KR102245145B1

KR102245145B1 - 바이오매스 생산능이 향상된 형질전환체 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법

Info

Publication number: KR102245145B1
Application number: KR1020190114619A
Authority: KR
Inventors: 한지숙; 차승우
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2021-04-28
Also published as: KR20210033196A

Abstract

본 발명은 특정 신호전달 체계 결손을 통해 바이오매스 생산능이 향상된 형질전환체 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 형질전환체는 신호전달 단백질인 RegA의 유전자가 유전체상에서 결손됨으로써 메탄에서의 증식 효율이 월등히 향상된다. 따라서, 상기 형질전환체를 이용하여 바이오매스를 생산할 경우, 야생형 미생물 대비 동일한 양의 메탄으로부터 보다 많은 바이오매스의 생산이 가능하여 탄소원 및 에너지원으로서의 메탄 이용을 절감시킬 수 있다. 즉, 상기 형질전환체는 바이오매스 생산 비용 절감에 기여할 수 있어, 산업적으로 활용가능성이 많다.

Description

바이오매스 생산능이 향상된 형질전환체 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법{TRANSFORMANTS WITH ENHANCED PRODUCTIVITY OF BIOMASS AND A METHOD OF PRODUCTION BIOMASS USING THEREOF}

본 발명은 특정 신호전달 체계 결손을 통해 바이오매스 생산능이 향상된 형질전환체 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법에 관한 것이다.

석유 자원의 고갈과 온실 가스 발생 등 각종 환경 문제에 대한 관심이 증가함에 따라, 기존의 석유화학 공정으로부터 생산되던 많은 화합물들을 지속 가능하며 친환경적으로 생산할 수 있는 기술의 필요성이 대두되었다. 기존 산업의 근간이 되는 화석 연료는 결국 바이오매스가 오랜 시간을 거쳐 변형된 것이기 때문에, 실질적으로 이를 대체하기 위해서는 결국 탄소원인 바이오매스가 효율적으로 전환되어야 한다.

바이오매스는 식물과 미생물의 광합성에 의하여 생성되는 식물체, 균체와 이를 먹고 살아가는 동물체를 포함하는 생물유기체, 즉 바이오에너지의 에너지원을 의미한다. 바이오매스를 목적 화합물로 전환하기 위해서는, 바이오매스에 포함되어 있는 당(sugar)을 미생물의 발효 과정을 거쳐 원하는 대사산물로 전환시켜야 한다. 지금까지는 옥수수 및 사탕수수 등과 같은 녹말 작물(starch crop)로부터 얻어낸 포도당(glucose)을 발효 공정에 사용하여 왔지만, 가까운 미래에 바이오 화합물의 수요량이 급증할 경우 곡물 가격 폭등으로 인한 많은 문제점이 발생될 것으로 예상되고 있다(이진원 외 1, 2011).

한편, 저렴한 탄소원인 메탄의 유용물질로의 전환에 대한 관심이 증가함에 따라, 메탄을 유일한 탄소원이자 에너지원으로 사용할 수 있는 메탄자화균주가 각광받고 있다. 바이오매스로서 메탄자화균주 자체를 사료와 같은 형태로 활용하거나, 바이오매스와 연동되어 생산되는 유용 물질을 생산할 경우, 메탄의 바이오매스 전환율 증가는 생산 비용 절감에 중요한 기여를 할 수 있다. 그러나, 이러한 균주의 유전적 조작을 통해 메탄의 바이오매스 전환율을 증가시킨 사례는 아직 보고되지 않고 있다.

이진원 외 1, 바이오에너지의 종류와 생산방법. NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 29, No. 4, 2011.

본 발명자들은 유전자 조작을 통해 메탄의 바이오매스 전환율을 증가시킬 수 있는 미생물을 개발하던 중, 신호전달 단백질인 RegA의 유전자를 유전체 상에서 결손시킨 메탄자화균주에서 야생형 대비 증식 효율이 향상되고, 바이오매스가 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 바이오매스 생산능이 증가된 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메탄자화균에서 regA 유전자가 결손된 바이오매스 생산용 형질전환체를 제공한다.

또한, 상기 바이오매스 생산용 형질전환체를 포함하는 바이오매스 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 바이오매스 생산용 조성물을 포함하는 바이오매스 생산용 키트를 제공한다.

또한, 상기 바이오매스 생산용 형질전환체를 메탄을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 바이오매스의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 신호전달 단백질인 RegA의 유전자가 유전체상에서 결손됨으로써 메탄에서의 증식 효율이 월등히 향상된다. 따라서, 상기 형질전환체를 이용하여 바이오매스를 생산할 경우, 야생형 미생물 대비 동일한 양의 메탄으로부터 보다 많은 바이오매스의 생산이 가능하여 탄소원 및 에너지원으로서의 메탄 이용을 절감시킬 수 있다. 즉, 상기 형질전환체는 바이오매스 생산 비용 절감에 기여할 수 있어, 산업적으로 활용가능성이 많다.

도 1은 R. sphaeroides 균주의 RegB/A 신호전달체계 작동 원리를 도식화한 것이다.
도 2는 메틸로모나스 속 DH-1 균주와 형질전환된 JHM2000 균주의 메탄에서의 성장 곡선을 비교하여 나타낸 것이다.

본 발명의 일 측면으로, 메탄자화균에서 regA 유전자가 결손된 바이오매스 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 명세서에서 사용한 용어, "메탄자화균"은 메탄산화세균이라고도 호칭되며, 메탄을 유일탄소원으로 이용하여 생육하는 원핵생물을 의미한다. 대부분의 메탄자화균은 대기중의 메탄을 탄소원으로서 사용하는데, 대체로 메탄을 메탄올의 형태로 전환시킨 후, 생체내 대사에 사용한다.

일례로, 상기 메탄자화균은 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로마이크로비움 속(Methylomicrobium), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum) 및 메틸아시디마이크로비움 속(Methylacidimicrobium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주일 수 있으며, 바람직하게는 메틸로모나스 속 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메틸로모나스 속 DH-1(Methylomonas sp. DH-1) 균주일 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "메틸로모나스 속 DH-1 균주"란, 하수슬러지로부터 유래되고, 종래에 보고되지 않았던 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.)에 속하는 균주로서, 2015년 8월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 기탁번호 KCTC18400P를 부여받은 균주를 의미한다.

상기 메틸로모나스 속 DH-1 균주(이하, "DH-1 균주"라 약칭 함)는 다음과 같은 특징을 나타낸다: (a) 수용성 미립자 메탄산화효소(soluble methane monooxygenase, sMMO) 유전자가 존재하지 않는다; (b) 미립자 메탄산화효소(particulate methane monooxygenase, pMMO) 유전자, PQQ-의존성 메탄올 디하이드로게나제(PQQ-dependent methanol dehydrogenase, mxaFJGIRSACKLDEK) 유전자, PQQ 생합성 유전자 클러스터(PQQ biosynthesis gene cluster, pqqBCDE) 유전자, 피루브산 탈카르복시효소(pyruvate decarboxylase, PDC) 유전자, 글루타밀-tRNA 합성효소(glutamyl-tRNA synthase, gltX) 유전자, NADPH-의존성 글루타밀-tRNA 환원효소(NADPH-dependent glutamyl-tRNA reductase, hemA) 유전자, 글루타메이트-1-세미알데히드 아미노트랜스퍼라제(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, hemL) 유전자, 스쿠알렌 호펜 사이클라제(squalene hopene cyclase, shc) 유전자 등이 발현된다; (c) 포름알데히드를 대사하는 RuMP 대사경로(ribulose monophosphate cycle), ED 대사경로(Entner-Doudoroff pathway), EMP 대사경로(Embden-Meyerhof-Parnas pathway), PP 대사경로(pentose phosphate pathway), H4MPT 대사경로(Tetrahydromethanopterim pathway), H4F 대사경로(tetrahydrofolaste pathway), 세린 대사경로(serine pathway), TCA 대사경로(TCA cycle), C30 카로티노이드 합성경로(C30 carotenoid synthesis pathway), 호파노이드 생합성 경로(hopanoid biosynthesis pathway), C40 카로티노이드 합성경로(C30 carotenoid synthesis pathway) 등이 활성화되어 있다; 및 (d) 피루브산카르복시화효소(pyruvate carboxylase) 유전자, 포스포에놀피루브산카르복실화효소(phosphoenolpyruvate carboxylase) 유전자 및 피루브산 탈카르복시효소(pyruvate decarboxylase, PDC) 유전자의 조합 활성에 의해 이산화탄소를 흡수하여 고정시킨다.

본 명세서에서 사용한 용어 "형질전환체"는 숙주 미생물에 내재적인 유전자의 발현을 억제하여 숙주 미생물이 가지는 원래의 유전적인 특징과 상이한 유전적인 특징을 새로이 나타내도록 변이시킨 변이 균주를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체는 메탄자화균 유전체 상에서 RegA가 결손되어 바이오매스 생산능이 증가한 형질전환 균주를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에서 사용한 용어, "RegA"는 균주의 산화 환원 균형을 인지하여 하위 단계 유전자의 발현량을 조절하는 전사조절인자이다. 구체적으로, RegB/A 신호전달 체계에서, RegB 단백질은 산소가 없을 때 사량체(tetramer)에서 이량체(dimer)로 전환되어 활성을 띄게 되는데, 이는 RegA의 인산화를 유도하여 하위 유전자들의 전사를 조절한다.

일례로, R. sphaeroides 균주의 RegB/A 신호전달 체계 작동 원리를 도 1에 나타내었다. 상기 R. sphaeroides 균주에서는 질소 고정(nifA), 호기성 호흡(cydAB), 전자 전달계(petABC) 관련 유전자가 RegA의 타겟으로 규명되었다. 상기 RegA는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있으며, 이를 코딩하는 regA 유전자는 서열번호 2의 염기서열 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

일 구체예로, 본 발명에 따른 형질전환체는 RegA의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 바이오매스 생산능이 향상될 수 있다.

상기 "내재적 활성"은 미생물이 천연의 상태 또는 해당 효소의 변형 전에 가지고 있는 단백질의 활성 상태를 의미한다. 또한, "단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화된"은 단백질을코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 상기 내재적 활성이 감소된 유전자는 상기 유전자의 일부 또는 전부 결실시켜 제작할 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "형질전환"은 제작된 재조합 DNA를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 일 구체예로, 재조합 DNA는 전기천공법을 통해 숙주세포에 도입될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 하기 세 가지의 DNA 단편을 오버랩(overlap)하여 재조합 DNA는 제작하였다: (1) RegA 유전자의 위쪽을 포함한 1,020 bp 단편; (2) 터미네이터 및 선별 마커(kanamycin)을 포함한 1,323 bp 단편; 및 regA 유전자의 아래쪽을 포함한 1,020 bp 단편. 이후, 상기 제작된 재조합 DNA를 전기천공법을 이용하여 메틸로모나스 속 DH-1 균주 내에 도입하였다.

본 명세서에서 사용한 용어, "전기천공법"은 세포에 전기 충격을 주어 벡터 내에 삽입한 재조합 DNA를 숙주 세포 내로 이식하는 방법을 의미한다. 구체적으로, 세포벽을 제거한 원형질체에 전기 충격을 주어 세포막이 DNA를 받아들이게 하는 방법이다.

본 발명은 다른 측면으로, 본 발명에 따른 바이오매스 생산용 형질전환체를 포함하는 바이오매스 생산용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 바이오매스 생산용 형질전환체는 전술한 바와 동일하다.

상술한 바와 같이, 상기 regA 유전자가 결실된 형질전환체는 메탄을 포함하는 환경에서 야생형 대비 우수한 증식능을 가지므로, 상기 형질전환체 또는 이의 배양물을 이용하면 메탄으로부터 바이오매스를 높은 수율로 생산할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체의 배양물은 메탄으로부터 바이오매스를 생산하는데 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 상기 형질전환체의 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 형질전환체의 배양물을 원심분리하여 수득한 배양상등액, 상기 형질전환체를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득한 파쇄물, 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득한 분획물 등이 될 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명에 따른 바이오매스 생산용 조성물을 포함하는 바이오매스 생산용 키트를 제공한다. 이때, 상기 바이오매스 생산용 조성물은 전술한 바와 동일하다.

본 발명의 바이오매스 생산용 키트는, 상기 바이오매스 생산용 조성물을 포함하여 바이오매스를 생산하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 반응에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적인 예로는, 상기 바이오매스생산에 사용되는 완충액, 상기 바이오매스 생산을 수행하기 위한 반응용기, 상기 바이오매스 생산을 수행하기 위한 진탕배양기, 상기 바이오매스 생산 반응을 수행하기 위한 타이머 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 바이오매스 생산용 형질전환체를 메탄을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 바이오매스의 생산 방법을 제공한다. 이때, 상기 바이오매스 생산용 형질전환체는 전술한 바와 동일하다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 상기 형질전환체로부터 바이오매스를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일례로 메탄을 포함하는 배지에 접종하여 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 형질전환체는 메탄을 포함하는 조건하에서 증식능이 향상되었다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 이때, 상기 배양은 진탕배양일 수 있다. 또한, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 메탄을 포함하는 대기조건 하에서 배양을 수행할 수 있다. 상기 대기중 메탄의 농도는 0.01 내지 50%(v/v), 10 내지 40%(v/v), 20 내지 30%(v/v)일 수 있으며, 바람직하게는 20%(v/v)일 수 있다.

또한, 배양온도는 20 내지 40℃, 25 내지 35℃, 27 내지 30℃일 수 있고, 바람직하게는 30℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 아울러, 상기 배양은 교반조건에서 수행될 수 있는데, 상기 교반조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 100 내지 300 rpm, 150 내지 250 rpm, 170 내지 200 rpm일 수 있고, 바람직하게는 170 rpm일 수 있다.

본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 메틸로모나스 속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

탄소원의 예로는 수크로오스 또는 글루코오스가 포함될 수 있고, 수크로오스를 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원이 다양하게 이용될 수 있다.

질소원의 예로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.

배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 40℃, 구체적으로는 25℃ 내지 35℃, 더욱 구체적으로는 30℃일 수 있으나, 목적하는 목적에 따라 제한 없이 변경될 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량에 도달할 때까지 계속 할 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구체예로, 배양에 사용되는 배지는 메탄자화균의 배양에 사용되는 것으로 알려진 NMS(nitrate mineral salts) 배지를 사용할 수 있고, 메탄자화균에 따라 상기 배지에 포함된 성분 또는 이의 함량을 조절한 배지를 사용할 수 있다.

특히, 배지에 NaCl, KCl 등의 염류를 포함할 경우, DH-1 균주 또는 그의 형질전환체의 증식 또는 바이오매스의 생산성을 향상시킬 수 있다. 이때, 배지에 포함되는 염류의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일례로 0.1 내지 3.0%(w/w), 1.0 내지 2.0%(w/w), 1.5%(w/w)일 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오매스의 생산 방법은, 상기 배양이 종료된 후, 배양물로부터 바이오매스를 회수하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 배양물은 메틸로모나스 속 DH-1(Methylomonas sp. DH-1) 균주 또는 이의 형질전환체의 배양물, 상기 배양물의 배양상등액, 상기 메틸로모나스 속 DH-1 균주 또는 그의 형질전환체의 파쇄물, 이들의 분획물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

바이오매스를 회수하는 단계는 투석, 원심분리, 여과, 용매추출, 크로마토그래피, 결정화 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 형질전환체의 배양물을 원심분리하여 상기 형질전환체를 제거하고 얻어진 상등액을, 용매추출법에 적용하여 바이오매스를 회수하는 방법을 사용할 수 있고, 이외에도 상기 바이오매스의 특성에 맞추어 공지된 실험방법을 조합하여 상기 바이오매스를 회수할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 균주 준비

하기 실시예에서는 메탄화균주로서 메틸로모나스 속 DH-1(Metyhlomonas sp. DH-1) 균주를 사용하였고, 이는 2015년 8월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 기탁번호 KCTC18400P를 부여받은 균주를 의미한다.

제조예 2. regA 유전자 결손 형질전환체 제작

regA가 결손된 돌연변이 균주를 제작하기 위해 하기 세 가지의 DNA 단편을 오버랩 하여 제작하였다: (1) RegA 유전자의 위쪽을 포함한 1,020 bp짜리 단편; (2) 터미네이터 및 선별 마커(kanamycin)를 포함한 1,323 bp짜리 단편; 및 (3) regA 유전자의 아래쪽을 포함한 1,020 bp 짜리 단편.

상기 세 가지의 DNA 단편에 대해 각각 PCR을 수행한 후, 상기 각각의 DNA 단편을 1 uL씩 사용하여 오버랩핑 PCR(overlapping PCR)을 수행하였다. 이때, 상기 각 단편들끼리는 20개의 염기서열이 겹치도록 디자인하였으며, PCR을 통해 도합 3,323 bp의 재조합 DNA(서열번호 12)를 제작하였다. 구체적으로, 상기 세 가지의 DNA 단편의 PCR을 위한 각각의 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었고, 상기 세 가지의 DNA 단편의 전체 서열을 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에서, 상기 각 단편들끼리 겹치는 부분을 굵은 글씨로 표시하였다.

DNA 단편	Forward primer	Reverse primer
regA 유전자의 위쪽을 포함한 단편(1,020 bp)	gtggaacatggtgatcataacttcgt (서열번호 3)	tgatgcctggtaccactagtttatccgtaggcaaattggtcatggatactc (서열번호 4)
터미네이터 및 선별 마커(kanamycin)를 포함한 단편(1,323 bp)	actagtggtaccaggcatcaaataaaacg (서열번호 6)	gggccctgaggtctgcctcgtg (서열번호 7)
regA 유전자의 아래쪽을 포함한 단편(1,020 bp)	cgaggcagacctcagggccccgggtaatca gagggggagc (서열번호 9)	gatttggttgcctctaaatagacc (서열번호 10)

DNA 단편	단편 전체 서열	서열번호
regA 유전자의 위쪽을 포함한 단편(1,020 bp)	gtggaacatg gtgatcataa cttcgtgtgt ctacaccgtg ttgatcgcct ataacgtgcc gcttccggcc atcgagccgc atttggcgca tccggccatg gccgagttga cgccggaaat gagtctgcag atgcatctga tgaacgatag gcgctatttc aatctgcatg tgttcggcat gtggttcggt tttgtgttca gtgccggctt ggtcgcgttt tttgtcgtgg aattgtcgaa aacgttaaaa gagcgcgagc gcaatctggc cgatgcccgc gagagtgcct tgcgggatga gcgcgtggtt tcgctgggta cgttggcggc cagcgcggct cacgatatgg gcacgccgct gggtacgatc gcgatcctca cgcacgaaat ggtcgaggat ttccccgagc accggtatcc tgagctctac cacaagctga tgatcgtgca gcagcaaatc gaccgctgca agcaggcgtt gtcggtgatg tcggcgtcgg ccggcgagat gcgggccgaa tcgggcaagg tcatgctggt cagcgagtat atcgacgaag ttttgaatca atggcgggcg cacaaatctg ctacccggct gaaattattc gtatccccga acgtagacat ggcggcgaaa ataatcgccg agcgcacggt gacccattcc attatcaata tcctgaacaa cgcggccgag gcttctccgg acgacgccgg tatcgagttt catgccgagt ggagcgatga caatttgttt ttgcggatcc gggatttcgg tccggggctg ccggccgagt ttatcgattt cgccgggcat cagccggtga aaagcaacaa gcagggcatg ggggtgggtt tgtttttgac ctataccacg ataaaacgct tgggcggtac aatacagttc agtaatctcg acagcggcgg agcttgcgtg gagatcagtt tgccgttgtt agctaaggag agtatccatg accaatttgc ctacggataa actagtggta ccaggcatca	서열번호 5
터미네이터 및 선별 마커(kanamycin)를 포함한 단편(1,323 bp)	actagtggta ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cggaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaattaatt aaccacgttg tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaatcagaa ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcggcttt gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa ctggtccacc tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga tggggcgatt caggcctggt atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctcaggg ccc	서열번호 8
regA 유전자의 아래쪽을 포함한 단편(1,020 bp)	cgaggcagac ctcagggccc cgggtaatca gagggggagc ttgaaaaacg ggtttcagtt cgactttatg actggcgcaa gcagtccgca cgcgcagggc ctcagtattc ggcatgcggt tacgcgctgc cggtgtaagt cttgaagacc gtcaagactt gttagggcgt catgcagggc atatcactac gcataccgta aggcggaaat cgctcggctg attgagtgtg tggaattgct ttgcgacgat aagcaacaac ccgagcttac attgattcgg gcagcttaat cgtcaaaaag tcggaaatga aaaatggcag acacaaaaaa ccagctctga tttctcagta actggttgat ttgtatatcg aattgatggt gggtcgtgtg cgattcgaac gcacgaccat cgcattaaaa gtgcaattac aattctgtaa gccattgttt ttatttaatt attaattttg tctggtctgt ctacgcgaca cgacgcatca caactgagca taactaagtc gcgtaaatct cgcgtacgat ttttgcgaat ttgataacgc tagattacgg aaaggtattg actgcattac aatctgttct tgtttcagat caattttagc gccgaatcaa agcgtaagga aaacactatg caaatagcta tcgacctccc caacgatttt gtcagttttc aatcggctgc cgacatcgag aaagacatgc ggttgagcta ttccttgtgg ctatttaaaa atgccaaggt caccattacc aaggctgctg aactggctca tctggatata tacgacttca tggcagcttg taaacaaaat caagtatctg tcatcgacat tagtccacag gaattgttgg atgaggttgc ggggatgcga tcagtatgat tctggttgcg gattgttccg cattggtagc gttgtcgatc tgcgatagtt tatatttatt gtaagcattg tttacccggg tggcggtacc tgaatcggtc tatttagagg caaccaaatc	서열번호 11

상기 제작된 재조합 DNA를 전기천공법(Micropulser^TM Electroporator(Biorad))을 이용하여 메틸로모나스 속 DH-1 균주에 형질전환하였다. 본 발명에서 상기 제작된 regA 유전자가 결손된 균주의 균주명은 JHM2000이며, 유전자형은 DH-1 regA△::Kan이다.

실험예 1. 메탄 조건에서 균주의 증식능 비교

1) 배지 및 배양조건

야생형 메틸로모나스 속 DH-1 균주와 상기 제조예 2에서 준비한 JHM2000 균주를 NMS(0.488 g/L MgSO₄, 1 g/L KNO₃, 0.228 g/L CaCl₂-2H₂O, 3.8% Fe-EDTA, 0.1% Na₂MoO₄ 및 미량원소 용액(trace element solution))에 인산용액, 비타민, 10 μM CuSO₄ 및 선별 마커(kanamycin)가 첨가된 배지에서 배양하였다.

* 미량원소 용액: 500 mg/L FeSO₄-7H₂O, 400 mg/L ZnSO₄-7H₂O, 15.71 mg/L MnCl₂-4H₂O, 50 mg/L CoCl₂-6H₂O, 10 mg/L NiCl₂-6H₂O, 15 mg/L H₃BO₃ 및 250 mg/L EDTA 함유.

* 인산 용액은 26 g/L KH₂PO₄ 및 32.83 g/L Na₂HPO₄ 함유.

* 비타민은 2.0 mg/L biotin, 2.0 mg/L folic acid, 5.0 mg/L Thiamine HCl, 5.0 mg/L Ca pantothenate, 0.1 mg/L Vitamin B₁₂, 5.0 mg/L Riboflavin 및 5.0 mg/L Nicotinamide 함유.

배양은 진탕배양기를 이용하여 30℃에서 170 rpm으로 진행하였다. 배양조건으로 초기접종 세포농도는 OD₆₀₀=0.1로 고정하였고, 125 mL 진탕 플라스크에서 12.5 mL 배지로 진행하였으며, 가스 시린지(Agilent 50 mL gas tight syringe 5190-1547)를 사용하여 20%의 메탄을 공급하였다.

2) 형질전환된 균주의 성장 측정

이후, 야생형 메틸로모나스 속 DH-1 균주와 상기 제조예 2에서 제작된 형질전환된 JHM2000 균주의 세포 밀도는 Multiskan Go(Thermo fishers scientific)를 사용하여 600 nm 의 파장에서 측정하였다. 그 결과, regA가 결손된 JHM2000 균주에서 최종 세포 광학 밀도 OD₆₀₀ 값이 야생형 DH-1 균주 대비 더 높게 나타났다(도 2). 즉, 동일한 양의 메탄에서 본 발명의 형질전환된 JHM2000 균주가 더욱 잘 증식할 수 있는 것을 확인한 바, regA가 결손된 JHM2000 균주가 야생형 DH-1 균주에 비해 메탄으로부터 보다 더 많은 바이오매스의 생산이 가능함을 추측할 수 있다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> TRANSFORMANTS WITH ENHANCED PRODUCTIVITY OF BIOMASS AND A METHOD OF PRODUCTION BIOMASS USING THEREOF <130> FPD/201906-0029/C <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RegA <400> 1 Met Thr Asn Leu Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Leu Leu Val Asp Asp 1 5 10 15 Asp Val Thr Tyr Cys Ser Val Leu Lys Pro Ala Leu Glu Lys Arg Asn 20 25 30 Phe Gln Val Thr Val Ala Asn Asp Val Ala Thr Ala Met Lys Leu Ala 35 40 45 Glu Gln Thr Glu Pro Glu Tyr Ala Val Ile Asp Leu Arg Ile Gly Phe 50 55 60 Asp Ser Gly Leu Glu Met Val Lys Lys Leu Ile Ser Leu Asp Asp Asn 65 70 75 80 Thr Gln Ile Val Met Leu Thr Gly Phe Ala Ser Ile Ala Thr Ala Val 85 90 95 Glu Ala Ile Lys Leu Gly Ala Ile His Tyr Leu Thr Lys Pro Ala Asn 100 105 110 Ala Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Tyr Lys Asn Glu Gly Asp Ala Ser 115 120 125 Val Ala Ile Ser Asp Ser Pro Leu Ser Val Lys Arg Leu Glu Trp Glu 130 135 140 His Leu Gln Lys Val Leu Met Gln His Asp Gly Asn Ile Ser Ala Ala 145 150 155 160 Ala Arg Ala Leu Asn Met His Arg Arg Thr Leu Gln Arg Lys Leu Glu 165 170 175 Lys Lys Pro Val Lys Glu 180 <210> 2 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> regA <400> 2 atgaccaatt tgcctacgga taagccgaat ttattgttgg ttgacgatga cgtgacctat 60 tgttcggtgt tgaagccggc gttggaaaaa cgcaattttc aggtaacggt agccaacgat 120 gtggcgacgg cgatgaaatt ggccgagcag accgagccgg agtacgcggt aatcgatttg 180 cggatcggtt tcgattccgg gctggagatg gtcaagaagc ttatttcgct ggacgacaat 240 acccaaatcg tcatgttgac cggtttcgcc agcatcgcga ccgcggtgga ggcgatcaag 300 ttaggtgcaa tccactatct gaccaagccg gcgaatgccg acgaaattgt cagcgcgcta 360 tacaaaaacg agggcgacgc ctcggtggct atcagcgata gcccgttatc ggtaaagcgt 420 ctggaatggg aacatttgca aaaagtactg atgcaacacg acggcaacat ttccgccgcc 480 gcgcgcgccc tgaatatgca tcgaaggact ttgcaacgga agctggagaa aaaaccggtc 540 aaggaatga 549 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for DNA fragment including the upper part of regA gene(1,020 bp) <400> 3 gtggaacatg gtgatcataa cttcgt 26 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for DNA fragment including the upper part of regA gene(1,020 bp) <400> 4 tgatgcctgg taccactagt ttatccgtag gcaaattggt catggatact c 51 <210> 5 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment including the upper part of regA gene(1,020 bp) <400> 5 gtggaacatg gtgatcataa cttcgtgtgt ctacaccgtg ttgatcgcct ataacgtgcc 60 gcttccggcc atcgagccgc atttggcgca tccggccatg gccgagttga cgccggaaat 120 gagtctgcag atgcatctga tgaacgatag gcgctatttc aatctgcatg tgttcggcat 180 gtggttcggt tttgtgttca gtgccggctt ggtcgcgttt tttgtcgtgg aattgtcgaa 240 aacgttaaaa gagcgcgagc gcaatctggc cgatgcccgc gagagtgcct tgcgggatga 300 gcgcgtggtt tcgctgggta cgttggcggc cagcgcggct cacgatatgg gcacgccgct 360 gggtacgatc gcgatcctca cgcacgaaat ggtcgaggat ttccccgagc accggtatcc 420 tgagctctac cacaagctga tgatcgtgca gcagcaaatc gaccgctgca agcaggcgtt 480 gtcggtgatg tcggcgtcgg ccggcgagat gcgggccgaa tcgggcaagg tcatgctggt 540 cagcgagtat atcgacgaag ttttgaatca atggcgggcg cacaaatctg ctacccggct 600 gaaattattc gtatccccga acgtagacat ggcggcgaaa ataatcgccg agcgcacggt 660 gacccattcc attatcaata tcctgaacaa cgcggccgag gcttctccgg acgacgccgg 720 tatcgagttt catgccgagt ggagcgatga caatttgttt ttgcggatcc gggatttcgg 780 tccggggctg ccggccgagt ttatcgattt cgccgggcat cagccggtga aaagcaacaa 840 gcagggcatg ggggtgggtt tgtttttgac ctataccacg ataaaacgct tgggcggtac 900 aatacagttc agtaatctcg acagcggcgg agcttgcgtg gagatcagtt tgccgttgtt 960 agctaaggag agtatccatg accaatttgc ctacggataa actagtggta ccaggcatca 1020 1020 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for DNA fragment(1,323 bp) <400> 6 actagtggta ccaggcatca aataaaacg 29 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for DNA fragment(1,323 bp) <400> 7 gggccctgag gtctgcctcg tg 22 <210> 8 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment(1,323 bp) <400> 8 actagtggta ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cggaagactg ggcctttcgt 60 tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaattaatt aaccacgttg 120 tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa 180 aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa 240 cgtcttgctc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 300 gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 360 atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 420 agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 480 tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc 540 aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 600 tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 660 gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 720 acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 780 tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 840 aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 900 atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 960 ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 1020 atgagttttt ctaatcagaa ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga 1080 cttgacggga cggcggcttt gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat 1140 cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa 1200 ctggtccacc tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga 1260 tggggcgatt caggcctggt atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctcaggg 1320 ccc 1323 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for DNA fragment including the lower part of regA gene(1,020 bp) <400> 9 cgaggcagac ctcagggccc cgggtaatca gagggggagc 40 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for DNA fragment including the lower part of regA gene(1,020 bp) <400> 10 gatttggttg cctctaaata gacc 24 <210> 11 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment including the lower part of regA gene(1,020 bp) <400> 11 cgaggcagac ctcagggccc cgggtaatca gagggggagc ttgaaaaacg ggtttcagtt 60 cgactttatg actggcgcaa gcagtccgca cgcgcagggc ctcagtattc ggcatgcggt 120 tacgcgctgc cggtgtaagt cttgaagacc gtcaagactt gttagggcgt catgcagggc 180 atatcactac gcataccgta aggcggaaat cgctcggctg attgagtgtg tggaattgct 240 ttgcgacgat aagcaacaac ccgagcttac attgattcgg gcagcttaat cgtcaaaaag 300 tcggaaatga aaaatggcag acacaaaaaa ccagctctga tttctcagta actggttgat 360 ttgtatatcg aattgatggt gggtcgtgtg cgattcgaac gcacgaccat cgcattaaaa 420 gtgcaattac aattctgtaa gccattgttt ttatttaatt attaattttg tctggtctgt 480 ctacgcgaca cgacgcatca caactgagca taactaagtc gcgtaaatct cgcgtacgat 540 ttttgcgaat ttgataacgc tagattacgg aaaggtattg actgcattac aatctgttct 600 tgtttcagat caattttagc gccgaatcaa agcgtaagga aaacactatg caaatagcta 660 tcgacctccc caacgatttt gtcagttttc aatcggctgc cgacatcgag aaagacatgc 720 ggttgagcta ttccttgtgg ctatttaaaa atgccaaggt caccattacc aaggctgctg 780 aactggctca tctggatata tacgacttca tggcagcttg taaacaaaat caagtatctg 840 tcatcgacat tagtccacag gaattgttgg atgaggttgc ggggatgcga tcagtatgat 900 tctggttgcg gattgttccg cattggtagc gttgtcgatc tgcgatagtt tatatttatt 960 gtaagcattg tttacccggg tggcggtacc tgaatcggtc tatttagagg caaccaaatc 1020 1020 <210> 12 <211> 3323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant DNA(3,323 bp) <400> 12 gtggaacatg gtgatcataa cttcgtgtgt ctacaccgtg ttgatcgcct ataacgtgcc 60 gcttccggcc atcgagccgc atttggcgca tccggccatg gccgagttga cgccggaaat 120 gagtctgcag atgcatctga tgaacgatag gcgctatttc aatctgcatg tgttcggcat 180 gtggttcggt tttgtgttca gtgccggctt ggtcgcgttt tttgtcgtgg aattgtcgaa 240 aacgttaaaa gagcgcgagc gcaatctggc cgatgcccgc gagagtgcct tgcgggatga 300 gcgcgtggtt tcgctgggta cgttggcggc cagcgcggct cacgatatgg gcacgccgct 360 gggtacgatc gcgatcctca cgcacgaaat ggtcgaggat ttccccgagc accggtatcc 420 tgagctctac cacaagctga tgatcgtgca gcagcaaatc gaccgctgca agcaggcgtt 480 gtcggtgatg tcggcgtcgg ccggcgagat gcgggccgaa tcgggcaagg tcatgctggt 540 cagcgagtat atcgacgaag ttttgaatca atggcgggcg cacaaatctg ctacccggct 600 gaaattattc gtatccccga acgtagacat ggcggcgaaa ataatcgccg agcgcacggt 660 gacccattcc attatcaata tcctgaacaa cgcggccgag gcttctccgg acgacgccgg 720 tatcgagttt catgccgagt ggagcgatga caatttgttt ttgcggatcc gggatttcgg 780 tccggggctg ccggccgagt ttatcgattt cgccgggcat cagccggtga aaagcaacaa 840 gcagggcatg ggggtgggtt tgtttttgac ctataccacg ataaaacgct tgggcggtac 900 aatacagttc agtaatctcg acagcggcgg agcttgcgtg gagatcagtt tgccgttgtt 960 agctaaggag agtatccatg accaatttgc ctacggataa actagtggta ccaggcatca 1020 aataaaacga aaggctcagt cggaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt 1080 gaacgctctc ctgagtagga caaattaatt aaccacgttg tgtctcaaaa tctctgatgt 1140 tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac 1200 agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc gaggccgcga 1260 ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg 1320 caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg 1380 aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg 1440 ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca 1500 tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct 1560 gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt 1620 cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca 1680 cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct 1740 gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc 1800 actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt 1860 attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac 1920 tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat 1980 aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaatcagaa 2040 ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcggcttt 2100 gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat cacgcatctt cccgacaacg 2160 cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa ctggtccacc tacaacaaag 2220 ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga tggggcgatt caggcctggt 2280 atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctcaggg ccccgggtaa tcagaggggg 2340 agcttgaaaa acgggtttca gttcgacttt atgactggcg caagcagtcc gcacgcgcag 2400 ggcctcagta ttcggcatgc ggttacgcgc tgccggtgta agtcttgaag accgtcaaga 2460 cttgttaggg cgtcatgcag ggcatatcac tacgcatacc gtaaggcgga aatcgctcgg 2520 ctgattgagt gtgtggaatt gctttgcgac gataagcaac aacccgagct tacattgatt 2580 cgggcagctt aatcgtcaaa aagtcggaaa tgaaaaatgg cagacacaaa aaaccagctc 2640 tgatttctca gtaactggtt gatttgtata tcgaattgat ggtgggtcgt gtgcgattcg 2700 aacgcacgac catcgcatta aaagtgcaat tacaattctg taagccattg tttttattta 2760 attattaatt ttgtctggtc tgtctacgcg acacgacgca tcacaactga gcataactaa 2820 gtcgcgtaaa tctcgcgtac gatttttgcg aatttgataa cgctagatta cggaaaggta 2880 ttgactgcat tacaatctgt tcttgtttca gatcaatttt agcgccgaat caaagcgtaa 2940 ggaaaacact atgcaaatag ctatcgacct ccccaacgat tttgtcagtt ttcaatcggc 3000 tgccgacatc gagaaagaca tgcggttgag ctattccttg tggctattta aaaatgccaa 3060 ggtcaccatt accaaggctg ctgaactggc tcatctggat atatacgact tcatggcagc 3120 ttgtaaacaa aatcaagtat ctgtcatcga cattagtcca caggaattgt tggatgaggt 3180 tgcggggatg cgatcagtat gattctggtt gcggattgtt ccgcattggt agcgttgtcg 3240 atctgcgata gtttatattt attgtaagca ttgtttaccc gggtggcggt acctgaatcg 3300 gtctatttag aggcaaccaa atc 3323

Claims

메탄자화균에서 regA 유전자가 결손된 바이오매스 생산용 형질전환체로서, 상기 메탄자화균은 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로마이크로비움 속(Methylomicrobium), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis) 및 메틸로셀라 속(Methylocella)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주인 것인, 바이오매스 생산용 형질전환체.
삭제
제1항에 있어서,
상기 메탄자화균은 메틸로모나스 속의 균주인 것인, 바이오매스 생산용 형질전환체.
제3항에 있어서,
상기 메틸로모나스 속 균주는 DH-1 균주인 것인, 바이오매스 생산용 형질전환체.
제4항에 있어서,
상기 메틸로모나스 속 DH-1 균주는 KCTC18400P로 기탁된 것인, 바이오매스 생산용 형질전환체.
제1항에 있어서,
상기 regA가 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것인, 바이오매스 생산용 형질전환체.
제1항에 있어서,
상기 형질전환체는 메탄을 포함하는 조건하에서 증식능이 향상된 것인, 바이오매스 생산용 형질전환체.
제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오매스 생산용 형질전환체를 포함하는 바이오매스 생산용 조성물.
제8항의 바이오매스 생산용 조성물을 포함하는 바이오매스 생산용 키트.
제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오매스 생산용 형질전환체를 메탄을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 바이오매스의 생산 방법.
제10항에 있어서,
상기 배양은 진탕배양인 것인, 바이오매스의 생산 방법.
제10항에 있어서,
상기 배양은 20 내지 40℃의 온도조건에서 수행되는 것인, 바이오매스의 생산 방법.
제10항에 있어서,
상기 배양은 100 내지 300 rpm의 교반조건에서 수행되는 것인, 바이오매스의 생산 방법.
제10항에 있어서,
상기 배양이 종료된 후, 배양물로부터 바이오매스를 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 바이오매스의 생산 방법.
제14항에 있어서,
상기 배양물은 상기 형질전환체의 배양물, 상기 배양물의 배양상등액, 상기 형질전환체의 파쇄물, 이들의 분획물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 바이오매스 생산 방법.