KR20210045752A

KR20210045752A - 1,3-부탄다이올 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210045752A
Application number: KR1020190129161A
Authority: KR
Inventors: 이은열; 이옥경; 티 트 응우옌
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-04-27

Abstract

본 발명은 1,3-부탄다이올 생성능을 가지는 형질전환 메탄자화균 및 이를 이용한 1,3-부탄다이올의 생산 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 형질전환 메탄자화균은 메탄으로부터 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있으므로 친환경적이고 경제적으로 1,3-부탄다이올을 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

1,3-부탄다이올 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도{Transformed methanotrophs for producing 1,3-butanediol and uses thereof}

본 발명은 1,3-부탄다이올 생성능을 가지는 형질전환 메탄자화균 및 이를 이용한 1,3-부탄다이올의 생산 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 부티르알데히드 탈수소효소(Butyraldehyde dehydrogenase), 알코올/알데하이드 탈수소효소(alcohol/aldehyde dehydrogenase) 및 NAD(P)H 의존 아세토아세틸-CoA 환원 효소(NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase)의 활성이 강화된; PHA 합성 효소(PHA synthases)의 활성이 감소 또는 불활성화된 1,3-부탄다이올을 생산하는 형질전환 메탄자화균에 관한 것이다.

메탄은 천연가스와 셰일가스의 주성분으로 바이오매스의 혐기소화 과정에서 발생하거나 매립지가스에서 주로 발생하며 매년 국내에서 200만톤, 세계적으로는 1,500억톤이 발생되고 있다. 또한, 메탄은 온실효과를 일으키는 주요 물질로 CO₂보다 온실가스 효과가 21배 정도 높은 원인 물질로 알려져 있다. 이러한 메탄은 메탄자화균을 이용하여 생물학적 전환을 통해 다양한 고부가가치산물을 생산할 수 있다.

메탄자화균(methanotroph)은 메탄을 유일 탄소원으로 사용하여 생장하는 미생물이며 type II 메탄자화균은 serine cycle, ethylmalonyl-CoA (EMC), TCA 등과 같은 다양한 물질대사과정을 통해 메탄을 다른 물질로 전환할 수 있다. type II 메탄자화균의 EMC 경로는 poly-hydroxybutyrate (PHB)의 전구물질인 3-hydroxybutyryl CoA를 생산할 수 있으며 type II 메탄자화균의 유전체 상에 PHB synthase가 존재하는 것으로 알려져 있어 메탄으로부터 PHB 합성이 가능하며, 세포 무게의 30-40%에 해당하는 PHB를 합성한다는 연구가 보고된 바 있다.

본 발명에서는 PHB 합성을 위한 flux를 조절하여 1,3-부탄다이올을 생산하고자 한다. 라세믹 1,3-부탄다이올은 주로 4-hydroxy-2-butanone (4H₂B)와 같은 석유계 기반의 화학물질로부터 여러 단계의 화학 반응을 통해 합성되는 비천연 (non-natural) 알코올이다. 1,3-부탄다이올 합성 경로가 도입된 형질 전환 균주를 이용한 1,3-부탄다이올의 바이오 전환은 특정 이성질체를 선택적으로 생산할 수 있으며, 그중 (R)-1,3-부탄다이올은 광학 활성 알코올로, 페로몬, 향료, 살충제를 포함한 산업용 화학 물질 생산을 위한 빌딩 블록 및 주요 키랄 중간체로 사용되고 있다.

현재까지 보고된 미생물을 이용한 1,3-부탄다이올 생산 기술은 탄소원으로 포도당을 활용하였으나 본 발명에서는 메탄을 유일 탄소원으로 활용하여 1,3-부탄다이올을 생산함으로써 생산 공정 단가 절감에 기여하고자 하였다.

대한민국 공개특허 KR10-2019-0112044

본 발명의 하나의 목적은 부티르알데히드 탈수소효소(Butyraldehyde dehydrogenase), 알코올/알데하이드 탈수소효소(alcohol/aldehyde dehydrogenase) 및 NAD(P)H 의존 아세토아세틸-CoA 환원 효소(NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase)에 활성을 가지고; PHA 합성 효소(PHA synthases)의 활성이 감소 또는 불활성화 되는 1,3-부탄다이올을 생산하는 형질전환 메탄자화균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 메탄자화균을 이용한 메탄기질로부터 1,3-부탄다이올의 제조방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 butyraldehyde dehydrogenase(Bld)와 alcohol/aldehyde dehydrogenase(adh), NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase(PhaB) 효소의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되고, PHA synthases (PhaC)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 불활성화된 1,3-부탄다이올 생산용 형질전환 메탄자화균을 제공한다.

또한, 발명자들은 1,3-부탄다이올을 생산하기 위한 보다 환경 친화적이고 경제적인 방법으로, 메탄 등 바이오매스를 활용한 방법에 대해 예의 연구 노력한 결과, 놀랍게도 본 발명의 형질전환 메탄자화균을 이용할 경우 1,3-부탄다이올의 생산이 가능함을 확인하였다. 메탄을 유일 탄소원으로 사용하는 메탄자화균을 통한 1,3-부탄다이올의 생산은 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명을 통해 최초로 개발되었다는 점에서 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다.

본 발명에서 용어 "1,3-부탄다이올" 은 비천연 광학 활성 알코올로, 페로몬, 향료, 살충제를 포함한 산업용 화학 물질 생산을 위한 빌딩 블록 및 주요 키랄 중간체로 사용되고 있다.

본 발명에서 용어 "메탄자화균(metahnotroph)"은 메탄을 주요 탄소원 또는 에너지원으로 사용하는 세균을 의미한다. 상기 메탄자화균은 본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 숙주 균주를 의미할 수 있으며, 본 발명의 목적상 메탄을 탄소원으로 사용하여, 아세틸 CoA을 출발물질로 acetoacetyl-CoA, 3-hydroxybutyryl CoA, 3-hydroxybutyraldehyde를 거쳐 최종적으로 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는한 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한, 메탄, 메탄올, 메틸아민 등 C1 화합물을 에너지원으로 사용하는 메틸자화균(methylotroph) 중에서 메탄을 함께 사용할 수 있는 균주 또한 본 발명의 메탄화균에 포함될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

상기 메탄자화균은 메탄 등 C1 화합물을 에너지원으로 사용할 수 있는 것인한 특별히 이에 제한되지 않으나, 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium) 속 또는 메틸로시 너스 속(Methylosinus) 균주일 수 있으며, 구체적으로 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium) OB3b일 수 있다.

이러한 메탄자화균을 이용한 바이오전환 공정의 경우, 비교적 저렴한 메탄을 탄소원으로 사용할 수 있어 경제적으로 유리하며, 대기 중의 메탄을 사용 가능하다는 점에서 온실가스의 방출 예방 등 환경적인 면에서도 장점이 있다. 또한, 기존에 포도당(glucose)을 이용한 공정 대비 산소의 손실이 없어 최종 생산 물질의 수율 또한 높다.

본 발명에서 용어 "형질전환 메탄자화균"은 상기 메탄자화균의 유전자를 도입하거나 또는 제거하여 형질을 전환시킨 균주를 의미한다.

구체적으로, 본 발명의 형질전환 메탄자화균은 butyraldehyde dehydrogenase(Bld)와 alcohol/aldehyde dehydrogenase(adh), NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase(PhaB) 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본명에 있어서, 상기 형질전환 메탄자화균은 1,3-부탄다이올 생산능이 없는 야생형에 비해 1,3-부탄다이올생산능이 현저히 향상된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "부티르알데히드 탈수소효소(Butyraldehyde dehydrogenase)"는 3-hydroxybutyryl CoA를 3-hydroxybutyraldehyde로 전환을 촉매하는 효소를 의미한다.

상기 부티르알데히드 탈수소효소(Butyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(Bld)는 Clostridium saccharoperbutylacetonicum 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 butyraldehyde dehydrogenase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "알코올/알데하이드 탈수소효소(alcohol/aldehyde dehydrogenase)"는 3-hydroxybutyraldehyde를 1,3-부탄다이올로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

상기 알코올/알데하이드 탈수소효소(alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)는 Clostridium acetobutylicum 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 2의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 alcohol/aldehyde dehydrogenase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "아세토아세틸-CoA 환원 효소(acetoacetyl-CoA reductase)"는 acetoacetyl-CoA를 3-hydroxybutyryl CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

상기 "아세토아세틸-CoA 환원 효소(acetoacetyl-CoA reductase)"를 코딩하는 유전자(PhaB)는 Rastonia Eutropha 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기서열번호 3의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 acetoacetyl-CoA reductase 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "PHA 합성 효소(PHA synthases)"는 3-hydroxybutyryl CoA를 polyhydroxybutylate(PHB)로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

상기 PHA 합성 효소(PHA synthases)를 코딩하는 유전자(PhaC)는 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium) OB3b 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 4의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기서열번호 4의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 PHA synthases 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, Clostridium saccharoperbutylacetonicum 유래의 Bld와 Clostridium acetobutylicum 유래의 adh 유전자를 type II 메탄자화균 Methylosinus trichosporium OB3b 내에서 과발현시킨 결과, 약 5mg/L의 1,3-부탄다이올 이 생산됨을 확인하였으며, 추가로 3-hydroxybutyryl CoA의 세포 내 농도를 향상시키기 위해 Rastonia eutropha 유래 PhaB 유전자를 과발현시킨 형질전환 균주에서 각각 약 8mg/L의 1,3-부탄다이올이 생산됨을 확인하였다. 또한, Methylosinus trichosporium OB3b의 유전체 상의 PhaC를 약화 또는 불활성화시키고 그 위치에 Bld와 adh 유전자를 과발현시킨 결과, 약 40mg/L의 1,3-부탄다이올이 생산됨을 확인하였다.

전술한 각각의 효소 또는 단백질은 본 발명에서 사용되는 각각의 활성을 나타내는한, 각 효소 또는 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위된 아미노산 서열을포함할수 있는데, 상기 각 효소 또는 단백질의 활성을 나타내는 한, 상기 각 효소또는 단백질의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다구체적으로는 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 것으로, 실질적으로 각 효소 또는 단백질과 동일하거나 상응하는 활성을 가지는 아미노산 서열의 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 용어 "약화 또는 불활성화"는 효소 또는 단백질의 활성이 야생형 또는 그 내재적 활성에 비해 감소 또는 전혀 발현이 되지 않거나, 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 상기 효소 또는 단백질의 활성 약화또는 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 해당 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실, 상기 뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체상의 상기 뉴클레오티드 서열의 변형, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에서 용어 "강화"는 효소 또는 단백질의 활성이 야생형 또는그 내재적 활성에 비해 증가되는 것을 의미한다. 상기 효소 또는 단백질의 활성 강화는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 1,3-부탄다이올 생산용 형질전환 메탄자화균을 배양하는 단계를 포함하는, 1,3-부탄다이올 제조방법을 제공하는 것이다. 상기 butyraldehyde dehydrogenase(Bld)와 alcohol/aldehyde dehydrogenase(adh), NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase(PhaB) 강화, PHA synthase(PhaC) 약화 또는 불활성화된, 형질전환 메탄자화균 및 이를 이용한 1,3-부탄다이올 생산을 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "배양"은 목적하는 세포 또는 조직 등을 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육하는 것을 의미한다. 상기 환경 조건은 대표적으로 영양소,온도, 삼투압, pH, 기체 조성, 빛 등이 있으나, 직접적인 영향을 주는 것은 배지이며, 배지는 크게 액체배지와 고체배지로 나뉠 수 있다. 본 발명의 형질전환 메탄자화균의 배양은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

구체적으로, 상기 배양은 상기 형질전환 메탄자화균으로부터 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 유가 배양 또는 주입배치 또는 반복 유가 배양 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 메탄자화균의 배양에 사용되는것으로 알려진 NMS(nitrate mineral salts) 배지를 사용할 수 있고, 메탄자화균에 따라 상기 배지에 포함된 성분 또는 이의 함량을 적절히 조절한 배지를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 형질전환 메탄자화균의 배양 온도는 15℃ 내지 45℃, 구체적으로 20℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 25℃내지 35℃일 수 있으며, 메탄과 균주의 원활한 접촉을 위해, 150rpm 내지 300rpm,구체적으로 180rpm 내지 270rpm, 보다 구체적으로 200rpm 내지 250rpm으로 교반할수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 1,3-부탄다이올의 제조방법은 상기 형질전환 메탄자화균을 C1 탄소원을 포함하는 배양액에 배양하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 배양액으로부터 1,3-부탄다이올을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 1,3-부탄다이올을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 1,3-부탄다이올 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별 용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 HPLC, 이온교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법이 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1,3-부탄다이올 생산용 형질전환 메탄자화균을 포함하는 1,3-부탄다이올 생산용 조성물을 제공한다.

상기 butyraldehyde dehydrogenase(Bld)와 alcohol/aldehyde dehydrogenase(adh), NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase(PhaB) 강화, PHA synthase(PhaC) 약화 또는 불활성화된 1,3-부탄다이올을 생산하는 형질전환 메탄자화균은 전술한 바와 같다.

본 발명의 형질전환 메탄자화균은 메탄으로부터 1,3-부탄다이올을 생산할 수 있으므로 친환경적이고 경제적으로 1,3-부탄다이올을 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1의 a은 M. trichosporium OB3b에서 1,3-부탄다이올을 생산하기 위한 대사공학 경로를 간략히 도식화한 것이다.
도 1의 b은 M. trichosporium OB3b에서 1,3-부탄다이올을 생산하기 위하여 제작된 플라스미드 정보를 제공한다.
도 2의 a는 M. trichosporium OB3b 야생형 및 형질전환 메탄자화균(OB3b-AB, OB3b-APB)의 성장을 OD600 값으로 나타낸 것이다.
도 2의 b는 M. trichosporium OB3b 야생형 및 형질전환 메탄자화균(OB3b-AB, OB3b-APB) 균주의 성장 6일째 1,3-부탄다이올의 생산량을 나타낸 것이다.
도 3은 M. trichosporium OB3b 야생형, 형질전환 메탄자화균 OB3b-AB, OB3b-APB 및 OB3b-AB-ΔC 균주의 6일째 1,3-부탄다이올의 생산량을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명은 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 형질전환 메탄자화균을 이용한 1,3-부탄다이올의 생산성을 위한 세포 배양 및 회수

M. trichosporium OB3b(NCIMB 11131)은 이전 연구(Hwang et al., 2015)에서 기술된 바와 같이, 5μM의 CuSO₄를 포함한 NMS(nitrate mineral salt) 배지에서 배양하였다. M. trichosporium OB3b 세포를 50ml의 NMS 배지가 들어있고 스크류 캡으로 밀봉된 500ml 배플 플라스크(baffled flask)에서 30℃로 230 rpm으로 교반하며 배양하였다. 기밀식 주사기(gas-tight syringe)를 사용한 가스 교환에 의해 최종 농도 30%(v/v) 메탄을 공급하였으며, 헤드 스페이스를 매일 새것으로 교환하였다. 세포 배양의 광학 밀도는 1cm 경로 길이의 1.5ml 큐벳을 사용하여 Beckman 분광 광도계에서 측정하였다. 50μg/ml의 최종 농도를 갖는 카나마이신(Km)을 재조합 플라스미드를 함유하는 M. trichosporium OB3b 및 대장균 모두의 선별하는 데에 사용하였다.

<실시예 2> 1,3-부탄다이올의 분석

500mL 플라스크 배양물의 배양 배지로부터 상층액을 수득하였다. 1,3-부탄다이올의 양은 RI 검출기 및 Aminex HPX-87H 유기산 컬럼(300mm Х 7.8mm; Bio-Rad)을 갖는 HPLC(Jasco Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. 황산(0.005M)을 60℃에서 유속 0.7mL/분으로 이동상으로 사용하였다. 모든 용액은 사용하기 전 0.2μm 멤브레인을 통해 여과하였다.

<실시예 3> 1,3-부탄다이올 생합성 경로 구축을 위한 벡터시스템 구축

본 발명의 프라이머는 Primer 3 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며 Macrogen (서울,한국)에서 합성되었다[표 1]. Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium acetobutylicum, Rastonia eutropha 및 M. trichosporium OB3b의 gDNA는 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 사용하여 분리하였으며, 모든 플라스미드는 Gibson 어셈블리를 사용하여 제작하였다. 프라이머 pAWP89-Tac-For/pAWP89-Tac-Rev (Puri et al., 2013)에 의해 선형 벡터 pAWP89를 제조하기 위해 역 PCR을 사용하였다. 1,3-부탄다이올 생산을 위한 유전자를 증폭를 증폭하기 위하여 Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium acetobutylicum 의 gDNA를 분리하고 프라이머 5, 6을 이용하여 butyraldehyde dehydrogenase(Bld)를 증폭하고 프라이머 7, 8을 이용하여 alcohol/aldehyde dehydrogenase(adhE)를 증폭하여 Gibson 어셈블리를 사용하여 pAWP89-AB 벡터를 얻었음. 프라이머 9 및 10을 이용하여 Rastonia eutropha 유래 NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase (PhaB) 클로닝하여 pAWP89-AB 플라스미드에 도입함으로써 pAWP89-ABP 벡터로 구축하였다. M. trichosporium OB3b의 phaC 유전자의 결실시키기 위하여 phaC 유전자의 upstream을 클로닝하기 위하여 프라이머 11 및 12, phaC 유전자의 downstream을 클로닝하기 위하여 프라이머 13 및 14를 사용하여 pCM351_△phaC 벡터를 구축한 후 프라이머 15 및 16을 사용하여 pAWP89-AB 벡터의 butyraldehyde dehydrogenase(Bld) 및 alcohol/aldehyde dehydrogenase(adhE) 클로닝하여 phaC 유전자의 upstream 바로 뒤에 삽입하여 재조합 pCM351-AB-△C 벡터를 얻었다.

프라이머 이름	서열번호	서열	효소	벡터
Adh-For	5	ggaacaaaagctgggtacATGAAAGTTACAAATCAAAAAGAACT	KpnI	pAWP89-lacZ
Adh-Rev	6	cgagggggggcccggtacTTAAAATGATTTTATATAGATATCCT	KpnI	pAWP89-lacZ
PhaB-For	7	aattcctgcagcccggggAGGAAACAGCTATGACTCAGCGCATTGCGTA	BamHI	pAWP89-lacZ
PhaB-Rev	8	gccgctctagaactagtgTCAGCCCATATGCAGGCC	BamHI	pAWP89-lacZ
Bld-For	9	cgccaccgcggtggagctAGGAAACAGCTATGATTAAAGACACGCTAGTTTCT	SacI	pAWP89-lacZ
Bld_Rev	10	atagggcgaattggagctTTAACCGGCGAGTACACATCT	SacI	pAWP89-lacZ
F1-phaC-For	11	CACCTGACGTCTAGATCTGGCGTCACTTTTGGTCCCAGA	EcoRI	pCM351-Gen
F1-phaC-Rev	12	TGGTACCAATTGTACAGCTGAGCCGGCGCTCCTCCGCCGT	EcoRI	pCM351-Gen
F2-phaC-For	13	CGTGTTAACCGGTGAGCTAATCTGCGCAAGGTGAAGAT	SacI	pCM351-Gen
F2-phaC-Rev	14	CTGGATCCTCTAGTGAGCTCGTCGAGCTGAAGGAGCGGG	SacI	pCM351-Gen
Ptac-AB-For	15	CCCAGCTGTACAATTGGTACTGAGCTGTTGACAATTAATC	KpnI	pCM351-Gen
Ptac-AB-Rev	16	GCCATATGCATCCATGGTACCGATTTAGAACTGCGATTCT	KpnI	pCM351-Gen

본 발명에서 구축된 플라스미드는 표 2에 나타내었다.

플라스미드 이름
pAWP89
pAWP89-lacZ	pAWP89 without dTomato, carrying lacZ reason from pBBR1MCS-2
pAWP89-AB	pAWP89-lacZ containing Adh gene from Clostridium acetobutylicum, and Bld gene from Clostridium saccharoperbutylacetonicum driven by Ptac promoter
pAWP89-APB	pAWP89-lacZ containing Adh gene from Clostridium acetobutylicum, and Bld gene from Clostridium saccharoperbutylacetonicum driven by Ptac promoter, phaB gene from Rastonia Eutropha
pCM351-AB-ΔC	pCM351-F12 for deletion phaC and containing Adh gene from Clostridium acetobutylicum, and Bld gene from Clostridium saccharoperbutylacetonicum driven by Ptac promoter

<실시예 4> 1,3-부탄다이올 생합성 경로 구축을 위한 벡터시스템의 M. trichosporium OB3b로의 형질전환

상기 실시예 3을 통하여 얻어진 재조합 발현용 벡터 및 결손용 벡터를 야생형 메탄자화균 M. trichosporium OB3b에 형질전환시키기 위하여, 컨주게이션(conjugation)을 실시하였다. OD600에서 약 0.2까지 자란 M.trichosporium OB3b를 사용하였다 M. trichosporium OB3b50ml 및 도입될 플라스미드를 포함하는 공여자 E. coli S17-1 10ml를 NMS로 세척하였다. 이후, 이들을 0.2 μm 멸균 니트로셀룰로스 필터에 혼합된 세포를 도포하였다. 필터를 0.02%(w/v) 프로테오스-펩톤(proteose-peptone)을 포함한 NMS 한천 배지에 놓고, 메탄(대기 중 50 %)의 존재하에 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 0.02%(w/v) 프로테오스-펩톤(proteose-peptone)을 포함한 NMS 한천 플레이트로부터의 세포를 10mL NMS 배지에 재현탁시키고, 7000g에서 5분 동안 원심분리하여 농축시켰다. 세포 펠렛은 카나마이신이 포함된 NMS 한천에 도말하고 단일한 콜로니가 나타날 때까지 메탄/공기(3:7, v/v)와 함께 2-3주 동안 배양하였다.

형질전환 메탄자화균을 선별하기 위하여, 16s DNA 분석법을 통하여 M. trichosporium OB3b임을 확인하고 표 1에서 기재된 프라이머를 이용하여 각각의 유전자가 삽입되었는지 확인하였다. 이를 통해 얻은 형질전환 메탄자화균은 하기 표 3에 기재하였다.

균주 이름
OB3b_AB	M. trichosporium OB3b harboring pAWP89-AB
OB3b_APB	M. trichosporium OB3b harboring pAWP89-APB
OB3b_AB-ΔC	M. trichosporium OB3b harboring pCM351-AB-ΔC

<실시예 5> 형질전환 메탄자화균의 생장 속도 및 1,3-부탄다이올 생산능 확인

1,3-부탄다이올 생산이 형질전환 메탄자화균의 세포성장에 비교 평가하기 위하여, 실시예 1의 방법으로 야생형 균주와 형질전환 메탄자화균를 비교 평가하였다. 적정 시간별로 배양액을 수득하여 OD₆₀₀값을 한 결과, 1,3-부탄다이올의 생산은 세포 성장 속도에는 영향이 미치지 않는 것을 확인하였다(도 2a)

<실시예 6> 형질전환 메탄자화균을 이용한 메탄기질로부터 1,3-부탄다이올 생산, 추출 및 정량 확인

상기 실시예 1의 방법으로 야생형 균주 M. trichosporium OB3b와 형질전환 메탄자화균(OB3b_AB, OB3b_APB 및 OB3b_AB-ΔC)를 6일간 배양한 후, 상기 실시예 2의 방법으로 1,3-부탄다이올을 분석 및 정량하였다.

그 결과, 야생형 균주에서는 1,3-부탄다이올이 생성되지 않았고, butyraldehyde dehydrogenase(Bld)와 alcohol/aldehyde dehydrogenase(adhE)를 과발현시킨 형질전환 메탄자화균 OB3b_AB에서는 5 mg/L의 1,3-부탄다이올을 생산하였으며, NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase를 추가로 과발현시킨 OB3b_APB 균주는 8 mg/L의 1,3-부탄다이올을 생산되므로 OB3b_AB 균주보다 1,3-부탄다이올 생산성이 1.6배 향상되었다(도 2b).

또한, M. trichosporium OB3b 유전체 내에 존재하는 PHB synthase를 결손시키고 그 위치에 butyraldehyde dehydrogenase(Bld)와 alcohol/aldehyde dehydrogenase(adhE)를 도입한 OB3b_AB-ΔC 균주는 40 mg/L의 1,3-부탄다이올을 생산, OB3b_AB 균주보다 생산성이 8배 증가하였다(도 3).

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Transformed methanotrophs for producing 1,3-butanediol and uses thereof <130> PN1910-475 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 499 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> butyraldehyde dehydrogenase (Bld) <400> 1 atgattaaag acacgctagt ttctataaca aaagatttaa aattaaaaac aaatgttgaa 60 aatgccaatc taaagaacta caaggatgat tcttcatgtt tcggagtttt cgaaaatgtt 120 gaaaatgcta taagcaatgc cgtacacgca caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 180 gaacaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattagaaaa taaagagatt 240 ctagctacaa tgattcttga agaaacacat atgggaagat atgaagataa aatattaaag 300 catgaattag tagctaaata cactcctggg acagaagatt taactactac tgcttggtca 360 ggagataacg ggcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gcgttatagg tgcaataact 420 ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagta taggcatgat agctgctgga 480 aatactgtgg tatttaacg 499 <210> 2 <211> 499 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> alcohol/aldehyde dehydrogenase (adh) <400> 2 atgaaagtta caaatcaaaa 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cacctgacgt ctagatctgg cgtcactttt ggtcccaga 39 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> F1-phaC-Rev <400> 12 tggtaccaat tgtacagctg agccggcgct cctccgccgt 40 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2-phaC-For <400> 13 cgtgttaacc ggtgagctaa tctgcgcaag gtgaagat 38 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2-phaC-Rev <400> 14 ctggatcctc tagtgagctc gtcgagctga aggagcggg 39 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptac-AB-For <400> 15 cccagctgta caattggtac tgagctgttg acaattaatc 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptac-AB-Rev <400> 16 gccatatgca tccatggtac cgatttagaa ctgcgattct 40

Claims

부티르알데히드 탈수소효소(Butyraldehyde dehydrogenase), 알코올/알데하이드 탈수소효소(alcohol/aldehyde dehydrogenase) 및 NAD(P)H 의존 아세토아세틸-CoA 환원 효소(NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase)에 활성을 가지고; PHA 합성 효소(PHA synthases)의 활성이 감소 또는 불활성화 되는 1,3-부탄다이올을 생산하는 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 부티르알데히드 탈수소효소(Butyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(Bld)는 서열번호 1의 염기서열로 표시되고, 알코올/알데하이드 탈수소효소(alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것인 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 NAD(P)H 의존 아세토아세틸-CoA 환원 효소(NAD(P)H dependent acetoacetyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자(PhaB)는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것인 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 PHA 합성 효소(PHA synthases)를 코딩하는 유전자(PhaC)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것인 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 메탄자화균은 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium) 속 또는 메틸로시 너스 속(Methylosinus) 균주인, 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 메탄자화균은 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium) OB3b인, 형질전환 메탄자화균.
제 1항에 있어서, 상기 형질전환 메탄자화균은 1,3-부탄다이올 생산능이 없는 야생형에 비해 1,3-부탄다이올 생산능이 향상된 것인, 형질전환 메탄자화균.
C1 탄소원을 포함하는 배양액에 제1항의 형질전환 메탄자화균을 배양하는 단계를 포함하는, 1,3-부탄다이올의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 배양액으로부터 1,3-부탄다이올을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 1,3-부탄다이올의 제조방법.