JPWO2004074476A1 - 新規ベクター - Google Patents
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Abstract
本発明は、工業的に安全に及び／又は安価で効率よく、遺伝子組換え技術によりポリエステル生産するための方法を提供する。 本発明は、より工業的に安全であることを特徴とする広宿主域ベクター、該ベクターに少なくともポリエステル合成酵素遺伝子を導入したポリエステル合成酵素発現プラスミド、該プラスミドを含むポリエステル合成能を有する形質転換体、および該プラスミドまたは形質転換体を使用したポリエステルの製造方法である。
Description
本発明は、広宿主域ベクターｐＪＲＤ２１５ベクターを改良して作成した新規ベクター、およびそれを用いたポリエステルの製造方法に関するものである。
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）であり、１９２５年にＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍで最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいグリーンプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。
その中で、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）の製造方法が開示されている（例えば、特開昭５７−１５０３９３号公報、特開昭５９−２２０１９２号公報参照）。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際のところＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルム等に使用するのに要求される柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成型体の分野にしか利用されなかった。
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）およびその製造方法について研究がなされた（特開平５−９３０４９号公報、特開平７−２６５０６５号公報）。これら文献のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエを用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８，４８２２−４８２３（１９９５））。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてアエロモナス・キャビエを培養し、３ＨＨが１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。しかしながら、本製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量３０％でありポリマー生産性が低いことから、実用化に向け更に高い生産性が得られる方法が探索された。
当該Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものから糸やフィルム等のような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、これらの製造方法では本ポリマーの生産性が依然として低く、本ポリマーの実用化に向けた生産方法としては未だ不十分といわざるを得ない。
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産するアエロモナス・キャビエよりポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）シンターゼ遺伝子がクローニングされた（特開平１０−１０８６８２号公報、Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９，１５，４８２１−４８３０（１９９７））。本遺伝子をラルストニア・ユートロファ（旧アルカリゲネス・ユートロファス）に導入した形質転換体を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った結果、菌体生産性は４ｇ／Ｌ、ポリマー含量は３０％であった。更に本形質転換体を炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体含量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（Ｔ．Ｈｕｋｕｉ等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．４９，３３３（１９９８））。本研究で使用されたＰＨＡ合成酵素発現プラスミドは、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ ３７５３３）にポリエステル合成酵素遺伝子を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等であった（特開平１０−１０８６８２号公報）。その後、本酵素に対して種々のＰＨＡ合成酵素変異体が作られた。その中で、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示されている（Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２））。
ｐＪＲＤ２１５は、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０の誘導体であり、接合伝達性を有している（Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｍ．Ｈｅｕｓｔｅｒｓｐｒｅｕｔｅ等，Ｇｅｎｅ，５１，２７５−２８０（１９８７））。
接合伝達とは、異なる形質を持つ細菌を混合培養した時に起こる現象であり、ある細菌（供与菌）の遺伝子の一部が、他の細菌（受容菌）に移ることを指す。接合伝達能力の強度は、供与体の染色体上あるいは供与体が持つプラスミド上の接合伝達に関与する遺伝子によって決定される。接合伝達に関与する遺伝子には、自己伝達性遺伝子ｔｒａおよび共役伝達性遺伝子ｍｏｂ、そしてｏｒｉＴ配列がある。ｔｒａがコードするタンパク質は、供与菌・受容菌間の相互作用に関与する。ｍｏｂがコードするタンパク質はｏｒｉＴ配列にニックを入れる機能、さらに一本鎖となったＤＮＡを安定に運ぶ機能を有する。ｏｒｉＴ配列は、ニックサイトとニックが入るための認識配列から成る。これら３種が共存してはじめて接合伝達が起こる。
ｐＪＲＤ２１５構築のもとになったＲＳＦ１０１０の研究はこれまでさかんに行われている。接合伝達性に関するｍｏｂＢ遺伝子の部分欠失、あるいはｍｏｂＡ，ｍｏｂＢ両遺伝子の部分欠失、あるいはｏｒｉＴ配列の部分欠失により、エシェリキア・コリでは複製されるプラスミドの数が上昇し、接合伝達性が大幅に除去されることがすでに知られている（Ｊ．Ｆｒｅｙ，Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｇｅｎｅ，１１３，１０１−１０６（１９９２））。また、ＲＳＦ１０１０のｏｒｉＴ領域、ｍｏｂ遺伝子領域と高い相同性を示すプラスミドＲ１１６２を用いた研究では、ｍｏｂＡ遺伝子の１８０番目以降のアミノ酸を欠失した場合、あるいはｍｏｂＡ遺伝子の２５番目のアミノ酸残基をチロシンからフェニルアラニンに置換することにより、ｍｏｂタンパク質の機能が不活化したとの報告がある（Ｅ．Ｃ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７７，１４５７５−１４５８０（２００２））。
しかし、ＲＳＦ１０１０のｍｏｂＡ遺伝子は複製に関与するｒｅｐＢ遺伝子と一部重複しているため（Ｐ．Ｓｃｈｏｌｚ，Ｖ．Ｈａｒｉｎｇ等，Ｇｅｎｅ，７５，２７１−２８８（１９８９））、シュードモナス・プチダではｍｏｂＡ，ｍｏｂＢ遺伝子を部分欠失させるとベクターが複製しないという報告もあり（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｐ．Ｓｃｈｏｌｚ等，Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ，２４，２０９−２２３（１９８６））、ラルストニア・ユートロファでこのような改変ベクターが複製されるかは不明であった。
また、ｐＪＲＤ２１５は、接合伝達に関与する遺伝子のうち、ｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有するため、工業スケールでのポリエステル製造時にｐＪＲＤ２１５を保有する形質転換体が万が一漏洩した場合、ＲＰ４のようにｔｒａ遺伝子含有プラスミドを持つ微生物と接触すると、接合伝達が生じる可能性があり、組換え体の封じ込めといった安全面での課題を有していた。
また、これまでラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株（ＤＳＭ５４１）（ポリエステル合成能欠損株）への形質転換法として、主として用いられてきたのは、上記の接合伝達法であった。したがって接合伝達能を失わせた場合、接合伝達法以外の方法、すなわちエレクトロポレーション法やカルシウム法等を用いて形質転換することが必須となる。しかし、ｐＪＲＤ２１５ベクターを宿主であるラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株に導入する場合、そのプラスミドの大きさから形質転換効率が著しく低下することが経験的に知られていた。
従って、接合伝達能力を欠失させた場合、宿主の形質転換を容易に行うため、ポリエステル合成酵素発現プラスミドの改良といった新たな課題が生じる。このため、エレクトロポレーション法等を用いて本ベクターを宿主であるラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株に導入する場合に、形質転換効率の向上のため、プラスミドサイズの小型化が望まれていた。
発明の要約
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、従来用いていた広宿主域ベクターｐＪＲＤ２１５から、ｍｏｂ遺伝子群の部分欠失もしくは塩基置換、および／または、ｏｒｉＴ配列の部分欠失もしくは全欠失を行うことにより、ベクターの持つ接合伝達能力を著しく低下させ、工業的により安全に使用可能なベクターが得られることを見いだした。
また、操作性向上のため、広宿主域ベクターｐＪＲＤ２１５から、不要な遺伝子配列部分、すなわちストレプトマイシン耐性遺伝子およびｃｏｓ配列を欠失させることにより、形質転換効率の向上した小型ベクターが得られることを見いだした。
さらに、作製したそれらのベクターに、アエロモナス・キャビエ由来のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を合成する酵素発現ユニット（ＥＥ３２、ＥＥ３２ｄ１３、Ｎ１４９Ｓ、Ｄ１７１Ｇ、Ｆ３５３Ｔ等）を挿入した発現プラスミドを、ラルストニア・ユートロファに遺伝子導入した該形質転換体を用いて、ポリエステルを製造することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、より工業的に安全であることを特徴とする広宿主域ベクター、該ベクターに少なくともポリエステル合成酵素遺伝子を導入したポリエステル合成酵素発現プラスミド、該プラスミドを含むポリエステル合成能を有する形質転換体、および該プラスミドを使用したポリエステルの製造方法に関する。
つまり、本発明は、接合伝達能力の一部または全てを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；上記ポリエステル合成酵素発現プラスミドによって形質転換された形質転換体；ポリエステルが、下式（１）
（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である、上記発現プラスミドまたは形質転換体を用いたポリエステルの製造方法、に関する。
発明の詳細な開示
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミドは、接合伝達能力の一部または全てを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミドである。
ベクター作製
まず、ベクターの作製について説明する。
全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。また、クローニング宿主としては、特に限定はないが、例えば大腸菌等が挙げられる。
本発明において使用するベクターとしては、接合伝達性遺伝子を持つ広宿主域ベクターであれば特に制限はないが、特開平７−２６５０６５号公報に記載のｐＪＲＤ２１５を好ましく使用することができる。また、ｐＪＲＤ２１５の塩基配列を配列番号１に示す。
ベクターから接合伝達能を低下あるいは欠失させるには、接合伝達性に関与する遺伝子領域を全欠失、部分欠失、塩基挿入、塩基置換等のいずれかを行うことによって、その機能を低下あるいは欠失させることができる。
例えばｐＪＲＤ２１５であれば、ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ、ｍｏｂＣ、ｏｒｉＴ配列に対し、全欠失、部分欠失、塩基挿入、塩基置換等のいずれかを行う。ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ、ｍｏｂＣ、ｏｒｉＴ配列のうちのどの遺伝子の機能を欠失させてもよいが、特に、可動性に必須であるｍｏｂＡ遺伝子、あるいはニックサイトを持つｏｒｉＴ配列に対して上記の操作を行うことが好ましい。また、機能を低下あるいは欠失させる遺伝子は、１種類でもよいが２種類以上ならばさらに好ましい。
なお、ｐＪＲＤ２１５は、ＲＳＦ１０１０の誘導体であるため、Ｐ．Ｓｃｈｏｌｚ，Ｖ．Ｈａｒｉｎｇ等，Ｇｅｎｅ，７５，２７１−２８８（１９８９）でのＲＳＦ１０１０の定義をそのまま引用することができる。すなわち、ｐＪＲＤ２１５のｏｒｉＴ配列は配列番号１の３０８１〜３１６９であり、ニックサイトは３１３８と３１３９の間と定義できる。また、ｍｏｂＡ遺伝子は配列番号１の３２５０〜４４０７、ｍｏｂＢ遺伝子は配列番号１の３９９８〜４４１１と定義することができる。
接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失または変異であるポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の３７３７〜４３７８を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の４０００〜４３７８を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の３３２３のアデニンをチミンへ置換したポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
また、接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｏｒｉＴ領域の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
さらに、接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域およびｏｒｉＴ領域の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１７８の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３２１４の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３０９５〜３２１４の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
ここで、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失は、ｍｏｂ遺伝子部分を含む制限酵素断片の欠失、またはＰＣＲを用いた欠失等により行うことができる。また、ｍｏｂ遺伝子領域の変異は、部位特異的変異導入法等により行うことができる。さらに、ｏｒｉＴ領域の欠失は、上記ｍｏｂ遺伝子領域の欠失の場合と同様に、ｏｒｉＴ部分を含む制限酵素断片の欠失、またはＰＣＲを用いた欠失等により行うことができる。
また、形質転換効率の向上のためにプラスミドを小型化するには、ポリエステル合成酵素遺伝子の発現およびプラスミド複製に不要である部分を欠失させることにより行える。例えば、使用するベクターに抗生物質耐性遺伝子が２つ以上あるならば、そのどちらかを欠失させることができる。
例えばｐＪＲＤ２１５の場合、カナマイシン耐性遺伝子あるいはストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失させることが可能であるが、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失させることが好ましい。
また、ｐＪＲＤ２１５の場合、プラスミドの小型化を目的とし、プラスミドの複製に関与しないマルチクローニングサイトやｃｏｓ領域等も欠失させることができる。マルチクローニングサイトおよびラムダファージ由来のｃｏｓ領域は、明確に定義されていないが、Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｍ．ＨｅｕｓｔｅｒｓＰｒｅｕｔｅ等，Ｇｅｎｅ，５１，２７５−２８０（１９８７）より、配列番号１の９６８０〜１０１３０付近がマルチクローニングサイトであり、９２６０〜９６６０付近がｃｏｓ領域であるといえる。
ストレプトマイシン耐性遺伝子領域を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の２０６〜１６９０を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
ｃｏｓ領域を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の９２３７〜１０１２７を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の８９１５〜１００５５を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
ストレプトマイシン耐性遺伝子領域の欠失、ｃｏｓ領域の欠失、マルチクローニングサイトの欠失も、上記ｍｏｂ遺伝子領域の欠失と同様にして行うことができる。
また、接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミドも好適に用いることができる。なお、当該ポリエステル合成酵素発現プラスミドは、上述の接合伝達能力の一部または全ての欠失およびストレプトマイシン耐性遺伝子の欠失を組み合わせることにより得ることができる。
さらに、ｃｏｓ領域の欠失やマルチクローニングサイトの欠失を組み合わせることもでき、例えば、接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；接合伝達能力の一部または全てを欠失し、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
次に、ポリエステル合成酵素発現プラスミドの作製について説明する。
上記のようにして作製したベクターに、ポリエステル合成酵素遺伝子を挿入することにより、本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミドを作製することができる。
ポリエステル合成酵素遺伝子としては、構造遺伝子のほかに、プロモーター、ターミネーター等、宿主菌で機能する発現ユニットを有していればよい。
ポリエステル合成酵素遺伝子は、アエロモナス・キャビエ由来のものが好ましく、例えば、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているアエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２、ＥＥ３２ｄ１３等を用いることができる。また、Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２）に記載されている、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子）、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）、あるいは、コンピューター上での酵素の立体構造または予想される立体構造を基に有用なアミノ酸変異を特定可能なプログラム等、例えばＳｈｒｉｋｅ（特開２００１−１８４８３１）により設計された、３５３番目のアミノ酸のフェニルアラニンがスレオニンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｆ３５３Ｔ変異体遺伝子）、または、上記置換の内のいずれか２つ以上のアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（上記変異を組み合わせた変異体遺伝子）等を好ましく用いることができる。なお、ポリエステル合成酵素発現プラスミドには、上記発現ユニットが１個以上複数個存在してもよい。
形質転換体の作製
次に、形質転換体の作製について説明する。
本発明の形質転換体は、上記ポリエステル合成酵素発現プラスミドによって形質転換されたものである。つまり、本発明の形質転換体は、上記で得られたポリエステル合成酵素発現プラスミドを、当該プラスミドに適合する宿主中に導入することにより得られる。
宿主としては、特に制限はないが、天然から単離された微生物や、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている徴生物等を使用できる。具体的にはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の細菌類を使用することができる。好ましくはラルストニア属であり、より好ましくはラルストニア・ユートロファである。
微生物へのポリエステル合成酵素発現プラスミドの導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）や、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））等を用いることができる。
本発明に用いる好ましい形質転換体としては、例えば、宿主としてのラルストニア・ユートロファに、各ポリエステル合成酵素発現プラスミドを導入した形質転換体等が挙げられる。具体的には、以下に示す形質転換体等が挙げられる。ｐＪＲＤｄｃｍＢＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｃｍＢＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５２、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５３、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄｃｍ１６３ＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｃｍ１６３ＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５４、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄＴｃｓＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃｓＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５５、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２４、原寄託日平成１５年５月１６日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、
ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２５、原寄託日平成１５年５月１６日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、
ｐＪＲＤｄｓＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｓＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５８、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２６、原寄託日平成１５年５月１６日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、
ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６０、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧを導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２３、寄託日平成１６年２月１３日、ブダペスト条約に基づく国際寄託）。
なお、これら形質転換体はいずれも、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
ポリエステル生産
次に、ポリエステルの生産について説明する。
本発明のポリエステルの製造方法は、上記発現プラスミドまたは形質転換体を用い、下式（１）
（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造する方法である。
ポリエステルの生産においては、糖、油脂または脂肪酸を炭素源として与え、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、上記形質転換体を培養することができる。
例えば、ラルストニア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属またはシュードモナス属に属する微生物等の細菌を宿主として得られた形質転換体を、培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源を与え、場合によっては、窒素源、無機塩類および有機栄養源のうちのいずれかを制限した培地、例えば窒素源を０．０１〜０．１％に制限した培地等を用いることができる。
糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
また、培養液中に、ベクターに存在する耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。
培養温度は、その菌の生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜７日間程度で良い。
その後、得られた該培養菌体からポリエステルを回収すればよい。
本発明において、菌体からのポリエステルの回収は、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から、遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収する。
得られたポリエステルの平均分子量や３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。あるいは、ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。
接合伝達能の評価
次に、接合伝達能の評価について説明する。作製したベクターの接合伝達能は、以下の方法で評価することができるが、この方法に限定されるものではない。
まず、評価するベクターを、ｔｒａ遺伝子を持つ細菌に形質転換し、これを供与菌とする。ｔｒａ遺伝子を持つ細菌としては、例えばエシェリキア・コリＳ１７−１株等を用いることができる。受容菌としては、供与菌と共存培養でき、かつ、評価するベクターがその細胞内で複製できる細菌であればどのようなものでも用いることができるが、混合培養後に供与菌と分離できるよう、供与菌とは異なる抗生物質耐性を持つものが望ましい。
次に、供与菌と受容菌それぞれを、あらかじめ適当な培地で培養して増やし、それぞれを混合した後、適当な培地に接種することにより混合培養を行う。
この時用いる培地としては、固体、液体のどちらを用いてもよく、抗生物質は添加しない。混合培養の培養温度は、供与菌、受容菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間には特に制限はないが、５時間から２０時間が好ましい。
接合伝達能の評価は、受容菌あたりの接合伝達頻度を算出することにより行うが、この方法に限定されるものではない。接合伝達頻度の算出方法は、以下の実施例に詳しく記載する。
その中で、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）の製造方法が開示されている（例えば、特開昭５７−１５０３９３号公報、特開昭５９−２２０１９２号公報参照）。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際のところＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルム等に使用するのに要求される柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成型体の分野にしか利用されなかった。
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）およびその製造方法について研究がなされた（特開平５−９３０４９号公報、特開平７−２６５０６５号公報）。これら文献のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエを用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８，４８２２−４８２３（１９９５））。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてアエロモナス・キャビエを培養し、３ＨＨが１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。しかしながら、本製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量３０％でありポリマー生産性が低いことから、実用化に向け更に高い生産性が得られる方法が探索された。
当該Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものから糸やフィルム等のような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、これらの製造方法では本ポリマーの生産性が依然として低く、本ポリマーの実用化に向けた生産方法としては未だ不十分といわざるを得ない。
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産するアエロモナス・キャビエよりポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）シンターゼ遺伝子がクローニングされた（特開平１０−１０８６８２号公報、Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９，１５，４８２１−４８３０（１９９７））。本遺伝子をラルストニア・ユートロファ（旧アルカリゲネス・ユートロファス）に導入した形質転換体を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った結果、菌体生産性は４ｇ／Ｌ、ポリマー含量は３０％であった。更に本形質転換体を炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体含量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（Ｔ．Ｈｕｋｕｉ等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．４９，３３３（１９９８））。本研究で使用されたＰＨＡ合成酵素発現プラスミドは、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ ３７５３３）にポリエステル合成酵素遺伝子を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等であった（特開平１０−１０８６８２号公報）。その後、本酵素に対して種々のＰＨＡ合成酵素変異体が作られた。その中で、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示されている（Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２））。
ｐＪＲＤ２１５は、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０の誘導体であり、接合伝達性を有している（Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｍ．Ｈｅｕｓｔｅｒｓｐｒｅｕｔｅ等，Ｇｅｎｅ，５１，２７５−２８０（１９８７））。
接合伝達とは、異なる形質を持つ細菌を混合培養した時に起こる現象であり、ある細菌（供与菌）の遺伝子の一部が、他の細菌（受容菌）に移ることを指す。接合伝達能力の強度は、供与体の染色体上あるいは供与体が持つプラスミド上の接合伝達に関与する遺伝子によって決定される。接合伝達に関与する遺伝子には、自己伝達性遺伝子ｔｒａおよび共役伝達性遺伝子ｍｏｂ、そしてｏｒｉＴ配列がある。ｔｒａがコードするタンパク質は、供与菌・受容菌間の相互作用に関与する。ｍｏｂがコードするタンパク質はｏｒｉＴ配列にニックを入れる機能、さらに一本鎖となったＤＮＡを安定に運ぶ機能を有する。ｏｒｉＴ配列は、ニックサイトとニックが入るための認識配列から成る。これら３種が共存してはじめて接合伝達が起こる。
ｐＪＲＤ２１５構築のもとになったＲＳＦ１０１０の研究はこれまでさかんに行われている。接合伝達性に関するｍｏｂＢ遺伝子の部分欠失、あるいはｍｏｂＡ，ｍｏｂＢ両遺伝子の部分欠失、あるいはｏｒｉＴ配列の部分欠失により、エシェリキア・コリでは複製されるプラスミドの数が上昇し、接合伝達性が大幅に除去されることがすでに知られている（Ｊ．Ｆｒｅｙ，Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｇｅｎｅ，１１３，１０１−１０６（１９９２））。また、ＲＳＦ１０１０のｏｒｉＴ領域、ｍｏｂ遺伝子領域と高い相同性を示すプラスミドＲ１１６２を用いた研究では、ｍｏｂＡ遺伝子の１８０番目以降のアミノ酸を欠失した場合、あるいはｍｏｂＡ遺伝子の２５番目のアミノ酸残基をチロシンからフェニルアラニンに置換することにより、ｍｏｂタンパク質の機能が不活化したとの報告がある（Ｅ．Ｃ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７７，１４５７５−１４５８０（２００２））。
しかし、ＲＳＦ１０１０のｍｏｂＡ遺伝子は複製に関与するｒｅｐＢ遺伝子と一部重複しているため（Ｐ．Ｓｃｈｏｌｚ，Ｖ．Ｈａｒｉｎｇ等，Ｇｅｎｅ，７５，２７１−２８８（１９８９））、シュードモナス・プチダではｍｏｂＡ，ｍｏｂＢ遺伝子を部分欠失させるとベクターが複製しないという報告もあり（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｐ．Ｓｃｈｏｌｚ等，Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ，２４，２０９−２２３（１９８６））、ラルストニア・ユートロファでこのような改変ベクターが複製されるかは不明であった。
また、ｐＪＲＤ２１５は、接合伝達に関与する遺伝子のうち、ｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有するため、工業スケールでのポリエステル製造時にｐＪＲＤ２１５を保有する形質転換体が万が一漏洩した場合、ＲＰ４のようにｔｒａ遺伝子含有プラスミドを持つ微生物と接触すると、接合伝達が生じる可能性があり、組換え体の封じ込めといった安全面での課題を有していた。
また、これまでラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株（ＤＳＭ５４１）（ポリエステル合成能欠損株）への形質転換法として、主として用いられてきたのは、上記の接合伝達法であった。したがって接合伝達能を失わせた場合、接合伝達法以外の方法、すなわちエレクトロポレーション法やカルシウム法等を用いて形質転換することが必須となる。しかし、ｐＪＲＤ２１５ベクターを宿主であるラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株に導入する場合、そのプラスミドの大きさから形質転換効率が著しく低下することが経験的に知られていた。
従って、接合伝達能力を欠失させた場合、宿主の形質転換を容易に行うため、ポリエステル合成酵素発現プラスミドの改良といった新たな課題が生じる。このため、エレクトロポレーション法等を用いて本ベクターを宿主であるラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株に導入する場合に、形質転換効率の向上のため、プラスミドサイズの小型化が望まれていた。
発明の要約
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、従来用いていた広宿主域ベクターｐＪＲＤ２１５から、ｍｏｂ遺伝子群の部分欠失もしくは塩基置換、および／または、ｏｒｉＴ配列の部分欠失もしくは全欠失を行うことにより、ベクターの持つ接合伝達能力を著しく低下させ、工業的により安全に使用可能なベクターが得られることを見いだした。
また、操作性向上のため、広宿主域ベクターｐＪＲＤ２１５から、不要な遺伝子配列部分、すなわちストレプトマイシン耐性遺伝子およびｃｏｓ配列を欠失させることにより、形質転換効率の向上した小型ベクターが得られることを見いだした。
さらに、作製したそれらのベクターに、アエロモナス・キャビエ由来のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を合成する酵素発現ユニット（ＥＥ３２、ＥＥ３２ｄ１３、Ｎ１４９Ｓ、Ｄ１７１Ｇ、Ｆ３５３Ｔ等）を挿入した発現プラスミドを、ラルストニア・ユートロファに遺伝子導入した該形質転換体を用いて、ポリエステルを製造することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、より工業的に安全であることを特徴とする広宿主域ベクター、該ベクターに少なくともポリエステル合成酵素遺伝子を導入したポリエステル合成酵素発現プラスミド、該プラスミドを含むポリエステル合成能を有する形質転換体、および該プラスミドを使用したポリエステルの製造方法に関する。
つまり、本発明は、接合伝達能力の一部または全てを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；上記ポリエステル合成酵素発現プラスミドによって形質転換された形質転換体；ポリエステルが、下式（１）
発明の詳細な開示
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミドは、接合伝達能力の一部または全てを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミドである。
ベクター作製
まず、ベクターの作製について説明する。
全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。また、クローニング宿主としては、特に限定はないが、例えば大腸菌等が挙げられる。
本発明において使用するベクターとしては、接合伝達性遺伝子を持つ広宿主域ベクターであれば特に制限はないが、特開平７−２６５０６５号公報に記載のｐＪＲＤ２１５を好ましく使用することができる。また、ｐＪＲＤ２１５の塩基配列を配列番号１に示す。
ベクターから接合伝達能を低下あるいは欠失させるには、接合伝達性に関与する遺伝子領域を全欠失、部分欠失、塩基挿入、塩基置換等のいずれかを行うことによって、その機能を低下あるいは欠失させることができる。
例えばｐＪＲＤ２１５であれば、ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ、ｍｏｂＣ、ｏｒｉＴ配列に対し、全欠失、部分欠失、塩基挿入、塩基置換等のいずれかを行う。ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ、ｍｏｂＣ、ｏｒｉＴ配列のうちのどの遺伝子の機能を欠失させてもよいが、特に、可動性に必須であるｍｏｂＡ遺伝子、あるいはニックサイトを持つｏｒｉＴ配列に対して上記の操作を行うことが好ましい。また、機能を低下あるいは欠失させる遺伝子は、１種類でもよいが２種類以上ならばさらに好ましい。
なお、ｐＪＲＤ２１５は、ＲＳＦ１０１０の誘導体であるため、Ｐ．Ｓｃｈｏｌｚ，Ｖ．Ｈａｒｉｎｇ等，Ｇｅｎｅ，７５，２７１−２８８（１９８９）でのＲＳＦ１０１０の定義をそのまま引用することができる。すなわち、ｐＪＲＤ２１５のｏｒｉＴ配列は配列番号１の３０８１〜３１６９であり、ニックサイトは３１３８と３１３９の間と定義できる。また、ｍｏｂＡ遺伝子は配列番号１の３２５０〜４４０７、ｍｏｂＢ遺伝子は配列番号１の３９９８〜４４１１と定義することができる。
接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失または変異であるポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の３７３７〜４３７８を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の４０００〜４３７８を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の３３２３のアデニンをチミンへ置換したポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
また、接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｏｒｉＴ領域の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
さらに、接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域およびｏｒｉＴ領域の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１７８の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３２１４の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３０９５〜３２１４の欠失であるポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
ここで、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失は、ｍｏｂ遺伝子部分を含む制限酵素断片の欠失、またはＰＣＲを用いた欠失等により行うことができる。また、ｍｏｂ遺伝子領域の変異は、部位特異的変異導入法等により行うことができる。さらに、ｏｒｉＴ領域の欠失は、上記ｍｏｂ遺伝子領域の欠失の場合と同様に、ｏｒｉＴ部分を含む制限酵素断片の欠失、またはＰＣＲを用いた欠失等により行うことができる。
また、形質転換効率の向上のためにプラスミドを小型化するには、ポリエステル合成酵素遺伝子の発現およびプラスミド複製に不要である部分を欠失させることにより行える。例えば、使用するベクターに抗生物質耐性遺伝子が２つ以上あるならば、そのどちらかを欠失させることができる。
例えばｐＪＲＤ２１５の場合、カナマイシン耐性遺伝子あるいはストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失させることが可能であるが、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失させることが好ましい。
また、ｐＪＲＤ２１５の場合、プラスミドの小型化を目的とし、プラスミドの複製に関与しないマルチクローニングサイトやｃｏｓ領域等も欠失させることができる。マルチクローニングサイトおよびラムダファージ由来のｃｏｓ領域は、明確に定義されていないが、Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｍ．ＨｅｕｓｔｅｒｓＰｒｅｕｔｅ等，Ｇｅｎｅ，５１，２７５−２８０（１９８７）より、配列番号１の９６８０〜１０１３０付近がマルチクローニングサイトであり、９２６０〜９６６０付近がｃｏｓ領域であるといえる。
ストレプトマイシン耐性遺伝子領域を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の２０６〜１６９０を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
ｃｏｓ領域を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミドとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の９２３７〜１０１２７を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド；ｐＪＲＤ２１５の８９１５〜１００５５を欠失させたポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
ストレプトマイシン耐性遺伝子領域の欠失、ｃｏｓ領域の欠失、マルチクローニングサイトの欠失も、上記ｍｏｂ遺伝子領域の欠失と同様にして行うことができる。
また、接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミドも好適に用いることができる。なお、当該ポリエステル合成酵素発現プラスミドは、上述の接合伝達能力の一部または全ての欠失およびストレプトマイシン耐性遺伝子の欠失を組み合わせることにより得ることができる。
さらに、ｃｏｓ領域の欠失やマルチクローニングサイトの欠失を組み合わせることもでき、例えば、接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド；接合伝達能力の一部または全てを欠失し、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド等が挙げられる。
次に、ポリエステル合成酵素発現プラスミドの作製について説明する。
上記のようにして作製したベクターに、ポリエステル合成酵素遺伝子を挿入することにより、本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミドを作製することができる。
ポリエステル合成酵素遺伝子としては、構造遺伝子のほかに、プロモーター、ターミネーター等、宿主菌で機能する発現ユニットを有していればよい。
ポリエステル合成酵素遺伝子は、アエロモナス・キャビエ由来のものが好ましく、例えば、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているアエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２、ＥＥ３２ｄ１３等を用いることができる。また、Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２）に記載されている、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子）、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）、あるいは、コンピューター上での酵素の立体構造または予想される立体構造を基に有用なアミノ酸変異を特定可能なプログラム等、例えばＳｈｒｉｋｅ（特開２００１−１８４８３１）により設計された、３５３番目のアミノ酸のフェニルアラニンがスレオニンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｆ３５３Ｔ変異体遺伝子）、または、上記置換の内のいずれか２つ以上のアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（上記変異を組み合わせた変異体遺伝子）等を好ましく用いることができる。なお、ポリエステル合成酵素発現プラスミドには、上記発現ユニットが１個以上複数個存在してもよい。
形質転換体の作製
次に、形質転換体の作製について説明する。
本発明の形質転換体は、上記ポリエステル合成酵素発現プラスミドによって形質転換されたものである。つまり、本発明の形質転換体は、上記で得られたポリエステル合成酵素発現プラスミドを、当該プラスミドに適合する宿主中に導入することにより得られる。
宿主としては、特に制限はないが、天然から単離された微生物や、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている徴生物等を使用できる。具体的にはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の細菌類を使用することができる。好ましくはラルストニア属であり、より好ましくはラルストニア・ユートロファである。
微生物へのポリエステル合成酵素発現プラスミドの導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）や、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））等を用いることができる。
本発明に用いる好ましい形質転換体としては、例えば、宿主としてのラルストニア・ユートロファに、各ポリエステル合成酵素発現プラスミドを導入した形質転換体等が挙げられる。具体的には、以下に示す形質転換体等が挙げられる。ｐＪＲＤｄｃｍＢＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｃｍＢＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５２、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５３、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄｃｍ１６３ＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｃｍ１６３ＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５４、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄＴｃｓＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃｓＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５５、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２４、原寄託日平成１５年５月１６日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、
ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２５、原寄託日平成１５年５月１６日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、
ｐＪＲＤｄｓＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｓＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５８、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２６、原寄託日平成１５年５月１６日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、
ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３を導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６０、寄託日平成１５年５月１６日）、
ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧを導入した形質転換体である、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２３、寄託日平成１６年２月１３日、ブダペスト条約に基づく国際寄託）。
なお、これら形質転換体はいずれも、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
ポリエステル生産
次に、ポリエステルの生産について説明する。
本発明のポリエステルの製造方法は、上記発現プラスミドまたは形質転換体を用い、下式（１）
ポリエステルの生産においては、糖、油脂または脂肪酸を炭素源として与え、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、上記形質転換体を培養することができる。
例えば、ラルストニア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属またはシュードモナス属に属する微生物等の細菌を宿主として得られた形質転換体を、培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源を与え、場合によっては、窒素源、無機塩類および有機栄養源のうちのいずれかを制限した培地、例えば窒素源を０．０１〜０．１％に制限した培地等を用いることができる。
糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
また、培養液中に、ベクターに存在する耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。
培養温度は、その菌の生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜７日間程度で良い。
その後、得られた該培養菌体からポリエステルを回収すればよい。
本発明において、菌体からのポリエステルの回収は、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から、遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収する。
得られたポリエステルの平均分子量や３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。あるいは、ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。
接合伝達能の評価
次に、接合伝達能の評価について説明する。作製したベクターの接合伝達能は、以下の方法で評価することができるが、この方法に限定されるものではない。
まず、評価するベクターを、ｔｒａ遺伝子を持つ細菌に形質転換し、これを供与菌とする。ｔｒａ遺伝子を持つ細菌としては、例えばエシェリキア・コリＳ１７−１株等を用いることができる。受容菌としては、供与菌と共存培養でき、かつ、評価するベクターがその細胞内で複製できる細菌であればどのようなものでも用いることができるが、混合培養後に供与菌と分離できるよう、供与菌とは異なる抗生物質耐性を持つものが望ましい。
次に、供与菌と受容菌それぞれを、あらかじめ適当な培地で培養して増やし、それぞれを混合した後、適当な培地に接種することにより混合培養を行う。
この時用いる培地としては、固体、液体のどちらを用いてもよく、抗生物質は添加しない。混合培養の培養温度は、供与菌、受容菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間には特に制限はないが、５時間から２０時間が好ましい。
接合伝達能の評価は、受容菌あたりの接合伝達頻度を算出することにより行うが、この方法に限定されるものではない。接合伝達頻度の算出方法は、以下の実施例に詳しく記載する。
図１は、本発明のｍｏｂ領域欠失ベクターおよびストレプトマイシン耐性遺伝子欠失ベクター構築図である。
図２は、本発明のｃｏｓ領域ｏｒｉＴ領域欠失ベクター構築図である。
図３は、本発明のｍｏｂ遺伝子領域部分欠失ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
図４は、本発明のｍｏｂ遺伝子領域部分欠失ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
図５は、本発明のｍｏｂＡ遺伝子変異ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
図６は、本発明のｍｏｂ領域およびｏｒｉＴ領域欠失ベクター構築図である。
図２は、本発明のｃｏｓ領域ｏｒｉＴ領域欠失ベクター構築図である。
図３は、本発明のｍｏｂ遺伝子領域部分欠失ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
図４は、本発明のｍｏｂ遺伝子領域部分欠失ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
図５は、本発明のｍｏｂＡ遺伝子変異ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
図６は、本発明のｍｏｂ領域およびｏｒｉＴ領域欠失ベクター構築図である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
（実施例１） ｍｏｂＡ，ｍｏｂＢ遺伝子部分欠失
プラスミドｐＪＲＤ２１５を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断することにより、ｍｏｂＡおよびＢ遺伝子の一部分を欠失させた約９．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造（株）製）を用いて自己連結させ、プラスミドｐＪＲＤｄｍを得た（図１）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｍは、ｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５を欠失させたものである。
（実施例２） ｃｏｓ領域欠失およびｏｒｉＴ領域欠失
プラスミドｐＪＲＤ２１５を制限酵素ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩで切断したものを、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、自己連結させた。このプラスミドをｐＪＲＤｄｃとする（図２）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｃは、ｐＪＲＤ２１５の８９１５〜１００５５を欠失させたものである。
次に、プラスミドｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号４と配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、同様にｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号５と配列番号７で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られた２断片に重複部分があることを利用して、オーバーラップＰＣＲ法を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造（株）製）を用いた。このオーバーラップＰＣＲ法により得られた約２．８ｋｂの断片を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆ１ＩＩＩで切断し、同様にＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断しておいた上記のｐＪＲＤｄｃと連結させた。これにより、ｐＪＲＤｄＴｃを得た（図２）。当該プラスミドｐＪＲＤｄＴｃは、ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
また同様に、ｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号４と配列番号８で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、同様にｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号５と配列番号９で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られた２断片に重複部分があることを利用して、オーバーラップＰＣＲ法を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。このオーバーラップＰＣＲ法により得られた約２．８ｋｂの断片を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断し、同様に制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断したｐＪＲＤｄｃと連結させた。これにより、ｐＪＲＤｄｎｃを得た（図２）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｎｃは、ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１４５を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
（実施例３） ｐＪＲＤｄｍからｃｏｓ領域欠失およびｍｏｂ遺伝子領域欠失あるいは変異導入
プラスミドｐＪＲＤｄｍを制限酵素ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩで切断したものを、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、自己連結させた。このプラスミドをｐＪＲＤｄｃｍとする（図３）。
次に、ｐＪＲＤｄｃｍを鋳型とし、配列番号５と配列番号１０で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｖａｎ９１ＩとＡｆｌＩＩＩで切断し、同様に制限酵素Ｖａｎ９１ＩとＡｆｌＩＩＩで切断したｐＪＲＤｄｃｍに連結し、プラスミドｐＪＲＤｄｃｍ４３８０を得た（図３）。
一方、ｐＪＲＤ２１５を鋳型として、配列番号１１と１２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断し、制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＳＴＶ２８ベクター（宝酒造（株）社製使用）に挿入し、ｐＳＴＶｍｏｂを作成した。次に、ｐＳＴＶｍｏｂ中のＶａｎ９１Ｉサイト３つあるうちの２番目のＶａｎ９１Ｉサイトを欠失するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１３と配列番号１４を用いてｐＳＴＶｍｏｂを増幅した。ポリメラーゼとしてはＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。ＰＣＲ反応後、制限酵素ＤｐｎＩを加え鋳型としたプラスミドを切断し、エシェリキア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換体よりＶａｎ９１Ｉサイトを１つ欠失したプラスミドｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを得た（図４）。
次に、鋳型としてｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを用い、プライマーとして配列番号１５と配列番号１６を用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。増幅した断片を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断し、Ｖａｎ９１Ｉ処理したｐＪＲＤｄｃｍ４３８０と連結することにより、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３を得た（図４）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｃｍ１６３は、ｐＪＲＤ２１５の３７３７〜４３７８を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
同様に、鋳型としてｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを用い、プライマーとして配列番号１５と配列番号１７を用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。増幅した断片を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断し、Ｖａｎ９１Ｉ処理したｐＪＲＤｄｃｍ４３８０と連結することにより、ｐＪＲＤｄｃｍＢを得た（図４）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｃｍＢは、ｐＪＲＤ２１５の４０００〜４３７８を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
次に、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３３２３のアデニンをチミンに置換するために、すなわちｍｏｂＡ遺伝子の２５番目のアミノ酸残基をチロシンからフェニルアラニンに置換するために、以下の作業を行った。ｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを鋳型とし、ＰＣＲプライマーとして配列番号１８と配列番号１９を用いて増幅した。ポリメラーゼとしてはＰｆｕを用いた。ＰＣＲ反応後、制限酵素ＤｐｎＩを加え鋳型としたプラスミドを切断し、エシェリキア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換体よりｐＳＴＶｍｏｂ２５ＹＦを得た（図５）。ｐＳＴＶｍｏｂ２５ＹＦをＶａｎ９１Ｉ処理して得られた約０．９ｋｂの断片を、Ｖａｎ９１Ｉで切断したｐＪＲＤｄｃに連結し、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦを得た（図５）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦは、ｐＪＲＤ２１５の３３２３のアデニンをチミンへ置換し、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
（実施例４） ストレプトマイシン耐性遺伝子欠失
ｐＪＲＤ２１５および実施例１〜３で得たベクターｐＪＲＤｄｍ、ｐＪＲＤｄＴｃ、ｐＪＲＤｄｎｃ、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３、ｐＪＲＤｄｃｍＢ、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦを、制限酵素ＥｃｏＩＣＲＩとＰｓｈＡＩで切断することにより、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ｓｔｒＡおよびｓｔｒＢ遺伝子）のうち約１．５ｋｂを欠失させ、平滑末端となった約８．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを自己連結させ、プラスミドｐＪＲＤｄｓ、ｐＪＲＤｄｍｓ、ｐＪＲＤｄＴｃｓ、ｐＪＲＤｄｎｃｓ、ｐＪＲＤｄｓｃｍ１６３、ｐＪＲＤｄｓｃｍＢ、ｐＪＲＤｄｓｃｍ２５ＹＦを得た（図１）。これらプラスミドは、用いたプラスミドにおいて、さらにｐＪＲＤ２１５の２０６〜１６９０を欠失させたものである。
（実施例５） ｐＪＲＤｄｍｓからｃｏｓ領域およびマルチクローニングサイト欠失
実施例４で得られたプラスミドｐＪＲＤｄｍｓを制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断したものを、配列番号２（順鎖）および配列番号３（逆鎖）に示す合成ＤＮＡ配列と連結させた。このことにより、ｃｏｓ配列およびマルチクローニングサイトを含む約０．９ｋｂを、合成ＤＮＡ４５ｂｐと置き換えることにより完全に欠失させ、約７．１ｋｂのプラスミドｐＪＲＤｄｍｓｃを得た（図１）。
（実施例６） ｍｏｂ領域およびｏｒｉＴ領域欠失ベクター作製
次に、配列番号２０と配列番号２１で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｂｅｓｔを用いた。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したプラスミドｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、プラスミドｐＪＲＤｄｍＴ１およびｐＪＲＤｄｍｓＴ１を得た（図６）。
同様に、配列番号２０と配列番号２２で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したプラスミドｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、プラスミドｐＪＲＤｄｍＴ２およびｐＪＲＤｄｍｓＴ２を得た（図６）。
さらに同様に、配列番号２０と配列番号２３で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したプラスミドｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、プラスミドｐＪＲＤｄｍＴ３およびｐＪＲＤｄｍｓＴ３を得た（図６）。
（実施例７） ポリエステル生産用発現プラスミド作製、および形質転換体構築
Ｎ１４９Ｓ変異体、Ｄ１７１Ｇ変異体、Ｆ３５３Ｔ変異体遺伝子断片は、それぞれＰＣＲ法により作成した。例えば、Ｄ１７１Ｇ変異はアエロモナス・キャビエ由来ＰＨＡ合成酵素の１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換されている。従って、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているアエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２ｄ１３を、一旦ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングしておき、配列番号２４と配列番号２５で示される合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＥｘ Ｔａｑポリメラーゼ（宝バイオ製）を用いた。
実施例１〜５で得たベクターｐＪＲＤｄｓ、ｐＪＲＤｄｍ、ｐＪＲＤｄｍｓ、ｐＪＲＤｄＴｃ、ｐＪＲＤｄＴｃｓ、ｐＪＲＤｄｎｃ、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３、ｐＪＲＤｄｃｍＢ、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦを、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２ｄ１３、または、Ｎ１４９Ｓ変異体、Ｄ１７１Ｇ変異体、Ｆ３５３Ｔ変異体の遺伝子断片をそれぞれ、上記プラスミドのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、発現プラスミドｐＪＲＤｄｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄＴｃ１４９ＮＳ、ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧ、ｐＪＲＤｄＴｃ３５３ＦＴ、ｐＪＲＤｄＴｃｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３ＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｃｍＢＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦＥＥ３２ｄ１３をそれぞれ作製した。
これらの発現プラスミドを含むラルストニア・ユートロファの形質転換体を電気パルス法により作製した。つまり、遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍのものを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌとプラスミド２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、形質転換体をそれぞれ取得した。
これらの形質転換体はそれぞれ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託を行った（ｐＪＲＤｄｃｍＢＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５２、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５３、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３ＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５４、ｐＪＲＤｄＴｃｓＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５５、ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２４、ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２５、ｐＪＲＤｄｓＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５８、ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２６、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６０、ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧ形質転換体＝ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２３）。
（実施例８） 形質転換体を使用したポリエステル生産
実施例７で得られた形質転換体を、Ｎｉｌｅｒｅｄ含有培地（リン酸水素２ナトリウム・１２水塩 ９ｇ、リン酸２水素カリウム １．５ｇ、塩化アンモニウム ０．０５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ｇ、フルクトース ０．５ｇ、塩化コバルト・６水塩 ０．２５ｐｐｍ、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水塩 １６ｐｐｍ、塩化カルシウム・２水塩 １０．３ｐｐｍ、塩化ニッケル・６水塩０．１２ｐｐｍ、硫酸銅・５水塩 ０．１６ｐｐｍ、Ｎｉｌｅｒｅｄ ０．５ｍｇ、寒天 １５ｇ／１Ｌ）に播種し、３０℃で１週間培養した。培養後、全ての株が赤変し、菌体内にポリエステルを蓄積していることが判明した。
（実施例９） 形質転換体の接合伝達能評価
実施例７に記載した発現プラスミドのうち、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３について接合伝達能評価を行った。コントロールにはｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３を用いた。
これらの発現プラスミドで形質転換されたエシェリキア・コリＳ１７−１株を供与菌とし、エシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株を受容菌とした。供与菌、受容菌それぞれをＴＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １．２％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２．４％、グリセロール ０．４％）に植菌し、３７℃で１晩培養した。ＬＢプレート（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％、寒天１．５％）上に滅菌済のニトロセルロースフィルタを載せ、培養液をそれぞれ供与菌１０μｌと受容菌１０μｌに混合させ、その混合培養液をニトロセルロースフィルタ上に接種した。３７℃で５〜１５時間培養した後、ニトロセルロースフィルタを生理食塩水１ｍｌの入ったチューブに移し、十分懸濁してニトロセルロースフィルタ上の菌を浮遊させた。
こうして得られた混合菌の懸濁液を１００〜１０７倍希釈し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート、およびクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌのみを含むＬＢプレートに、それぞれ１００μｌずつプレーティングし、３７℃で１晩培養した。培養後、それぞれの出現コロニー数を数えたところ、表１に示す結果となった。
エシェリキア・コリＳ１７−１株はクロラムフェニコール感受性かつカナマイシン感受性である。一方、エシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株は、クロラムフェニコール耐性かつカナマイシン感受性である。エシェリキア・コリＳ１７−１株の形質転換に用いた発現プラスミドは全てカナマイシン耐性遺伝子を含むので、発現プラスミドを保持する菌はカナマイシン耐性となる。したがって、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌのみを含むＬＢプレートでは、エシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株の総数を検出でき、カナマイシン５０μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートでは、発現プラスミドが伝達されたエシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株が検出できる。
そこで、受容菌あたりの接合伝達頻度は、細胞懸濁液１００μｌ中に含まれる、接合伝達により発現プラスミドが導入されたエシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株数を、エシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株の総数で割ることにより計算した。また、導入されたＸＬ１０−ｇｏｌｄの数が０であった場合は、導入されたＸＬ１０−ｇｏｌｄの数を仮に１とおいて受容菌あたりの接合伝達頻度を算出し、得られた接合伝達頻度未満と表す。以下に実際の算出値を示す。
表１の結果より、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３がｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、９／１００７×１０−５＝８．９×１０−８；ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３がｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、１３／１８３×１０−７＝７．１×１０−９；ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３がｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、１／３０１×１０−５＝３．３×１０−８未満；ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３がｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、１／４２０×１０−５＝２．４×１０−８未満であった。
同様の方法でｐＪＲＤ２１５ＥＥ３２ｄ１３の接合伝達頻度を別途試験した場合の、受容菌あたりの接合伝達頻度は、３１８／５１３×１０−３＝６．２×１０−４であったため、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３は、ｐＪＲＤ２１５ＥＥ３２ｄ１３よりも１／１０４〜１／１０５倍以下に接合伝達頻度が落ちており、ｔｒａ遺伝子と共存した場合においても接合伝達性は実質的にないと考えられる。
（実施例１） ｍｏｂＡ，ｍｏｂＢ遺伝子部分欠失
プラスミドｐＪＲＤ２１５を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断することにより、ｍｏｂＡおよびＢ遺伝子の一部分を欠失させた約９．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造（株）製）を用いて自己連結させ、プラスミドｐＪＲＤｄｍを得た（図１）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｍは、ｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５を欠失させたものである。
（実施例２） ｃｏｓ領域欠失およびｏｒｉＴ領域欠失
プラスミドｐＪＲＤ２１５を制限酵素ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩで切断したものを、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、自己連結させた。このプラスミドをｐＪＲＤｄｃとする（図２）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｃは、ｐＪＲＤ２１５の８９１５〜１００５５を欠失させたものである。
次に、プラスミドｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号４と配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、同様にｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号５と配列番号７で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られた２断片に重複部分があることを利用して、オーバーラップＰＣＲ法を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造（株）製）を用いた。このオーバーラップＰＣＲ法により得られた約２．８ｋｂの断片を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆ１ＩＩＩで切断し、同様にＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断しておいた上記のｐＪＲＤｄｃと連結させた。これにより、ｐＪＲＤｄＴｃを得た（図２）。当該プラスミドｐＪＲＤｄＴｃは、ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
また同様に、ｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号４と配列番号８で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、同様にｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号５と配列番号９で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られた２断片に重複部分があることを利用して、オーバーラップＰＣＲ法を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。このオーバーラップＰＣＲ法により得られた約２．８ｋｂの断片を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断し、同様に制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断したｐＪＲＤｄｃと連結させた。これにより、ｐＪＲＤｄｎｃを得た（図２）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｎｃは、ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１４５を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
（実施例３） ｐＪＲＤｄｍからｃｏｓ領域欠失およびｍｏｂ遺伝子領域欠失あるいは変異導入
プラスミドｐＪＲＤｄｍを制限酵素ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩで切断したものを、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、自己連結させた。このプラスミドをｐＪＲＤｄｃｍとする（図３）。
次に、ｐＪＲＤｄｃｍを鋳型とし、配列番号５と配列番号１０で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｖａｎ９１ＩとＡｆｌＩＩＩで切断し、同様に制限酵素Ｖａｎ９１ＩとＡｆｌＩＩＩで切断したｐＪＲＤｄｃｍに連結し、プラスミドｐＪＲＤｄｃｍ４３８０を得た（図３）。
一方、ｐＪＲＤ２１５を鋳型として、配列番号１１と１２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断し、制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＳＴＶ２８ベクター（宝酒造（株）社製使用）に挿入し、ｐＳＴＶｍｏｂを作成した。次に、ｐＳＴＶｍｏｂ中のＶａｎ９１Ｉサイト３つあるうちの２番目のＶａｎ９１Ｉサイトを欠失するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１３と配列番号１４を用いてｐＳＴＶｍｏｂを増幅した。ポリメラーゼとしてはＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。ＰＣＲ反応後、制限酵素ＤｐｎＩを加え鋳型としたプラスミドを切断し、エシェリキア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換体よりＶａｎ９１Ｉサイトを１つ欠失したプラスミドｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを得た（図４）。
次に、鋳型としてｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを用い、プライマーとして配列番号１５と配列番号１６を用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。増幅した断片を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断し、Ｖａｎ９１Ｉ処理したｐＪＲＤｄｃｍ４３８０と連結することにより、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３を得た（図４）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｃｍ１６３は、ｐＪＲＤ２１５の３７３７〜４３７８を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
同様に、鋳型としてｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを用い、プライマーとして配列番号１５と配列番号１７を用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。増幅した断片を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断し、Ｖａｎ９１Ｉ処理したｐＪＲＤｄｃｍ４３８０と連結することにより、ｐＪＲＤｄｃｍＢを得た（図４）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｃｍＢは、ｐＪＲＤ２１５の４０００〜４３７８を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
次に、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３３２３のアデニンをチミンに置換するために、すなわちｍｏｂＡ遺伝子の２５番目のアミノ酸残基をチロシンからフェニルアラニンに置換するために、以下の作業を行った。ｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを鋳型とし、ＰＣＲプライマーとして配列番号１８と配列番号１９を用いて増幅した。ポリメラーゼとしてはＰｆｕを用いた。ＰＣＲ反応後、制限酵素ＤｐｎＩを加え鋳型としたプラスミドを切断し、エシェリキア・コリＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換体よりｐＳＴＶｍｏｂ２５ＹＦを得た（図５）。ｐＳＴＶｍｏｂ２５ＹＦをＶａｎ９１Ｉ処理して得られた約０．９ｋｂの断片を、Ｖａｎ９１Ｉで切断したｐＪＲＤｄｃに連結し、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦを得た（図５）。当該プラスミドｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦは、ｐＪＲＤ２１５の３３２３のアデニンをチミンへ置換し、かつ、ｃｏｓ領域を欠失させたものである。
（実施例４） ストレプトマイシン耐性遺伝子欠失
ｐＪＲＤ２１５および実施例１〜３で得たベクターｐＪＲＤｄｍ、ｐＪＲＤｄＴｃ、ｐＪＲＤｄｎｃ、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３、ｐＪＲＤｄｃｍＢ、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦを、制限酵素ＥｃｏＩＣＲＩとＰｓｈＡＩで切断することにより、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ｓｔｒＡおよびｓｔｒＢ遺伝子）のうち約１．５ｋｂを欠失させ、平滑末端となった約８．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを自己連結させ、プラスミドｐＪＲＤｄｓ、ｐＪＲＤｄｍｓ、ｐＪＲＤｄＴｃｓ、ｐＪＲＤｄｎｃｓ、ｐＪＲＤｄｓｃｍ１６３、ｐＪＲＤｄｓｃｍＢ、ｐＪＲＤｄｓｃｍ２５ＹＦを得た（図１）。これらプラスミドは、用いたプラスミドにおいて、さらにｐＪＲＤ２１５の２０６〜１６９０を欠失させたものである。
（実施例５） ｐＪＲＤｄｍｓからｃｏｓ領域およびマルチクローニングサイト欠失
実施例４で得られたプラスミドｐＪＲＤｄｍｓを制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断したものを、配列番号２（順鎖）および配列番号３（逆鎖）に示す合成ＤＮＡ配列と連結させた。このことにより、ｃｏｓ配列およびマルチクローニングサイトを含む約０．９ｋｂを、合成ＤＮＡ４５ｂｐと置き換えることにより完全に欠失させ、約７．１ｋｂのプラスミドｐＪＲＤｄｍｓｃを得た（図１）。
（実施例６） ｍｏｂ領域およびｏｒｉＴ領域欠失ベクター作製
次に、配列番号２０と配列番号２１で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｂｅｓｔを用いた。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したプラスミドｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、プラスミドｐＪＲＤｄｍＴ１およびｐＪＲＤｄｍｓＴ１を得た（図６）。
同様に、配列番号２０と配列番号２２で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したプラスミドｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、プラスミドｐＪＲＤｄｍＴ２およびｐＪＲＤｄｍｓＴ２を得た（図６）。
さらに同様に、配列番号２０と配列番号２３で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したプラスミドｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、プラスミドｐＪＲＤｄｍＴ３およびｐＪＲＤｄｍｓＴ３を得た（図６）。
（実施例７） ポリエステル生産用発現プラスミド作製、および形質転換体構築
Ｎ１４９Ｓ変異体、Ｄ１７１Ｇ変異体、Ｆ３５３Ｔ変異体遺伝子断片は、それぞれＰＣＲ法により作成した。例えば、Ｄ１７１Ｇ変異はアエロモナス・キャビエ由来ＰＨＡ合成酵素の１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換されている。従って、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているアエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２ｄ１３を、一旦ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングしておき、配列番号２４と配列番号２５で示される合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＥｘ Ｔａｑポリメラーゼ（宝バイオ製）を用いた。
実施例１〜５で得たベクターｐＪＲＤｄｓ、ｐＪＲＤｄｍ、ｐＪＲＤｄｍｓ、ｐＪＲＤｄＴｃ、ｐＪＲＤｄＴｃｓ、ｐＪＲＤｄｎｃ、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３、ｐＪＲＤｄｃｍＢ、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦを、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２ｄ１３、または、Ｎ１４９Ｓ変異体、Ｄ１７１Ｇ変異体、Ｆ３５３Ｔ変異体の遺伝子断片をそれぞれ、上記プラスミドのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、発現プラスミドｐＪＲＤｄｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄＴｃ１４９ＮＳ、ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧ、ｐＪＲＤｄＴｃ３５３ＦＴ、ｐＪＲＤｄＴｃｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３ＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｃｍＢＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦＥＥ３２ｄ１３をそれぞれ作製した。
これらの発現プラスミドを含むラルストニア・ユートロファの形質転換体を電気パルス法により作製した。つまり、遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍのものを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌとプラスミド２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、形質転換体をそれぞれ取得した。
これらの形質転換体はそれぞれ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託を行った（ｐＪＲＤｄｃｍＢＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５２、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５３、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３ＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５４、ｐＪＲＤｄＴｃｓＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５５、ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２４、ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２５、ｐＪＲＤｄｓＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５８、ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２６、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３形質転換体＝ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６０、ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧ形質転換体＝ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２３）。
（実施例８） 形質転換体を使用したポリエステル生産
実施例７で得られた形質転換体を、Ｎｉｌｅｒｅｄ含有培地（リン酸水素２ナトリウム・１２水塩 ９ｇ、リン酸２水素カリウム １．５ｇ、塩化アンモニウム ０．０５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ｇ、フルクトース ０．５ｇ、塩化コバルト・６水塩 ０．２５ｐｐｍ、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水塩 １６ｐｐｍ、塩化カルシウム・２水塩 １０．３ｐｐｍ、塩化ニッケル・６水塩０．１２ｐｐｍ、硫酸銅・５水塩 ０．１６ｐｐｍ、Ｎｉｌｅｒｅｄ ０．５ｍｇ、寒天 １５ｇ／１Ｌ）に播種し、３０℃で１週間培養した。培養後、全ての株が赤変し、菌体内にポリエステルを蓄積していることが判明した。
（実施例９） 形質転換体の接合伝達能評価
実施例７に記載した発現プラスミドのうち、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３について接合伝達能評価を行った。コントロールにはｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３を用いた。
これらの発現プラスミドで形質転換されたエシェリキア・コリＳ１７−１株を供与菌とし、エシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株を受容菌とした。供与菌、受容菌それぞれをＴＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １．２％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２．４％、グリセロール ０．４％）に植菌し、３７℃で１晩培養した。ＬＢプレート（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％、寒天１．５％）上に滅菌済のニトロセルロースフィルタを載せ、培養液をそれぞれ供与菌１０μｌと受容菌１０μｌに混合させ、その混合培養液をニトロセルロースフィルタ上に接種した。３７℃で５〜１５時間培養した後、ニトロセルロースフィルタを生理食塩水１ｍｌの入ったチューブに移し、十分懸濁してニトロセルロースフィルタ上の菌を浮遊させた。
こうして得られた混合菌の懸濁液を１００〜１０７倍希釈し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート、およびクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌのみを含むＬＢプレートに、それぞれ１００μｌずつプレーティングし、３７℃で１晩培養した。培養後、それぞれの出現コロニー数を数えたところ、表１に示す結果となった。
そこで、受容菌あたりの接合伝達頻度は、細胞懸濁液１００μｌ中に含まれる、接合伝達により発現プラスミドが導入されたエシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株数を、エシェリキア・コリＸＬ１０−ｇｏｌｄ株の総数で割ることにより計算した。また、導入されたＸＬ１０−ｇｏｌｄの数が０であった場合は、導入されたＸＬ１０−ｇｏｌｄの数を仮に１とおいて受容菌あたりの接合伝達頻度を算出し、得られた接合伝達頻度未満と表す。以下に実際の算出値を示す。
表１の結果より、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３がｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、９／１００７×１０−５＝８．９×１０−８；ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３がｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、１３／１８３×１０−７＝７．１×１０−９；ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３がｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、１／３０１×１０−５＝３．３×１０−８未満；ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３がｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、１／４２０×１０−５＝２．４×１０−８未満であった。
同様の方法でｐＪＲＤ２１５ＥＥ３２ｄ１３の接合伝達頻度を別途試験した場合の、受容菌あたりの接合伝達頻度は、３１８／５１３×１０−３＝６．２×１０−４であったため、ｐＪＲＤｄｍＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｍｓＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄＴｃＥＥ３２ｄ１３、ｐＪＲＤｄｎｃＥＥ３２ｄ１３は、ｐＪＲＤ２１５ＥＥ３２ｄ１３よりも１／１０４〜１／１０５倍以下に接合伝達頻度が落ちており、ｔｒａ遺伝子と共存した場合においても接合伝達性は実質的にないと考えられる。
上述したように、新規ベクター、特にラルストニア・ユートロファで複製可能な新規ベクターを用いた遺伝子組換え技術により、工業的に安全に及び／又は安価で効率よく、ポリエステル生産することが可能となった。
【配列表】
Claims (45)
- 接合伝達能力の一部または全てを欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ベクターがｐＪＲＤ２１５（配列番号１）である請求の範囲第１項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- プラスミドに含有されるポリエステル合成酵素遺伝子が、以下の（１）〜（５）のいずれか１つ以上の遺伝子である請求の範囲第１または２項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド；
（１）アエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（２）１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（３）１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（４）３５３番目のアミノ酸のフェニルアラニンがスレオニンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（５）上記（２）から（４）の置換の内、いずれか２つ以上のアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子。 - 接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失または変異である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失である請求の範囲第４項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３７３７〜４３７８の欠失である請求の範囲第４項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の４０００〜４３７８の欠失である請求の範囲第４項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の変異が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３３２３のアデニンからチミンへの置換である請求の範囲第４項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- 接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｏｒｉＴ領域の欠失である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｏｒｉＴ領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５の欠失である請求の範囲第９項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｏｒｉＴ領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１６９の欠失である請求の範囲第９項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- 接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域およびｏｒｉＴ領域の欠失である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５の欠失である請求の範囲第１２項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１６９の欠失である請求の範囲第１２項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１７８の欠失である請求の範囲第１２項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３２１４の欠失である請求の範囲第１２項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３０９５〜３２１４の欠失である請求の範囲第１２項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ベクターがｐＪＲＤ２１５（配列番号１）である請求の範囲第１８項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- プラスミドに含有されるポリエステル合成酵素遺伝子が、以下の（１）〜（５）のいずれか１つ以上の遺伝子である請求の範囲第１８または１９項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド；
（１）アエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（２）１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（３）１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（４）３５３番目のアミノ酸のフェニルアラニンがスレオニンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（５）上記（２）から（４）の置換の内、いずれか２つ以上のアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子。 - ストレプトマイシン耐性遺伝子領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の２０６〜１６９０の欠失である請求の範囲第１８〜２０項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- 接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ベクターがｐＪＲＤ２１５（配列番号１）である請求の範囲第２２項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- プラスミドに含有されるポリエステル合成酵素遺伝子が、以下の（１）〜（５）のいずれか１つ以上の遺伝子である請求の範囲第２２または２３項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド；
（１）アエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（２）１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（３）１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（４）３５３番目のアミノ酸のフェニルアラニンがスレオニンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（５）上記（２）から（４）の置換の内、いずれか２つ以上のアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子。 - 接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失または変異である請求の範囲第２２〜２４項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失である請求の範囲第２５項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３７３７〜４３７８の欠失である請求の範囲第２５項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の４０００〜４３７８の欠失である請求の範囲第２５項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の変異が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３３２３のアデニンからチミンへの置換である請求の範囲第２５項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- 接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｏｒｉＴ領域の欠失である請求の範囲第２２〜２４項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｏｒｉＴ領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５の欠失である請求の範囲第３０項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｏｒｉＴ領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１６９の欠失である請求の範囲第３０項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- 接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域およびｏｒｉＴ領域の欠失である請求の範囲第２２〜２４項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５の欠失である請求の範囲第３３項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１６９の欠失である請求の範囲第３３項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１７８の欠失である請求の範囲第３３項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３２１４の欠失である請求の範囲第３３項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３０９５〜３２１４の欠失である請求の範囲第３３項記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ストレプトマイシン耐性遺伝子領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の２０６〜１６９０の欠失である請求の範囲第２２〜２４項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｃｏｓ領域をさらに欠失した請求の範囲第１〜３９項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｃｏｓ領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の９２３７〜１０１２７の欠失である請求の範囲第４０項に記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- ｃｏｓ領域の欠失が、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の８９１５〜１００５５の欠失である請求の範囲第４０項に記載のポリエステル合成酵素発現プラスミド。
- 請求の範囲第１〜４２項のいずれかに記載のポリエステル合成酵素発現プラスミドによって形質転換された形質転換体。
- 宿主がラルストニア・ユートロファである請求の範囲第４３項記載の形質転換体。
- ポリエステルが、下式（１）
（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である、請求の範囲第１〜４４項のいずれかに記載の発現プラスミドまたは形質転換体を用いたポリエステルの製造方法。
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