JP7360329B2 - 変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、その遺伝子および形質転換体、並びに、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
変異(b):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から436番目のロイシンが、ロイシン以外のアミノ酸に置換された変異
変異(c):配列番号1で示されるアミノ酸配列のC末端から11個以上19個以下のアミノ酸残基が欠失された変異。
本発明に係る変異型PHA合成酵素は、配列番号1で示されるアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を示し、かつ、下記(a)~(c)のいずれか1以上の変異を含むアミノ酸配列を有するものである。また、本発明は、該変異型PHA合成酵素をコードする遺伝子(以下、「変異型PHA合成酵素遺伝子」と略す)も提供する。
本発明の形質転換体は、本発明の変異型PHA合成酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体であり、該遺伝子を宿主の微生物に導入することにより製造される。
本発明の形質転換体を培養することで、該形質転換体にPHAを生産させ、得られたPHAを回収することでPHAを製造することができる。
まず、phaC1遺伝子破壊用プラスミドを作製した。合成オリゴDNAを用いたPCRにより、phaC1遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するDNA断片(配列番号12)を得た。得られたDNA断片を制限酵素SwaIで消化した。このDNA断片を、同じくSwaIで消化した特開2007-259708号公報に記載のベクターpNS2X-sacBと連結し、phaC1より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターpNS2X-sacB-phaC1ULを作製した。
合成オリゴDNA等を用いたPCRにより、配列番号13で示される塩基配列を有するDNA断片を増幅した。取得したDNA断片を、特開2007-259708号公報記載のpCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ)にて連結し、pCUP2-Ptrp-NSDGを得た。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、配列番号15および配列番号16で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。同様に配列番号17および配列番号18で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。上記PCRで得られた2種類のDNA断片を鋳型とし、配列番号15および配列番号18で示したDNAをプライマーペアとして、同様の条件でPCRを行い、DNA断片を取得した。このDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kitにて連結し、大腸菌JM109コンピテントセル(タカラバイオ)に導入した。各大腸菌コロニーからプラスミドを回収し、DNA配列を確認することにより、pCUP2-Ptrp-NSDG-S389Xを取得した。ここで、Xは、アミノ酸A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,又は、Yを表す。得られたpCUP2-Ptrp-NSDG-S389Xは、trpプロモーター下で、N末端から389番目のセリンがXに置換された変異を有するNSDGを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、配列番号15および配列番号19で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。同様に配列番号20および配列番号18で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。上記PCRで得られた2種類のDNA断片を鋳型とし、配列番号15および配列番号18で示したDNAをプライマーペアとして、同様の条件でPCRを行い、DNA断片を取得した。このDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kitにて連結し、大腸菌JM109コンピテントセル(タカラバイオ)に導入した。各大腸菌コロニーからプラスミドを回収し、DNA配列を確認することにより、pCUP2-Ptrp-NSDG-L436Xを取得した。ここで、Xは、アミノ酸A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,又は、Yを表す。得られたpCUP2-Ptrp-NSDG-L436Xは、trpプロモーター下で、N末端から436番目のロイシンがXに置換された変異を有するNSDGを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、配列番号15および配列番号21で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。得られたDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kitにて連結し、pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT5を取得した。得られたpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT5は、trpプロモーター下で、C末端から5個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するNSDGを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、配列番号15および配列番号22で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。得られたDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kitにて連結し、pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT10を取得した。得られたpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT10は、trpプロモーター下で、C末端から10個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するNSDGを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、配列番号15および配列番号23で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。得られたDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kitにて連結し、pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT13を取得した。得られたpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT13は、trpプロモーター下で、C末端から13個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するNSDGを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、配列番号15および配列番号24で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。得られたDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kitにて連結し、pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT15を取得した。得られたpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT15は、trpプロモーター下で、C末端から15個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するNSDGを発現するプラスミドである。
製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGを鋳型とし、配列番号15および配列番号25で示したDNAをプライマーペアとして、PCRを行った。得られたDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-fusion HD Cloning Kitにて連結し、pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT20を取得した。得られたpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT20は、trpプロモーター下で、C末端から20個のアミノ酸残基が欠失された変異を有するNSDGを発現するプラスミドである。
まず、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株をNutrient Broth培地(DIFCO)で一晩培養した。得られた培養液0.5mLをNutrient Broth培地100mLに接種し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を氷上で速やかに冷却し、菌体を回収して氷冷した蒸留水で良く洗浄した後、得られた菌体を2mLの蒸留水に懸濁した。菌体液を、製造例2で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGプラスミド溶液と混合し、キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、MicroPulserエレクトロポレーター(バイオ・ラッド)を使用し、電圧1.5kV、抵抗800Ω、電流25μFの条件で行った。エレクトロポレーション後、菌体溶液を回収して5mLのNutrient Broth培地を添加し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を、100mg/Lのカナマイシン硫酸塩を含むNutrient Agar培地に塗布した。30℃で3日間培養し、得られたコロニーからプラスミドが導入された菌株を取得した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG株と命名した。
製造例10と同様の方法で、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株を親株とし、製造例3で作製したpCUP2-Ptrp-NSDG-S389Xを導入した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-S389X株と命名した。
製造例10と同様の方法で、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株を親株とし、製造例4で作製したpCUP2-Ptrp-NSDG-L436Xを導入した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L436X株と命名した。
製造例10と同様の方法で、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株を親株とし、製造例5で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT5を導入した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT5株と命名した。
製造例10と同様の方法で、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株を親株とし、製造例6で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT10を導入した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT10株と命名した。
製造例10と同様の方法で、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株を親株とし、製造例7で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT13を導入した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT13株と命名した。
製造例10と同様の方法で、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株を親株とし、製造例8で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT15を導入した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT15株と命名した。
製造例10と同様の方法で、製造例1で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株を親株とし、製造例9で作製したpCUP2-Ptrp-NSDGΔCT20を導入した。得られた菌株をH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDGΔCT20株と命名した。
PHAを含む乾燥菌体約20mgに1mLの硫酸-メタノール混液(15:85)と1mLのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することでPHA分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに0.5mLの脱イオン水を加えてよく混合した後、水層と有機層が分離するまで放置した。その後、分取した有機層中のPHA分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。得られたピーク面積から、3HH比率を算出した。
種母培地の組成は、10g/L 肉エキス、10g/L バクトトリプトン、2g/L 酵母エキス、9g/L リン酸二水素ナトリウム12水和物、1.5g/L リン酸水素二カリウムとした。
製造例11で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-S389X株を用いて、比較例1と同様の方法で培養を行い、乾燥菌体重量および3HH比率を分析した。結果を表1に示した。
表1の結果から、配列番号14で示されるアミノ酸配列の389番目のセリンをいずれのアミノ酸に置換しても、乾燥菌体重量に大きな変化はないことが分かる。このことから、ポリマー生産量にも劇的な変化は無いと考えられる。
製造例12で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L436X株を用いて、比較例1と同様の方法で培養を行い、乾燥菌体重量および3HH比率を分析した。結果を表2に示した。
表2の結果から、配列番号14で示されるアミノ酸配列の436番目のロイシンをアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、又は、セリン(S)に置換した9種類の変異体(比較例8~11、13、15~18)では、比較例1と比較して乾燥菌体重量が大きく低下しており、ポリマー生産性が低下したと考えられる。また、436番目のロイシンをイソロイシン(I)、又は、メチオニン(M)に置換した変異体(比較例12、14)では、比較例1と比較して乾燥菌体重量および3HH比率のいずれにも変化は認められなかった。
製造例13~17で作製したH16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDGΔC5,ΔC10,ΔC13,ΔC15,又はΔC20株を用いて、比較例1と同様の方法で培養を行い、乾燥菌体重量および3HH比率を分析した。結果を表3に示した。
表3の結果から、配列番号14で示されるアミノ酸配列のC末端から5個のアミノ酸残基が欠失した変異体(比較例19)および前記C末端から10個のアミノ酸残基が欠失した変異体(比較例20)では、比較例1と比較して乾燥菌体重量および3HH比率のいずれにも変化は認められず、前記C末端から20個のアミノ酸残基が欠失した変異体(比較例21)では、乾燥菌体重量が大きく低下した。しかし、前記C末端から13個のアミノ酸残基が欠失した変異体(実施例22)および前記C末端から15個のアミノ酸残基が欠失した変異体(実施例23)では、乾燥菌体重量に大きな変化がなく、かつ、3HH比率の低下が認められた。
Claims (10)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を示し、かつ、下記(a)~(b)のいずれか1以上の変異を含み、前記アミノ酸配列のN末端から149番目のアスパラギンがセリンに置換された変異、及び、前記アミノ酸配列のN末端から171番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異をさらに含むアミノ酸配列を含む、変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素であって、
配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素が生産するポリヒドロキシアルカン酸共重合体と比較して3-ヒドロキシヘキサン酸比率が高いポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造を実現する変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素。
変異(a):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から389番目のセリンが、システイン、イソロイシン、トレオニン又はバリンに置換された変異
変異(b):配列番号1で示されるアミノ酸配列のN末端から436番目のロイシンが、バリンに置換された変異 - 請求項1に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子。
- 請求項2に記載の遺伝子を有する形質転換体。
- 宿主が真正細菌である請求項3に記載の形質転換体。
- 真正細菌がカプリアビダス属に属する細菌である請求項4に記載の形質転換体。
- 真正細菌がカプリアビダス ネカトールである請求項4に記載の形質転換体。
- 真正細菌がカプリアビダス ネカトールH16である請求項4に記載の形質転換体。
- 請求項3~7のいずれか1項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する、請求項8に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシ酪酸と3-ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項8に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
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