및 그의 아미노산 서열을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pJC1 및 그의 대장균 형질전환체 (수탁번호 : KCTC 0398 BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 미생물을 배양하여 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 효소를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 효소를 생산하는 숙주 미생물을 이용하여 폴리-베타-하이드록시부티릭산 및 그와 관련한 공중합체를 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 생분해성 천연 고분자 물질로서 산업적으로 유용한 폴리하이드록시알칸산 (polyhydroxyalkanoate, PHA) 및 그의 공중합체를 대량 생산하기 위하여, 성장과 동시에 고농도로 폴리하이드록시알칸산을 축적할 수 있는 알칼리게네스 레이터스 (Alcaligenes latus) 균주를 사용하여 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련유전자를 분리한다.
구체적으로, 본 발명은 알칼리게네스 레이터스 균주로부터 전체 염색체 유전자를 분리하고 이를 제한효소로 부분 절단하여 플라스미드 벡터 pUC19 등과 연결시킨 다음 대장균에 형질전환시켜 상기 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 선별한다. 이 때 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물은 고체 배지 및 액체 배지에서 폴리하이드록시알칸산을 축적함을 관찰할 수 있다 (도 1및도 2참조).
상기 폴리하이드록시알칸산을 생산하는 미생물로부터 재조합 벡터를 분리하여 확인한 결과, 상기 벡터에 6.4kb 크기의 알칼리게네스 레이터스의 염색체 유전자 조각이 들어가 있고 이 유전자 조각에는 폴리하이드록시알칸산의 생합성 효소인 β-케토티올레아제, 아세토아세틸-CoA 환원효소 및 폴리하이드록시알칸산 합성효소 모두의 유전자가 포함되어 있었다.
본 발명의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자는 폴리하이드록시알칸산 합성효소, β-케토티올레아제 및 아세토아세틸-CoA 환원효소 유전자를 순서대로 포함하고, 여기에 포함되는 폴리하이드록시알칸산 합성효소 유전자는 1608 bp 크기이고 (536개 아미노산), β-케토티올레아제 유전자는 1176 bp 크기이며 (392개 아미노산), 아세토아세틸-CoA 환원효소 유전자는 735bp 크기인 (245개 아미노산) 것으로 나타났다 (도 4참조).
또한, 상기 폴리하이드록시알칸산 합성효소 유전자는 서열 2 의 염기 서열을 가지고 이로부터 얻은 폴리하이드록시알칸산 합성효소는 서열 5 의 아미노산 서열을 가진다. 또한, 상기 β-케토티올레아제 유전자는 서열 3 의 염기 서열을 가지고 이로부터 얻은 β-케토티올레아제 효소는 서열 6 의 아미노산 서열을 가진다. 또한, 상기 아세토아세틸-CoA 환원효소 유전자는 서열 4 의 염기 서열을 가지고 이로부터 얻은 아세토아세틸-CoA 환원효소는 서열 7 의 아미노산 서열을 가진다 (도 3및 서열목록 참조).
본 발명의 유전자를 포함하는 상기 재조합 벡터를 pJC1 (도 5참조)로 명명하고 이를 대장균에 형질전환시켜 얻은 형질전환체E. coliXL1-Blue/pJC1 를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 11월 5일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0398 BP).
본 발명은 상기 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 미생물을 배양하여 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 효소를 제조한다.
또한, 본 발명은 상기 과정으로 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 효소를 생산하는 숙주 미생물을 이용하여 폴리하이드록시알칸산 및 그와 관련한 공중합체를 제조한다.
구체적으로, 상기 재조합 발현 벡터로 대장균을 형질전환시키고 선별된 대장균을 포도당이 적당한 농도로 첨가된 액체 배지에서 배양하여 폴리하이드록시알칸산을 생산한다. 이와 같은 과정으로 대장균을 배양하는 경우 폴리하이드록시알칸산이 건조 균체에 대해 40 % 이상 축적되었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 알칼리게네스 레이터스의 염색체 유전자 분리
본 발명은 알칼리게네스 레이터스의 염색체 유전자를 얻기 위하여, 알칼리게네스 레이터스 균주 (Wang, F. and Lee, S. Y.,Appl. Envirn. Microbiol.,63: 3707-3706, 1997)를 500mL 의 NB 배지 (8g/L nutrient broth)에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이들 균주가 초기 대수 성장기에 있을 때 원심분리하여 수확한 다음 생리식염수-EDTA (Saline-EDTA; 0.15 M NaCl, 0.1M EDTA, pH 8.0) 용액으로 2번 씻어주었다. 생리식염수-EDTA 로 씻은 균체를 40mL 의 생리식염수-트리스 완충용액 (Saline-Tris; 0.1M NaCl, 10mM EDTA, 0.1M 트리스-염산, pH 9.0)에 현탁시키고 이에 사용하기 직전에 제조한 20mg/mL 의 라이소자임 용액 1mL 을 첨가하였다. 이를 37℃에서 천천히 흔들어 주면서 트리스-SDS 완충용액 (0.14M NaCl, 1mM EDTA, 20mM 트리스-염산, pH 7.5 용액에 5 % SDS 를 가함)을 방울방울 첨가하였다. 상기 용액이 점성을 가진 것으로 변할 경우 단백질을 제거하기 위하여 10mg/mL 의 프로테아제 K (proteinase K) 5.5mL 을 가하고 37℃에서 2시간 동안 효소 반응을 시켰다. 다음 같은 양의 페놀을 가하여 실온에서 30분 동안 조심스럽게 잘 혼합한 다음 용액을 원심분리관에 옮겨 상온에서 6,000rpm 으로 10분 동안 원심분리하였다. 이 때 상층액을 비이커에 옮겨 용량을 확인하고 이에 2배 용량의 냉각 에탄올을 천천히 가하여 염색체 유전자를 침전시킨 다음 유리봉으로 유전자를 말아서 감아 올렸다. 유리봉을 자연 건조시켜 에탄올을 제거한 다음 10mL 의 TE 완충용액 (10mM 트리스-염산, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용해시켰다. 다음 RNase 를 최종농도 50μg/mL 이 되도록 가하고 37℃에서 1시간 동안 효소 반응을 시켰다. 다시 같은 양의 페놀을 가하여 실온에서 30분 동안 조심스럽게 혼합한 다음 원심분리하여 상층액을 비이커에 옮겨 용량을 확인하였다. 다시 여기에 2배 용양의 냉각 에탄올을 천천히 가하여 염색체 유전자를 침전시킨 다음 유리봉으로 유전자를 말아서 감아올렸다. 이 때 얻은 유전자를 상온에서 다시 건조시킨 다음 2mL 의 TE 완충용액에 잘 녹였다.
<실시예 2> 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자의 클로닝
본 발명은 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 클로닝하기 위하여, 상기 실시예 1 에서 얻은 알칼리게네스 레이터스의 염색체 유전자를 제한효소Sau3AI 으로 부분 절단하였다. 제한효소Sau3AI 은 4개의 염기로 이루어진 특정 DNA 서열을 절단하는 효소이므로 이 제한효소로 부분 절단을 수행할 경우 작은 크기의 유전자로부터 커다란 크기까지의 부분 유전자를 얻을 수 있다. 이러한 과정으로 절단한 유전자를 낮은 녹는점을 가진 아가로스 젤 (low-melting temperature agarose gel)에 전기영동하여 유전자를 크기에 따라 분리하였다.
본 발명은 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자 전체를 얻기 위하여, 상기로부터 4kb 크기 이상의 유전자를 얻고 이를 2.68 kb 크기인 플라스미드 벡터 pUC19 와 결합시키기 위하여 상기 플라스미드 벡터를 제한효소Sau3AI 과 같은 절단 말단 서열을 가지는 제한효소BamHI 으로 절단하였다. 절단된 플라스미드 벡터 pUC19 와 분리된 4kb 크기 이상의 알칼리게네스 레이터스의 부분 염색체 유전자를 T4 DNA 라이게이제 (New England Biolabs사)를 이용하여 결합시킴으로 재조합 발현벡터를 제작하였다.
상기 재조합 벡터를 이용하여 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 대장균 XL1-Blue (Stratagene 사) 균주를 형질전환시키는데, 상기 벡터는 플라스미드 벡터 pUC19 를 제한효소BamHI 으로 절단한 다음 본 발명의 유전자를 결합시킴으로 대장균 XL1-Blue 균주 내로 들어갈 경우 앰피실린, X-gal (5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 그리고 IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)가 첨가된 고체 LB 배지 (트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L)에서 흰 집락을 형성시키며 그렇지 않고 플라스미드 벡터 pUC19 만이 대장균 내로 들어갈 경우에는 파란색 집락을 형성시킨다. 이러한 과정을 통해 얻은 플라스미드 벡터 pUC19 에 알칼리게네스 레이터스의 부분 염색체가 결합된 집락을 폴리하이드록시알칸산을 축적할 수 있는 액체 배지에 접종하면 폴리하이드록시알칸산의 합성을 관찰할 수 있었다.
상기 일련의 과정을 통하여 폴리하이드록시알칸산을 축적하는 재조합 대장균을 얻었다. 이 대장균에서 재조합 플라스미드 벡터를 분리하여 확인한 결과, 원래의 플라스미드 벡터 pUC19 에 6.4kb 크기의 알칼리게네스 레이터스의 염색체 유전자 조각이 들어가 있었다. 또한, 알칼리게네스 레이터스의 염색체 유전자 가운데서 얻어진 6.4kb 크기의 이러한 유전자 조각이 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하고 있다는 것을 확인하였다. 또한, 이 유전자 조각을 이용하여 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자의 염기 서열을 결정하였으며 이로부터 폴리하이드록시알칸산의 생합성 효소인 β-케토티올레아제, 아세토아세틸-CoA 환원효소, 폴리하이드록시알칸산 합성효소 모두의 유전자가 얻어졌다는 것이 확인되었다.
본 발명은 상기 재조합 발현 벡터를 pJC1 으로 명명하고 이를 대장균에 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 11월 5일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0398 BP).
<실시예 3> 알칼리게네스 레이터스에서 얻은 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자의 구조 분석
본 발명은 플라스미드 벡터 pUC19 에 결합된 알칼리게네스 레이터스의 염색체 유전자 조각의 염기 서열을 분석한 결과, 6.4kb 크기의 유전자 조각에는 β-케토티올레아제, 아세토아세틸-CoA 환원효소, 폴리하이드록시알칸산 합성효소 유전자 등 3가지 유전자가 모두 포함되어 있다는 것이 밝혀졌으며, 이에는 폴리하이드록시알칸산 합성효소, β-케토티올레아제 및 환원효소 유전자가 순서대로 있는 것이 확인되었다.
구체적으로, 폴리하이드록시알칸산 합성효소 유전자의 크기는 1608 bp (536개 아미노산), β-케토티올레아제 유전자의 크기는 1176 bp (392개 아미노산) 그리고 아세토아세틸-CoA 환원효소 유전자의 크기는 735bp (245개 아미노산)인 것이 확인되었다.
<실시예 4> 알칼리게네스 레이터스에서 얻은 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 폴리하이드록시알칸산 생산 재조합 대장균
본 발명은 상기 실시예 2 에서 제조한 알칼리게네스 레이터스로부터 분리한 6.4kb 크기의 염색체 유전자 조각을 포함하는 재조합 발현 벡터 pJC1 로 대장균XL1-Blue 균주를 형질전환시키고 대장균 내에 재조합 발현 벡터가 들어가 있을 경우 앰피실린 배지에서 성장하기 때문에 100μg/mL 의 앰피실린이 첨가된 고체 배지에서 대장균 형질전환체를 선별하였다. 이 선별된 대장균을 포도당이 20g/L 농도로 첨가된 단순 또는 복합 액체 배지에서 배양하여 폴리하이드록시알칸산을 생산하였다. 상기 균주를 온도 30℃ 또는 37℃에서 플라스크로 배양하였을 경우 폴리하이드록시부티릭산이 건조 균체에 대해 40 % 이상 축적되었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폴리하이드록시알칸산 (polyhydroxyalkanoate, PHA) 생합성 관련 유전자는 폴리하이드록시알칸산을 1 단계 배양방법으로 대량 생산할 수 있는 알칼리게네스 레이터스 균주에서 유래한 것이고, 폴리하이드록시알칸산 합성효소 (PHA synthase), β-케토티올레아제 (β-ketothiolase) 및 아세토아세틸-CoA 환원효소 (acetoacetyl-CoA reductase)의 유전자를 모두 포함하고 있어 미생물 내에서 생분해성 천연 고분자 물질인 폴리하이드록시알칸산 및 그 공중합체를 대량 생산하데 매우 유용하다. 또한, 이러한 효소 및 유전자를 이용하면 생체 고분자의 생합성 과정을 분자생물학적으로 깊게 이해할 수 있다.
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 1
서열의 길이 : 6436
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 유전자
[서열 1a]
[서열 1b]
[서열 1c]
[서열 1d]
[서열 1e]
[서열 1f]
[서열 1g]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 2
서열의 길이 : 1611
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 유전자
[서열 2a]
[서열 2b]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 3
서열의 길이 : 1179
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 유전자
[서열 3a]
[서열 3b]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 4
서열의 길이 : 738
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 유전자
[서열 4a]
[서열 4b]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 5
서열의 길이 : 536
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 효소 단백질
[서열 5a]
[서열 5b]
[서열 5c]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 6
서열의 길이 : 392
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 효소 단백질
[서열 6a]
[서열 6b]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 7
서열의 길이 : 245
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 효소 단백질
[서열 7a]
[서열 7b]

Claims (9)

  1. 서열 1의 염기서열을 가지며, 알칼리게네스 레이터스 유래의 폴리하이드록시알칸산 합성효소 유전자, β-케토티올레아제 유전자 및 아세토아세틸-CoA 환원효소 유전자를 포함하는 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자.
  2. 제 1항에 있어서, β-케토티올레아제 유전자는 서열 3 의 염기 서열을 가지는 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자.
  3. 제 1항에 있어서, 아세토아세틸-CoA 환원효소 유전자는 서열 4 의 염기 서열을 가지는 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자.
  4. 알칼리게네스 레이터스 유래의 서열 6 의 아미노산 서열을 가지는 β-케토티올레아제 효소.
  5. 알칼리게네스 레이터스 유래의 서열 7 의 아미노산 서열을 가지는 아세토아세틸-CoA 환원효소.
  6. 제 1항의 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pJC1.
  7. 제 6항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체 XL1-Blue/pJC1(수탁번호 : KCTC 0398 BP).
  8. 제 6항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 미생물을 배양하여 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 효소를 제조하는 방법.
  9. 제 8항의 과정에서 얻은 폴리하이드록시알칸산 생합성 관련 효소를 생산하는 숙주 미생물을 이용하여 폴리하이드록시알칸산 및 그와 관련한 공중합체를 제조하는 방법.
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