KR20210114744A - 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 공중합체 생산능을 가지는 형질전환 메탄자화균에 관한 것으로, 본 발명의 형질전환 메탄자화균은 메탄을 유일 탄소원으로 이용하여 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산할 수 있으며, 이러한 메탄자화균을 이용한 바이오전환 공정의 경우, 비교적 저렴한 메탄을 탄소원으로 사용할 수 있어 경제적으로 유리하며, 대기 중의 메탄을 사용 가능하다는 점에서 온실가스의 방출 예방 등 환경적인 면에서도 장점이 있다.
Description
본 발명은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 4-하이드록시부티레이트의 공급없이 메탄으로부터 3-하이드록시부티레이트와 4-하이드록시부티레이트를 각각 생합성한 후, 이를 중합하여 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산하는 형질전환 메탄자화균에 관한 것이다.
폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHA)는 재조합 대장균 또는 Ralstonia eutropha에 의해 산업적으로 생산되는 생분해성 폴리에스테르이다. 최근 연구에 따르면 Methylocystis hirsuta 또는 cyanobacteria를 이용하여 메탄 또는 CO2로부터 폴리하이드록시알카노에이트 생산이 보고되고 있다. 폴리-3-하이드록시부티레이트(poly(3-hydroxybutyrate), PHB)는 많은 종류의 미생물에서 가장 많이 연구된 바이오 폴리에스터이지만 폴리-3-하이드록시부티레이트는 잘 부러지는 특성으로 인해 그다지 유용하지 않다. 4-hydroxybutyrate(4HB)를 poly(3-hydroxybutyrate)(PHB)에 혼입하면 3-hydroxybutyrate(3HB) 및 4HB로 구성된 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate), poly(3HB-co-4HB))가 형성된다. 4-하이드록시부티레이트 mol %에 따라, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체는 경질 결정질에서 탄성 고무로 특성이 변한다. 유연한 물리적 및 기계적 특성으로 인해 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체는 최고의 폴리하이드록시알카노에이트 중 하나로 평가되고 있으며 포장 필름, 가스 필터, 약물 운반체 및 세포 배양 스캐폴드(cells culture scaffolds)로 사용될 수 있다.
메탄을 탄소원으로 사용하는 메탄자화균인 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium) OB3b는 자연적으로 폴리-3-하이드록시부티레이트를 합성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명은 4-하이드록시부티레이트 합성 경로를 구축하고 메탄을 유일한 탄소원으로 사용하여 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 합성하는 플랫폼 균주를 개발하고, 메탄 유래의 생분해성 폴리머 생산 공정을 개발함으로써 환경 친화적이고 지속가능한 기술을 확보하고자 한다.
Steinbuchel, A., Valentin, H.E. & Schonebaum, A. Application of recombinant gene technology for production of polyhydroxyalkanoic acids: Biosynthesis of poly(4-hydroxybutyric acid) homopolyester. J Environ Polym Degr 2, 67-74 (1994).
본 발명의 목적은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 메탄자화균을 포함하는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 숙신산 세미알데히드 탈수소효소 유전자, NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소 유전자, 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소 유전자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자가 도입된 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 메탄자화균을 포함하는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 메탄자화균을 메탄을 포함하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 메탄자화균은 C1 탄소원으로부터 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산할 수 있으며, 이러한 메탄자화균을 이용한 바이오전환 공정의 경우, 비교적 저렴한 메탄을 탄소원으로 사용할 수 있어 경제적으로 유리하며, 대기 중의 메탄을 사용 가능하다는 점에서 온실가스의 방출 예방 등 환경적인 면에서도 장점이 있다.
도 1은 본 발명에서 제조하는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 화학식을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 M. trichosporium OB3b에 수행한 대사조작에 의한 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산경로를 간략히 도식화한 것이다.
도 3은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 PAWP894HB-abfT의 정보를 나타낸 것이다.
도 4는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 pAWP4HB-Msed의 정보를 나타낸 것이다.
도 5는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 pAWP894HB-BS101OP의 정보를 나타낸 것이다.
도 6는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 pAWP894HB-BS101OPI의 정보를 나타낸 것이다.
도 7A은 형질전환 메탄자화균으로부터 추출한 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 GC-MS를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7B은 GC-MS를 이용하여 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 정성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 M. trichosporium OB3b에 수행한 대사조작에 의한 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산경로를 간략히 도식화한 것이다.
도 3은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 PAWP894HB-abfT의 정보를 나타낸 것이다.
도 4는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 pAWP4HB-Msed의 정보를 나타낸 것이다.
도 5는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 pAWP894HB-BS101OP의 정보를 나타낸 것이다.
도 6는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 pAWP894HB-BS101OPI의 정보를 나타낸 것이다.
도 7A은 형질전환 메탄자화균으로부터 추출한 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 GC-MS를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7B은 GC-MS를 이용하여 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 정성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
본 발명자들은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위한 보다 환경 친화적이고 경제적인 방법으로, 메탄 등 바이오매스를 활용한 방법에 대해 예의 연구 노력한 결과, 본 발명의 형질전환 메탄자화균을 이용할 경우 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 생산이 가능함을 확인하였다. 메탄을 유일 탄소원으로 사용하는 메탄자화균을 통한 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 생산은 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명을 통해 최초로 개발되었다는 점에서 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다.
본 발명은 숙신산 세미알데히드 탈수소효소 유전자, NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소 유전자, 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소 유전자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자가 도입된, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균을 제공한다.
본 발명에서 용어 "숙신산 세미알데히드 탈수소효소(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase, sucD)"는 succinyl CoA를 succinyl semialdehyde로 전환시키는 효소를 의미한다.
상기 숙신산 세미알데히드 탈수소효소를 코딩하는 유전자(sucD)는 Porphyromonas gingivalis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 숙신산 세미알데히드 탈수소효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소 (NADPH-dependent succinate semialdehyde reductase, yqhD)"는 succinyl semialdehyde로부터 4-hydroxybutyrate를 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.
상기 NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소를 코딩하는 유전자(yqhD)는 E. coli 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 2의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소 (4-hydroxybutyrate-CoA transferase)"는 4-hydroxybutyrate를 4-hydroxybutyl-CoA 로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.
상기 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소를 코딩하는 유전자(BS101)는 Clostridium Kluyveri유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 3의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.
상기 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소를 코딩하는 유전자(abfT)는 Porphyromonas gingivalis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 4의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 4의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.
상기 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소를 코딩하는 유전자(Msed)는 Metallosphaera sedula 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 5의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "메탄자화균(metahnotroph)"은 메탄을 주요 탄소원 또는 에너지원으로 사용하는 세균을 의미한다. 상기 메탄자화균은 본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 숙주 균주를 의미할 수 있다. 또한, 메탄, 메탄올, 메틸아민 등 C1 탄소원을 에너지원으로 사용하는 메틸자화균(methylotroph) 중에서 메탄을 함께 사용할 수 있는 균주 또한 본 발명의 메탄화균에 포함될 수 있다.
상기 메탄자화균은 메탄 등 C1 탄소원을 에너지원으로 사용할 수 있는 것인한 특별히 이에 제한되지 않으나, 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium) 속 또는 메틸로시 너스 속(Methylosinus) 균주일 수 있으며, 바람직하게는 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium) OB3b일 수 있다.
또한, 상기 형질전환 메탄자화균은 NADP+-의존성 아이소시트르산 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 추가로 도입된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "NADP+-의존성 아이소시트르산 탈수소효소(NADP+- dependent isocitrate dehydrogenase, icd)"는 아이소시트르산을 알파케토글루타르산으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.
상기 NADP+-의존성 아이소시트르산 탈수소효소를 코딩하는 유전자(icd)는 Methylosinus trichosporium OB3b 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 6의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 6의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 NADP+-의존성 아이소시트르산 탈수소효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.
상기 언급한 각각의 효소 또는 단백질은 본 발명에서 사용되는 각각의 활성을 나타내는 한, 각 효소 또는 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위된 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 상기 각 효소 또는 단백질의 활성을 나타내는 한, 상기 각 효소 또는 단백질의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 것으로, 실질적으로 각 효소 또는 단백질과 동일하거나 상응하는 활성을 가지는 아미노산 서열의 경우도 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환 메탄자화균"은 상기 메탄자화균의 유전자를 도입하거나 또는 제거하여 형질을 전환시킨 균주를 의미한다. 또한, 상기 형질전환 메탄자화균은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산능이 없는 야생형에 비해 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산능이 향상된 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 형질전환 메탄자화균은 숙신산 세미알데히드 탈수소효소(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase, sucD), NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소(NADPH-dependent succinate semialdehyde reductase, yqhD) 및 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소 (4-hydroxybutyrate-CoA transferase)가 과발현된 것일 수 있다. 또한, NADP+-의존성 아이소시트르산 탈수소효소 (NADP+- dependent isocitrate dehydrogenase, icd) 내재적 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "강화"는 효소 또는 단백질의 활성이 야생형 또는 그 내재적 활성에 비해 증가되는 것을 의미한다. 상기 효소 또는 단백질의 활성 강화는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
이어서, 본 발명은 상기 형질전환 메탄자화균을 포함하는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 조성물을 제공한다.
도 1은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 화학식을 나타낸 것이다.
본 발명의 용어 “3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체”는 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHA) 중 하나로 3-하이드록시부티레이트와 4-하이드록시부티레이트가 결합된 생분해성 폴리에스테르를 의미한다. 유연한 물리적 및 기계적 특성으로 인해 최고의 폴리하이드록시알카노에이트 중 하나로 평가되고 있으며 포장 필름, 가스 필터, 약물 운반체 및 세포 배양 스캐폴드(cells culture scaffolds)로 사용될 수 있다.
도 2는 본 발명의 형질전환 메탄자화균의 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 생산과정을 나타낸 모식도이다.
도 2를 참조하여 설명하자면, 본 발명의 형질전환 메탄자화균은 메탄을 탄소원으로 사용하여, 숙시닐-CoA(succinyl-CoA, SUC-CoA)를 출발물질로 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 4-하이드록시부틸-CoA(4-hydroxybutyl-CoA)를 거쳐 최종적으로 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 조성물을 포함하는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 키트를 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 형질전환 메탄자화균을 메탄을 포함하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 목적하는 세포 또는 조직 등을 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육하는 것을 의미한다. 상기 환경 조건은 대표적으로 영양소, 온도, 삼투압, pH, 기체 조성, 빛 등이 있으나, 직접적인 영향을 주는 것은 배지이며, 배지는 크게 액체배지와 고체배지로 나뉠 수 있다. 본 발명의 형질전환 메탄자화균의 배양은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 배양은 상기 형질전환 메탄자화균으로부터 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 메탄자화균의 배양에 사용되는 것으로 알려진 NMS(nitrate mineral salts) 배지를 사용할 수 있고, 메탄자화균에 따라 상기 배지에 포함된 성분 또는 이의 함량을 적절히 조절한 배지를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 형질전환 메탄자화균의 배양 온도는 15℃ 내지 45℃, 구체적으로 20℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 25℃내지 35℃일 수 있으며, 메탄과 균주의 원활한 접촉을 위해, 150rpm 내지 300rpm, 구체적으로 180rpm 내지 270rpm, 보다 구체적으로 200rpm 내지 250rpm으로 교반할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 생산방법은 상기 형질전환 메탄자화균을 C1 탄소원을 포함하는 배양액에 배양하는 것일 수 있다.
또한, 상기 배양이 종료된 후 질소원이 제거된 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 생산방법은 배양액으로부터 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별 용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 HPLC, 이온교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 야생형 M. trichosporium OB3b 및 형질전환 메탄자화균을 이용한 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 생산을 위한 세포 배양 및 회수
M. trichosporium OB3b (NCIMB 11131)은 5μM의 CuSO4를 포함한 NMS(nitrate mineral salt)배지에서 배양 하였다. M. trichosporium OB3b 세포를 50ml의 NMS 배지가 들어있고 스크류 캡으로 밀봉된 500ml 배플 플라스크(baffled flask)에서 30℃, 및 230 rpm으로 교반하며 배양하였다. 기밀식 주사기(gas-tight syringe)를 사용한 가스 교환에 의해 최종 농도 30%(v/v) 메탄을 공급하였으며, 헤드 스페이스를 매일 새것으로 교환하였다. 4일간 동일한 조건으로 배양 후, 질산염(nitrate)이 제거된 새로운 NMS 배지로 세포를 옮겨 3일간 추가로 배양하였다. 세포 배양의 광학 밀도는 1cm 경로 길이의 1.5 ml 큐벳을 사용하여 Beckman 분광 광도계에서 측정하였다. 50μg/ml의 최종 농도를 갖는 카나마이신(Km)을 재조합 플라스미드를 함유하는 M. trichosporium OB3b 및 대장균 모두의 선별하는 데에 사용하였다. 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산을 위하여 4 일간은 위와 동일한 조건으로 배양 후, 5일째부터 질산염(nitrate)이 제거된 새로운 NMS 배지로 세포를 옮겨 3일간 추가로 배양하였다.
<실시예 2> 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 분석
야생형 및 형질전환 메탄자화균을 10,000 g에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 수확한 후, 증류수로 1회 세척하고 동결건조기를 이용하여 세포를 건조시켰다. 건조된 세포중량 100mg을 methanolysis를 수행한 후, 가스크로마토그래피-질량 분석기 (GC-MSD, Agilent 7890B GC-5977B MSD, Korea Pty Ltd.)을 통해 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 함량 및 조성을 분석하였다. GC-MSD 분석 시 HP-5MS 케피러리 컬럼이 장착되고 불꽃 이온화 검출기 (FID)를 이용하였다. 분할 비는 1/50이었고 이동상으로 헬륨을 사용하였고 주입구, 검출기 온도는 각각 250℃, 275℃로 설정하였다. 오븐 온도는 초기 온도 50℃(2분간 유지), 이어서 20 ℃/분의 속도로 110℃까지 승온한 다음, 20 ℃/분의 속도로 250 ℃까지 추가 승온시켰다. 각 샘플에서 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 양은 동결 건조된 세포의 건조 중량 대비 백분율로 표시하였다.
<실시예 3> 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생합성 경로 구축을 위한 벡터시스템 구축
본 발명의 프라이머는 Primer 3 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며 Macrogen(서울,한국)에서 합성되었다(표 1 참조). Porphyromonas gingivalis, Clostridium Kluyveri, Metallosphaera sedula, E.coli 및 M. trichosporium OB3b의 gDNA는 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 사용하여 분리하였으며, 모든 플라스미드는 Gibson 어셈블리를 사용하여 제작되었다. 프라이머 pAWP89-Tac-For / pAWP89-Tac-Rev (Puri et al., 2013)를 사용하여 선형 벡터 pAWP89를 제조하기 위해 역 PCR을 수행하였다.
| 프라이머 | 서열 |
| YqhD-For | cgccaccgcggtggagctAGCTTAAGGATAAAGAAGGAGGTAAAACATGAACAACTTTAATCTGCA |
| YqhD-Rev | atagggcgaattggagctTTAGCGGGCGGCTTCGTATA |
| sucD-For | ggaacaaaagctgggtacATGGAAATCAAAGAAATGGT |
| sucD- Rev | cgagggggggcccggtacTTAGAGTTCCCAGATTTCTT |
| abfT -For | ttcacacaggaaacagctATGAAAGACGTATTAGCGGA |
| abfT -Rev | gcatcttcccgacaactaTTATCCGAAACGTTTGCGGA |
| abfT -Invert-For | tcctgcagcccggggTTGACAATTAATCATCGGCT |
| abfT -Invert-Rev | gccgctctagaactagtgTTATCCGAAACGTTTGCGGA |
| BS101OP -For | ttcacacaggaaacagctATGGAATGGGAGGAGATCTA |
| BS101OP -Rev | gcatcttcccgacaactaTCAGAAGCGCTTCTTGAACT |
| BS101OP -Invert-For | aattcctgcagcccggggTTCACACAGGAAACAGCTAT |
| BS101OP -Invert-Rev | gccgctctagaactagtgTCAGAAGCGCTTCTTGAACT |
| Msed -For | ttcacacaggaaacagctATGACGGTTCTACAGGAATA |
| Msed -Rev | gcatcttcccgacaactaTCACTTCTTTCTCTGGTCCA |
| Msed -Invert-For | aattcctgcagcccggggTTGACAATTAATCATCGGCT |
| Msed -Invert-Rev | gccgctctagaactagtgTCACTTCTTTCTCTGGTCCA |
| icd-Invert-For | ttcacacaggaaacagctATGAGCAAGATCAAGGT |
| icd-Invert-Rev | gcatcttcccgacaactaCTAGACACGTCCGGCCA |
| Picd-EcoRV-For | acggtatcgataagcttgatTTGACAATTAATCATCGGCT |
| Picd-EcoRV-Rev | gggctgcaggaattcgatCTAGACACGTCCGGCCAGCG |
도 3 내지 도 6은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산하기 위하여 제작된 플라스미드의 정보를 나타낸 것이다(표 2 참조).
| 플라스미드 | 특징 | 문헌 |
| pAWP4HB-SY | pAWP89-lacZ containing sucD: CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase from Porphyromonas gingivalis, yqhD: NADPH-dependent succinate semialdehyde reductase from E. coli | 선행문헌 |
| PAWP894HB-abfT | pAWP4HB-SY containing 4hb-coA: 4-hydroxybutyrayl coA transferase (abfT) from Porphyromonas gingivalis driven by Ptac promoter | This study |
| pAWP4HB-Msed | pAWP4HB-SY containing 4HB-coA synthetase from Metallosphaera sedula(Msed) strain driven by Ptac promoter | This study |
| pAWP894HB-BS101OP | pAWP4HB-SY containing codon optimizied 4HB-coA transferase (BS101OP) from Clostridium kluyveri strain driven by Ptac promoter | This study |
| pAWP894HB-BS101OPI | pAWP4HB-SY containing codon optimizied 4HB-coA transferase (BS101OP) from Clostridium kluyveri and overexpression of icd gene from Methylosinus trichosporium OB3b strain driven by Ptac promoter | This study |
<실시예 4> 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생합성 경로 구축을 위한 벡터시스템의
M. trichosporium
OB3b로의 형질전환
상기 실시예 3을 통하여 얻어진 재조합 발현용 벡터를 야생형 메탄자화균 M. trichosporium OB3b에 형질전환시키기 위하여, 컨주게이션(conjugation)을 실시하였다. OD 600에서 약 0.2까지 자란 M.trichosporium OB3b를 사용하였다 M. trichosporium OB3b 50ml 및 도입될 플라스미드를 포함하는 공여자 E. coli S17-1 10ml를 NMS로 세척하였다. 이후, 이들을 0.2 μm 멸균 니트로셀룰로스 필터에 혼합된 세포를 도포하였다. 필터를 0.02% (w/v) 프로테오스-펩톤(proteose-peptone)을 포함한 NMS 한천 배지에 놓고, 메탄(대기 중 50 %)의 존재 하에 30℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 0.02% (w/v) 프로테오스-펩톤(proteose-peptone)을 포함한 NMS 한천 플레이트로부터의 세포를 10mL NMS 배지에 재현탁시키고, 7000g에서 5분동안 원심분리하여 농축시켰다. 세포 펠렛은 카나마이신이 포함된 NMS 한천에 도말하고 단일한 콜로니가 나타날 때까지 메탄/공기(1:1, v/v)와 함께 2-3 주 동안 배양하였다.
형질전환 메탄자화균을 선별하기 위하여, 16s DNA 분석법을 통하여 M. trichosporium OB3b임을 확인하고 실시예 2에서 사용한 프라이머(표 1 참조)를 이용하여 각각의 유전자가 삽입되었는지 확인하였다. 이를 통해 얻은 형질전환 메탄자화균은 표 3에 나타내었다.
| 균주 | 특징 |
| Methylosinus trichosporium OB3b | An obligate aerobic methane-oxidizing alphaproteobacterium, used as host strain |
| OB3b/4HB_PG | M. trichosporium OB3b harboring PAWP894HB-abfT |
| OB3b/4HB_Ms | M. trichosporium OB3b harboring pAWP4HB-Msed |
| OB3b/BS101OP | M. trichosporium OB3b harboring pAWP894HB-BS101OP |
| OB3b/BS101OPI | M. trichosporium OB3b harboring pAWP894HB-BS101OPI |
<실시예 5> 야생형 균주
M. trichosporium
OB3b와 형질전환 메탄자화균을 이용한 메탄기질로부터 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산, 추출 및 정량
야생형 균주 M. trichosporium OB3b와 실시예 3 및 4에서 제작한 형질전환 메탄자화균(OB3b/4HB_PG, OB3b/4HB_Ms, OB3b/BS101OP, OB3b/BS101OPI)을 실시예 1과 동일하게 4일간 NMS(nitrate mineral salt)배지(1 g/L MgSO4·7H2O, 1 g/L KNO3, 0.2 g/L CaCl2·H2O, 0.0038 g/L Fe-EDTA 및 0.0005 g/L NaMo·4H2O)에서 메탄을 포함하는 대기조건 및 30℃의 온도조건에서 230 rpm으로 배양한 후, 5일째부터 질소원이 제거된 새로운 NMS(nitrate mineral salt)배지로 옮겨 3일간 추가 배양하였다. 수확한 세포는 실시예 2의 방법으로 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 분석 및 정량하였다.
도 7A은 형질전환 메탄자화균으로부터 추출한 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 GC-MS를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 7B은 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 정성 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 형질전환 메탄자화균은 폴리-3-하이드록시부티레이트(poly(3-hydroxybutyrate), PHB)와 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutrate, 4HB)를 생성했음을 알 수 있다.
| Strain | Subtrate | DCW (mg) |
PHA content (Wt% of DCW) |
3HB (Wt %) |
4HB (Wt %) |
3HB (mol %) |
4HB (mol %) |
| WT, OB3b | CH4 | 70 | 14.09 | 14.09 | 0 | 100 | 0 |
| OB3b/BS101OP | CH4 | 70 | 7.309 | 7.16 | 0.149 | 97.97 | 2.03 |
| OB3b/BS101OPI | CH4 | 57 | 7.006 | 6.79 | 0.216 | 96.92 | 3.08 |
WT, OB3b: 야생형 균주 M. trichosporium OB3b
3HB: 3-하이드록시부티레이트
4HB: 4-하이드록시부티레이트
PHA: 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체
게다가, 표 4에 나타난 바와 같이, 야생형 균주에서는 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체가 생성되지 않았고, 숙신산 세미알데히드 탈수소효소(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase, sucD), NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소(NADPH-dependent succinate semialdehyde reductase, yqhD) 및 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소 (4-hydroxybutyrate-CoA transferase)가 과발현된 재조합 균주 OB3b/BS101OP는 세포 중량 대비 7.3 %의 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체가 생산되었으며, 이 중 4-하이드록시부티레이트의 함량은 2.03 mol %였다. 또한, OB3b/SYO 균주에 NADP+-의존성 아이소시트르산 탈수소효소를 추가로 발현시킨 재조합 균주 OB3b/BS101OPI의 경우, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체의 비율은 7.0 wt%로 약간 감소하였으나, 4-하이드록시부티레이트 함량은 3.08%로 1.5배 증가하였다.
이러한 결과는 실시예 4의 형질전환 메탄자화균은 4-하이드록시부티레이트를 자체 생산하여 4-하이드록시부티레이트의 공급 없이 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체를 생산할 수 있다는 것을 의미한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University
<120> Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from
methane by metabolic engineered methanotrophs
<130> GKH20P-0035-KR
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sucD
<400> 1
atggaaatca aagaaatggt gagccttgcg cgcaaggctc agaaggagta tcaagctacc 60
cataaccaag aagcagttga caacatttgc cgagctgcag caaaagttat ttatgaaaat 120
gcagctattc tggctcgcga agcagtagac gaaaccggca tgggcgttta cgaacacaaa 180
gtggccaaga atcaaggcaa atccaaaggt gtttggtaca acctccacaa taaaaaatcg 240
gttggtatcc tcaatataga cgagcgtacc ggtatgatcg agatcgcaaa gcctatcgga 300
gttgtaggag ccgtaacgcc gacgaccaac ccgatcgtta ctccgatgag caatatcatc 360
tttgctctta agacttgcaa tgccatcatt attgcccccc accccagatc taaaaaatgc 420
tctgcacacg cagttcgtct gatcaaagaa gctatcgctc cgttcaacgt accggaaggt 480
atggttcaga tcatcgaaga acccagcatc gagaagacgc aggaactcat gggcgccgta 540
gacgtagtag ttgctacggg tggtatgggc atggtgaagt ctgcatattc ttcaggaaag 600
ccttctttcg gtgttggagc cggtaacgtt caggtgatcg tggatagcaa catcgatttc 660
gaagctgctg cagaaaaaat catcaccggt cgtgctttcg acaacggtat catctgctca 720
ggcgaacaga gcatcatcta caacgaggct gacaaggaag cagttttcac agcattccgc 780
aaccacggtg catatttctg tgacgaagcc gaaggagatc gtgctcgtgc agctatcttc 840
gaaaatggag ccatcgcgaa agatgtagta ggtcagagcg ttgccttcat tgccaagaaa 900
gcaaacatca atatccccga gggtacccgt attctcgttg ttgaagctcg cggcgtagga 960
gcagaagacg ttatctgtaa ggaaaagatg tgtcccgtaa tgtgcgccct cagctacaag 1020
cacttcgaag aaggtgtaga aatcgcacgt acgaacctcg ccaacgaagg taacggccac 1080
acttgtgcta tccactccaa caatcaggca cacatcatcc tcgcaggatc agagctgacg 1140
gtatctcgta tcgtagtgaa tgctccgagt gccactacag caggcggtca catccaaaac 1200
ggccttgccg taaccaatac gctcggatgc ggatcatggg gtaataactc tatctccgag 1260
aacttcactt acaagcacct cctcaacatt tcacgcatcg caccgttgaa ttcaagcatt 1320
cacatccccg atgacaaaga aatctgggaa ctctaa 1356
<210> 2
<211> 1164
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yqhD
<400> 2
atgaacaact ttaatctgca cactccgacc cgtattctct ttggtaaggg cgctatagca 60
ggtcttcgcg agcagatccc tcacgacgcc agggttctga taacctacgg tggtggttca 120
gtaaagaaga ccggtgttct cgaccaagtt cttgacgctc ttaaggggat ggacgtgctt 180
gaattcggcg gcatagagcc gaaccctgct tacgagactc taatgaacgc cgttaaactt 240
gttcgagaac agaaagtcac cttcctgctg gccgttggag gaggatcagt actagatggt 300
acgaaattca tcgccgcagc agcaaattac cctgagaaca tcgacccttg gcacatacta 360
cagactgggg gtaaagaaat caaatctgct ataccaatgg gatgtgtttt gactctgcct 420
gctactggaa gtgagtcgaa tgcgggcgcg gttatcagta gaaagacaac cggtgacaaa 480
caggcattcc acagtgccca tgtacaaccc gttttcgccg tactggaccc tgtgtacacc 540
tatacgctcc cccctcgcca agttgctaat ggagtagtcg acgcttttgt ccataccgtg 600
gaacaatatg taacgaagcc agtggatgct aaaattcagg accgatttgc tgagggaatt 660
ctattgacac ttattgagga tggtccgaag gctctgaaag aaccagaaaa ctatgacgta 720
cgcgcaaacg ttatgtgggc cgctacccag gcgctaaacg gccttatcgg ggcgggagtc 780
ccacaagatt gggctaccca catgctgggg cacgaactca cggccatgca cggactcgat 840
catgcccaaa cccttgccat cgtcctacca gctctttgga atgagaaacg cgatacgaaa 900
agggccaaac tgcttcaata tgcggagcgt gtctggaaca tcacggaggg cagtgatgat 960
gaaagaatag atgccgcgat tgccgcaacg agaaactttt tcgaacaact tggtgtaccg 1020
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BS101
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> abfT
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Claims (12)
- 숙신산 세미알데히드 탈수소효소를 코딩하는 유전자, NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소를 코딩하는 유전자 및 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소를 코딩하는 유전자가 도입된, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균.
- 제1항에 있어서, 상기 숙신산 세미알데히드 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균.
- 제1항에 있어서, 상기 NADPH-의존성 숙신산 세미알데히드 환원 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균.
- 제1항에 있어서, 상기 4-하이드록시부티레이트 CoA 전이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균.
- 제1항에 있어서, 상기 메탄자화균은 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium), 메틸로마이크로븀 속(Methylomicrobium) 또는 메틸로시너스 속(Methylosinus) 균주인, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균.
- 제5항에 있어서, 상기 메틸로시너스 속(Methylosinus) 균주는 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium) OB3b인, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균.
- 제1항에 있어서, 상기 형질전환 메탄자화균은 NADP+-의존성 아이소시트르산 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 추가로 도입된, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균.
- 제7항에 있어서, 상기 NADP+-의존성 아이소시트르산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 형질전환 메탄자화균.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형질전환 메탄자화균을 포함하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 조성물.
- 제9항의 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 조성물을 포함하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산용 키트.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형질전환 메탄자화균을 C1 탄소원을 포함하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산방법.
- 제11항에 있어서, 상기 배양이 종료된 후 질소원이 제거된 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 3-하이드록시부티레이트-4-하이드록시부티레이트 공중합체 생산방법.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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Citations (4)
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-
2020
- 2020-03-11 KR KR1020200030270A patent/KR102339122B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102339122B1 (ko) | 2021-12-14 |
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