WO2017104722A1 - スクロース資化性を有するｐｈａ生産微生物、及び該微生物を用いたｐｈａの製造方法 - Google Patents

スクロース資化性を有するｐｈａ生産微生物、及び該微生物を用いたｐｈａの製造方法 Download PDF

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WO2017104722A1
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尚志 有川
哲也 藤木
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    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01013—Sucrose synthase (2.4.1.13)

Definitions

  • the present invention relates to a PHA-producing microorganism having sucrose utilization and a method for producing PHA using the microorganism.
  • PHA Polyhydroxyalkanoic acid
  • PHA is a polyester-type organic polymer produced by a wide range of microorganisms.
  • PHA is a biodegradable thermoplastic polymer and can be produced from renewable resources. For these reasons, attempts have been made to industrially produce PHA as an environmentally conscious material or a biocompatible material and use it in various industries.
  • the general name of the monomer unit constituting this PHA is hydroxyalkanoic acid.
  • hydroxyalkanoic acid include 3-hydroxybutyric acid (hereinafter sometimes referred to as 3HB), 3-hydroxyvaleric acid (hereinafter sometimes referred to as 3HV), 3-hydroxyhexanoic acid (hereinafter referred to as 3HH).
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • 3HV 3-hydroxyvaleric acid
  • 3HH 3-hydroxyhexanoic acid
  • 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxyalkanoic acid having a longer alkyl chain, 4-hydroxybutyric acid and the like are exemplified, and these are homopolymerized or copolymerized to form a polymer molecule PHA. Is formed.
  • PHA examples include poly-3-hydroxybutyric acid (hereinafter sometimes referred to as P (3HB)), which is a 3HB homopolymer.
  • P (3HB-co-3HV) a copolymer of 3HB and 3HV
  • P (3HB-co-3HH) a copolymer of 3HB and 3HH
  • PHBH a copolymer of 3HB and 3HH
  • 3HB And P (3HB-co-4HB) which is a copolymer of and 4HB.
  • PHBH can have a wide range of physical properties applicable from hard polymers to soft polymers by changing the composition ratio of 3HH.
  • PHBH is required to be flexible, such as a film using PHBH having a high 3HH composition ratio, from a thing that requires hardness, such as a TV casing using PHBH having a low 3HH composition ratio.
  • PHBH is required to be flexible, such as a film using PHBH having a high 3HH composition ratio, from a thing that requires hardness, such as a TV casing using PHBH having a low 3HH composition ratio.
  • glucose is often used as the main carbon source, but glucose is a relatively expensive carbon source. Therefore, when glucose is used as the main carbon source, it may be more expensive than the production price by the chemical synthesis method using crude oil as the main raw material, which makes it difficult to commercialize in terms of price competitiveness.
  • sucrose is known as a sugar raw material that is cheaper than glucose.
  • Sucrose is one of the disaccharides formed by glucose and fructose, and is a carbon source that is produced from all plants having photosynthesis ability and is abundant in nature. Furthermore, sucrose is the main component of molasses, and molasses is an attractive carbon source in terms of renewable resources that do not compete with food.
  • sucrose PTS Phosphoenolpyruvate: “Carbohydrate” Phosphotransferase ”System
  • sucrose non-PTS sucrose non-PTS
  • the microorganism takes sucrose as it is, and then breaks it down into glucose and fructose.
  • sucrose PTS Phosphoenolpyruvate: “Carbohydrate” Phosphotransferase ”System
  • sucrose non-PTS the microorganism phosphorylates sucrose when it takes up sucrose and converts it to sucrose-6-phosphate. And it decomposes into glucose-6-phosphate and fructose inside microbial cells.
  • sucrose is decomposed outside the microbial cells, and the resulting glucose and fructose may be assimilated.
  • Capriavidas Necatol strain H16 known as a PHA-producing microorganism, can assimilate fructose but cannot assimilate glucose and sucrose.
  • sucrose utilization-related genes sucrose permease enzyme gene and sucrose hydrolysis
  • Escherichia coli W strain sucrose permease enzyme gene and sucrose hydrolysis
  • sucrose utilization has become possible by introducing an enzyme gene).
  • the organism from which the gene is derived and the host to which the gene is introduced are the same species, the probability that the gene introduced by genetic recombination will function well is considered high.
  • Patent Document 2 discloses an example in which sucrose-assimilating bacteria are imparted to sucrose-non-assimilating Escherichia bacteria by introducing a sucrose PTS gene group. Furthermore, Patent Document 1 discloses an example in which sucrose utilization is imparted by introducing a sucrose phosphotransferase gene and a sucrose hydrolase gene.
  • An object of the present invention is to provide a PHA-producing microorganism capable of assimilating sucrose and a method for producing PHA by culturing the microorganism using sucrose as a carbon source.
  • microorganisms having the ability to produce PHA include a heterologous organism-derived gene encoding sucrose hydrolase (CscA) and a sucrose permease (CscB). It was found that by introducing both genes derived from heterologous organisms encoding sucrose, the ability to decompose sucrose and the ability to take up sucrose into cells is added to the microorganism, and PHA production using sucrose as a carbon source becomes possible. The invention has been completed.
  • the present invention relates to a PHA-producing microorganism having a PHA synthase gene and the following heterologous organism-derived genes (1) and (2).
  • a sucrose hydrolase gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a polypeptide having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence and having sucrose hydrolase activity
  • Gene (2) A sucrose permease gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a gene encoding a polypeptide having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence and having sucrose permease activity
  • the microorganism is a transformant having a microorganism belonging to the genus Capriavidas as a host, and more preferably, the microorganism belonging to the genus Capriavidas is Capriavidas necatol.
  • the microorganism is imparted or enhanced with glucose utilization.
  • the PHA synthase gene is a PHA synthase gene capable of synthesizing P (3HB-co-3HH).
  • the microorganism further has a crotonyl-CoA reductase gene and an ethylmalonyl-CoA decarboxylase gene.
  • the microorganism has the acetoacetyl CoA reductase gene deleted or its expression level is suppressed.
  • the present invention also relates to a method for producing PHA, comprising a step of culturing the microorganism in a medium containing sucrose as a carbon source, and preferably relates to the production method wherein PHA is P (3HB-co-3HH).
  • a PHA-producing microorganism capable of assimilating sucrose can be provided. Further, PHA can be produced by fermentation by culturing the microorganism using sucrose as a carbon source.
  • Comparative Example 1 is a graph showing the sugar concentration changes in the growth and media in the sucrose-containing medium KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain (solid line including ⁇ : OD 600; solid line including ⁇ : sucrose concentration; solid line including ⁇ : Glucose concentration; solid line including x: fructose concentration)
  • KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C is a graph showing the sugar concentration changes in the growth and media in the sucrose-containing medium dR strain (solid line including ⁇ : OD 600; solid line including ⁇ : sucrose concentration; Solid line including ⁇ : glucose concentration; Solid line including x: fructose concentration)
  • FIG. 7 is a graph showing the growth of pCUP2-lacUV5-cscA in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 in a sucrose-containing medium and the change in sugar concentration in the medium with respect to Comparative Example 3 (solid line including ⁇ : OD 600 ; solid line including ⁇ : sucrose) Concentration; solid line including ⁇ : glucose concentration; solid line including x: fructose concentration)
  • FIG. 7 shows the growth of pCUP2-lacUV5-cscA in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 in a sucrose-containing medium and the change in sugar concentration in the medium with respect to Comparative Example 3 (solid line including ⁇ : OD 600 ; solid line including ⁇ : sucrose) Concentration; solid line including ⁇ : glucose concentration; solid line including x: fructose concentration)
  • FIG. 6 is a graph showing the growth of pCUP2-lacUV5-cscB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 in a sucrose-containing medium and the change in sugar concentration in the medium with respect to Comparative Example 4 (solid line including ⁇ : OD 600 ; solid line including ⁇ : sucrose) Concentration; solid line including ⁇ : glucose concentration; solid line including x: fructose concentration) BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG.
  • FIG. 1 is a graph showing the growth of pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 in a sucrose-containing medium and changes in sugar concentration in the medium with respect to Example 1 (solid line including ⁇ : OD 600 ; solid line including ⁇ : sucrose) Concentration; solid line including ⁇ : glucose concentration; solid line including x: fructose concentration)
  • FIG. 1 shows the growth of pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 in a sucrose-containing medium and changes in sugar concentration in the medium with respect to Example 1 (solid line including ⁇ : OD 600 ; solid line including ⁇ : sucrose) Concentration; solid line including ⁇ : glucose concentration; solid line including x: fructose concentration)
  • FIG. 5 is a graph showing growth of pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain in a sucrose-containing medium and changes in sugar concentration in the medium with respect to Example 2
  • sucrose-producing microorganism imparted or enhanced with sucrose utilization ability both a sucrose hydrolase gene derived from a different organism and a sucrose permease gene derived from a different organism are compared with a microorganism having a PHA synthase gene. By introducing, sucrose utilization is imparted or enhanced, and a microorganism that produces PHA using sucrose as a carbon source is provided.
  • sucrose hydrolase gene is a gene encoding sucrose hydrolase (CscA), an enzyme that hydrolyzes sucrose to produce glucose and fructose.
  • sucrose permease gene used in the present specification is a gene encoding sucrose permease (CscB) having a function of taking sucrose into cells.
  • the microorganism to be the original strain (host) into which the sucrose hydrolase gene and the sucrose permease gene are introduced is not particularly limited as long as it has a PHA synthase gene and can produce PHA.
  • a PHA-producing microorganism having no sucrose utilization or low sucrose utilization Such PHA-producing microorganisms include not only wild strains that inherently have PHA synthase genes, but also mutant strains obtained by artificially mutating such wild strains, or PHA synthase genes.
  • microorganisms include bacteria, yeasts, filamentous fungi, and the like, preferably bacteria.
  • bacteria include the genus Ralstonia, the genus Capriavidus, the genus Wautersia, the genus Aeromonas, the genus Escherichia, the genus Alcaligeneson, and the genus Alcaligeneson. Bacteria belonging to it are listed as preferred examples.
  • a bacterium belonging to the genus Ralstonia, Capriavidas, Aeromonas, or Wauthercia more preferably a bacterium belonging to the genus Capriavidas or Aeromonas, still more preferably belonging to the genus Capriavidas.
  • the microorganism having the PHA synthase gene is a recombinant strain into which an exogenous PHA synthase gene has been introduced by a genetic engineering technique
  • examples of the exogenous PHA synthase gene include capriavidas nekatol H16 strain (C.I.
  • a PHA synthase gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, or a polyhedron having 85% or more sequence identity to the amino acid sequence and having PHA synthesis activity
  • a PHA synthase gene encoding a peptide, a PHA synthase gene possessed by Aeromonas caviae, or a sequence identity of 85% or more to the amino acid sequence, and having PHA synthesizing activity
  • Genetics of PHA synthase encoding polypeptides Although the like are not limited to, other PHA synthetase gene can also be suitably utilized.
  • the sequence identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • PHA synthase gene capable of synthesizing PHBH is preferred as PHA, for example, a PHA synthase gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is more preferred.
  • the microorganism to be the original strain into which the sucrose hydrolase gene and sucrose permease gene are introduced is preferably a microorganism having a PHA synthase gene capable of synthesizing PHBH, and specific examples thereof include Capriavidas necatol.
  • a transformant into which a PHA synthase gene derived from Aeromonas caviae has been introduced is most preferred.
  • sucrose hydrolase gene is a gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 derived from Escherichia coli, or having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence, and sucrose hydrolyzing
  • SEQ ID NO: 1 derived from Escherichia coli
  • sucrose hydrolyzing it will not specifically limit if it is a gene which codes the polypeptide which has a degrading enzyme activity, As an example, the gene which has a base sequence of sequence number 5 is mentioned.
  • sucrose permease gene has a 90% or more sequence identity with respect to the gene which codes the amino acid sequence shown by sequence number 2 derived from Escherichia coli, or this amino acid sequence, and has sucrose permease activity Although it will not specifically limit if it is a gene which codes polypeptide, As an example, the gene which has a base sequence of sequence number 6 is mentioned.
  • the sequence homology is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the PHA synthase gene, sucrose hydrolase gene, and sucrose permease gene may be present on DNA such as chromosomes, plasmids, megaplasmids, etc. possessed by the host microorganism.
  • it may exist on DNA artificially integrated into a microorganism, such as on a plasmid vector or artificial chromosome.
  • it is preferably present on the chromosome or megaplasmid held by the microorganism, more preferably on the chromosome held by the microorganism.
  • a method for site-specific substitution or insertion of arbitrary DNA on DNA held by a microorganism is well known to those skilled in the art, and can be used in producing the microorganism of the present invention.
  • typical methods include a method using a transposon and a homologous recombination mechanism (Ohman et al., J. Bacteriol., Vol. 162: p1068 (1985)), a site generated by the homologous recombination mechanism.
  • a method based on the principle of specific integration and deletion by homologous recombination in the second stage Noti et al., Methods Enzymol., Vol.
  • the method for introducing a vector into a cell is not particularly limited, and examples thereof include a calcium chloride method, an electroporation method, a polyethylene glycol method, and a spheroplast method.
  • the promoter for expressing the sucrose hydrolase gene and the sucrose permease gene is not particularly limited.
  • the promoter of caprividas necatol phaC1 gene, promoter of phaP1 gene, lac promoter derived from E. coli, lacUV5 promoter, trc promoter, tic promoter, tac promoter and the like can be used.
  • the same promoter may be used for each gene, or different promoters may be used.
  • the lacUV5 promoter shown in SEQ ID NO: 7 is preferably used for both genes.
  • the glucose assimilability of the microorganism to which sucrose assimilation is imparted or enhanced by the above is low or not assimilating, the above-described methods such as gene mutation and destruction, enhancement of gene expression, introduction of foreign genes, etc. It is preferable to impart or enhance glucose utilization to microorganisms. Thereby, the sucrose utilization property of the microorganism can be further enhanced, and the PHA production amount can be improved when sucrose is used as a carbon source.
  • C.I. Necator H16 strain has no glucose uptake gene and cannot assimilate glucose.
  • the method of conferring glucose utilization to the necator H16 strain is not particularly limited, but as an example, the N-acetylglucosamine uptake gene nagE 793th base G is substituted with C, and a transcriptional regulator is added.
  • Examples include a method of imparting glucose utilization by destroying nagR, which is a gene to be encoded (Journal of Bioscience and Bioengineering, vol. 113, 63 (2012)).
  • Another example is a method for imparting glucose utilization by introducing a foreign gene encoding a glucose transporter (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-225662).
  • a method for introducing a glucose kinase gene may be effective.
  • PHBH crotonyl-CoA reductase gene (ccr) and an ethylmalonyl-CoA decarboxylase gene (emd) into Capriavidas nekatol into which a PHA synthase gene capable of incorporating 3HH monomer has been introduced
  • ccr crotonyl-CoA reductase gene
  • emd ethylmalonyl-CoA decarboxylase gene
  • PHBH can be produced using fructose as a carbon source by further introducing a gene (phaJ) encoding (R) -specific enoyl-CoA hydratase (metabolic engineering, vol. 27, 38 (2015). )).
  • ccr and / or emd may be introduced in addition to the sucrose hydrolase gene and sucrose permease gene.
  • the synthesis route of (R) -3-hydroxyacyl-CoA having 6 carbon atoms is strengthened or made efficient when sugar is used as a carbon source, and the 3HH composition in PHBH produced is increased. The ratio can be improved.
  • the crotonyl-CoA reductase used in the present invention is an enzyme that generates butyryl-CoA by reducing crotonyl-CoA having 4 carbon atoms, which is an intermediate in the fatty acid ⁇ -oxidation pathway.
  • Butyryl-CoA is condensed with another molecule of acetyl-CoA by the action of ⁇ -ketothiolase (BktB) and further converted to provide (R) -3HHx-CoA having 6 carbon atoms. It is copolymerized with (R) -3HB-CoA by a specific polyester polymerization enzyme.
  • the ccr that can be used in the present invention is not particularly limited as long as the post-translation reductase has the above-described crotonyl-CoA reductase activity.
  • a gene encoding crotonyl-CoA reductase derived from cinnamonensis (GenBank Accession No. AF178673), methanol-utilizing bacteria M.
  • a gene encoding crotonyl-CoA reductase derived from extorquens NCBI-GeneID: 7990208
  • a gene encoding crotonyl-CoA reductase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40, or a poly having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence and exhibiting crotonyl-CoA reductase activity A gene encoding a peptide.
  • the ethylmalonyl-CoA decarboxylase used in the present invention is an enzyme that catalyzes the decarboxylation of ethylmalonyl-CoA to butyryl-CoA produced by side reactions with crotonyl-CoA reductase or propionyl-CoA carboxylase.
  • the origin of ethylmalonyl-CoA decarboxylase is not particularly limited as long as it has this activity, and examples thereof include mouse-derived ethylmalonyl-CoA decarboxylase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41.
  • Examples of the gene base sequence that codes for the amino acid sequence and can be used in Capriavidas necatol include, but are not limited to, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 42.
  • a gene (phaJ) encoding the (R) -specific enoyl-CoA hydratase may be further introduced.
  • the biosynthesis ability of (R) -3HHx-CoA can be enhanced.
  • (R) -specific enoyl-CoA hydratase used in the present invention refers to 2-enoyl-CoA, which is a fatty acid ⁇ -oxidation intermediate, and (R) -3-hydroxyacyl, which is a PHA monomer.
  • phaJ Means an enzyme that converts to CoA;
  • the origin of phaJ is not particularly limited, but is preferably derived from Capriavidas necatol or Aeromonas caviae.
  • examples of the phaJ used in the present invention include phaJ4a (H16 A1070, NCBI-GeneID: 4248869) and phaJ4b (H16 B0397, NCBI-GeneID: 4454986) derived from Capriavidas Necatol, phaJ (GenBanks derived from Aeromonas cabie) ., BAA 21816) and the like.
  • a gene encoding acetoacetyl-CoA reductase is deleted or its expression is suppressed, whereby a PHBH having a higher 3HH composition ratio is obtained.
  • a gene encoding an acetoacetyl-CoA reductase that is deleted or suppresses expression may be a gene encoding an enzyme having a catalytic function to produce (R) -3HB-CoA using acetoacetyl-CoA as a substrate. That's fine.
  • examples thereof include phaB1 and phaB3 (NCBI-GeneID: 4249784, NCBI-GeneID: 4250155).
  • a deletion refers to an amino sequence in which a part or all of a target gene does not exist due to genetic manipulation or mutation, or a stop codon appears or codes due to addition or substitution of a base sequence. It is intended that some or all of the activity of the protein encoded by the gene is lost, such as as a result of a change.
  • Examples of a method for suppressing gene expression include, but are not limited to, modification of a nucleotide sequence in a promoter region upstream of a gene or a ribosome binding sequence.
  • ccr, emd, and phaJ may be present on DNA such as chromosomes, plasmids, megaplasmids, etc. possessed by the host microorganism, or may be artificially generated on plasmid vectors or artificial chromosomes. In particular, it may be present on DNA incorporated into the microorganism. However, from the viewpoint of holding the introduced DNA, it is preferably present on the chromosome or megaplasmid held by the microorganism, more preferably on the chromosome held by the microorganism.
  • the expression level of the gene can be increased by replacing, deleting, or adding the base sequence upstream of the originally retained gene. Good.
  • the promoter for expressing the above ccr, emd, and phaJ is not particularly limited.
  • the promoter of caprividas necatol phaC1 gene, promoter of phaP1 gene, lac promoter derived from E. coli, lacUV5 promoter, trc promoter, tic promoter, tac promoter and the like can be used.
  • the same promoter may be used for each gene, or different promoters may be used.
  • the trc promoter is preferably used for each gene.
  • Method for producing PHA PHA can be produced by culturing the microorganism of the present invention in a medium containing sucrose as a carbon source, and recovering the obtained PHA.
  • the microorganism is preferably cultured in a medium containing a carbon source, a nitrogen source that is a nutrient source other than the carbon source, inorganic salts, and other organic nutrient sources.
  • the carbon source only needs to contain sucrose, and examples of the carbon source containing sucrose include molasses rich in sucrose or molasses. Moreover, as long as it contains sucrose, other carbon sources may be contained, and sucrose and other carbon sources may be used in combination. As the other carbon source, any carbon source can be used as long as the microorganism of the present invention can be assimilated. However, sugars such as glucose and fructose, palm oil, palm kernel oil, corn oil, and palm are preferable.
  • oils and fats such as oil, olive oil, soybean oil, rapeseed oil, and Jatropha oil, and fractionated oils thereof, fatty acids such as lauric acid, oleic acid, stearic acid, palmitic acid, and myristic acid, and derivatives thereof.
  • Examples of the nitrogen source include ammonia; ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate; peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • Examples of the inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • Examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline, and vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, and vitamin C.
  • Conditions for culturing the microorganism of the present invention such as culture temperature, culture time, culture pH, medium, etc., are the microorganisms used, such as Ralstonia, Capriavidas, Wautersia, Aeromonas, Escherichia, Alkaligenes, Pseudomonas Conditions normally used in culture of bacteria such as genera may be used.
  • the type of PHA produced in the present invention is not particularly limited as long as it is a PHA that can be produced by a microorganism.
  • one or more monomers selected from hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms are used.
  • PHA obtained by polymerization is preferred.
  • 3HB homopolymer P (3HB), 3HB and 3HV copolymer P (3HB-co-3HV), 3HB and 3HH copolymer PHBH, 3HB and 4HB copolymer P (3HB-co -4HB) and the like but is not limited thereto.
  • PHBH is preferable from the viewpoint of wide application range as a polymer.
  • the type of PHA produced depends on the purpose, the type of PHA synthase gene possessed by the microorganism to be used or separately introduced, the type of metabolic system involved in the synthesis, the culture conditions, etc. It can be selected as appropriate.
  • the recovery of PHA from the microbial cells is not particularly limited, but can be performed by, for example, the following method.
  • the cells are separated from the culture solution with a centrifuge, and the cells are washed with distilled water, methanol, or the like and dried.
  • PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform.
  • Cellular components are removed from the organic solvent solution containing PHA by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA. Further, the supernatant is removed by filtration or centrifugation, and dried to recover PHA.
  • Analysis of the weight average molecular weight (Mw) of the obtained PHA and the monomer composition (mol%) such as 3HH can be performed by, for example, gel permeation chromatography, gas chromatography, nuclear magnetic resonance, or the like.
  • the overall genetic manipulation can be performed as described in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • enzymes, cloning hosts, etc. used for gene manipulation can be purchased from market suppliers and used according to the explanation.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can be used for gene manipulation.
  • the KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain used in the following production examples, examples and comparative examples is C.I.
  • the phaZ1,2,6 gene on the chromosome of necator H16 strain was deleted, and the PHA synthase gene derived from Aeromonas caviae (the gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4) was introduced It is a transformant and can be produced according to the method of International Publication No. 2014/065253.
  • PCR was performed using the primers represented by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 using the chromosomal DNA of necator H16 strain as a template. PCR was first treated at 98 ° C. for 2 minutes, and then repeated 25 cycles of a reaction of 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes. The polymerase was KOD-plus- (Toyobo) Used). Similarly, PCR was performed using the primers represented by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • PCR was performed under the same conditions using the two DNA fragments obtained by the above PCR as templates and the primers shown in SEQ ID NOs: 8 and 11, and the obtained DNA fragments were digested with the restriction enzyme SwaI.
  • This DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP 2007-259708 A digested with SwaI with DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo)), upstream from the 793rd base of the nagE structural gene.
  • a plasmid vector for chromosome replacement pNS2X-sacB + nagEG793C having a base sequence downstream from the base sequence and having a base sequence in which the 793rd base of the nagE structural gene was replaced from G to C was prepared.
  • a chromosome-substituted strain KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C was prepared as follows.
  • Escherichia coli S17-1 strain (ATCC47055) was transformed with the plasmid vector pNS2X-sacB + nagEG793C for chromosome replacement, and mixed culture was carried out on KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain on Nutrient Agar medium (Difco) and transferred.
  • the obtained culture broth was treated with Simmons agar medium containing 250 mg / L kanamycin (sodium citrate 2 g / L, sodium chloride 5 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g / L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g / L L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, agar 15 g / L, pH 6.8), and the strain that has grown on the agar medium is selected.
  • the plasmid is on the chromosome of KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain. Acquired stocks incorporated into.
  • This strain was cultured for 2 generations in Nutrient Broth medium (Difco), then diluted and applied onto Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, and the growing strain was obtained as a strain from which the plasmid had dropped. Further, by analysis with a DNA sequencer, one strain was isolated in which G, which is the 793rd base of the nagE structural gene on the chromosome, was replaced with C. This mutagenized strain was designated as KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C strain. The obtained KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C strain was obtained from C.I.
  • the starter to stop codons of the phaZ6 gene and phaZ1 gene on the chromosome of necator H16 strain are deleted, and further, the 16th to the stop codons of phaZ2 gene are deleted.
  • This is a strain in which a gene encoding a PHA synthase having an amino acid sequence is introduced, and G, which is the 793rd base of the nagE structural gene, is substituted with C.
  • a plasmid for gene disruption was prepared. The production was performed as follows.
  • PCR was performed using the primers shown by SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 using the chromosomal DNA of necator H16 strain as a template. PCR was performed under the same reaction conditions as described above, and KOD-plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used as the polymerase. Similarly, PCR was performed using primers represented by SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15. Furthermore, PCR was performed under the same conditions using the two DNA fragments obtained by the above PCR as templates and using the primers shown in SEQ ID NOS: 12 and 15, and the obtained DNA fragments were digested with the restriction enzyme SwaI.
  • This DNA fragment was ligated to the vector pNS2X-sacB described in JP-A-2007-259708 digested with SwaI with DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)), and the nucleotide sequence upstream and downstream from the nagR structural gene.
  • a plasmid vector pNS2X-sacB + nagRUD for gene disruption was prepared.
  • a gene disruption strain KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain was prepared using the gene disruption plasmid vector pNS2X-sacB + nagRUD as follows.
  • Escherichia coli S17-1 strain (ATCC47055) is transformed with the plasmid vector for gene disruption pNS2X-sacB + nagRUD, mixed culture on the KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C strain obtained above and on Nutrient Agar medium (Difco). The joint transmission was performed.
  • the obtained culture broth was treated with Simmons agar medium containing 250 mg / L kanamycin (sodium citrate 2 g / L, sodium chloride 5 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g / L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g / L L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, agar 15 g / L, pH 6.8), and the strain that has grown on the agar medium is selected, and the plasmid is KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C A strain integrated on the chromosome was obtained.
  • kanamycin sodium citrate 2 g / L, sodium chloride 5 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g / L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g / L L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, agar 15 g / L, pH 6.8
  • This strain was cultured for 2 generations in Nutrient Broth medium (Difco), then diluted and applied onto Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, and the growing strain was obtained as a strain from which the plasmid had dropped. Furthermore, by strain analysis using a DNA sequencer, one strain having a deletion from the start codon to the stop codon of the nagR gene on the chromosome was isolated. This gene-disrupted strain was designated as KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain. The KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain is a C.I.
  • the starter to stop codons of the phaZ6 gene and phaZ1 gene on the chromosome of necator H16 strain are deleted, and further, the 16th to the stop codons of phaZ2 gene are deleted.
  • This is a strain in which a gene encoding a PHA synthase having an amino acid sequence is introduced, G, which is the 793rd base of the nagE structural gene, is substituted with C, and the nagR gene is deleted from the start codon to the stop codon.
  • a plasmid into which the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 containing the cscA and cscB genes was introduced was obtained by artificial gene synthesis.
  • This plasmid was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the obtained DNA fragment containing the cscA and cscB genes was ligated with the plasmid vector pCUP2 described in International Publication No. 2007/049716 cut with MunI and SpeI.
  • the plasmid vector pCUP2-cscAB was obtained.
  • E. PCR was performed under the same conditions as in Production Example 1 using the genomic DNA of E. coli strain HB101 as a template and using the primers represented by SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • a DNA fragment containing the lacUV5 promoter sequence obtained by PCR was digested with MunI. This DNA fragment was ligated with the plasmid vector pCUP2-cscAB cut with MunI.
  • plasmids a plasmid in which a DNA fragment containing a lacUV5 promoter sequence was inserted in a direction where cscA and cscB were located downstream of the lacUV5 promoter was selected by PCR to obtain a plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscAB.
  • the plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscAB was introduced into the KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain to obtain a transformant pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6.
  • the introduction of the plasmid vector into the cells was carried out by electric introduction as follows.
  • the gene introduction apparatus used was a gene pulser manufactured by Biorad, and the cuvette used was a gap 0.2 cm manufactured by Biorad. 400 ⁇ l of competent cells and 20 ⁇ l of expression vector were injected into a cuvette and set in a pulse device, and an electric pulse was applied under the conditions of electrostatic capacity 25 ⁇ F, voltage 1.5 kV, and resistance value 800 ⁇ . After the pulse, the bacterial solution in the cuvette was cultured with shaking on Nutrient Broth medium (manufactured by DIFCO) at 30 ° C.
  • the cultured transformant pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 was obtained by culturing for days.
  • PCR was performed under the same conditions as in Production Example 1 using the plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscAB described in Production Example 2 as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  • the DNA fragment containing the cscA gene sequence obtained by PCR was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, ligated with the plasmid vector pCUP2 described in International Publication No. 2007/049716 cut with MunI and SpeI, and plasmid vector pCUP2 -CscA was obtained.
  • E.I. PCR was performed under the same conditions as in Production Example 1 using the genomic DNA of E.
  • coli strain HB101 as a template and using the primers represented by SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • a DNA fragment containing the lacUV5 promoter sequence obtained by PCR was digested with MunI. This DNA fragment was ligated with the plasmid vector pCUP2-cscA cut with MunI. From the obtained plasmid, a plasmid in which a DNA fragment containing the lacUV5 promoter sequence was inserted in the direction in which cscA was located downstream of the lacUV5 promoter was selected by PCR to obtain a plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscA.
  • the plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscA was introduced into KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain in the same manner as in Production Example 2 to obtain transformant pCUP2-lacUV5-cscA in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain.
  • PCR was performed under the same conditions as in Production Example 1 using the plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscAB described in Production Example 2 as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22.
  • a DNA fragment containing the cscB gene sequence obtained by PCR was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, ligated with the plasmid vector pCUP2 described in International Publication No. 2007/049716 and digested with MunI and SpeI, and plasmid vector pCUP2 -CscB was obtained.
  • E.I. PCR was performed under the same conditions as in Production Example 1 using the genomic DNA of E.
  • coli strain HB101 as a template and using the primers represented by SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • a DNA fragment containing the lacUV5 promoter sequence obtained by PCR was digested with MunI. This DNA fragment was ligated with the plasmid vector pCUP2-cscB cut with MunI. From the obtained plasmid, a plasmid in which a DNA fragment containing the lacUV5 promoter sequence was inserted in the direction in which cscB was located downstream of the lacUV5 promoter was selected by PCR to obtain a plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscB.
  • plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscB was introduced into KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain in the same manner as in Production Example 2 to obtain transformant pCUP2-lacUV5-cscB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain.
  • Escherichia coli S17-1 strain (ATCC47055) was transformed with plasmid bAO / pBlu / SacB-Km, and KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain obtained in Production Example 1 and Nutrient Agar medium (manufactured by Difco) were used. Conjugate transmission was performed by mixed culture.
  • the obtained culture broth was treated with Simmons agar medium containing 250 mg / L kanamycin (sodium citrate 2 g / L, sodium chloride 5 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g / L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g / L L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, agar 15 g / L, pH 6.8), and a strain that has grown on the agar medium is selected, and the plasmid is KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR A strain integrated on the chromosome of the strain was obtained.
  • Sonagar medium containing 250 mg / L kanamycin (sodium citrate 2 g / L, sodium chloride 5 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g / L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g / L L, dipotassium hydrogen phosphat
  • This strain was cultured for 2 generations in Nutrient Broth medium (Difco), then diluted and applied onto Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, and the growing strain was obtained as a strain from which the plasmid had dropped. Further, by analysis using a DNA sequencer, one strain was isolated in which a DNA having a nucleotide sequence including a promoter of phaC gene of A. Acaviae and a ribosome binding sequence was inserted immediately before the start codon of the bktB gene on the chromosome. This gene insertion strain was designated as ACP-bktB / ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain.
  • the ACP-bktB / ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain was obtained from C.I.
  • the starter to stop codons of the phaZ6 gene and phaZ1 gene on the chromosome of necator H16 strain are deleted, and further, the 16th to the stop codons of phaZ2 gene are deleted.
  • G which is the 793rd base of the nagE structural gene, was replaced with C
  • the nagR gene was deleted from the start codon to the stop codon
  • bktB ⁇ Ketothiolase
  • a promoter and ribosome binding sequence insertion strain ACP-bktB / ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR / trc-J4b was prepared as follows.
  • a plasmid for inserting a promoter and a ribosome binding sequence was prepared.
  • the production was performed as follows.
  • PCR was performed under the same conditions as in Production Example 1 using the chromosomal DNA of necator H16 strain as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24. Similarly, PCR was performed under the same conditions using the primers represented by SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26. Furthermore, PCR was performed under the same conditions using the plasmid pKK388-1 (manufactured by CLONTECH) as a template and the primers represented by SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28.
  • PCR was carried out under the same conditions using the three types of DNA fragments obtained by the above PCR as templates and the primers shown in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 26, and the resulting DNA fragments were digested with the restriction enzyme SwaI.
  • This DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP-A-2007-259708 digested with SwaI with DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo)), and the base sequence upstream of the phaJ4b structural gene, trc Plasmid vector pNS2X-sacB + phaJ4bU-trc-phaJ4b for insertion of promoter and ribosome binding sequence having promoter, ribosome binding sequence and phaJ4b structural gene sequence was prepared.
  • the ACP-bktB / ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR / trc-J4b strain was obtained from C.I.
  • the starter to stop codons of the phaZ6 gene and phaZ1 gene on the chromosome of necator H16 strain are deleted, and further, the 16th to the stop codons of phaZ2 gene are deleted.
  • a gene encoding a PHA synthase having an amino acid sequence was introduced, G, which is the 793rd base of the nagE structural gene, was replaced with C, the nagR gene was deleted from the start codon to the stop codon, and the start of the bktB gene
  • G which is the 793rd base of the nagE structural gene
  • C the nagR gene was deleted from the start codon to the stop codon
  • the start of the bktB gene A DNA consisting of a base sequence including a promoter and a ribosome binding sequence of the A. caviae phaC gene is inserted immediately before the codon, and a DNA consisting of a base sequence including a trc promoter and a ribosome binding sequence is inserted immediately before the start codon of the phaJ4b gene.
  • chromosome substitution strain KNK144S strain was prepared as follows.
  • KNK144S strain was prepared by performing conjugation transfer, selection on Simmons agar medium, and selection on Nutrient Agar medium containing 15% sucrose.
  • the KNK144S strain is a C.I.
  • the starter to stop codons of the phaZ6 gene and phaZ1 gene on the chromosome of necator H16 strain are deleted, and further, the 16th to the stop codons of phaZ2 gene are deleted.
  • a gene encoding a PHA synthase having an amino acid sequence was introduced, G, which is the 793rd base of the nagE structural gene, was replaced with C, the nagR gene was deleted from the start codon to the stop codon, and the start of the bktB gene
  • a DNA comprising a base sequence containing a promoter and a ribosome binding sequence of the phaC gene of A.
  • caviae is inserted immediately before the codon, and a DNA comprising a base sequence containing the trc promoter and the ribosome binding sequence is inserted immediately before the start codon of the phaJ4b gene, Furthermore, phaA structure remains A strain of restriction enzyme NheI cleavage site and the stop codon is produced in the children array.
  • the plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscAB described in Production Example 2 was introduced into the KNK144S strain in the same manner as in Production Example 2 to obtain a transformant pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK144S strain.
  • PCR was performed using the primers shown by SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 using the chromosomal DNA of necator H16 strain as a template. PCR was performed under the same reaction conditions as described above, and KOD-plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used as the polymerase. Similarly, PCR was performed using the primers represented by SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32. Furthermore, PCR was performed under the same conditions using the two DNA fragments obtained by the above PCR as templates and using the primers shown in SEQ ID NOs: 29 and 32, and the obtained DNA fragments were digested with the restriction enzyme SwaI.
  • This DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP-A-2007-259708 digested with SwaI with DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo)), and the nucleotide sequence upstream and downstream from the phaZ2 structural gene.
  • a plasmid vector pNS2X-sacB + phaZ2MunISpeI having
  • plasmid into which the base sequence represented by SEQ ID NO: 33, including the ribosome binding sequence, ccr and emd, was introduced by artificial gene synthesis was obtained.
  • This plasmid was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the resulting DNA fragment containing the ribosome binding sequence, ccr and emd genes was ligated with plasmid vector pNS2X-sacB + Z2UDMunISpeI digested with MunI and SpeI, and plasmid vector pNS2X- sacB + Z2U-ccr-emd-Z2D was obtained.
  • PCR was performed under the same conditions using the plasmid pKK388-1 (manufactured by CLONTECH) as a template and the primers represented by SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35.
  • the DNA fragment containing trc promoter sequence obtained by PCR was digested with MunI. This DNA fragment was ligated with the plasmid vector pNS2X-sacB + Z2U-ccr-emd-Z2D cut with MunI.
  • a DNA fragment containing a trc promoter sequence inserted in the direction where ccr and emd are located downstream of the trc promoter is selected by PCR, and the promoter, ribosome binding sequence and gene insertion plasmid are selected.
  • the vector pNS2X-sacB + Z2U-trc-ccr-emd-Z2D was obtained.
  • the KNK144S strain is used as a parent strain, and the promoter and ribosome binding sequence insertion strain described in Production Example 6 is prepared.
  • conjugation transfer, selection on Simmons agar medium, and selection on Nutrient Agar medium containing 15% sucrose were performed to produce the KNK143S strain.
  • the KNK143S strain is a C.I.
  • the starter to stop codons of the phaZ6 gene and phaZ1 gene on the chromosome of necator H16 strain are deleted, and further, the 16th to the stop codons of phaZ2 gene are deleted.
  • a gene encoding a PHA synthase having an amino acid sequence was introduced, G, which is the 793rd base of the nagE structural gene, was replaced with C, the nagR gene was deleted from the start codon to the stop codon, and the start of the bktB gene
  • a DNA comprising a base sequence containing a promoter and a ribosome binding sequence of the phaC gene of A.
  • caviae is inserted immediately before the codon, and a DNA comprising a base sequence containing the trc promoter and the ribosome binding sequence is inserted immediately before the start codon of the phaJ4b gene, phaA structural gene distribution Restriction enzyme NheI cleavage site and the stop codon is produced in a further trc promoter at a position where there is phaZ2 gene originally strains ribosome binding sequence, ccr gene and emd gene inserted.
  • the plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscAB described in Production Example 2 was introduced into the KNK143S strain by the method described in Production Example 2 to obtain a transformant pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK143S strain.
  • PCR was performed under the same conditions as in Production Example 1, using the chromosomal DNA of KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 as a template and using the primers represented by SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37. Similarly, PCR was performed under the same conditions using the primers represented by SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39. PCR was carried out under the same conditions using the two types of DNA fragments obtained by the above PCR as templates and using the primers represented by SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 39, and the resulting DNA fragments were digested with the restriction enzyme SwaI.
  • This DNA fragment was ligated with a vector pNS2X-sacB described in JP 2007-259708 A digested with SwaI with DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo)), and a base sequence upstream from the phaA structural gene, and A gene disruption plasmid vector pNS2X-sacB + phaAB1UD having a base sequence downstream from the structural gene for phaB1 (acetoacetyl CoA reductase) was prepared.
  • the KNK140S strain is a C.I.
  • the starter to stop codons of the phaZ6 gene and phaZ1 gene on the chromosome of necator H16 strain are deleted, and further, the 16th to the stop codons of phaZ2 gene are deleted.
  • a gene encoding a PHA synthase having an amino acid sequence was introduced, G, which is the 793rd base of the nagE structural gene, was replaced with C, the nagR gene was deleted from the start codon to the stop codon, and the start of the bktB gene
  • G which is the 793rd base of the nagE structural gene
  • the nagR gene was deleted from the start codon to the stop codon
  • the start of the bktB gene A DNA comprising a base sequence containing a promoter and a ribosome binding sequence of the phaC gene of A. caviae is inserted immediately before the codon, and a DNA comprising a base sequence containing the trc promoter and the ribosome binding sequence is inserted immediately before the start codon of the phaJ4b gene, Furthermore, phaA gene It is deleted strain to the stop codon of phaB1 gene from the start codon.
  • the plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscAB described in Production Example 2 was introduced into the KNK140S strain by the method described in Production Example 2 to obtain a transformant pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK140S strain.
  • a gene encoding a PHA synthase having an amino acid sequence was introduced, G, which is the 793rd base of the nagE structural gene, was replaced with C, the nagR gene was deleted from the start codon to the stop codon, and the start of the bktB gene
  • caviae is inserted immediately before the codon, and a DNA consisting of a base sequence including the trc promoter and the ribosome binding sequence is inserted immediately before the start codon of the phaJ4b gene, Originally phaZ2 gene trc promoter was position, ribosome binding sequences, is inserted ccr gene and emd gene, a further strain from the initiation codon to termination codon of phaB1 gene deleted of phaA gene.
  • the plasmid vector pCUP2-lacUV5-cscAB described in Production Example 2 was introduced into the KNK142S strain by the method described in Production Example 2 to obtain a transformant pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK142S strain.
  • the composition of the production medium used for the sucrose utilization test and PHA production was 1.1 w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.19 w / v% KH 2 PO 4 , 0.13 w / v% (NH 4) 2 SO 4, 0.1w / v% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.1v / v% trace metal salt solution (1.6 w in 0.1N HCl / v% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 1w / v% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O , dissolved 0.02w / v% CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016w / v% CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, the 0.012w / v% NiCl 2 ⁇ 6H 2 O Stuff.)
  • As the carbon source a 40 w / v% aqueous sucrose solution was used as a single carbon source, and was added to the medium so as to be
  • KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain (see International Publication No. 2014/065253), KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain prepared in Production Example 1, pCUP2-lacUV5-cscA in KNK005, phaZ1,2 produced in Production Example 4 6 strains and each glycerol stock (50 ⁇ L) of pCUP2-lacUV5-cscB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain prepared in Production Example 5 was inoculated into seed mother medium (5 mL), respectively, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. The obtained culture broth was used as a seed mother.
  • sucrose utilization test and PHA production culture 1.0 v / v% of the seed mother was inoculated into a Sakaguchi flask containing 200 mL of production medium, and shake culture was performed at a culture temperature of 30 ° C.
  • the culture solution was sampled over time, and the growth of microbial cells (OD 600 ) and various sugar concentrations (sucrose, glucose, fructose) in the medium were measured.
  • the sugar concentration was measured using F-kit sucrose / D-glucose / fructose (JK International). The results are shown in FIGS.
  • the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, freeze-dried, and the dry cell weight was measured.
  • the PHA production volume was calculated as follows. 100 mL of chloroform was added per 1 g of the obtained dried cells, and the mixture was stirred overnight at room temperature to extract PHA in the cells. The bacterial cell residue was filtered off, concentrated with an evaporator until the total volume became 1/3, hexane of 3 times the amount of the concentrated liquid was gradually added, and the mixture was allowed to stand for 1 hour with slow stirring. The precipitated PHA was filtered off and dried in vacuo at 50 ° C. for 3 hours. The weight of dry PHA was measured and the PHA production amount was calculated. The results are shown in Table 1.
  • the 3HH composition ratio of the produced PHA was measured by gas chromatography as follows. To 20 mg of dry PHA, 2 ml of sulfuric acid-methanol mixture (15:85) and 2 ml of chloroform were added and sealed, and heated at 100 ° C. for 140 minutes to obtain the methyl ester of the PHA decomposition product. After cooling, 1.5 g of sodium bicarbonate was added little by little to neutralize it, and the mixture was allowed to stand until the generation of carbon dioxide gas stopped. After 4 ml of diisopropyl ether was added and mixed well, the mixture was centrifuged, and the monomer unit composition of the PHA degradation product in the supernatant was analyzed by capillary gas chromatography.
  • the gas chromatograph used was Shimadzu Corporation GC-17A, and the capillary column used was GL Science NEUTRA BOND-1 (column length 25 m, column inner diameter 0.25 mm, liquid film thickness 0.4 ⁇ m). He was used as the carrier gas, the column inlet pressure was set to 100 kPa, and 1 ⁇ l of the sample was injected. As temperature conditions, the temperature was raised from the initial temperature of 100 to 200 ° C. at a rate of 8 ° C./min, and further from 200 to 290 ° C. at the rate of 30 ° C./min. As a result of analysis under the above conditions, the composition ratio of 3HH of the obtained PHA is shown in Table 1.
  • the KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain, the KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain and the pCUP2-lacUV5-cscB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strains of Comparative Examples 1, 2, and 4 can grow using sucrose as a carbon source. There wasn't.
  • the pCUP2-lacUV5-cscA in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain of Comparative Example 3 grew slightly with sucrose as a carbon source, but the growth rate was very slow.
  • the PHA produced by the pCUP2-lacUV5-cscA in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain of Comparative Example 3 did not contain a 3HH monomer unit and was a PHB that is a 3HB homopolymer.
  • Example 1 Sucrose utilization, PHA productivity and its 3HH composition ratio in pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6
  • the composition of the seed medium was the same as that described in Comparative Examples 1 to 4 .
  • kanamycin was added to the seed mother medium so as to have a final concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • composition and carbon source of the production medium used for the sucrose utilization test and PHA production were the same as those described in Comparative Examples 1 to 4.
  • the pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strain prepared in Production Example 2 was cultured in the same manner as in Comparative Examples 1 to 4, the culture solution was sampled over time, and cell growth (OD 600 ) and Various sugar concentrations (sucrose, glucose, fructose) in the medium were measured. The sugar concentration was measured in the same manner as in Comparative Examples 1 to 4. The results are shown in FIG.
  • the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, freeze-dried, and the dry cell weight was measured.
  • the PHA production amount and 3HH composition ratio were calculated in the same manner as in Comparative Examples 1 to 4. The obtained PHA production amount and 3HH composition ratio are shown in Table 1.
  • PCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 strains grew well using sucrose as a carbon source and produced PHA.
  • the PHA produced was PHB, a homopolymer.
  • Example 2 pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain in sucrose, glucose, fructose utilization, PHA productivity and its 3HH composition ratio
  • the composition of the seed medium is Comparative Examples 1-4 It was the same as that of description.
  • kanamycin was added to the seed mother medium so as to have a final concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • composition of the production medium used for the sucrose utilization test and PHA production was the same as that described in Comparative Examples 1 to 4.
  • the carbon source a 40 w / v% aqueous sucrose solution was used as a single carbon source, and was added to the medium so as to be 1.5 w / v%.
  • the pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain prepared in Production Example 3 was cultured in the same manner as in Comparative Examples 1 to 4, and the culture solution was sampled over time, and cell growth ( OD 600) and various sugar concentrations (sucrose in the medium, glucose, fructose) were measured. The sugar concentration was measured in the same manner as in Comparative Examples 1 to 4. The results are shown in FIG.
  • the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, freeze-dried, and the dry cell weight was measured.
  • the 3HH composition ratio of the produced PHA was calculated by the same method as in Comparative Examples 1 to 4.
  • Table 1 shows the 3HH composition ratio of the obtained PHA.
  • the pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain showed particularly excellent growth ability and PHA productivity using sucrose as a carbon source.
  • the growth rate when sucrose is used as the carbon source is higher than that when glucose is used as the carbon source. This was equivalent to the case where the necator H16 strain was originally made of fructose, which can be capitalized, as a carbon source.
  • the PHA produced by pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK005 ⁇ phaZ1,2,6 / nagEG793C, dR strain was PHB, which is a 3HB homopolymer.
  • Example 3 to 6 pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK144S strain, pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK143S strain, pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK140S strain and pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK142S Ratio
  • the composition of the seed medium was the same as that described in Comparative Examples 1 to 4.
  • kanamycin was added to the seed mother medium so as to have a final concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • composition of the production medium and the carbon source used for PHA production were the same as those described in Comparative Examples 1 to 4.
  • PCUP2-lacUV5-cscAB in KNK144S strain pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK143S strain
  • pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK140S strain pCUP2-lacUV5-cscAB strain 4 in KNK142S strain in Comparative Examples 6-9
  • the cells were cultured in the same manner as above, and after culturing for 72 hours, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, freeze-dried, and the dry cell weight was measured.
  • the PHA produced by the pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK144S strain of Example 3 and the pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK140S strain of Example 5 is a PHBH slightly containing 3HH monomer, and the pCUP2-lacUV5- of Example 4 is used.
  • the PHA produced by cscAB in KNK143S strain was PHBH with a 3HH composition ratio of 2.3%.
  • the PHA produced by the pCUP2-lacUV5-cscAB in KNK142S strain of Example 6 was a very high PHBH with a 3HH composition ratio of 26.7%.

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Abstract

本発明は、スクロースを資化することのできるＰＨＡ生産微生物、およびスクロースを炭素源として該微生物を培養することによるＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。ＰＨＡ合成酵素遺伝子と、下記（１）及び（２）の異種生物由来遺伝子とを有するＰＨＡ生産微生物。（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース加水分解酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース透過酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。また、該微生物を、スクロースを炭素源として含む培地で培養する工程を含む、ＰＨＡの製造方法。

Description

スクロース資化性を有するＰＨＡ生産微生物、及び該微生物を用いたＰＨＡの製造方法
　本発明は、スクロース資化性を有するＰＨＡ生産微生物と、該微生物を用いたＰＨＡの製造方法に関する。
　ポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと記すこともある）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子であり、再生可能資源を原料として産生することができる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。
　このＰＨＡを構成するモノマー単位の一般名は、ヒドロキシアルカン酸である。ヒドロキシアルカン酸には、具体的には３－ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記すこともある）、３－ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記すこともある）、３－ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記すこともある）、３－ヒドロキシオクタン酸、よりアルキル鎖の長い３－ヒドロキシアルカン酸や、４－ヒドロキシ酪酸などが例示され、これらが単独重合または共重合することにより、ポリマー分子であるＰＨＡが形成される。
　ＰＨＡの具体例として、３ＨＢのホモポリマーであるポリ－３－ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記すこともある）が挙げられる。また、３ＨＢと３ＨＶの共重合体であるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３ＨＨの共重合体であるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（以下、ＰＨＢＨと記すこともある）や、３ＨＢと４ＨＢの共重合体であるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）なども挙げられる。この中でも特にＰＨＢＨは、３ＨＨ組成比を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができる。そのため、ＰＨＢＨは、低３ＨＨ組成比のＰＨＢＨを用いたテレビの筐体等のように硬さを要求されるものから、高３ＨＨ組成比のＰＨＢＨを用いたフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。
　ＰＨＡのようなバルクケミカルの発酵生産において、生産コストにおける炭素源コストの占める割合は大きい。したがって、安価な炭素源を効率よく発酵に用いることが重要となる。
　微生物発酵による化学物質生産では、グルコースを主炭素源として行われる場合が多くみられるが、グルコースは比較的高価格の炭素源である。従って、グルコースを主炭素源とすると、原油を主原料物質とした化学合成法による生産価格よりも高価となる場合があり、価格競争力の面で商業化には困難がある。
　一方で、グルコースよりも安価な糖原料としてスクロースが知られている。スクロースは、グルコースとフルクトースで形成された二糖類の一つであり、光合成能を有する全ての植物から生産され、自然界に非常に豊富に存在する炭素源である。さらにスクロースは廃糖蜜の主成分であり、廃糖蜜は食料と競合しない再生可能資源という点でも魅力的な炭素源である。
　特許文献１によれば、微生物がスクロースを資化するメカニズムは、スクロースＰＴＳ（Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System）とスクロース非ＰＴＳの２つに大別される。スクロース非ＰＴＳを経由する場合、微生物はスクロースをそのままの形で取り込み、その後にグルコースとフルクトースに分解する。一方、スクロースＰＴＳを経由する場合では、微生物はスクロースを取り込む際にスクロースをリン酸化し、スクロース－６－リン酸へと変換する。そして微生物細胞内部でグルコース－６－リン酸とフルクトースに分解する。あるいは、微生物細胞外でスクロースが分解され、生じたグルコースとフルクトースが資化される場合もある。
　しかしながら、すべての微生物がスクロースを資化できるわけではない。例えば、ＰＨＡ生産微生物として知られるカプリアビダス・ネカトールＨ１６株は、フルクトースは資化できるがグルコースとスクロースは資化することができない。
　これまでにスクロース非資化性の微生物に対して、遺伝子工学的手法によりスクロース資化性を付加するいくつかの研究が行われている。例えば、非特許文献１では、元来スクロース非資化性であるエシェリキア・コリＫ－１２株に対して、エシェリキア・コリＷ株に由来するスクロース資化関連遺伝子（スクロース透過酵素遺伝子およびスクロース加水分解酵素遺伝子）を導入することによって、スクロース資化が可能となったことが示されている。この場合、遺伝子の由来生物と導入する宿主が同種の生物であるため、遺伝子組み換えによって導入された遺伝子がうまく機能する蓋然性は高いと考えられる。また、特許文献２では、スクロースＰＴＳ遺伝子群を導入することでスクロース非資化性のエシェリキア属細菌にスクロース資化性を付与した例が開示されている。さらに、特許文献１では、スクロースホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびスクロース加水分解酵素遺伝子を導入することでスクロース資化性を付与した例が開示されている。
特表２０１１－５０５８６９号公報 特開２００１－３４６５７８号公報
Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ，ｖｏｌ．７９，４７８（２０１３）
　本発明は、スクロースを資化することができるＰＨＡ生産微生物、及び、スクロースを炭素源として該微生物を培養することによるＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＨＡを産生する能力を有する微生物に、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする異種生物由来遺伝子とスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする異種生物由来遺伝子の両方を導入することによって、当該微生物にスクロース分解能力及び細胞内へのスクロース取り込み能力が付加され、スクロースを炭素源としたＰＨＡ生産が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子と、下記（１）及び（２）の異種生物由来遺伝子とを有するＰＨＡ生産微生物に関する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース加水分解酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース透過酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
　好ましくは、前記微生物が、カプリアビダス属に属する微生物を宿主とする形質転換体であり、より好ましくは、前記カプリアビダス属に属する微生物が、カプリアビダス・ネカトールである。好ましくは、前記微生物はグルコース資化性が付与又は強化されている。好ましくは、前記ＰＨＡ合成酵素遺伝子が、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子である。好ましくは、前記微生物は、さらにクロトニル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子およびエチルマロニル－ＣｏＡ脱炭酸酵素遺伝子を有する。好ましくは、前記微生物は、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子が欠失した、またはその発現量が抑制されている。
　また、本発明は、前記微生物を、スクロースを炭素源として含む培地で培養する工程を含む、ＰＨＡの製造方法に関し、好ましくはＰＨＡがＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）である前記製造方法に関する。
　本発明により、スクロースを資化することができるＰＨＡ生産微生物を提供することができる。また、炭素源としてスクロースを用いて該微生物を培養することでＰＨＡを発酵生産することが可能となる。
比較例１に関し、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度） 比較例２に関し、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度） 比較例３に関し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度） 比較例４に関し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度） 実施例１に関し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度） 実施例２に関し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ，ｄＲ株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度） 実施例２に関し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株のスクロース含有培地、グルコース含有培地、又はフルクトース含有培地における増殖および乾燥菌体重量、ＰＨＡ生産量の変化を示すグラフである。（△を含む実線：スクロース含有培地における変化；■を含む実線：グルコース含有培地における変化；×を含む実線：フルクトース含有培地における変化）
　以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。
　（１）スクロース資化性が付与または強化されたＰＨＡ生産微生物
　本発明では、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物に対し、異種生物由来のスクロース加水分解酵素遺伝子と異種生物由来のスクロース透過酵素遺伝子の両方を導入することによって、スクロース資化性が付与または強化され、スクロースを炭素源としてＰＨＡを生産する微生物を提供する。
　本明細書で使用する「スクロース加水分解酵素遺伝子」は、スクロースを加水分解し、グルコースとフルクトースを生じさせる酵素であるスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子である。また、本明細書で使用する「スクロース透過酵素遺伝子」は、スクロースを細胞内に取り込む働きを持つスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子である。
　本発明において、スクロース加水分解酵素遺伝子とスクロース透過酵素遺伝子が導入される元株（宿主）となる微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、ＰＨＡを生産できる微生物である限り特に限定されないが、本来はスクロース資化性を持たない、又はスクロース資化性の低いＰＨＡ生産微生物が好ましい。このようなＰＨＡ生産微生物としては、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株だけではなく、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有しない微生物に対して遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された組み換え菌株であってもよい。
　そのような微生物として、具体的には、細菌、酵母、糸状菌などが例示され、好ましくは、細菌である。当該細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する微生物であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）である。
　ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物が、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された組み換え菌株である場合、前記外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株）が保有する配列番号３に記載するアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ＰＨＡ合成活性を有するポリペプチドをコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子や、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）が保有するＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ＰＨＡ合成活性を有するポリペプチドをコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子などが挙げられるがこれらに限定されず、その他のＰＨＡ合成酵素遺伝子も好適に利用出来る。なお、上記配列同一性は好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。これらの中でも、ＰＨＡとしてＰＨＢＨを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子が好ましく、例えば配列番号４に記載するアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子がより好ましい。
　本発明においてスクロース加水分解酵素遺伝子とスクロース透過酵素遺伝子を導入される元株となる微生物としては、ＰＨＢＨを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物が好ましく、その具体例としては、カプリアビダス・ネカトールに、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された形質転換体が最も好適である。
　本発明では、上記微生物に、当該微生物とは異種の生物に由来するスクロース加水分解酵素遺伝子とスクロース透過酵素遺伝子を導入する。ここで、スクロース加水分解酵素遺伝子としては、エシェリキア・コリ由来の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つスクロース加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であれば特に限定されないが、一例として、配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。スクロース透過酵素遺伝子については、エシェリキア・コリ由来の配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つスクロース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であれば特に限定されないが、一例として、配列番号６に記載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。なお、上記配列相同性としては好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
　本発明のＰＨＡ生産微生物において、ＰＨＡ合成酵素遺伝子や、スクロース加水分解酵素遺伝子及びスクロース透過酵素遺伝子は、宿主となる微生物が保有する染色体、プラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に存在しても良いし、プラスミドベクター上や人工染色体上など人為的に微生物内に組み込まれたＤＮＡ上に存在しても良い。しかし、導入されたＤＮＡの保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に存在するのが好ましく、微生物が保有する染色体上に存在するのがより好ましい。
　微生物が保有するＤＮＡ上に任意のＤＮＡを部位特異的に置換又は挿入する方法は当業者に周知であり、本発明の微生物を製造する際に使用できる。特に限定されないが、代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　ｖｏｌ．１６２：ｐ１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　ｖｏｌ．１５４，　ｐ１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，　Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　ｖｏｌ．６，　ｐ１１９５　（１９９２）、　Ｌｅｎｚ等，　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　ｖｏｌ．１７６，　ｐ４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
　なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９又は２００１）などに記載される技術を利用することができる。
　上記スクロース加水分解酵素遺伝子、及びスクロース透過酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されない。例えば、カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子のプロモーター、ｐｈａＰ１遺伝子のプロモーター、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｉｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが使用可能である。また、各遺伝子に対し同じプロモーターを使用してもよく、異なるプロモーターを使用してもよい。特に、配列番号７に示されるｌａｃＵＶ５プロモーターを両遺伝子に対し使用するのが好ましい。
　上記によりスクロース資化性が付与または強化された微生物のグルコース資化性が低い、または資化性を持たない場合、遺伝子変異や破壊、遺伝子発現の強化、外来遺伝子の導入などの方法によって、前記微生物にグルコース資化性を付与または強化することが好ましい。これによって、前記微生物のスクロース資化性をさらに強化し、スクロースを炭素源として用いた場合にＰＨＡ生産量を向上させることができる。例えば、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株はグルコース取り込み系の遺伝子を持たないため、グルコースを資化することができない。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株にグルコース資化性を付与する方法は特に限定されないが、一例として、Ｎ－アセチルグルコサミンの取り込み遺伝子であるｎａｇＥの７９３番目の塩基であるＧをＣに置換し、さらに転写制御因子をコードする遺伝子であるｎａｇＲを破壊することで、グルコース資化性を付与する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ.１１３，６３（２０１２））が挙げられる。また、グルコーストランスポーターをコードする外来遺伝子を導入することで、グルコース資化性を付与する方法（特開２００９－２２５６６２号公報）も挙げられる。さらに、グルコースリン酸化酵素遺伝子を導入する方法が有効な場合もある。
　従来の研究から、３ＨＨモノマーを取り込み可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入したカプリアビダス・ネカトールに、クロトニル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｃｃｒ）およびエチルマロニル－ＣｏＡ脱炭酸酵素遺伝子（ｅｍｄ）を導入することで、あるいは（Ｒ）－特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪ）をさらに導入することで、フルクトースを炭素源としてＰＨＢＨを生産できることが知られている（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．２７，３８（２０１５））。本発明のＰＨＡ生産微生物において、前記スクロース加水分解酵素遺伝子及びスクロース透過酵素遺伝子に加えて、ｃｃｒ及び／又はｅｍｄが導入されていても良い。ｃｃｒ及び／又はｅｍｄの導入により、糖質を炭素源とする場合において、炭素数６の（Ｒ）－３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡの合成経路が強化又は効率化され、生産されるＰＨＢＨにおける３ＨＨ組成比率を向上させることができる。
　本発明において使用されるクロトニル－ＣｏＡ還元酵素とは、脂肪酸β－酸化経路の中間体である炭素数４のクロトニル－ＣｏＡを還元し、ブチリル－ＣｏＡを生成する酵素である。ブチリル－ＣｏＡがβ－ケトチオラーゼ（ＢｋｔＢ）の作用によりもう１分子のアセチル－ＣｏＡと縮合し、さらに変換されることにより、炭素数６の（Ｒ）－３ＨＨｘ－ＣｏＡが供給され、これが、広基質特異性を示すポリエステル重合酵素により（Ｒ）－３ＨＢ－ＣｏＡと共重合される。本発明において使用され得るｃｃｒは、翻訳後の該還元酵素が上記のクロトニル－ＣｏＡ還元酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば、放線菌Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ由来のクロトニル－ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ１７８６７３）や、メタノール資化性菌Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ由来のクロトニル－ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：７９９０２０８）等が挙げられる。好ましくは配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するクロトニル－ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つクロトニル－ＣｏＡ還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする遺伝子である。
　本発明に使用されるエチルマロニル－ＣｏＡ脱炭酸酵素とは、クロトニル－ＣｏＡ還元酵素やプロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼなどによる副反応で生じたエチルマロニル－ＣｏＡのブチリル－ＣｏＡへの脱炭酸反応を触媒する酵素を意味する。この活性を有する限りにおいては、エチルマロニル－ＣｏＡ脱炭酸酵素の由来は特に限定されないが、例えば配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するマウス由来のエチルマロニル－ＣｏＡ脱炭酸酵素が挙げられる。該アミノ酸配列をコードし、カプリアビダス・ネカトールにおいて使用可能な遺伝子塩基配列としては、例えば、配列番号４２に記載の塩基配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　本発明によるＰＨＢＨ生産微生物においては、上記ｃｃｒおよびｅｍｄの導入に加えて、上記（Ｒ）－特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪ）をさらに導入してもよい。これにより、（Ｒ）－３ＨＨｘ－ＣｏＡの生合成能力を強化することができる。ここで、本発明に使用される（Ｒ）－特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼとは、脂肪酸β－酸化系中間体である２－エノイル－ＣｏＡを、ＰＨＡモノマーである（Ｒ）－３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡに変換する酵素を意味する。この活性を有する限りにおいては、ｐｈａＪの由来は特に限定されないが、好ましくは、カプリアビダス・ネカトール又はアエロモナス・キャビエ由来である。本発明に使用されるｐｈａＪとして、例えば、カプリアビダス・ネカトール由来のｐｈａＪ４ａ（Ｈ１６　Ａ１０７０,ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：４２４８６８９）やｐｈａＪ４ｂ（Ｈ１６　Ｂ０３９７,ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：４４５４９８６）、アエロモナス・キャビエ由来のｐｈａＪ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＡＡ２１８１６）等が挙げられる。
　本発明のＰＨＢＨ生産微生物においては、上記ｃｃｒおよびｅｍｄの導入に加えて、アセトアセチル－ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を欠失させるか、その発現を抑制することで、より高い３ＨＨ組成比率のＰＨＢＨを生産することが可能となる。欠失させるかまたは発現を抑制するアセトアセチル－ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子としては、アセトアセチル－ＣｏＡを基質として（Ｒ）－３ＨＢ－ＣｏＡを生成する触媒機能を有する酵素をコードする遺伝子であればよい。特に限定されないが、例えば、ｐｈａＢ１やｐｈａＢ３（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：４２４９７８４、ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：４２５０１５５）が挙げられる。
　本明細書において欠失とは、遺伝子操作や突然変異によって、対象とする遺伝子の一部又は全部が存在しなくなった、あるいは塩基配列の追加や置換によって終止コドンが出現したりコードするアミノ配列が変化したなどの結果として、該遺伝子によってコードされたタンパク質の活性の一部又は全部が失われることを意図する。遺伝子発現を抑制する方法としては、遺伝子上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列における塩基配列の改変などが挙げられるが、これに限定されない。
　本発明のＰＨＡ生産微生物において、ｃｃｒ、ｅｍｄ、及びｐｈａＪは、宿主となる微生物が保有する染色体、プラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に存在しても良いし、プラスミドベクター上や人工染色体上など人為的に微生物内に組み込まれたＤＮＡ上に存在しても良い。しかし、導入されたＤＮＡの保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に存在するのが好ましく、微生物が保有する染色体上に存在するのがより好ましい。また、宿主となる微生物がこれらの遺伝子を元々保有している場合には、元々保有する遺伝子の上流の塩基配列を置換、欠失または付加することなどにより、遺伝子の発現量を増加させてもよい。
　上記ｃｃｒ、ｅｍｄ、及びｐｈａＪを発現させるためのプロモーターは特に限定されない。例えば、カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子のプロモーター、ｐｈａＰ１遺伝子のプロモーター、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｉｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが使用可能である。また、各遺伝子に対し同じプロモーターを使用してもよく、異なるプロモーターを使用してもよい。特に、ｔｒｃプロモーターを各遺伝子に対し使用するのが好ましい。
　（２）ＰＨＡの製造方法
　本発明の微生物を、炭素源としてスクロースを含む培地で培養することで、ＰＨＡを生産させ、得られたＰＨＡを回収することでＰＨＡを製造することができる。
　本発明によるＰＨＡの生産においては、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地において、前記微生物を培養することが好ましい。
　炭素源としてはスクロースを含有していれば良く、スクロースを含有する炭素源として、スクロースを豊富に含む糖蜜、または廃糖蜜が挙げられる。また、スクロースを含有していれば他の炭素源が含まれていてもよく、スクロースと他の炭素源を併用してもよい。他の炭素源としては、本発明の微生物が資化可能であればどんな炭素源でも使用可能であるが、好ましくは、グルコース、フルクトースなどの糖類、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　本発明の微生物を培養する際の、培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、使用する微生物、例えばラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等の細菌類の培養で通常使用されるような条件でよい。
　本発明において生産されるＰＨＡの種類としては、微生物が生産することのできるＰＨＡであれば特に限定されないが、好ましくは、炭素数４～１６のヒドロキシアルカン酸から選択される１種以上のモノマーを重合して得られるＰＨＡが好ましい。例えば、３ＨＢのホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３ＨＶの共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３ＨＨの共重合体ＰＨＢＨ、３ＨＢと４ＨＢの共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、その目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
　本発明において、微生物を培養した後、菌体からのＰＨＡの回収は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
　得られたＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ等のモノマー組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーやガスクロマトグラフ法、核磁気共鳴法等により行うことができる。
　以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
　また、以下の製造例、実施例、及び比較例で使用されるＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ１，２，６遺伝子が欠失し、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入された形質転換体であり、国際公開第２０１４／０６５２５３号の方法に準じて作製することが出来る。
　（製造例１）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製
　まず、染色体置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号８及び配列番号９で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは初めに９８℃で２分の処理を行った後、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分の一連の反応を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号１０及び配列番号１１で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号８及び１１で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基より上流および下流の塩基配列を有し、且つｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基がＧからＣに置換された塩基配列を含む染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃを作製した。
　次に、染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃを用いて、以下のようにして染色体置換株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株の作製を行った。
　染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。
　得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、当該寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、前記プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上のｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換された菌株１株を単離した。この変異導入株をＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株と命名した。得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、さらにｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換された株である。
　さらに、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１２及び配列番号１３で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記と同様の反応条件で行い、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号１４及び配列番号１５で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１２及び１５で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｎａｇＲ構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｎａｇＲＵＤを作製した。
　次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｎａｇＲＵＤを用いて、以下のようにして遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製を行った。
　遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｎａｇＲＵＤで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、上記で得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。
　得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、当該寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、前記プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上のｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株と命名した。ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、さらにｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。
　（製造例２）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の作製
　まず、ｃｓｃＡおよびｃｓｃＢ遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　人工遺伝子合成により、ｃｓｃＡおよびｃｓｃＢ遺伝子を含む、配列番号１６で示される塩基配列が導入されたプラスミドを得た。このプラスミドを制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたｃｓｃＡおよびｃｓｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、国際公開第２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｃｓｃＡＢを得た。
　さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１７および配列番号１８で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｃｓｃＡＢをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｌａｃＵＶ５プロモーターの下流にｃｓｃＡおよびｃｓｃＢが位置する向きに、ｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片が挿入されたものをＰＣＲによって選別し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢを得た。
　次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢをＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を得た。
　プラスミドベクターの細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を取得した。
　（製造例３）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製
　製造例２で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢを、製造例２と同様の方法で、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を得た。
　（製造例４）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の作製
　まず、ｃｓｃＡ遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢをテンプレートとして配列番号１９及び配列番号２０で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｃｓｃＡ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、国際公開第２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｃｓｃＡを得た。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１７および配列番号１８で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｃｓｃＡをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｌａｃＵＶ５プロモーターの下流にｃｓｃＡが位置する向きに、ｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片が挿入されたものをＰＣＲによって選別し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡを得た。
　次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡを、製造例２と同様の方法でＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を得た。
　（製造例５）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の作製
　まず、ｃｓｃＢ遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢをテンプレートとして配列番号２１及び配列番号２２で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｃｓｃＢ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、国際公開第２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｃｓｃＢを得た。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１７および配列番号１８で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｃｓｃＢをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｌａｃＵＶ５プロモーターの下流にｃｓｃＢが位置する向きに、ｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片が挿入されたものをＰＣＲによって選別し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＢを得た。
　次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＢを、製造例２と同様の方法でＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を得た。
　（製造例６）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４４Ｓ株の作製
　まず、特開２０１３－９６２７号公報に記載のプラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを用いて、以下のようにしてプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入株ＡＣＰ－ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製を行った。
　プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ，ｄＲ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。
　得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、当該寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、前記プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ，ｄＲ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上のｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株１株を単離した。この遺伝子挿入株をＡＣＰ－ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株と命名した。ＡＣＰ－ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｂｋｔＢ（βケトチオラーゼ）遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株である。
　さらに、以下のようにしてプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入株ＡＣＰ－ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株の作製を行った。
　まず、プロモーターおよびリボソーム結合配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２３及び配列番号２４で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号２５及び配列番号２６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、プラスミドｐＫＫ３８８－１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして配列番号２７および配列番号２８で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２３及び配列番号２６で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｔｒｃプロモーター、リボソーム結合配列、及びｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子配列を有するプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ－ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂを作製した。
　次に、プロモーターおよびリボソーム結合配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ－ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂを用いて、ＡＣＰ－ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を親株として、上記のプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入株の作製方法と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＡＣＰ－ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株を作製した。ＡＣＰ－ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、さらにｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株である。
　さらに、以下のようにして染色体置換株ＫＮＫ１４４Ｓ株の作製を行った。
　特開２００８－２９２１８号公報に記載の染色体置換用ベクターｐＢｌｕｅＡＳＲＵを用いて、ＡＣＰ－ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株を親株として、製造例１に記載の染色体置換株の作製と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＫＮＫ１４４Ｓ株を作製した。ＫＮＫ１４４Ｓ株はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、さらにｐｈａＡ構造遺伝子配列中に終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成した株である。
　次に、製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢを、製造例２と同様の方法でＫＮＫ１４４Ｓ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４４Ｓ株を得た。
　（製造例７）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４３Ｓ株の作製
　まず、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２９及び配列番号３０で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記と同様の反応条件で行い、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号３１及び配列番号３２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２９及び３２で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＺ２構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するプラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＺ２ＭｕｎＩＳｐｅＩを作製した。
　次に、人工遺伝子合成により、リボソーム結合配列、ｃｃｒおよびｅｍｄを含む、配列番号３３で示される塩基配列が導入されたプラスミドを得た。このプラスミドを制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたリボソーム結合配列、ｃｃｒおよびｅｍｄ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ｚ２ＵＤＭｕｎＩＳｐｅＩをＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ－ｃｃｒ－ｅｍｄ－Ｚ２Ｄを得た。
　次に、プラスミドｐＫＫ３８８－１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして配列番号３４および配列番号３５で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｔｒｃプロモーター配列を含むＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ－ｃｃｒ－ｅｍｄ－Ｚ２ＤをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｔｒｃプロモーターの下流にｃｃｒおよびｅｍｄが位置する向きに、ｔｒｃプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が挿入されたものをＰＣＲによって選別し、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ－ｔｒｃ－ｃｃｒ－ｅｍｄ－Ｚ２Ｄを得た。
　次に、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ－ｔｒｃ－ｃｃｒ－ｅｍｄ－Ｚ２Ｄを用いて、ＫＮＫ１４４Ｓ株を親株として、製造例６に記載のプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入株の作製方法と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＫＮＫ１４３Ｓ株を作製した。ＫＮＫ１４３Ｓ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＡ構造遺伝子配列中に終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成し、さらに元々はｐｈａＺ２遺伝子があった位置にｔｒｃプロモーター、リボソーム結合配列、ｃｃｒ遺伝子及びｅｍｄ遺伝子が挿入された株である。
　次に、製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢを、製造例２に記載の方法でＫＮＫ１４３Ｓ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４３Ｓ株を得た。
　（製造例８）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４０Ｓ株の作製
　まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号３６及び配列番号３７で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３８及び配列番号３９で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号３６及び配列番号３９で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＡ構造遺伝子より上流の塩基配列、及びｐｈａＢ１（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ）構造遺伝子より下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢ１ＵＤを作製した。
　次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢ１ＵＤを用いて、ＫＮＫ－１４４Ｓ株を親株として、製造例１に記載の染色体置換株の作製と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＫＮＫ１４０Ｓ株を作製した。ＫＮＫ１４０Ｓ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、さらにｐｈａＡ遺伝子の開始コドンからｐｈａＢ１遺伝子の終止コドンまでを欠失した株である。
　次に、製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢを、製造例２に記載の方法でＫＮＫ１４０Ｓ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４０Ｓ株を得た。
　（製造例９）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４２Ｓ株の作製
　製造例８に記載の遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢ１ＵＤを用いて、製造例７に記載のＫＮＫ－１４３Ｓ株を親株として、製造例１に記載の染色体置換株の作製と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＫＮＫ１４２Ｓ株を作製した。ＫＮＫ１４２Ｓ株はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、元々はｐｈａＺ２遺伝子があった位置にｔｒｃプロモーター、リボソーム結合配列、ｃｃｒ遺伝子及びｅｍｄ遺伝子が挿入され、さらにｐｈａＡ遺伝子の開始コドンからｐｈａＢ１遺伝子の終止コドンまでを欠失した株である。
　次に、製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢを、製造例２に記載の方法でＫＮＫ１４２Ｓ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４２Ｓ株を得た。
　（比較例１～４）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株およびｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株におけるスクロースの資化性、ＰＨＡ生産性およびその３ＨＨ組成比率
　種母培地の組成は１ｗ／ｖ％　Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。
　スクロース資化性試験およびＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、０．１３ｗ／ｖ％　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源は４０ｗ／ｖ％スクロース水溶液を単一炭素源として用い、１．５ｗ／ｖ％となるように培地に添加した。
　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株（国際公開第２０１４／０６５２５３号参照）、製造例１において作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株、製造例４において作製したｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株および製造例５において作製したｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の各グリセロールストック（５０μＬ）をそれぞれ種母培地（５ｍＬ）に接種して培養温度３０℃で２４時間振とう培養し、得られた培養液を種母とした。
　スクロース資化性試験およびＰＨＡ生産培養では、２００ｍＬの生産培地を入れた坂口フラスコに前記種母を１．０ｖ／ｖ％接種し、培養温度３０℃で振とう培養を行った。経時的に培養液をサンプリングし、菌体の増殖（ＯＤ６００）および培地中の各種糖濃度（スクロース、グルコース、フルクトース）を測定した。糖濃度の測定はＦ－キット ショ糖／D－グルコース／果糖（株式会社 J.K.インターナショナル）を用いて行った。結果を図１～４に示した。
　７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
　ＰＨＡ生産量は以下のように算出した。得られた乾燥菌体１ｇあたり１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が１／３になるまで濃縮後、濃縮液量の３倍量のヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、ＰＨＡ生産量を算出した。結果を表１に示した。
　生産されたＰＨＡの３ＨＨ組成比率は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＡの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸－メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰＨＡ分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ－１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ　ＢＯＮＤ－１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００～２００℃まで８℃／分の速度で昇温し、さらに２００～２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、得られたＰＨＡの３ＨＨ組成比率を表１に示した。
　比較例１、２および４のＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株およびｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、スクロースを炭素源として増殖することができなかった。比較例３のｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、スクロースを炭素源としてわずかに増殖したが、その増殖速度は非常に遅かった。また、比較例３のｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株によって生産されたＰＨＡは３ＨＨモノマー単位を含有せず、３ＨＢのホモポリマーであるＰＨＢであった。
　（実施例１）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株におけるスクロース資化性、ＰＨＡ生産性およびその３ＨＨ組成比率
　種母培地の組成は比較例１～４に記載のものと同様とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。
　スクロース資化性試験およびＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成および炭素源は比較例１～４に記載のものと同様とした。
　製造例２において作製したｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を比較例１～４と同様の方法で培養し、経時的に培養液をサンプリングし、菌体の増殖（ＯＤ６００）および培地中の各種糖濃度（スクロース、グルコース、フルクトース）を測定した。糖濃度の測定は比較例１～４と同様の方法で行った。結果を図５に示した。
　７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
　ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１～４と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。
　ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、スクロースを炭素源として良好に増殖し、ＰＨＡを生産した。生産されたＰＨＡはホモポリマーであるＰＨＢであった。
　（実施例２）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株におけるスクロース、グルコース、フルクトース資化性、ＰＨＡ生産性およびその３ＨＨ組成比率
　種母培地の組成は比較例１～４に記載のものと同様とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。
　スクロース資化性試験およびＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は比較例１～４に記載のものと同様とした。炭素源は４０ｗ／ｖ％スクロース水溶液を単一炭素源として用い、１．５ｗ／ｖ％となるように培地に添加した。
　製造例３において作製したｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を比較例１～４と同様の方法で培養し、経時的に培養液をサンプリングし、菌体の増殖（ＯＤ６００）および培地中の各種糖濃度（スクロース、グルコース、フルクトース）を測定した。糖濃度の測定は比較例１～４と同様の方法で行った。結果を図６に示した。
　７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
　ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１～４と同様の方法で算出した。結果を表１に示した。
　また、上記と同様の条件で炭素源をスクロース水溶液から同濃度のグルコース水溶液またはフルクトース水溶液に変更した生産培地において培養を行い、経時的に培養液をサンプリングし、菌体の増殖（ＯＤ６００）、乾燥菌体重量、及び、ＰＨＡ生産量を測定した。結果を図７に示した。
　生産されたＰＨＡの３ＨＨ組成比率を比較例１～４と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡの３ＨＨ組成比率を表１に示した。
　ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株は、スクロースを炭素源として、特に優れた増殖力およびＰＨＡ生産性を示した。スクロースを炭素源とした場合の増殖速度はグルコースを炭素源とした場合を上回り、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ　Ｈ１６株が元来資化可能なフルクトースを炭素源とした場合と同等であった。
　ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株によって生産されたＰＨＡは、３ＨＢのホモポリマーであるＰＨＢであった。
　（実施例３～６）ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４４Ｓ株、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４３Ｓ株、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４０Ｓ株およびｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４２Ｓ株におけるＰＨＡ生産性およびその３ＨＨ組成比率
　種母培地の組成は比較例１～４に記載のものと同様とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。
　ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成および炭素源は比較例１～４に記載のものと同様とした。製造例６～９において作製したｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４４Ｓ株、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４３Ｓ株、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４０Ｓ株およびｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４２Ｓ株をそれぞれ比較例１～４と同様の方法で培養し、７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
　ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１～４と同様の方法で算出した。結果を表１に示した。
　いずれの株も、スクロースを炭素源として良好に増殖し、ＰＨＡを生産した。実施例３のｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４４Ｓ株および実施例５のｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４０Ｓ株によって生産されたＰＨＡは３ＨＨモノマーを僅かに含有するＰＨＢＨであり、実施例４のｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４３Ｓ株によって生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が２．３％のＰＨＢＨであった。実施例６のｐＣＵＰ２－ｌａｃＵＶ５－ｃｓｃＡＢ　ｉｎ　ＫＮＫ１４２Ｓ株によって生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が２６．７％と非常に高いＰＨＢＨであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

Claims (9)

  1. ＰＨＡ合成酵素遺伝子と、下記（１）及び（２）の異種生物由来遺伝子とを有するＰＨＡ生産微生物。
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース加水分解酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
    （２）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース透過酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
  2. 前記微生物が、カプリアビダス属に属する微生物を宿主とする形質転換体である、請求項１に記載の微生物。
  3. 前記カプリアビダス属に属する微生物が、カプリアビダス・ネカトールである、請求項２に記載の微生物。
  4. グルコース資化性が付与又は強化されている、請求項１～３いずれか１項に記載の微生物。
  5. 前記ＰＨＡ合成酵素遺伝子が、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子である、請求項１～４いずれか１項に記載の微生物。
  6. さらにクロトニル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子およびエチルマロニル－ＣｏＡ脱炭酸酵素遺伝子を有する、請求項３～５いずれか１項に記載の微生物。
  7. アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子が欠失した、またはその発現量が抑制されている、請求項６に記載の微生物。
  8. 請求項１～７いずれか１項に記載の微生物を、スクロースを炭素源として含む培地で培養する工程を含む、ＰＨＡの製造方法。
  9. ＰＨＡがＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）である請求項８に記載の製造方法。
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